JPH085920B2

JPH085920B2 - 抗ヒトストロムライシンモノクローナル抗体及び酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPH085920B2
Application number: JP3078155A
Authority: JP
Inventors: 保典岡田; 正由新名; 太郎早川; 和士岩田; 優美香林; 修嗣小玉; 真一吉田
Original assignee: 富士薬品工業株式会社
Priority date: 1991-01-21
Filing date: 1991-01-21
Publication date: 1996-01-24
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: DE69225169T2; DE69225169D1; US5834212A; WO1992013096A1; EP0522169B1; EP0522169A4; JPH04237499A; EP0522169A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、抗ヒトストロムライシンモノク
ローナル抗体、及びそのモノクローナル抗体を用いた酵
素免疫測定法ならびに該測定法に基づき、検体中に存在
するヒトストロムライシンを潜在型ヒトストロムライシ
ンの量及び活性型ヒトストロムライシンの量の総和とし
て定量し、それによって、慢性関節リウマチ疾患を診断
することができる方法に関する。

【０００２】

【背景技術】ストロムライシンは、プロテオグリカナー
ゼあるいはＭＭＰ−３（マトリックス・メタロプロティ
ナーゼ−３）とも呼ばれ、各種のサイトカインあるいは
各種の増殖因子などで刺激された線維芽細胞や腫瘍細胞
で産生される物質である。生体内では、慢性関節リウマ
チ疾患患者の関節局所で産生されるほか、血液中あるい
は関節液中に存在する。

【０００３】ヒトストロムライシンは、関節軟骨の重要
な細胞外マトリックスであるプロテオグリカン及びＩＸ
型コラーゲンのほか、ゼラチン、ラミニン、ＩＶ型コラ
ーゲンやフィブロネクチンなどを分解することから、慢
性関節リウマチ疾患患者の関節内部の軟骨破壊に重要な
役割を果たすものと考えられている。

【０００４】ストロムライシンは潜在型ストロムライシ
ン（プロストロムライシンともいう）として産生され、
細胞外で活性化されて活性型ストロムライシンへと変換
される。潜在型ストロムライシンをプラスミンやトリプ
シンなどのセリンプロテアーゼで処理すると、ストロム
ライシンは限定分解され、活性型のストロムライシンと
なる。

【０００５】また、潜在型のヒトストロムライシンを４
−アミノフェニル酢酸第二水銀（ＡＰＭＡ）で処理した
場合にも活性型ヒトストロムライシンが生成する。潜在
型ヒトストロムライシンの分子量は５７，０００ダルト
ン（５７ｋＤ）あるは５９，０００（５９ｋＤ）であ
り、５９ｋＤのヒトストロムライシンは５７ｋＤのヒト
ストロムライシンに糖鎖が結合したものである。

【０００６】また、プロテアーゼ消化して得られた活性
型ヒトストロムライシンの分子量は４５ｋＤであるが、
ＡＰＭＡ処理した場合には、得られた活性型ヒトストロ
ムライシンの分子量は４５ｋＤと４６ｋＤであるが、Ａ
ＰＭＡによる処理時間を１２時間以上にすると、さらに
低分子化した２８ｋＤの分子量の活性型ヒトストロムラ
イシンが得られる。

【０００７】従来、慢性関節リウマチ疾患の診断には、
リウマチ因子の検出法に基づいたＲｏｓｅ法、Ｒｏｓｅ
法のＨｅｌｌｅｒによる変法、ＲＡＨＡ−テスト及びＲ
Ａ−テストなどが用いられている。しかし、これらの方
法では血中におけるリウマチ因子の存在は慢性関節リウ
マチ疾患に特異的ではないこと、これまでのリウマチ因
子の測定キットは定量性や再現性に乏しいなどの欠点を
有する。

【０００８】また、赤血球沈降速度（赤沈値）やＣ反応
性蛋白質（ＣＲＰ）の測定は、上記疾患の活動性を知る
ことはできるが、診断には適さないこと、抗核抗体やＬ
Ｅ細胞の検出については、疾患特異性が低く、他の膠原
病疾患でも良く検出されることなどにより、正確に慢性
関節リウマチ疾患を診断することは困難である。また、
ヒアルロン酸を定量する方法も存在するが、その部分
は、検体として関節液のみが用いられるという点で不便
である。

