KR102311391B1 - L- 분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용하여 l-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 초산 대사 조절자 A의 활성이 강화된 L-분지쇄 아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 L-분지쇄 아미노산 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)의 활성이 강화된, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 L-분지쇄 아미노산 생산방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 특히 분지쇄 아미노산(Brached Chain Amino Acids, BCAA)로 필수 아미노산인 L-발린, L-류신, L-이소류신을 총칭하는 것으로, 상기 분지쇄 아미노산은 항산화 효과 및 근육세포의 단백질 합성작용을 직접적으로 촉진시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 미생물을 이용한 분지쇄 아미노산의 생산은, 주로 에스케리키아 속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 케토이소카프로산 (2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다(대한민국 특허 등록번호 제10-0220018호, 대한민국 특허 등록번호 제10-0438146호). 그러나, 상기 미생물을 통한 L-분지쇄 아미노산의 생산은 공업적으로 대량 제조가 쉽지 않은 문제점이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 미생물을 이용한 L-분지쇄 아미노산의 생산능을 향상시키기 위해 예의 노력한 결과, 미생물의 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A, 이하 RamA)의 발현을 강화하였을 시, 분지쇄 아미노산 생산능이 현저하게 증가함을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)의 활성이 강화된, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 다른 뉴클레오티드로의 치환을 포함하는 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
이하, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 출원에 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시예는 공통된 사항에 대하여 다른 실시 양태의 설명 및 실시예에서도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원의 상세한 설명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 출원의 권리범위에 속하는 것은 물론이다. 그뿐만 아니라, 하기 기술된 구체적인 설명에 의하여 본 발명출원의 권리범위가 제한되는 것이 아니다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)의 활성이 강화된, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서, 용어 "초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)"는 본 출원의 목적 단백질로 초산 대사에 관련된 조절 단백질(regulatory protein)을 의미하며, ramA 유전자에 의해 코딩 될 수 있다.
본 출원에서, 상기 초산대사 조절자 A는 그 발현이 강화될 수 있으며, 상기 발현 강화로 인하여 L-분지쇄 아미노산의 생산능 증가를 가져올 수 있다.
본 출원에서, 용어 "강화/증가"는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 증가되는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
이러한 유전자 활성의 강화 또는 증가는, 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서는 유전자 발현조절서열인 프로모터에 변이 도입, 또는 활성이 강한 프로모터로 교체하는 것으로 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "유전자 발현 조절 서열"은 이에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 서열로서, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 출원의 유전자 발현 조절 서열은 유전자의 전사를 실시하기 위한 프로모터, 인핸서 등을 의미할 수 있으며, 그 외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 DNA 등을 더 포함할 수 있는 개념이다.
본 출원의 일 구체예로 상기 유전자 발현 조절 서열은 프로모터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 구체예로, 프로모터에 변이 도입, 또는 활성이 강한 프로모터로 교체함에 따라 초산대사 조절자 A는 그 발현이 강화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "프로모터"는 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 목적 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비 해독된 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다. 이때, 상기 프로모터의 목적 유전자는 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)를 코딩하는 유전자일 수 있다.
본 출원에서 용어 "작동 가능하게 연결된"(operatively linked)은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 상기 유전자 서열과 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 목적 유전자는 미생물에서 발현을 조절하고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하는 것으로, 구체적으로, 상기 유전자는 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 유전자는 ramA을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 ramA의 전사 활성을 강화시킬 수 있다. 또한, 상기 ramA는 내재적 유전자이거나 외래 유전자일 수 있으며, 활성 조절을 위한 변이를 포함하는 것일 수 있다. 상기 ramA를 코딩하는 유전자의 서열은 미국 국립보건원의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스를 통하여 당업자가 용이하게 입수할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 다른 뉴클레오티드로의 치환을 포함하는 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 "프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드"는 "변이형 폴리뉴클레오티드","변이형 프로모터" 또는 "변이형 ramA 프로모터"등으로 혼용되어 명명될 수 있으며, 본 명세서에서는 상기 기술된 용어가 모두 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 가닥이다.
본 출원의 목적상 상기 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 아미노산, 구체적으로는 분지쇄 아미노산, 보다 구체적으로는 류신, 발린, 이소류신을 포함하는 아미노산의 생산 또는 생산량을 증가시키는데 관여하는 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열"은 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A: RamA)를 코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 의미할 수 있다.
본 출원의 상기 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 자연 유래의 서열이 아닌 프로모터 활성을 갖는 변이형 폴리뉴클레오티드로, 작동 가능하게 연결되는 목적단백질의 발현을 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에 비해서 증대시킬 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 ramA 유전자의 프로모터 서열이 변이된 것으로, 상기 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환; 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환되거나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 변이에 따라 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것(consist of)일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 및 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 것일 수 있다. 이때, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5로 이루어진 것일 수 있다.
