JPH11137254A

JPH11137254A - バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法

Info

Publication number: JPH11137254A
Application number: JP9306155A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Hashiguchi; 賢一橋口; Kenzo Yokozeki; 健三横関
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 1999-05-25
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: JP3873408B2

Abstract

(57)【要約】【課題】エシェリヒア属細菌を用いて、枯草菌由来の
トランスグルタミナーゼを活性を有する形態で製造する
方法を提供する。【解決手段】バチルス属細菌由来のトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保持するエシェリヒア
属細菌を培養し、該細菌の対数増殖が鈍化した時期から
該細菌の生育が定常期に達する時期の間に前記トランス
グルタミナーゼ遺伝子の発現を誘導する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トランスグルタミ
ナーゼの製造法に関し、詳しくは、遺伝子組換え技術を
利用してバチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ
をエシェリヒア属細菌を用いて製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼ（以下、「Ｔ
Ｇ」という）は、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基の
γ−カルボキサミド基を基質とし、アシル転移反応を触
媒する酵素である。該反応において、ペプチド鎖内のリ
ジン残基のε−アミノ基がアシル受容体となるときは、
ペプチド分子内あるいは分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−
Ｌｙｓ架橋結合（以下、「ＧＬ結合」と略する）が形成
する。水がアシル受容体となるときは、グルタミン残基
に脱アミド反応が生じ、グルタミン残基がグルタミン酸
残基になる。

【０００３】ＴＧを利用することにより、種々の架橋高
分子化物を製造することができ、そのようにして製造さ
れた架橋高分子化物は、豆腐、プリン、ヨーグルト、チ
ーズ、摺り身、練製品、ソーセージ等の畜肉製品等の食
品、化粧料等として用いられる。

【０００４】従来、ＴＧは多くの動物組織に存在するこ
とが知られていた。例えば、モルモットの肝臓（Connel
lan et al., Journal of Biological Chemistry 246巻1
093〜1098頁(1971)）に存在し、研究されている。ま
た、微生物のＴＧについては、放線菌、枯草菌（M.V.Ra
manujam et al., FASEB J.4巻A2321）、粘菌（J.D.klei
n et al., J.Bacteriol.174巻2599〜2605頁）で報告さ
れている。産業的には放線菌の生産するＴＧが実用化さ
れている（特公平6-65280号公報、特開平1-27471号公
報）が、放線菌は一般の細菌に比べて生育速度が遅いた
め、培養時間が長くなり、それゆえ生産コストの増大を
招く。

【０００５】一方、枯草菌由来のＴＧを産業に応用する
場合、従来知られている枯草菌由来のＴＧが５ｍＭのＣ
a²⁺によって阻害されるので実際の食品系では使用でき
ないという問題があったが、５ｍＭのＣa²⁺存在下で活
性を示すＴＧを産生する枯草菌が見い出され、枯草菌由
来のＴＧの産業上での応用が可能となっている（特開平
9-131180号）。また、この枯草菌由来のＴＧ遺伝子を用
い、遺伝子組換え技術を利用してＴＧを製造する技術も
開発されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、エシェリヒア
属細菌等に枯草菌由来のＴＧ遺伝子を導入し、該遺伝子
を発現させてＴＧを生産させようとする場合、ＴＧタン
パク質が会合し、封入体（inclusion body）を形成する
場合が多い。この封入体から活性を有するＴＧを得るた
めには、封入体の可溶化、ＴＧタンパク質の巻き戻しと
いう操作が必要となるが、枯草菌由来のＴＧタンパク質
の封入体から活性を有するＴＧタンパク質を得ることは
困難である。また、枯草菌由来のＴＧを活性を有する形
態で十分な量生産させることは、成功するには至ってい
なかった。

【０００７】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、エシェリヒア属細菌を用いて、枯草菌由来のＴＧを
活性を有する形態で製造する方法を提供することを課題
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、バチルス属細菌
由来のＴＧ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を培養
してＴＧを生産させる際に、ＴＧ遺伝子の発現を特定の
培養期に誘導することによって、ＴＧを活性を有する形
態で効率よく生産させることができることを見出し、本
発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、バチルス属細菌由来の
ＴＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保持するエシェリヒア属
細菌を培養し、該遺伝子を発現させることによりＴＧを
製造する方法において、前記エシェリヒア属細菌の対数
増殖が鈍化した時期から該細菌の生育が定常期に達する
時期の間に前記ＴＧ遺伝子の発現を誘導することを特徴
とする方法である。