【０００９】ヒトストロムライシンは、種々の関節疾患
のうちでも特に慢性関節リウマチ疾患において、その疾
患患者の関節局所で多量に合成・分泌されていることが
見出された。変形性関節症疾患患者の滑膜表層細胞や関
節軟骨細胞もストロムライシンを合成・分泌している
が、慢性関節リウマチ疾患では、多発性の関節炎を生じ
るのに対し、変形性関節症疾患では、通常、単発性であ
ることから、変形性関節症疾患患者の血中あるいは関節
液中のストロムライシン量には健常人の場合に比べて著
明な増加は認められない。

【００１０】現在までのところ、上記のような関節破壊
の指標となる生化学的マーカーは全く見出されていない
ため、本発明は慢性関節リウマチの診断に関して、特に
有意義である。

【００１１】

【発明の開示】本発明は、ハイブリドーマによるＩｇＧ
クラスの抗ヒトストロムライシンモノクローナル抗体な
らびにその製造方法、及び上記モノクローナル抗体を用
いるサンドイッチ法に基づくヒトストロムライシンの酵
素免疫測定法及びその測定法により慢性関節リウマチ疾
患患者の血液その他の検体中のストロムライシン量を定
量し、その定量値を健常人の相当する検体中のストロム
ライシンの定量値と比較することに基づき慢性関節リウ
マチ疾患を診断する方法を提供するものである。

【００１２】すなわち、本発明は、（１）潜在型ヒトストロムライシン及び活性型ヒトスト
ロムライシンと特異的に免疫反応し、かつ、ヒトコラゲ
ナーゼおよびヒトゼラチナーゼと免疫反応しない抗ヒト
ストロムライシンモノクローナル抗体。（２）上記（１）記載の潜在型ヒトストロムライシン及
び活性型ヒトストロムライシンと特異的に免疫反応し、
かつ、ヒトコラゲナーゼおよびヒトゼラチナーゼど免疫
反応しない抗ヒトストロムライシンモノクローナル抗体
の中から２種の異なったモノクローナル抗体を選択し、
この２種の組み合せを用いて、その２種のうちのいずれ
か一方を酵素標識用抗体として使用し、他の一方を固相
担体結合用抗体として使用して、サンドイッチ法によ
り、検体中のヒトストロムライシンを潜在型ヒトストロ
ムライシンの量と活性型ヒトストロムライシンの量の総
和として定量することを特徴とするヒトストロムライシ
ンの酵素免疫測定法。（３）上記（２）に記載の酵素免疫測定法により、ヒト
血液あるいはヒト関節液を検体として、その検体中に存
在するヒトストロムライシンについて、それを潜在型ヒ
トストロムライシンの量と活性型ヒトストロムライシン
の量の総和として定量するヒトストロムライシンの酵素
免疫測定法。（４）上記の酵素免疫測定法により測定された定量値を
健常人の相当する検体の定量値と比較することに基づ
き、慢性関節リウマチ疾患を診断するために使用する上
記（２）および上記（３）に記載の酵素免疫測定法。

【００１３】本発明において用いられる上記の酵素免疫
測定法は、後掲の実施例により説明されるところから理
解されようが、たとえば、酵素免疫測定法としては、第
一抗体固相法、二抗体法、エミット法（Ｅｎｚｙｍｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅ；ＥＭＩＴ）、エンザイムチャンネリン
グイムノアッセイ法、酵素活性修飾物質イムノアッセイ
法及びリポソーム膜−酵素イムノアッセイ法などの競合
法や、あるいは、サンドイッチ法、イムノエンザイムメ
トリックアッセイ法、酵素活性増強イムノアッセイ法及
びプロキシマールリンケージイムノアッセイ法などの非
競合法の通常の各種酵素免疫学的測定方法の中から任意
に選択し、これを行うことができる。