다른 구체예로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 및 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환된 것일 수 있다. 이때, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구체예로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환; 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 및 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환된 것일 수 있다. 이때, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 이루어진 것일 수 있다.
이때, 상기 용어 "변이"는 유전적 또는 비유전적으로 안정적인 표현형적 변화를 의미하며, 본 명세서에서 "돌연변이"와 혼용되어 명명될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 변이를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 비해 변이된(증가 된) 프로모터 활성을 가질 수 있다. 따라서, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자인 ramA 유전자의 발현 및 상기 ramA에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절(증가)할 수 있으며, 나아가 목적 유전자 이외의 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
본 출원의 L-분지쇄 아미노산 생산 미생물은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환; 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환되거나 또는 이들의 조합을 포함하는, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 일 수 있다.
본 출원의 L-분지쇄 아미노산 생산 미생물은 서열번호 3 내지 5 중에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 80%이상 100%미만의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 미생물은 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하여 분지쇄 아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 상기 "L-분지쇄 아미노산을 생산할 수 있는 미생물"은 "분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물", "분지쇄 아미노산 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "분지쇄 아미노산"이란 곁사슬에 분지알킬기가 있는 아미노산을 말하며, 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 상기 분지쇄 아미노산은 L-분지쇄 아미노산일 수 있고, 상기 L-분지쇄 아미노산은 L-발린, L-류신 및 L-이소류신 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, “분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 분지쇄 아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 본 출원의 목적상 상기 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 목적하는 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 구체적으로 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물 또는 분지쇄 아미노산 생산능을 갖는 미생물은, 분지쇄 아미노산 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 분지쇄 아미노산 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "분지쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 분지쇄 아미노산 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물 일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 분지쇄 아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 분지쇄 아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 상기 "향상된 분지쇄 아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 분지쇄 아미노산 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 미생물, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로서, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드 또는 적합한 유전자 발현 조절 서열; 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λLB3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λ11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
또한, 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 프로모터를 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 예를 들면, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 출원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 상기 변이형 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현 조절 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여, 숙주세포 내에서 상기 유전자가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 나아가, 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현될 수 있기만 한다면, 형질전환된 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는, 숙주세포의 염색체 상에 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두의 경우를 포함할 수 있다.
상기 형질전환하는 방법은 상기 유전자 발현 조절 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 세포 내로 도입하는 모든 방법을 포함하며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법은 목적물질을 상기의 배지 또는 미생물로부터 회수 또는 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "폴리뉴클레오티드", "코리네박테리움 속 미생물"및 "L-분지쇄 아미노산"은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 아미노산은 정제된 형태 또는 아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)등에 의하여 변형될 수 있다.
따라서, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대해서 34번째 서열은 T로 고정; 36번째 서열은 T로 고정; 37번째 서열은 G로 고정; 41번째 서열은 T로 고정; 및 43번째 서열은 A로 고정되며, 그 이외의 서열과는 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 대해서 41번째 서열은 T로 고정; 및 43번째 서열은 A로 고정되며, 그 이외의 서열과는 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에 대해서 34번째 서열은 T로 고정; 36번째 서열은 T로 고정; 및 37번째 서열은 G로 고정; 되며, 그 이외의 서열과는 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
이때, 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 3 내지 5 중 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 또는 43번째 위치 외의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "상동성(homology) 또는 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한, 본 출원의 변이형 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리뉴클레오티드 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되고 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
특히, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 내지 5 중에 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 80%이상 100%미만의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다(consist of)는 표현은 상기 폴리뉴클레오티드를 프로모터로서 목적 유전자에 연결하여 사용할 때, 제한효소 사용과 같이 목적 유전자에 연결하는 과정 중에 발생할 수 있는 뉴클레오티드의 추가, 및/또는 삭제, 및/또는 변이 등의 경우를 배제하지 않는 것을 의미한다.
예를 들어, 서열번호 3 내지 5 중에 선택되는 어느 하나의 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 활성을 갖는 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 3 내지 5 중에 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되어 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열도 포함할 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물의 경우, 발린, 류신 또는 이소류신을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산량이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 코리네박테리움속 균주가 분지쇄 아미노산을 아주 극미량으로 생산할 수 있거나 생산하지 못하는 것에 비해, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 통해 분지쇄 아미노산 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 배양하는 경우, L-분지쇄 아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있다.
