DE19543265A1 - Autoantigene und Verfahren zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die minde­ stens eine für ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, wobei das Polypeptid mindestens eine aus einer Me­ tallprotease stammende autoantigene Determinante enthält, das Polypeptid selbst sowie gegen das Polypeptid gerichtete Anti­ körper und gegen das Polypeptid gerichtete spezifische Inhibi­ toren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Kits zum Nachweis von autoantigenen Metallproteasen und von Au­ toimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis.

Trotz umfangreicher Untersuchungen konnten bisher Autoimmun­ krankheiten und insbesondere deren Etiologie noch nicht aufge­ klärt werden, was natürlich die therapeutische Behandlung sowie die Diagnosemöglichkeiten stark einschränkt bzw. nachteilig be­ einflußt. Beispielsweise erfordert die gegenwärtige Diagnose von rheumatoider Arthritis unter anderem eine Röntgenun­ tersuchung, in gravierenden Fällen sogar eine Gelenkpunktion, was für den Patienten äußerst belastend bzw. schmerzhaft sein kann. Ferner ist mit den im Stand der Technik bekannten Diagnosemöglichkeiten eine Frühdiagnose von beispielsweise rheu­ matoider Arthritis und damit verbunden die Möglichkeit einer entsprechend frühzeitigen therapeutischen Behandlung meistens nicht gegeben (vgl. Arnett, F.C. et al. (1987) Arthritis Rheum. 31 : 315).

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten bereit­ zustellen, welches die Nachteile der gegenwärtig im Stand der Technik verwendeten Untersuchungsmethoden beseitigt und insbe­ sondere für Vorsorgeuntersuchungen auf Autoimmunkrankheiten ge­ eignet ist.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekenn­ zeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Ein erster erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft eine Nu­ kleinsäure, die mindestens eine für ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das Polypeptid mindestens eine aus einer Metallprotease stammende autoantigene Determi­ nante umfaßt.

Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuresequenz" bedeuten natürliche oder halbsynthetische oder synthetische oder modifi­ zierte Nukleinsäuremoleküle aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden.

Der Begriff "Polypeptid" umfaßt natürlich vorkommende Polypep­ tide und rekombinante Polypeptide. Natürlich vorkommende Poly­ peptide umfassen erfindungsgemäß autoantigene Metallproteasen per se oder autoantigene Abschnitte bzw. Fragmente davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Metallproteasen sogenannte Membranproteine, d. h. sie haften so in der Zelloberflächenmembran, daß die funktionellen Teile des Proteins nach außen gewandt sind und gegebenenfalls proteolytisch abgespalten werden können. Metallproteasen stam­ men vorzugsweise aus Makrophagen und verwandten Zelltypen und kommen beispielsweise in der Gelenkinnenhaut, Membrana synovia­ lis, von Säugern vor. Rekombinante Polypeptide bezeichnen ein mit molekularbiologischen Techniken hergestelltes Konstrukt, dem die natürliche DNA des originalen Genoms bzw. die natürli­ che DNA modifiziert mit einer fremden DNA-Sequenz zugrunde liegt und rekombiniert werden kann, z. B. mit Plasmiden, und in einem geeigneten Wirtssystem repliziert und exprimiert werden kann.

