DE69428292T2

DE69428292T2 - Rekombinanter c140-rezeptor, seine agonisten und antagonisten

Info

Publication number: DE69428292T2
Application number: DE69428292T
Authority: DE
Inventors: M. Scarborough; Johan Sundelin
Original assignee: COR Therapeutics Inc
Current assignee: COR Therapeutics Inc
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-26
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2014-07-27
Also published as: EP0804452A4; EP0804452A1; NO960341L; JPH09503906A; AU7516794A; NO960341D0; KR960703939A; CA2168232A1; EP0804452B1; DE69428292D1; AU701677B2; US5629174A; CN1057118C; WO1995003318A1; CN1131950A; NZ271516A; ATE205502T1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich auf einen neu entdeckten Rezeptor, der ein Glied der G- Protein-gekoppelten Rezeptor-Superfamilie ist. Der Rezeptor wird in endothelialen Zellen in Blutgefäßen exprimiert. Die Vermeidung von Wirkungen auf diesen Rezeptor ist ein essentielles Element bei der Begrenzung der Nebenwirkungen von Arzneimitteln, die zur Stimulation anderer Rezeptoren in dieser Familie verabreicht werden.

Stand der Technik

Reaktionen von Tieren auf viele therapeutische und prophylaktische Arzneimittel werden durch Rezeptoren vermittelt, die an Zelloberflächen ansässig sind. Eine Klasse solcher Rezeptoren umfasst die G-Protein-gekuppelten Rezeptoren, deren physiologische Wirkung durch einen Proteinkomplex mit drei Untereinheiten, die sog. G-Proteine, vermittelt wird, die an diesen Rezeptortyp unter anschließender Freisetzung einer Untereinheit binden, wobei zusätzliche intrazelluläre Vorgänge in Bewegung gesetzt werden. Rezeptoren dieser Unterklasse umfassen u. a. adrenergene Rezeptoren, Neuropeptidrezeptoren, den Thrombinrezeptor und den C140-Rezeptor, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Diese Rezeptorklasse wird durch das Vorliegen von sieben Transmembranregionen charakterisiert, die den Rezeptor in der Zelloberfläche verankern.
Es ist das schwer fassbare Ziel der Gestalter therapeutischer Substanzen, eine gewünschte Antwort in einem Subjekt ohne Nebenwirkungen zu erreichen. Entsprechend sollten Arzneimittel, die geplant wurden, um auf einen spezifischen Rezeptor abzuzielen, z. B. den Thrombinrezeptor, spezifisch mit dem Thrombinrezeptor reagieren und keine Wirkung auf verwandte Rezeptoren haben. Der C140-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann bei der Regulierung des vaskulären Drucks involviert sein und eine unabsichtliche Stimulation oder Blockierung dieses Rezeptors würde unvorhersagbare und daher unerwünschte Resultate haben. Es ist daher nützlich, im voraus zu bestimmen, ob therapeutische Reagenzien, die für ein Ziel, z. B. den Thrombinrezeptor, bestimmt sind, den unerwünschten Nebeneffekt der Reaktivität mit dem C140-Rezeptor haben werden oder nicht.
Durch Bereitstellung der rekombinanten Materialien für die Produktion des C140- Rezeptors in zweckdienlichen Assaysystemen, sowie von Agonist- und Antagonist- Reagenzien zur Verwendung in diesem Assay ermöglicht die Erfindung die Vorherbestimmung des Vorliegens oder der Abwesenheit der Nebenwirkung einer Reaktivität mit dem C140-Rezeptor bei Kandidaten-Arzneimitteln. Diese Nebenwirkung wird üblicherweise unerwünscht sein, da angenommen wird, dass der C140-Rezeptor auf Enzyme, z. B. Serinproteasen, welche mit Verletzungen und Immunstörungen in Verbindung stehen, reagiert.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung stellt Verfahren und Materialien bereit, die in Assaysystemen verwendbar sind, um die Neigung von Kandidaten-Arzneimitteln, unerwünschte Nebenwirkungen aufzuweisen, zu bestimmen. Die Isolierung, die rekombinante Produktion und die Charakterisierung des C140-Rezeptors erlauben den Aufbau eines Assaysystems unter Verwendung des Rezeptors als Substrat und unter Verwendung von Agonisten und Antagonisten für den Rezeptor als Kontrollreagenzien in diesem Assay.
Somit ist die Erfindung nach einem Aspekt auf rekombinante Materialien gerichtet, die mit der Produktion des C140-Rezeptors in Verbindung stehen. Diese umfassen z. B. transfizierte Zellen, die kultiviert werden können, so dass sie den C140-Rezeptor an ihren Oberflächen zeigen; auf diese Weise wird ein Assaysystem für die Wechselwirkung von Materialien mit dem nativen C140-Rezeptor bereitgestellt. Im Allgemeinen sind die Beschränkungen bei den Wirtszellen, die in diesen Assaysystemen verwendbar sind, die, dass die Zellen den geeigneten Mechanismus aufweisen, um den Rezeptor an ihren Oberflächen aufzuweisen und das G-Protein als Mediator für die intrazelluläre Antwort enthalten. (Allerdings erfordern Assay, die nur die Bindung untersuchen, kein G-Protein). Die meisten Tierzellen erfüllen diese Anforderungen.
Nach einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf C140-Rezeptor- Agonisten gerichtet, die die aktivierte Form des extrazellulären Teils des Rezeptorproteins nachahmen. Diese Agonisten sind als Kontrollreagenzien in dem oben beschriebenen Assay verwendbar, um die Funktionsfähigkeit des Assaysystems zu verifizieren. Außerdem können Agonisten für den C140-Rezeptor in vivo hypotensive Wirkungen aufweisen. Dementsprechend können die Agonisten selbst auch als Antihypertensiva nützlich sein.
Nach einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf C140-Rezeptor- Antagonisten gerichtet. Diese Antagonisten umfassen modifizierte Formen der C140- Rezeptor-Agonist-Peptide, denen essentielle Merkmale fehlen, die zur Aktivierung des Rezeptors erforderlich sind. Diese Antagonisten binden an Rezeptor, aktivieren ihn nicht und verhindern eine Rezeptoraktivierung durch Agonisten und den nativen Rezeptor- Bindungsliganden.
Eine zweite Antagonistengruppe umfasst Antikörper, die zur Bindung spezifischer Teile des Rezeptorproteins konstruiert sind. Im Allgemeinen sind diese monoklonalen Antikörperpräparate, die für einen gewünschten Bereich des C140-Rezeptors hochspezifisch sind. Die Antikörper der Erfindung sind auch in Immunoassays auf das Rezeptorprotein verwendbar, z. B. bei der Prüfung der erfolgreichen Expression des Gens in Rekombinationssystemen.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Assaysysteme, die rekombinanten C-Rezeptor verwenden, um auf Agonist- und Antagonist-Aktivität von Kandidaten-Arzneimitteln durchzumustern. Dieser Assay ist speziell bei der Sicherstellung, dass diese therapeutischen Mittel keine unerwünschten Nebenwirkungen haben, die durch Aktivierung oder Inhibierung des C140-Rezeptors verursacht werden, haben, anwendbar in einigen Fällen kann Agonist-Aktivität bei diesem Rezeptorsystem therapeutischen Nutzen haben. Einige dieser Assaysysteme beinhalten die Verwendung der Agonistenpeptide als positive Kontrollen. Der Assay kann auch verwendet werden, um nach Antagonisten durchzumustern, die die agonistische Wirkung inhibieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Diagnose von Bedingungen, die durch Aktivierung des C140-Rezeptors charakterisiert sind, durch Detektion des Peptids, dass vom C140-Rezeptor abgespalten wird, wenn der Rezeptor aktiviert wird, in Flüssigkeiten wie Blut oder Urin. Ein weiteres Diagnoseverfahren, das von der Erfindung umfasst wird, ist eine Sichtbarmachung der aktivierten Rezeptorformen durch Lokalisieren eines Bilderzeugungsmittels am aktivierten Rezeptor in situ, wobei Antikörper verwendet werden, die für den aktivierten Rezeptor spezifisch sind.
Weitere Aspekte der Erfindung sind auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, die die Agonisten und Antagonisten der Erfindung enthalten. Die Agonisten der Erfindung sind Antihypertensiva; umgekehrt können die Antagonisten, wenn gewünscht, den Blutdruck erhöhen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A und Fig. 1B (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) zeigen die DNA- und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von Maus-C140-Rezeptor.
Fig. 2A und Fig. 2B (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) zeigen DNA- und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von humanem C140-Rezeptor.
Fig. 3 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) zeigt einen Vergleich der Aminosäure- Sequenzen des humanen C140-Rezeptors und des Maus-C140-Rezeptors.
Fig. 4 zeigt ein vorgeschlagenes Modell für die C140-Rezeptor-Aktivierung, basierend auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Fig. 5 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7) zeigt einen Vergleich der Aminosäure- Sequenzen für den Maus-C140-Rezeptor und den humanen Thrombinrezeptor.
Fig. 6 zeigt die Resultate des Northern Blot, um das Vorliegen von mRNA, die für den C140-Rezeptor codiert, in verschiedenen Mausgeweben nachzuweisen.
Fig. 7 zeigt eine Blutdruckaufzeichnung, die die hypotensive in vivo-Wirkung eines C140-Argonistpetids zeigt.
Fig. 8 zeigt eine Blutgefäßdilatation in einer femoralen Rattenvene, induziert durch C140-Rezeptor Agonistpeptid. Fig. 8a zeigt diese Resultate in der immobilisierten Vene; Fig. 8b zeigt diese Resultate für die immobilisierte Vene, die von endothelialen Zellen befreit ist.
Fig. 9 zeigt die Resultate eines Assays zur Aktivierung des C140-Rezeptors, exprimiert in Frosch-Oozyten, durch Plasmin, Kallikrein oder Trypsin. Fig. 9a zeigt die Resultate für Plasmin; Fig. 9b zeigt die Resultate für Kallikrein; Fig. 9c zeigt die Resultate für Trypsin.
Fig. 10A und 10B (SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60) zeigen die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz eines cDNA-Klons, der für Maus-C140- Rezeptor codiert.
Fig. 11A und 11B (SEQ ID NO: 61 und SEQ ID NO: 62) zeigen die Nukleotid- Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz eines cDNA-Klons, der für humanen C140-Rezeptor codiert ist.
Fig. 12 zeigt die Resultate einer in situ-Hybridisierung einer sezierten neugeborenen Maus mit Maus-C140-Rezeptorsonden.
Fig. 13 zeigt einen Northern Blot der Gesamt-RNA aus humanen Zellenlinien, die an eine humane C140-Rezeptorsonde hybridisiert sind.