또한, 본 출원에 의해 제조된 아미노산은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1. 인공변이법을 통한 발린 생산능 증가 변이주 선별
실시예 1-1. UV조사를 통한 인공 돌연변이 유발
대표적인 분지쇄 아미노산인 발린 생산능이 증가된 변이주를 선별하기 위하여 발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)를 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30oC에서 36시간 배양하였다. 이렇게 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.
실시예 1-2. 돌연변이 유발 균주 발효역가 평가 및 균주 선별
모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 대비하여 L-발린의 생산능이 증가된 변이주를 선별하고자 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다. 각각의 콜로니는 영양배지에서 계대 배양된 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 1에 나타내었다.
영양배지 (pH 7.2)
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
| 균주명 | L-발린(g/L) | |
| 대조군 | KCCM11201P | 2.8 |
| 실험군 | A1 | 2.9 |
| A2 | 2.5 | |
| A3 | 3.5 | |
| A4 | 3.0 | |
| A5 | 1.5 | |
| A6 | 1.2 | |
| A7 | 4.2 | |
| A8 | 3.9 | |
| A9 | 2.8 | |
| A10 | 2.4 | |
| A11 | 3.1 | |
| A12 | 3.3 | |
| A13 | 3.8 | |
| A14 | 2.7 | |
| A15 | 2.9 |
대조군인 KCCM11201P 균주에 비하여 발린 생산량이 가장 많이 증가한 A7균주를 선별하였다(표 1 참고).
실시예 2. 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인
발린 생산능이 증가된 상기 A7 균주의 주요 유전자들을 시퀀싱하여 KCCM11201P 균주 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 야생형 균주와 비교하였다. 그 결과, 상기 A7 균주가 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A, RamA)의 프로모터 위치에 변이를 포함하고 있음을 확인하였다.
구체적으로, A7 균주는 상기 ramA 유전자의 프로모터 영역(서열번호 1)에서 변이를 포함하는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.
이하 실시예에서는, 상기 ramA 유전자의 프로모터 영역 특정 위치에 삽입된 변이로 인한 효과와, ramA 유전자의 프로모터 개량 및 치환에 의한 RamA 발현 강화가 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산인 발린, 이소류신, 루이신의 생성량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
실시예 3. 변이가 도입된 균주 제작 및 발린 생산능 확인
실시예 3-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주에 프로모터 변이 도입 및 L-발린 생산능 평가
서열번호 2로 표시되는 ramA 유전자 프로모터 변이형 폴리뉴클레오티드를 코리네글루타미쿰 KCCM11201P에 삽입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 A7 균주의 게노믹(genomic) DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하고, 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 150초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였으며, 서열번호 9와 서열번호 10을 이용하여 1114bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편 1"이라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 1을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 상기 변이 도입 단편 1을 포함하는 벡터 pDZ-Pm-ramA를 제조하였다.
| 프라이머 | 염기 서열 | 서열번호 |
| Pm(TATAAT)-F1 | gctctagaTAGGCCGGTTCGGACTCGCCCTGCC | 서열번호 9 |
| Pm(TATAAT)-R1 | gctctagaaacgtgcgcgcagtcatggtgactt | 서열번호 10 |
상기 pDZ-Pm-ramA을 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 9과 서열번호 10을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ramA 업스트림 영역 내(서열번호 1) 프로모터에 변이가 삽입된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P-Pm-ramA이라 명명하였다.
발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P와 KCCM11201P-Pm-ramA의 발린 생성능을 비교하기 위하여 플라스크 평가를 수행하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.
영양배지 (pH 7.2)
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
| 균주 | L-발린 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| KCCM11201P | 2.6 | 2.5 | 2.7 | 2.6 |
| KCCM11201P-Pm-ramA | 3.2 | 3.3 | 3.1 | 3.2 |
그 결과, KCCM11201P-Pm-ramA 균주의 L-발린 생산능은 KCCM11201P 대비 약 23% 증가함을 확인하였다.
실시예 3-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주에서 프로모터의 개량 및 치환된 균주의 제작 및 제작된 균주의 L-발린 생산능 평가
상기 3-1 결과에서 보듯이 ramA 유전자 프로모터 변이에 의해 발린 생산능이 증가되는 것을 확인하여, 추가적으로 ramA 발현을 증가시키고자 서열번호 2의 변이형 프로모터를 기반으로 ramA 프로모터의 개량 또는 치환을 위한 벡터를 제작하였다.
변이가 포함된 벡터를 제작하기 위하여, 5' 말단과 3' 말단에 xbaI 제한효소 부위를 가지도록 표 4의 프라이머 3(서열번호11) 내지 프라이머 10(서열번호18)을 합성하였다.