【００１０】本発明は、好ましい態様として、上記方法
において、エシェリヒア属細菌細胞中にＴＧが蓄積され
ることを特徴とする方法を提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１２】＜１＞本発明に用いるＴＧ遺伝子本発明に用いるバチルス属細菌由来のＴＧ遺伝子は、バ
チルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡを含み、か
つ、エシェリヒア属細菌細胞内で所望の培養期にＴＧの
発現を誘導することが可能な遺伝子である。このような
ＴＧ遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内で発現誘導が
可能なプロモーターに、バチルス属細菌由来のＴＧをコ
ードするＤＮＡを連結することにより得られる。

【００１３】ＴＧをコードするＤＮＡが由来するバチル
ス属細菌としては、ＴＧを産生するバチルス属細菌であ
れば特に制限されないが、具体的にはバチルス・ズブチ
リス、（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォ
ルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バ
チルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ス
フェリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ポリ
ミキサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・アルカロフ
ィラス（Bacillusalcalophilus）等が挙げられる。

【００１４】これらの中では、バチルス・ズブチリスが
好ましく、特にバチルス・ズブチリス AJ12866及びAJ13
07が好ましい。バチルス・ズブチリス AJ12866 は通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（以下、「生
命研」と略する）に、１９９５年２月２日付けで寄託さ
れており、その寄託番号は FERM P-14750 である。ま
た、バチルス・ズブチリス AJ12866 は、１９９５年１
２月４日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託に移管
されており、その国際寄託番号は FERM BP-5325であ
る。バチルス・ズブチリス AJ1307 は生命研に、１９
９５年８月２２日付けで寄託されており、その寄託番号
は FERM P-15123 である。また、バチルス・ズブチリス
AJ1307 は、１９９６年１月１８日付けでブタペスト条
約に基づく国際寄託に移管されており、その国際寄託番
号は FERM BP-5367 である。

【００１５】上記にようなバチルス属細菌から、ＴＧを
コードするＤＮＡを取得する方法について説明する（特
開平9-131180号参照）。はじめに、精製されたＴＧのア
ミノ酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta C
hem. Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を
決定することができる。またApplied Biosystems社製の
シークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することが
できる。

【００１６】明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、
これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮ
Ａの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンある
いはバチルス属細菌の遺伝子中でもっとも頻繁に用いら
れるコドンを採用する。

【００１７】演繹された塩基配列に基づいて、３０〜５
０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を
合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)
に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシ
ンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該Ｄ
ＮＡ分子は、バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡ全長を、バチルス属細菌染色体遺伝子ライブラリー
から単離する際に、プローブとして利用できる。あるい
は、バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡをＰ
ＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。
ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはバチルス
属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡ全長を含んでいな
いことがあるので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡ
をプローブとして用いて、バチルス属細菌由来のＴＧを
コードするＤＮＡ全長をバチルス属細菌染色体遺伝子ラ
イブラリーから単離することが好ましい。

【００１８】ＰＣＲ法の操作については、White, T.J.
et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されて
いる。バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを調製する方法に
ついては、Molecular Biological Methods for Bacillu
s, John Wiley & Sons Ltd (1990)等に記載されてい
る。バチルス属などの細菌染色体遺伝子ライブラリーを
作成する方法については、Molecular Biological Metho
ds for Bacillus, JohnWiley & Sons Ltd (1990)等に記
載されている。ＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺
伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する
方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Co
ld Spring Harbor press (1989)等に記載されている。

【００１９】単離されたＴＧをコードするＤＮＡの塩基
配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecul
ar Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載さ
れている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシー
クエンサーを用いて、塩基配列を決定することができ
る。

