[go: up one dir, main page]

CN117338905B - 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117338905B
CN117338905B CN202311374181.XA CN202311374181A CN117338905B CN 117338905 B CN117338905 B CN 117338905B CN 202311374181 A CN202311374181 A CN 202311374181A CN 117338905 B CN117338905 B CN 117338905B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sleep
peptide
casein peptide
hydrolyzed casein
percent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311374181.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN117338905A (zh
Inventor
刘飞
陈媛媛
曹庸
李双祁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Greencream Biotech Co ltd
Original Assignee
Greencream Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Greencream Biotech Co ltd filed Critical Greencream Biotech Co ltd
Priority to CN202311374181.XA priority Critical patent/CN117338905B/zh
Publication of CN117338905A publication Critical patent/CN117338905A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117338905B publication Critical patent/CN117338905B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于功能性寡肽技术领域，公开了一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用。得到的水解酪蛋白肽具备（1）延长睡眠总时长；（2）减少觉醒次数；（3）提高血清褪黑素的含量；（4）提高血清色氨酸的含量的作用，本发明制备得到的睡眠肽可以用于奶粉、固体饮料、饮料、压片糖果等多种形式的产品中；功效活性含量高（500mg/天/人以上有效），白色粉末、冲调性/溶解性好（溶液澄清透明）、流动性好、耐高温（满足生产高温灭菌需求），可以较好的改善中失眠人群的入睡困难、睡眠浅、睡眠过程中易醒、无法长时间睡眠、白天犯困、没有精神等多种睡眠障碍，促进内源β‑NMN生成，可以较好的缓解疲劳、改善精神状态等，具备广泛的应用前景。

Description

一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能性寡肽技术领域，更具体的，涉及一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用。
背景技术
多个研究已经证明牛乳中含有能促进睡眠的肽。2009年Saint-Hilaire研究的结果证明牛乳源促睡眠肽对人睡眠也有促进作用，长期施用牛乳源络蛋白水解肽在4周期间对睡眠的各个方面具有显著影响。
现有研究发现牛乳经过胰蛋白酶水解后再进行等电点沉淀的牛乳源促睡眠肽，多是采用全细胞膜片钳技术检测发现其具有较好的促睡眠效果，但是目前对促睡眠的研究的数据较少，对睡眠的各个指正检测不够全面。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽(下文简称为睡眠肽)。
本发明的第二个目的是提供上述睡眠肽的制备方法。
本发明的第三个目的是提供含有上述睡眠肽的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供水解酪蛋白肽在制备具有促睡眠作用的产品中的应用，该水解酪蛋白肽的氨基酸序列为SLSQSK。
优选的，所述水解酪蛋白肽的用量为500-1000mg/天。
优选的，所述水解酪蛋白肽具备以下至少一种功能：
(1)延长睡眠总时长；
(2)减少觉醒次数；
(3)提高血清褪黑素的含量；
(4)提高血清色氨酸的含量。
