JP2617783B2

JP2617783B2 - 肝臓癌疾患の診断用試薬

Info

Publication number: JP2617783B2
Application number: JP27079788A
Authority: JP
Inventors: 恭一井上; 隆文市田; 幹宮際; 太郎早川; 修嗣小玉; 和士岩田
Original assignee: 富士薬品工業株式会社
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1997-06-04
Anticipated expiration: 2012-06-04
Also published as: JPH0271153A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は肝臓癌疾患の診断のためのヒト体液中のヒト
コラゲナーゼインヒビターの定量用試薬に関するもので
ある。コラゲナーゼインヒビター（テイシユ・インヒビ
ター・オブ・メタロプロテアーゼ:TIMP）はヒト及びそ
の他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中及
び関節軟骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞、
線維肉腫細胞培養外液中に存在するたん白質である（Mu
rphyら、Biochem.J.195、167〜170、1981;Welgusら、J.
Biol.Chem.258、12259〜12264、1983;Kishiら、J.Bioch
em.96、395〜404、1984等参照）。TIMPは特定のたん白
質であってたん白化学的に単一な物質である。本発明は
ウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナル
抗体のうち、ヒトコラゲナーゼインヒビターとも反応す
るコノクローナル抗体を用いるサンドイツチ法に基づく
酵素免疫学的測定法により、ヒト体液中のヒトコラゲナ
ーゼインヒビターを定量する方法に関するものであり、
そのヒトコラゲナーゼインヒビター量を健常人の血清
中、血漿中あるいは関節液中のヒトコラゲナーゼインヒ
ビター量と比べることにより肝臓癌疾患の診断を行うこ
とができるものである。

〔背景技術〕コラゲナーゼインヒビターは、ヒトおよびその他の動
物の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中及び関節軟
骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞、線維肉腫
細胞培養液中に存在することが知られている。コラゲナ
ーゼインヒビター量を測定する手段としては、従来、そ
の生物活性を測定することによる方法が知られている。
しかし、J.Lab.Clin.Med.75,258〜263（1970）にEisen
らが、また、Arthritis and Rheumatism27,285〜290（1
984）にCawstonらが記載しているように、血清中あるい
は血漿中のコラゲナーゼインヒビター活性を測定するに
は、それらの液中に、その測定を妨害する蛋白質、たと
えば、α_２−マクログロブリンが存在するため、従来知
られている測定方法によっては、その測定は不可能であ
る。早川、岩田らは、先に、ウシコラゲナーゼインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体を用い、サンドイツチ
法に基づく酵素免疫学的測定法（EIA）を行うことによ
り微量の試料で精度良く、簡便かつ迅速にコラゲナーゼ
インヒビターを特異的に定量する方法を開発したが（特
願昭62−42781号）、本発明者らは、ヒト血清中あるい
は血漿中に存在するコラゲナーゼインヒビター量が、肝
臓癌疾患にかかることにより明らかに増加することを発
見し、血清中あるいは血漿中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビターの量を上記の酵素免疫学的測定法により測定
することによって、肝臓癌疾患の診断を行い得ることを
見出した。

〔発明の開示〕

本発明は、上述の如き知見に基づいてなされたもので
あって肝臓癌疾患を診断するためのヒト体液中のヒトコ
ラゲナーゼインヒビターの定量法であって、ウシコラゲ
ナーゼインヒビターに対するモノクローナル抗体で、ヒ
トコラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対
し、特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体の組
合せを用い、その一方を固相用抗体として使用し、他方
を酵素標識用抗体として使用して、サンドイッチ法によ
りヒトの血清中あるいは血漿中に存在するヒトコラゲナ
ーゼインヒビターを酵素免疫学的に定量するための診断
用試薬を提供するものである。