【００１４】上記の測定法においては、固相担体として
は、抗原や抗体を受動的に良く吸着するポリスチレン
製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製、あるいは
ポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティッ
ク、試験管などの種々の材料を使用することができ、ま
た、その形態も任意に適切なものを選択し、使用するこ
とができる。

【００１５】用いられる標識用酵素の例としては、ペル
オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼあるいはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼなどがあげられ、また、それらの
酵素活性を測定する手段としては、比色法、蛍光法、生
物発光法あるいは化学発光法などを選択し、随時これら
の酵素及び酵素活性測定法を採択して、適宜組み合わせ
て使用することにより測定を行うことができる。

【００１６】一方、酵素標識を付与する抗体としては、
抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファセルの
如き陰イオン交換ゲルにより精製したＩｇＧ画分、さら
には、ペプシン消化後、還元して得られる特異的結合部
分Ｆａｂ′を用いることもできる。

【００１７】以下、実施例により、本発明によるモノク
ローナル抗体ならびにその製造方法及び該モノクローナ
ル抗体を使用してヒトストロムライシンを酵素免疫学的
に測定する方法、さらには、その測定方法を用いて慢性
関節リウマチ疾患を診断する方法について具体的に説明
する。ただし、本発明はこれらの例示に限定されるもの
ではない。

【００１８】〔実施例１〕抗ヒトストロムライシンモノ
クローナル抗体の作製（ａ）抗原−ヒトプロストロムライシンの調製Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４，７３１〜７４１（１９８
８）に記載の本発明者らによる方法に従い、慢性関節リ
ウマチ疾患患者の滑膜細胞をダルベッコ変法イーグル培
地（日水製薬製）で培養した。すなわち、関節形成術を
行った慢性関節リウマチ患者の滑膜組織を細切し、酵素
学的に滑膜細胞を遊離させた後、２０％ウシ胎児血清、
ペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ変
法イーグル培地中で培養した。

【００１９】上記文献記載に準拠して初代培養して得ら
れた細胞を、次に、ウサギ・マクロファージで処理した
無血清培地でさらに培養し、５〜７日目にその培養液を
回収した。得られた培養液をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ム（Ｗｈａｔｍａｎ製）、グリーンＡダイマトレックス
カラム（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐ．製）、ゼラチンセフ
ァロースカラム、コンカナバリンＡセファロースカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）及び抗コラゲナーゼ抗体結合
アフィニティカラムで処理した後、最後にウルトロゲル
ＡｃＡ４４カラム（ＬＫＢ製）を用いてヒトプロストロ
ムライシンを精製した。

【００２０】得られた精製ヒトプロストロムライシンを
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したところ、分子量約５
７ｋＤの単一バンドを示した。この精製ヒトプロストロ
ムライシンは、上記処理においてコンカナバリンＡセフ
ァロースカラムを用いて得られたものであるため、糖鎖
が結合している５９ｋＤのプロストロムライシンを含ん
でいない。

【００２１】（ｂ）抗体産生細胞の調製６週令のＢａｌｂ／ｃ雌マウス２匹にまずフロインド完
全アジュバンドを用いて、前記（ａ）項で記述した精製
ヒトプロストロムライシンで初回免疫した。すなわち、
それぞれのマウスに１５μｇのヒトプロストロムライシ
ンを０．２ｍｌの溶液として腹腔内投与した。その後、
１７日目に１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
に溶解した１５μｇのヒトプロストロムライシンを追加
免疫した。最終免疫として５４日目に静脈内投与〔１
６．５μｇ／マウス；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解〕により補助免疫し、３日後にマ
ウス脾臓を取り出し、脾臓細胞を調製した。

【００２２】（ｃ）細胞融合（１）以下の材料及び方法を用いる。ＲＰＭＩ１６
４０培地：ＲＰＭＩＮｏ．１６４０（ＦｌｏｗＬａ
ｂ．製）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピルビン酸
ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム（５０Ｕ
／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）
及び硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を加え、ドラ
イアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレ
ンフィルターで除菌濾過する。

【００２３】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ１６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ製）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように
加える。

