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CN114106096A - 一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用 - Google Patents

一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用 Download PDF

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CN114106096A
CN114106096A CN202111358479.2A CN202111358479A CN114106096A CN 114106096 A CN114106096 A CN 114106096A CN 202111358479 A CN202111358479 A CN 202111358479A CN 114106096 A CN114106096 A CN 114106096A
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赵谋明
钱兢菁
郑淋
赵翊君
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Guangdong Huatai Biological Technology Co ltd
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
Guangdong Huatai Biological Technology Co ltd
South China University of Technology SCUT
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Abstract

本发明公开了一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用，所述六肽的一级结构氨基酸序列为Tyr‑Pro‑Val‑Glu‑Pro‑Phe，分子量为750.85Da。本发明的六肽既可以化学合成，也可以从酪蛋白酶解产物中定向制备。本发明的六肽具有明显的改善睡眠活性，主要体现在能够显著提高小鼠入睡率及延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。同时还能显著增加抑制性神经递质γ‑氨基丁酸GABA与兴奋性神经递质谷氨酸Glu的比值，具有很好的增强小鼠睡眠效果，可直接用于预防和治疗失眠或睡眠障碍疾病的食品或药物中。

Description

一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用
技术领域
本发明属于功能性多肽领域，具体涉及一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用。
背景技术
失眠是指难以入睡或难以保持睡眠的状态，包括睡眠潜伏期长、睡眠持续时间短、多梦或易醒。人的一生中有三分之一的时间都是睡眠，睡眠不足会导致一系列问题，如日间生活质量下降、疲劳、焦虑、记忆力下降，甚至严重失眠还会引发抑郁症及免疫功能障碍。根据2020年WHO一项最新的调查报告显示，中国失眠人群已高达36.1％左右。失眠日益成为困扰人们最严峻的问题之一，并且近年来还逐渐趋于年轻化，90后年轻人群由于晚睡、熬夜、压力、焦虑等问题，失眠人群日益增加。目前，常用于治疗睡眠的药物主要是苯二氮卓类、利眠宁等西药，以及酸枣仁、γ-氨基丁酸等天然活性物质，但西药存在一定的副作用，而已报道的天然活性物质，食源性成分较少，有待于进一步开发新的食物来源的改善睡眠活性物质。
现有技术中含抗焦虑十肽YLGYLEQLLR(α-CZP)的酪蛋白胰蛋白酶酶解物已证明，该酶解物具有显著延长大鼠戊巴比妥钠诱导睡眠时间的效果。但是酪蛋白胰蛋白酶酶解产物中是否含有其他具有改善睡眠活性的肽尚且未知。此外，已发表的中国专利公开了菜籽多肽与五味子水提物及协同改善睡眠的方法，表明菜籽多肽与五味子复配具有改善睡眠功效，但并未提出具体是哪一条多肽或哪种小分子化合物发挥作用。同时中国专利公开了具有改善睡眠功能的多肽草本固体饮料的配方，同样只提供了一种具有改善睡眠功效的配方。因此，目前关于食源性改善睡眠活性多肽的研究，还有所不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有改善睡眠活性的六肽。
本发明的另一目的在于提供一种具有改善睡眠活性的六肽在预防和治疗失眠或睡眠障碍疾病的食品或药物中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案之一实现。
一种具有改善睡眠活性的六肽，所述六肽的氨基酸序列为Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe，分子量为750.85Da。
进一步地，一种具有改善睡眠活性的六肽的应用，所述六肽在预防和治疗失眠或睡眠障碍疾病的食品或药物中的应用，所述应用具体包括：直接用于片剂、固体饮料应用，或者与其他具有改善睡眠活性成分的复配。
进一步地，所述的六肽可通过固相合成获得。
进一步地，所述六肽可通过现有技术的化学固相合成法获得。
进一步地，所述六肽的制备工艺从酪蛋白酶解产物中提取分离获得，采用所述工艺，以酪蛋白酶解产物计，六肽的释放量能达到质量百分含量——1.2％。
进一步地，所述的六肽具体由以下步骤分离获得：
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:6～1:12加水搅拌，升温至37～50℃，加入酪蛋白质量0.1～1.0％的蛋白酶，酶解4～6h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级超高效液相色谱(UPLC)分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