本発明者らは、ウシ歯髄の培養外液から精製したコラ
ゲナーゼインヒビターを含む溶液をBalb/cマウスの腹腔
内に投与することにより免疫した後、そのマウスのひ臓
細胞を分離した。そのひ臓細胞と８−アザグアニン耐性
ミエローマ細胞NS−１とを5:1の割合で混合し、50％ポ
リエチレングリコール4000中で融合させることによりハ
イブリドーマを得た。ポリスチレン製96穴マイクロウエ
ルに各ウエル当たり6.0×10⁵個となるように得られたハ
イブリドーマを分散した後、HAT培地中で培養した。各
ウエルの培養液中にウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター
に対する抗体が産生されているか否かを固相−抗体結合
テスト法（ELISA）によりチエツクし、それが陽性であ
るウエル中のハイブリドーマを限界希釈法によりクロー
ニングした。その結果、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体を産生する17種類のモ
ノクローンを得、その各モノクローンをBalb/cマウスの
腹腔内に投与することにより、モノクローナル抗体を含
む腹水を得た。その腹水から硫酸アンモニウムによる塩
析分別、DEAE−Sephacelによるイオン交換クロマトグラ
フイーおよびSephacryl S−300 Superfineによるゲルろ
過クロマトグラフイーなどによってモノクローナル抗体
を精製した。上記の如く精製した17種類のモノクローナ
ル抗体いずれもウシコラゲナーゼインヒビターと特異的
に交叉したが、それらのなかの４種類のモノクローナル
抗体、すなわち、IgG（クローン７−6C1）、IgG（クロ
ーン７−19F6）、IgG（クローン７−21B12）およびIgG
（クローン７−23G9）がヒトコラゲナーゼインヒビター
とも反応することをウエスタンブロツテイングによって
明らかにした。これら４種類のモノクローナル抗体のう
ち２種類のモノクローナル抗体、すなわち、IgG（クロ
ーン７−23G9）を固相用抗体とし、IgG（クローン７−6
C1）から調製したFab′（クローン７−6C1）−POD複合
体を標識抗体として用いたサンドイッチ法に基づくEIA
を行うことにより、ヒトコラゲナーゼインヒビターを微
量（1.5pg）で、特異的に、精度良く、定量することが
できた。このサンドイッチ法を用いて、健常人血清50検
体中のコラゲナーゼインヒビターを定量したところ、血
清1ml当たり184±30ngのコラゲナーゼインヒビターが存
在することがわかった。一方、原発性肝臓癌患者血清10
0検体中および転移性肝臓癌患者血清３検体中に存在す
るコラゲナーゼインヒビター量は血清1ml当たりそれぞ
れ平均486±316ngおよび1172±712ngであり、これらの
値は健常人血清中に存在するその値に比べて明らかに高
い。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動性肝炎患者
血清45検体および慢性非活動性肝炎患者血清26検体の中
に存在するコラゲナーゼインヒビター量は血清1ml当た
りそれぞれ平均228±163ng、233±88ngおよび166±73ng
であり、健常人血清中に存在するその量と比べて有意の
差は認められなかった。従って、種々の肝臓病患者中で
も肝臓癌患者における血清中での特異的に高いコラゲナ
ーゼインヒビターの量に着目して、患者血清中のコラゲ
ナーゼインヒビター量を測定することにより、その患者
が、肝臓癌患者であるか否かを診断することができるこ
とになることが判った。また、健常人血漿26検体中のコ
ラゲナーゼインヒビターの量は血漿1ml当たり64±10ng
であるのに対し、原発性肝臓癌患者８検体中に存在する
コラゲナーゼインヒビター量は血漿1ml当たり583±447n
gであり、健常人血漿中に存在するその値に比べて明ら
かに高いことが認められた。

ただし、血清中あるいは血漿中に存在するコラゲナー
ゼインヒビター量増加の現象は、肝臓癌患者以外に慢性
関節リウマチ疾患患者についても認められるので、この
血清中のコラゲナーゼインヒビターの測定を、肝機能判
定法であるZTT（硫酸亜鉛混濁反応）、GOT（グルタミン
オギザロ酢酸トランスアミナーゼ）、GPT（グルタミン
ピルビン酸トランスアミナーゼ）、ALP（アルカリ性フ
オスフアターゼ）、LDH（乳酸脱水素酵素）、γ−GTP
（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）、PH（プロリ
ルハイドロキシラーゼ）およびAFP（α−フエトプロテ
イン）などの測定と併用することにより、被測定者の肝
臓癌の罹患の有無を診断することができるのである。

本発明においては上記の酵素免疫学的測定法が用いら
れるが、固相単体として抗原や抗体を受動的に良く吸着
するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピ
レン製、あるいはポリビニール製のボール、マイクロプ
レート、ステイツク、試験管などの種々の材料および使
用形態が任意に選択、使用できる。一方、酵素標識を付
与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、DEAE−
Sephacelの如き陰イオン交換ゲルにより精製したIgG画
分、さらにはペプシン消化後、還元して得られる特異的
結合部分Fab′を用いることもできる。