Bester Modus zur Durchführung der Erfindung

Die Charakteristika des C140-Rezeptors, die durch die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, sind in den Fig. 1 bis 4 zusammengefasst. Die Fig. 1A und 1B (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) zeigen die vollständige DNA-Sequenz des Klons, der für den Mausrezeptor codiert, zusammen mit der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz. Der Ausdruck "C140-Rezeptor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Rezeptor in irgendeiner Tierspezies, der dem Mausrezeptor entspricht, der in Klon C140 enthalten ist, der hier in Beispiel 1 beschrieben wird. Unter Verwendung der nativen DNA, die für die Mausform dieses Rezeptors codiert, können die entsprechenden Rezeptoren in anderen Spezies einschließlich Menschen, wie es hier erläutert wird, erhalten werden. Die Fig. 2A und 2B (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) zeigen die entsprechende DNA und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des humanen Rezeptors.
Die gesamte Aminosäure-Sequenz des Maus-Rezeptors enthält 395 Aminosäuren, einschließlich eines 27-Aminosäure-Signalpeptids, die, wenn es abgespalten wird, in einem reifen 368-Aminosäurerezeptorprotein resultiert. In ähnlicher Weise wird der humane Rezeptor durch ein offenes Leseraster codiert, das 398 Aminosäuren entspricht, einschließlich einer wahrscheinlich 29-Aminosäure-Signalpeptidsequenz, das in einem reifen 369- Aminosäurerezeptorprotein resultiert, was in den Fig. 2A und 2B gezeigt ist.
Fig. 3 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) zeigt einen Vergleich der humanen und der Maus-Aminosäure-Sequenzen; wie dargestellt ist, weisen diese Sequenzen einen hohen Homologiegrad auf.
Hydrophobität/Hydrophilität-Diagramme der Sequenzen, die in den Fig. 1A und 1B und 2A und 2B (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3) dargestellt sind, geben an, dass der reife C140-Rezeptor ein Glied der 7-Transmembran-Domänen-Rezeptorfamilie ist, deren Wirkung auf die Zelle durch das G-Protein vermittelt wird. Der reife C140-Rezeptor hat eine relativ lange extrazelluläre Aminosäureextension, die mehrere Consensus-Stellen für eine Asparagin-gebundene Glycosylierung hat. Er enthält auch ein konserviertes Asparagin in der ersten Transmembranregion, das Motiv Leu-Ala-X-X-Asp in der zweiten Transniembranregion, ein Trp in der vierten Transmembranregion und einen Carboxy-terminalen Schwanz, der mehrere Serin- und Threonin-Reste enthält. Ein vorgeschlagenes Modell des in situ-Rezeptors ist in Fig. 4 dargestellt.
Aus Fig. 5 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7) sind Ähnlichkeiten zum Thrombinrezeptor leicht zu erkennen.
Fig. 5 vergleicht die Aminosäure-Sequenz von Maus-C140 mit der des Thrombinrezeptors. Es ist bekannt, dass der Thrombinrezeptor durch proteolytische Spaltung der Arg-Ser-Bindung bei den Positionen 41 und 42 aktiviert wird, was ein Aktivierungspeptid freisetzt, das eine Rückfaltung des Rezeptors und eine Aktivierung über das neu geschaffene Aminoende erlaubt. In analoger Weise wird der C140-Rezeptor durch Spaltung der Arg- Ser-Bindung bei den Positionen 34 und 35 aktiviert, wobei ebenfalls eine Aktivierungspeptid freigesetzt wird, das sich von Position 1 des vermeindlichen reifen Proteins zur Spaltungsstelle erstreckt. Es wird angenommen, das Arg-28 der Aminoterminale Aminosäurerest des reifen Proteins ist, so dass das Aktivierungspeptid die Sequenz RNNSKGR (SEQ ID NO: 8) hat. So könnte dieses Peptid als Index für eine Aktivierung des C140-Rezeptors verwendet werden. In jedem Fall ist die genaue Lage des N-Endes des reifen Proteins für den Aufbau von Agonisten oder Antagonisten unwichtig. Das Aktivierungspeptid wird wahrscheinlich leicht in freier Form durch die Niere filtriert und möglicherweise im Urin konzentriert und kann als Index einer Aktivierung des C140-Rezeptors verwendet werden.
Eine Freisetzung des Aktivierungspeptids erlaubt eine Rückfaltung des Rezeptorproteins zur Aktivierung des Rezeptors. Dies ist schematisch in Fig. 4 dargestellt, welche auch zeigt, dass Konformationsänderungen, die aus der Freisetzung des Aktivierungpeptids und einer Rückfaltung resultieren, zu einer intrazellulären Konformationsveränderung des Rezeptors führen. Diese Hypothese wird durch die Feststellung bestätigt, dass der C140- Rezeptor durch ein Peptid aktiviert werden kann, dass das neue Amino-Ende, welches durch die Aktivierung geschaffen wurde, nachahmt. Dementsprechend verhalten sich Mimics (bzw. Nachahmungen) des N-Endes des neuen Amino-Endes am aktivierten Rezeptor als Agonisten dafür. Die Bedeutung der ersten fünf Aminosäuren im neu geschaffenen Amino-Ende im Rezeptor zur Rezeptoraktivierung wurde im folgenden ebenfalls bestätigt.
Basierend auf dieser Information und in Analogie zu den Mechanismen, die einer Trypsinogenaktivierung zu Trypsin und der Aktivierung des Thrombin-Rezeptors zu Grunde liegen, scheint es, dass die positiv geladene Aminogruppe am Serin, das frisch freigelegt wird, wenn der Ligand den Rezeptor spaltet, eine wichtige Rolle bei der Rezeptoraktivierung spielt. Peptide, die auf der Agonistpeptidsequenz basieren, die den C140-Rezeptor bindet, die aber so modifiziert sind, dass die freie Alpha-Aminogruppe fehlt, können als Antagonisten dieses Rezeptors fungieren. Somit dienen Modifikationen der Agonistenpeptide, denen die Fähigkeit zur spezifischen aktivierenden Wechselwirkung fehlt, als C140- Rezeptor-Antagonisten.

Verbindungen der Erfindung

Die zur Beschreibung der Peptidverbindungen der Erfindung verwendete Nomenklatur folgt der gängigen Praxis, bei der die N-terminale Aminogruppe an die linke Seite und die Carboxygruppe an die rechte Seite jedes Aminosäurerests im Peptid gestellt wird. In den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der Erfindung darstellen, sollen die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, obgleich dies oft nicht spezifisch gezeigt ist, so verstanden werden, dass sie in der Form vorliegen, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden, es sei denn es ist etwas anderes spezifiziert. So ist es klar, dass N-terminales H&spplus;&sub2; und C-terminales O&supmin; bei physiologischem pH vorliegen, obgleich dies in spezifischen Beispielen oder allgemeinen Formeln nicht notwendigerweise spezifiziert oder dargestellt ist. Freie funktionelle Gruppen an den Seitenketten der Aminosäurereste können auch durch Amidierung, Acylierung oder andere Substitution, was z. B. die Löslichkeit der Verbindungen ändern kann, ohne ihre Aktivität zu beeinträchtigen, modifiziert sein.
In den dargestellten Peptiden wird jeder Gen-codierte Rest, wenn geeignet, durch eine Ein-Buchstaben-Bezeichnung, die dem Trivialnamen der Aminosäure entspricht, entsprechend der folgenden gängigen Liste dargestellt:
Die Aminosäuren, die genetisch nicht codiert werden, werden, wie in der folgenden Diskussion angegeben, abgekürzt.
In den spezifischen Peptiden, die in der vorliegenden Anmeldung dargestellt sind, ist die L-Form irgendeines Aminosäurerest, der ein optisches Isomeres hat, gemeint, wenn nicht ausdrücklich die D-Form durch ein hochgestelltes Kreuz angezeigt wird (&spplus;).
Die Verbindungen der Erfindung sind Peptide, die teilweise als Aminosäurereste konstruierter Klassen definiert werden. Aminosäurereste können im Allgemeinen in die vier folgenden Hauptunterklassen eingeteilt werden:
Sauer: Der Rest hat in Folge des Verlustes eines H-Ions bei physiologischem pH eine negative Ladung und der Rest wird durch eine wässrige Lösung angezogen, so dass er die Oberflächenpositionen in der Konformation eines Peptids sucht, in dem er enthalten ist, wenn das Peptid in wässrigem Medium bei physiologischen pH vorliegt.
Basisch: Der Rest hat durch Assoziation mit einem H-Ion bei physiologischem pH eine positive Ladung und der Rest wird durch eine wässrige Lösung angezogen, so dass er in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, die Oberflächenpositionen sucht, wenn das Peptid in wässrigem Medium bei physiologischem pH vorliegt.
Neutral/nicht-polar: Die Reste werden bei physiologischem pH nicht geladen und der Rest wird durch eine wässrige Lösung abgestoßen, so dass sie die inneren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem der Rest enthalten ist, suchen, wenn das Peptid in einem wässrigem Medium ist. Die Reste werden hier auch als "hydrophob" bezeichnet.
Neutral/polar: Die Reste sind bei physiologischem pH nicht geladen, allerdings wird der Rest durch eine wässrige Lösung angezogen, so dass er die äußeren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, sucht, wenn das Peptid in einem wässrigem Medium ist.
Es ist natürlich klar, dass bei einer statistischen Sammlung einzelner Restmoleküle einige Moleküle geladen sein werden und einige nicht und es wird in stärkerem oder geringerem Ausmaß eine Anziehung in das wässrige Medium oder eine Abstoßung aus einem wässrigem Medium bestehen. Eine angepasste Definition für "geladen" bedeutet, dass ein bedeutender Prozentanteil (mindestens etwa 25%) der einzelnen Moleküle bei physiologischem pH geladen sind. Das Ausmaß einer Anziehung oder Abstoßung, die zur Klassifizierung als polar oder nicht-polar erforderlich ist, ist willkürlich und daher wurden Aminosäuren, die von der vorliegenden Erfindung spezifisch ins Auge gefasst werden, als das eine oder das andere klassifiziert. Die meisten Aminosäuren, die nicht spezifisch genannt werden, können auf der Basis ihres bekannten Verhaltens klassifiziert werden.
Aminosäurereste können ferner als zyklisch oder nicht-zyklisch und aromatisch oder nicht-aromatisch, durch selbstverständliche Klassifikationen bezüglich der Seitenketten-Subsituentengruppen der Reste und als klein oder groß subklassifiziert werden. Der Rest wird als klein angesehen, wenn er einschließlich des Carboxylkohlenstoffs insgesamt vier Kohlenstoffatome oder weniger enthält. Kleine Reste sind natürlich immer nichtaromatisch.
Für die natürlich vorkommenden Protein-Aminosäuren ist die Subklassifizierung nach dem vorstehenden Schema wie folgt:
Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;
Basisch/nicht-zyklisch: Arginin, Lysin;
Basisch/zyklisch: Histidin;
Neutral/polar/klein: Gycin, Serin, Cystein;
Neutral/nicht-polar/klein: Alanin;
Neutral/polar/groß/nicht-aromatisch: Threonin, Asparagin, Glutamin;
Neutral/polar/groß/aromatisch: Tyrosin;
Neutral/nicht-polar/groß/nicht-aromatisch: Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin;
Neutral/nicht-polar/groß/aromatisch: Phenylalanin und Tryptophan.
Die Gen-codierte sekundäre Aminosäure Prolin ist, obgleich technisch in der Gruppe neutral/nicht-polar/groß/zyklisch und nicht-aromatisch, in Folge ihrer bekannten Wirkungen auf die Sekundär-konformation von Peptidketten ein spezieller Fall und ist daher in dieser definierten Gruppe nicht enthalten.
Bestimmte allgemein auftretende Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code codiert werden, umfassen z. B. beta-Alanin (beta-Ala) oder andere omega- Aminosäuren, z. B. 3-Aminopropionsäure, 2,3-Diaminopropionsäure (2,3-diaP), 4- Aminobuttersäure usw., alpha-Aminoisobuttersäure (Aib), Sarcosin (Sar), Ornithin (Orn), Citrullin (Cit), t-Butylalanin (t-BuA), t-Butylglycin (t-BuG), N-Methylisoleucin (N-Melle), Phenylglycin (Phg) und Cyclohexylalanin (Cha), Norleucin (Nle), Cysteinsäure (Cya), 2- Naphthylalanin (2-Nal); 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic); β-2- Thienylalanin (Thi); Homoarginin (Har) und Methioninsulfoxid (MSO). Auch diese fallen zweckdienlicherweise in besondere Kategorien.
Basierend auf den obigen Definitionen sind Sar, beta-Ala, 2,3-diaP und Aib neutral/nicht-polar/klein;
t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle, Mvl und Cha neutral/nicht-polar/groß/nichtaromatisch;
ist Orn basisch/nicht-zyklisch;
ist Cya sauer;
sind Cit, Acetyl Lys und MSO neutral/polar/groß/nicht-aromatisch; und sind Phg, Nal, Thi und Tic neutral/nicht-polar/groß/aromatisch.
Die verschiedenen omega-Aminosäuren werden entsprechend ihrer Größe als neutral/nicht-polar/klein (beta-Ala, d. h. 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure) oder groß (alle anderen) klassifiziert.
Weitere Aminosäure-Substitutionen für die, die im Gen codiert sind, können in Peptidverbindungen im Schutzumfang der Erfindung enthalten sein und können entsprechend ihrer Struktur in diesem allgemeinen Schema klassifiziert sein.
Alle Verbindungen der vorliegenden Erfindung können, wenn eine Aminosäure das C-Ende, in Form der pharmazeutisch annehmbaren Salze oder Ester vorliegen. Salze können z. B. Na&spplus;, K+, Ca&spplus;², Mg&spplus;² und der gleichen sein; die Ester sind im allgemeinen die von Alkoholen mit 1-6C.
In allen Peptiden der Erfindung kann gegebenenfalls eine Amidbindung oder können gegebenenfalls mehrerer Amidbindungen (-CO-NH-) durch eine andere Bindung, die ein Isoster ist, ersetzt sein, z. B. durch -CH&sub2;NH-, -CH&sub2;S-, -CH&sub2;CH&sub2;, -CH=CH- (cis und trans), -COCH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2; und -CH&sub2;SO-. Dieses Ersetzen kann nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren erfolgen. Die folgenden Literaturstellen beschreiben die Herstellung von Peptidanalogen, die diese alternativen Bindungsgruppierungen umfassen: Spatola, A.F., Vega Data (März 1983), Bd, 1, Ausgabe 3, "Peptide Backbone Modifications" (allgemeine Übersicht); Spatola, A.F., in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins," B. Weinstein, Herausg., Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983) (allgemeine Übersicht); Morley, J.S., Trends Pharm Sci (1980) S. 463-468 (allgemeine Übersicht); Hudson, D., et al., Int J Pept Prot Res (1979) 14: 177-185 (-CH&sub2;NH-CH&sub2;CH&sub2;-); Spatola, A.F., et al., Life Sci (1986.) 38: 1243-1249 (-CH&sub2;-S); Hann, M.M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis und trans); Almquist, R.G., et al., J Med Chem (1980) 23: 1392-1398 (-COCH&sub2;-); Jennings-White, C., et al., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533 (-COCH&sub2;-); Szelke, M., et al., Europäische Anmeldung EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH&sub2;-); Holladay, M.W., et al., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401-4404 (-C(OH)CH&sub2;-); und Hruby, V.J., Life Sci (1982) 31: 189-199 (-CH&sub2;-S-).