【００２４】ＰＥＧ４，０００溶液：ＲＰＭＩ１６
４０培地のポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ
４，０００、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．製）５０％（ｗ
／ｗ）無血清溶液を調製する。

【００２５】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ
−２（ＳＰ−２／Ｏ・Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅ
ｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ
＆Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
＆Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１〜３７２に
記載の０ｉらの方法に準拠して行った。

【００２６】（２）前記（ｂ）項で調製した有核脾臓
細胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率
１００％）とを５：１の割合で融合する。すなわち脾臓
細胞とミエローマ細胞とを別々に前記ＲＰＭＩ１６４
０培地で洗浄する。次に同じ培地に懸濁し、融合させる
ため上記の割合で混合する。容量５０ｍｌの円錐形スチ
ロール樹脂製試験管（住友ベークライト製）を用い、３
７ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中１，０００ｒｐｍ、
１０分間遠心分離し、上清を完全に吸出する。沈殿した
細胞に３７℃で加温したＰＥＧ４，０００溶液４．５
ｍｌを穏やかに撹拌しながら１分間滴下し、さらに１分
間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。次に３７℃で加
温したＲＰＭＩ１６４０培地４．５ｍｌを１分間で滴
下する。

【００２７】この操作をさらに１回繰り返した後、同培
地３１．７ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下
し、細胞を分散させる。これを１，０００ｒｐｍ、７分
間遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。次に沈澱し
た細胞に、３７℃で加温したＮＳ−１培地４５ｍｌをす
みやかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットで
注意深く分散させる。

【００２８】これを、同培地９１ｍｌの入ったボトルに
加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウェル
（岩城硝子製）にウェル当たり６．０×１０^５個／０．
１ｍｌの細胞を加える。このマイクロウェルを７％炭酸
ガス／９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培
養する。

【００２９】（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖（１）使用する培地は以下のとおりである。ＨＡＴ培
地：前記（ｃ）項で述べたＮＳ−１培地に、さらにヒポ
キサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μ
Ｍ）及びチミジン（１６μＭ）を加える。ＨＴ培地：ア
ミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ培地と同一組
成の培地である。

【００３０】（２）前記（ｃ）項の培養開始後翌日
（１日目）、細胞にピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．
１ｍｌ）を加える。２、３、５及び８日目にそれぞれ培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
え、１０日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換え
る。このとき、ハイブリドーマの充分な生育が観察され
る。ハイブリドーマが生育した全ウェルについて、次項
（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウェルを確認する。

【００３１】次にフィーダーとして１０^７個のマウス胸
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウェル（住友ベークライト製）に加えたものを用い、
上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移
す。これを前記（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガス存
在下、３７℃で５日間培養する。ハイブリドーマの充分
生育した時点でＥＬＩＳＡにより陽性を再確認し、それ
ぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法によるクロー
ニングを行う。なお、クローニングに使用した後の残液
をポリスチレン製２５ｃｍ^２組織培養フラスコ（岩城硝
子製）に移し、凍結保存用試料とする。

【００３２】（ｅ）固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳ
Ａ）による抗ヒトストロムライシン抗体産生ハイブリド
ーマの検索Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法に準拠し
て行う。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検出に適し
ている。９６穴ミクロタイトレーションプレート（Ｆｌ
ｏｗＬａｂ．製）を３０ｎｇ／ウェルのヒトプロスト
ロムライシン（前記（ａ））でコートする。これに前記
（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上清の一
部を加えて室温で約１時間インキュベートする。２次抗
体としてＰＯＤ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｃ
ａｐｐｅｌＬａｂ．製）を加え、さらに室温で約１時
間インキュベートする。次に基質である過酸化水素とｏ
−フェニレンジアミンを加え、マイクロプレートリーダ
ー（ＭＲＰ−Ａ４、東洋ソーダ製）を用いて４９２ｎｍ
の吸光度を測定する。

【００３３】（ｆ）クローニング前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当たりフ
ィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウェルの３６ウェ
ル、３６ウェル及び２４ウェルにウェル当たりそれぞれ
５個、１個及び０．５個のハイブリドーマを加える

【００３４】５日目に全ウェルに約０．１ｍｌのＮＳ−
１培地を追加し、１０日目に培地の半分（０．１ｍｌ）
を新しいＮＳ−１培地で置き換える。クローニング開始
後１４日目でハイブリドーマの充分な生育が認められ、
それらについてＥＬＩＳＡを行った。テストした全ウェ
ルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコロニー数を
確認し、ウェル中に１コロニーが確認されたウェルを１
個選び再クローニングする。最終的にヒトストロムライ
シンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ１
４株が得られた。

【００３５】（ｇ）ハイブリドーマによるモノクロー
ナル抗体の大量産生ハイブリドーマの増殖は常法によって行う。すなわち、
得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な
培養液で培養し、その培養上清から１０〜１００μｇ／
ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。
一方、大量に抗体を得るためには、脾臓細胞とミエロー
マ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃマウス）
にマウス１匹当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ．製）を腹腔内投与す
る。

【００３６】１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１
０^７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後
に４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を
得ることができる。

【００３７】（ｈ）モノクローナル抗体のアイソタイ
プ前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトプロストロムライ
シンをコートしたミクロタイトレーションプレートに、
各モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を
加えた。０．０５％ツイン２０含有ＰＢＳで洗浄した
後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙ
ｍｅｄＬａｂ．製）を加えた。ＰＢＳによる洗浄後、
ＰＯＤ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、
基質として過酸化水素及び２，２’−アジノージ（３−
エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いて検出した。

【００３８】その結果をまとめて後掲の表１に示す。得
られたヒトストロムライシンに対するモノクローナル抗
体のうち、１０個が免疫グロブリン鎖γ１／κを、２個
がγ２ａ／κを、又、２個がγ２ｂ／κを有していた。
又、ヒトストロムライシンとの反応性については、後掲
の（ｊ）項に記載した方法により得られた結果である。

【００３９】（ｉ）モノクローナル抗体の精製前記（ｇ）項で得られた各腹水をアフィゲルプロテイン
ＡＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用い
て精製した。

【００４０】（ｊ）ヒトストロムライシンとモノクロ
ーナル抗体との反応性Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４，７３１〜７４１（１９８
８）に本発明者らが記載しているように、ヒト滑膜細胞
の培養液中には、分子量５９ｋＤと５７ｋＤの潜在型の
ストロムライシンが存在する。しかし、この培養液をＣ
ａ^２＋の存在下で４−アミノフェニル酢酸第二水銀（Ａ
ＰＭＡ）で処理すると、潜在型ストロムライシンは活性
化し、分子量４６ｋＤと４５ｋＤの活性型ストロムライ
シンが得られる。そこで、潜在型ストロムライシンを含
む上記培養液及び活性型ストロムライシンを含むＡＰＭ
Ａ処理した培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

【００４１】次に、ＰＯＤ標識ヤギ抗マウス免疫グロブ
リン（ＣａｐｐｅｌＬａｂ．製）を用いて、細胞工学
１＆２、１０６１〜１０６８（１９８３）に記載の田部
の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、実施
例１（ｉ）項で得られた各モノクローナル抗体と潜在型
ストロムライシン（５９ｋＤ及び５７ｋＤ）との反応
性、及び各モノクローナル抗体と活性型ストロムライシ
ン（４６ｋＤ及び４５ｋＤ）との反応性を検討した。

【００４２】この結果を表１に示す。表１に示すとお
り、１４種類のモノクローナル抗体は、いずれも潜在型
ストロムライシン及び活性型ストロムライシンの全てと
反応することが認められた。一方、培養液中には、潜在
型コラゲナーゼや潜在型ゼラチナーゼも共存するが、上
記のウェスタンブロッティングパターンでは、ストロム
ライシンの分子量に相当する６０ｋＤ及び５７ｋＤのバ
ンドが認められただけで、ヒトコラゲナーゼの分子量に
相当する５５ｋＤ及び５２ｋＤ、また、ヒトゼラチナー
ゼの分子量に相当する７２ｋＤのバンドは検出されなか
った。従って、上記の１４種類のモノクローナル抗体
は、ヒトコラゲナーゼやヒトゼラチナーゼとは反応せ
ず、ストロムライシンと特異的に反応することが認めら
れた。