개량되는 ramA 프로모터는 Pm1, Pm2, Pm3-ramA로 명명하였고, Pm1-ramA 제작을 위하여는 서열번호 11 및 서열번호 13의 프라이머 쌍; 및 서열번호 12 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하였으며, Pm2-ramA 제작을 위하여 서열번호 11 및 서열번호 15의 프라이머 쌍; 및 서열번호 12 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하였다. 또한, Pm3-ramA 제작을 위하여는 서열번호 11 및 서열번호 17의 프라이머 쌍; 및 서열번호 12 및 서열번호 18로 이루어지는 프라이머 쌍을 이용하였다.
상기 각 프라이머를 이용하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]을 수행하였다.
이때, PCR 조건은 변성 95℃도에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 시켜서 수행되었다.
그 다음 상기에서 수득한 PCR 산물을 기 제작된 pDZ-Pm-ramA 벡터를 xbaI 제한효소 처리 후 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 수행하였다. 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 상기 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 최종적으로 pDZ-Pm1-ramA, pDZ-Pm2-ramA, pDZ-Pm3-ramA이라 명명하였다.
| 프라이머 | 염기 서열 | 서열번호 |
| 프라이머 3 | gctcggtacccggggatcctctagataggccggttcggactcgccctgcc | 서열번호11 |
| 프라이머 4 | ttacgccaagcttgcatgctctagaaacgtgcgcgcagtcatggtgactt | 서열번호12 |
| 프라이머 5 | CGA CAA GGG TCC ATT ATA CCA CAC CTT TGG GGG T | 서열번호13 |
| 프라이머 6 | acccccaaaggTgTGgtaTaAtgGacccttgtcg | 서열번호14 |
| 프라이머 7 | TCG ACA AGG GTA CAT TAT ACT TCC CCT TT | 서열번호15 |
| 프라이머 8 | aaaggggaagtaTaAtgtacccttgtcga | 서열번호16 |
| 프라이머 9 | AAG GGT ACA GTG TAC CAC ACC TTT GGG GGT | 서열번호17 |
| 프라이머 10 | acccccaaaggTgTGgtacactgtaccctt | 서열번호18 |
| 프라이머 11 | attcgagctcggtacccggtctagatcaagaaactgcaggtgtgtaccga | 서열번호19 |
| 프라이머 12 | CAT CGG TAG GCT ATG CCG GCG GTA CCT TCA GAT TTC CTC CTG CTT TAC AC | 서열번호20 |
| 프라이머 13 | gtaccgccggcatagcctaccgatg | 서열번호21 |
| 프라이머 14 | AGT GTT TCC TTT CGT TGG GTA CGT A | 서열번호22 |
| 프라이머 15 | tacgtacccaacgaaaggaaacactgtggatacccagcggattaaagatg | 서열번호23 |
| 프라이머 16 | TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AAT CGC GGC GCA GAT CCT CAT CGG TC | 서열번호24 |
또한 이와 별개로, ramA 프로모터를 강한 프로모터인 Pcj7으로 치환하기 위하여, 5' 말단과 3' 말단에 xbaI 제한효소 부위를 가지도록 표 4의 프라이머 11(서열번호 19) 내지 프라이머 16(서열번호 24)을 합성하였다.
서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍; 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 쌍을 이용하여 위의 변이벡터 제작(실시예 3-1)과 같은 방법으로 pDZ-Pcj7-ramA 벡터를 제작하였다.
상기 pDZ-Pm1-ramA, pDZ-Pm2-ramA, pDZ-Pm3-ramA, pDZ-Pcj7-ramA을 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 9과 서열번호 10의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ramA 프로모터 개량 및 Pcj7 프로모터로 치환된 균주를 확인할 수 있었다.
상기 재조합 균주들 중 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P-Pm1-ramA, KCCM11201P-Pm2-ramA, KCCM11201P-Pm3-ramA를 각각 CA08-1518, CA08-1519, CA08-1520이라 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)에 2020년 4월 27일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM12704P, KCCM12705P, KCCM12706P 를 부여 받았다.
또한, 상기 Pcj7 프로모터로 치환된 균주는 KCCM11201P-Pcj7-ramA로 명명하였다. 이후 상기 3-1과 동일한 방법으로 발린 생산능 평가를 하였고, 결과는 하기 표 5와 같다.