优选的，所述水解酪蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
(1)加酪蛋白3-4倍质量的水，在40℃-50℃条件下搅拌溶解；
(2)加入无花果蛋白酶进行酶解，加酶量为酪蛋白质量的0.15％-0.2％，反应温度40℃-50℃，反应时间1h-2h，pH 7.0-9.0；
(3)将温度调节至80-90℃，保温20min-30min，进行灭菌；
(4)调pH值4.0-5.0，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀；
(5)纯化：调pH值3.0-4.0，温度-20℃-4℃，乙醇浓度40％-60％，静置4h-6h，离心，除去沉淀，保留上清液；
(6)阴离子交换树脂纯化：上清液调整纯化液pH为7.0，使用717阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用0.5％的盐酸洗脱；
(7)反相硅胶纯化：洗脱液再进行反相硅胶纯化，
HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：10mL/min；检测波长：236nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～50min，25％～40％；50.01min～80min，40％～75％；80.01min～90min，75％～90％；90.01min～100min，90％～25％。重复进样，收集洗脱峰；
(8)干燥：经过冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥的任意一种，对得到的产物进行干燥成粉即得。
优选的，所述产品为保健品、功能性食品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以酪蛋白为原料，通过定向可控酶解，得到上述水解酪蛋白肽具备显著的促睡眠功能。
得到的水解酪蛋白肽具备(1)延长睡眠总时长；(2)减少觉醒次数；(3)提高血清褪黑素的含量；(4)提高血清色氨酸的含量的作用，本发明制备得到的睡眠肽可以用于奶粉、固体饮料、饮料、压片糖果等多种形式的产品中；低苦味、活性高(500mg/天/人以上有效)，白色粉末、冲调性/溶解性好(溶液澄清透明)、流动性好、耐高温(满足生产高温灭菌需求)、可以酸溶解(果汁pH4.0左右，一般的蛋白/肽会沉淀)、且严格控制钠、钾、钙、含量(适合特医用)，具备广泛的应用前景。
附图说明
图1为实验研究流程图；
图2为服用睡眠肽或安慰剂两周后主观睡眠质量及日间功能、带式睡眠监测仪指标的变化情况；A、服用睡眠肽或安慰剂两周后主观睡眠质量(PSQI、ISI)及日间功能(焦虑水平、压力水平、疲劳水平)的问卷得分变化情况变化；B、服用睡眠肽或安慰剂两周后带式睡眠监测仪指标的变化情况(睡眠时长、REM期时长、浅睡时长、深睡时长)*，干预一周与基线时比较，#，干预两周与基线时比较，*/#P<0.05，**/##,P<0.01，***/###，P<0.001；
图3为不同剂量睡眠肽干预对血清代谢物的影响；A、OPLSDA显示不同剂量干预对血清代谢物的影响及Vplot(LDS：低剂量组干预后、HDS：高剂量组干预后、PS：安慰剂干预后)；
图4为不同剂量睡眠肽干预对血清代谢物的调节趋势；红色代表上调，绿色代表下调，蓝色代表无统计学差异(LDB：低剂量组基线、HDB：高剂量组基线、PB：安慰剂组基线、LDS：低剂量组干预后、HDS：高剂量组干预后、PS：安慰剂干预后)；
图5为随机森林图显示重要性前10种血清代谢物；
图6为褪黑素合成途径相关代谢物含量(LDB：低剂量组基线、HDB：高剂量组基线、PB：安慰剂组基线、LDS：低剂量组干预后、HDS：高剂量组干预后、PS：安慰剂干预后)；
图7为血清睡眠相关因子含量干预前后变化；SP，P物质；Melatonln，褪黑素；NA，去甲肾上腺素；γ-GABA，伽马氨基丁酸；NPY，神经肽Y物质。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1睡眠肽的制备
以酪蛋白为原料，通过定向可控酶解，获得含有活性的睡眠肽。
具体包括以下步骤：
(1)向烧杯中加纯水300mL，开搅拌200rpm，向烧杯中缓慢投入酪蛋白100g，在40℃条件下搅拌溶解。
(2)加入无花果蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量为酪蛋白质量的0.2％，反应温度45℃，反应时间1h，pH 8.0。
(3)将温度调节至85℃，保温30min，进行灭菌。
(4)调pH值4.5，3000r/min离心30min，除去未酶解的大分子蛋白沉淀。
(5)上清液调pH值3.0，温度4℃，乙醇浓度50％，静置4h，离心，弃去沉淀，收集上清液；