【００２０】バチルス属細菌由来のＴＧをコードするＤ
ＮＡの一つを配列表配列番号１に示す。該ＤＮＡはバチ
ルス・ズブチリス AJ1307 株の染色体ＤＮＡから単離さ
れたものである。バチルス属細菌由来のＴＧをコードす
るＤＮＡは、配列表配列番号１に示されるＤＮＡだけで
はない。すなわち、バチルス属に属する細菌の種及び株
ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからであ
る。

【００２１】また、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡから
単離されたＴＧをコードするＤＮＡに人工的に変異（例
えばコードされるＴＧが１若しくは２以上のアミノ酸残
基の置換、欠失、挿入又は付加を含み、かつＴＧ活性が
維持されるような変異）を加えて、塩基配列を変更する
ことができる。人工的に変異を加える方法として頻繁に
用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154 (198
7)に記載されている部位特異的変異導入法がある。

【００２２】バチルス・ズブチリス AJ1307 由来のＴＧ
をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得
られる組み換えＤＮＡ（pBSTG75-11）を細胞内に有する
エシェリヒア・コリ AJ13172 は生命研に、１９９５年
１２月２０日付けで、ブタペスト条約に基づいて国際寄
託されており、その国際寄託番号は FERM BP-5346であ
る。pBSTG75-11は、pUC18にバチルス・ズブチリス AJ13
07由来のＴＧをコードする配列を含む約２ｋｂのＤＮＡ
断片が挿入されたプラスミドであり、ＴＧをコードする
ＤＮＡがlacZ'（β−ガラクトシダーゼのＮ末端側の一
部分をコードする配列）の下流に接続されており、lac
プロモーター制御下でＴＧのＮ末端側に１１アミノ酸残
基からなるペプチドが付加された融合タンパクを発現す
るようにデザインされている（特開平9-131180号参
照）。pBSTG75-11をHindIII及びBamHIで消化すると、Ｔ
ＧをコードするＤＮＡ配列が得られる。

【００２３】ＴＧをコードするＤＮＡを発現させるプロ
モーターとしては、通常大腸菌における異種タンパク質
生産に用いられるプロモーターであって、任意の培養期
に発現誘導可能なプロモーターであれば使用することが
でき、例えば、trcプロモーター、trpプロモーター、ta
cプロモーター、PLプロモーター、lacプロモーター等の
強力なプロモーターが挙げられる。

【００２４】ＴＧ遺伝子を大腸菌に導入するためのベク
ターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好まし
く、Col E1由来の複製開始点を有するプラスミド、例え
ばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミド、あるい
はその誘導体が挙げられる。また、形質転換体を選別す
るために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマ
ーカーを有することが好ましい。このようなプラスミド
として、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販
されている（pTrc99A（ファルマシア製）、pUC系（宝酒
造（株）製）、pPROK系（クロンテック製）、pKK233-2
（クロンテック製）ほか）。

【００２５】ＴＧ遺伝子の下流には、転写終結配列であ
るターミネーターを連結してもよい。ターミネーターと
しては、T7ターミネーター、fdファージターミネータ
ー、T4ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子の
ターミネーター、大腸菌trpA遺伝子のターミネーター等
が挙げられる。

【００２６】上記ベクターに、プロモーター、バチルス
属細菌由来のＴＧをコードするＤＮＡ、必要に応じてタ
ーミネーターの順に連結したＤＮＡ断片が挿入されたプ
ラスミドで大腸菌を形質転換することにより、バチルス
属細菌由来のＴＧ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌
が得られる。尚、上記のベクターには、ＴＧをコードす
るＤＮＡを発現させるのに好適なプロモーターを含んで
いるものがあり、そのようなベクターを用い、ベクター
に含まれるプロモーターに下流にバチルス属細菌由来の
ＴＧをコードするＤＮＡを連結する場合には、別途プロ
モーターをベクターに挿入する必要はない。

【００２７】ＴＧ遺伝子を含むベクターをエシェリヒア
属細菌に導入するには、D.M.Morrisonの方法（Methods
in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を
塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）
等、通常のエシェリヒア属細菌の形質転換に用いられる
方法により行うことができる。