Der Begriff "autoantigene Determinante bzw. Epitop" bedeutet, daß ein oder mehrere lineare oder konformationelle Bereiche der Metallprotease vom eigenen Immunsystem durch sogenannte Autoan­ tikörper erkannt werden. Das Vorkommen von Autoantikörpern wird als Indiz dafür gewertet, daß ein Protein der eigenen Zellen, z. B. in den Makrophagen der Synovialmembran, als Folge einer Krankheit quantitativ und qualitativ abnormal ausgeprägt wird. Beispielsweise wird als mögliche Ursache der Gelenkzerstörung bei rheumatoider Arthritis angenommen, daß ein bisher nicht identifiziertes infektiöses Agens Gelenkmakrophagen zur ver­ mehrten Expression von Proteasen anregt, die durch Proteolyse von Gelenkgewebe weitere potentielle Autoantigene freisetzen (vgl. Opdenakker et al., 1994, Immunol. Today 15 : 103; Wicks et al., 1994, Immunol. Today 15 : 553). In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Nuklein­ säure die in Fig. 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder Ab­ schnitte bzw. Fragmente davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Nuklein­ säure den Sequenzabschnitt 1110-2206 der in Fig. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vek­ tor, der die vorstehend definierte, erfindungsgemäße Nuk­ leinsäure zur Expression des rekombinanten Polypeptids in pro­ karyotischen oder eukaryotischen Wirtszellen enthält. Der er­ findungsgemäße Vektor kann vorzugsweise geeignete regulato­ rische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequen­ zen, enthalten. Der erfindungsgemäße Vektor kann beispielsweise ein Expressionsvektor oder ein Vektor zur vorzugsweise stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das geneti­ sche Material einer Wirtszelle sein. Ein geeignetes Expressi­ onssystem umfaßt beispielsweise den Vektor pET-24 und E. coli BRL(DE3) oder BL21(DE3), oder für die Expression in eukaryonti­ schen Zellen den Vektor pcDNA3 und cos-Zellen oder CHO-Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise Prokaryonten, wie E. coli, oder eukaryotische Wirtszellen wie cos oder CHO. Im Prinzip kann jedes im Handel erhältliche pro- oder eukaryontische Expressionssystem verwen­ det werden. Für eine ausreichende Expressionsrate ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure entweder im genetischen Material der Wirtszelle stabil integriert oder der erfindungsgemäße Vek­ tor enthält geeignete regulatorische Bereiche zur Replikation, Transkription und/oder Translation in vivo und/oder in vitro, d. h. auch im zellfreien System.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist das Polypeptid selbst, das von der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz entsprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann durch post-translationale Reaktionen in vivo oder durch im Stand der Technik bekannte chemische und/oder en­ zymatische Methoden in vitro modifiziert sein. In einer be­ vorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Polypeptid die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder Ab­ schnitte bzw. Fragmente davon, beispielsweise das vom Se­ quenzabschnitt 1110-2206 der in Fig. 1 gezeigten Nukleinsäure­ sequenz kodierte Expressionsprodukt.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, der erfindungsgemäße Vektor sowie das erfindungsgemäße Polypeptid können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden (vgl. Ausubel et al., 1991, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, N.Y.).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein po­ lyklonaler, vorzugsweise monospezifischer, oder monoklonaler Antikörper, der gegen das vorstehend definierte Polypeptid ge­ richtet ist. Der erfindungsgemäße Antikörper kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden (vgl. Coligan et al., 1993, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, New York, N.Y.).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Autoimmunkrankheiten, insbesondere von rheumatoider Arthritis (RA) und anderer autoimmuner Arthri­ tisformen wie SLE (Systemischer Lupus Erythematodes), MCTD (Mischkollagenose) und PSS (Progressive Sklerodermie), worin entweder das vorstehend definierte Polypeptid oder der vorste­ hend definierte Antikörper mit Serum eines Säugers einem Enzym­ immunoassay, vorzugsweise einem ELISA, unterworfen werden.

Beispielsweise hat der Nachweis von Autoantikörpern gegen Me­ tallproteasen im ELISA gegenüber anderen Diagnoseverfahren bei rheumatoider Arthritis, wie Röntgenuntersuchung oder Gelenk­ punktion, die Vorteile, nicht-invasiv und erheblich kostengün­ stiger zu sein. Außerdem können Autoantikörper aufgrund der Empfindlichkeit des Immunsystems auf bereits geringe Mengen Au­ toantigen schon nachweisbar sein, wenn bildgebende Verfahren noch keine Beschädigung des Gelenkes anzeigen. Es ist auch mög­ lich, daß spezifische Inhibitoren der Metallprotease in pharma­ zeutischen Formulierungen zur Therapie im Gelenk eines Rheuma­ patienten verwendet werden können.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein dia­ gnostischer Kit zum Nachweis einer Autoimmunkrankheit, der mindestens entweder das vorstehend definierte Polypeptid oder den vorstehend definierten Antikörper enthält.