(6)上清液调整纯化液pH为7.0，使用717阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用0.5％的盐酸洗脱。
(7)洗脱液再进行反相硅胶纯化，HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：10mL/min；检测波长：236nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～50min，25％～40％；50.01min～80min，40％～75％；80.01min～90min，75％～90％；90.01min～100min，90％～25％。重复进样，收集洗脱峰。
(8)浓缩干燥。收集洗脱峰后真空浓缩，冷冻干燥，得到的睡眠肽。
测定睡眠肽的氨基酸序列为：SLSQSK。
实施例2睡眠肽的应用
样品：睡眠肽，浅黄至白色外观，添加辅料制成片剂。规格：420mg/片，睡眠肽的有效量为250mg/片，60片/瓶。安慰剂在剂型、口感、外观和包装上与样品相同。
志愿者纳入标准：
1)年龄18-60岁。
2)性别不限。
3)身体质量指数18.5-23.9公斤/平方米。
4)生命体征正常(血压低于140/90mmHg(即收缩压低于140mmHg，舒张压低于90mmHg，心率在60-100bpm之间)。
3)匹兹堡睡眠质量指数得分>7。
4)符合原发性失眠症的症状。
5)已签署书面知情同意书。
排除标准：
1)已确诊患有重度焦虑、抑郁症患者。
2)酒精或药物依赖者。
3)每天吸烟超过10支。
4)对牛奶蛋白或睡眠肽成分过敏。
5)继发性失眠患者。
6)纳入前一个月使用过治疗失眠的药物。
7)正在进行失眠的非药物治疗(如认知行为疗法、放松疗法等)。
8)怀孕或哺乳期。
9)有癌症或其他重大疾病者。
10)不愿或不能完成整个试验者。
样本含量计算：按照文献记载，以下公式计算样本含量，设置检验水准α＝0.05，检验效能β＝0.8，计算得75人，考虑10％的失访率，样本含量为82人。
实验分组：符合条件的所有志愿者被随机分配。基于外部独立第三方集中生成随机列表，睡眠肽与安慰剂包装分别分布独立编号。在治疗阶段，受试者与研究实施人员对研究治疗分组盲目，除非在特殊的医疗情况下，否则不能接触到随机化代码。每个受试者按分组结果参与治疗，包括安慰剂(压片载体，2片)、低剂量睡眠肽(500mg/次，2片)、高剂量睡眠肽(1000mg/次，4片)，要求志愿者每天在睡觉前30分钟内口服。
实验方法：睡眠肽和安慰片剂的尺寸、外观、颜色、气味和味道一致。均以药瓶形式提供给志愿者。每个药瓶中都装够足量片剂(30片)。采用Excel随机数字表法对纳入的志愿者进行随机分组，分别为安慰剂组、低剂量睡眠肽组、高剂量睡眠肽组。志愿者入组后出现睡眠障碍时为第0天，第0、14天使用带式睡眠监测仪监测睡眠情况、并进行血液样本采集，第0、7、14天完成相关问卷调查，调查问卷包括个人基本信息采集表、共识睡眠日记(CSD)、匹兹堡睡眠质量指数问卷(PSQI)、失眠严重程度指数(ISI)、疲劳量表(FS-14)、焦虑自评量表(SAS)、压力知觉量表(CPSS)。
睡眠质量监测：本次试验采用带式睡眠监测仪进行睡眠质量监测。以下为产品参数。型号：睡眠监测仪，品牌：CARENT/凯伦特，生产企业：杭州博博科技，保健用品产品名称：睡客睡眠监测仪。测定原理：主要采用压电感应薄膜或其他致电感应元件作为传感器。睡眠状态下，人体因呼吸引起的姿态变化和脉搏的振动通过弹性硅胶压片传递到传感器而获得电信号，经放大和滤波处理后分离出呼吸和心率信号，将该信号传递至处理器统计，从而获取人体睡眠数据，用户可以透过睡眠数据了解身体状况，及时进行调整身体状况。监测指标包括：睡眠总时长、觉醒次数、浅睡时长、深睡时长、REM期时长。该睡眠监测仪体积小巧轻便，不影响受试者睡眠，可持续监测，且经济方便，可用于居家睡眠记录。受试者在基线和干预后都使用该带式睡眠监测仪监测睡眠情况。其通过监测受试者肢体活动的发生和程度，进而判断其睡眠情况。
在基线和干预7天、14天时，受试者完成对睡眠质量、焦虑、压力、疲劳反应评估。调查问卷包括个人基本信息采集表、共识睡眠日记(CSD)、匹兹堡睡眠质量指数问卷(PSQI)、失眠严重程度指数(ISI)、疲劳量表(FS-14)、焦虑自评量表(SAS)、压力知觉量表(CPSS)。量表通过面谈或问卷星APP完成。
一、研究流程
如图1所示，本次试验招募志愿者100人，随机化分配至低剂量组33人、高剂量组33人、安慰剂组34人。其中低剂量组因样本采集不全，流失5人，完成随访28人；高剂量组因疫情原因未及时采样，流失7人，完成随访26人；安慰剂组因样本采集不全，流失6人，完成随访28人。完成随访及进入数据分析的志愿者共82人。
二、研究对象的人口学特征
3组志愿者性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义，具有可比性。见表1。