前述のとおり、本発明は、固相単体に結合させる抗体
および酵素標識を付与する抗体として、コラゲナーゼイ
ンヒビターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合す
る種類のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた酵素
免疫学的測定法に基づいたヒトコラゲナーゼインヒビタ
ーの定量を行い、その結果を、健常人の値と比較するこ
とによって、被測定者が、肝臓癌疾患にかかっているか
否かを診断するものである。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。ただ
し、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナル抗体の
作製（ａ）抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 J.Biochem.96,395〜404（1984）に記載の本発明者ら
の方法に従いウシ未萌出知歯の根部歯髄をイーグルMEM
培地（日水製薬製）で培養した培養外液からCon A−セ
フアロース、ウルトロゲルAcA44およびDE−52セルロー
スの各カラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製
した。精製インヒビターはJ.Mol.Biol.80,579〜599（19
73）に記載のLaemmliらの方法に従いドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）で調べたところ分子量約32,000ダルトン（Ｄ）の単
一バンドを示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製６週令のBalb/c雌マウス２匹をまずフロインド完全ア
ジユバンド中で、前記（ａ）で記述した精製ウシコラゲ
ナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれぞれ
48μｇのウシコラゲナーゼインヒビターを0.4mlの溶液
として腹腔内投与する。さらに30日目に生理食塩水に溶
解した84μｇのウシコラゲナーゼインヒビターを追加免
疫する。最終免疫として58日目に腹腔内投与（95μg/50
0μｌ生理食塩水）により補助免疫し、３日後にマウス
脾臓を取り出し、脾細胞を調製する。

（ｃ）細胞融合（１）以下の材料および方法を用いる。

RPMI1640培地:PRMI No.1640（Difco Laboratories）
に重炭酸ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム
（1mM）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウ
ム（50U/ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、
および硫酸アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライア
イスでpHを7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレンフイルター
で除菌過する。

NS−１培地：上記RPMI1640培地に除菌過した仔牛胎
児血清（M.A.Bioproducts）を15％（v/v）の濃度に加え
る。

PEG4,000溶液:RPMI1640培地のポリエチレングリコー
ル4,000（PEG4,000、Merck＆CO.,Inc.）50％（w/w）無
血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−１（P3−NS
1−１）との融合はSelected Method in Cellular Immun
ology（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freema
n and Company（1980）、351〜372に記載のOiらの方法
を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率10
0％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割
合で融合する。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記
のRPMI1640培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁し、
融合させるため上記の割合で混合する。容量50mlの円錐
形スチロール樹脂製試験管（Iwaki Glass）を用い、40m
lのRPMI1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上清を完全
に吸出する。沈澱細胞に37℃加温PEG4,000溶液1.3mlを
穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹
拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃加温PRMI16
40培地1.3mlを１分間で滴下する。この操作をさらに１
回繰返した後、同培地9mlを２〜３分間で常に撹拌しな
がら滴下し細胞を分散させる。これを400×ｇ、10分間
遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。次にこの沈澱
細胞に37℃加温NS−１培地12.9mlをすみやかに加え、細
胞の大きい塊りを10mlのピペツトを用いて注意深くピペ
ツテイングして分散する。さらに同培地26mlを加えて希
釈し、ポリスチレン製96穴マイクロウエル（Iwaki Glas
s）にウエル当り6.0×10⁵個/0.1mlの細胞を加える。な
お、この時使用する96穴マイクロウエルは前処理として
0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（37℃）
で一晩保温し、使用時に培地を吸引除去しておく。細胞
を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス/93％空
気中で温度37℃、湿度100％下に培養に付する。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖（１）使用する培地は以下のとおりである。

HAT培地：前記（ｃ）で述べたNS−１培地にさらにヒ
ポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μ
Ｍ）、およびチミジン（16μＭ）を加える。

HT培地：アミノプテリンを除去した以外は上記HAT培
地と同一組成のものである。

（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペツトでHAT培地２滴（約0.1ml）を加え
る。２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を
新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新し
いHT培地で置き換える。以降３〜４日毎に培地の半分を
新しいHT培地で置き換える。通常２〜３週間で充分なハ
イブリドーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育
全ウエルについて次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テス
ト法（ELISA）により陽性ウエルをチエツクする。次に
フイーダーとして10⁷個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1
mlをポリスチレン製24穴セルウエル（Iwaki Glass）に
加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイブリド
ーマの全内容物を移す。これを上記（ｃ）におけると同
様に７％炭酸ガス存在下、37℃で約１週間培養に付す
る。その間１〜２回各ウエルの上清0.5mlを新しいHT培
地0.5mlと交換する。ハイブリドーマの充分生育した時
点でELISA法により陽性を再確認し、それぞれについて
次項（ｆ）記載の限界希釈法によるクローニングを行
う。なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン
製25cm²組織培養フラスコ（Iwaki Glass）に移し、凍結
保存用試料を調製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗ウシコ
ラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブリドーマの検索 Anal.Biochem.104,205〜214（1980）に記載のRennard
らの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハ
イブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタイ
トレーシヨンプレート（Flow Laboratories,Inc.）を0.
5〜1.0μｇのウシコラゲナーゼインヒビターでコート
し、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミン（BS
A）でブロツクする。これに前記（ｄ）で得られたハイ
ブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１
時間インキユベートする。２次抗体として西洋わさびペ
ロキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（capp
el Lab.）を加え、さらに室温で約１時間インキユベー
トする。次に過酸化水素と基質である−フエニレンジ
アミンを加え生成した褐色の程度を肉眼で定性的に判定
するか、あるいはコロナ２波長マイクロプレート光度計
（MTP−22、コロナ電気社）を用いて500nmの吸光度を測
定する。