【００２８】本発明に用いるエシェリヒア属細菌として
は、エシェリヒア・コリ等、エシェリヒア属に属する微
生物であれば特に制限されないが、具体的にはナイトハ
ルトらの著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia co
li and Salmonella Typhimurium,American Society for
Microbiology,Washington D.C.,1208, table 1）に挙
げられるものが利用できる。たとえば、エシェリヒア・
コリ JM109 株や、MC1061 株などがあげられる。

【００２９】上記のようにして得られるＴＧ遺伝子を保
持するエシェリヒア属細菌を培養するのに用いる培地と
しては、実施例で述べる2×YT培地（Bctotrypton 1.6
%、Yest extract 1.0%、NaCl 0.5%）の他、M9-カザミノ
酸培地、LB培地などの通常大腸菌を培養するのに用いる
培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件
は、用いたベクターのマーカー、宿主菌等の種類に応じ
て適宜選択する。

【００３０】本発明においては、バチルス属細菌由来の
ＴＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保持するエシェリヒア属
細菌を培養する際に、該エシェリヒア属細菌の対数増殖
が鈍化した時期から該細菌の生育が定常期に達する時期
の間にＴＧ遺伝子の発現を誘導する。対数増殖が鈍化す
る時期よりも前にＴＧ遺伝子の発現を誘導すると、ＴＧ
の生産量が低いか、あるいは生産量が高くても大半のＴ
Ｇが封入体を形成し、活性を有するＴＧはわずかしか産
生されないが、対数増殖が鈍化した時期から定常期に達
する時期の間にＴＧ遺伝子の発現を誘導すると、ＴＧの
一部は封入体を形成したとしても、活性を有するＴＧが
細胞内に著量蓄積する。

【００３１】対数増殖が鈍化する時期あるいは定常期に
達する時期は、使用するエシェリヒア属細菌、ベクタ
ー、プロモーター及び培地の種類、並びに培養条件等に
よって異なるが、設定した条件で予備的に培養を行い、
経時的に生菌数又は吸光度を測定し、グラフにプロット
して生育曲線を作成することによって、容易に調べるこ
とができる。また、特に好ましい誘導時期は、経時的に
菌体抽出液のＴＧ活性を測定することにより知ることが
できる。さらに、誘導をかけた後の培養時間も、同様に
して適宜設定すればよい。

【００３２】生産されたバチルス属細菌由来のＴＧは、
エシェリヒア属細菌の菌体を溶解又は破砕し、溶菌液又
は破砕液から不溶性画分を除去すれば、粗酵素液として
得ることができる。さらに、必要に応じて、通常の沈
澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりＴ
Ｇを精製して用いることも可能である。この場合、ＴＧ
に対する抗体を利用した精製法も利用できる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。

【００３４】＜１＞枯草菌由来ＴＧのエシェリヒア・コ
リでの直接発現系の構築（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製バチルス・ズブチリス AJ1307株の染色体ＤＮＡ１μｇ
をHindIIIで完全に消化した。エタノール沈澱によって
ＤＮＡを回収した後、１０μｌの１０：１ＴＥに溶解し
た。このうちの５μｌと、HindIIIで消化されてさらにB
APによる脱リン酸化処理を受けたpUC118（宝酒造製）１
ngとを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を
用いて連結反応を行った。エシェリヒア・コリJM109株
のコンピテント・セル（宝酒造製）１００μｌとライゲ
ーション反応液３μｌとを混合して、エシェリヒア・コ
リJM109株を形質転換した。これを適当な固形培地に塗
布し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。

【００３５】（２）プローブの作製プローブには、ＴＧ遺伝子を含む枯草菌染色体DNAのHin
dIII断片をpUC118にクローニングしたプラスミド(pBSTG
75-11)（特開平9-131180号公報実施例10参照）に含まれ
ているＴＧ遺伝子の全長を用いた。pBSTG75-11に含まれ
ているＴＧをコードする配列は、配列表配列番号１にお
いて塩基番号118〜1042に相当する。尚、pBSTG75-11に
よって形質転換されたエシェリヒア・コリJM109株（AJ1
3172）は生命研に、１９９５年１２月２０日付けで、FE
RM BP-5346の寄託番号で、ブタペスト条約に基づいて国
際寄託されている。