Fig. 1 zeigt die 3222 bp lange DNA-Sequenz, die für die Me­ tallprotease MPRS aus der Synovialmembran eines Rheumapatienten kodiert (Herkunft: Synovialmembran eines RA-Patienten; Eigen­ schaften der Sequenz: Translationsstart ATG an pos. 82 mit charakteristischer eukaryontischer Startsequenz, Translations­ stop TGA an pos. 1606, autoantigener Bereich zwischen pos. 1110 und pos. 2206 (kursiv); 88% Identität zur repetitiven alu J-Subfamilie im untranslatierten Bereich von pos. 1480-1590).

Fig. 2 (A) ist die 508 AS lange Primärsequenz der Metallpro­ tease MPRS, die von der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz ko­ diert wird (Molekulargewicht, errechnet aus cDNA-Sequenz: 57,4 kDa). Fig. 2 (B) zeigt strukturelle Eigenschaften dieser Me­ tallprotease.

Fig. 3 ist ein Coomassie Blau-gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel mit aus mononucleären Blutzellen isolierter rekombinanter MPRS und ihrem RASED-Fragment, das von einer RA-Patientin stammt.

Fig. 4 zeigt das Ergebnis einer Immunpräzipitation der zell­ frei translatierten MPRS durch Seren von Patienten (RA = Rheumatoide Arthritis, Patientenserum; c = Kontroll-Xeno­ serum; N1, N2 = "Normalserum", human, als Kontrolle; MCTD = Mischkollagenose, Patientenserum; SLE = Systemischer Lu­ pus Erythematodes, Patientenserum).

Fig. 5 zeigt einen Homologie-Vergleich der erfindungsgemäßen, in Fig. 2 gezeigten Metallprotease mit bisher bekannten Me­ tallproteasen. Fett hervorgehobene Aminosäuren markieren stark konservierte Bereiche. Die für Metallproteasen typischen Domä­ nen (hydrophobes Signalpeptid, abspaltbares Propeptid, kataly­ tische Domäne mit Zn²⁺-Bindestelle, "Hinge"Region und Hemopexin ähnliche Domäne) sind aus der Abbildung zu entnehmen (vgl. Bir­ kedal-Hansen, H. et al. (1993) Crit. Rev. Oral. Biol. Med.). Die MTMMP-Sequenz stammt aus der "genbank"-Datenbank (NCBI, USA), alle anderen Sequenzen sind aus der Proteindatenbank "Swissprot" entnommen (STRO1 = Stromyelisin-1 Precursor (MMP- 3); STRO2 = Stromyelisin-2 Precursor (MMP-10); STRO3 = Stromyelisin-3 Precursor (MMP-11); 92KD = 92 kD Type IV Collagenase Precursor (MMP-9); 72KD = 72 kD Type IV Collagenase Precursor (MMP-2); MME = Macrophage Metalloelastase Precursor (MMP-12); NEUCOLL = Neutrophil Collagenase Precursor (MMP-8); INTCOLL = Interstital Collagenase Precursor (MMP-1); PUMP- 1 = Matrylisin Precursor (MMP-7); MTMMP-1 = Membrane Type Ma­ trix Metalloproteinase).

Durch das nachfolgende Beispiel wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.

1. Isolierung einer für eine autoantigene Determinante kodie­ rende Nukleinsäuresequenz (RASED)

Die Isolation von mRNA aus Synovialmembran-Zellen einer RA- Patient in erfolgt nach im Stand der Technik bekannten Ver­ fahren und eine Expressions-cDNA-Bank wird mit dem Expressi­ onsvektor lambda Zap II (Fa. Stratagene) hergestellt. Das Absuchen ("Screening") der cDNA-Bank wird mit gereinigtem Immunglobulin G der RA-Patientin durchgeführt.

Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurde ein primä­ rer Klon "Rased", der ein Fragment von 1106 bp der Metall­ protease (MPRS)-mRNA umfaßt, aus der cDNA-Bank (3×10⁵ Klone/µg mRNA) erhalten, wobei dieses Fragment aufgrund des Screenings mit Immunglobulin G der RA-Patientin ein autoan­ tigenes Epitop enthält.