| 균주 | L-발린 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| KCCM11201P | 2.6 | 2.5 | 2.7 | 2.6 |
| KCCM11201P-Pm1-ramA(CA08-1518) | 3.2 | 3.4 | 3.3 | 3.3 |
| KCCM11201P-Pm2-ramA(CA08-1519) | 3.1 | 3.2 | 3.3 | 3.2 |
| KCCM11201P-Pm3-ramA(CA08-1520) | 3.2 | 3.0 | 3.1 | 3.1 |
| KCCM11201P-Pcj7-ramA | 2.9 | 3.1 | 3.0 | 3.0 |
상기 표 5의 결과로서, KCCM11201P 균주보다 개량된 프로모터를 포함하는 KCCM11201P-Pm1-ramA(CA08-1518), KCCM11201P-Pm2-ramA(CA08-1519) 및 KCCM11201P-Pm3-ramA(CA08-1520) 균주의 경우 각각 약 27%, 23%, 19% L-발린 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 KCCM11201P-Pcj7-ramA 균주와 동등 또는 그 이상의 L-발린 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
또한, KCCM11201P-Pm1-ramA의 개량된 프로모터를 포함하는 경우에는, KCCM11201P-Pm2-ramA 균주보다도 약 4% 증가된 L-발린 생산 증가율을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예3-3: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V 균주에서
ramA
유전자 프로모터 개량 및 치환된 균주의 제작 및 제작된 균주의 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-발린 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머 쌍; 및 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 단편 A, B 모두 537bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 서열번호 25와 서열번호 26를 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하여 1044bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편 2"라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 2를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.
| 프라이머 | 염기 서열 | 서열번호 |
| 프라이머 17 | aatttctagaggcagaccctattctatgaagg | 서열번호 25 |
| 프라이머 18 | agtgtttcggtctttacagacacgagggac | 서열번호 26 |
| 프라이머 19 | gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact | 서열번호 27 |
| 프라이머 20 | aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg | 서열번호 28 |
이후, 상기 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 25와 서열번호 26를 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 삽입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다.
마지막으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 상기 실시예 3-1, 3-2 와 같은 방법으로 각각의 벡터들을 형질전환시킨 균주를 제작하고 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V-Pm1-ramA, CJ7V-Pm2-ramA, CJ7V-Pm3-ramA 및 CJ7V-Pcj7-ramA이라 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 7에 나타내었다.
| 균주 | L-발린 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| CJ7V | 2.2 | 2.2 | 2.3 | 2.2 |
| CJ7V-Pm1-ramA | 2.8 | 2.7 | 2.7 | 2.7 |
| CJ7V-Pm2-ramA | 2.6 | 2.6 | 2.7 | 2.6 |
| CJ7V-Pm3-ramA | 2.6 | 2.4 | 2.5 | 2.5 |
| CJ7V-Pcj7-ramA | 2.4 | 2.5 | 2.6 | 2.5 |
상기 표 7에서 볼 수 있듯이, 개량된 프로모터를 포함하는 CJ7V-Pm1-ramA, CJ7V-Pm2-ramA 및 CJ7V-Pm3-ramA 균주의 경우 각각 약 23%, 18%, 14% L-발린 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 균주인 CJ7V-Pcj7-ramA와 동등 또는 그 이상의 L-발린 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
또한, CJ7V-Pm1-ramA 의 개량된 프로모터를 포함하는 경우에는, CJ7V-Pm2-ramA의 변이균주보다도 약 5% 증가된 L-발린 생산 증가율을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 3-4: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V 균주에서
ramA
유전자 프로모터 개량 및 치환된 균주의 제작 및 제작된 균주의 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-발린 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-3와 같은 방법으로 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이[ilvN(A42V)]를 도입하여 L-발린 생산능을 갖게된 변이주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.
마지막으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 상기 실시예 3-1, 3-2 와 같은 방법으로 각각의 벡터들을 형질전환시킨 균주를 제작하고 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V-Pm1-ramA, CJ8V-Pm2-ramA, CJ8V-Pm3-ramA 및 CJ8V-Pcj7-ramA이라 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 8에 나타내었다.
| 균주 | L-발린 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| CJ8V | 1.9 | 2.0 | 1.9 | 1.9 |
| CJ8V-Pm1-ramA | 2.3 | 2.3 | 2.3 | 2.3 |
| CJ8V-Pm2-ramA | 2.3 | 2.1 | 2.2 | 2.2 |
| CJ8V-Pm3-ramA | 2.0 | 2.1 | 2.2 | 2.1 |
| CJ8V-Pcj7-ramA | 2.1 | 2.0 | 1.9 | 2.0 |
상기 표 8에서 볼 수 있듯이, CJ8V 균주보다 개량된 프로모터를 포함하는 CJ8V-Pm1-ramA, CJ8V-Pm2-ramA 및 CJ8V-Pm3-ramA 균주의 경우 각각 약 21%, 16%, 10% L-발린 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 CJ8V-Pcj7-ramA 균주와 동등 또는 그 이상의 L-발린 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
또한, CJ8V-Pm1-ramA의 개량된 프로모터를 포함하는 경우에는, CJ8V-Pm2-ramA의 변이균주보다도 약 5% 증가된 L-발린 생산 증가율을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 4. L-루이신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P, KCCM11662P 균주에서 프로모터 변이 도입주 제작 및 L-루이신 생산능 평가
상기 pDZ-Pm1-ramA, pDZ-Pm2-ramA, pDZ-Pm3-ramA, pDZ-Pcj7-ramA을 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P, KCCM11662P 에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호9과 서열번호10를 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ramA 프로모터 개량 및 Pcj7 치환된 균주를 확인하였고, 상기 재조합 균주들을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P-Pm1-ramA, KCCM11661P Pm2-ramA, K KCCM11661P-Pm3-ramA, KCCM11661P -Pcj7-ramA 및 KCCM11662P-Pm1-ramA, KCCM11662P Pm2-ramA, K KCCM11662P-Pm3-ramA, KCCM11662P -Pcj7-ramA 이라 명명하였다.