【００３６】pBSTG75-11を鋳型にして、Primer S2（配
列番号２）及びPrimer S3（配列番号３）を用いてPCR反
応を行った。PCR反応は、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2に従
って行った。

【００３７】鋳型であるpBSTG75-11を10ng、Primer S2
及びPrimer S3を各20pmol含む100μlの反応液を調製し
て反応を行った。なお、Primer S2はＴＧ遺伝子の配列
番号１の塩基配列１１８番目から１５２番目の３５塩基
に相補するプライマー、PrimerS3はＴＧ遺伝子の配列番
号１の塩基配列８１８番目から８５２番目の３５塩基に
相補するプライマーである。PCRの反応は以下の条件で
３０サイクル行った。

【００３８】９４℃ ３０秒５５℃ ３０秒７２℃ １分

【００３９】上記の反応で増幅されたＤＮＡ断片を１％
アガロースゲル（Seaplaque GTG、FMC社製）電気泳動に
より分離した。目的のバンドを切り出し、EasyPrep Sys
tem（ファルマシア社製）とPCR Products Prep Kit（フ
ァルマシア社製）を用いてＤＮＡを精製した。最終的に
4ng/μlのＤＮＡ溶液200μlを得た。

【００４０】このＤＮＡ断片を³²Ｐで標識し、プローブ
とした。［α-³²P］dCTP 3000Ci/mmol（アマシャム社
製）とRandom Primer DNA Labeling Kit Ver.2（宝酒造
社製）を用いて説明書通りにプローブの標識を行った。

【００４１】（３）コロニーハイブリダイゼーションコロニーハイブリダイゼーションの操作は、Molecular
Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (19
89)に記載されている方法に準拠して行った。

【００４２】染色体ＤＮＡライブラリーのコロニーをナ
イロンメンブレンフィルター（Hybond-N、アマシャム社
製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行
った。ハイブリダイゼーションはRapid-hyb buffer（ア
マシャム社製）を用いて行った。フィルターを該バッフ
ァー中に浸し、65℃で４時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。その後、上記で作製した標識プローブを添
加し、65℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。
この後、フィルターを0.1%SDSを含む２×SSCで室温、２
０分間洗浄した。さらに0.1%SDSを含む0.1×SSCで65
℃、15分間洗浄を２回行った。その結果、プローブとハ
イブリダイズするコロニーを５株確認できた。

【００４３】（４）ＴＧ遺伝子のＤＮＡシーケンス選抜した形質転換体が保有するプラスミドの一つ（pBST
G3-1と命名した）をMolecular Cloning, 2nd edition,
Cold Spring Harbor press (1989)に記載される方法に
従って調製し、pUC118に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配
列を決定した。シーケンス反応は、 Dye Terminator Cyc
le Sequencing Kit（ABI社製）を用いて説明書に従って
行った。また、電気泳動は、DNA Sequencer 373（ABI社
製）を用いて行った。その結果、配列表配列番号１に示
した塩基配列を有することを確認した。

【００４４】（５）ＴＧ直接発現プラスミドの構築上記のようにして得られたプラスミドpBSTG3-1から、枯
草菌由来ＴＧ遺伝子を含むHindIII-BamHI断片をpHSG399
にサブクローニングし、pHSG9TGを作製した（図１）。p
HSG399は、lacプロモーターの制御下で発現するlacZ'を
有しており、その直下にHindIII部位及びBamHI部位が存
在する。

【００４５】枯草菌由来ＴＧ遺伝子中、Ｎ末端メチオニ
ンのコドン直前の塩基配列を、配列番号４に示す塩基配
列を有する合成オリゴヌクレオチド［NDE2］を用いて、
部位特異的変異導入法により２塩基置換し、Ｎ末端メチ
オニンのコドンの部分にNdeI部位を導入した（図１、pH
SG9TG(Nde)）。これにより、得られたプラスミドを制限
酵素NdeIで消化することによって、Ｎ末端メチオニンの
コドンの直前のＴ（チミン）の上流に、任意の塩基配列
を接続することを可能にした。

