JPH08269090A - 新規ぺプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 次のアミノ酸配列[I] または[II]で示される
オピオイド活性を有する新規ペプチド。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-A-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-B [I] (ＡはHis またはPro を示し、Ｂはカルボキシル基末端
またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr を示す) 。 Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-C [II] (Ｃはカルボキシル基末端、Thr-Glu-Ser-Gln-Ser また
はThr-Glu-Ser-Glu-Ser-Leu-Thr を示す) 。 【効果】 オピオイド活性を示すので中枢神経抑制、鎮
咳、鎮静、止瀉等の薬理効果を有する医薬として用いら
れる。
オピオイド活性を有する新規ペプチド。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-A-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-B [I] (ＡはHis またはPro を示し、Ｂはカルボキシル基末端
またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr を示す) 。 Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-C [II] (Ｃはカルボキシル基末端、Thr-Glu-Ser-Gln-Ser また
はThr-Glu-Ser-Glu-Ser-Leu-Thr を示す) 。 【効果】 オピオイド活性を示すので中枢神経抑制、鎮
咳、鎮静、止瀉等の薬理効果を有する医薬として用いら
れる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オピオイド活性を有す
る新規ペプチドに関する。本発明のペプチドは、その活
性から中枢神経抑制、鎮咳、鎮痛、鎮静、止瀉等の薬理
作用を示すので医薬として有用である。
る新規ペプチドに関する。本発明のペプチドは、その活
性から中枢神経抑制、鎮咳、鎮痛、鎮静、止瀉等の薬理
作用を示すので医薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、食品中に含まれる生理活性物質に
ついて、多くの研究がなされている。特に、牛乳中にお
いては、オピオイド活性を有する生理活性ペプチドが多
く見出されており、例えばβ−カゾモルフィン７(Hoppe
-Seyler'Z, Physiol.Chem., Vol.360, p1221 (1979)
）、β−カゾモルフィン５，６，及び４アミド（Chang
K.J. et al,Science, Vol.212, p75, (1981)）が知ら
れている。又、本発明者らも同様に乳中に含まれる生理
活性物質を探索しており、オピオイド活性又はオピオイ
ド阻害活性を有する乳タンパク質由来のペプチドをこれ
まで特開昭60-184096号、特開昭61-68499号、特開昭61-
271300 号、特開昭61-277697 号、特開平3-220131号、
特開平4-316598号、特開平6-128287号等で開示してい
る。本発明者らは、牛乳中に含まれる生理活性物質につ
いてオピオイド活性に注目しさらに鋭意探索した結果、
該活性を有する新規なペプチドを見出すに至った。
ついて、多くの研究がなされている。特に、牛乳中にお
いては、オピオイド活性を有する生理活性ペプチドが多
く見出されており、例えばβ−カゾモルフィン７(Hoppe
-Seyler'Z, Physiol.Chem., Vol.360, p1221 (1979)
）、β−カゾモルフィン５，６，及び４アミド（Chang
K.J. et al,Science, Vol.212, p75, (1981)）が知ら
れている。又、本発明者らも同様に乳中に含まれる生理
活性物質を探索しており、オピオイド活性又はオピオイ
ド阻害活性を有する乳タンパク質由来のペプチドをこれ
まで特開昭60-184096号、特開昭61-68499号、特開昭61-
271300 号、特開昭61-277697 号、特開平3-220131号、
特開平4-316598号、特開平6-128287号等で開示してい
る。本発明者らは、牛乳中に含まれる生理活性物質につ
いてオピオイド活性に注目しさらに鋭意探索した結果、
該活性を有する新規なペプチドを見出すに至った。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、オピ
オイド活性を有する新規なペプチドを提供することにあ
る。
オイド活性を有する新規なペプチドを提供することにあ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、牛乳の酵
素分解物中に、オピオイド活性を有するペプチドがある
ことを見出し、このペプチドを単離しそのアミノ酸配列
を決定した。この結果、次のアミノ酸配列を有するペプ
チドを見出した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-A-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-B [I] (たゞし、アミノ酸配列中 AはHis またはPro を示し、B
はカルボキシル基末端またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr
-Gln-Thr を示す) 、及び Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-C [II] (たゞし、アミノ酸配列中 Cはカルボキシル基末端、Thr
-Glu-Ser-Gln-Ser またはThr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr
を示す) 。
素分解物中に、オピオイド活性を有するペプチドがある