제작된 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 루이신 생산능을 비교하였다.
각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-루이신의 농도를 분석하였고, 분석한 L-루이신의 농도를 하기 표 9에 나타내었다.
<영양배지 (pH 7.2)>
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 50 g, 황산암모늄 20 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 20 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 탄산칼슘 15 g (증류수 1리터 기준)
| 균주 | L-루이신 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| KCCM11661P | 2.8 | 2.6 | 2.7 | 2.7 |
| KCCM11661P-Pm1-ramA | 3.2 | 2.9 | 2.8 | 3.0 |
| KCCM11661P Pm2-ramA | 3.0 | 2.8 | 2.9 | 2.9 |
| KCCM11661P-Pm3-ramA | 3.1 | 3.1 | 3.0 | 3.0 |
| KCCM11661P -Pcj7-ramA | 3.2 | 3.1 | 3.1 | 3.1 |
| KCCM11662P | 3.0 | 3.1 | 2.9 | 3.0 |
| KCCM11662P-Pm1-ramA | 3.3 | 3.3 | 3.5 | 3.3 |
| KCCM11662P Pm2-ramA | 3.3 | 3.2 | 3.2 | 3.2 |
| KCCM11662P-Pm3-ramA | 3.2 | 3.5 | 3.3 | 3.3 |
| KCCM11662P -Pcj7-ramA | 3.4 | 3.4 | 3.3 | 3.3 |
그 결과, 개량된 프로모터를 포함하는 KCCM11661P-Pm1-ramA, KCCM11661P Pm2-ramA, KCCM11661P-Pm3-ramA균주는 KCCM11661P보다 각각 11%, 7%, 11% L-루이신 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 KCCM11661P -Pcj7-ramA 균주와 유사한 수준의 L-루이신 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
또한, 개량된 프로모터를 포함하는 KCCM11662P-Pm1-ramA, KCCM11662P Pm2-ramA, KCCM11662P-Pm3-ramA 균주는 KCCM11662P 보다 각각 10%, 6%, 10% L-루이신 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 KCCM11662P -Pcj7-ramA 균주와 유사한 수준의 L-루이신 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
실시예 5. L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서
ramA
유전자 프로모터 개량 및 치환된 균주 제작 및 L-이소류신 생산능 평가
L-이소류신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-이소류신 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, L-이소류신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에 상기 실시예 3-1, 3-2 와 같은 방법으로 각각의 벡터들을 형질전환시킨 균주를 제작하고 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P-Pm-ramA, KCCM11248P-Pm1-ramA, KCCM11248P-Pm2-ramA, KCCM11248P-Pm3-ramA 및 KCCM11248P-Pcj7-ramA이라 명명하였다. 상기 KCCM11248P-Pm-ramA, KCCM11248P-Pm1-ramA, KCCM11248P-Pm2-ramA, KCCM11248P-Pm3-ramA 및 KCCM11248P-Pcj7-ramA균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 이소류신 생산능을 평가하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종 배지(pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 50 g, (NH4)2SO4 12.5 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양종료 후 HPLC를 이용하여 L-이소류신의 농도를 측정하였고, 측정한 L-이소류신 농도는 하기 표 10과 같다.