【００４６】次いで、配列番号５及び６に示す塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチド［SD1F及びSD1R］をア
ニールして得られるＤＮＡ断片を、HindIII及びNdeIで
消化したpHSG9TG(Nde)と連結し、pHSG9TG(Nde)のHindII
I-NdeI断片を前記の合成DNA断片で置き換えることによ
って、lacプロモーター制御下で枯草菌由来ＴＧを直接
発現出来る発現系を構築した（図２、pHSD1TG）。前記
の合成ＤＮＡ断片（以下、5'フランキング領域」とい
う）は、両端にHindIII切断配列及びNdeI切断配列を有
し、内部にlacZ'の3'末端側の一部と、ＳＤ（Shine-Dal
garno）配列とを有している。pHSD1TGにおいて、合成Ｄ
ＮＡ断片中のlacZ'の3'末端側の一部は、pHSG399由来の
lacプロモーターに続くlacZ'の5'末端側に接続してお
り、lacプロモーターの制御下で、lacZ'及びＴＧ遺伝子
を発現させることができる。尚、lacZ'のコード配列と
ＴＧ遺伝子との間には、lacZ'と同一フレームの終止コ
ドン、及びＳＤ配列が存在し、ＴＧは融合タンパク質と
してではなく、単独で発現するように設計されている。

【００４７】＜２＞枯草菌由来ＴＧのエシェリヒア・コ
リでの直接発現上記で構築したpHSD1TGから、枯草菌由来ＴＧ遺伝子
（5'フランキング領域を含む）を含むHindIII-BamHI断
片を切り出し、これをHindIII及びBamHIで消化したpUC1
9に連結することによって、pUSD1TGを構築した（図
２）。

【００４８】pUSD1TGでエシェリヒア・コリ JM109株を
形質転換し、得られた形質転換株をアンピシリン100μg
/mlを含む2×YT培地（Bctotrypton 1.6%、Yest extract
1.0%、NaCl 0.5%）にて37℃、一夜培養した。この培養
液１mlを、0.2%カザミノ酸とアンピシリン100μg/mlと
を含む2×YT培地100mlに接種して、37℃にて振盪培養し
た。培地の波長660nmの吸光度が0.4〜0.5に達した時点
（対数増殖期中期(midlog phase)）で、1mM IPTG（イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を培地に
添加してlacプロモーターの発現を誘導し、更に６時
間、37℃にて振盪培養した。この段階で菌体を顕微鏡観
察すると、菌体内に封入体が形成されていた。ベクター
（pUC19）のみの保持株では封入体の形成は観察されな
かった。

【００４９】集菌後、0.85% NaClにて菌体を洗浄し、Ｓ
bufer（20mM Tris-HCl、5mM EDTA、30mM NaCl、pH 8）
に懸濁し、更に0.2mg/ml リゾチームを加えて氷上で１
時間処理した後、超音波破砕した。破砕液を10,000×g
で10分遠心分離し、沈殿を0.5% Triton X-100 を含むＳ
bufferにて２回洗浄し、10mM EDTA (pH8) 溶液に懸濁
して、封入体の画分とした。

【００５０】得られた封入体をSDS-PAGEに供したとこ
ろ、その分子量は、特開平9-131180号公報に開示されて
いる枯草菌由来ＴＧの分子量（約28,000〜約30,000）と
一致した。また、封入体を8M 尿素にて溶解後、尿素濃
度が2.5Mになる様に希釈し、その遠心上清をPVDF膜にし
みこませ、20%メタノールにて１時間洗浄後、Applied B
iosystems社製プロテインシーケンサーにて、封入体を
形成した蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。その
結果、封入体を形成した蛋白質のＮ末端アミノ酸10残基
は、特開平9-131180号公報に開示されている枯草菌由来
ＴＧのＮ末端アミノ酸配列と一致した。以上のことか
ら、pUSD1TGにて枯草菌由来ＴＧが直接発現されている
ことが確認された。