三、主观睡眠质量及日间功能
如图2所示，与基线相比，服用低、高剂量睡眠肽或安慰剂7、14天后，匹兹堡睡眠质量指数显著下降(P<0.001)，失眠严重程度指数显著下降(P<0.01)，焦虑自评量表得分显著下降(P<0.001)，日间压力水平显著下降(P<0.05)，该4类量表得分变化情况显示干预组与安慰剂组比较无统计学意义。
与基线相比，服用高剂量睡眠肽7天后疲劳水平显著降低(P<0.05)，服用低剂量和高剂量睡眠肽或安慰剂7、14天后，疲劳量表-14量表得分显著下(P<0.05)，但干预组与安慰剂组比较无统计学意义(图2B)。与基线相比，服用安慰剂两周后，睡眠总时长缩短(P<0.05)；低、高剂量组睡眠总时长延长(P>0.05)。与安慰剂组比较，低、高剂量组睡眠总时长差异有统计学意义(P<0.05)。不同剂量睡眠肽和安慰剂在干预前后深睡时长、浅睡时长、REM期时长无显著差异。
四、觉醒次数
参考现有技术，定义减分率＝(基线觉醒次数-治疗后觉醒次数)/基线觉醒次数×100％。减分率>30％为有效；≤30％为无效。计算各组干预前后有效例数。14天干预后，低剂量组有效率(53.6％)显著高于安慰剂组有效率(14.3％)(P<0.01)，结果如表2。
表2
五、主观睡眠质量、日间功能有效性分析
安慰剂组与高、低剂量睡眠肽14天干预后匹兹堡睡眠质量指数、失眠严重程度指数、焦虑自评表、压力知觉量表、疲劳量表-14有效率无显著性差异，见表3。
表3安慰剂或高、低剂量水解酪蛋白肽干预后主观睡眠质量、日间功能有效性
六、血清代谢组学分析
1、不同剂量睡眠肽干预对血清代谢物的影响
OPLS-DA显示不同剂量干预对血清代谢物均产生影响。基于OPLS-DA分析的Vplot，以VIP值大于1、P值≤0.05筛选差异性代谢物，共得到203种差异性代谢产物(图3)。并以log2FC＞1.2、log2FC＜-1.2，P值≤0.05定义代谢物上调与下调标准。与安慰剂组比较，上调的血清代谢物：低剂量组118种，高剂量组68种。下调的血清代谢物：低剂量组85种，高剂量58种。与干预前相比，干预后上调血清代谢物：低剂量组：72种，高剂量组81种，安慰剂组77种。下调血清代谢物：低剂量组16种，高剂量组37种，安慰剂组16种(图4)。
如图5所示，对随机森林图重要性前10的血清代谢物分别是cis-Gadoleic、Tipredane、Nervinic acid、Sphingosine、Beta Carboline、Endoxifen O-glucuronide、9(10)-EpOME、“LydoPA(0:0/18:2(9Z,12Z))”、Deoxycholic acid 3-glucuonide、7-Carboxy-alpha-chromanol。
2、血清中与褪黑素合成途径相关代谢物相对含量
在色氨酸代谢通路产物中(图6)，与基线和安慰剂组比较，低、高剂量干预后血清褪黑素相对含量均显著升高(P<0.05)。与基线相比，低(P<0.001)、高剂量(P<0.05)干预后血清色氨酸含量显著升高。与基线和安慰剂组比较，低、高剂量(P<0.001)干预后5-甲基四氢叶酸相对含量显著升高(P<0.01)。与基线相比，低、高剂量干预后二氢叶酸含量显著升高(P<0.001)。与安慰剂比较，高剂量组L-色氨醇含量显著升高(P<0.05)。与安慰剂比较，低剂量组N-乙酰血清素硫酸酯(血清素转化为褪黑素的中间产物)含量显著下降(P<0.0001)。与基线相比，低剂量干预后β-烟酰胺-d-核糖核苷酸含量显著升高。与基线相比，低、高剂量、安慰剂干预后喹啉酸含量显著升高(P<0.001)。
3、血清睡眠相关因子
如图7所示，与基线相比，低、高剂量、安慰剂组干预后P物质含量显著降低，P<0.001，与安慰剂组比较，低、高剂量组P物质含量升高，P<0.05。与基线相比，低、高剂量、安慰剂组干预后褪黑素含量显著升高，P<0.001。与基线相比，低、高剂量、安慰剂组干预后去甲肾上腺素含量显著升高，P<0.001，与安慰剂组比较，低剂量组去甲肾上腺素含量升高，P<0.05。与基线相比，低、高剂量、安慰剂组干预后γ-氨基丁酸物质含量显著升高，P<0.001。与基线相比，低、高剂量、安慰剂组干预后神经肽Y含量显著升高，P<0.001。
讨论：在本次研究的主要结果显示，14天的水解酪蛋白肽干预后，睡眠总时长与觉醒次数均有显著的改善效应。但不同剂量的水解酪蛋白肽对睡眠质量的改善效果不同。低、高计量的水解酪蛋白肽能显著延长睡眠总时长，但本次试验结果总睡眠时长延长时间略长，可能是因为使用了较高剂量的水解酪蛋白肽所致。对减少觉醒次数方面，低剂量组有效率(53.6％)高于安慰剂组有效率(14.3％)，P<0.01。低剂量的水解酪蛋白肽(500mg)对减少觉醒次数方面效应显著。