| 균주 | L-이소류신 (g/L) | |||
| 배치 1 | 배치 2 | 배치 3 | 평균 | |
| KCCM11248P | 1.6 | 1.3 | 1.4 | 1.43 |
| KCCM11248P-Pm1-ramA | 2.0 | 1.8 | 2.2 | 2.00 |
| KCCM11248P-Pm2-ramA | 1.8 | 2.0 | 1.9 | 1.90 |
| KCCM11248P-Pm3-ramA | 1.7 | 1.8 | 1.6 | 1.70 |
| KCCM11248P-Pcj7-ramA | 1.8 | 1.8 | 1.7 | 1.76 |
그 결과, 개량된 프로모터를 포함하는 KCCM11248P-Pm1-ramA, KCCM11248P-Pm2-ramA, KCCM11248P-Pm3-ramA 균주는 KCCM11248P 보다 각각 39%, 32%, 18% L-이소류신 생산 증가율을 확인할 수 있었으며, 강한 프로모터로 치환된 KCCM11248P-Pcj7-ramA 균주와 유사 또는 그 이상의 수준의 L-이소류신 생산능을 보임을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> A MICROORGANISM HAVING ENHANCED BRANCHED-CHAIN AMINO ACID
PRODUCING ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING BRANCHED-CHAIN AMINO
ACID USING THE SAME
<130> KPA191226-KR
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter
<400> 1
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta cactgtaccc ttgtc 55
<210> 2
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter variant
<400> 2
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta taatgtaccc ttgtcgaatg 60
attgttactc gtgacgcgcc ctatgggtgt accagcacgg gtgtaaagca ggaggaaatc 120
tgaag 125
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter variant Pm1
<400> 3
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggtgtggta taatggaccc ttgtc 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter variant Pm2
<400> 4
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta taatggaccc ttgtc 55
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter variant Pm3
<400> 5
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggtgtggta cactggaccc ttgtc 55
<210> 6
<211> 512
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene promoter variant Pcj7
<400> 6
gcgatccgcc tcgactatgt tcacccccaa aggggaagta cactgtaccc ttgtcgaatg 60
attgttactc gtgacgcgcc ctatgggtgt accagcacgg gtgtaaagca ggaggaaatc 120
tgaaggtacc gccggcatag cctaccgatg tagattccac cccatctgtc tcccagtaca 180
ttttttcatg accccagaaa catcccagcg ctactaatag ggagcgttga ccttccttcc 240
acggaccggt aatcggagtg cctaaaaccg catgcggctt aggctccaag ataggttctg 300
cgcggccggg taatgcatct tctttagcaa caagttgagg ggtaggtgca aataagaacg 360
acatagaaat cgtctccttt ctgtttttaa tcaacataca ccaccaccta aaaattcccc 420
gaccagcaag ttcacagtat tcgggcacaa tatcgttgcc aaaatattgt ttcggaatat 480
catgggatac gtacccaacg aaaggaaaca ct 512
<210> 7
<211> 846
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene ATCC14067
<400> 7
gtggataccc agcggattaa agatgacgaa gatgctattc gttcggcgct gacatcgctg 60
aaaaccgcaa caggcatccc agtcaccatg ttcgccactg tgttgcagga caatcgcctg 120
caaattactc agtgggttgg gttgcgtacc ccggctctgc agaatctggt cattgaacca 180
ggtgtgggcg ttggtggacg cgtcgtcgca acccgtcgtc cggttggtgt gagtgattac 240
accagggcaa atgtcatttc acatgagaag gattccgcga ttcaggatga gggccttcat 300
tccattgtcg cagttcccgt gatcgtgcac cgcgaaatcc gtggcgtttt gtatgttggc 360
gttcactctg cggtgcgtct cggcgacact gttattgaag aagtcaccat gactgcgcgc 420
acgttggaac aaaacctggc gatcaactcc gcgcttcgcc gcaatggcgt tcctgatggt 480
cgcggttccc tcaaagctag ccgcgtgatg aatggggcgg agtgggagca ggttcgttcc 540
actcattcca agctgcgcat gctggcaaat cgtgtgaccg atgaggatct gcgccgcgat 600
ttggaagagc tttgcgatca gatggtcacc ccagtccgca tcaagcagac caccaagctg 660
tccgcgcgtg agttggacgt gctggcttgt gtcgcgctcg gtcacaccaa cgtcgaagct 720
gctgaagaga tgggcatcgg cgcggaaacc gtcaagagct acctgcgctc ggtcatgcgc 780
aagctcggcg cccacacgcg ctacgaggca gtcaacgcag cacgccggat cggcgcactg 840
ccttaa 846
<210> 8
<211> 281
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RamA gene ATCC14067 a.a.