A. Agonisten

Die Agonisten der Erfindung umfassen eine Reihe von Peptiden der Formel AA&sub1;- AA&sub2;-AA&sub3;-AA&sub4;-AA&sub5;-AA&sub6;-AA&sub7;-Z
worin AA&sub1; eine kleine Aminosäure oder Threonin;
AA&sub2; und AA&sub3; jeweils unabhängig voneinander neutrale/nicht-polare/große/nichtaromatische Aminosäuren sind;
AA&sub4; eine kleine Aminosäure ist;
AA&sub5; eine basische Aminosäure ist;
AA&sub6; vorhanden oder abwesend sein kann und, wenn vorhanden, eine neutrale/nichtpolare/große/nicht-aromatische Aminosäure ist;
AA&sub7; abwesend ist, wenn AA&sub6; abwesend ist, und vorhanden oder abwesend sein kann, wenn AA&sub6; vorhanden ist und eine saure Aminosäure ist; und
Z ein Subsituent ist, der eine Agonist-Aktivität nicht stört.
Das Peptid der Formel 1 kann am C-Ende (nicht aber am N-Ende) durch eine weitere Aminosäuresequenz verlängert sein (dargestellt als in Z enthalten), um einen nichtstörenden Subsituenten zu umfassen.
Am C-Ende der Verbindungen der Formel 1 kann die Carboxylgruppe in der nichtderivatisierten Form vorliegen oder kann amidiert sein oder kann ein Ester sein, in der nichtderivatisierten Form kann das Carboxyl als freie Säure oder ein Salz, vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbares Salz vorliegen.
Wenn das C-Ende amidiert ist, wird das Stickstoffatom der Amidogruppe kovalent an den Carbonylkohlenstoff am C-Ende gebunden sein, NR'R' sein, worin jedes R' unabhängig Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-6C ist; solche Alkyle sind geradkettige oder verzweigte gesättigte Hydrocarbylreste mit 1-6C, z. B. Methyl, Ethyl, Isopentyl, n-Hexyl und dergleichen. Beispiele für solche Amidogruppen sind unter anderen: -NH&sub2;, -NHCH&sub3;, -N(CH&sub3;)&sub2;, -NHCH&sub2;CH&sub3;, -NHCH&sub2;CH&sub2;(CH&sub3;)&sub2; und - NHCH&sub2;CH(CH&sub3;)CH&sub2;CH&sub3;. Außerdem kann ein R' oder können beide R' gegebenenfalls mit einem oder mehreren Subsituenten substituiert sein, z. B. -OR', -NR'R', Halogen,- NR'CNR'NR'R' umd der gleichen, worin R' jeweils unabhängig wie oben definiert ist. Auf diese Weise kann Z -OH oder ein Ester (OR') oder Salzformen davon oder NR'R', worin R' wie oben definiert ist, sein.
Bevorzugte Ausführungsformen für AA&sub1;, sind Ser oder 2,3-Diaminopropionyl (2,3- diaP). Bevorzugte Ausführungsformen für AA&sub2; und AA&sub3; sind Val, Ile, Cha und Leu. Bevorzugte Ausführungsformen für die Reste im Rest der Verbindung der Formel (1) sind die, in denen AA&sub4; Gly ist, AA&sub5; Lys, Arg oder Har ist, AA&sub6;, wenn vorhanden, Val, Ile, Cha oder Leu ist und AA&sub7;, wein vorhanden, Asp oder Glu ist. Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (1), die aus der Gruppe bestehend aus SLIGRLETQPPIT(SEQ ID NO: 31), SLIGRLETQPPI(SEQ ID NO: 32), SLIGRLETQPP(SEQ ID NO: 33), SLIGRLETQP(SEQ ID NO: 34), SLIGRLETQ(SEQ ID NO: 35), SLIGRLET(SEQ ID NO: 36), SLIGRLE(SEQ ID NO: 37), SLIGRL(SEQ ID NO: 38), SLIGR(SEQ ID NO: 39); SLLGKVDGTSHVT(SEQ ID NO: 40), SLLGKVDGTSHV(SEQ ID NO: 41), SLLGKVDGTSH(SEQ ID NO: 42), SLLGKVDGTS(SEQ ID NO: 43), SLLGKVDGT(SEQ ID NO: 44), SLLGKVDG(SEQ ID NO: 45), SLLGKVD(SEQ ID NO: 46), SLLGKV(SEQ ID NO: 47), SLLGK(SEQ ID NO: 48), S(Cha)IGR(SEQ ID NO: 49), S(Cha)LGK(SEQ ID NO: 50), (2,3-diaP)-IGR(SEQ ID NO: 51), (2,3- diaP)LLGK(SEQ ID NO: 52), SLLGKR-NH&sub2;(SEQ ID NO: 53), SLIGRR-NH&sub2;(SEQ ID NO: 54), S(Cha)LGKK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 55), S(Cha)IGRK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 56), (2,3- diaP)-LIGRK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 57), (2,3-diaP)-LLGKK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 58)und den amidierten Formen davon ausgewählt sind.

B. Antagonisten

Verbindungen der Erfindung, die mit Aktivitäten wechselwirken, die durch den C140-Rezeptor vermittelt werden, umfassen modifizierte Agonistpeptide, denen der Ntermiriale Serinrest fehlt, und Antikörper, die mit verschiedenen kritischen Positionen am C140-Rezeptor immunreaktiv sind.