【００５１】＜３＞発現誘導時期の変更によるＴＧ活性
体蓄積量の増大 pUSD1TG上の枯草菌由来ＴＧ遺伝子を、pTrc99A（Pharma
cia Co. より購入）に載せかえ、枯草菌由来ＴＧがtrc
プロモーター制御下で発現可能なプラスミドpTcSD1TGを
作製した（図３）。すなわち、pUSD1TGをNheIで消化し
た後、切断末端を平滑化し、さらにBamHIで消化して得
られるＴＧ遺伝子断片（5'フランキング領域を含む）
を、BamHI及びSmaIで消化したpTrc99Aに連結した。pTrc
99Aは、trcプロモーターを有しており、その直下にSmaI
部位及びBamHI部位が存在する。

【００５２】pTcSD1TGでエシェリヒア・コリ JM109 株
を形質転換し、得られた形質転換株をアンピシリン100
μg/mlを含む2×YT培地（Bctotrypton 1.6%、Yest extr
act 1.0%、NaCl 0.5%）にて37℃、一夜培養後、培養液
１mlを0.2%カザミノ酸とアンピシリン100μg/mlとを含
む2×YT培地100mlに接種して37℃にて振盪培養した。培
養液の波長660nmの吸光度が0.4〜0.5に達した時点（対
数増殖期中期）、または波長660nmの吸光度が3.2〜4.0
に達した時点（対数増殖が鈍化した時点）で、1mMIPTG
を培地に添加して発現を誘導し、更に37℃にて振盪培養
した。

【００５３】集菌後、菌体を0.85% NaClにて洗浄し、Ｋ
buffer (50mM TrisHCl、10mM EDTA、2mM DTT、pH7.5)
に懸濁し、0.2mg/mlリゾチームと0.02mg/ml DNase Iを
加えて37℃、40分処理後、15mM MgSO₄を加えて37℃で更
に15分処理し、50mM NaHCO₃(pH10)を加え、1M NaOHにて
pHを10.2に調整した後、37℃で更に30分処理した。この
処理液を12,000×gで30分遠心分離し、上清中の枯草菌
由来ＴＧ活性を、特開平9-131180号公報に記載された方
法に従って、¹⁴Cラベルされたプトレッシンのジメチル
カゼインへの取込活性として測定した。菌体の湿重量
（WCW(Wet cellweight)）当たりのＴＧ活性及び培養液
0.1ml当たりのＴＧ活性を図４に示す。