（ｆ）クローニング前記（ｄ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。NS−１培地ml当りフイーダ
ーとして10⁷個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培
地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエル
および24ウエルにウエル当り５個、１個および0.5個の
ハイブリドーマを加える。５日目、12日目に全ウエルに
各約0.1mlのNS−１培地を追加する。クローニング開始
後14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、
コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群についてEL
ISA法を行う。テストした全ウエルが陽性でない場合、
抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１
コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再クローニ
ングする。最終的にウシコラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ17株が得ら
れた。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、
モノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをNS
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は10〜100μg/mlである）。一方、大量
に抗体を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動
物と同系の動物（Balb/c、マウス）に腫瘍形成促進剤プ
リスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Ald
rich Chemical社）をマウス一匹当たり0.5ml腹腔内投与
し、１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×10⁷個を同
じく腹腔内投与することにより、生体内で、さらに、１
〜２週間後、４〜7mg/mlのモノクローナル抗体を含む腹
水を得ることができる。

（ｈ）モノクローナル抗体のアイソタイプ前記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナ
ーゼインヒビターをコートしたミクロタイトレーシヨン
プレートに前述したELISA法に従って結合させる。PBSに
よる洗浄後次に、アイソタイプ特異的ウサギ抗マストIg
抗体（Zymed Laboratories）を加える。PBSによる洗浄
後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG
（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として2,2′−アジノージ
（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化
水素を用いて検出した。その結果をまとめて後掲の第１
表に示した。得られたウシコラゲナーゼインヒビターに
対するモノクローナル抗体の内15個が免疫グロブリン鎖
γ1/κを、１個がγ2a/κを、そして、１個がγ2b/κを
有していた。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（40％飽和）
後、塩化ナトリウム0.06Mを含む40mMリン酸緩衝液、pH
8.0で平衡化したDEAE−Sephacel（pharmacia社）の非吸
着画分を分取し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリウ
ムを含む50mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化したSephacr
yl S−300Superfine（Pharmacia社）カラムでゲル過
し、培地中のFCSおよびマウス由来のたん白質を分離、
除去した。

実施例２ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターとモノクローナル抗
体との交叉性（ａ）酵素標識モノクローナル抗体（Fab′−POD複合
体）の調製法（１）Fab′画分の調製実施例１（ｉ）で得られたIgG画分を0.1M塩化ナトリ
ウム含有0.1M酢酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、その溶液
を以下述べるようにしてペプシンで消化した。すなわ
ち、前記画分中のIgGに対して２％（w/w）のペプシンを
加え、37℃、24時間消化した。更にその消化物に2Mトリ
ス溶液を加えてpH7.0を調整することにより消化反応を
停止させ、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したウ
ルトロゲルAcA44カラム（LKB製）を用いたゲル過によ
りＦ（ab′）_２画分を分取した。

次に、このＦ（ab′）_２画分をエチレンジアミン四酢
酸（EDTA）含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）中で透析
し、終濃度10mMとなるようにアミノエタンチオール（ME
A）を加えて37℃で1.5時間還元した後、5mM EDTA含有0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したウルトロゲルAcA
44カラムを用いてゲル過し、Fab′画分を分取した。

（２）マレイミド標識POD画分の調製上記（１）の操作とは別に、以下述べるようにして西
洋わさび由来ペルオキシダーゼ（POD）にマレイミドを
標識した。すなわち、PODを10mg/mlの量で0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶解し、そのPODに対して、25倍モル量
のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イ
ミド（EMCS）をジメチルホルムマミド溶液として加え、
30℃、30分間反応させた。これを0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.0）で平衡化したセフアデツクスＧ−50カラムでゲル
過し、マレイミド標識POD画分を分取した。

（３）Fab′−POD複合体画分の調製上記（１）の如くして調製した画分中のFab′に対し
て上記（２）で得られた画分中のマレイミド標識PODと
して等モルになるようにして、両画分を混合し、更にFa
b′およびマレイミド標識PODの終濃度が100uMとなるよ
うに5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）で希釈し
た。この混合液を４℃、20時間反応後、Fab′の10倍モ
ル量のＮ−エチルマレイミドで未反応のチオール基をブ
ロツクした。これを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で平衡
化したウルトロゲルAcA44カラムでゲル過し、Fab′−
POD複合体画分を分取後、0.1％牛血清アルブミン（BS
A）及び0.005％チメロサールを添加し、４℃で保存し
た。

（ｂ）ウエスタンブロツテイング実施例１（ａ）項で精製したウシ歯髄コラゲナーゼイ
ンヒビターをSDS−PAGEに供した後、市販のPOD標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例２（ａ）で得
られたFab′−POD複合体を用いて細胞工学１＆２、1061
〜1068（1983）に記載の田部の方法に従ってウエスタン
ブロツテイングを行い、酵素標識抗体による染色のパタ
ーンを得た。これを第１図に示す。第１図において、Ａ
及びＢはウエスタンブロツテイング後のニトロセルロー
ス膜をそれぞれ実施例２（ａ）で得られたFab′（クロ
ーン７−3F1）−POD複合体及びFab′（クローン７−21B
12）−POD複合体で免疫染色した結果を示すものであ
る。

また、１〜16は下記の各モノクローナル抗体（いずれ
もIgGタイプ）の溶液にウエスタンブロツテイング後の
ヒトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニトロセ
ルロース膜をPOD標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Cap
pel Labortatories製）で免疫染色した結果を示すもの
である。

1:クローン７−3F1、2:クローン７−4F2、3:クローン
７−5A1、4:クローン７−6C1、5:クローン７−7F11、6:
クローン７−8B2、7:クローン７−9B4、8:クローン７−
10E11、9:クローン７−11A5、10:クローン７−12B6、1
1:クローン７−15E8、12:クローン７−18F3、13:クロー
ン７−19F6、14:クローン７−20C2、15:クローン７−21
B12、16:クローン７−23G9。

第１図に示されるところから明らかなように、上記の
モノクローナル抗体は、いずれもウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターと交叉することがわかった。

実施例３サンドイツチ酵素免疫測定法（ａ）モノクローナル抗体結合ボールの調製法 J.Immunoassay４,209〜327（1983）に記載の石川らの
方法に従って実施例１（ｉ）で得られたモノクローナル
抗体を0.1％アジ化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（p
H7.5）に溶解し、それを100μg/ml（A₂₈₀＝0.15）の濃
度に調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポリス
チレンボール（径6.5mm、Precision Plastic Ball製）
を浸漬し、４℃に24時間静置した。次にモノクローナル
抗体溶液を除去した後、0.1％BSA、0.1％塩化ナトリウ
ム及び0.1％アジ化ナトリウム含有10mMリン酸緩衝液（p
H7.0）（以下緩衝液Ａと略記する）で５回洗浄した後、
緩衝液Ａに浸し、４℃で保存した。

（ｂ）サンドイツチ測定法精製したコラゲナーゼインヒビター溶液、あるいはコ
ラゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を１％BSAを含
む緩衝液Ａで希釈し、各試験管に300μｌを加えた。次
に前記（ａ）項で調製した抗体結合ボールを加え、37℃
で１時間振とう加温後（第１反応）、0.1M塩化ナトリウ
ム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）3mlで各試験管を３回
洗浄した。次に実施例２（ａ）項で調製したFab′−POD
複合体を20ng/試験管となるように0.1％BSA及び0.1M塩
化ナトリウム含有10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で希釈し3
0℃で１時間振とう加温した（第２反応）。反応終了
後、第１反応終了時と同様に洗浄した。次に0.1M酢酸緩
衝液（pH5.5）に溶解したPOD基質、すなわち0.0134％テ
トラメチルベンチジン（TMBZ）を0.3ml加え、更に0.01
％過酸化水素0.1mlを加えて30℃で１時間振とう加温
（第３反応）後、1.33N硫酸0.6mlを添加することにより
反応を停止させた。その反応混液のA₄₅₀値を分光光度計
で測定し、標準直線より試料中のコラゲナーゼインヒビ
ター量を求めた。

（ｃ）サンドイツチ測定用モノクローナル抗体の選択コラゲナーゼインヒビターを定量することが可能なモ
ノクローナル抗体の組み合わせを探す目的で実施例１
（ｉ）項の方法で精製したクローン７−3F1、７−6C1、
７−19F6、および７−21B12の各モノクローナル抗体か
らFab′−POD複合体を調製した。一方、クローン７−3F
1、７−4F2、７−5A1、７−6C1、７−7F11、７−8B2、
７−9B4、７−10E11、７−11A5、７−12B6、７−15E8、
７−18F3、７−19F6、７−20C2、７−21B12、および７
−23G9の各モノクローナル抗体を固相として、試験管当
たり1ngの精製したウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター
を用いて実施例３（ｂ）項の方法によりサンドイツチ定
量を行った。得られたA₄₅₀値を後掲の第２表に示す。な
お、第２表中のA₄₅₀値は試料1ng添加の値からコラゲナ
ーゼインヒビターを添加しない時の値を差し引いた数値
である。上記４種類のいずれのFab′−POD複合体を用い
た場合においても、固相として７−4F2、７−11A5、７
−12B6、７−18F3、７−20C2、および７−23G9の６種類
の抗体を用いた時のA₄₅₀が２以上の値を示した。次にこ
れら24通りの組み合わせについて、ウシ歯髄コラゲナー
ゼインヒビターの添加量を変えてサンドイツチ定量を行
った。Fab′（クローン７−6C1）−PODを複合体とし
て、クローン７−23G9抗体を固相とした場合に得られた
結果を第２図に示す。第２図に示すように、添加したウ
シ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とA₄₅₀の間に直線関
係が成立し、定量感度は試験管当たり約1pg（3a mol）
であった。上記以外の組み合わせについても上記の直線
関係がみられ、いずれの組み合わせについてもサンドイ
ツチ定量が可能であることがわかった。

実施例４ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの同定（ａ）アフイニテイカラムの調製 Nature214,1302〜1304（1967）に記載のAxｎらおよ
びProc.Natl.Acad.Sci.USA,61 636〜643（1968）に記載
のCuatrecasasらの方法に従って臭化シアンを介して担
体のセフアロース4Bにリカンドとして実施例１（ｉ）で
得られた精製モノクローナル抗体を固定化した。次に抗
体結合セフアロース4Bゲル0.3mlをガラス管に充填し、
0.1M塩化ナトリウムおよび5mM塩化カルシウム含有30mM
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化し使用した。

（ｂ）ヒト血清コラゲナーゼインヒビターのアフイニテ
イカラムクロマトグラフイーヒト血清1mlを0.1M塩化ナトリウムおよび5mM塩化カル
シウム含有30mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に対して
透析した後、上記（ａ）項記載の方法に従って調製した
クローン７−21B12抗体結合セフアロース4Bカラムに供
し、上記緩衝液で洗浄し（非吸着画分）、次にカラムを
2M塩化ナトリウム含有30mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）および0.5M塩化ナトリウム含有0.2Mグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（pH10.5）で順次洗浄し（洗浄画
分）、最後にカラムに吸着した蛋白質を0.2Mグリシン−
塩酸緩衝液（pH2.0）で溶出した（溶出画分）。得られ
た溶出画分を0.1M塩化ナトリウムおよび5mM塩化カルシ
ウム含有30mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）中で透析し
た後、もう一度クローン７−21B12抗体結合セフアロー
ス4Bカラムを用いた再アフイニテイクロマトグラフイー
に供し、上記と同様の操作により溶出画分にコラゲナー
ゼインヒビターを得た。そこで、ウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターに対するモノクローナル抗体がヒト血清コ
ラゲナーゼインヒビターと交叉するのか否かを検討する
ため、上記の溶出画分をSDS−PAGEに供した後、ウエス
タンブロツテイングを行った。第３図はウエスタンブロ
ツテイング後のニトロセルロース膜を1:クローン７−3F
1、2:クローン７−6C1、3:7−19F6、4:クローン７−21B
12および5:クローン７−23G9の各モノクローナル抗体か
ら調製したFab′−POD複合体で免疫染色を行った結果を
示すものである。第３図に示されるように、ヒト血清中
にもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対するモノク
ローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒビターが存
在することがわかった。しかも、それらの分子量はいず
れも実施例１（ａ）項で得られたウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターのそれと同じ32,000Dであることがわかっ
た。

実施例５サンドイツチ測定法によるヒト血清中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量（ａ）標準直線の作成ヒトコラゲナーゼインヒビターをサンドイツチ定量す
るのに最も適したモノクローナル抗体の組み合わせにつ
いて検討した。実施例３（ｃ）項に示したように、ウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビターを感度良く定量できる４
種類のFab′−POD複合体、すなわち、Fab′（７−3F1）
−POD、Fab′（７−6C1）−POD、Fab′（７−19F6）−P
ODおよびFab′（７−21B12）−PODと６種類の固相用抗
体、すなわち、クローン７−4F2、７−11A5、７−12B
6、７−18F3、７−20C2および７−23G9のモノクローナ
ル抗体を用いた24通りの組み合わせのうち、実施例４
（ｂ）項に記載したとおりにカラムクロマトグラフイー
処理したヒト血清コラゲナーゼインヒビターを定量でき
る組み合わせを調べた。その結果、ヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターを抗原とした場合、用いたほとんどの組
み合わせでA₄₅₀のシズナルは全く検出されなかったが、
固相用抗体としてクローン７−23G9抗体、複合体として
Fab′（クローン７−6C1）−PODを用いた場合、サンド
イツチ定量可能であることがわかった。次に、上記の組
み合わせを用いて、実施例３（ｃ）項に示した方法によ
り、ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの添加量を変え
てサンドイツチ定量を行うことによって標準直線を作成
し、得られた結果を第４図に示す。第４図にみられるよ
うに、添加したヒト血清コラゲナーゼインヒビター量と
A₄₅₀の間に直線関係が成立し、ヒトコラゲナーゼインヒ
ビターの定量が可能であることがわかった。しかし、そ
の定量感度は試験管当たり約10pg（320a mol）であり、
ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの場合の定量感度
（試験管当たり1pg）に比べて10倍低いことがわかっ
た。

（ｂ）患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの定量上記（ａ）において示したモノクローナル抗体の組み
合わせを用いて健常人血清95検体、原発性肝臓癌患者血
清100検体および転移性肝臓癌患者血清３検体の中に存
在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイツチ定量
し、その結果を第３表の１および２に示した。なお、こ
のサンドイツチ定量において、標準直線の作成には抗原
とし実施例４（ｂ）項で精製したヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターを用いた。また、この定量は検体血清を１
％BSAを含む緩衝液Ａで1,600倍に希釈して行った。第３
表の１および２に示した数値は同一の実験系を２回行っ
た結果の平均値である。第３表の１にみられるように、
健常人血清1ml中に存在するコラゲナーゼインヒビター
量は平均1.59±0.37μｇであるのに対し、原発性肝臓癌
患者血清および転移性肝臓癌患者血清1ml中に存在する
コラゲナーゼインヒビター量は第３表の２に見られるよ
うにそれぞれ平均3.22±2.10μｇおよび7.81±3.87μｇ
と高い値を示した。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性
活動性肝炎患者血清45検体および慢性非活動性肝炎患者
血清26検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビターを
サンドイツチ定量した値を第４表に示した。その結果、
肝硬変患者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢
性非活動性肝炎患者血清1ml中に存在するコラゲナーゼ
インヒビター量はそれぞれ平均1.52±1.08μｇ、1.55±
0.58μｇおよび1.10±0.47μｇであり、これらの値はい
ずれも健常人血清中に存在するコラゲナーゼインヒビタ
ー量と有意の差は認められなかった。

実施例６ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの精製実施例４の（ｂ）で最終的に得られた溶出画分中には
前述したとおり、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに
対するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼイン
ヒビターが存在する（第３図参照）。しかし、この溶出
画分中には、コラゲナーゼインヒビター以外にも、上記
モノクローナル抗体とは反応しない蛋白質が多種存在す
ることが認められた。そこで、この溶出画分を0.1Mリン
酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したAcA44カラムを用いてゲ
ル過を行い、コラゲナーゼインヒビターと他の蛋白質
とを分離することによりヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを精製した。第５図は得られた血清コラゲナーゼイ
ンヒビター（１）、対照としてのウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビター（２）および分子量マーカー（３）の各SD
S−PAGEパターンを示している。第５図にみられるよう
に、ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの分子量はウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビターのそれと同様、32,000D
であることがわかった。

実施例７サンドイツチ測定法における精製ヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線の作成実施例６において得られた精製ヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターの添加量を変えて、実施例５の（ａ）項記
載のモノクローナル抗体の組み合わせを用いてサンドイ
ツチ定量を行うことによって標準直線を作成した。得ら
れた結果は第６図に示すとおりである。第６図にみられ
るように、添加したヒト血清コラゲナーゼインヒビター
量とA₄₅₀の間に直線関係が成立し、この時の定量感度は
試験管当たり1.5pg（48a mol）であった。この定量感度
は、実施例５の（ａ）項で作成した標準直線の場合に比
べて6.7倍高く、また、実施例３の（ｃ）項記載のウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビターの場合に比べて1.5倍低
いことがわかった。

実施例８サンドイツチ測定法によるヒト血清中あるいはヒト血漿
中のコラゲナーゼインヒビターの定量に基づく肝臓癌疾
患の診断（ａ）肝疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの
定量実施例７において示したモノクローナル抗体の組み合
わせを用いて健常人血清50検体、原発性肝臓癌患者血清
100検体および転移性肝臓癌患者血清３検体の中に存在
するコラゲナーゼインヒビターをサンドイツチ定量し、
その結果を第５表の１および２に示した。なお、このサ
ンドイツチ定量において、標準直線の作成には抗原とし
て実施例６で精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビタ
ーを用いた。また、この定量は検体血清１％HBSAを含む
緩衝液Ａで1,600倍に希釈して行った。第５表の１およ
び２に示した数値は同一の実験系を２回行った結果の平
均値である。第５表の１にみられるように、健常人血清
1ml中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平均184
±31ngであるのに対し、原発性肝臓癌患者血清および転
移性肝臓癌患者血清1ml中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量は第５表の２に見られるようにそれぞれ平均
484±316ngおよび1171±712ngと高い値を示した。一
方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動性肝炎患者血清45
検体および慢性非活動性肝炎患者血清26検体の中に存在
するコラゲナーゼインヒビターをサンドイツチ定量した
値を第６表に示した。第６表に見られるように、肝硬変
患者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢性非活
動性肝炎患者血清1ml中に存在するコラゲナーゼインヒ
ビター量はそれぞれ平均228±163ng、233±88ngおよび1
66±73ngであり、これらの値はいずれも健常人血清中に
存在するコラゲナーゼインヒビター量と有意の差は認め
られなかった。