血清代谢组学的研究显示苯丙尿酸代谢是酪蛋白肽改善睡眠障碍人群睡眠质量的一条重要通路。苯丙氨酸作为机体的必须氨基酸，在苯丙氨酸羟化酶的作用下转化成酪氨酸，酪氨酸在神经系统和肾上腺髓质中产生多巴胺、去甲肾上腺素以及肾上腺素，这些兴奋性神经递质参与了睡眠-觉醒周期,是引起失眠的重要神经递质。多巴胺是肾上腺素和去甲肾上腺素合成的前体，多巴胺首先转化为去甲肾上腺素，然后转化为肾上腺素。脑内的去甲肾上腺素主要由低位脑干肾上腺素能神经末梢合成和分泌，去甲肾上腺素作用于下丘脑、丘脑、基底前脑调节睡眠觉醒。
大部分安眠药物直接或者间接通过抑制去甲肾上腺素发挥治疗作用。多项实验研究提示，肾上腺素反应系统对于维持觉醒和调节睡眠觉醒状态非常重要，电生理研究发现肾上腺能神经元的放电与觉醒状态密切相关。虽然研究结果多样或者效应短暂，但是损毁肾上腺素能神经元引起睡眠觉醒改变。给予肾上腺素能受体的激动剂或者拮抗剂引起睡眠时间减少或者增多。奎宁酸(Quinic acid)是色氨酸代谢为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)途径的中间产物。同时色氨酸作为原料合成的褪黑素，是一种由松果体分泌的吲哚类激素，能够有效缩短睡眠睡眠潜伏期、治疗或缓解睡眠障碍。本次研究发现，不同剂量的水解酪蛋白肽干预能提高色氨酸合成褪黑素途径的相关物质。因此水解酪蛋白肽可能激活该条通路。研究表明。P物质作为兴奋性神经递质使人处于兴奋清醒状态，增加入睡难度。低、高剂量的水解酪蛋白肽能显著降低血清P物质含量促进睡眠。综上所述，水解酪蛋白肽可能通过影响褪黑素合成途径来发挥促睡眠作用。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.水解酪蛋白肽在制备具有促睡眠作用的产品中的应用，其特征在于，该水解酪蛋白肽的氨基酸序列为SLSQSK；所述水解酪蛋白肽的用量为500-1000mg/天。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水解酪蛋白肽具备以下至少一种功能：
(1)延长睡眠总时长；
(2)减少觉醒次数；
(3)提高血清褪黑素的含量；
(4)提高血清色氨酸的含量。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水解酪蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
(1)加酪蛋白3-4倍质量的水，在40℃-50℃条件下搅拌溶解；
(2)加入无花果蛋白酶进行酶解，加酶量为酪蛋白质量的0.15％-0.2％，反应温度40℃-50℃，反应时间1h-2h，pH 7.0-9.0；
(3)将温度调节至80-90℃，保温20min-30min，进行灭菌；
(4)调pH值4.0-5.0，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀；
(5)纯化：调pH值3.0-4.0，温度-20℃-4℃，乙醇浓度40％-60％，静置4h-6h，离心，除去沉淀，保留上清液；
(6)阴离子交换树脂纯化：上清液调整纯化液pH为7.0，使用717阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用0.5％的盐酸洗脱；
(7)反相硅胶纯化：洗脱液再进行反相硅胶纯化，
HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：10mL/min；检测波长：236nm；进样量：2mL；流动相：A泵超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B泵乙腈，B泵初始浓度为25％；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min～50min，25％～40％；50.01min～80min，40％～75％；80.01min～90min，75％～90％；90.01min～100min，90％～25％；重复进样，收集洗脱峰；
(8)干燥：经过冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥的任意一种，对得到的产物进行干燥成粉即得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为保健品、功能性食品。
CN202311374181.XA 2023-10-23 2023-10-23 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用 Active CN117338905B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311374181.XA CN117338905B (zh) 2023-10-23 2023-10-23 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311374181.XA CN117338905B (zh) 2023-10-23 2023-10-23 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117338905A CN117338905A (zh) 2024-01-05