<400> 8
Met Asp Thr Gln Arg Ile Lys Asp Asp Glu Asp Ala Ile Arg Ser Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ser Leu Lys Thr Ala Thr Gly Ile Pro Val Thr Met Phe Ala
20 25 30
Thr Val Leu Gln Asp Asn Arg Leu Gln Ile Thr Gln Trp Val Gly Leu
35 40 45
Arg Thr Pro Ala Leu Gln Asn Leu Val Ile Glu Pro Gly Val Gly Val
50 55 60
Gly Gly Arg Val Val Ala Thr Arg Arg Pro Val Gly Val Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Thr Arg Ala Asn Val Ile Ser His Glu Lys Asp Ser Ala Ile Gln Asp
85 90 95
Glu Gly Leu His Ser Ile Val Ala Val Pro Val Ile Val His Arg Glu
100 105 110
Ile Arg Gly Val Leu Tyr Val Gly Val His Ser Ala Val Arg Leu Gly
115 120 125
Asp Thr Val Ile Glu Glu Val Thr Met Thr Ala Arg Thr Leu Glu Gln
130 135 140
Asn Leu Ala Ile Asn Ser Ala Leu Arg Arg Asn Gly Val Pro Asp Gly
145 150 155 160
Arg Gly Ser Leu Lys Ala Ser Arg Val Met Asn Gly Ala Glu Trp Glu
165 170 175
Gln Val Arg Ser Thr His Ser Lys Leu Arg Met Leu Ala Asn Arg Val
180 185 190
Thr Asp Glu Asp Leu Arg Arg Asp Leu Glu Glu Leu Cys Asp Gln Met
195 200 205
Val Thr Pro Val Arg Ile Lys Gln Thr Thr Lys Leu Ser Ala Arg Glu
210 215 220
Leu Asp Val Leu Ala Cys Val Ala Leu Gly His Thr Asn Val Glu Ala
225 230 235 240
Ala Glu Glu Met Gly Ile Gly Ala Glu Thr Val Lys Ser Tyr Leu Arg
245 250 255
Ser Val Met Arg Lys Leu Gly Ala His Thr Arg Tyr Glu Ala Val Asn
260 265 270
Ala Ala Arg Arg Ile Gly Ala Leu Pro
275 280
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gctctagata ggccggttcg gactcgccct gcc 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gctctagaaa cgtgcgcgca gtcatggtga ctt 33
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gctcggtacc cggggatcct ctagataggc cggttcggac tcgccctgcc 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttacgccaag cttgcatgct ctagaaacgt gcgcgcagtc atggtgactt 50
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
cgacaagggt ccattatacc acacctttgg gggt 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
acccccaaag gtgtggtata atggaccctt gtcg 34
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
tcgacaaggg tacattatac ttccccttt 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
aaaggggaag tataatgtac ccttgtcga 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
aagggtacag tgtaccacac ctttgggggt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
acccccaaag gtgtggtaca ctgtaccctt 30
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
attcgagctc ggtacccggt ctagatcaag aaactgcagg tgtgtaccga 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
catcggtagg ctatgccggc ggtaccttca gatttcctcc tgctttacac 50
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
gtaccgccgg catagcctac cgatg 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
agtgtttcct ttcgttgggt acgta 25
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
tacgtaccca acgaaaggaa acactgtgga tacccagcgg attaaagatg 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
tgcatgcctg caggtcgact ctagaatcgc ggcgcagatc ctcatcggtc 50
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32
Claims (15)
- 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)의 활성이 강화된, 루이신 또는 이소류신 생산 미생물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성 강화는 유전자 발현 조절 서열에 변이를 도입; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입 또는 이들의 조합에 의하여 달성되는 것인, 미생물.
- 제 2항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 프로모터인 것인, 미생물.
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 다른 뉴클레오티드로의 치환을 포함하는 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 초산 대사 조절자 A(regulators of acetate metabolism A)의 활성이 강화된, L-분지쇄 아미노산 생산 미생물.
- 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환; 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환되거나 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 미생물.
- 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 3 내지 5 중 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인, 미생물.
- 제 4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 것인, 미생물.
- 제 7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함하는, 미생물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 것인, 미생물.
- 제 4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기의 배지 또는 미생물로부터 회수 또는 분리하는 단계를 추가로 포함하는, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 및 제 9항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 루이신 또는 이소류신을 생산하는 방법.
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째, 36번째, 37번째, 41번째 및 43번째 뉴클레오티드 중 선택되는 어느 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 다른 뉴클레오티드로의 치환을 포함하는, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 34번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 36번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 37번째 뉴클레오티드가 G로 치환; 41번째 뉴클레오티드가 T로 치환; 43번째 뉴클레오티드가 A로 치환되거나 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
- 제 13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 3 내지 5 중 선택되는 어느 하나의 클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
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Non-Patent Citations (3)
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| Ann Lab Med., 2020 Jan;40(1):15-20. * |
| Applied Microbiology and Biotechnology volume 102, pages5901-5910(2018) * |
| Scientific Reports, volume 8, Article number: 3632, pp. 1-18(2018. 2. 26. 공개)* * |
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