ことを見出し、このペプチドを単離しそのアミノ酸配列
を決定した。この結果、次のアミノ酸配列を有するペプ
チドを見出した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-A-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-B [I] (たゞし、アミノ酸配列中 AはHis またはPro を示し、B
はカルボキシル基末端またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr
-Gln-Thr を示す) 、及び Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-C [II] (たゞし、アミノ酸配列中 Cはカルボキシル基末端、Thr
-Glu-Ser-Gln-Ser またはThr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr
を示す) 。
【０００５】具体的には、次のアミノ酸配列で示される
ペプチドを見出し、本発明者らはそれぞれのペプチドを
次のように命名した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n ［His8］β−カゾモルフィン１３ Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr ［His8］β−カゾモルフィン２１ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe β−ネオカゾモルフィン６ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser β−ネオカゾモルフィン１１ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Th
r β−ネオカゾモルフィン１３
ペプチドを見出し、本発明者らはそれぞれのペプチドを
次のように命名した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n ［His8］β−カゾモルフィン１３ Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr ［His8］β−カゾモルフィン２１ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe β−ネオカゾモルフィン６ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser β−ネオカゾモルフィン１１ Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Th
r β−ネオカゾモルフィン１３
【０００６】さらに、これらのペプチドと化学構造が類
似し、同様にオピオイド活性を有するペプチドを探索し
たところ、次のアミノ酸配列を有するペプチドを得るこ
とができ、これらのペプチドを次のように命名した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n ［Pro8］β−カゾモルフィン１３ Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr ［Pro8］β−カゾモルフィン２１ 即ち、本発明は、これらのアミノ酸配列を有するペプチ
ドに関する。これらのペプチドは全く新規なペプチドで
あり、オピオイド活性を示す。これらのペプチドは、そ
の活性により中枢神経抑制、鎮痛、鎮静、鎮咳、止瀉等
の薬理作用を示し医薬として有用である。
似し、同様にオピオイド活性を有するペプチドを探索し
たところ、次のアミノ酸配列を有するペプチドを得るこ
とができ、これらのペプチドを次のように命名した。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n ［Pro8］β−カゾモルフィン１３ Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-Pro-Gl
n-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr ［Pro8］β−カゾモルフィン２１ 即ち、本発明は、これらのアミノ酸配列を有するペプチ
ドに関する。これらのペプチドは全く新規なペプチドで
あり、オピオイド活性を示す。これらのペプチドは、そ
の活性により中枢神経抑制、鎮痛、鎮静、鎮咳、止瀉等
の薬理作用を示し医薬として有用である。
【０００７】本発明のペプチドは、牛乳のβカゼインを
複数の酵素を用いて数段階に分けて分解することによっ
て得ることができる。これらの複数の酵素としては、ペ
プシン−パンクレアチン、ペプシン−トリプシン、及び
これらの酵素とロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）
との組み合わせがある。すなわち、牛乳のβ−カゼイン
をペプシンで酵素分解し、得られるβ−カゼインペプシ
ン消化物をパンクレアチンあるいはトリプシンで消化
し、さらに、必要に応じてＬＡＰで消化する。この酵素
消化物を数種のカラムにかけて逆相クロマトグラフィー
で分画し、得られる画分のオピオイド活性を測定し、活
性を有する画分を選択することによって得ることができ
る。そして、この画分のアミノ酸配列はプロティンシー
クエンサーによる配列分析、及びアミノ酸分析計による
アミノ酸分析により特定することができる。又、市販の
ペプチドシンセサイザーを用いることにより容易に合成
が可能である。例えば、合成装置としてＳａｍ Ｔｗｏ
ペプチド合成装置（バイオサーチ社製）を用いてペプチ
ドの合成を行う。即ち、樹脂に活性基を保護したアミノ
酸を吸着させ、これにデブロッキング液を注入して保護
基を除去し、活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者
を反応させジペプチドを合成する。この操作を繰り返す
ことにより、目的とする配列を有するペプチドを合成す
ることができる。ペプチドの担体としての樹脂からの脱
離と保護基の除去は、10％アニソールを含む無水フッ化
水素中で０℃の温度条件下に１時間攪拌することにより
行う。フッ化水素を留去した後樹脂をエーテルで洗浄
し、30％酢酸により抽出し、凍結乾燥により粗ペプチド
が得られる。この粗ペプチドを0.1 ％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤ
Ｓ）カラムを接続した高速液体クロマログラフにより、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線的濃度勾配に
て展開、精製する。目的とするペプチドは、特有の溶出
位置を示す。又、このようにして得られたペプチドのア
ミノ酸配列は、市販のプロテインシークエンサーによる
配列分析、及びアミノ酸分析計によるアミノ酸分析によ
り特定することができる。
複数の酵素を用いて数段階に分けて分解することによっ
て得ることができる。これらの複数の酵素としては、ペ
プシン−パンクレアチン、ペプシン−トリプシン、及び
これらの酵素とロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）
との組み合わせがある。すなわち、牛乳のβ−カゼイン
をペプシンで酵素分解し、得られるβ−カゼインペプシ
ン消化物をパンクレアチンあるいはトリプシンで消化
し、さらに、必要に応じてＬＡＰで消化する。この酵素
消化物を数種のカラムにかけて逆相クロマトグラフィー
で分画し、得られる画分のオピオイド活性を測定し、活
性を有する画分を選択することによって得ることができ
る。そして、この画分のアミノ酸配列はプロティンシー
クエンサーによる配列分析、及びアミノ酸分析計による
アミノ酸分析により特定することができる。又、市販の
ペプチドシンセサイザーを用いることにより容易に合成
が可能である。例えば、合成装置としてＳａｍ Ｔｗｏ
ペプチド合成装置（バイオサーチ社製）を用いてペプチ
ドの合成を行う。即ち、樹脂に活性基を保護したアミノ
酸を吸着させ、これにデブロッキング液を注入して保護
基を除去し、活性基を保護したアミノ酸を注入し、両者
を反応させジペプチドを合成する。この操作を繰り返す
ことにより、目的とする配列を有するペプチドを合成す
ることができる。ペプチドの担体としての樹脂からの脱
離と保護基の除去は、10％アニソールを含む無水フッ化
水素中で０℃の温度条件下に１時間攪拌することにより
行う。フッ化水素を留去した後樹脂をエーテルで洗浄
し、30％酢酸により抽出し、凍結乾燥により粗ペプチド
が得られる。この粗ペプチドを0.1 ％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤ
Ｓ）カラムを接続した高速液体クロマログラフにより、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線的濃度勾配に
て展開、精製する。目的とするペプチドは、特有の溶出
位置を示す。又、このようにして得られたペプチドのア
ミノ酸配列は、市販のプロテインシークエンサーによる
配列分析、及びアミノ酸分析計によるアミノ酸分析によ
り特定することができる。
【０００８】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。しかし、これらは単に例示するのみであ
り、本発明はこれらにより限定されるものではない。
く説明する。しかし、これらは単に例示するのみであ
り、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】酵素分解による本発明ペプチドの製造方法 β−カゼインペプシン消化物の調製 原料乳より塩酸による酸沈殿によって酸カゼインを調製
した。得られた酸カゼイン100gよりHippらの方法（Hipp
N.J. et al., J. Dairy. Sci. vol.35, p272(1952)）
に従い、β−カゼインを調製した。得られたβ−カゼイ
ン15ｇにブタ胃由来ペプシン（シグマ社製）を 1/100量
添加して、pH２，37℃で５時間消化した。消化終了時に
ＮａＯＨにて中和後、１０分間加熱して酵素を失活させ
た。このペプシン消化物１ｇを、以下に示すようにパン
クレアチン消化、トリプシン消化、さらにＬＡＰ消化を
行なって新規ペプチドを得た。
した。得られた酸カゼイン100gよりHippらの方法（Hipp
N.J. et al., J. Dairy. Sci. vol.35, p272(1952)）
に従い、β−カゼインを調製した。得られたβ−カゼイ
ン15ｇにブタ胃由来ペプシン（シグマ社製）を 1/100量
添加して、pH２，37℃で５時間消化した。消化終了時に
ＮａＯＨにて中和後、１０分間加熱して酵素を失活させ
た。このペプシン消化物１ｇを、以下に示すようにパン
クレアチン消化、トリプシン消化、さらにＬＡＰ消化を
行なって新規ペプチドを得た。
【０００９】
【実施例２】パンクレアチン消化物の調製 実施例１で得られたβ−カゼインペプシン消化物500mg
にパンクレアチン（シグマ社製：４×U.S.P.）を 1/100
量添加して、pH7.5 、37℃で５時間消化した。10分間加
熱し酵素を失活させ、ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-A
R、20φ×250mm、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％
ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）によ
る逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で分画し
た。溶出パターンを図１に示す。この結果、活性フラク
ションＡが得られた。このフラクションＡをさらにフェ
ネチルカラム（Devosil PhA-T-5 、4.6 φ×250mm 、野
村化学社製）を用い、0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリ
ル濃度勾配（１％／分）による逆相クロマトグラフィー
（流速10ml／分）で精製した。溶出パターンを図２に示
す。活性画分をプロテインシークエンサー（４７７Ａ、
アプライドバイオシステムズ社製）で構造を解析したと
ころ、Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe の６残基からなるペプ
チドと確認した。このペプチドをβ−ネオカゾモルフィ
ン６と命名した。
にパンクレアチン（シグマ社製：４×U.S.P.）を 1/100
量添加して、pH7.5 、37℃で５時間消化した。10分間加
熱し酵素を失活させ、ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-A
R、20φ×250mm、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％
ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）によ
る逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で分画し
た。溶出パターンを図１に示す。この結果、活性フラク
ションＡが得られた。このフラクションＡをさらにフェ
ネチルカラム（Devosil PhA-T-5 、4.6 φ×250mm 、野
村化学社製）を用い、0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリ
ル濃度勾配（１％／分）による逆相クロマトグラフィー
（流速10ml／分）で精製した。溶出パターンを図２に示
す。活性画分をプロテインシークエンサー（４７７Ａ、
アプライドバイオシステムズ社製）で構造を解析したと
ころ、Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe の６残基からなるペプ
チドと確認した。このペプチドをβ−ネオカゾモルフィ
ン６と命名した。
【００１０】
【実施例３】ＬＡＰ消化物の調製 実施例２で得られたβ−カゼインのペプシン−パンクレ
アチン消化物 200mgに1/100 量のブタ腎臓由来ＬＡＰ
（Type III-CP 、シグマ社製 140unit/mg 蛋白質）を添
加し、pH８、37℃で16時間消化した。消化後10分間加熱
し酵素を失活させ、ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-AR、
20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％Ｔ
ＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による
逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で分画した。
溶出パターンを図３に示す。得られた活性フラクション
Ａ、Ｂ、Ｃをさらにフェネチルカラム（Devosil PhA-T-
5 、4.6 φ×250mm 、野村化学社製）を用い、0.1 ％Ｔ
ＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による
逆相クロマトグラフィー（流速10nl／分）でそれぞれ精
製した。溶出パターンを図４〜図６に示す。活性画分を
プロテインシークエンサー（４７７Ａ、アプライドバイ
オシステムズ社製）で構造を解析したところ、活性画分
Ａ及びＣには既知物質である［His8］β−カゾモルフィ
ン９及び［Pro8］β−カゾモルフィン９が確認され、
又、活性画分ＢにはTyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-
Asn-Ser-Leu-Pro-Gln の１３残基からなるペプチドを確
認した。これを［His8］β−カゾモルフィン１３と命名
した。なお、図５及び図６中の矢印は該当するピークを
示す。その他の図の矢印も同様である。
アチン消化物 200mgに1/100 量のブタ腎臓由来ＬＡＰ
（Type III-CP 、シグマ社製 140unit/mg 蛋白質）を添
加し、pH８、37℃で16時間消化した。消化後10分間加熱
し酵素を失活させ、ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-AR、
20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％Ｔ
ＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による
逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で分画した。
溶出パターンを図３に示す。得られた活性フラクション
Ａ、Ｂ、Ｃをさらにフェネチルカラム（Devosil PhA-T-
5 、4.6 φ×250mm 、野村化学社製）を用い、0.1 ％Ｔ
ＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による
逆相クロマトグラフィー（流速10nl／分）でそれぞれ精
製した。溶出パターンを図４〜図６に示す。活性画分を
プロテインシークエンサー（４７７Ａ、アプライドバイ
オシステムズ社製）で構造を解析したところ、活性画分
Ａ及びＣには既知物質である［His8］β−カゾモルフィ
ン９及び［Pro8］β−カゾモルフィン９が確認され、
又、活性画分ＢにはTyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-
Asn-Ser-Leu-Pro-Gln の１３残基からなるペプチドを確
認した。これを［His8］β−カゾモルフィン１３と命名
した。なお、図５及び図６中の矢印は該当するピークを
示す。その他の図の矢印も同様である。
【００１１】
【実施例４】トリプシン消化物の調製 実施例１で得られたβ−カゼインペプシン消化物 200mg
にウシ膵臓由来トリプシン（Type XIII 、シグマ社製 1
6,500unit/mg蛋白）を1/100 量添加してpH7.5、37℃で
５時間消化した後、10分間加熱し酵素を失活させた。得
られたトリプシン消化物をＯＤＳカラム（Cosmosil 5C
18-AR、20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／
分）による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で
分画した。溶出パターンを図７に示す。得られた活性フ
ラクションＡ、Ｂをさらにフェネチルカラム（Devosil
PhA-T-5 、 4.6φ×250mm 、野村化学社製）を用い、0.
1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）
による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で精製
した。溶出パターンをそれぞれ図８及び図９に示す。活
性画分に含まれるペプチドの構造をプロテインシークエ
ンサー（４７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）
で解析したところ、Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Thr-Glu-Ser-
Gln-Ser の１１残基からなるペプチド、及びTyr-Pro-Va
l-Glu-Pro-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thrの１３残基か
らなるペプチドが確認された。これらのペプチドをそれ
ぞれβ−ネオカゾモルフィン１１及びβ−ネオカゾモル
フィン１３と命名した。
にウシ膵臓由来トリプシン（Type XIII 、シグマ社製 1
6,500unit/mg蛋白）を1/100 量添加してpH7.5、37℃で
５時間消化した後、10分間加熱し酵素を失活させた。得
られたトリプシン消化物をＯＤＳカラム（Cosmosil 5C
18-AR、20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／
分）による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で
分画した。溶出パターンを図７に示す。得られた活性フ
ラクションＡ、Ｂをさらにフェネチルカラム（Devosil
PhA-T-5 、 4.6φ×250mm 、野村化学社製）を用い、0.
1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）
による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で精製
した。溶出パターンをそれぞれ図８及び図９に示す。活
性画分に含まれるペプチドの構造をプロテインシークエ
ンサー（４７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）
で解析したところ、Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Thr-Glu-Ser-
Gln-Ser の１１残基からなるペプチド、及びTyr-Pro-Va
l-Glu-Pro-Thr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thrの１３残基か
らなるペプチドが確認された。これらのペプチドをそれ
ぞれβ−ネオカゾモルフィン１１及びβ−ネオカゾモル
フィン１３と命名した。
【００１２】
【実施例５】ＬＡＰ消化物の調製 実施例４で得られたβ−カゼインペプシン−トリプシン
消化物にＬＡＰ（TypeIII-CP 、シグマ社製 140unit/mg
蛋白）を1/100 量添加して、pH８、37℃で１６時間消
化した後、10分間加熱し酵素を失活させた。得られたト
リプシン−ＬＡＰ消化物をＯＤＳカラム（Cosmosil 5C
18-AR、20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／
分）による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で
分画した。溶出パターンを図１０に示す。得られた活性
フラクションＣをさらにフェネチルカラム（Devosil Ph
A-T-5、 4.6φ×250mm 、野村化学社製）、及びシアノ
プロピルカラム（Cosmosil 5CN-R、 4.6φ×250mm 、ナ
カライテスク社製）をそれぞれ用い、0.1 ％ＴＦＡを含
むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による逆相クロ
マトグラフィー（流速10ml／分）で精製した。溶出パタ
ーンをそれぞれ図１１及び図１２に示す。活性画分に含
まれるペプチドの構造をプロテインシークエンサー（４
７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）で解析した
ところ、Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Le
u-Pro-Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr の２１残
基からなるペプチドと確認した。このペプチドを［Hi
s8］β−カゾモルフィン２１と命名した。
消化物にＬＡＰ（TypeIII-CP 、シグマ社製 140unit/mg
蛋白）を1/100 量添加して、pH８、37℃で１６時間消
化した後、10分間加熱し酵素を失活させた。得られたト
リプシン−ＬＡＰ消化物をＯＤＳカラム（Cosmosil 5C
18-AR、20φ×250mm 、ナカライテスク社製）を用い、
0.1 ％ＴＦＡを含むアセトニトリル濃度勾配（１％／
分）による逆相クロマトグラフィー（流速10ml／分）で
分画した。溶出パターンを図１０に示す。得られた活性
フラクションＣをさらにフェネチルカラム（Devosil Ph
A-T-5、 4.6φ×250mm 、野村化学社製）、及びシアノ
プロピルカラム（Cosmosil 5CN-R、 4.6φ×250mm 、ナ
カライテスク社製）をそれぞれ用い、0.1 ％ＴＦＡを含
むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による逆相クロ
マトグラフィー（流速10ml／分）で精製した。溶出パタ
ーンをそれぞれ図１１及び図１２に示す。活性画分に含
まれるペプチドの構造をプロテインシークエンサー（４
７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）で解析した
ところ、Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-Le
u-Pro-Gln-Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr の２１残
基からなるペプチドと確認した。このペプチドを［Hi
s8］β−カゾモルフィン２１と命名した。
【００１３】
【実施例６】合成による本発明ペプチドの製造方法 ［Pro8］β−カゾモルフィン２１の合成 市販の Boc（ブトキシカルボニル）−Gln −樹脂（置換
率0.5mEq/g） 0.2ｇと45％ＴＦＡ及び2.5 ％アニソール
を含む塩化メチレン20mlをペプチド合成装置（Ｓａｍ
Ｔｗｏ、バイオサーチ社製）の反応槽の中で室温で25分
間反応させてBoc 基を除去した。次に、Boc 基の除去さ
れたThr(Bzl)−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、次いで10
％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレンによ
り中和した後、更に塩化メチレンで洗浄した。この樹脂
に0.4M Boc−Gln のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌ、
0.4M ジイソプロピルカルボジミドの塩化メチレン溶液
５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２時間攪拌下に
反応させた。得られた樹脂を順にジメチルホルムアミ
ド、塩化メチレン、ジイソプロピルエチルアミンを10％
含有する塩化メチレン、塩化メチレン及び塩化メチレン
／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して Boc−アミノ
酸のカップリングを繰り返し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-P
he-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser(Bzl)-Leu-Pro-Gln-As
n-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr(Bzl)−樹脂からなる生成物を得
た。この樹脂を10％のアニソールを含有するフッ化水素
20mlに入れて０℃で２時間攪拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。その後、フッ化水素を減圧留去し、残留物
を30％酢酸で抽出し、それを凍結乾燥して粗ペプチド25
0mg を得た。ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-AR、20φ×
250mm 、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％ＴＦＡを
含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による逆相ク
ロマトグラフィー（流速10ml／分）により精製して最終
精製物100mg を得た。溶出パターンを図１３に示す。得
られたペプチドのアミノ酸組成（モル比）はTyr:Pro:Ph
e:Gly:Ile:Asn:Ser:Leu:Gln:Thr ＝1:7:1:1:2:2:1:2:2:
2 であった。更にプロテインシーケンサーにより分析し
たところ、[Pro8]β−カゾモルフィン21であることが確
認された。
率0.5mEq/g） 0.2ｇと45％ＴＦＡ及び2.5 ％アニソール
を含む塩化メチレン20mlをペプチド合成装置（Ｓａｍ
Ｔｗｏ、バイオサーチ社製）の反応槽の中で室温で25分
間反応させてBoc 基を除去した。次に、Boc 基の除去さ
れたThr(Bzl)−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、次いで10
％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレンによ
り中和した後、更に塩化メチレンで洗浄した。この樹脂
に0.4M Boc−Gln のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌ、
0.4M ジイソプロピルカルボジミドの塩化メチレン溶液
５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２時間攪拌下に
反応させた。得られた樹脂を順にジメチルホルムアミ
ド、塩化メチレン、ジイソプロピルエチルアミンを10％
含有する塩化メチレン、塩化メチレン及び塩化メチレン
／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して Boc−アミノ
酸のカップリングを繰り返し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-P
he-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser(Bzl)-Leu-Pro-Gln-As
n-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr(Bzl)−樹脂からなる生成物を得
た。この樹脂を10％のアニソールを含有するフッ化水素
20mlに入れて０℃で２時間攪拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。その後、フッ化水素を減圧留去し、残留物
を30％酢酸で抽出し、それを凍結乾燥して粗ペプチド25
0mg を得た。ＯＤＳカラム（Cosmosil 5C18-AR、20φ×
250mm 、ナカライテスク社製）を用い、0.1 ％ＴＦＡを
含むアセトニトリル濃度勾配（１％／分）による逆相ク
ロマトグラフィー（流速10ml／分）により精製して最終
精製物100mg を得た。溶出パターンを図１３に示す。得
られたペプチドのアミノ酸組成（モル比）はTyr:Pro:Ph
e:Gly:Ile:Asn:Ser:Leu:Gln:Thr ＝1:7:1:1:2:2:1:2:2:
2 であった。更にプロテインシーケンサーにより分析し
たところ、[Pro8]β−カゾモルフィン21であることが確
認された。
【００１４】
【実施例７】［Pro8］β−カゾモルフィン１３の合成 上記と同様の方法により、Boc −アミノ酸のカップリン
グを繰り返し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro
-Ile-Pro-Asn-Ser(Bzl)-Leu-Pro-Gln −樹脂からなる生
成物を得た。これを精製し、最終精製物70mgを得た。溶
出パターンを図１４に示す。アミノ酸組成（モル比）は
Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn:Ser:Leu:Gln＝1:5:1:1:1:1:
1:1:1 であり、プロテインシーケンサーにより[Pro8]β
−カゾモルフィン13ペプチドであることが確認された。
グを繰り返し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro
-Ile-Pro-Asn-Ser(Bzl)-Leu-Pro-Gln −樹脂からなる生
成物を得た。これを精製し、最終精製物70mgを得た。溶
出パターンを図１４に示す。アミノ酸組成（モル比）は
Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn:Ser:Leu:Gln＝1:5:1:1:1:1:
1:1:1 であり、プロテインシーケンサーにより[Pro8]β
−カゾモルフィン13ペプチドであることが確認された。
【００１５】
【実施例８】オピオイド活性の測定 体重３００〜３５０ｇのモルモットより抽出した回腸か
ら縦走筋神経叢標本を調製し、該標本の一端を糸を介し
て等長性トランスジューサに接続し、他端を内容積２ｍ
ｌのマグナス管の底に固定した。マグナス管にはクレブ
ス−リンゲル液を満たし、３７℃の温度に保ち、Ｏ2 ／
ＣＯ2 混合ガス（９５：５）を通気した。マグナス管内
の電極には１０秒に１回の割合で電気刺激（10V 、0.5
msec）を与え、筋収縮を張力を電気的に記録した。収縮
を50％抑制するオピオイド物質濃度（μＭ）をＩＣ50と
して測定した。結果を表１に示す。
ら縦走筋神経叢標本を調製し、該標本の一端を糸を介し
て等長性トランスジューサに接続し、他端を内容積２ｍ
ｌのマグナス管の底に固定した。マグナス管にはクレブ
ス−リンゲル液を満たし、３７℃の温度に保ち、Ｏ2 ／
ＣＯ2 混合ガス（９５：５）を通気した。マグナス管内
の電極には１０秒に１回の割合で電気刺激（10V 、0.5
msec）を与え、筋収縮を張力を電気的に記録した。収縮
を50％抑制するオピオイド物質濃度（μＭ）をＩＣ50と
して測定した。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】 オピオイド活性 ─────────────────────────── ペプチド ＩＣ50（μＭ） ─────────────────────────── β−カゾモルフィン７（対照） ３．２ β−ネオカゾモルフィン６ ５９ β−ネオカゾモルフィン１１ ６４７ β−ネオカゾモルフィン１３ ５７６ [His8] β−カゾモルフィン１３ ２．９ [His8] β−カゾモルフィン２１ ４．４ [Pro8] β−カゾモルフィン１３ ４．２ [Pro8] β−カゾモルフィン２１ ８．５ ───────────────────────────
【００１７】
【発明の効果】本発明は、β−カゼインを基質として複
数の酵素で分解することにより新規なペプチドを得るこ
とができた。また、これらの新規ペプチドをペプチド合
成法により得ることができた。これらのペプチドはオピ
オイド活性を示し、中枢神経抑制、鎮咳、鎮痛、鎮静、
止瀉等の生理活性を示すので医薬として有用である。
数の酵素で分解することにより新規なペプチドを得るこ
とができた。また、これらの新規ペプチドをペプチド合
成法により得ることができた。これらのペプチドはオピ
オイド活性を示し、中枢神経抑制、鎮咳、鎮痛、鎮静、
止瀉等の生理活性を示すので医薬として有用である。
【００１８】
配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile His Asn Ser Leu Pro Gln 1 5 10
【００１９】配列番号：２ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln 1 5 10
【００２０】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile His Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro 1 5 10 15 Pro Leu Thr Gln Thr 20
【００２１】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro 1 5 10 15 Pro Leu Thr Gln Thr 20
【００２２】配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００２３】配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００２４】配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr 1 5 10
【図１】実施例２における、活性フラクションＡのＯＤ
Ｓカラムからの溶出パターンを示す。
Ｓカラムからの溶出パターンを示す。
【図２】実施例２における、本発明のβ−ネオカゾモル
フィン６のフェネチルカラムからの溶出パターンを示
す。
フィン６のフェネチルカラムからの溶出パターンを示
す。
【図３】実施例３における、活性画分Ａ，Ｂ及びＣのＯ
ＤＳカラムからの溶出パターンを示す。
ＤＳカラムからの溶出パターンを示す。
【図４】実施例３における、活性画分Ａの公知物質の[H
is8]β- カゾモルフィン9 のフェネチルカラムからの溶
出パターンを示す。
is8]β- カゾモルフィン9 のフェネチルカラムからの溶
出パターンを示す。
【図５】実施例３における、活性画分Ｂの本発明の[His
8]β- カゾモルフィン13のフェネチルカラムからの溶出
パターンを示す。
8]β- カゾモルフィン13のフェネチルカラムからの溶出
パターンを示す。
【図６】実施例３における、活性画分Ｃの公知物質の[H
is8]β- カゾモルフィン 9のフェネチルカラムからの溶
出パターンを示す。
is8]β- カゾモルフィン 9のフェネチルカラムからの溶
出パターンを示す。
【図７】実施例４における、活性画分Ａ及びＢのＯＤＳ
カラムからの溶出パターンを示す。
カラムからの溶出パターンを示す。
【図８】実施例４における、活性画分Ａの本発明β−ネ
オカゾモルフィン11のフェネチルカラムからの溶出パタ
ーンを示す。
オカゾモルフィン11のフェネチルカラムからの溶出パタ
ーンを示す。
【図９】実施例４における、活性画分Ｂの本発明のβ-
ネオカゾモルフィン13のフェネチルカラムからの溶出パ
ターンを示す。
ネオカゾモルフィン13のフェネチルカラムからの溶出パ
ターンを示す。
【図１０】実施例５における、活性画分のＯＤＳカラム
からの溶出パターンを示す。
からの溶出パターンを示す。
【図１１】実施例５における、活性画分Ｃのフェネチル
カラムからの溶出パターンを示す。
カラムからの溶出パターンを示す。
【図１２】実施例５における、本発明の[Pro8]β- カゾ
モルフィン21のシアノプロピルカラムからの溶出パター
ンを示す。
モルフィン21のシアノプロピルカラムからの溶出パター
ンを示す。
【図１３】実施例６における、本発明の[His8]β- カゾ
モルフィン21のＯＤＳカラムからの溶出パターンを示
す。
モルフィン21のＯＤＳカラムからの溶出パターンを示
す。
【図１４】実施例６における、本発明の[Pro8]β- カゾ
モルフィン13のＯＤＳカラムからの溶出パターンを示
す。
モルフィン13のＯＤＳカラムからの溶出パターンを示
す。
Claims (1)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列[I] または[II]で示さ
れるペプチド。 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-A-Asn-Ser-Leu-Pro-Gln-B [I] (アミノ酸配列中 AはHis またはPro を示し、B はカル
ボキシル基末端またはAsn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Th
rを示す) 。 Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-C [II] (アミノ酸配列中 Cはカルボキシル基末端、Thr-Glu-Ser
-Gln-Ser またはThr-Glu-Ser-Gln-Ser-Leu-Thr を示す)
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7094516A JPH08269090A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 新規ぺプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7094516A JPH08269090A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 新規ぺプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08269090A true JPH08269090A (ja) | 1996-10-15 |
Family
ID=14112498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7094516A Pending JPH08269090A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | 新規ぺプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08269090A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000075173A3 (en) * | 1999-06-02 | 2002-07-11 | Regen Therapeutics Plc | Peptide fragments of colostrinin |
| WO2002046211A3 (en) * | 2000-12-06 | 2003-03-13 | Regen Therapeutics Plc | Peptides derived from colostrinin |
| WO2004092206A1 (ja) * | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Meiji Dairies Corporation | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤、機能性食品ならびに機能性食品の製造方法 |
| CN114106096A (zh) * | 2021-11-16 | 2022-03-01 | 华南理工大学 | 一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用 |
-
1995
- 1995-03-28 JP JP7094516A patent/JPH08269090A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000075173A3 (en) * | 1999-06-02 | 2002-07-11 | Regen Therapeutics Plc | Peptide fragments of colostrinin |
| WO2002046211A3 (en) * | 2000-12-06 | 2003-03-13 | Regen Therapeutics Plc | Peptides derived from colostrinin |
| WO2004092206A1 (ja) * | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Meiji Dairies Corporation | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤、機能性食品ならびに機能性食品の製造方法 |
| CN114106096A (zh) * | 2021-11-16 | 2022-03-01 | 华南理工大学 | 一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用 |
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