2. Isolierung und Charakterisierung einer für eine als Autoan­ tigen wirkenden Meteallprotease (MPRS) kodierende Nuklein­ säuresequenz

MPRS-mRNA wird in peripheren mononucleären Blutzellen über reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion nachgewiesen. Die Isolation der mRNA aus peripheren mononucleären Blutzel­ len und die Herstellung einer cDNA-Bank mit lambda Zap II wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Das Screening der cDNA-Bank wird mit einer markierten, auf dem RASED-Klon basierenden DNA-Sonde durchgeführt.

Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurde ein des vollständiger cDNA-Klon der MPRS erhalten, dessen vollstän­ dige Sequenzierung die in Fig. 1 gezeigte DNA-Sequenz und die davon abgeleitete, in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz ergab.

Der in Fig. 5 gezeigte Datenbankvergleich zeigt auf Pro­ teinebene zwischen 30 und 35% Identität (bei einer Ähnlich­ keit von über 50%) zu bekannten Metallproteasen, wobei die katalytische Domäne sowie die für Metallproteasen typische Domänenstruktur vorhanden sind.

3. Gelchromatographische Analyse der Metallprotease MPRS und deren Fragment RASED

Die Expression und Reinigung von MPRS aus E. coli wird mit pET24 und mit N-terminalem oligo-Histidin-"tag" durchge­ führt. Die Expression und Reinigung von RASED aus E. coli wird mit pGEX 1 als Fusionsprotein mit Glutamin-S-Trans­ ferase durchgeführt. Die so erhaltenen Peptidkonstrukte wur­ den über ein SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufge­ trennt und die aufgetrennten Peptidkonstrukte durch Coomas­ sie Blau-Färbung des SDS-Polyacrylamidgels nachgewiesen; vgl. Fig. 3.

4. Immunologische Analyse der Metallprotease MPRS mittels Im­ munpräzipitation

Die zellfreie Transkription/Translation von MPRS erfolgt in Retikulozytenlysaten. Die Immunpräzipitation der zellfrei translatierten MPRS wird mit Seren von Patienten durchge­ führt; vgl. Fig. 4.

Das in Fig. 4 zusammengefaßte Ergebnis zeigt deutlich, daß MPRS als starkes Autoantigen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und Systemischer Lupus Erythematodes wirkt.

Claims (14)

1. Nukleinsäure, enthaltend mindestens eine für ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das Polypeptid minde­ stens eine aus einer Metallprotease stammende autoantigene Determinante umfaßt.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Metallprotease ein Membranprotein ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Me­ tallprotease aus der Gelenkinnenhaut von Säugern stammt.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die in Fig. 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder Abschnitte davon.

5. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure von einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure von einem der An­ sprüche 1 bis 4 oder den Vektor von Anspruch 5.

7. Polypeptid, enthaltend mindestens eine aus einer Metall­ protease stammende autoantigene Determinante.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, umfassend die in Fig. 2 ge­ zeigte Aminosäuresequenz oder Abschnitte davon.

9. Antikörper, der gegen das Polypeptid von Anspruch 7 oder 8 gerichtet ist.

10. Verfahren zum Nachweis einer Autoimmunkrankheit, worin

• (a) das Polypeptid von Anspruch 7 oder 8, oder
• (b) der Antikörper von Anspruch 9

mit Serum eines Säugers einem Enzymimmunoassay unterworfen wird.

11. Kit zum Nachweis einer Autoimmunkrankheit, enthaltend

• (a) das Polypeptid von Anspruch 7 oder 8, oder
• (b) den Antikörper von Anspruch 9.

12. Verwendung des Polypeptids von Anspruch 7 oder 8 oder des Antikörpers von Anspruch 9 zum Nachweis von Au­ toimmunkrankheiten.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Autoimmunkrankheiten rheumatoide Arthritis, Systemische Lupus Erythematosus, Mischkollagenose und Progressive Sklerodermie umfassen.