【００５４】図４に示されるように、対数増殖が鈍化し
てから誘導をかけた場合の方が、対数増殖期中期で誘導
をかけた場合に比べて、培養液当たりで約4.5倍、湿重
量当たりで約2.6倍高いＴＧ活性が得られた。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌を用
いて、枯草菌由来のＴＧを活性を有する形態で製造する
ことができる。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1042 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ハ゛チルスス゛フ゛チリス (Bacillus subtilis) 株名： AJ 1307 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：118..855 特徴を決定した方法：配列 CTGCTTAAAA AGTTTTAAAA TAAAAAATGG AAGAAGTTCT TTTTGGCAGT CTTCTGTCTT 60 TTTAGCTTTC ATTGCCCAAG CTCTTTGCAT ATCTTATATA AACAAGGGGG GCTAAAC 117 ATG ATT ATT GTA TCA GGA CAA TTG CTC CGT CCC CAG GAT ATT GAA AAT 165 Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Leu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Glu Asn 1 5 10 15 TGG CAG ATT GAT CAA AAT CTG AAT CCG CTG TTA AAA GAG ATG ATT GAG 213 Trp Gln Ile Asp Gln Asn Leu Asn Pro Leu Leu Lys Glu Met Ile Glu 20 25 30 ACG CCT GTT CAG TTT GAT TAT CAT TCA ATT GCT GAA CTG ATG TTT GAG 261 Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ala Glu Leu Met Phe Glu 35 40 45 CTT AAA CTG CGG ATG AAT ATT GTA GCA GCG GCA AAG ACG CTG CAC AAA 309 Leu Lys Leu Arg Met Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Lys 50 55 60 AGC GGG GCG AAG TTT GCC ACT TTT TTA AAA ACA TAC GGG AAT ACA ACG 357 Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr 65 70 75 80 TAT TGG AGG GTT TCA CCG GAG GGC GCC TTG GAG CTG AAA TAC AGA ATG 405 Tyr Trp Arg Val Ser Pro Glu Gly Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Met 85 90 95 CCG CCT TCA AAA GCG ATT CGG GAC ATT GCA GAG AAC GGC CCG TTT TAT 453 Pro Pro Ser Lys Ala Ile Arg Asp Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr 100 105 110 GCG TTT GAA TGC GCA ACC GCA ATC GTT ATC ATT TAT TAC TTG GCC TTA 501 Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Leu Ala Leu 115 120 125 ATC GAT ACA ATC GGT GAA GAT AAA TTC AAT GCC AGC TTT GAC AGA ATT 549 Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile 130 135 140 ATT TTA TAT GAC TGG CAT TAT GAG AAA TTG CCG ATC TAT ACG GAA ACA 597 Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Thr 145 150 155 160 GGA CAC CAC TTT TTC CTT GGA GAT TGT TTG TAT TTT AAG AAT CCT GAA 645 Gly His His Phe Phe Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu 165 170 175 TTT GAT CCG CAA AAG GCG CAA TGG AGA GGC GAA AAT GTG ATT TTA CTG 693 Phe Asp Pro Gln Lys Ala Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu 180 185 190 GGG GAA GAT AAA TAT TTT GCC CAT GGT CTT GGA ATC TTA AAC GGA AAG 741 Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Ala His Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys 195 200 205 CAA ATT ATA GAT AAG CTG AAT TCT TTT AGG AAA AAA GGA GCC TTA CAG 789 Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Ser Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln 210 215 220 TCA GCC TAC CTT CTG TCT CAG GCG ACC AGA CTG GAT GTT CCG TCT CTT 837 Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu 225 230 235 240 TTC CGC ATC GTC CGC TAAAAAGCCC CATCGCCTAT TTTCGGGACG ATGGGGTTTC 892 Phe Arg Ile Val Arg 245 AAATGCCTTT CGTTTTCGAT AGAAGGGGGC TGTGCCGAAA TATTGGTTCG CAGCCCACTC 952 CATTTTTTCA AGGTCATTTC TTGTCACGAT TGGATCCTGG CTGCTCCATT TGATAAAGCG 1012 GACAAAATAG TAGCCTTTGA TAGGAACCAT 1042

【００５７】配列番号：２配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル：Ｎｏ配列 ATGATTATTG TATCAGGACA ATTGCTCCGT CCCCA 35

【００５８】配列番号：３配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル：Ｎｏ配列 GCGGACGATG CGGAAAAGAG ACGGAACATC CAGTC 35

【００５９】配列番号：４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル：Ｎｏ配列 ATACAATAAT CATATGTAGC CCC 23

【００６０】配列番号：５配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル：Ｎｏ配列 AGCTTCGAAG CTAGCTAAAA CTTTAAGAAG GAGATATCA 39

【００６１】配列番号：６配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル：Ｎｏ配列 TATGATATCT CCTTCTTAAA GTTTTAGCTA GCTTCGA 37

【図面の簡単な説明】

【図１】 NdeI部位を導入した枯草菌由来ＴＧ遺伝子を
含むプラスミドpHSG9TG(Nde)の構築過程を示す図。

【図２】枯草菌由来ＴＧ遺伝子を直接発現するプラス
ミドpHSD1TG及びpUSD1TGの構築過程を示す図。

【図３】 trcプロモーターにより枯草菌由来ＴＧ遺伝
子を直接発現するプラスミドpTcSD1TGの構築過程を示す
図。

【図４】エシェリヒア・コリJM109（pTcSD1TG）の菌
体中のＴＧ活性を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス属細菌由来のトランスグルタミ
ナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保持するエシェリヒア
属細菌を培養し、該遺伝子を発現させることによりトラ
ンスグルタミナーゼを製造する方法において、前記エシ
ェリヒア属細菌の対数増殖が鈍化した時期から該細菌の
生育が定常期に達する時期の間に前記トランスグルタミ
ナーゼ遺伝子の発現を誘導することを特徴とする方法。
【請求項２】エシェリヒア属細菌細胞中にトランスグ
ルタミナーゼが蓄積されることを特徴とする請求項１記
載の方法。