Peptid-Antagonisten

Die Antagonisten der ersten Gruppe - modifizierte Agonisten - können durch die folgende Formel dargestellt werden:
X-AA&sub2;-AA&sub3;-AA&sub4;-AA&sub5;-AA&sub6;-AA&sub7;-Z
worin X ein anderer Aminosäurerest als Ser, Ala, Thr, Cys, 2,3-diaP oder Gly ist oder eine Desamino- oder acylierte Aminosäure ist;
worin AA&sub2; und AA&sub3; unabhängig voneinander jeweils neutrale/nichtpolare/große/nicht-aromatische Aminosäuren sind;
AA&sub4; eine kleine Aminosäure ist;
AA&sub5; eine basische Aminosäure ist;
AA&sub6; vorhanden oder abwesend sein kann und, wenn vorhanden, eine neutrale/nichtpolare/große/nicht-aromatische Aminosäure ist;
AA&sub7; abwesend ist, wenn AA&sub6; abwesend ist, und vorhanden oder abwesend sein kann, wenn AA&sub6; vorhanden ist und eine saure Aminosäure ist, und
Z ein Subsituent ist, der die Agonistaktivität nicht stört.
Bevorzugte Acylgruppen haben die Formel RCO-, worin R eine geradkettige oder verzweigte Alcylgruppe mit 1-6C darstellt. Acetyl ist besonders bevorzugt.
Bevorzugte Ausführungsformen für X umfassen Reste von 3-Mercaptopropionsäure (Mpr), 3-Mercaptovaleriansäure (Mvl), 2-Mercaptobenzoelsäure (Mba) und S-Methyl-3- mercaptopropionsäure (SMeMpr). Bevorzugte Ausführungsformen für AA&sub2; bis AA&sub7; sind die gleichen wie für die Agonisten oben beschrieben; Z ist auch wie oben beschrieben.
Besonders bevorzugt unter den Antagonistpeptiden dieser Klasse sind die, die aus der Gruppe bestehend aus Mpr-LLGK (SEQ ID NO: 9), Mpr-LIGR(SEQ ID NO: 10), Mpr- (Cha)LKG(SEQ ID NO: 11), Mpr-(Cha)IGR(SEQ ID NO: 12), Mpr-LLGKK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 13), Mpr-LIGRK-NH&sub2;(SEQ ID NO: 14), Mpr-LIGRKETQP-NH&sub2;(SEQ ID NO: 15), Mpr- LLGKKDGTS-NH&sub2;(SEQ ID NO: 16), (n-pentyl)2-N-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH&sub2;(SEQ ID NO: 17), und (Me-N-(n-Pentyl)-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH&sub2;(SEQ ID NO: 18) ausgewählt sind.

Antikörper

Antagonisten, die Antikörper sind, welche mit kritischen Positionen des C140- Rezeptors immunreaktiv sind, werden durch Immunisierung eines geeigneten Säugersubjekts mit Peptiden, die als antigene Regionen solche Teile des C140-Rezeptors enthalten, die Ziel der Antikörper sein sollen, erhalten. Kritischer Regionen umfassen die Region einer proteolytischen Spaltung, das Segment des extrazellulären Segments, das für die Aktivierung kritisch ist (dieses beinhaltet die Spaltungsstelle) und die Teile der Sequenz, die die extrazellulären Schleifen bilden, insbesondere die Region, die mit dem N-Ende der extrazellulären Region des aktivierten Rezeptors wechselwirkt. Die Agonistenpeptide der Erfindung können in diesem Fall als Immunogene verwendet werden.
Dies sind Peptide, die enthalten: die proteolytische Region, nämlich z. B. SKGRSLIGRLET (SEQ ID NO: 19), die extrazellulären Schleifen, z. B. die, die I- SYHLHGNNWVYGEALC(SEQ ID NO: 20); QTIYIPALNITTCHDVLPEEVLVGDMFNYFL(SEQ ID NO: 21) und
HYFLIKTQRQSHVYA(SEQ ID NO: 22) umfassen. Die im folgenden beschriebenen Agonistpeptide sind ebenfalls als Immunogene verwendbar.
Die Antigene werden hergestellt, indem geeignete Säugerwirte nach geeigneten Immunisierungsprotokollen unter Verwendung der Peptidhaptene alleine, wenn diese eine ausreichende Länge haben, oder, wenn gewünscht, oder, wenn notwendig, zur Verstärkung der Immunogenität mit geeigneten Trägern konjugiert, immunisiert werden. Verfahren zur Herstellung immonugener Konjugate mit Trägern, z. B. BSA, KLH oder andere Trägerproteine, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Unter bestimmten Umständen kann eine direkte Konjugation unter Verwendung von beispielsweise Carbodiimid-Reagenzien wirksam sein; in anderen Fällen können Bindungsreagenzien, z. B. die, die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, geliefert werden, erwünscht sein, um Akzessibilität zum Hapten bereitzustellen. Die Haptenpeptide können am Amino- oder Carboxy-Ende mit einem Cys-Rest verlängert sein oder mit Cysteinresten durchsetzt sein, um z. B. die Bindung an einen Träger zu erleichtern. Eine Verabreichung der Immonugene erfolgt im Allgemeinen durch Injektion über einen geeigneten Zeitraum und unter Verwendung geeigneter Adjuvanzien, wie sie auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Während des Immunisierungsplans werden Antikörpertiter entnommen, um die Zulänglichkeit der Antikörperbildung zu bestimmen.
Obgleich die polyclonalen Antisera, die auf diese Weise hergestellt werden, bei einigen Anwendungen für pharmazeutischen Zusammensetzungen zufriedenstellend sein können, ist eine Verwendung monoclonaler Präparate bevorzugt. Immortalisierte Zelllinien, die die gewünschten monoclonalen Antikörper sekretieren, werden durch einen Immunoassay durchgemustert, in dem das Antigen das Peptidhapten ist oder das Antigen der C140-Rezeptor selbst ist, der an einer rekombinanten Wirtzelle auftrat. Wenn die geeignete immortalisierte Zellkultur, die den gewünschten Antikörper sekretiert, identifiziert ist, können die Zellen entweder in vitro oder durch Produktion in Aszites-Flüssigkeit kultiviert werden.
Die gewünschten monoclonalen Antikörper werden dann aus dem Kulturüberstand oder aus dem Aszites-Überstand isoliert. Fragmente der monoclonalen oder der polyclonalen Antisera, die den immunologisch signifikanten Teil enthalten, können als Antagonisten so wie auch als intakte Antikörper eingesetzt werden. Die Verwendung von immunologisch reaktiven Fragmenten, z. B. den Fragmenten Fab, Fab', F(ab')&sub2; ist oft vorteilhaft, speziell in einem therapeutischen Zusammenhang, da diese Fragmente im Allgemeinen weniger immunogen sind als das ganze Immunoglobulin.
Die Antikörper oder Fragmente können auch unter Anwendung gängiger Technologie, durch Rekombinationsmittel produziert werden. Regionen, die spezifisch an die gewünschten Rezeptorregionen binden, können auch im Zusammenhang mit Chimären der Herkunft aus mehreren Spezies produziert werden.
Die so produzierten Antikörper sind nicht nur als potentielle Antagonisten für den Rezeptor, die die Antagonistrolle in den erfindungsgemäßen Assays spielen, verwendbar, sondern sind auch in Immunoassays zum Nachweis des aktivierten Rezeptors einsetzbar. Als solche können diese Antikörper an Bilderzeugungsmittel zur Verabreichung an ein Subjekt gekoppelt werden, um die Detektion eines lokalisierten Antikörpers zu gestatten, wodurch die Position der C140-Rezeptoren sowohl in aktivierter wie in nichtaktivierter Form ermittelt werden kann. Außerdem sind diese Reagenzien in vitro verwendbar, um z. B. die erfolgreiche Produktion des C140-Rezeptors, der sich an der Oberfläche der rekombinanten Wirtszellen entwickelt hat, festzustellen.

Herstellung von Peptid-Agonisten und -antagonisten

Die Peptid-Agonisten und -antagonisten der Erfindung können unter Verwendung von Standard-Festphasen (oder Lösungsphasen-)-Peptidsynthese-Verfahren, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Außerdem kann die DNA, die für diese Peptide codiert, unter Anwendung eines im Handel verfügbaren Oligonukleotidsynthese- Instrumentarium synthetisiert werden und unter Anwendung von Standard- Rekombinationsproduktionssystemen rekombinant produziert werden. Die Produktion unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthese ist erforderlich, wenn Aminosäuren, die nicht Gen codiert sind, eingebaut werden sollen.

Rekombinanten-Produktion von C140-Rezeptor zur Verwendung in Assays

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Materialien zur Herstellung von C140-Rezeptor zur Bereitstellung an der Oberfläche von Rekombinanten-Zellen bereit. Eine Produktion des Rezeptors unter Verwendung dieser Rekombinationsverfahren liefert ein nützliches Reagens, um die Fähigkeit eines Kandidaten-Arzneimittels, an den C140- Rezeptor zu binden, diesen zu aktivieren oder zu antagonisieren, zu bestimmen. Die Bestimmung dieser Eigenschaften ist bei der Beurteilung der Spezifität von Arzneimitteln, die zur Bindung anderer verwandter Rezeptoren gedacht sind, essentiell.
Für diese Rekombinanten-Produktion wird eine DNA-Sequenz, die für den C140- Rezeptor codiert, z. B. wie die, die in den Fig. 1A und 1B (SEQ ID NO: 1), den Fig. 2A und 2B (SEQ ID NO: 3), den Fig. 10A und 10B (SEQ ID NO: 59) und den Fig. 11A und 11B (SEQ ID NO: 61) angegeben sind oder ihre substantielle Äquivalente oder ihre degenerierte Analoga, entweder durch Rückgewinnung der nativen Sequenz, wie es im Folgenden ausgeführt wird, oder durch Verwendung substantieller Teile der bekannten nativen Sequenz als Sonde hergestellt oder kann de novo unter Anwendung von Standardverfahren synthetisiert werden. Die DNA wird in Expressionsvektoren, die für den gewünschten Wirt geeignet sind, ligasiert und in kompatible Zellen transformiert. Die Zellen werden unter Bedingungen, die die Expression des C140-Rezeptor-codierenden Gens begünstigen, kultiviert und die Zellen, die den Rezeptor an der Oberfläche aufweisen, werden zur Verwendung in den Assays geerntet.
Die Wirtszellen sind typischerweise Tierzellen, am typischsten Säugerzellen. Um in den Assays verwendbar zu sein, müssen die Zellen intrazelluläre Mechanismen haben, die es ermöglichen, dass der Rezeptor in der Konfiguration, die in Fig. 4 allgemein gezeigt ist, an der Zelloberfläche auftritt. Wenn der Assay eine zelluläre Reaktion auf den aktivierten Rezeptor als Detektionssystem verwendet, müssen die Zellen auch einen an G-Proteingebundenen Mechanismus zur Antwort auf die Aktivierung der Rezeptoren enthalten. Die meisten Säugerzellen und andere Tierzellen erfüllen diese Qualifikationen.
Besonders nützliche Zellen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Xenopus laevis-Froschoozyten, die typischerweise eher cRNA als Standard- Rekombinationsexpressionssysteme, die von der DNA ausgehen, die für das gewünschte Protein codiert, verwenden. RNA mit Cap-Struktur wird typischerweise aus linearisierten Vektoren produziert, die DNA-Sequenzen enthalten, die für den Rezeptor codieren. Die Reaktion wird unter Verwendung von RNA-Polymerase und Standardreagenzien durchgeführt. cRNA wir isoliert, typischerweise unter Verwendung einer Phenol/Chloroform- Ausfällung mit Ethanol und in die Oozyten injiziert.
Die Tierwirtszellen, die die DNA exprimieren, die für den C140-Rezeptor codiert, oder die Oozyten, in die cRNA injiziert worden war, werden zur Durchführung der Expression der codierenden Nucleinsäure kultiviert, um den C140-Rezeptor herzustellen, der in analoger Weise wie es in Fig. 4 dargestellt ist, an deren Oberflächen auftritt. Diese Zellen werden dann direkt in Assays zur Untersuchung eines Kandidaten-Arzneimittels, ob es den Rezeptor bindet, antagonisiert oder aktiviert, verwendet.

Assays

In einem Typ eines einfach durchzuführenden Assays kann der Wettbewerb des Kandidaten-Arzneimittels um die Bindung an den Rezeptor entweder mit einem Agonisten oder einem bekannten Bindungsantagonisten untersucht werden. In einem Verfahren kann der kompetitive Agonist oder Antagonist markiert sein; die markierte Substanz, von der bekannt ist, dass sie an den Rezeptor bindet, kann natürlich ein synthetisches Peptid sein. In einem typischen Protokoll werden variierende Konzentrationen des Kandidaten zusammen mit einer konstanten Konzentration an markiertem Agonist oder Antagonist zugeführt, dann kann die Inhibition einer Bindung der Markierung an den Rezeptor unter Anwendung bekannter Techniken beurteilt werden.
In einem etwas verfeinerten Verfahren kann die Wirkung von Kandidaten- Verbindungen auf Agonist-induzierte Reaktionen in den Zellen, die den C140-Rezeptor rekombinant exprimieren, gemessen werden, wie es im Folgenden noch beschrieben wird. Assaysysteme für die Wirkung der Rezeptoraktivierung an diesen Zellen umfassen Calcium-Mobilisierung und Spannungsklemme, die nachfolgend detailliert beschrieben werden. Diese Assays erlauben eher eine Einschätzung der Wirkung des Kandidaten-Arzneimittels auf der Rezeptoraktivität als einfach nur der Fähigkeit, an den Rezeptor zu binden.
Agonist-induzierte Erhöhungen bei der &sup4;&sup5;Ca-Freisetzung durch Oozyten, die cRNA exprimieren, die für den C140-Rezeptor codieren, oder andere rekombinante Zellen, die C140-Rezeptor produzieren, werden durch veröffentlichte Techniken bestimmt (Williams, J.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 4939-4943). Kurz zusammengefasst, intrazelluläre Calciumpools werden markiert, indem Gruppen von 30 Oozyten in 300 ul Calcium-freier modifizierter Barth's-Lösung (MBSH), die 50 uCi&sup4;&sup5;CaCl&sub2; (10-10 mCi/mg Ca; Amersham) enthält, für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert werden. Die markierten Oozyten oder Zellen werden gewaschen, dann in MBSH II ohne Antibiotika 90 Minuten inkubiert. Gruppen mit 5 Oozyten werden selektiert und in einzelne Vertiefungen in einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen (Falcon 3047), die 0,5 ml pro Vertiefung MBSH II ohne Antibiotika enthält, gegeben. Dieses Medium wird alle 10 Minuten entfernt und durch frisches Medium ersetzt; das geerntete Medium wird durch Szintillationszählung analysiert, um &sup4;&sup5;Ca, das während jeder 10-minütigen Inkubation durch die Oozyten freigesetzt wurde, zu bestimmen. Die 10-minütigen Inkubationen werden fortgesetzt, bis eine stabile Basislinie der &sup4;&sup5;Ca-Freisetzung pro Zeiteinheit erreicht ist. Es werden 2 zusätzliche 10 Minuten-Sammlungen erhalten, dann wird Testmedium, das Agonist enthält, zugesetzt und die durch den Agonisten induzierte &sup4;&sup5;Ca-Freisetzung bestimmt.
Unter Verwendung des obigen Assays kann die Fähigkeit eines Kandidaten- Arzneimittels, den Rezeptor zu aktivieren, direkt untersucht werden. In diesem Fall werden die erfindungsgemäßen Agonisten als Kontrollen verwendet. Außerdem kann unter Verwendung des Agonisten der Erfindung unter Aktivierung des rekombinanten Rezeptors die Wirkung des Kandidaten-Arzneimittels auf diese Aktivierung direkt getestet werden. Rekombinante Zellen, die die Nucleinsäuren exprimieren, die für den Rezeptor codieren, werden in dem Assay in Gegenwart eines Agonisten mit und ohne die Kandidatenverbindung inkubiert. Eine Verringerung der Aktivierung in Gegenwart des Kandidaten wird einen Antagonisten-Effekt anzeigen. Umgekehrt kann auch die Fähigkeit eines Kandidaten- Arzneimittels, die Antagonisten-Effekte eines Antagonisten der Erfindung umzukehren, untersucht werden.
In einer Alternative zur Messung der Calciummobilisierung kann der Spannungsklemmen-Assay zur Messung der Rezeptoraktivierung verwendet werden. Agonisteninduzierte Chloridströme nach innen werden bei Oozyten, die in einer Spannungsklemme sind und C140-Rezeptor-codierende cRNA exprimieren, oder in Zellen, die DNA aus rekombinanten Expressionssystem exprimieren, gemessen, wie es bereits früher beschrieben wurde (Julius, D., et al. Science (1988) 241: 558-563), außer dass die Spannungs- Klemmen-Technik mit einer einzelnen Elektrode verwendet wird.

Detektion von aktivierten Rezeptoren

In einer Ausführungsform erlaubt die Verfügbarkeit des rekombinanten C140- Rezeptorproteins die Produktion von Antikörpern, die gegenüber der aktivierten Form des Rezeptors immunspezifisch sind und die dann zur diagnostischen Bilderzeugung von aktivierten Rezeptoren in vivo verwendet werden können. Diese Antikörper werden entweder zu der aktivierten Form des Rezeptors, der rekombinant hergestellt wurde, oder zu dem Peptid, dass das "neue Aminoterminale"-Peptid, das hier beschrieben wird, darstellt, produziert. Die resultierenden Antikörper oder die immunspezifischen Fragmente davon, z. B. die Fragmente Fab, Fab', Fab'&sub2;, werden dann mit Markierungen konjugiert, die nach bekannten Verfahren nachgewiesen werden, z. B. radioaktive Markierungen einschließlich Technetium&sup9;&sup9; und Indium¹¹¹ oder andere radioaktive Markierungen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind. Wenn diese Antikörper nahe den Stellen des aktivierten Rezeptors in vivo injiziert werden, erlaubt dies eine Lokalisierung von Bereichen, die aktivierte Rezeptoren enthalten.
In einer anderen Ausführungsform kann das Vorliegen des Aktivierungspeptids in Körperflüssigkeiten oder in Kulturmedien nachgewiesen und gemessen werden. Antikörper gegen das Aktivierungspeptid werden wie oben beschrieben hergestellt und können in Standärd-ELISA- oder RIA-Assays verwendet werden, um überschüssige Mengen des Aktivierungspeptids, z. B. in Urin nachzuweisen.

Verabreichung von Agonisten und Antagonisten als Arzneimittel

Die erfindungsgemäßen Peptide, die sich als Agonisten verhalten, werden in herkömmlichen Formulierungen zur systemischen Verabreichung, wie es auf dem Gebiet bekannt ist, verabreicht. Typische derartige Formulierungen können z. B. in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton PA, letzte Ausgabe, gefunden werden.
Bevorzugte Formen einer systemischen Verabreichung von Peptiden umfassen Injektion, typischerweise eine Verabreichung durch intravenöse Injektion. Andere Injektionsrouten, z. B. subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal, können ebenfalls verwendet werden. In jüngster Zeit wurden alternative Mittel für die systemische Verabreichung von Peptiden erfunden, die eine transmucosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Penetrationsmitteln wie z. B. Gallensalzen oder Fusidinsäure, oder anderen Detergenzien umfassen. Bei geeigneter Formulierung zu enteralen oder eingekapselten Formulierungen ist auch eine orale Verabreichung möglich. Eine Verabreichung dieser Verbindungen kann auch topisch und/oder lokal in Form von Salben, Pasten, Gelen und dergleichen erfolgen.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, des Verabreichungswegs, der Natur der Formulierung, dem Zustand des Patienten und dem Urteil des behandelnden Arztes ab. Allerdings liegen geeignete Dosierungsbereiche im Bereich von 0,1 bis 100 ug pro kg der Person. Weite Variationen bei der benötigten Dosierung werden jedoch im Hinblick auf die Vielzahl der Peptide, die verfügbar sind, und die unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungsrouten zu erwarten sein. Beispielsweise würde eine orale Verabreichung höhere Dosierungen verlangen als eine intravenöse Verabreichung. Schwankungen beim Dosierungslevel können zur Optimierung routinemäßiger Standardversuche eingestellt werden, was auf diesem Gebiet wohlbekannt ist.
Wie im Folgenden gezeigt wird, wirken sich die Agonisten der Erfindung als Antihypotensiva; Antagonisten haben die umgekehrte Wirkung. So können Patienten, deren Blutdruck erhöht oder gesenkt werden muss, durch Verabreichung des geeigneten Peptids profitieren.
Außerdem haben die Agonisten antiinflammatorische Eigenschaften und Wundheilungseingenschaften.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber nicht beschränken.

Beispiel 1

Isolierung des Gens, das für den Maus-C140-Rezeptor codiert

Eine genomische Cosmid-Maus-Bibliothek (erhalten von Dr. R.A. Wetsel, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri und in Wetsel, R.A. et al., J Biol Chem (1990) 265: 2435-2440) wurde mit zwei ³²P-markierten Oligonukleotiden, entsprechend bp 190-249 bzw. 742-801, der Rinder-Substanz K-Rezeptor-cDNA (Masu, Y. et al., Nature (1987) 329: 836-838) durchgemustert. Die Hybridisierungsbedingungen sind 5 · SSC, 5 · Denhardt's, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml Sperma-DNA, 10&sup6; cpm/ml markierte Oligonukleotide, 60ºC über Nacht, danach waschen mit 1 · SSC, 01% SDS bei 60ºC.
In einem der isolierten Klone (C140) wurde die Hybridisierungsregion einem 3,7 kb PstI-Fragment zugeordnet. Dieses Fragment wurde in den im Handel erhältlichen pBluescript-Vektor subcloniert. Die hybridisierenden und benachbarten Regionen wurden in beiden Orientierungen nach dem Sanger-Kettenterminierungsverfahren sequenziert. Die Fig. 1A und die Fig. 1B (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) zeigen sowohl die Nukleotidsequenz als auch die abgeleitete Aminosäuresequenz des Maus-C140-Rezeptors. Die orientierende Signalsequenz (SP) und die sieben Transmembranregionen sind überstrichen, potentielle Asparagin-gebundene Glycosylierungsstellen sind mit ausgefüllten Pfeilen markiert und die potentielle Proteaserezeptorspaltstelle bei Arg34-Ser35 ist mit einem nicht ausgefüllten Pfeil gekennzeichnet.

Beispiel 2

Isolierung des Gens, das für den humanen C140-Rezeptor codiert

Die Verfügbarkeit genomischer DNA, die für den Mausprotease-C140-Rezeptor codiert, erlaubte die Gewinnung des entsprechenden humanen Gens. Eine humane Genombibliothek, die in den Vektor EMBL3 cloniert war, wurde bei genau den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unter Verwendung der ganzen codierenden Region des Mausklons als Sonde durchgemustert. Das isolierte humane Gen, einschließlich der DNA- Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz, sind in Fig. 2A und Fig. 2B (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) dargestellt. Anschließende Experimente zeigten, dass das humane C140-Gen in der selben Region des langen Arms von Chromosom Nr. 5 (5q12-5q13) liegt, wie es für das humane Thrombinrezeptorgen beschrieben ist.
Außerdem wurde ein genomisches 1,1 kb-DNA-Fragment von Genome Systems Inc., commercial screening service erhalten; es war PCR-positiv zu einem Primerpaar, das ein Fragment erzeugt, das 350 Nukleotide der humanes C140-Protein-codierenden Region überspannt, erzeugt. Ein 1,1 kb bamH 1-Fragment wurde subcloniert und sequenziert und es wurde festgestellt, dass es eine Promotorsequenz mit 800 Nukleotiden enthält. Dem Promotor fehlt sowohl eine TATA-Box als auch eine CAAT-Box, allerdings ist er reich an G und C; diese Merkmale sind Promotoren vieler konstitutiver Gene gemeinsam. Es wurden zwei Bindungselemente, die für SP1 und AP2 spezifisch sind, identifiziert.

Beispiel 3

Vergleich verwandter G-Protein-Rezeptoren

Wie in Fig. 3 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) dargestellt ist, zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen Protease C140-Rezeptors ausgedehnte Ähnlichkeit (> 90%) zu der Maussequenz.
Fig. 5 (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7) zeigt eine Aminosäurensequenz- Anordnung des Maus-C140-Rezeptois und des verwandten humanen G-Proteinrezeptor- Thrombittrezeptor (Coughlin, S. Cell). Die orientierenden Signalsequenzen (SP), die Transmembranregionen und die Proteasespaltungsstellen sind markiert.

Beispiel 4

Isolierung von Maus-C140-cDNA

Es wurde eine cDNA-Bibliothek aus einem Mausmagen in Ugt 10 konstruiert und mit einer Sonde, die die C1040-Genom-DNA umfasste, durchgemustert. Ein einziger Phagenklon wurde isoliert und mit EcoRI geschnitten. Das Insert wurde in pBlue-script und pSG5 cloniert und sequenziert.
Die isolierte cDNA war 2732 Nukleotide lang, einschließlich einer 16 Basen- PolyA-Erweiterung; 5'RACE resultierte in der Anfügung von nur 27 Basen am 5'-Ende. Das 5'-Ende der apparenten codierenden Region unterscheidet sich vom 5-Ende des offenes Leserasters der Genom-DNA; es wird angenommen, dass das 5'-Ende der cDNA korrekt ist. Die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-cDNA, die für C140 codiert, ist in den Fig. 10A und 10B dargestellt (SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60).

Beispiel 5

Isolierung von humaner cDNA, die für C140 codiert

Eine cDNA-Bibliothek von humanem Darmtumor wurde einer PCR unterworfen, wobei Primer verwendet wurden, die aus dem genomischen Klon von Beispiel 2 aufgebaut worden waren; das amplifizierte Fragment wurde in pSGS cloniert und sequenziert. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 11 dargestellt. Es gibt 4 Aminosäuredifferenzen zwischen der cDNA-codierten Sequenz und der, die durch die genomische DNA codiert wird, was in den Fig. 11A und 11B gezeigt ist (SEQ ID NO: 61 und SEQ ID NO: 62).

Beispiel 6

Aktivierung von Protease-C140-Rezeptor in Oozyten

Sowohl native als auch mutante C140-Rezeptoren wurden in Oozyten produziert und mit einem Peptid, das das neue Amino-Ende nachahmte, oder durch das proteolytische Enzym Trypsin (das die extrazelluläre Region spaltet) aktiviert. Native Rezeptoren wurden durch Clonieren der codierenden Region des Rezeptorgens unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion in den Expressionsvektor pSG-5 produziert (Green, 5. et al., Nucleic Acid Res (1988) 16 : 369). Die Orientierung und Integrität der clonierten codierenden Region wurde verifiziert, indem die Nukleotidsequenz mit dem Sanger-Kettenterminierungsverfahren bestimmt wurde. Eine auf eine Stelle gerichtete Mutagenese wurde verwendet, um mutante Rezeptoren in pSG-5 zu konstruieren.
Es wurden 3 mutante Rezeptoren hergestellt, in denen Serin-35 durch Prolin, Arginin bzw. Histidin ersetzt war. Die Nukleotidsequenzen der drei Mutanten wurden wie oben verifiziert.
Um den Rezeptor an der Oberfläche von Oozyten zu produzieren, wurde cRNA, die für den Rezeptor codiert, wie folgt hergestellt. PSG-5-C140-Plasmid-DNA wurde durch Abbau mit XbaI linear gemacht und es wurde cRNA mit Cap-Struktur in vitro unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase produziert (Krieg and Melton, Meth Enzymol (1987) 155: 397-415).
Oozyten aus Xenopus leavis wurden geerntet und unter Anwendung veröffentlichter Techniken präpariert (Coleman, A., in Hames, B.D. und Higgins, S.J., Herausg. Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press, S. 271-302; Williams, J.A., et al. Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 4939-4943). Zur Entfernung follikulärer Zellen wurden Oozyten für 1,5 h unter Schütteln in Calcium-freiem Barth's, das jeweils 2 mg/ml Collagenase 1A und Hyaluronidase 1S enthielt, inkubiert. Die Oozyten wurden dann 5 · in normalem Barth's gewaschen und bei 18ºC in Barth's-Medium, das 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2,5 mM Natriumpyruvat enthielt, inkubiert. Oozyten im Stadium V wurden selektiert und dann wurden ihnen 30 nl cRNA (0,33 ug/ul Wasser) oder Wasser allein injiziert und sie wurden in Gruppen von 4/Vertiefung in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen mit 0,25 ml Medium inkubiert. Nach 36 Stunden wurden die Oozyten mit &sup4;&sup5;Ca(250 uCi/ml) inkubiert. Nach 12 h Inkubation wurden die Oozyten gewaschen und es wurden 0,2 ml Medium zugesetzt und alle fünf Minuten ersetzt. Das geerntete Medium wurde durch Scintillationszählung analysiert. Nach 5-maligem Ersetzen zur Bestimmung der Basislinienfreisetzung von &sup4;&sup5;Ca wurde Testmedium mit dem Agonisten, z. B. SLIGRL (SEQ ID NO: 23) zugesetzt, und die hervorgerufene &sup4;&sup5;Ca-Freisetzung wurde bestimmt.
Oozyten wurde cRNA mit Cap-Struktur (ca. 10 ng), die für den Maus C140- Rezeptor des Wildtyps (WT) oder einen der drei mutanten Rezeptoren 35Pro, 35Arg und 35His codierte, injiziert. Nach 36 Stunden wurden die Oozyten, denen cRNA injiziert worden war und Kontrollen, denen Wasser injiziert worden war, mit &sup4;&sup5;Ca beladen und 12 Stunden danach wurde die Peptid- oder Trypsin-induzierte &sup4;&sup5;Ca-Freisetzung - wie oben beschrieben - bestimmt. Das Peptid SLIGRL (SEQ ID NO: 23) wurde mit 100 uM zugesetzt und Trypsin mit 300 pM zugesetzt. Die Stimulation mit dem Peptid wurde an der selben Oozytengruppe nach der Stimulation mit Trypsin durchgeführt. Die in Tabelle 1 dargestellten Daten geben den Mittelwert von drei wiederholten Bestimmungen dar und bedeuten die Erhöhung im Vergleich zu Oozyten, denen Wasser injiziert wurde. TABELLE 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war das Agonist-Peptid SLIGRL (SEQ ID NO: 23) fähig, sowohl den Rezeptor des Wildtyps wie auch mutierte Rezeptoren zu aktivieren. Andererseits ist Trypsin, das nur durch Spaltung der extrazellulären Domäne aktivieren kann, fähig, den Rezeptor des Wildtyps zu aktivieren.

Beispiel 7: Aktivierung des C140-Rezeptors durch verschiedene Agonist-Peptide

Verschiedene Peptide wurden mit 100 uM in dem obigen Assay untersucht, wobei Maus-C140-Rezeptor des Wildtyps, exprimiert in Oozyten, verwendet wurde. Die Resultate sind in Tabelle 2 angegeben.

TABELLE 2

Peptid -fache Erhöhung von &sup4;&sup5;Ca

SLIGRL (SEQ ID NO: 23) 15
SLIGRA (SEQ ID NO: 24) 8,5
SLIGAL (SEQ ID NO: 25) 0
SLIARL (SEQ ID NO: 26) 4,3
SLAGRL (SEQ ID NO: 27) 0
SAIGRL (SEQ ID NO: 28) 0
ALIGRL (SEQ ID NO: 29) 1,3
SFFLRW (SEQ ID NO: 30) 1,7
Das "native" Peptid SLIGR (SEQ ID NO: 23) ist am wirksamsten; ein Ersetzen von L in Position 6 durch Alanin senkt die Aktivität, zerstört sie aber nicht. Positionen 2 und 3 sind empfindlicher. Position 1 toleriert eine Substitution mit Alanin, verringert aber die Aktivität um den Faktor 10; die Aktivität dieses Agonisten ist mit der des analogen Thrombinrezeptor-Agonisten SFFLRW (SEQ ID NO: 30) vergleichbar.

Beispiel 8

Expression von C140-Rezeptor in verschiedenen Geweben

Poly(A)+RNA wurde aus Mausgeweben hergestellt, an einem 1, 2% Agarosegel, das 50% Formamid enthielt, getrennt und auf Hybond C extra membrane (Amersham) aufgetüpfelt. Der Blot wurde mit einer mit ³²P-markierten "statistischen Startsonde" markiert, die auf die gesamte codierende Region von Maus-C140-Rezeptor gerichtet war. Die Sonde wurde bei 42ºC für 48 h hybridisiert, dann nacheinander bei 20ºC in 1 · SSC, 2 · in 0,1% SDS, jeweils fünf Minuten, dann bei 65ºC mit 1 · SSC, wieder 2x, jeweils für 20 Minuten, und dann mit 0,1 · SSC, 0,1% SDS 2x für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die resultierende Membran wurde 5 Tage bei 80ºC mit einem Intensivierungsschirm autoradiografiert.
Die in Fig. 6 dargestellten Resultate geben an, dass Niere und Dünndarm, nicht aber Milz, mRNA enthalten, die für C140 codiert. In Fig. 6, in der jede Bahn 10 ug RNA enthält, stammt Bahn A aus Milz, Bahn B aus Niere und Bahn C aus Dünndarm.

Beispiel 9

Expression von C140-Transkripten in Mäusen

Eine in situ-Hybridisierung unter Verwendung von ³&sup5;S-RNA-Sonden wurde verwendet, um C140-Transkripte in Maus-Embryogenese und in Geweben erwachsener Mäuse zu lokalisieren. Ein starkes Signal wurde im gastrointestinalen Trakt am Tag 11,5 gefunden; am Tag 14 gab es eine starke Hybridisierung an epithelialen Strukturen in der Nasopharynx, im Magen-Darm, der Haut und in endothelialen Zellen in größeren Gefäßen. Es gab eine gewisse Hybridisierung in der Leber und im Sclerotom, aber kein Signal im Muskel oder im ZNS. Am Tag 17 waren die Signale im Sclerotom verschwunden und zusätzliche epitheliale Strukturen zeigten eine Hybridisierung, einschließlich Ösophagus, Nierenglomeruli, Lunge, Haarfollikel und Epidermis.
Bei Neugeborenen wurden die Signale, die nach 17 Tagen festgestellt wurden, beibehalten und zusätzliche Signale wurden in der thymischen Medulla und der Nierenmedulla gefunden. Erwachsene zeigten Transkripte in der Magenschleimhaut, im Dünndarm und Dickdarm, der weißen Pulpa der Milz, der Thymus- und Nierenmedulla. Wieder waren keine Signale im ZNS, der Leber, der Lunge oder der Nebennierendrüse. Fig. 12 zeigt die Resultate einer in situ-Hybridisierung in einer sezierten neugeborenen Maus unter Verwendung dieser Sonden.

Beispiel 10

Expression von C140-Transkripten in humanen Geweben

Fig. 13 zeigt die Resultate eines Northern Blots der Gesamt-RNA aus humanen Zeillinien, die an eine humane C140-Rezeptorsonde hybridisierten. Es wurden 10 mg Gesamt-RNA verwendet. Eine Hybridisierung wurde bei RNA aus Magen (Bahn 1), Ca-Co-2- Zellen (Bahn 2); HAT-29-Zellen (Bahn 3), A498-Zellen (Bahn 5), 5637-Zellen (Bahn 8), Haut-Keratinocyten (Bahn 12) und HUVEC (Bahnen 13 und 14) erhalten. Keine Hybridisierung wurde in HuTu80-Zellen, J82-Zellen, MCF-7-, HeLa- oder NCI 12-Zellen (Bahnen 4, 6, 9 und 10) nachgewiesen.

Beispiel 11

Bestimmung der hypotensiven Aktivität von C140-Agonisten

Der C140-Agonist SLIGRL (SEQ ID NO: 23) wurde in 0,2 ml Puffer in unterschiedlichen Konzentrationen in die femorale Rattenvene injiziert, dann wurde der arterielle Druck überwacht. Die Resultate verschiedener Konzentrationen sind in Fig. 7 dargestellt.
Die Kurve in Fig. 7 zeigt, dass selbst bei 0,1 mM eine deutliche Abnahme des Blutdrucks auftrat; größere Abnahmen wurden bei einer Konzentration von 1 mM beobachtet.
Dieser Effekt wurde auch gezeigt, indem die Vasodilation als Resultat einer Stimulation der femoralen Rattenvene mit dem obigen Agonisten beobachtet wurde. Erwachsene Sprague-Dawley-Ratten wurden durch Ausbluten während einer Diethylether-Anästhesie getötet, die femorale Vene wurde entfernt und aus Fett und Bindegewebe freigelegt. Es wurden kreisförmige Präparationen der Vene in ein Organbad (5 ml) an zwei L-förmigen Metallhaltern (0,2 mm Durchmesser) montiert. Einer der Metallhalter war in einen der Hebel eines Grass FTO C-Kraftumwandlers geschraubt. Die Badlösung war Krebs-Ringer- Lösung, die 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl&sub2;, 1,2 mM MgSO&sub4;, 24,8 mM NaH- CO&sub3;, 1,2 mM KH&sub2;PO&sub4; und 5,6 mM Glucose enthielt. Die Badflüssigkeit wurde kontinuierlich mit 88,5% Sauerstoff-11,5% CO&sub2; behandelt; die Temperatur wurde bei 37ºC gehalten. Das Endothelium wurde entfernt, indem CO&sub2; durch die Behälter blubbern gelassen wurde. Die Grundspannung lag zwischen 7,5 und 12 mN. Die Präparationen wurden für mindestens eine Stunde vor Anwendung eines Anagonisten und Kontrollsubstanzen equilibriert.
Die Resultate dieser Bestimmungen sind in Fig. 8a und 8b dargestellt. Wie in Fig. 8a dargestellt ist, wird eine Kontraktion, die durch Anwendung von PGF2 bei 3 · 10&supmin;&sup5; M induziert wird, durch Verabreichung von 10&supmin;&sup5; M Agonist entspannt. Die Resultate in Fig. 8a wurden unter Verwendung der Vene, bei der das Endothelium noch vorhanden war, erhalten.
In Fig. 8b war das Endothelium entfernt worden. In einem analogen Experiment wird der Kontraktion, die durch 3 · 10&supmin;&sup5; M PGF2 induziert wurde, durch 10&supmin;&sup5; M Agonist oder durch 10&supmin;&sup5; M Acetycholine nicht entgegengewirkt.

Beispiel 12

Aktivierung von rekombinantem C140-Rezeptor durch Plasmin und Kallikrein

Die Fig. 9a und 9b zeigen die Fähigkeit von Plasmin bzw. Kallikrein Oozyten zu aktivieren, denen C140-cRNA (offene Kreise) oder Wasser (Kreuze) als Kontrolle injiziert worden war.
Fig. 9c zeigt die Fähigkeit von Trypsin, Frosch-Oozyten zu aktivieren, denen C140-Rezeptor-cRNA (ausgefüllte Kreise) oder Substanz K-Rezeptor-cRNA (offene Kreise) injiziert worden war. Trypsin hatte ganz klar eine andere Wirkung auf die Oozyten, denen C140-Rezeptor injiziert worden war.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: COR THERAPEUTICS, INC.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: REKOMBINANTER C140-REZEPTOR UND SEINE AGONISTEN UND ANTAGONISTEN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 62
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: EP 0 804 452
(B) ANMELDETAG: 26. Juli 1994
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG
(A) ANMELDENUMMER: US C8/097 938
(B) ANMELDETAG: 26. Juli 1993
(C) KLASSIFIKATION:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1431 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 232..1416
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 232 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 395 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1255 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 56..1249
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 56 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 398 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 395 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 398 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 425 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Cha = Cyclohexylalanin" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Cha) = Cyclohexylalanin" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist Mpr = 3-Mercaptopropionsäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (n-Pentyl)2-N-Leu." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Me-N-(n-Pentyl)." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear · (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOlOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGEORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Cha) = Cyclohexylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Cha) = Cyclohexylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (2,3-diaP) = 2,3-Diaminopropionyl." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (2,3-diaP) = 2,3- Diaminopropionyl." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

(2) ANGABEN 2U SEQ ID NO: 54:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle ·
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Cha) = Cyclohexylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORN: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (Cha) = Cyclohexylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE; 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (2,3-diaP) = 2,3- Diaminopropionyl." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LAGE: 1
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note = "Diese Position ist (2,3-diaP) = 2,3- Diaminopropionyl." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2732 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 73..1269
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 73 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 399 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(i) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1414 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 50..1240
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 50 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 397 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, das ein DNA-Molekül ist, umfassend ein Expressionssystem, das, wenn es in einen rekombinanten Wirt transformiert wird, fähig ist, den C140- Rezeptor an der Zelloberfläche des Wirts zu exprimieren, wobei das Expressionssystem eine den C140- Rezeptor codierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, die funktionsähig an eine zu der codierenden Nukleinsäuresequenz heterologe Kontrollsequenz gebunden ist und in der Wirtszelle funktionsfähig ist.

2. Nucleinsäuremolekül, das ein DNA-Molekül ist, das den C140-Rezeptor codiert.

3. Nucleinsäuremolekül, das ein cRNA-Molekül ist, das den C140-Rezeptor codiert.

4. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 61, umfaßt.

5. Eine Zelle, die so modifiziert ist, daß sie die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Zelle nach Anspruch 5, die eine somatische Säugerzelle ist.

7. Zelle nach Anspruch 5, die eine Oozyte ist.

8. Zelle nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich der C140-Rezeptor an der Oberfläche der Zelle entwickelt.

9. Verfahren zur Bestimmung der C140-Agonist-Aktivität einer Kandidatensubstanz, umfassend die Schritte:

- Inkubieren der Zellen von Anspruch 8 in Gegenwart und Abwesenheit der Substanz und

- Messen des Vorhandenseins, der Abwesenheit oder des Ausmaßes der Aktivierung des C140-Rezeptors in Gegenwart der Substanz, verglichen mit der Abwesenheit der Substanz, wobei eine Zunahme der Aktivierung in Gegenwart der Substanz, verglichen mit der Abwesenheit der Substanz, Agonist-Aktivität der Substanz anzeigt.

10. Verfahren zur Bestimmung der C140-Antagonist-Aktivität einer Kandidatensubstanz, umfassend die Schritte:

- Inkubieren der Zellen von Anspruch 8 in Gegenwart eines C140-Agonisten und in Gegenwart und Abwesenheit des Kandidaten und

- Messen der Aktivierung des C140-Rezeptors in Gegenwart und Abwesenheit des Kandidaten, wobei eine Abnahme der Aktivierung in Gegenwart des Kandidaten einer Antagonist-Aktivität des Kandidaten anzeigt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßschritt die Calcium-Mobilisation oder den inneren Chlorid-Strom mißt.

12. Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Kandidatensubstanz, an den C140-Rezeptor zu binden, umfassend die Schritte:

- Inkubieren der Zellen von Anspruch 8 in Gegenwart des Kandidaten; und

- Bestimmen, ob der Kandidat an den C140-Rezeptor bindet.

13. Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Kandidatensubstanz, an den C140-Rezeptor zu binden, umfassend die Schritte:

- Inkubieren der Zellen von Anspruch 8 in Gegenwart eines C140-Agonisten oder eines bekannten C140- Antagonisten und in Gegenwart und Abwesenheit des Kandidaten, und

- Messen der Bindung des C140-Agonisten oder C140-Antagonisten an die Oberfläche der Zellen in Gegenwart und Abwesenheit des Kandidaten, wobei eine Abnahme der Bindung in Gegenwart des Kandidaten die Fähigkeit des Kandidaten, an den Rezeptor zu binden, anzeigt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßschritt eine kompetitive Hemmung der Bindung eines markierten bekannten Agonisten oder Antagonisten beinhaltet.