CN117338905B true CN117338905B (zh) 2024-05-03

Family

ID=89357215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311374181.XA Active CN117338905B (zh) 2023-10-23 2023-10-23 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117338905B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117919377A (zh) * 2023-11-27 2024-04-26 广州绿萃生物科技有限公司 水解酪蛋白寡肽及其在辅助降血压中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050051734A (ko) * 2003-11-28 2005-06-02 학교법인 건국대학교 베타-카세인 생성능을 갖는 포유동물 유선 세포주에 의한베타-카세인 단백질의 생산방법
WO2009138762A2 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Regen Therapeutics Plc Therapeutic use of peptides
CN105085651A (zh) * 2015-09-02 2015-11-25 广州绿萃生物科技有限公司 一种酪蛋白磷酸肽单体及其制备方法
CN105548531A (zh) * 2015-12-14 2016-05-04 华南农业大学 利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法
CN114106096A (zh) * 2021-11-16 2022-03-01 华南理工大学 一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用
WO2023124266A1 (zh) * 2021-12-27 2023-07-06 江南大学 一种检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0029777D0 (en) * 2000-12-06 2001-01-17 Regen Therapeutics Plc Peptides

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050051734A (ko) * 2003-11-28 2005-06-02 학교법인 건국대학교 베타-카세인 생성능을 갖는 포유동물 유선 세포주에 의한베타-카세인 단백질의 생산방법
WO2009138762A2 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Regen Therapeutics Plc Therapeutic use of peptides
CN105085651A (zh) * 2015-09-02 2015-11-25 广州绿萃生物科技有限公司 一种酪蛋白磷酸肽单体及其制备方法
CN105548531A (zh) * 2015-12-14 2016-05-04 华南农业大学 利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法
CN114106096A (zh) * 2021-11-16 2022-03-01 华南理工大学 一种具有改善睡眠活性的六肽及其应用
WO2023124266A1 (zh) * 2021-12-27 2023-07-06 江南大学 一种检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of an integrated chromatographic system for on-line digestion and characterization of phosphorylated proteins;C Temporini等;《Journal of Chromatography. A》;20080118;第1183卷(第1-2期);摘要、第66页右栏-67页及表2 *