进一步地，所述的六肽由以下具体步骤分离获得：(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:6～1:12加水搅拌，升温至50～60℃，加入酪蛋白质量0.1～1.0％的蛋白酶，酶解4～5h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级超高效液相色谱(UPLC)分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
进一步地，步骤(1)所述酪蛋白的来源包括牛乳、水牛乳、羊乳、骆驼乳。
步骤(1)所述的蛋白酶包括胰酶及木瓜蛋白酶。
进一步地，所述食品具体包括功能饮料、片剂、粉剂、压片糖果、凝胶糖果。
进一步地，所述食品或药物包括缓解压力、焦虑或抑郁类、镇静安眠类保健品或药物。
进一步地，直接用于片剂、固体饮料应用，所述六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末的含量为1wt％-5wt％，麦芽糊精的含量为50wt％-59wt％，山梨糖醇的含量为30wt％-35wt％，充分混合，过筛，造粒，压片成品，所述食品为食品添加剂、功能食品、保健食品。
进一步地，所述六肽可以应用于食品或药物中还含有其他具有改善睡眠或抗焦虑功效的活性成分和/或可接受的辅料，包括脱脂奶粉、γ氨基丁酸、胶原蛋白肽，发挥协同增效作用。
一种具有改善睡眠活性的六肽在预防和治疗失眠或睡眠障碍疾病的食品或药物中的应用，所述应用具体包括以下几种形式：
(1)直接用于片剂、固体饮料应用，所述六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末、麦芽糊精和山梨糖醇混合后进行过筛、造粒、喷雾干燥后制得组合物；
(2)与其他具有改善睡眠或抗焦虑功效的活性成分和/或可接受的辅料，所述可接受的辅料包括脱脂奶粉、γ氨基丁酸、胶原蛋白肽其中一种或多种。
进一步地，所述食品为普通食品、食品添加剂、功能食品、保健食品。
进一步地，所述食品或药物包括缓解压力、焦虑或抑郁类、镇静安眠类保健品或药物。
进一步地，所述食品包括功能饮料、片剂、粉剂、压片糖果、凝胶糖果。
进一步地，所述食品为功能食品、保健食品时，可以是各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明的六肽能显著提高戊巴比妥钠诱导小鼠入睡率，极显著延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。
(2)本发明的六肽还能显著增加抑制性神经递质GABA与兴奋性神经递质Glu比值，从而具有显著的改善睡眠活性，可以用于制备具有改善睡眠功效的功能食品及保健食品。
(3)本发明的六肽可以用于预防和治疗失眠和睡眠障碍疾病的普通食品、食品添加剂、功能食品或缓解压力、焦虑及抑郁、镇静安眠保健食品或药物中，发挥改善睡眠功效。
附图说明
图1为液相-质谱鉴定具有改善睡眠活性的六肽Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe的二级谱图。
图2为实施例1中六肽与对比例1中α-CZP在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中的入睡率结果柱状图。
图3为六肽纯化组分应用在食品中的样品在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中的入睡率结果柱状图。
图4为实施例1中六肽与对比例1中α-CZP在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中的睡眠时间结果柱状图。
图5为六肽纯化组分应用在食品中的样品在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中的睡眠时间结果柱状图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
下列实施例中涉及的实验方法：
(1)质谱鉴定方法
使用超高效液相色谱联用质谱(UPLC-MS/MS)鉴定生物活性肽，采用梯度洗脱色谱分离，联用二级质谱鉴定定量，洗脱速度为0.2mL/min，进样量为2μL。流动相A为0.1％甲酸水，B为乙腈(色谱纯)，洗脱程序为：0～10min，22％～47％B；10～12min，47％～90％B；12～14min，90％B；14～15min，90％～5％B；15～18min，5％B平衡至初始状态。质谱参数：电子轰击离子源能量7eV，毛细管电压4500V，离子源温度200℃，干燥气体流量8.0L/min，雾化器压力1.5bar，质量扫描范围m/z 50～1500。
(2)延长戊巴比妥钠睡眠时间实验
参考《保健食品检验与评价技术规范》中第十章、改善睡眠功能检验方法进行测定。(其中空白对照组为口服灌胃相同剂量的超纯水，阳性对照组为腹腔注射1mg/kg的安定类药物地西泮，而其他样品多肽组别均设置口服灌胃5mg/kg，0.1mL/10g)
(3)GABA/Glu比值测定方法
使用在售的酶联免疫测试盒及普通测试盒分别测定血清中GABA和Glu的相对含量，然后通过计算获得二者比值。
实施例1
固相合成法合成改善睡眠活性的六肽：
将1g二氯树脂溶胀、洗涤，脱除9-芴甲氧羰基保护基(Fmoc保护基)后加入氨基酸进行缩合反应，重复脱保护—缩合的过程直至所有氨基酸连接完毕。切割树脂，得到改善睡眠活性的六肽粗品，用反相高效液相色谱法纯化，得到六肽纯品。
图1为液相-质谱鉴定具有改善睡眠活性的六肽Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe的二级谱图。由图1可以观察到，实施例1纯化多肽纯品鉴定是六肽Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe。
实施例2
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:6加水搅拌，升温至37℃，先加入酪蛋白质量0.3％的胰酶，37℃酶解2h后升温至95℃灭酶15min，得到酶解液，再加入0.4％的木瓜蛋白酶，50℃酶解4h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级UPLC分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
实施例3
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:12加水搅拌，升温至50℃，加入酪蛋白质量0.2％的胰酶直接复合0.5％的木瓜蛋白酶，50℃酶解4h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级UPLC分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
实施例4
改善睡眠活性的六肽在食品中的应用
取0.5g脱脂奶粉(牛乳源，蛋白质含量17.5％)，麦芽糊精的含量为50wt％，山梨糖醇的含量为35wt％，改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末的含量为5wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
实施例5
改善睡眠活性的六肽在食品中的应用
取0.5g食品级γ-氨基丁酸，麦芽糊精的含量为55wt％，山梨糖醇的含量为32wt％，改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末的含量为3wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
实施例6
改善睡眠活性的六肽在食品中的应用
取0.5g食品级胶原蛋白肽，麦芽糊精的含量为59wt％，山梨糖醇的含量为30wt％，改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末的含量为1wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
对比例1
固相合成法合成YLGYLEQLLR(α-CZP)十肽：
将1g二氯树脂溶胀、洗涤，脱除Fmoc保护基后加入氨基酸进行缩合反应，重复脱保护—缩合的过程直至所有氨基酸连接完毕。切割树脂，得到多肽YLGYLEQLLR(α-CZP)粗品，用反相高效液相色谱法纯化，得到多肽纯品。
对比例2
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:12加水搅拌，升温至37℃，加入酪蛋白质量1％的胰酶，37℃酶解6h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级UPLC分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
对比例3
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:6加水搅拌，升温至50℃，加入酪蛋白质量0.3％的胰酶复合0.4％的木瓜蛋白酶，50℃酶解4h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物通过制备级UPLC分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
对比例4
取0.5g脱脂奶粉(牛乳源，蛋白质含量17.5％)，麦芽糊精的含量为50wt％，山梨糖醇的含量为35wt％，其余部分由白砂糖代替改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末，白砂糖的含量为5wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
对比例5
取0.5g食品级γ-氨基丁酸，麦芽糊精的含量为55wt％，山梨糖醇的含量为32wt％，其余部分由白砂糖代替改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末，白砂糖的含量为3wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
对比例6
取0.5g食品级胶原蛋白肽，麦芽糊精的含量为59wt％，山梨糖醇的含量为30wt％，其余部分由白砂糖代替改善睡眠活性的六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末，白砂糖的含量为1wt％，充分混合，过筛，造粒，压片。
由图2可知，戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验中，空白对照组入睡率为50％，而阳性对照组、实施例1及对比例1口服灌胃组显著提高戊巴比妥钠诱导小鼠入睡率，分别高达91.67％(p<0.01)和83.33％(p<0.05)，66.67％。而已报道抗焦虑十肽α-CZP口服灌胃后，小鼠入睡率仅50％，与空白对照组无显著性差异。说明本发明改善睡眠活性的六肽能够有效改善小鼠入睡率，具有改善难以入睡问题的功效。
由图3所示，空白对照组入睡率为50％，对比例4～6组小鼠入睡率分别为60％，66.67％，60％，均无显著差异，而实施例4～6组能显著提高小鼠入睡率，具体分别为85.71％(p<0.05)，83.33％(p<0.05)，78.57％(p<0.05)，说明改善睡眠肽在食品中添加不存在拮抗作用，甚至与γ-氨基丁酸、胶原蛋白肽等食品组合可能可以发挥协同增效作用。
根据图4所示，空白对照组睡眠时间为559.00±272.24s，而阳性对照组、实施例1及对比例1口服灌胃组极显著延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，分别高达4007.88±895.54s和2501.63±1021.21s(p<0.001)，2044.50±886.48s(p＜0.001)。而已报道抗焦虑十肽α-CZP口服灌胃后，小鼠睡眠时间为1366.14±826.06s(p<0.01)，与空白对照组有显著性差异，具有改善睡眠效果，但与本发明改善睡眠活性的六肽相比，本发明改善睡眠活性的六肽显著延长睡眠时间。说明本发明改善睡眠活性的六肽能有效延长小鼠睡眠时间，并且比抗焦虑十肽α-CZP的改善睡眠活性更强，具有改善睡眠时长的功效。
由图5所示，空白对照组睡眠时间为559.00±272.24s，对比例4～6组睡眠时间分别为1115.8±578.07s(p<0.05)，1944.5±886.48s(p<0.01)，748.5±136.85s，而实施例4～6组同样能显著延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，具体分别为2577.5±1355.07s(p<0.001)，2521.63±1646.89s(p<0.001)，2044.5±886.48s(p<0.01)，说明改善睡眠肽在食品中添加不存在拮抗作用，甚至还可以发挥协同增效作用。
根据表1可知，本发明改善睡眠活性的六肽可极显著降低兴奋性神经递质谷氨酸Glu的含量，同时也明显增加抑制性神经递质γ-氨基丁酸GABA的含量，二者比值相比空白对照组显著增加，因此本发明改善睡眠活性的六肽极有可能通过大脑中枢GABA能神经系统发挥作用。并且相较对比例1中十肽α-CZP而言，本发明改善睡眠活性的六肽组别的二者比值也更高，从而具有更强的改善睡眠效果。
根据表2可知，对实施例2-3及对比例2-3所得成品纯化组分进行超高效液相色谱联用质谱外标定量法，计算本发明所得改善睡眠活性的六肽在酪蛋白酶解产物中释放质量百分含量(以酪蛋白酶解产物计)，实施例2-3分别显著高于对比例2-3(p＜0.05)，特定的酶解工艺才能显著释放改善睡眠六肽，从而发挥显著改善睡眠功效。
表1不同组别小鼠外周血清中GABA和Glu含量
Figure BDA0003358098390000071
注：*代表与空白对照组相比具有显著差异(p＜0.05)，**代表与空白对照组相比具有极显著差异(p＜0.01)。
表2酪蛋白酶解产物中释放改善睡眠活性的六肽的质量百分含量
Figure BDA0003358098390000081
注：*代表实施例2-3分别与对比例2-3相比具有显著差异(p＜0.05)。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有改善睡眠活性的六肽，其特征在于，所述六肽的氨基酸序列为Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe。
2.一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述六肽在预防和治疗失眠或睡眠障碍疾病的食品或药物中的应用，所述应用具体包括：直接用于片剂、固体饮料应用，或者与其他具有改善睡眠活性成分的复配。
3.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述的六肽可通过固相合成获得。
4.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述六肽的制备工艺从酪蛋白酶解产物中提取分离获得，采用所述工艺，以酪蛋白酶解产物计，六肽的释放量能达到质量百分含量——1.2％。
5.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述的六肽具体由以下步骤分离获得：
(1)酪蛋白酶水解：将酪蛋白与水按质量比1:6～1:12加水搅拌，升温至37～50℃，加入酪蛋白质量0.1～1.0％的蛋白酶，酶解4～6h后升温至95℃灭酶15min，酶解液经过滤浓缩和喷雾干燥获得酪蛋白酶解物；
(2)将得到的酪蛋白酶解物分离纯化，分别经过乙醇分离分级处理、凝胶过滤色谱柱G25分离纯化收集，最后通过制备级UPLC分离纯化得到7.5-7.8min处组分，经质谱鉴定后为改善睡眠活性的六肽。
6.根据权利要求5所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，步骤(1)所述酪蛋白的来源包括牛乳、水牛乳、羊乳、骆驼乳。
7.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述食品具体包括功能饮料、片剂、粉剂、压片糖果、凝胶糖果。
8.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述食品或药物包括缓解压力、焦虑或抑郁类、镇静安眠类保健品或药物。
9.根据权利要求2所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，直接用于片剂、固体饮料应用，所述六肽的纯化组分浓缩液的喷雾干燥粉末的含量为1wt％-5wt％，麦芽糊精的含量为50wt％-59wt％，山梨糖醇的含量为30wt％-35wt％，充分混合，过筛，造粒，压片成品，所述食品为食品添加剂、功能食品、保健食品。
10.根据权利要求2任一项所述一种具有改善睡眠活性六肽的应用，其特征在于，所述六肽可以应用于食品或药物中还含有其他具有改善睡眠或抗焦虑功效的活性成分和/或可接受的辅料，包括脱脂奶粉、γ氨基丁酸、胶原蛋白肽，发挥协同增效作用。
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