【００４３】〔実施例２〕抗ヒトストロムライシンモノ
クローナル抗体を用いた免疫組織染色ヒトストロムライシンは、細胞内で産生された後、細胞
内に貯蔵されることなく、細胞外に持続的に分泌され
る。そこで、どのような細胞でヒトストロムライシンが
産生されているのかを知る目的で、ヒトストロムライシ
ンを産生する細胞内に蓄積させるために、モネンシン
（２μＭ）の存在下で慢性関節リウマチ疾患患者の滑膜
組織を３時間培養した。

【００４４】上記組織を、ペリオデイト−リジン−パラ
ホルムアルデヒド固定し、パラフィン切片を作製した。
脱パラフィンしたこれらの切片中の内因性ペルオキシダ
ーゼを過酸化水素でブロックした後、実施例１の（ｉ）
項で得られた抗ヒトストロムライシンモノクローナル抗
体（ＩｇＧ）と反応させた。つぎに、その切片をＰＢＳ
で充分洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）と反応させた後、さらにアビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼコンプレックス（ＶｅｃｔｏｒＬａｂ．
製）と反応させた。

【００４５】上記のようにして得られた切片をＰＢＳで
洗浄した後、基質としてジアミノベンチジン及び過酸化
水素を用いて発色させた。抗ヒトストロムライシンモノ
クローナル抗体としてＩｇＧ（クローン５５−２Ａ４）
及びＩｇＧ（クローン５５−３Ｇ３）を用いたときの免
疫組織染色では、いずれも、ヒトストロムライシンは、
慢性関節リウマチ疾患患者の滑膜表層細胞に陽性に染色
された。従って、クローン５５−２Ａ４及びクローン５
５−３Ｇ３は、いずれも、免疫組織染色に使用できるこ
とが判明した。

【００４６】〔実施例３〕ヒトストロムライシンの定量
法（ａ）酵素標識モノクローナル抗体の調製（１）Ｆａｂ′画分の調製実施例１（ｉ）項で得られた各精製モノクローナル抗体
（ＩｇＧ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、上記ＩｇＧに対して２％（ｗ／ｗ）のペ
プシンを加え、３７℃、２４時間消化した。

【００４７】さらにその消化物に、２Ｍトリス溶液を加
えてｐＨを７．０に調整することによって反応を停止さ
せ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを用いたゲル濾過によ
り、Ｆ（ａｂ′）_２画分を分取した。

【００４８】次に、このＦ（ａｂ′）_２画分を５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析し、最終濃度１０ｍＭと
なるようにアミノエタンチオールを加え３７℃で９０分
間還元した後、５ｍＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４
４カラムを用いてゲル濾過し、Ｆａｂ′画分を分取し
た。

【００４９】（２）マレイミド標識ＰＯＤ画分の調製上記（１）項の操作とは別に、以下に述べるようにして
ＰＯＤにマレイミドを標識した。すなわち、ＰＯＤを１
０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、そのＰＯＤに対して、２５倍モル量のＮ
−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド
をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液として加え、３
０℃、３０分間反応させた。これを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−５０
カラムでゲル濾過し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取
した。

【００５０】（３）Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体画分の調
製前記（１）項で調製した画分中のＦａｂ′に対して、上
記（２）項で得られた画分中のマレイミド標識ＰＯＤと
して等モルになるように両画分を混合し、さらにＦａ
ｂ′及びマレイミド標識ＰＯＤの最終濃度が１００μＭ
となるように、５ｍＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）で希釈した。

【００５１】この混合液を４℃、２０時間反応後、Ｆａ
ｂ′の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで未反応の
チオール基をブロックした。これを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．５）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４
カラムを用いてゲル濾過し、Ｆａｂ′−ＰＯＤ複合体画
分を分取後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及
び０．００１％クロルヘキシジンを添加し、４℃で保存
した。

【００５２】（ｂ）モノクローナル抗体結合ボールの
調製Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ４，２０９〜３２７（１
９８３）に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、
実施例１（ｉ）項で得られた精製モノクローナル抗体を
０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、その濃度を１００μｇ／ｍｌ
に調整した。

【００５３】このモノクローナル抗体溶液にポリスチレ
ンボール（径６．５ｍｍ，ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａ
ｓｔｉｃＢａｌｌ製）を浸漬し、４℃に２４時間静置
した。次にモノクローナル抗体溶液を除去した後、０．
１％ＢＳＡ、０．１％塩化ナトリウム及び０．００１％
クロルヘキシジン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で洗浄し、４℃にて保存した。

【００５４】（Ｃ）酵素免疫測定法実施例１（ａ）項で得られた精製ヒトプロストロムライ
シンを、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１％ＢＳＡ含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、１２８０
ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、これを段階希釈した溶液を
各々５０μｌずつとり、標準試料とした。

【００５５】一方、検体試料としては、健常人血清、慢
性関節リウマチ疾患（ＲＡ）患者血清及び変形性関節症
疾患（ＯＡ）患者血清を各々５０μｌ用いた。上記の試
料をそれぞれ試験管にとり、上記（ａ）で調製したＦａ
ｂ′−ＰＯＤ複合体画分（１００ｎｇ／ｍｌ）、０．１
Ｍ塩化ナトリウム及び１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌに溶解した。次
にこれらの各々の試験管に、前記にて調製したモノクロ
ーナル抗体結合ポリスチレンボールを１個ずつ添加し
て、室温で１時間静置した後、５０ｍＭ塩化ナトリウム
含有５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄した。

【００５６】次に、９％ＤＭＦ含有０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）に溶解したＰＯＤ基質、すなわち、０．
０２５％テトラメチルベンチジンを３００μｌずつ加
え、さらに０．００７５％過酸化水素水を３００μｌず
つ加え、室温で３０分間静置した後、１．７５Ｎ硫酸１
４００μｌを添加することにより反応を停止させた。島
津マイクロフロー紫外可視分光光度計（ＵＶ−７３０）
を用いて、反応混合液の波長４５０ｎｍの吸光度を測定
し、標準試料から作成した検量線により、検体試料の吸
光度に相当するヒトストロムライシン濃度を読み取っ
た。

【００５７】ＩｇＧ（クローン５５−３Ｇ３）を固相用
抗体とし、ＩｇＧ（クローン５５−２Ａ４）を標識用抗
体として用いて得られた標準曲線を図１に示す。ただ
し、上記以外のモノクローナル抗体の組み合わせでもヒ
トストロムライシンの定量は可能であるが、上記の組み
合わせで得られた感度が最も高かった。また、表１に示
したように、得られたモノクローナル抗体は、潜在型ス
トロムライシン及び活性型ストロムライシンの両方と反
応性を有している。従って、上記のサンドイッチアッセ
イ系でも検体中の潜在型ストロムライシン及び活性型ス
トロムライシンの両方ともに定量している。

【００５８】一方、実施例１の（ｊ）項に記載したよう
に、固相用抗体及び標識用抗体はいずれもヒトコラゲナ
ーゼやヒトゼラチナーゼと反応しないで、上記のアッセ
イ系においてはストロムライシンのみを特異的に定量し
ている。図１に示されているように、ヒトプロストロム
ライシン標準試料の濃度の上昇に伴って、Ａ_４５０は増
加しており、定量感度は、試料１ｍｌ当たり２０ｎｇ／
ｍｌであった。

【００５９】（ｄ）ＲＡ患者及びＯＡ患者についての
ストロムライシンの定量上記（ｃ）項において示した酵素免疫測定法により、健
常人、ＲＡ患者及びＯＡ患者の血中ストロムライシンを
定量した。すなわち、検体試料として健常人血清（９検
体）、ＲＡ患者血清（１０検体）及びＯＡ患者血清（１
１検体）を各々５０μｌずつ用いて、ストロムライシン
濃度を測定した。その結果、表２にみられるように、健
常人血清中のストロムライシン濃度（平均値±Ｓ．
Ｄ．）は、６５．９±２０．３ｎｇ／ｍｌであった。

【００６０】一方、ＲＡ患者血清中のストロムライシン
濃度（平均±Ｓ．Ｄ．）は７３１．８±３６９．４ｎｇ
／ｍｌであり、この値は健常人血清中のストロムライシ
ン濃度に比し有意に高いことが認められた。一方、ＯＡ
患者血清中のストロムライシン濃度は８４．３±４９．
６ｎｇ／ｍｌであり、健常人血清中のストロムライシン
濃度と有意な差は認められなかった。

【００６１】なお、上記の診断にあたっての検体として
は、血液あるいは関節液のほか、適宜、生体から得られ
るストロムライシン含有試料を用いることができる。そ
の例としては、例えば、ヒト滑膜組織、ヒト軟骨組織あ
るいは、それらの培養液をあげることができる。

【００６２】次に、ＲＡ患者及びＯＡ患者の関節液中ス
トロムライシンを定量した。すなわち、検体試料として
ＲＡ患者関節液（９検体）及びＯＡ患者関節液（１０検
体）について、ストロムライシン濃度を測定した。ただ
し、関節液５０μｌを用いた場合、測定値（Ａ_４５０）
は検量線の範囲を越えるため、予め１０〜１００倍に希
釈した関節液を試料とした。

【００６３】その結果、表３にみられるように、ＲＡ患
者関節液中のストロムライシン濃度（平均±Ｓ．Ｄ．）
は４９２５７±２３２６７ｎｇ／ｍｌであり、この値は
ＯＡ患者関節液中のストロムライシン濃度（１００９７
±６４０ｎｇ／ｍｌ）に比し有意に高かった。

【００６４】

【表１】

【００６５】

【表２】

【００６６】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３の（ｃ）項で得られた標準曲線、すな
わち、ＩｇＧ（クローン５５−３Ｇ３）を固相用抗体と
し、ＩｇＧ（クローン５５−２Ａ４）を標識用抗体とし
て用いた１段階サンドイッチ法におけるヒトプロストロ
ムライシンの標準曲線を示す図である。ラ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者小玉修嗣富山県高岡市長江1868 高岡スカイハイツ 603号 (72)発明者吉田真一富山県富山市中島４丁目13番16号 (56)参考文献ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ, 265［28］（1990）Ｐ．17238−17245 Ｍａｔｒｉｘ，10［５］（1990）Ｐ. 285−291 ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，135［６］（1989）Ｐ．1055−1064

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】潜在型ヒトストロムライシン及び活性型
ヒトストロムライシンと特異的に免疫反応し、かつ、ヒ
トコラゲナーゼおよびヒトゼラチナーゼと免疫反応しな
い抗ヒトストロムライシンモノクローナル抗体。
【請求項２】請求項１記載の潜在型ヒトストロムライ
シン及び活性型ヒトストロムライシンと特異的に免疫反
応し、かつ、ヒトコラゲナーゼおよびヒトゼラチナーゼ
と免疫反応しない抗ヒトストロムライシンモノクローナ
ル抗体の中から２種の異なったモノクローナル抗体を選
択し、この２種の組み合せを用いて、その２種のうちの
いずれか一方を酵素標識用抗体として使用し、他の一方
を固相担体結合用抗体として使用して、サンドイッチ法
により、検体中のヒトストロムライシンを潜在型ヒトス
トロムライシンの量と活性型ヒトストロムライシンの量
の総和として定量することを特徴とするヒトストロムラ
イシンの酵素免疫測定法。
【請求項３】請求項２に記載の酵素免疫測定法によ
り、ヒト血液あるいはヒト関節液を検体として、その検
体中に存在するヒトストロムライシンについて、それを
潜在型ヒトストロムライシンの量と活性型ヒトストロム
ライシンの量の総和として定量するヒトストロムライシ
ンの酵素免疫測定法。
【請求項４】上記の酵素免疫測定法により測定された
定量値を健常人から採取された検体の定量値と比較する
ことに基づき、慢性関節リウマチ疾患を検出するために
使用する請求項２および請求項３に記載の酵素免疫測定
法。