15. Antikörperzusammensetzung, die zu einer extrazellulären Region des C140-Rezeptor-Proteins oder eines Teils davon spezifisch immunreaktiv ist.

16. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Region die Ligand-bindende Region ist.

17. Antikörperzusammensetzung, die zu dem aktivierten C140- Rezeptor spezifisch immunreaktiv ist.

18. Antikörperzusammensetzung, die zu einem Epitop innerhalb der Rezeptorsequenz SLIGRL (SEQ ID NO: 23) spezifisch immunreaktiv ist.

19. Antikörperzusammensetzung, die zu dem gespaltenen Aktivierungspeptid des C140-Rezeptors spezifisch immunreaktiv ist.

20. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide aus der Gruppe bestehend aus ISYHLHGNNWVYGEALC (SEQ ID NO: 20), QTIYIPALNITTCHDVLPEEVLVGDMFNYEL (SEQ ID NO: 21) und HYFLIKTQRQSHVYA (SEQ ID NO: 22) ausgewählt sind.

21. Antikörperzusammensetzung, die zu dem Peptid SKGRSLIGRLET (SEQ ID NO: 19) spezifisch immunreaktiv ist.

22. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung einen monoklonalen Antikörper umfaßt.

23. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 22, die außerdem ein bildgebendes Mittel umfaßt, das zur Verabreichung an Menschen geeignet ist und das die extrazelluläre Region des C140-Rezeptor-Proteins oder eines Peptids davon nachweist.

24. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, die die Fab-, Fab'- oder F(ab')2-Fragmente des monoklonalen Antikörpers umfaßt.

25. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, die zur Verabreichung an Menschen formuliert ist.

26. Verwendung eines Antikörpers, der für aktivierten C140- Rezeptor spezifisch ist, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Subjekt, das vermeindlich aktivierten C140-Rezeptor beherbert, für die in situ-Lokalisierung des aktivierten C140-Rezeptors.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an ein bildgebendes Mittel gekoppelt ist.

28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das bildgebende Mittel eine radioaktive Markierung ist.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die radioaktive Markierung Technetium 99 oder Indium 111 ist.

30. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von aktiviertem C140-Rezeptor in einem Säugersubjekt, umfassend die Schritte:

- Inkontaktbringen einer Probe einer biologischen Flüssigkeit des Subjekts mit einem Nachweissystem, das das Vorhandensein, die Abwesenheit oder die Menge eines gespaltenen Aktivierungs-Peptid des C140-Rezeptors mißt; und

- Nachweisen des Vorhandenseins, der Abwesenheit oder der Menge des gespaltenen Peptids:

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweissystem Antikörper gegen das Aktivierungs- Peptid des Rezeptors umfaßt.

32. Agonist-Peptid, das zum Aktivieren des C140-Rezeptors fähig ist, wobei das Peptid die Formel

AA&sub1;-AA&sub2;-AA&sub3;-AA&sub4;-AA&sub5;-AA&sub6;-AA&sub7;-Z

hat,

worin AA&sub1; eine kleine Aminosäure oder Threonin ist;

AA&sub2; und AA&sub3; jeweils unabhängig voneinander neutrale/nicht-polare/große/nicht-aromatische Aminosäuren sind;

AA&sub4; eine kleine Aminosäure ist,

AA&sub5; eine basische Aminosäure ist;

AA&sub6; vorhanden oder abwesend sein kann und, wenn vorhanden, eine neutrale/nicht-polare/große/nichtaromatische Aminosäure ist;

AA&sub7; abwesend ist, wenn AA&sub6; abwesend ist, und vorhanden oder abwesend sein kann, wenn AA&sub6; vorhanden ist und eine saure Aminosäure ist; und

Z ein Substituent ist, der eine Agonist-Aktivität nicht stört.

33. Peptid nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß eine Carboxyl-Gruppe am C-Ende des Peptids amidiert, verestert oder in Form eines Salzes vorliegt.

34. Peptid nach Anspruch 32, worin AA&sub1; Ser, Ala, Gly, Thr oder 2,3-Diaminopropionsäure (2,3-diaP) ist; und/oder

worin AA&sub2; und AA&sub3; jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Ile, Val, Leu und Cha ausgewählt sind; und/oder

worin AA&sub4; Gly ist; und/oder

worin AA&sub5; Arg, Lys oder Har ist; und/oder

worin Z OR' oder NR' R' darstellt; worin jedes R' unabhängig voneinander H oder ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 1 bis 6C ist oder einen oder mehrere der Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -OR', -NR' R', Halogen und

- NR' CNR' NR' R', worin R unabhängig H oder ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 1 bis 6C ist, hat.

35. Peptid nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß AA&sub1; Ser ist.

36. Peptid nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß AA&sub1; (2,3-diaP) ist.

37. Peptid nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß AA&sub1;-AA&sub2;-AA&sub3; aus der Gruppe bestehend aus SLI, SLL, SChal, SChaL, (2,3-diaP)LI und (2,3-diaP)LL ausgewählt ist; und/oder

daß Z eine zusätzliche Peptid-Sequenz aus 1 bis 5 Aminosäuren umfaßt.

38. Peptid nach Anspruch 34, das aus der Gruppe bestehend aus SLIGRLETQPPIT (SEQ ID NO: 31), SLIGRLETQPPI (SEQ ID NO: 32), SLIGRLETQPP (SEQ ID NO: 33), SLIGRLETQP (SEQ ID NO: 34), SLIGRLETQ (SEQ ID NO: 35), SLIGRLET (SEQ ID NO: 36), SLIGRLE (SEQ ID NO: 37), SLIGRL (SEQ ID NO: 38), SLIGR (SEQ ID NO: 39), SLLGKVDGTSHVT (SEQ ID NO: 40), SLLGKVDGTSHV (SEQ ID NO: 41), SLLGKVDGTSH (SEG ID NO: 42), SLLGKVDGTS (SEQ ID NO: 43), SLLGKVDGT (SEQ ID NO: 44), SLLGKVDG (SEQ ID NO: 45), SLLGKVD (SEQ ID NO: 46), SLLGKV (SEQ ID NO: 47), SLLGK (SEQ ID NO: 48), S(Cha)IGR (SEQ ID NO: 49), S(Cha)LGK (SEQ ID NO: 50), (2,3-diaP)-LIGR (SEQ ID NO: 51), (2,3-diaP)LLGK (SEQ ID NO: 52), SLLGKR-NH2 (SEQ ID NO: 53), SLIGRR-NH&sub2; (SEQ ID NO: 54), S(Cha)LGKK-NH2 (SEQ ID NO: 55), S(Cha)IGRK-NH2 (SEQ ID NO: 56), (2,3-diaP)-LIGRK-NH2 (SEQ ID NO: 57) und (2,3-diaP)-LLGKK-NH2 (SEQ ID NO: 58) ausgewählt ist.

39. Peptid, das fähig ist, die Funktion des C140-Rezeptors zu inhibieren, wobei das Peptid die Formel

X-AA&sub2;-AA&sub3;-AA&sub4;-AA&sub5;-AA&sub6;-AA&sub7;-Z hat,

worin X ein anderer Aminosäure-Rest als Ser, Ala, Thr, Cys, 2,3-diap oder Gly ist oder eine Desamino- oder acylierte Aminosäure ist,

worin AA&sub2; und AA&sub3; unabhängig voneinander jeweils neutrale/nicht-polare/große/nicht-aromatische Aminosäuren sind;

AA&sub4; ein kleine Aminosäure ist;

AA&sub5; eine basische Aminosäure ist;

AA&sub7; abwesend ist, wenn AA&sub6; abwesend ist, und vorhanden oder abwesend sein kann, wenn AA&sub6; vorhanden ist, und eine saure Aminosäure ist, und

Z ein Substituent ist, der die Agonist-Aktivität nicht stört.

40. Peptid nach Anspruch 39,

worin X Mvl, Mpr, Mba oder SMeMpr ist; und/oder

worin AA&sub2; und AA&sub3; jeweils unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Ile, Val, Leu, Nle, Nva, Cyclopentylalanin und Cha ausgewählt sind; und/oder

worin AA&sub5; Arg, Lys, Orn oder Har ist; und/oder

worin Z OH oder einen Ester oder ein Salz davon oder NR' R' umfaßt, worin jedes R' unabhängig H oder ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 1 bis 6C ist, worin jedes R' gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -OR', -NR' R' und -NR' CNR' NR' R' substituiert sein kann, worin jedes R' H ist oder eine geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit 1 bis 6C ist.

41. Peptid nach Anspruch 40,

worin AA&sub2;-AA&sub3; aus der Gruppe bestehend aus L1, LL, ChaI und ChaL ausgewählt ist; und/oder

worin Z eine Peptid-Extinktion von 1 bis 5 Aminosäure- Resten umfaßt.

42. Peptid nach Anspruch 39, das aus der Gruppe bestehend aus Mpr-LLGK (SEQ ID NO: 9), Mpr-LIGR (SEQ ID NO: 10), Mpr-(Cha)LKG (SEQ ID NO: 11), Mpr-(Cha)IGR (SEg ID NO: 12) Mpr-LLGKK-NH2 (SEQ ID NO: 13), Mpr-LIGRK-NH2 (SEQ ID NO: 14), Mpr-LIGRKETQP-NH2 (SEQ ID NO: 15), Mpr- LLGKKDGTS-NH2 (SEQ ID NO: 16), (n-Pentyl)2-N-LIGRK-NH2 (SEQ ID NO: 17) und (Me-N-(n-Pentyl)-LIGRK-NH2 (SEQ ID NO: 18) und den amidierten oder acylierten Formen davon ausgewählt ist.

43. Verwendung eines Agonisten des C140-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Wundheilung.

44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß der Agonist ein Peptid nach einem der Ansprüche 32 bis 38 ist.

45. Verwendung eines Agonisten des C140-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Entzündung.

46. Verwendung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß der Agonist ein Peptid nach einem der Ansprüche 32 bis 38 ist.

47. Verwendung eines Peptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) einem Peptid, das zur Aktivierung des C140-Rezeptors wirksam ist, nach einem der Ansprüche 32 bis 38 und (ii) einem Peptid, das zur Hemmung des C140- Rezeptors wirksam ist, nach einem der Ansprüche 39 bis 42, zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Modulation von Blutdruck in einem Subjekt verabreicht werden soll.

48. Verwendung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid, das zur Aktivierung des C140-Rezeptors wirksam ist, als Antihypertensivum verabreicht wird.

49. Verwendung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid, das zur Inhibierung des C140-Rezeptors wirksam ist, zur Erhöhung des Blutdrucks verabreicht wird.

50. Peptid nach einem der Ansprüche 32 bis 42 zur Verwendung als Arzneimittel.

51. Verfahren zum Exprimieren des C140-Rezeptors, das den Schritt eines Kultivierens der Zellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 umfaßt.