（ｂ）肝疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 Br.J.Haematol.33,239−247（1976）に記載のLudlamとC
ashの方法に従って、健常人血液および原発性肝臓癌疾
患患者血液からそれぞれの血漿を採取した。なお、ここ
で採取した血漿は、血液にEDTA、プロスタグランジン
E₁、およびテオフイリンを加え冷却した後、４℃で1900
×g60分間遠心分離して得られた上澄であり、血液中の
血小板は、分解されずに沈澱画分にとどまっている。

上記の如くして得られた健常人血漿26検体および原発
性肝臓癌患者血漿８検体の中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビターを上記（ａ）項に示したのと同じ方法を用い
てサンドイツチ定量した。その結果は後掲の第７表に示
されるとおりである。第７表にみられるように、健常人
血漿1ml中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平
均64±10ngであるのに対し、原発性肝臓癌疾患患者血漿
1ml中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平均583
±447ngと高い値を示した。

（ｃ）モノクローナル抗体とコラゲナーゼインヒビター
との特異的反応の確認実施例４、（ｂ）項に示したように、サンドイツチ測
定法に用いる２種類のモノクローナル抗体（クローン７
−6C1とクローン７−23G9）はヒトコラゲナーゼインヒ
ビターと反応するが、血清あるいは血漿などのように、
種々の蛋白質が高濃度で溶解している系でも、このモノ
クローナル抗体がコラゲナーゼインヒビターと特異的に
反応していることを確認するための試験を行った。

健常人血清あるいは肝臓癌患者血清を0.1M塩化ナトリ
ウムおよび5mM塩化カルシウム含有30mMトリスー塩酸緩
衝液（pH8.0）で５倍に希釈した後、実施例４の（ａ）
項記載の方法に従って調製したクローン７−23G9（サン
ドイツチ測定法の固相用抗体）結合セフアロース4Bカラ
ムに供し、実施例４の（ｂ）項記載の方法に従って溶出
画分を得た。この溶出画分をSDS−PAGEを供した後、ウ
エスタンブロツテイングを行い、サンドイツチ測定法の
標識抗体であるFab′（クローン７−6C1）−POD複合体
で免疫染色を行った。その結果は第７図に示すとおりで
ある。1:精製ヒト血清コラゲナーゼインヒビター、2:健
常人血清、3:肝臓癌患者血清のいずれを用いた場合に
も、単一バンドを示すことから、本発明の診断法におけ
るサンドイツチ測定法では、極めて特異的にコラゲナー
ゼインヒビターだけが定量されていることが示された。

以上述べたことから明らかなように、本発明に係る診
断用試薬を用いるサンドイッチ法を適用することによ
り、肝臓癌疾患の診断を、簡便に、短時間内にさらに感
度良く行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターをSDS−PAG
Eを供した後、種々のモノクローナル抗体を用いた時の
ウエスタンブロツテイングパターンを示す図であり、第
２図は固相７−23G9抗体−複合体Fab′（７−6C1）−PO
D測定系でのウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの標準
直線を示す図であり、第３図はヒト血清コラゲナーゼイ
ンヒビターをSDS−PAGEに供した後、ウエスタンブロツ
テイングを行った時の免疫染色のパターンを示す図であ
り、第４図は固相７−23G9抗体−複合体Fab′（７−6C
1）−POD測定系でのヒト血清コラゲナーゼインヒビター
の標準直線を示す図であり、第５図はヒト血清から精製
したコラゲナーゼインヒビターのSDS−PAGEパターンを
示す図であり、第６図は精製したヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターを用いて、サンドイツチ測定した時の標準
直線を示す図であり、第７図はヒト血清をIgG（７−23G
9）抗体結合アフイニテイカラムに供して得られた溶出
画分をSDS−PAGEに供した後、Fab′（７−6C1）−POD複
合体を用いた時のウエスタンブロツテイングパターンを
示す図である。

フロントページの続き (72)発明者早川太郎愛知県名古屋市天白区天白町平針大提下 1355番地 (72)発明者小玉修嗣富山県高岡市長江1868番地高岡スカイハイツ603号 (72)発明者岩田和士富山県高岡市五十里東町190番地

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】サンドイッチ法によりヒト体液中に存在す
るヒトコラゲナーゼインヒビターを酵素免疫学的に定量
するための、ウシコラゲナーゼインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体であってヒトコラゲナーゼインヒビタ
ーと特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体から
なる肝臓癌疾患の診断用試薬。