Effect of processing on polyamine content and bioactive peptides released after in vitro gastrointestinal digestion of infant formulas;C Gómez-Gallego等;《Journal of Dairy Science》;20151210;第99卷(第2期);第924-932页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117338905A (zh) 2024-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN117338905B (zh) 一种具有促睡眠作用的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用
Stacy et al. Apomorphine for the acute treatment of “off” episodes in Parkinson's disease
Unno et al. Ingestion of green tea with lowered caffeine improves sleep quality of the elderly via suppression of stress
WO2022099527A1 (zh) 一种养心安神药物组合物及其制备方法和应用
JP2004521919A (ja) 抗ストレス機能、抗疲労機能、月経前期症候群及び月経痛緩和機能及び脳神経栄養因子としての機能を有する酵母由来機能性ペプチド及びその製造方法
CN101791314B (zh) 藏红花素在制备催眠类药物中的用途
CN117482214B (zh) 一种改善中老年失眠的水解酪蛋白肽及其制备方法和应用
CN106666746A (zh) 具有调节神经递质平衡功能的芦笋组合物及其制备方法、芦笋组合物粉剂
Dehghanmehr et al. Effect of oral saffron capsules on sleep quality in patients with diabetes at Zabol-Iran
CN113559130A (zh) 一种酸枣仁枯草芽孢杆菌共发酵产物及其制备方法和应用
CN118787096B (zh) 一种提高睡眠质量的组合物及其制备方法和应用
Michelakis et al. Plasma renin activity and levodopa in Parkinson's disease
CN101711240B (zh) 睡眠改善剂
CN119185517A (zh) 一种治疗失眠的药食同源食物提取物的组合物
CN108186688A (zh) 一种促进睡眠的组合物
US10568939B2 (en) Composition and method for improving sleep duration and quality
CN110604783A (zh) 一种治疗失眠的中药组合物饮品及其制备方法
CN109157540A (zh) 麦饭石在制备防治过敏性疾病、精神类疾病、代谢类疾病和内分泌紊乱疾病药物中的应用
CN109288858A (zh) 姜石在制备防治过敏性疾病、精神类疾病、代谢类疾病和内分泌紊乱疾病药物中的应用
Nedachi et al. Effect of combining sleep-promoting food intake and electric field application on sleep in healthy participants: A pilot study
CN102225160A (zh) 一种治疗美尼尔氏综合症的中药制剂
US9855292B2 (en) Cyanocobalamin, methylcobalamin, and/or adenosylcobalamin to help maintain a pain-free head and pain-free body and provide defense against headaches and body pain
CN105073122A (zh) 人参皂苷组合物
CN114027508A (zh) 一种改善睡眠的功能性食品γ-氨基丁酸复方制剂
Yaroslav et al. AMNESIA AFTER THE HEMORRHAGIC AND ISCHEMIC STROKE: IS IT POSSIBLE TO MINIMIZE ITS DEVELOPMENT ALREADY IN INTENSIVE CARE?

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant