JPH0788310B2 - 抗体結合体 - Google Patents
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- JPH0788310B2 JPH0788310B2 JP58037569A JP3756983A JPH0788310B2 JP H0788310 B2 JPH0788310 B2 JP H0788310B2 JP 58037569 A JP58037569 A JP 58037569A JP 3756983 A JP3756983 A JP 3756983A JP H0788310 B2 JPH0788310 B2 JP H0788310B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
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- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
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Description
【発明の詳細な説明】 1.発明の属する技術分野 本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗
体（従来の抗血清）を含む抗体を可溶性または不溶性の
結合相手（化合物、リンカー、または担体）に共有結合
させて、アフィニティー精製、分離、診断、治療などに
有用な抗体結合体を形成させることに関する。
体（従来の抗血清）を含む抗体を可溶性または不溶性の
結合相手（化合物、リンカー、または担体）に共有結合
させて、アフィニティー精製、分離、診断、治療などに
有用な抗体結合体を形成させることに関する。
更に詳細には、本発明は、抗体分子の抗原結合領域外に
ある抗体分子の炭水化物成分との、抗体分子のスルフド
リル基との、または抗体のFc領域のアミノ基またはカル
ボキシ基との結合方法に関するものである。生成した結
合体は、もとになる抗体の完全な免疫特異性と免疫反応
性を実質的に保有しており、その他に補体を活性化する
能力をも有する。
ある抗体分子の炭水化物成分との、抗体分子のスルフド
リル基との、または抗体のFc領域のアミノ基またはカル
ボキシ基との結合方法に関するものである。生成した結
合体は、もとになる抗体の完全な免疫特異性と免疫反応
性を実質的に保有しており、その他に補体を活性化する
能力をも有する。
本発明は更に、in vivoまたはiv vitroで標的部位へ化
合物を運搬するキャリヤーシステム全般にも係わるもの
である。かかるシステムはin vivoで標的部位へ薬剤ま
たは他の化合物を運搬するシステム、iv vitroとin viv
oでの造影システム（例：腫瘍造影システム）、細胞選
別システム、更に抗原−抗体相互作用に基づく分離機構
等の分野にも係わるものである。
合物を運搬するキャリヤーシステム全般にも係わるもの
である。かかるシステムはin vivoで標的部位へ薬剤ま
たは他の化合物を運搬するシステム、iv vitroとin viv
oでの造影システム（例：腫瘍造影システム）、細胞選
別システム、更に抗原−抗体相互作用に基づく分離機構
等の分野にも係わるものである。
本発明は更に、基質−リンカーと抗体との結合をも含
み、これにより生じた抗体結合体は抗原と結合し、補体
を活性化する能力を保持するものである。所定の応用例
では、これは活性形態の化合物の標的部位での放出を促
進する。
み、これにより生じた抗体結合体は抗原と結合し、補体
を活性化する能力を保持するものである。所定の応用例
では、これは活性形態の化合物の標的部位での放出を促
進する。
2. 発明の背景 2.1. 共有結合 化合物と抗体との共有結合を行うには、各種の反応を利
用することができる。これはリシンのアミノ基、グルタ
ミン酸とアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システイ
ンのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部
位を含む、抗体分子のアミノ酸残基の反応により達成さ
れてきた。
用することができる。これはリシンのアミノ基、グルタ
ミン酸とアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システイ
ンのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部
位を含む、抗体分子のアミノ酸残基の反応により達成さ
れてきた。
これらの抗体分子のポリペプチド主鎖への共有結合法法
には重大な欠点がある。免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ
鎖のアミノ酸配列は、抗原結合領域を含む抗体分子中に
比較的規則的にかつランダムに分散しているアミノ酸の
すべてを含むものである。この抗原結合領域内に化学的
修飾が起こると、抗体の認識要素内に変化を導入したこ
とになる。かかる変化は、抗体の抗原に対する親和性と
特異性とを変化させると思われ、実際に変化させてい
る。様々な抗体の集団では、かかる抗原結合領域内の変
化は一部の抗体を完全に不活性化し、また抗原結合部位
への該変化の接近状態に応じてその他の抗体をより少な
い程度に不活性化することになる。この不活性化は、抗
原結合部位を非反応性にするような該結合部位のコンフ
ォメーションの変化によるものであるかも知れず、また
抗原が抗原結合領域へ接近するのを制限するような抗原
結合領域外の変化によるものであるかも知れない。
には重大な欠点がある。免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ
鎖のアミノ酸配列は、抗原結合領域を含む抗体分子中に
比較的規則的にかつランダムに分散しているアミノ酸の
すべてを含むものである。この抗原結合領域内に化学的
修飾が起こると、抗体の認識要素内に変化を導入したこ
とになる。かかる変化は、抗体の抗原に対する親和性と
特異性とを変化させると思われ、実際に変化させてい
る。様々な抗体の集団では、かかる抗原結合領域内の変
化は一部の抗体を完全に不活性化し、また抗原結合部位
への該変化の接近状態に応じてその他の抗体をより少な
い程度に不活性化することになる。この不活性化は、抗
原結合部位を非反応性にするような該結合部位のコンフ
ォメーションの変化によるものであるかも知れず、また
抗原が抗原結合領域へ接近するのを制限するような抗原
結合領域外の変化によるものであるかも知れない。
最も普通に用いられている非特異的共有結合法は、化合
物のカルボキシル基を抗体のアミノ基へ結合させるカル
ボジイミド反応であろう。これ以外に、ジアルデヒドま
たはイミドエステル等の二官能性試薬を用いて化合物を
アミノ基を抗体分子のアミノ基へ結合させることも行れ
ている。研究者の中には化合物と抗体分子とを結合させ
るためにシッフ塩基反応を用いたものもいる。この方法
では、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬剤ま
たは細胞毒剤の過ヨウ素酸塩による酸化を伴い、従って
アルデヒドが形成され、これが抗体分子と反応すること
になる。結合は、抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基の
形成を介して起こる。その他に、反応性のスルフヒドリ
ル基を有する化合物を抗体分子にカップリングさせるこ
とも行われた。イソチオシアネートをカップリング剤と
して用いて、化合物を抗体に共有結合させることもでき
る。この方法により、蛍光顕微鏡法（Brandtzaeg,1973,
Scand.J.Immunol.２:273−290）や細胞選別システム（L
oken and Herzenberg,1975,Annals N.Y.Acad.Sci.254:1
63−171）に用いるために蛍光化合物を抗体分子へ結合
させることが行われた。
物のカルボキシル基を抗体のアミノ基へ結合させるカル
ボジイミド反応であろう。これ以外に、ジアルデヒドま
たはイミドエステル等の二官能性試薬を用いて化合物を
アミノ基を抗体分子のアミノ基へ結合させることも行れ
ている。研究者の中には化合物と抗体分子とを結合させ
るためにシッフ塩基反応を用いたものもいる。この方法
では、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬剤ま
たは細胞毒剤の過ヨウ素酸塩による酸化を伴い、従って
アルデヒドが形成され、これが抗体分子と反応すること
になる。結合は、抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基の
形成を介して起こる。その他に、反応性のスルフヒドリ
ル基を有する化合物を抗体分子にカップリングさせるこ
とも行われた。イソチオシアネートをカップリング剤と
して用いて、化合物を抗体に共有結合させることもでき
る。この方法により、蛍光顕微鏡法（Brandtzaeg,1973,
Scand.J.Immunol.２:273−290）や細胞選別システム（L
oken and Herzenberg,1975,Annals N.Y.Acad.Sci.254:1
63−171）に用いるために蛍光化合物を抗体分子へ結合
させることが行われた。
鎖間のジスルフィド結合を共有結合の部位として利用す
ることもできる。たとえ鎖間ジスルフィド結合のみを選
択的に還元することができたとしても、機能的親和性、
凝集能、補体固定能等の抗体の機能的特性のいくつかが
悪影響を受けるであろう。
ることもできる。たとえ鎖間ジスルフィド結合のみを選
択的に還元することができたとしても、機能的親和性、
凝集能、補体固定能等の抗体の機能的特性のいくつかが
悪影響を受けるであろう。
2.2. 非共有結合 抗原結合領域外（可変領域外）での抗体分子の別の結合
方法は、抗体分子の不変領域に対して向けられた抗体の
使用、または不変領域内の部位に特異的に結合すること
が知られるスタフィロコッカスのプロテインＡを用いる
ものである。これらの結合の仕方は非共有結合であるの
で、どちらのやり方も限定されており、分離・精製法に
は効率がよくないと思われる。抗原の解離は、非共有的
に結合している担体から抗体が放出される結果になりか
ねないので、抗原の選択的溶出が行れなくなる。更にキ
ャリヤーシステムについては（第2.3節を参照のこ
と）、抗体複合体が標的部位に達する前に非共有結合が
こわれる可能性が大きいので、共有結合の方が好まし
い。
方法は、抗体分子の不変領域に対して向けられた抗体の
使用、または不変領域内の部位に特異的に結合すること
が知られるスタフィロコッカスのプロテインＡを用いる
ものである。これらの結合の仕方は非共有結合であるの
で、どちらのやり方も限定されており、分離・精製法に
は効率がよくないと思われる。抗原の解離は、非共有的
に結合している担体から抗体が放出される結果になりか
ねないので、抗原の選択的溶出が行れなくなる。更にキ
ャリヤーシステムについては（第2.3節を参照のこ
と）、抗体複合体が標的部位に達する前に非共有結合が
こわれる可能性が大きいので、共有結合の方が好まし
い。
2.3. キャリヤーシステム 薬物運搬システムではいくつかの物質をキャリヤー分子
として利用しているが、上手くいった例は限られてい
る。実際に、キャリヤーは無毒性で、しかも標的部位に
対して特異性をもつべきである。理想的には、標的部位
においてキャリヤーから化合物が活性形態で放出される
ための機構があるべきである。DNA、リポソーム、蛋
白、ステロイドホルモン、抗体（抗体分子全部またはFa
bフラグメント）等のキャリヤー分子が、放射性化合物
（例.I125,I131）;DNAと結合する物質であるアルキル化
剤や種々の抗生物質（例．ダウノマイシン，アドリアマ
イシン，クロラムブシル）；メトトレキセート等の代謝
拮抗物質；細胞表面で作用する物質（例．毒物ホスホリ
パーゼ，微生物の毒物）；蛋白質合成抑制剤（例．ジフ
テリア毒素，有毒植物蛋白）等の広範囲にわたる薬剤ま
たは細胞毒剤と共に従来用いられてきた。この点につい
ては以下の文献を参照されたい:Bale et al.,1980,Canc
er Research 40:2965−2972;Gohs and Blair,1978,J.Na
tl.Cancer Inst.61（３）:657−676;Gregoriadrs,1977,
Nature 265:407−411;GBegoriadis,1980,Pharmac.Ther.
10:103−118;Trouet et al.,1980,Recent Results Canc
er Res.75:229−235。本発明に関連のあるデリバリーシ
スムについて以下に述べる。
として利用しているが、上手くいった例は限られてい
る。実際に、キャリヤーは無毒性で、しかも標的部位に
対して特異性をもつべきである。理想的には、標的部位
においてキャリヤーから化合物が活性形態で放出される
ための機構があるべきである。DNA、リポソーム、蛋
白、ステロイドホルモン、抗体（抗体分子全部またはFa
bフラグメント）等のキャリヤー分子が、放射性化合物
（例.I125,I131）;DNAと結合する物質であるアルキル化
剤や種々の抗生物質（例．ダウノマイシン，アドリアマ
イシン，クロラムブシル）；メトトレキセート等の代謝
拮抗物質；細胞表面で作用する物質（例．毒物ホスホリ
パーゼ，微生物の毒物）；蛋白質合成抑制剤（例．ジフ
テリア毒素，有毒植物蛋白）等の広範囲にわたる薬剤ま
たは細胞毒剤と共に従来用いられてきた。この点につい
ては以下の文献を参照されたい:Bale et al.,1980,Canc
er Research 40:2965−2972;Gohs and Blair,1978,J.Na
tl.Cancer Inst.61（３）:657−676;Gregoriadrs,1977,
Nature 265:407−411;GBegoriadis,1980,Pharmac.Ther.
10:103−118;Trouet et al.,1980,Recent Results Canc
er Res.75:229−235。本発明に関連のあるデリバリーシ
スムについて以下に述べる。
リポソームによる薬剤の運搬は標的特異性に欠けるとい
う重大な欠陥がある。最近、この問題を解決しようとし
て、薬剤を含むリポソームへ全抗体またはFabフラグメ
ントを共有結合させた研究が行われた〔Heath at el.,1
981,Biochim.Biophys.Acta 640;66−81;Huang et al.,1
980,L.Biol.Chem.255（17）:8015−8018;Lansons and M
allet,1981,Anal.Biochem.111:54−59;Martin et al.,1
981,Biochem.20:4229−4238〕。更に、抗体と前もって
結合させた複数の特定標的へ製剤を向けるためにプロテ
インＡ（Staph Aプロテイン）をリポソームに結合させ
た研究も行われた。かかる標的は用いる抗体によって限
定される〔Leserman et al.,1980,Nature 288:602−60
4〕。しかしながら、リポソームキャリヤーシステムの
特に重要な本質的問題は、殆んどの場合標的化されたリ
ポソームがin vivoで標的部位に選択的に到達しないこ
とである。リポソームが抗体分子で被覆されているか否
かは問わず、リポソームはマクロファージにより直ちに
取り込まれ、他の標的部位に到達する前に循環系から除
去されてしまう。
う重大な欠陥がある。最近、この問題を解決しようとし
て、薬剤を含むリポソームへ全抗体またはFabフラグメ
ントを共有結合させた研究が行われた〔Heath at el.,1
981,Biochim.Biophys.Acta 640;66−81;Huang et al.,1
980,L.Biol.Chem.255（17）:8015−8018;Lansons and M
allet,1981,Anal.Biochem.111:54−59;Martin et al.,1
981,Biochem.20:4229−4238〕。更に、抗体と前もって
結合させた複数の特定標的へ製剤を向けるためにプロテ
インＡ（Staph Aプロテイン）をリポソームに結合させ
た研究も行われた。かかる標的は用いる抗体によって限
定される〔Leserman et al.,1980,Nature 288:602−60
4〕。しかしながら、リポソームキャリヤーシステムの
特に重要な本質的問題は、殆んどの場合標的化されたリ
ポソームがin vivoで標的部位に選択的に到達しないこ
とである。リポソームが抗体分子で被覆されているか否
かは問わず、リポソームはマクロファージにより直ちに
取り込まれ、他の標的部位に到達する前に循環系から除
去されてしまう。
リポソーム標的化システムには他にも重大な本質的問題
があることを大多数の研究者が認めている。即ち、標的
化されたリポソームが標的細胞に結合することは必ずし
もリポソーム内容物、つまり薬剤が標的細胞内に取り込
まれることを意味しないということである〔Weinstein
et al.,1978,Biochem.Biopyhs.Acta 509:272−288〕。
一部の研究者は、標的細胞内に取り込まれるレセプター
に対して特異性を有する化合物を用いてリポソームを標
的化することでこの問題を解決しようとした〔Leserman
et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.77（７）:40
89−4093;Mauk et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.77（８）:4430−4434〕。しかしながら、リポソーム
内容物を取り込ませる問題は、腫瘍細胞の全てが食細胞
として活動しているとは限らないので解決されないまま
である。例えば、線維肉腫細胞はリンパ腫や白血病の細
胞よりもずっと食作用が弱い。従って、これらのリポソ
ームを用いたデリバリーシステムは、究極的には細胞を
死に至らしめる物質を内部へ取り込む標的細胞自体の能
力に依存する。
があることを大多数の研究者が認めている。即ち、標的
化されたリポソームが標的細胞に結合することは必ずし
もリポソーム内容物、つまり薬剤が標的細胞内に取り込
まれることを意味しないということである〔Weinstein
et al.,1978,Biochem.Biopyhs.Acta 509:272−288〕。
一部の研究者は、標的細胞内に取り込まれるレセプター
に対して特異性を有する化合物を用いてリポソームを標
的化することでこの問題を解決しようとした〔Leserman
et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.77（７）:40
89−4093;Mauk et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.77（８）:4430−4434〕。しかしながら、リポソーム
内容物を取り込ませる問題は、腫瘍細胞の全てが食細胞
として活動しているとは限らないので解決されないまま
である。例えば、線維肉腫細胞はリンパ腫や白血病の細
胞よりもずっと食作用が弱い。従って、これらのリポソ
ームを用いたデリバリーシステムは、究極的には細胞を
死に至らしめる物質を内部へ取り込む標的細胞自体の能
力に依存する。
最後に、たとえリポソームが標的細胞内に取り込まれた
場合でも、薬剤が活性形態で放出されるという保証はな
い。食作用の後で、リポソーム内容物は標的細胞のリソ
ソーム内に取り込まれる。リソソーム内の蛋白質分解酵
素は、薬剤の構造を変えたり活性部位を開裂することに
より、薬剤を分解したり府活性化したりする。リソソー
ム内にまれている多種多様な蛋白質分解酵素のため、薬
剤が活性形態で放出されるような結合の仕方を考案する
ことは、不可能ではないにしても、非常に難しくなる。
かくして、標的細胞リソソームの酵素内容物への依存
は、活性形態の薬剤を放出させるためのせいぜい偶発的
システムであると言える。
場合でも、薬剤が活性形態で放出されるという保証はな
い。食作用の後で、リポソーム内容物は標的細胞のリソ
ソーム内に取り込まれる。リソソーム内の蛋白質分解酵
素は、薬剤の構造を変えたり活性部位を開裂することに
より、薬剤を分解したり府活性化したりする。リソソー
ム内にまれている多種多様な蛋白質分解酵素のため、薬
剤が活性形態で放出されるような結合の仕方を考案する
ことは、不可能ではないにしても、非常に難しくなる。
かくして、標的細胞リソソームの酵素内容物への依存
は、活性形態の薬剤を放出させるためのせいぜい偶発的
システムであると言える。
化合物または薬剤を従来の抗体、モノクローナル抗体ま
たは腫瘍抗原に対する抗体のFab部分へ直接結合させる
ことを伴う標的システムについての報告が大きの研究者
によってなされた。これについては上記と論文、Blythm
an et al.,1981,Nature 290:145−146;Davis and Prest
on,1981,Science 213:1385−1388;Hurwitz et ol.,197
9,Int.L.Cancer 24:461−470;米国特許第4,093,607号；
英国特許第1,446,536号を参照されたい。Lrdal and Hak
omori（1980,L.Biol Chem.255（21）:10509−10579）
は、抗体で標的化し、アビジンにより媒介される薬剤に
よる腫瘍細胞の撲滅について述べている。
たは腫瘍抗原に対する抗体のFab部分へ直接結合させる
ことを伴う標的システムについての報告が大きの研究者
によってなされた。これについては上記と論文、Blythm
an et al.,1981,Nature 290:145−146;Davis and Prest
on,1981,Science 213:1385−1388;Hurwitz et ol.,197
9,Int.L.Cancer 24:461−470;米国特許第4,093,607号；
英国特許第1,446,536号を参照されたい。Lrdal and Hak
omori（1980,L.Biol Chem.255（21）:10509−10579）
は、抗体で標的化し、アビジンにより媒介される薬剤に
よる腫瘍細胞の撲滅について述べている。
標的システムのキャリヤーとして、抗体以外の蛋白につ
いて調べた研究者も多数ある。例えば、脱シアリル化糖
蛋白質は優先的に肝細胞によって取り込まれる。上記の
論文、ならびにBernstein et al.,1978 J.Natl.Cancer
Inst.60（２）:379−384を参照されたい。
いて調べた研究者も多数ある。例えば、脱シアリル化糖
蛋白質は優先的に肝細胞によって取り込まれる。上記の
論文、ならびにBernstein et al.,1978 J.Natl.Cancer
Inst.60（２）:379−384を参照されたい。
抗体キャリヤーシステムはリポソームキャリヤーシステ
ムよりも標的に対して高い特異性を有しているが、標的
部位での薬剤の放出には重大な問題が生じる。リポソー
ム媒介システムと同じように、抗体−薬剤化合物が腫瘍
細胞によって取り込まれて、薬物がリソソーム酵素によ
る開裂を経て放出されるようにしなければならい（上記
論文を参照のこと）。更に、薬剤が抗体分子の部位へ非
特異的にランダムに結合すると、抗原結合能を妨げるこ
とがあり、それ故該システムの有効性を減ずることがあ
る。
ムよりも標的に対して高い特異性を有しているが、標的
部位での薬剤の放出には重大な問題が生じる。リポソー
ム媒介システムと同じように、抗体−薬剤化合物が腫瘍
細胞によって取り込まれて、薬物がリソソーム酵素によ
る開裂を経て放出されるようにしなければならい（上記
論文を参照のこと）。更に、薬剤が抗体分子の部位へ非
特異的にランダムに結合すると、抗原結合能を妨げるこ
とがあり、それ故該システムの有効性を減ずることがあ
る。
非侵入的in vivo造影方法において最近用いられている
放射性薬剤技法は、標的となる臓器が循環系から放射性
薬剤ラベルを取り込む能力に基づいている。この技法は
種々の物質を利用して放射性化合物を所望の標的へ運搬
するものであり、かかる物質には基質、基質類似体、リ
ガンド、ホルモン、放射性核腫、二官能性キレート剤
（重金属または放射性核腫と結合可能なキレート剤を一
端に有し、標的細胞へ共有結合できる反応基を他端に含
有するリンカー基）およびリポソームがある［Spencer,
R.P.編集,1980,Radiopharmaceuticals Structure−Acti
vity Relationship（放射線薬物の構造−活性の関係）,
Grune ＆ Stratton.New York;Eckelman and Levanson,1
977,Intl.J.Appl.Radiation and Isotoper 28:67−8
2］。現在利用可能な他の非侵入的技法は発光断層撮影
法、核磁気共鳴イメージング、in vivo分光法等であ
る。Brownell et al.,1982,Science 215:619−626を参
照されたい。その中で、著者らは放射性薬剤分野での標
識抗体の使用を示唆している。
放射性薬剤技法は、標的となる臓器が循環系から放射性
薬剤ラベルを取り込む能力に基づいている。この技法は
種々の物質を利用して放射性化合物を所望の標的へ運搬
するものであり、かかる物質には基質、基質類似体、リ
ガンド、ホルモン、放射性核腫、二官能性キレート剤
（重金属または放射性核腫と結合可能なキレート剤を一
端に有し、標的細胞へ共有結合できる反応基を他端に含
有するリンカー基）およびリポソームがある［Spencer,
R.P.編集,1980,Radiopharmaceuticals Structure−Acti
vity Relationship（放射線薬物の構造−活性の関係）,
Grune ＆ Stratton.New York;Eckelman and Levanson,1
977,Intl.J.Appl.Radiation and Isotoper 28:67−8
2］。現在利用可能な他の非侵入的技法は発光断層撮影
法、核磁気共鳴イメージング、in vivo分光法等であ
る。Brownell et al.,1982,Science 215:619−626を参
照されたい。その中で、著者らは放射性薬剤分野での標
識抗体の使用を示唆している。
3. 発明の概要 本発明は抗体分子と化合物を共有結合させることに関
し、その結果生じる抗体結合体は抗原へ結合しかつ補体
を活性化する能力を保持する点に特徴がある。更に具体
的には、本発明によるかかる結合の方法は、抗体の炭水
化物成分、抗体のスルフヒドリル基ならびに抗体のFc領
域のアミノまたはカルボキシル基への結合を含むもので
ある。
し、その結果生じる抗体結合体は抗原へ結合しかつ補体
を活性化する能力を保持する点に特徴がある。更に具体
的には、本発明によるかかる結合の方法は、抗体の炭水
化物成分、抗体のスルフヒドリル基ならびに抗体のFc領
域のアミノまたはカルボキシル基への結合を含むもので
ある。
本発明の好ましい態様では、かかる結合の方法は抗体Ｈ
鎖の炭水化物成分、一般にはCH2領域への共有結合に係
わるものである。炭水化物は抗体の不変領域内（可変領
域外）にあるので、炭水化物自体の修飾により反応性の
基または干渉性の基が可変領域内に直接導入されること
はない。従って、かかるアプローチは免疫反応や特異性
に悪影響を与えることなしに抗体を共有結合で修飾する
ための手段として有利である。
鎖の炭水化物成分、一般にはCH2領域への共有結合に係
わるものである。炭水化物は抗体の不変領域内（可変領
域外）にあるので、炭水化物自体の修飾により反応性の
基または干渉性の基が可変領域内に直接導入されること
はない。従って、かかるアプローチは免疫反応や特異性
に悪影響を与えることなしに抗体を共有結合で修飾する
ための手段として有利である。
本発明の好ましい態様によれば、抗体の修飾は公知の試
薬および反応を用いる炭水化物成分への共有結合により
行う。蛋白質化学の代わりに、本発明者らは糖蛋白質の
炭水化物を修飾するという炭水化物に固有の炭水化物化
学反応を利用した。基本的には、排他的ではないが、主
として炭水化物成分に係わる数多くの異なる酵素的、非
酵素的反応が存在している。
薬および反応を用いる炭水化物成分への共有結合により
行う。蛋白質化学の代わりに、本発明者らは糖蛋白質の
炭水化物を修飾するという炭水化物に固有の炭水化物化
学反応を利用した。基本的には、排他的ではないが、主
として炭水化物成分に係わる数多くの異なる酵素的、非
酵素的反応が存在している。
本発明の抗体結合体は、完全ではないにしても、実質的
な免疫反応性と免疫特異性を保持することが見出され
た。モノクローナル抗体を用いてかかる結合体を生成す
る時、会合定数と抗体異性度指数（index of heterogen
eity）とは共有結合修飾の本発明方法によって左右され
るものではないが、従来法の修飾では平均結合定数が減
少し、機能的異質性を導入することになる。更に本発明
の新規な手法と共に使用可能な試薬は非常に選択的であ
り、従って抗体分子のポリペプチド部分の検出可能な反
応がまったく存在しない。これは抗体の分子または機能
的な１価フラグメントを用いて行うことができる。更
に、修飾はIgA,IgD,IgE,IgG,IgMを含む種々の抗体クラ
スと、モノクローナル抗体を含む任意の供給源から得た
抗体についても行うことができる。
な免疫反応性と免疫特異性を保持することが見出され
た。モノクローナル抗体を用いてかかる結合体を生成す
る時、会合定数と抗体異性度指数（index of heterogen
eity）とは共有結合修飾の本発明方法によって左右され
るものではないが、従来法の修飾では平均結合定数が減
少し、機能的異質性を導入することになる。更に本発明
の新規な手法と共に使用可能な試薬は非常に選択的であ
り、従って抗体分子のポリペプチド部分の検出可能な反
応がまったく存在しない。これは抗体の分子または機能
的な１価フラグメントを用いて行うことができる。更
に、修飾はIgA,IgD,IgE,IgG,IgMを含む種々の抗体クラ
スと、モノクローナル抗体を含む任意の供給源から得た
抗体についても行うことができる。
本発明は更に、in vivoまたはin vitroで特定の細胞、
組織、臓器または他の部位へ１以上の化合物を運搬し、
続いて標的部位で該化合物を補体の媒介により放出させ
るために、該化合物を標的へ向かわせるキャリヤー分子
として抗体を使用することをも包含するものである。ま
た、この放出は血清プロテアーゼにより媒介させること
もある。
組織、臓器または他の部位へ１以上の化合物を運搬し、
続いて標的部位で該化合物を補体の媒介により放出させ
るために、該化合物を標的へ向かわせるキャリヤー分子
として抗体を使用することをも包含するものである。ま
た、この放出は血清プロテアーゼにより媒介させること
もある。
所望の標的（例．腫瘍細胞、ウイルス、真菌、細胞、寄
生体の抗原決定基）に対する抗体をキャリヤー分子とし
て使用することができる。従来の抗体をキャリヤー分子
として使用してもよいが、モノクローナル抗体は、抗原
特異性が増し、運搬システムの効率が向上し、製造が容
易であるという利点を有する。
生体の抗原決定基）に対する抗体をキャリヤー分子とし
て使用することができる。従来の抗体をキャリヤー分子
として使用してもよいが、モノクローナル抗体は、抗原
特異性が増し、運搬システムの効率が向上し、製造が容
易であるという利点を有する。
in vivoで投与されると、キャリヤー抗体分子は標的部
位の抗原決定基に結合する。引続いて起こる結合された
化合物の放出は、補体の活性化または血清プロテアーゼ
に依存する。補体（com plement）とは、ある種の免疫
複合体の生成により連続的に活性化される（補体カスケ
ード反応）血清蛋白のグループに与えられた集合的な名
称である。カスケード反応の補正成分のうちいくつか
は、特定の基質または化学結合に特異的な蛋白質加水分
解活性を有する。
位の抗原決定基に結合する。引続いて起こる結合された
化合物の放出は、補体の活性化または血清プロテアーゼ
に依存する。補体（com plement）とは、ある種の免疫
複合体の生成により連続的に活性化される（補体カスケ
ード反応）血清蛋白のグループに与えられた集合的な名
称である。カスケード反応の補正成分のうちいくつか
は、特定の基質または化学結合に特異的な蛋白質加水分
解活性を有する。
本発明の方法によれば、化合物を補体活性化が可能であ
る免疫グロブリンクラスの抗体キャリヤー分子に結合さ
せる。この結合は１種またはそれ以上の活性化された補
体酵素による開裂をうけやすいリンカーを介して行れ、
１以上の異なる化合物を各抗体分子へ結合させることが
できる。その結果生じた抗体結合体が固体に投与され
る。修飾をうけた抗体と抗原とのin vivoでの結合に引
続き、固体の血清補体が活性化され、化合物は選択的に
開裂され、標的部位で放出される。かかる結合体は補体
結合アッセイシステムでの標的抗原のin vitro検出と識
別にも使用することができる。
る免疫グロブリンクラスの抗体キャリヤー分子に結合さ
せる。この結合は１種またはそれ以上の活性化された補
体酵素による開裂をうけやすいリンカーを介して行れ、
１以上の異なる化合物を各抗体分子へ結合させることが
できる。その結果生じた抗体結合体が固体に投与され
る。修飾をうけた抗体と抗原とのin vivoでの結合に引
続き、固体の血清補体が活性化され、化合物は選択的に
開裂され、標的部位で放出される。かかる結合体は補体
結合アッセイシステムでの標的抗原のin vitro検出と識
別にも使用することができる。
本発明の実施にあたっては、抗体の抗原結合能または補
体活性化能（補体結合とも言う）を妨げることなく、化
合物を抗体分子に結合させることが好ましい。本発明
は、補体活性化能を有する抗体のいずれにでも化合物を
結合させるため用いることができる。新規なリンカーお
よび結合方法を開示する。
体活性化能（補体結合とも言う）を妨げることなく、化
合物を抗体分子に結合させることが好ましい。本発明
は、補体活性化能を有する抗体のいずれにでも化合物を
結合させるため用いることができる。新規なリンカーお
よび結合方法を開示する。
また、腫瘍造影または抗原−抗体相互作用に基づく分離
法のごとき、ある種の技法においては、抗体が不溶性マ
トリックスに結合されるが、これには化合物が標的部位
に結合したままでいることが必要となる。標的部位での
開裂が好ましくない別の態様では、活性化補体蛋白に対
して感受性のないリンカーグループを用いるか、または
抗体分子として補体を活性化しないクラスまたは型のも
のを用いる。
法のごとき、ある種の技法においては、抗体が不溶性マ
トリックスに結合されるが、これには化合物が標的部位
に結合したままでいることが必要となる。標的部位での
開裂が好ましくない別の態様では、活性化補体蛋白に対
して感受性のないリンカーグループを用いるか、または
抗体分子として補体を活性化しないクラスまたは型のも
のを用いる。
最後に、他の化合物、例えばホルモンまたは神経伝達物
質の運搬において、補体カスケードを活性化せずに化合
物の開裂を行うことが好ましい場合には、補体の結合し
ない抗体に結合させた血清プロテアーゼ感受性リンカー
を用いてもよい。
質の運搬において、補体カスケードを活性化せずに化合
物の開裂を行うことが好ましい場合には、補体の結合し
ない抗体に結合させた血清プロテアーゼ感受性リンカー
を用いてもよい。
4. 発明の開示 糖蛋白質は、ある種の治療用および／または診断用手段
として用いられる生物学的に重要な巨大分子のいくつか
の種類のうちの一つである。現在認識されている糖蛋白
質のクラスは決して完全なものではないが、かかる物質
を列挙してみれば、免疫グロブリン、血清補体成分、種
々の酵素、細胞表面組織適合性抗原および細胞表面レセ
プター等が含まれる。これらの化合物はポリペプチド主
鎖へ共有結合された炭水化物残基を有している。抗体と
は、炭水化物成分が通常免疫グロブリン分子のＨ鎖上に
位置する糖蛋白質の一つのクラスである（数種の免疫グ
ロブリンの模式図を示す図１を参照のこと）。炭水化物
成分を含む免疫グロブリンのFabまたはFab′フラグメン
トもここに説明する反応式に用いることができる。IgG
免疫グロブリンのFab′フラグメントは、ペプシンまた
はパパインで抗体分子を開裂することにより得られる
〔前者は２価フラグメント（Fab′）２をもたらし、後
者は二つの１価フラグメント2Fabをもたらす〕。
として用いられる生物学的に重要な巨大分子のいくつか
の種類のうちの一つである。現在認識されている糖蛋白
質のクラスは決して完全なものではないが、かかる物質
を列挙してみれば、免疫グロブリン、血清補体成分、種
々の酵素、細胞表面組織適合性抗原および細胞表面レセ
プター等が含まれる。これらの化合物はポリペプチド主
鎖へ共有結合された炭水化物残基を有している。抗体と
は、炭水化物成分が通常免疫グロブリン分子のＨ鎖上に
位置する糖蛋白質の一つのクラスである（数種の免疫グ
ロブリンの模式図を示す図１を参照のこと）。炭水化物
成分を含む免疫グロブリンのFabまたはFab′フラグメン
トもここに説明する反応式に用いることができる。IgG
免疫グロブリンのFab′フラグメントは、ペプシンまた
はパパインで抗体分子を開裂することにより得られる
〔前者は２価フラグメント（Fab′）２をもたらし、後
者は二つの１価フラグメント2Fabをもたらす〕。
4.1. 抗体の選択 本発明によれば、どのような抗原またはハプテンに対し
て誘導された抗体も用いることができる。従来の抗体
（抗血清）を用いてもよいが、モノクローナル抗体には
いくつかの利点がある。各モノクローナル抗体は一つの
抗原決定基に対して特異性を有する。これに加えて、各
モノクローナル抗体は無限に産生が可能である。本発明
で用いる抗体はいずれかの抗原決定基、例えば、腫瘍、
細菌、真菌、ウイルス、寄生体、マイコプラズマ、組織
適合性抗原、分化抗原、その他の細胞膜抗原、病原体表
面抗原、毒素、酵素、アレルゲン、薬剤ならびに生物学
的活性を有する分子に対して誘導されたものである。
て誘導された抗体も用いることができる。従来の抗体
（抗血清）を用いてもよいが、モノクローナル抗体には
いくつかの利点がある。各モノクローナル抗体は一つの
抗原決定基に対して特異性を有する。これに加えて、各
モノクローナル抗体は無限に産生が可能である。本発明
で用いる抗体はいずれかの抗原決定基、例えば、腫瘍、
細菌、真菌、ウイルス、寄生体、マイコプラズマ、組織
適合性抗原、分化抗原、その他の細胞膜抗原、病原体表
面抗原、毒素、酵素、アレルゲン、薬剤ならびに生物学
的活性を有する分子に対して誘導されたものである。
特に興味のある薬剤としては、オピオイド類、アンフェ
タミン類、バルビツール酸塩、ステロイド類、カテコー
ルアミン類、ジランチン（dilantin）、テオフィリン、
ヒスタミン、カンナビノイド類等である。抗原の一覧表
は、米国特許第4,193,983号、特に第７〜11欄に記載さ
れており、該特許明細書を参照によりここに組み入れる
ものとする。
タミン類、バルビツール酸塩、ステロイド類、カテコー
ルアミン類、ジランチン（dilantin）、テオフィリン、
ヒスタミン、カンナビノイド類等である。抗原の一覧表
は、米国特許第4,193,983号、特に第７〜11欄に記載さ
れており、該特許明細書を参照によりここに組み入れる
ものとする。
抗体と結合した化合物の運搬および放出を希望する場合
は、IgMクラスまたはIgGのサブクラスの内いずれかの免
疫グラブリンを用いるべきである。なんとなれば、これ
らの免疫グロブリンは補体を活性化することが知られて
いるからである。他の用途では補体活性化能力のないキ
ャリヤー免疫グロブリンを用いてもよい。かかる免疫グ
ロブリンのキャリヤーには以下のものが含まれる:IgA,I
gD,IgEの如きあるクラスの抗体、IgGのある種のサブク
ラス、免疫グロブリンのある種のフラグメント、例えば
半抗体分子（単一のH:L鎖の対）、またはFab,Fab′また
は（Fab′）２フラグメント。in vivo標的の造影を行い
たい場合には、抗体フラグメントは比較的速い速度で標
的部位に浸透するのでキャリヤーとして有利である。さ
らに、相異なる抗原決定基に対して反応する抗体の組合
せを用いてもよい。
は、IgMクラスまたはIgGのサブクラスの内いずれかの免
疫グラブリンを用いるべきである。なんとなれば、これ
らの免疫グロブリンは補体を活性化することが知られて
いるからである。他の用途では補体活性化能力のないキ
ャリヤー免疫グロブリンを用いてもよい。かかる免疫グ
ロブリンのキャリヤーには以下のものが含まれる:IgA,I
gD,IgEの如きあるクラスの抗体、IgGのある種のサブク
ラス、免疫グロブリンのある種のフラグメント、例えば
半抗体分子（単一のH:L鎖の対）、またはFab,Fab′また
は（Fab′）２フラグメント。in vivo標的の造影を行い
たい場合には、抗体フラグメントは比較的速い速度で標
的部位に浸透するのでキャリヤーとして有利である。さ
らに、相異なる抗原決定基に対して反応する抗体の組合
せを用いてもよい。
4.2. 化合物を抗体分子へ結合する方法 従来法の利用に加えて、本発明は化合物を抗体分子へ結
合させる新規な方法を含んでいる。即ち、（１）抗体分
子の炭水化物成分へ結合させること、（２）抗体分子の
スルフヒドリル基へ結合させること、および（３）抗体
分子のFc領域のアミノ基またはカルボキシル基へ結合さ
せることである。どの方法を利用した場合も、結合によ
って抗体の主な特徴である免疫特異性や免疫反応性等を
有意に変えてはならない。その他には製造された抗体結
合体の安定性と反応の単純さが考慮される。
合させる新規な方法を含んでいる。即ち、（１）抗体分
子の炭水化物成分へ結合させること、（２）抗体分子の
スルフヒドリル基へ結合させること、および（３）抗体
分子のFc領域のアミノ基またはカルボキシル基へ結合さ
せることである。どの方法を利用した場合も、結合によ
って抗体の主な特徴である免疫特異性や免疫反応性等を
有意に変えてはならない。その他には製造された抗体結
合体の安定性と反応の単純さが考慮される。
4.2.1. 抗体の炭水化物成分への結合 以下に詳述するように、抗体の炭水化物側鎖を選択的に
酸化してアルデヒドを生成する。生成したアルデヒドを
アミン基（例．ヒドロキシルアミン，ヒドラジン，フェ
ニルヒドラジンまたはセミカルバジド等のアンモニア誘
導体）と反応させてシッフ塩基（例．オキシム，ヒドラ
ゾン，フェニルヒドラゾンまたはセミカルバゾン）を生
成させる。
酸化してアルデヒドを生成する。生成したアルデヒドを
アミン基（例．ヒドロキシルアミン，ヒドラジン，フェ
ニルヒドラジンまたはセミカルバジド等のアンモニア誘
導体）と反応させてシッフ塩基（例．オキシム，ヒドラ
ゾン，フェニルヒドラゾンまたはセミカルバゾン）を生
成させる。
または、抗体の炭水化物成分を酵素的技法で修飾して他
の化学基との結合または反応を可能にすることができ
る。かかる酵素の一例は酸素の存在下でガラクトースを
酸化するガラクトースオキシダーゼである。
の化学基との結合または反応を可能にすることができ
る。かかる酵素の一例は酸素の存在下でガラクトースを
酸化するガラクトースオキシダーゼである。
4.2.1.1.酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物成分の酸化はアルデヒド基の生成へ
導く。過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸ナ
トリウム、メタ過ヨウ素酸カリウム等の酸化剤を用いる
ことができる。これらの中では酸素酸とその塩は二次的
な反応つまり好ましくない副反応の度合が低いので好ま
しい。一般的な議論については、Jackson著、1944「有
機反応（Organic Reactions）２」第341頁;Bunton著、1
965「有機化学における酸化（Oxidation in Organic Ch
emistry）」第１巻、（ワイバーグ編）（アカデミック
プレス）社、ニューヨーク）第367頁を参照されたい。
導く。過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸ナ
トリウム、メタ過ヨウ素酸カリウム等の酸化剤を用いる
ことができる。これらの中では酸素酸とその塩は二次的
な反応つまり好ましくない副反応の度合が低いので好ま
しい。一般的な議論については、Jackson著、1944「有
機反応（Organic Reactions）２」第341頁;Bunton著、1
965「有機化学における酸化（Oxidation in Organic Ch
emistry）」第１巻、（ワイバーグ編）（アカデミック
プレス）社、ニューヨーク）第367頁を参照されたい。
抗体とこれらの酸化剤との酸化反応は公知の方法で行う
ことができる。酸化反応では、抗体は通常水溶液の形で
用いられ、その濃度は通常100mg/ml以下、好ましくは１
〜20mg/mlである。酸化剤として酸素酸またはその塩を
用いるときは、これは通常水溶液の形で用いられ、その
濃度は通常0.001〜50mM、好ましくは1.0〜10mMである。
酸素酸およびその塩の量は抗体の種類に左右されるが、
一般に過剰量、例えば被酸化性炭水化物の２〜10倍量が
用いられる。しかし最適量は日常的な実験により決定で
きる。
ことができる。酸化反応では、抗体は通常水溶液の形で
用いられ、その濃度は通常100mg/ml以下、好ましくは１
〜20mg/mlである。酸化剤として酸素酸またはその塩を
用いるときは、これは通常水溶液の形で用いられ、その
濃度は通常0.001〜50mM、好ましくは1.0〜10mMである。
酸素酸およびその塩の量は抗体の種類に左右されるが、
一般に過剰量、例えば被酸化性炭水化物の２〜10倍量が
用いられる。しかし最適量は日常的な実験により決定で
きる。
抗体を酸素酸またはその塩で酸化する工程において、最
適pH範囲は約４〜８、温度は０〜37℃、そして反応時間
は約15分から12時間である。
適pH範囲は約４〜８、温度は０〜37℃、そして反応時間
は約15分から12時間である。
糖蛋白を酸素酸またはその塩で酸化する間、光を遮断し
て糖蛋白の過剰酸化を防止することが好ましい。
て糖蛋白の過剰酸化を防止することが好ましい。
4.2.1.2. 酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化は酵素、ガラクトースオ
キシダーゼで行うこともできる〔Cooper,et al.,1959,
J.Biol.Chem.234:445−448〕。
キシダーゼで行うこともできる〔Cooper,et al.,1959,
J.Biol.Chem.234:445−448〕。
抗体は水溶液の形で用い、濃度は通常0.5〜20mg/mlであ
る。酵素は通常溶液ml当り約５〜100単位、pH約5.5〜約
8.0で用いられる。pH、基質濃度、バッファーおよびバ
ッファー濃度の酵素反応に対する影響はクーパー等（前
掲）が述べている。
る。酵素は通常溶液ml当り約５〜100単位、pH約5.5〜約
8.0で用いられる。pH、基質濃度、バッファーおよびバ
ッファー濃度の酵素反応に対する影響はクーパー等（前
掲）が述べている。
4.2.1.3.抗体結合体の製造 本発明による抗体結合体は、酸化抗体を利用可能なアミ
ン基を有する適当な結合相手と反応させて製造する。こ
の直後に得られる生成物（抗体結合体）は、初期の付加
生成物から水分子の除去により生じた炭素−窒素二重結
合を含む。
ン基を有する適当な結合相手と反応させて製造する。こ
の直後に得られる生成物（抗体結合体）は、初期の付加
生成物から水分子の除去により生じた炭素−窒素二重結
合を含む。
アルデヒドとヒドラジドの反応についてはマーチ（Marc
h）著「上級有機化学：反応、メカニズムおよび構造（A
cvanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms and
Strusture）」1978年（マグロウヒル社、ニューヨー
ク）第674頁を参照されたい。
h）著「上級有機化学：反応、メカニズムおよび構造（A
cvanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms and
Strusture）」1978年（マグロウヒル社、ニューヨー
ク）第674頁を参照されたい。
濃度が約0.5〜20mg/mlの酸化抗体の溶液を結合相手と混
ぜ合わせ（結合相手の反応性基と抗体アルデヒドのモル
比は約１〜約10,000）、この溶液を約１〜18時間加温し
た。適温は０℃〜37℃で、pHは約６〜８でありうる。
ぜ合わせ（結合相手の反応性基と抗体アルデヒドのモル
比は約１〜約10,000）、この溶液を約１〜18時間加温し
た。適温は０℃〜37℃で、pHは約６〜８でありうる。
4.2.1.4.抗体結合体の安定化 抗体結合体が抗体とその結合相手との間で第4.2.1.3.節
に記載の方法で生成された後、抗体結合体は適当な還元
剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライドまたはナ
トリウムボロハイドライドで安定化を計ることも可能で
ある。
に記載の方法で生成された後、抗体結合体は適当な還元
剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライドまたはナ
トリウムボロハイドライドで安定化を計ることも可能で
ある。
還元剤は通常、有効なアルデヒド基に対して約10〜100
倍モル過剰に加える。これについての一般的情報はJent
oft and Dearborn,1979,J.Biol.Chem.254:4359を参照さ
れたい。
倍モル過剰に加える。これについての一般的情報はJent
oft and Dearborn,1979,J.Biol.Chem.254:4359を参照さ
れたい。
4.2.2.抗体分子のスルフヒドリル基への結合 遊離スルフヒドリル基は免疫グロブリン分子のジスルフ
ィド結合から生成しうる。これは抗体分子の温和な還元
により達成できる。IgGのジスルフィド結合の中で通常
最も還元しやすいものは二つのＨ鎖を結合するものであ
る。抗体分子の抗原結合領域の近くにあるジスルフィド
結合は比較的影響をうけないで残存する（図１を参照の
こと）。かかる還元の結果として、補体結合能が失われ
るが、抗体−抗原結合能は影響をうけない（Karush et
al.,1979,Biochem,18:2226,−2232）。Ｈ鎖領域内で生
成される遊離スルフヒドリル基は、次にカルボキシまた
はアミノ基を含む化合物のヨードアルキル誘導体（例．
化合物に結合されるリンカーグループのヨードアルキル
誘導体）と反応し、共有結合を形成する。かかる結合は
免疫グロブリンの抗原結合部位を妨害しない。
ィド結合から生成しうる。これは抗体分子の温和な還元
により達成できる。IgGのジスルフィド結合の中で通常
最も還元しやすいものは二つのＨ鎖を結合するものであ
る。抗体分子の抗原結合領域の近くにあるジスルフィド
結合は比較的影響をうけないで残存する（図１を参照の
こと）。かかる還元の結果として、補体結合能が失われ
るが、抗体−抗原結合能は影響をうけない（Karush et
al.,1979,Biochem,18:2226,−2232）。Ｈ鎖領域内で生
成される遊離スルフヒドリル基は、次にカルボキシまた
はアミノ基を含む化合物のヨードアルキル誘導体（例．
化合物に結合されるリンカーグループのヨードアルキル
誘導体）と反応し、共有結合を形成する。かかる結合は
免疫グロブリンの抗原結合部位を妨害しない。
化合物を還元免疫グロブリンまたは還元抗体フラグメン
トの遊離スルフヒドリル基へ結合することにより製造さ
れる抗体結合体は補体を活性化しない。従って、これら
の結合体は、化合物の開裂や放出が望ましくないin vit
ro分離やin vivo造影システムに用いることができる。
このような結合体は、補体により媒介されない放出を所
望する時にも用いることができる。かかる態様では、還
元免疫グロブリンまたは還元抗体フラグメントのスルフ
ヒドリル基へ血清プロテアーゼによる開裂をうけやすい
リンカーを介して化合物を結合させることもできる。
トの遊離スルフヒドリル基へ結合することにより製造さ
れる抗体結合体は補体を活性化しない。従って、これら
の結合体は、化合物の開裂や放出が望ましくないin vit
ro分離やin vivo造影システムに用いることができる。
このような結合体は、補体により媒介されない放出を所
望する時にも用いることができる。かかる態様では、還
元免疫グロブリンまたは還元抗体フラグメントのスルフ
ヒドリル基へ血清プロテアーゼによる開裂をうけやすい
リンカーを介して化合物を結合させることもできる。
IgG免疫グロブリンのFab′フラグメントは抗体分子をペ
プシン（２価フラグメント（Fab′）２をもたらす）ま
たはパパイン（二つの１価フラグメント2Fabをもたら
す）で開裂すると得られる。図１を参照されたい。Fab
と（Fab′）２フラグメントは抗体分子全体よりも小さ
く、従って、標的部位または組織への浸透が容易であ
る。これによりin vivo造影は明らかに有利となる。そ
の理由は結合体がin vivo部位（腫瘍塊、感染部位等）
へ浸透しやすくなるからである。抗体フラグメントを使
って生成した結合体を用いる場合は、これらのフラグメ
ントが胎盤関門を越えないというその他の利点もある。
その結果、この態様を用いる時、妊娠中の婦人において
造影化合物に胎児を曝露することなくin vivo部位（例
えば、腫瘍）を撮影することができる。
プシン（２価フラグメント（Fab′）２をもたらす）ま
たはパパイン（二つの１価フラグメント2Fabをもたら
す）で開裂すると得られる。図１を参照されたい。Fab
と（Fab′）２フラグメントは抗体分子全体よりも小さ
く、従って、標的部位または組織への浸透が容易であ
る。これによりin vivo造影は明らかに有利となる。そ
の理由は結合体がin vivo部位（腫瘍塊、感染部位等）
へ浸透しやすくなるからである。抗体フラグメントを使
って生成した結合体を用いる場合は、これらのフラグメ
ントが胎盤関門を越えないというその他の利点もある。
その結果、この態様を用いる時、妊娠中の婦人において
造影化合物に胎児を曝露することなくin vivo部位（例
えば、腫瘍）を撮影することができる。
抗体分子のスルフヒドリル基へ化合物を結合させると補
体結合能を破壊することになるが、かかる結合の方法を
用いて補体媒介放出システムに用いる抗体結合体を作る
ことができる。このような態様では、補体感受性を有す
る基質リンカーに結合させた化合物を、還元したIg分子
または抗体フラグメントのスルフヒドリルに結合させ、
補体を活性化することのできる完全な抗体分子との混合
物として標的へ運搬する。後者が補体を活性化し、この
補体が前者から化合物を開裂するだろう。抗体フラグメ
ントを、補体媒介放出システムにおいてキャリヤー分子
として使用すれば、妊娠中の女性の治療が可能となり、
結合体が標的部位へより迅速に振動するという利点が得
られる。
体結合能を破壊することになるが、かかる結合の方法を
用いて補体媒介放出システムに用いる抗体結合体を作る
ことができる。このような態様では、補体感受性を有す
る基質リンカーに結合させた化合物を、還元したIg分子
または抗体フラグメントのスルフヒドリルに結合させ、
補体を活性化することのできる完全な抗体分子との混合
物として標的へ運搬する。後者が補体を活性化し、この
補体が前者から化合物を開裂するだろう。抗体フラグメ
ントを、補体媒介放出システムにおいてキャリヤー分子
として使用すれば、妊娠中の女性の治療が可能となり、
結合体が標的部位へより迅速に振動するという利点が得
られる。
本発明によれば、還元抗体分子のスルフヒドリル基への
結合を行うため、基質リンカーはヨードアルキル基をリ
ンカーの一端に結合させることにより修飾される。リン
カーの修飾されていない部位は化合物へ共有結合させて
もよく、させなくともよい。例えば、第5.5節で製造し
た化合物にエステルまたはアミド結合される基質リンカ
ー（表２および表３を参照）は、ヨードアルキル基を付
加して修飾し、以下に示すヨードアルキル誘導体を形成
させる（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味す
る）。
結合を行うため、基質リンカーはヨードアルキル基をリ
ンカーの一端に結合させることにより修飾される。リン
カーの修飾されていない部位は化合物へ共有結合させて
もよく、させなくともよい。例えば、第5.5節で製造し
た化合物にエステルまたはアミド結合される基質リンカ
ー（表２および表３を参照）は、ヨードアルキル基を付
加して修飾し、以下に示すヨードアルキル誘導体を形成
させる（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味す
る）。
前述した様に、リンカーは活性化補体または血清プロテ
アーゼによる開裂をうけやすいものであっても、これに
抵抗を示すものであってもよい。
アーゼによる開裂をうけやすいものであっても、これに
抵抗を示すものであってもよい。
リンカーグループのヨードアルキル誘導体を還元抗体分
子または還元抗体フラグメントと反応させると、リンカ
ーグループは抗体分子またはフラグメントに共有結合さ
れる。これは以下の通りである（注：＊印はアミドまた
はエステル結合を意味する）。
子または還元抗体フラグメントと反応させると、リンカ
ーグループは抗体分子またはフラグメントに共有結合さ
れる。これは以下の通りである（注：＊印はアミドまた
はエステル結合を意味する）。
4.2.3.抗体分子のFc領域のアミノまたはカルボキシ基へ
の結合 化合物を抗体分子へ結合させる従来法を変更して、本発
明のために使用することもできる。これらの従来法では
化合物を抗体分子のアミノまたはカルボキシル基へ結合
させる。従来法の欠点は抗体分子の抗原への結合親和力
が低下する（つまり免疫特異性が低下する）ことにあ
り、これはリンカーまたは化合物が抗体分子のFab領域
（抗原結合アーム）へ非特異的に結合するためである。
従って、従来の結合法を利用するには、基質リンカーを
抗体分子のより適切な位置へ向けるようにして、免疫複
合体形成と補体による開裂を可能にすべきである。この
ためには、Fc領域のアミノまたはカルボキシル基が基質
リンカーと、例えば可溶性カルボジイミド反応を介し
て、反応している間、免疫グロブリンまたは半分子の抗
原結合アーム（Fab領域）を保護する。リンカーが化合
物へ共有結合されている場合は、抗体分子との結合を干
渉するような化合物の反応性基はどれも、抗体分子をリ
ンカーと反応させる前にブロックすべきである。抗体結
合体が形成されたら、化合物の反応性基を脱ブロックす
る。リンカーは活性化補体または血清プロテアーゼに開
裂をうけやすいものであっても、これに抵抗するもので
あってもよい。カップリングの程度は試薬を限定するこ
とによりコントロールできる。例えば（注：＊印はアミ
ドまたはエステル結合を意味する）： Fabアームの保護には幾通りかの方法がある。キャリヤ
ー抗体分子のFab部分は、キャリヤーFab抗原結合アーム
に対する抗体（抗Fab抗体）に結合させることができ
る。その後の結合反応は、キャリヤー抗体分子の未結合
のFc部分への化合物の結合をもたらすだろう。抗Fab抗
体をカラムに固定させると、反応済の成分と未反応の成
分の分離が容易になる。
の結合 化合物を抗体分子へ結合させる従来法を変更して、本発
明のために使用することもできる。これらの従来法では
化合物を抗体分子のアミノまたはカルボキシル基へ結合
させる。従来法の欠点は抗体分子の抗原への結合親和力
が低下する（つまり免疫特異性が低下する）ことにあ
り、これはリンカーまたは化合物が抗体分子のFab領域
（抗原結合アーム）へ非特異的に結合するためである。
従って、従来の結合法を利用するには、基質リンカーを
抗体分子のより適切な位置へ向けるようにして、免疫複
合体形成と補体による開裂を可能にすべきである。この
ためには、Fc領域のアミノまたはカルボキシル基が基質
リンカーと、例えば可溶性カルボジイミド反応を介し
て、反応している間、免疫グロブリンまたは半分子の抗
原結合アーム（Fab領域）を保護する。リンカーが化合
物へ共有結合されている場合は、抗体分子との結合を干
渉するような化合物の反応性基はどれも、抗体分子をリ
ンカーと反応させる前にブロックすべきである。抗体結
合体が形成されたら、化合物の反応性基を脱ブロックす
る。リンカーは活性化補体または血清プロテアーゼに開
裂をうけやすいものであっても、これに抵抗するもので
あってもよい。カップリングの程度は試薬を限定するこ
とによりコントロールできる。例えば（注：＊印はアミ
ドまたはエステル結合を意味する）： Fabアームの保護には幾通りかの方法がある。キャリヤ
ー抗体分子のFab部分は、キャリヤーFab抗原結合アーム
に対する抗体（抗Fab抗体）に結合させることができ
る。その後の結合反応は、キャリヤー抗体分子の未結合
のFc部分への化合物の結合をもたらすだろう。抗Fab抗
体をカラムに固定させると、反応済の成分と未反応の成
分の分離が容易になる。
このような結合体は以下の通りに製造することができる
（各工程後にバッファーで十分に洗浄する）。抗Fab抗
体を臭化シアンで活性化したセファロースカラム等の適
当な支持マトリックスに結合させる。カラムにキャリヤ
ー抗体を注入し、カラムのすべての抗原結合部位を飽和
させる。これによりキャリヤー抗体のFab領域が結合さ
れ、抗Fab抗体の抗原結合部位を保護することになる。
カラムをアミノ基遮断剤（例．無水酢酸，カルボベンゾ
キシクロライド等）で処理し、抗Fab抗体および結合し
たキャリヤー抗体の両方の露出した部分の全つの遊離ア
ミノ基をブロックする。それからカラムをカオトロピッ
ク剤（chaotropic agent）（例．チオシアネート、過塩
素酸塩、ヨウ化物等）または変性剤（例．尿素、ホルモ
ン−尿素、塩酸グアニジン等）で処理するが、これによ
り抗Fab抗体の免疫特異性を破壊せずにキャリヤー抗体
を抗Fab抗体から分離することができる〔Dandliker et
al.,1967,Biochemistry ６（５）:1460−1467〕。この
処理によって不要なキャリヤー抗体分子が放出され、固
定化抗Fab抗体を遊離させて、その後免疫複合体を形成
させることができる。その結果、カラムは非抗原結合部
位にブロックされたアミノ基を含む固定化抗Fab抗体を
含むことになり、キャリヤー抗体の負荷を受ける。キャ
リヤー抗体が抗Fab抗体に結合した後で、化合物に結合
された基質リンカーを用いて従来の結合反応を行う。利
用可能なアミノ基はキャリヤー抗体のFc部分にだけある
ので、この反応は化合物がキャリヤー抗体のこの部分へ
基質リンカーを介して結合するという結果をもたらす。
最後に、得られた結合体は適当なバッファー（例．カオ
トロピック剤または変性剤）を用いて溶出によりカラム
から放出される。
（各工程後にバッファーで十分に洗浄する）。抗Fab抗
体を臭化シアンで活性化したセファロースカラム等の適
当な支持マトリックスに結合させる。カラムにキャリヤ
ー抗体を注入し、カラムのすべての抗原結合部位を飽和
させる。これによりキャリヤー抗体のFab領域が結合さ
れ、抗Fab抗体の抗原結合部位を保護することになる。
カラムをアミノ基遮断剤（例．無水酢酸，カルボベンゾ
キシクロライド等）で処理し、抗Fab抗体および結合し
たキャリヤー抗体の両方の露出した部分の全つの遊離ア
ミノ基をブロックする。それからカラムをカオトロピッ
ク剤（chaotropic agent）（例．チオシアネート、過塩
素酸塩、ヨウ化物等）または変性剤（例．尿素、ホルモ
ン−尿素、塩酸グアニジン等）で処理するが、これによ
り抗Fab抗体の免疫特異性を破壊せずにキャリヤー抗体
を抗Fab抗体から分離することができる〔Dandliker et
al.,1967,Biochemistry ６（５）:1460−1467〕。この
処理によって不要なキャリヤー抗体分子が放出され、固
定化抗Fab抗体を遊離させて、その後免疫複合体を形成
させることができる。その結果、カラムは非抗原結合部
位にブロックされたアミノ基を含む固定化抗Fab抗体を
含むことになり、キャリヤー抗体の負荷を受ける。キャ
リヤー抗体が抗Fab抗体に結合した後で、化合物に結合
された基質リンカーを用いて従来の結合反応を行う。利
用可能なアミノ基はキャリヤー抗体のFc部分にだけある
ので、この反応は化合物がキャリヤー抗体のこの部分へ
基質リンカーを介して結合するという結果をもたらす。
最後に、得られた結合体は適当なバッファー（例．カオ
トロピック剤または変性剤）を用いて溶出によりカラム
から放出される。
4.3.結合相手 本発明の方法によれば、抗体は適当な結合相手ならば何
にでも結合することができる。主たる限定要素は、結合
反応が（１）競合する好ましくない反応を制限するに足
るだけの選択的であること、（２）抗体の反応性や選択
性と干渉しないように穏やかなものであること、という
２点である。わかりやすく言うと、結合相手は（ａ）抗
体に直接結合する対象の化合物と、（ｂ）可溶性リンカ
ーと、（ｃ）不溶性担体とに分けられる。
にでも結合することができる。主たる限定要素は、結合
反応が（１）競合する好ましくない反応を制限するに足
るだけの選択的であること、（２）抗体の反応性や選択
性と干渉しないように穏やかなものであること、という
２点である。わかりやすく言うと、結合相手は（ａ）抗
体に直接結合する対象の化合物と、（ｂ）可溶性リンカ
ーと、（ｃ）不溶性担体とに分けられる。
4.3.1.対象の化合物 抗体が結合する相手は、抗体との反応後もその主要特性
を保有している化合物であって、抗体が免疫特異性と免
疫反応性を実質的に保持できるものであればいかなる化
合物であってもよい。
を保有している化合物であって、抗体が免疫特異性と免
疫反応性を実質的に保持できるものであればいかなる化
合物であってもよい。
例えば、糖蛋白の酸化炭水化物部分のアルデヒドを化合
物へ結合したい場合、化合物は好ましくはアミノ基また
はヒドラジド基の如き反応性基を含有しているべきであ
る。かかる化合物はホルモン、酸素、輸送蛋白、触媒、
キレート化合物、受容体蛋白、免疫グロブリンの如き各
種蛋白、蛍光または化学ルミネッセンス化合物または潜
在的な蛍光または合額ルミネッセンス化合物を含む。
「潜在的」蛍光または化学ルミネッセンス化合物とは他
の物質と反応、修飾または組み合わせた後にだけ蛍光ま
たは化学ルミネッセンスを発する化合物を指す。対象化
合物にアミノ基が含まれない時には、化合物を修飾して
カップリングのためのアミノまたはヒドラジド基をつく
ることができる。
物へ結合したい場合、化合物は好ましくはアミノ基また
はヒドラジド基の如き反応性基を含有しているべきであ
る。かかる化合物はホルモン、酸素、輸送蛋白、触媒、
キレート化合物、受容体蛋白、免疫グロブリンの如き各
種蛋白、蛍光または化学ルミネッセンス化合物または潜
在的な蛍光または合額ルミネッセンス化合物を含む。
「潜在的」蛍光または化学ルミネッセンス化合物とは他
の物質と反応、修飾または組み合わせた後にだけ蛍光ま
たは化学ルミネッセンスを発する化合物を指す。対象化
合物にアミノ基が含まれない時には、化合物を修飾して
カップリングのためのアミノまたはヒドラジド基をつく
ることができる。
運搬システムに用いる抗体と結合される化合物は意図す
る用途（例．細胞の死滅、細胞増殖の予防、ホルモン療
法、標的造影、遺伝子治療、細胞選別または分離法）に
あわせて選択する。かかる化合物は、例えば薬剤、毒
素、毒素フラグメント、アルキル化剤、酵素、抗生物
質、代謝拮抗物質、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物
質、DNA、放射線不透過染料、放射性アイソトープ、蛍
光性化合物、マーカー化合物、レクチン、細胞膜の透過
性に変更を加える化合物ならびに不溶性マトリックス等
である。表１には本発明に用いることのできるいくつか
の薬剤を記載したが、これは排他的な表でないことは当
然である。また、化合物を組合せて用いることもでき
る。
る用途（例．細胞の死滅、細胞増殖の予防、ホルモン療
法、標的造影、遺伝子治療、細胞選別または分離法）に
あわせて選択する。かかる化合物は、例えば薬剤、毒
素、毒素フラグメント、アルキル化剤、酵素、抗生物
質、代謝拮抗物質、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物
質、DNA、放射線不透過染料、放射性アイソトープ、蛍
光性化合物、マーカー化合物、レクチン、細胞膜の透過
性に変更を加える化合物ならびに不溶性マトリックス等
である。表１には本発明に用いることのできるいくつか
の薬剤を記載したが、これは排他的な表でないことは当
然である。また、化合物を組合せて用いることもでき
る。
4.3.2.可溶性リンカー 本発明によれば、一方で抗体と反応し、他方で対象化合
物と反応するいくつかの反応性基を有する中間可溶性リ
ンキング剤つまりリンカーを介して、どの化合物または
不溶性担体にでも抗体を共有結合させることができる。
リンカーは、抗体（または対象化合物もしくは不溶性担
体）との反応や最終生成物が抗体の反応性と選択性に好
ましくない影響を与えないようなものを選ばなければな
らない。一般的にはこれらのリンカーとしてはメルカプ
トエタノールアミンの如く酸化抗体にそのアミノ基を介
して結合するようなヘテロ二官能性リンカーを含む。硫
黄原子を脱ブロックすると、遊離スルフヒドリル基を次
の反応に利用できる。リンカーは抗体と対象の化合物ま
たは不溶性担体との間の距離を任意に選べるような大き
さであればよい。
物と反応するいくつかの反応性基を有する中間可溶性リ
ンキング剤つまりリンカーを介して、どの化合物または
不溶性担体にでも抗体を共有結合させることができる。
リンカーは、抗体（または対象化合物もしくは不溶性担
体）との反応や最終生成物が抗体の反応性と選択性に好
ましくない影響を与えないようなものを選ばなければな
らない。一般的にはこれらのリンカーとしてはメルカプ
トエタノールアミンの如く酸化抗体にそのアミノ基を介
して結合するようなヘテロ二官能性リンカーを含む。硫
黄原子を脱ブロックすると、遊離スルフヒドリル基を次
の反応に利用できる。リンカーは抗体と対象の化合物ま
たは不溶性担体との間の距離を任意に選べるような大き
さであればよい。
4.3.3.不溶性担体 適当な不溶性担体は直接抗体に結合させても、または間
接的に可溶性リンカーを介して結合させてもよい。アミ
ンを含有する不溶性担体、例えばアミンまたはヒドラジ
ド担体等、即ち、誘導体化したデキストラン、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリビニル、ポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミド、ガラス、ラテックス等の適当
なポリマーを含む担体へ直接結合させるために酸化抗体
を用いる。これらの担体は通常ビーズとして用いられる
が、特定の用途によっては管や板の両面であってもよ
い。
接的に可溶性リンカーを介して結合させてもよい。アミ
ンを含有する不溶性担体、例えばアミンまたはヒドラジ
ド担体等、即ち、誘導体化したデキストラン、アガロー
ス、ポリスチレン、ポリビニル、ポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミド、ガラス、ラテックス等の適当
なポリマーを含む担体へ直接結合させるために酸化抗体
を用いる。これらの担体は通常ビーズとして用いられる
が、特定の用途によっては管や板の両面であってもよ
い。
4.4.キャリヤーシステム 本発明の一態様によれば、化合物は標的抗原に対する抗
体に結合させることもできる。標的部位での活性化形態
での化合物の放出が望ましい時は、補対カスケードを活
性化する能力を有するクラスに属する抗体分子（免疫グ
ロブリン）の特定部位へ化合物を結合させる。この結合
は化学結合（例．エステルまたはアミド結合）および血
清補対成分の一つまはそれ以上による開裂をうけやすい
リンカーグループ（例．ペプチドまたはアミノ酸）を介
して行われる。
体に結合させることもできる。標的部位での活性化形態
での化合物の放出が望ましい時は、補対カスケードを活
性化する能力を有するクラスに属する抗体分子（免疫グ
ロブリン）の特定部位へ化合物を結合させる。この結合
は化学結合（例．エステルまたはアミド結合）および血
清補対成分の一つまはそれ以上による開裂をうけやすい
リンカーグループ（例．ペプチドまたはアミノ酸）を介
して行われる。
ここに説明した化学的結合方法により得られた抗体結合
体は、抗原と結合し、補体カスケードを活性化する能力
を保持することができる。その結果、結合体を固体に投
与すると、引続いてin vivoで標的抗原との免疫複合体
の形成が行われ、これにより固体の血清補体が活性化さ
れる。リンカーが補体による開裂をうれるようにデザイ
ンされているのであれば、化合物は補体カスケードの一
つまたはそれ以上の酵素によって標的部位で開裂され
る。化合物の放出は標的部位への運搬後に行われるの
で、標的運搬システムの効率は大巾に改善される。
体は、抗原と結合し、補体カスケードを活性化する能力
を保持することができる。その結果、結合体を固体に投
与すると、引続いてin vivoで標的抗原との免疫複合体
の形成が行われ、これにより固体の血清補体が活性化さ
れる。リンカーが補体による開裂をうれるようにデザイ
ンされているのであれば、化合物は補体カスケードの一
つまたはそれ以上の酵素によって標的部位で開裂され
る。化合物の放出は標的部位への運搬後に行われるの
で、標的運搬システムの効率は大巾に改善される。
本発明方法は他の標的運搬システムと比べて更に有利で
ある。腫瘍細胞の全てが標的抗原決定基をもつわけでは
ないことが知られているので、標的細胞内への取り込み
を必要とするような運搬システムでは、抗原決定基を有
しかつ複合体を取り込むことのできる腫瘍細胞について
のみ運搬が成功する。抗原決定基をもたなかったり取り
込みができない腫瘍細胞については治療不能である。
ある。腫瘍細胞の全てが標的抗原決定基をもつわけでは
ないことが知られているので、標的細胞内への取り込み
を必要とするような運搬システムでは、抗原決定基を有
しかつ複合体を取り込むことのできる腫瘍細胞について
のみ運搬が成功する。抗原決定基をもたなかったり取り
込みができない腫瘍細胞については治療不能である。
本発明方法によれば、抗体キャリヤー分子は化合物を標
的細胞へと搬送する。しかしながら、重要なことは、一
度標的細胞との結合が行われた後では、本発明方法では
固体の活性化された補体酵素により活性化合物の放出が
可能となることである。放出が行われた後では、化合物
は自由に標的部位、例えば腫瘍塊等へ浸透することがで
きる。その結果、化合物は抗原決定基をもたない腫瘍細
胞にも、決定基をもつ腫瘍細胞と同様に効果を及ぼすこ
とになる。更に、プロセス全体が結合体の取り込みに左
右されない。
的細胞へと搬送する。しかしながら、重要なことは、一
度標的細胞との結合が行われた後では、本発明方法では
固体の活性化された補体酵素により活性化合物の放出が
可能となることである。放出が行われた後では、化合物
は自由に標的部位、例えば腫瘍塊等へ浸透することがで
きる。その結果、化合物は抗原決定基をもたない腫瘍細
胞にも、決定基をもつ腫瘍細胞と同様に効果を及ぼすこ
とになる。更に、プロセス全体が結合体の取り込みに左
右されない。
ここに述べた標的への運搬方法はいくつかの目的のため
に用いることができる。結合体をつくるために用いる抗
体、リンカー、化合物は運搬の目的によって選択する。
特定の標的部位への薬剤化合物の運搬および放出の結
果、腫瘍細胞、がん細胞、真菌、細菌、寄生体またはウ
イルスを選択的に殺したり、それらの増殖を防ぐことが
できる。ホルモン、酵素または神経伝達物質の所定の部
位へ運搬することも可能である。最終的には、本発明方
法はDNAまたは特定遺伝子をin vivoまたはin vitroでこ
の特定遺伝子欠損標的細胞へ運搬するような遺伝子治療
にも応用可能となろう。
に用いることができる。結合体をつくるために用いる抗
体、リンカー、化合物は運搬の目的によって選択する。
特定の標的部位への薬剤化合物の運搬および放出の結
果、腫瘍細胞、がん細胞、真菌、細菌、寄生体またはウ
イルスを選択的に殺したり、それらの増殖を防ぐことが
できる。ホルモン、酵素または神経伝達物質の所定の部
位へ運搬することも可能である。最終的には、本発明方
法はDNAまたは特定遺伝子をin vivoまたはin vitroでこ
の特定遺伝子欠損標的細胞へ運搬するような遺伝子治療
にも応用可能となろう。
更に別の態様においては、化合物を標的まで運搬するが
放出しないようにデザインすることもできる。従って、
本発明は、in vivoおよびin vitroで腫瘍、臓器または
感染部位等の特定部位を見い出し、検出し、定量するた
めに用いることもできる。本発明のこの態様は、特に造
影システム、細胞選別法、分離法等に有用である。
放出しないようにデザインすることもできる。従って、
本発明は、in vivoおよびin vitroで腫瘍、臓器または
感染部位等の特定部位を見い出し、検出し、定量するた
めに用いることもできる。本発明のこの態様は、特に造
影システム、細胞選別法、分離法等に有用である。
更に詳細に述べれば、造影に関しては放射性薬物または
重金属が、（ａ）リンカーと共有結合しているか、また
は（ｂ）キレート剤を介してリンカーと非共有結合して
いる。従って、標的の性質と運搬の目的に応じて、広い
範囲の抗体、リンカー、対象の化合物を種々の組合せで
用いることができる。
重金属が、（ａ）リンカーと共有結合しているか、また
は（ｂ）キレート剤を介してリンカーと非共有結合して
いる。従って、標的の性質と運搬の目的に応じて、広い
範囲の抗体、リンカー、対象の化合物を種々の組合せで
用いることができる。
4.5.血清補体とリンカーの選択 本発明の方法によれば、化合物の放出を希望する時は、
この化合物をIgMクラスまたはIgGのある種のサブクラス
の抗体の特定部位へ結合させる（図１）。その結果得ら
れた結合体は、抗原と結合し、補体カスケード反応を活
性化する能力を保有する。
この化合物をIgMクラスまたはIgGのある種のサブクラス
の抗体の特定部位へ結合させる（図１）。その結果得ら
れた結合体は、抗原と結合し、補体カスケード反応を活
性化する能力を保有する。
補体とは、古典的な経路とプロパージン経路の二つの方
法の内いずれか一つにより活性化される血清蛋白グルー
プに与えられた集合的名称である（Muller−Eberhard,H
ospital Practice,1977年８月:33−43）。古典的経路
は、まずIgMクラスまたはIgGのある種のサブクラスの抗
体をその対応する抗原へ結合させることから始まるのに
対して、プロパージン経路は血清蛋白のプロパージンな
らびに他の非免疫グロブリン血清因子に依存する〔Reid
and Porter,1981,Ann.Rev.Biochem.50:433−464〕。
法の内いずれか一つにより活性化される血清蛋白グルー
プに与えられた集合的名称である（Muller−Eberhard,H
ospital Practice,1977年８月:33−43）。古典的経路
は、まずIgMクラスまたはIgGのある種のサブクラスの抗
体をその対応する抗原へ結合させることから始まるのに
対して、プロパージン経路は血清蛋白のプロパージンな
らびに他の非免疫グロブリン血清因子に依存する〔Reid
and Porter,1981,Ann.Rev.Biochem.50:433−464〕。
古典的経路は、本発明の実施には特に重要なものであ
る。古典的経路の特徴は、補体系の蛋白質分解酵素を活
性化するある種の抗体−抗原複合体（または免疫複合
体）の形成にある〔Borsos and Rapp,1965,J.Immunol.9
5:559−566;Cohen,1968,J.Immunol.100:407−413;Cohen
and Becker,1968,J.Immun ol.100;403−406;Ishizaka
et al.,1968,J.Immunol.100:1145−1153〕。これらの活
性化された補体酵素は、補体カスケードの他の成分を開
裂し、活性化する（図２）。最終的には、「攻撃複合体
（attack complex）」（または溶解複合体）の形成が起
こり、標的細胞膜の一体性がくずれる結果となる。
る。古典的経路の特徴は、補体系の蛋白質分解酵素を活
性化するある種の抗体−抗原複合体（または免疫複合
体）の形成にある〔Borsos and Rapp,1965,J.Immunol.9
5:559−566;Cohen,1968,J.Immunol.100:407−413;Cohen
and Becker,1968,J.Immun ol.100;403−406;Ishizaka
et al.,1968,J.Immunol.100:1145−1153〕。これらの活
性化された補体酵素は、補体カスケードの他の成分を開
裂し、活性化する（図２）。最終的には、「攻撃複合体
（attack complex）」（または溶解複合体）の形成が起
こり、標的細胞膜の一体性がくずれる結果となる。
古典的経路で最初に活性化される成分はC1であって、こ
れはC2とC4に作用するプロテアーゼとなる。活性化C1
（Ｃ）は特異的なエステラーゼ活性を有する。活性化 は時にC3転換酵素と称されることがあるが、C3を加水分
解により開裂する複合体であり、活性化C3（Ｃ▲
▼）と共にC5を開裂する。C3の開裂は補体活性化におけ
る古典的経路とプロパージン経路を共通した最初のステ
ップである。
れはC2とC4に作用するプロテアーゼとなる。活性化C1
（Ｃ）は特異的なエステラーゼ活性を有する。活性化 は時にC3転換酵素と称されることがあるが、C3を加水分
解により開裂する複合体であり、活性化C3（Ｃ▲
▼）と共にC5を開裂する。C3の開裂は補体活性化におけ
る古典的経路とプロパージン経路を共通した最初のステ
ップである。
Ｃと との酵素活性については、カウボキシ末端エステルまた
はアミド結合でin vitroで開裂されるモデル合成基質を
用いた（表２）研究が最近行われた。これらの合成基質
を本発明で述べたように抗体分子と化合物の間のリンカ
ーとして用いてもよい。かかるリンカーにより、特定の
補体が媒介する開裂、これに続く活性型化合物の標的部
位での放出が可能となる。しかしながら、補性成分のい
ずれかによる開裂をうけやすい基質をリンカーとして用
いてもよい。
はアミド結合でin vitroで開裂されるモデル合成基質を
用いた（表２）研究が最近行われた。これらの合成基質
を本発明で述べたように抗体分子と化合物の間のリンカ
ーとして用いてもよい。かかるリンカーにより、特定の
補体が媒介する開裂、これに続く活性型化合物の標的部
位での放出が可能となる。しかしながら、補性成分のい
ずれかによる開裂をうけやすい基質をリンカーとして用
いてもよい。
かくして、本発明によれば、化合物は基質リンカーグル
ープの一端に結合され、リンカーグループの他端は抗体
分子の特定部位に結合される。例えば、化合物がヒドロ
キシ基またはアミノ基をもっている時は、ペプチド、ア
ミノ酸または他の適当に選んだリンカーのカルボキシ末
端基へエステルまたはアミド結合を介して結合される。
例えば、かかる化合物はカルボジイミド反応を介してリ
ンカーペプチドへ結合させることもできる。化合物がリ
ンカーとの結合を干渉するような官能基を含む時は、こ
れらの干渉性官能基を化合物の結合前にブロックし、結
合体の製造後に脱ブロックすることもできる。例えば、
第３図は抗新生物薬剤であるアルケラン（Alkeran）（B
urroughs−Wellcome社製）とペプチドCBZ−gly−gly−a
rgの結合のための一般反応式を示す。その後、リンカー
グループの反対側、つまりアミノ末端基は補体活性化能
を有する抗体分子へ結合させるための修飾をうける。
ープの一端に結合され、リンカーグループの他端は抗体
分子の特定部位に結合される。例えば、化合物がヒドロ
キシ基またはアミノ基をもっている時は、ペプチド、ア
ミノ酸または他の適当に選んだリンカーのカルボキシ末
端基へエステルまたはアミド結合を介して結合される。
例えば、かかる化合物はカルボジイミド反応を介してリ
ンカーペプチドへ結合させることもできる。化合物がリ
ンカーとの結合を干渉するような官能基を含む時は、こ
れらの干渉性官能基を化合物の結合前にブロックし、結
合体の製造後に脱ブロックすることもできる。例えば、
第３図は抗新生物薬剤であるアルケラン（Alkeran）（B
urroughs−Wellcome社製）とペプチドCBZ−gly−gly−a
rgの結合のための一般反応式を示す。その後、リンカー
グループの反対側、つまりアミノ末端基は補体活性化能
を有する抗体分子へ結合させるための修飾をうける。
化合物とリンカーの結合は、リンカーを抗体分子へ結合
する前でも後でもよい。寿命の短い放射性アンソトープ
の抗体への結合などの場合は、まず中間体として安定し
た修飾抗体を製造することが好ましく、その場合リンカ
ーは結合した化合物を含まない。用途によっては、化合
物を修飾抗体のリンカーへ共有結合させてもよい。これ
らのペプチドリンカーは長さが可変であってよく、これ
は抗体分子からの基質までの距離がリンカーと化合物の
間のアミドまたはエステル結合で生じる開裂の効率を左
右するからである。これらのリンカーは有機化合物を含
み、例えば一端を抗体分子の特定部位へ共有結合させる
ことができる所望の長さの有機ポリマーを含みうる。有
機ポリマーの他端はアミノ酸またはペプチドリンカーに
結合していてもよい。表３には、本発明の抗体結合体を
形成するためのリンカーグループとして用いることので
きる他の基質を示してある（表中ｎはゼロを含む整数で
ある）。これらの配列は補体基質配列のアミノ酸を類似
の酸−塩基特性を有するアミノ酸と置き換えることによ
り得られた。この表は排他的なものではない。
する前でも後でもよい。寿命の短い放射性アンソトープ
の抗体への結合などの場合は、まず中間体として安定し
た修飾抗体を製造することが好ましく、その場合リンカ
ーは結合した化合物を含まない。用途によっては、化合
物を修飾抗体のリンカーへ共有結合させてもよい。これ
らのペプチドリンカーは長さが可変であってよく、これ
は抗体分子からの基質までの距離がリンカーと化合物の
間のアミドまたはエステル結合で生じる開裂の効率を左
右するからである。これらのリンカーは有機化合物を含
み、例えば一端を抗体分子の特定部位へ共有結合させる
ことができる所望の長さの有機ポリマーを含みうる。有
機ポリマーの他端はアミノ酸またはペプチドリンカーに
結合していてもよい。表３には、本発明の抗体結合体を
形成するためのリンカーグループとして用いることので
きる他の基質を示してある（表中ｎはゼロを含む整数で
ある）。これらの配列は補体基質配列のアミノ酸を類似
の酸−塩基特性を有するアミノ酸と置き換えることによ
り得られた。この表は排他的なものではない。
このようにして、結合体が補体の存在下で抗原に結合す
ると、化合物をリンカーへ結合するアミドまたはエステ
ル結合が開裂され、その結果として化合物がその活性型
で放出される。これらの結合体を固体へ投与すると、化
合物の標的部位への運搬およびそこでの放出が起こり、
かかる結合体は時に薬剤、抗生物質、代謝拮抗物質、抗
増殖剤、細胞毒のin vivo運搬に有効である。
ると、化合物をリンカーへ結合するアミドまたはエステ
ル結合が開裂され、その結果として化合物がその活性型
で放出される。これらの結合体を固体へ投与すると、化
合物の標的部位への運搬およびそこでの放出が起こり、
かかる結合体は時に薬剤、抗生物質、代謝拮抗物質、抗
増殖剤、細胞毒のin vivo運搬に有効である。
別の態様においては、本発明の結合体を用いて標的抗原
をin vitroで検出することもできる。例えば、結合体を
標的抗原と血清補体を含む試験用混合物に添加すると、
その結果生じる化合物（例えば、蛍光化合物）の補体媒
介放出が、該混合物内の標的抗原の存在を知らせる指標
および尺度となる。
をin vitroで検出することもできる。例えば、結合体を
標的抗原と血清補体を含む試験用混合物に添加すると、
その結果生じる化合物（例えば、蛍光化合物）の補体媒
介放出が、該混合物内の標的抗原の存在を知らせる指標
および尺度となる。
用途によっては、化合物の放出が好ましくないものもあ
る。従って、本発明の別の態様では、補体酵素による開
裂をうけにくいリンカーを介して化合物が抗体分子へ結
合される。これらのリンカーにはアミノ酸、ペプチドま
たはここに述べた方法により後で抗体分子または抗体フ
ラグメントへの結合に用いることのできる官能基を含む
ように修飾しうる他の有機化合物が含まれる。かかる有
機リンカーの一般式は次の通りである： Ｗ−（CH2）ｎ−Ｑ 〔式中、Ｗは または−CH2−であり、 Ｑはアミノ酸、ペプチド、キレート剤（例えばジエチレ
ントリアミン五酢酸）またはキレート剤誘導体であり、
ｎは０から20までの整数である〕 更には、化合物を補体活性化能のない抗体分子または抗
体フラグメントに結合されることも可能である。補体活
性化能をもたないキャリヤー抗体を用いる時は、活性化
補体による開列をうけにくいリンカーまたは活性化補体
による開裂をうけやすいリンカーを用いて結合を行う。
非開裂のアプローチはアガロース、ポリアクリルアミド
等の固定化または不溶性マトリックス抗体分子またはフ
ラグメントと結合させるのに用いてもよい。その後、こ
れらの生成物は複合混合物から特定の抗原成分を同定し
たり、これを分離するのに用いられる。この技術は、抗
原を含むと考えられる混合物を固定化抗体結合体と接触
させることにより達成される。反応しなかった成分をす
べて洗い流してから、抗原−抗体複合体を解離できる変
性剤またはカオトロピック剤で処理して、不溶性マトリ
ックスから標的抗原を分離することができる。
る。従って、本発明の別の態様では、補体酵素による開
裂をうけにくいリンカーを介して化合物が抗体分子へ結
合される。これらのリンカーにはアミノ酸、ペプチドま
たはここに述べた方法により後で抗体分子または抗体フ
ラグメントへの結合に用いることのできる官能基を含む
ように修飾しうる他の有機化合物が含まれる。かかる有
機リンカーの一般式は次の通りである： Ｗ−（CH2）ｎ−Ｑ 〔式中、Ｗは または−CH2−であり、 Ｑはアミノ酸、ペプチド、キレート剤（例えばジエチレ
ントリアミン五酢酸）またはキレート剤誘導体であり、
ｎは０から20までの整数である〕 更には、化合物を補体活性化能のない抗体分子または抗
体フラグメントに結合されることも可能である。補体活
性化能をもたないキャリヤー抗体を用いる時は、活性化
補体による開列をうけにくいリンカーまたは活性化補体
による開裂をうけやすいリンカーを用いて結合を行う。
非開裂のアプローチはアガロース、ポリアクリルアミド
等の固定化または不溶性マトリックス抗体分子またはフ
ラグメントと結合させるのに用いてもよい。その後、こ
れらの生成物は複合混合物から特定の抗原成分を同定し
たり、これを分離するのに用いられる。この技術は、抗
原を含むと考えられる混合物を固定化抗体結合体と接触
させることにより達成される。反応しなかった成分をす
べて洗い流してから、抗原−抗体複合体を解離できる変
性剤またはカオトロピック剤で処理して、不溶性マトリ
ックスから標的抗原を分離することができる。
この非開裂アプローチは、細胞選別法〔Loken and Herz
enberg,1975,Annals N.Y.Acad.Sci.254:163−171〕や化
合物の放出が好ましくない場合の腫瘍、臓器、感染部位
等の位置を決める造影システムに用いるための抗体結合
体をつくるものにも特に有用である。かかる造影システ
ムでは、抗体フラグメントの使用が明らかに有利であ
る。その理由は、このようなフラグメントが抗体分子よ
りもはるかに容易に組織内に拡散し、浸透するからであ
る。これに加えて、抗体フラグメントは胎盤関門を越え
ない〔Bellanti,1978,Immunology II,W.B.Saunders,Phi
ladelphia〕。従って、妊娠中の婦人でも腫瘍造影を実
施することができる。
enberg,1975,Annals N.Y.Acad.Sci.254:163−171〕や化
合物の放出が好ましくない場合の腫瘍、臓器、感染部位
等の位置を決める造影システムに用いるための抗体結合
体をつくるものにも特に有用である。かかる造影システ
ムでは、抗体フラグメントの使用が明らかに有利であ
る。その理由は、このようなフラグメントが抗体分子よ
りもはるかに容易に組織内に拡散し、浸透するからであ
る。これに加えて、抗体フラグメントは胎盤関門を越え
ない〔Bellanti,1978,Immunology II,W.B.Saunders,Phi
ladelphia〕。従って、妊娠中の婦人でも腫瘍造影を実
施することができる。
本発明の更に別の態様によれば、化合物と抗体との間の
間隔を最適にするような方法でリンカーを構築すること
が必要となろう。これは一般構造式 Ｗ−（CH2）ｎ−Ｑ を有するリンカーを用いて可能となるが、式中Ｑはアミ
ノ酸またはペプチドであり、Ｗとｎは上記した通りであ
る。
間隔を最適にするような方法でリンカーを構築すること
が必要となろう。これは一般構造式 Ｗ−（CH2）ｎ−Ｑ を有するリンカーを用いて可能となるが、式中Ｑはアミ
ノ酸またはペプチドであり、Ｗとｎは上記した通りであ
る。
更に別の標的運搬応用例においては、補体の活性化なし
で化合物が放出されることが望ましい。これは補体カス
ケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するからであ
る。それ故に、標的細胞を殺さずに化合物の運搬と放出
を行わねばならない時にはこのアプローチが有用であ
る。ホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物
質、遺伝子または酵素等の細胞メディエーターを標的細
胞へ運搬したい時は、これが目標となる。これらの結合
体は、補体活性化能のない抗体分子またはフラグメント
に、血清プロテアーゼによる開裂を中程度に受けやすい
リンカーを介して、化合物を結合させて形成することが
できる。この結合体を固体に投与すると、抗原−抗体複
合体が直ちに形成されるが、化合物の開裂速度は遅く、
その結果として化合物が標的部位で放出される。
で化合物が放出されることが望ましい。これは補体カス
ケードの活性化が最終的に標的細胞を溶解するからであ
る。それ故に、標的細胞を殺さずに化合物の運搬と放出
を行わねばならない時にはこのアプローチが有用であ
る。ホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経伝達物
質、遺伝子または酵素等の細胞メディエーターを標的細
胞へ運搬したい時は、これが目標となる。これらの結合
体は、補体活性化能のない抗体分子またはフラグメント
に、血清プロテアーゼによる開裂を中程度に受けやすい
リンカーを介して、化合物を結合させて形成することが
できる。この結合体を固体に投与すると、抗原−抗体複
合体が直ちに形成されるが、化合物の開裂速度は遅く、
その結果として化合物が標的部位で放出される。
古典的な補体経路での活性化の第一ステップはC1と抗体
−抗原複合体との間の相互作用を必要とする。この相互
作用は、抗体分子のFc領域の部位が存在することを必要
とする（図１）。炭水化合物成分のいくつかは免疫グロ
ブリンのFc領域内に位置しているが、これらはC1結合が
おこるために必要である。炭水化合成分の除去は、免疫
重合体が補体の成分C1と結合する能力を喪失させる〔Wi
nkelhake et al.,1980,J.Biol.Chem.255:2822−282
8〕。炭水化物成分を含む免疫グリブリンのFabまたはFa
b′フラグメントはここに記載した反応式に用いること
ができる。かかる免疫グリブリンの例はパットナム等に
よって配列決定されたヒトIgMである〔Putnam et al.,1
973,Science132:287〕。
−抗原複合体との間の相互作用を必要とする。この相互
作用は、抗体分子のFc領域の部位が存在することを必要
とする（図１）。炭水化合物成分のいくつかは免疫グロ
ブリンのFc領域内に位置しているが、これらはC1結合が
おこるために必要である。炭水化合成分の除去は、免疫
重合体が補体の成分C1と結合する能力を喪失させる〔Wi
nkelhake et al.,1980,J.Biol.Chem.255:2822−282
8〕。炭水化物成分を含む免疫グリブリンのFabまたはFa
b′フラグメントはここに記載した反応式に用いること
ができる。かかる免疫グリブリンの例はパットナム等に
よって配列決定されたヒトIgMである〔Putnam et al.,1
973,Science132:287〕。
本発明の一態様によれば、基質リンカーはヒドラジンま
たはヒドラジド誘導体をリンカーの一端に結合させるこ
とにより修飾される。リンカーの修飾をうけない部分は
化合物へ共有結合しても、しなくてもよい。例えば、エ
ステルまたはアミド結合を介して化合物へ結合された基
質リンカーは、第4.5節に記載した通り（表２および３
を参照のこと）、ペプチド鎖の反対側のアミノ末端基に
ヒドラジド（例．フェニルヒドラジン）を結合させるこ
とにより修飾される。この結果、次の構造が得られる
（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味する）。
たはヒドラジド誘導体をリンカーの一端に結合させるこ
とにより修飾される。リンカーの修飾をうけない部分は
化合物へ共有結合しても、しなくてもよい。例えば、エ
ステルまたはアミド結合を介して化合物へ結合された基
質リンカーは、第4.5節に記載した通り（表２および３
を参照のこと）、ペプチド鎖の反対側のアミノ末端基に
ヒドラジド（例．フェニルヒドラジン）を結合させるこ
とにより修飾される。この結果、次の構造が得られる
（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味する）。
上記構造式ではヒドラジンがパラ位にあるが、ヒドラジ
ン成分がオルトまたはメタ位にある化合物を用いること
もできる。その後、エステルまたはアミド結合を介して
化合物へ結合されたペプチドリンカーのヒドラジド誘導
体を、酸化免疫グロブリンつまり酸化炭水化合物を含む
免疫グロブリンと反応させる。その結果ヒドラゾンが形
成され、補体による開裂をうけやすいリンカーグループ
を介して免疫グリブリンの炭水化物側鎖と化合物とが共
有結合される。所望により、用いるリンカーは活性化補
体または血清プロテアーゼによる開裂を抵抗するもので
もよい（例．造影システムで用いるキレート剤またはキ
レート剤誘導体を含むリンカー）。別の応用例では、リ
ンカーは血清プロテアーゼによる開裂をうけやすいよう
にデザインされる。本明細書に記載したリンカーとキャ
リヤー抗体の共有結合は抗体分子の抗原結合部位も補体
結合も妨害しない。その結果得られた構造は以下の通り
である（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味す
る）。
ン成分がオルトまたはメタ位にある化合物を用いること
もできる。その後、エステルまたはアミド結合を介して
化合物へ結合されたペプチドリンカーのヒドラジド誘導
体を、酸化免疫グロブリンつまり酸化炭水化合物を含む
免疫グロブリンと反応させる。その結果ヒドラゾンが形
成され、補体による開裂をうけやすいリンカーグループ
を介して免疫グリブリンの炭水化物側鎖と化合物とが共
有結合される。所望により、用いるリンカーは活性化補
体または血清プロテアーゼによる開裂を抵抗するもので
もよい（例．造影システムで用いるキレート剤またはキ
レート剤誘導体を含むリンカー）。別の応用例では、リ
ンカーは血清プロテアーゼによる開裂をうけやすいよう
にデザインされる。本明細書に記載したリンカーとキャ
リヤー抗体の共有結合は抗体分子の抗原結合部位も補体
結合も妨害しない。その結果得られた構造は以下の通り
である（注：＊印はアミドまたはエステル結合を意味す
る）。
ここでは主として抗体の炭水化合物成分との反応につい
て述べたが、かかる技術は他の種類の糖蛋白にも用いら
れる。
て述べたが、かかる技術は他の種類の糖蛋白にも用いら
れる。
4.6.抗体結合体の他の用途 本発明の抗体結合体は、医学、産業用に種々の用途を有
しており、分離、アフィニティー精製、診断薬、治療
薬、免疫アッセイ、細胞選別、電気泳動分析、組織学、
細胞学等に用いられる。これらの用途はすべて、構造が
わずかに異なる化合物を特異的に識別できる抗体の能力
を利用している。
しており、分離、アフィニティー精製、診断薬、治療
薬、免疫アッセイ、細胞選別、電気泳動分析、組織学、
細胞学等に用いられる。これらの用途はすべて、構造が
わずかに異なる化合物を特異的に識別できる抗体の能力
を利用している。
本発明の新規な抗体結合体は、抗体と抗原との相互作用
が検出可能な信号または検出可能な信号の変調手段を提
供する免疫アッセイにも用いることができる。信号は化
学的、電磁放射線、特に紫外線または可視光線の吸収も
しくは発光でもよく、熱的、容積測定的、電気化学的で
あってもよい。信号の変調は、例えば蛍光または化学ル
ミネッセンスの消光または変化の結果であってもよく、
この場合結合相手は蛍光または化学ルミネッセンス物質
（または潜在的な蛍光または化学ルミネッセンス物質）
である。
が検出可能な信号または検出可能な信号の変調手段を提
供する免疫アッセイにも用いることができる。信号は化
学的、電磁放射線、特に紫外線または可視光線の吸収も
しくは発光でもよく、熱的、容積測定的、電気化学的で
あってもよい。信号の変調は、例えば蛍光または化学ル
ミネッセンスの消光または変化の結果であってもよく、
この場合結合相手は蛍光または化学ルミネッセンス物質
（または潜在的な蛍光または化学ルミネッセンス物質）
である。
免疫アッセイでは、抗原の通常何らかの方法でラベルま
たはタグを付してあり、アッセイでは抗体に結合したラ
ベルまたはタグを抗原の量と結合していないラベルまた
はタグを付した抗原の量との差を識別する。ホモジーニ
アスアッセイでは、ラベルまたタグの出す信号の変調の
結果として、識別が行われる。ヘテロジーニアスアッセ
イにおいては、識別は結合抗原と非結合抗原の物理的な
分離の結果である。
たはタグを付してあり、アッセイでは抗体に結合したラ
ベルまたはタグを抗原の量と結合していないラベルまた
はタグを付した抗原の量との差を識別する。ホモジーニ
アスアッセイでは、ラベルまたタグの出す信号の変調の
結果として、識別が行われる。ヘテロジーニアスアッセ
イにおいては、識別は結合抗原と非結合抗原の物理的な
分離の結果である。
5.実施例：シリーズＩ 以下の実施例において抗体分子を中間体可溶性リンカー
を介して対象の化合物へ特定的に結合する方法を示す。
を介して対象の化合物へ特定的に結合する方法を示す。
5.1.抗体分子の炭水化物成分の酸化 本実施例で用いた抗体分子はモノクローナルIgM（No.17
1と称する）であって、ヒツジ赤血球細胞の抗原決定基
に対して特異性を有する。モノクローナル抗体をつくる
には次の方法をとった。ルイスラットにヒツジ赤血球細
胞を１回注射して免疫を与え、３日後に免疫ラットの脾
臓細胞を取り出し、マックカーン等の方法によって骨髄
腫系SP2/OAg14と融合させた（McKearn et al.,1979,Imm
unol.Rev.47:91−115）。ついで、クローン化細胞を増
殖させ、その結果得られたモノクローナル抗体をクリン
マン＆マックカーンの方法で精製した（Klinman ＆ Mck
earn,1981,J.Immunol.Meth.42:1−９）。
1と称する）であって、ヒツジ赤血球細胞の抗原決定基
に対して特異性を有する。モノクローナル抗体をつくる
には次の方法をとった。ルイスラットにヒツジ赤血球細
胞を１回注射して免疫を与え、３日後に免疫ラットの脾
臓細胞を取り出し、マックカーン等の方法によって骨髄
腫系SP2/OAg14と融合させた（McKearn et al.,1979,Imm
unol.Rev.47:91−115）。ついで、クローン化細胞を増
殖させ、その結果得られたモノクローナル抗体をクリン
マン＆マックカーンの方法で精製した（Klinman ＆ Mck
earn,1981,J.Immunol.Meth.42:1−９）。
抗体の炭化化合物成分の酸化は、上述のクーパー等の方
法の変法により、抗体とガラクトースオキシダーゼとを
反応させて行った（Cooper et al.前掲）。このため、N
o.171モノクローナル抗体3.8mgを0.135M NaCl,0.015M T
ris−HCl（pH7.0）,0.5mM MgCl2,0.15mM CaCl2から成る
バッファー1mlへ添加した。続いて、ガラクトースオキ
シダーゼ溶液〔ニュージャージー州フリーホールドのWo
rthington Biochemical社製〕の0.1mlアリコートを該バ
ッファー1ml当り酵素52単位の濃度で抗体溶液へ添加し
た。最後に、該バッファー0.1mlに溶解したカタラーゼ
（Worthington Biochemical社製）43μｇを反応混合物
に添加した（酸化反応中に生成した過酸化水素を分解す
るためにカタラーゼを添加した）。反応混合物を室温で
48時間インキュベートし、４℃で貯蔵した。図４は未酸
化（ａ）と酸化（ｂ）抗体の励起スペクトルを示す。
法の変法により、抗体とガラクトースオキシダーゼとを
反応させて行った（Cooper et al.前掲）。このため、N
o.171モノクローナル抗体3.8mgを0.135M NaCl,0.015M T
ris−HCl（pH7.0）,0.5mM MgCl2,0.15mM CaCl2から成る
バッファー1mlへ添加した。続いて、ガラクトースオキ
シダーゼ溶液〔ニュージャージー州フリーホールドのWo
rthington Biochemical社製〕の0.1mlアリコートを該バ
ッファー1ml当り酵素52単位の濃度で抗体溶液へ添加し
た。最後に、該バッファー0.1mlに溶解したカタラーゼ
（Worthington Biochemical社製）43μｇを反応混合物
に添加した（酸化反応中に生成した過酸化水素を分解す
るためにカタラーゼを添加した）。反応混合物を室温で
48時間インキュベートし、４℃で貯蔵した。図４は未酸
化（ａ）と酸化（ｂ）抗体の励起スペクトルを示す。
5.2.抗体分子への結合のためのトリペプチド−AMCの製
造 本実施例のためには、合成蛍光原化合物を結合相手とし
て用いた。この合成化合物の特性は、蛍光原化合物の結
合状態と遊離状態が分光蛍光計により判別可能であると
いうことである。ここで用いた合成蛍光原化合物はニュ
ーヨーク州ロングアイランド、カーデンシティパークの
Serva Fine Biochemicals社製（カタログ＃51474）であ
る。本化合物はアミド結合を介して蛍光化合物７−アミ
ノ−４−メチルクマリン（AMC）に結合したトリペプチ
ド（Gly−Gly−Arg）から成る。グリシンのアミノ基は
カルボベンゾキシクロライド（Cbz）でブロックされ
る。本化合物（ここではトリペプチド−AMCと記す）の
構造式を下に示す。
造 本実施例のためには、合成蛍光原化合物を結合相手とし
て用いた。この合成化合物の特性は、蛍光原化合物の結
合状態と遊離状態が分光蛍光計により判別可能であると
いうことである。ここで用いた合成蛍光原化合物はニュ
ーヨーク州ロングアイランド、カーデンシティパークの
Serva Fine Biochemicals社製（カタログ＃51474）であ
る。本化合物はアミド結合を介して蛍光化合物７−アミ
ノ−４−メチルクマリン（AMC）に結合したトリペプチ
ド（Gly−Gly−Arg）から成る。グリシンのアミノ基は
カルボベンゾキシクロライド（Cbz）でブロックされ
る。本化合物（ここではトリペプチド−AMCと記す）の
構造式を下に示す。
遊離AMCの最大励起および発光（それぞれ345nm,445nm）
はトリペプチドに結合したAMCのそれとは違っている
（それぞれ325nm,395nm）。これにより蛍光測定アッセ
イを用いてAMC分子の結合型と遊離型とを区別すること
ができる。383nmと455nmの励起および発光波長はアッセ
イのための最適差異を得るために利用することができ
る。これらの波長では、遊離AMCはその最大蛍光の20％
を保有するが、結合AMCの等モル量より500倍多い相対蛍
光を有している〔Zimmerman,et al.,1978,Proc.Natl.Ac
ad,Sci.,U.S.A.75（２）:750−535〕。
はトリペプチドに結合したAMCのそれとは違っている
（それぞれ325nm,395nm）。これにより蛍光測定アッセ
イを用いてAMC分子の結合型と遊離型とを区別すること
ができる。383nmと455nmの励起および発光波長はアッセ
イのための最適差異を得るために利用することができ
る。これらの波長では、遊離AMCはその最大蛍光の20％
を保有するが、結合AMCの等モル量より500倍多い相対蛍
光を有している〔Zimmerman,et al.,1978,Proc.Natl.Ac
ad,Sci.,U.S.A.75（２）:750−535〕。
トリペプチド−AMCを第5.1節で製造した抗体の酸化炭水
化物成分へ特異的に結合させるため、ヒドラジン誘導体
をトリペプチド−AMC化合物の末端グリシンへ結合させ
た。ヒドラジン基の存在は、非常に穏やかな条件下での
抗体分子の酸化炭水化物成分の反応性をもたらす一方
で、抗原結合部位に影響を与えないところから有利であ
る。その結果、抗体分子の酸化炭水化物側鎖のアルデヒ
ド基がヒドラジン誘導体と反応してヒドラゾンを形成す
る。
化物成分へ特異的に結合させるため、ヒドラジン誘導体
をトリペプチド−AMC化合物の末端グリシンへ結合させ
た。ヒドラジン基の存在は、非常に穏やかな条件下での
抗体分子の酸化炭水化物成分の反応性をもたらす一方
で、抗原結合部位に影響を与えないところから有利であ
る。その結果、抗体分子の酸化炭水化物側鎖のアルデヒ
ド基がヒドラジン誘導体と反応してヒドラゾンを形成す
る。
ヒドラジン誘導体（例.4−フルオロフェニルヒドラジ
ン）を結合するには、トリペプチド−AMCをまずCbz基を
取り去ってグリシンアミノ末端基で脱ブロックした。こ
れはトリペプチド−AMCをトリフルオロ酢酸（ミズーリ
州セントルイス、シグマ社製）に溶解し、溶液内にHBr
ガス〔ニュージャージー州イーストラザフォード、マチ
ソン社（Matheson）製〕を45分間通して行った。生成物
H2N−Gly−Gly−Arg−NH−AMCは低温のジエチルエーテ
ル〔ニュージャージー州フィリップスバーグ、ベーター
・ケミカル社（Baker Chemical Co.）製〕を添加して沈
殿させ、無水エタノール〔ペンシルバニア州リンフィー
ルド、パブリッカー・インダストリーズ社（Publicker
Industries Co.）製〕に溶解した。無水エタノール中の
４−フルオロフェニルヒドラジン〔ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Ch
emical Co.）製〕を等モル量撹拌しながら加えた。室温
で２時間遮光した状態でインキュベートした後、反応混
合物を４℃で遮光状態で貯蔵した。その結果得られた生
成物（フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC）は以
下の構造式を有する。
ン）を結合するには、トリペプチド−AMCをまずCbz基を
取り去ってグリシンアミノ末端基で脱ブロックした。こ
れはトリペプチド−AMCをトリフルオロ酢酸（ミズーリ
州セントルイス、シグマ社製）に溶解し、溶液内にHBr
ガス〔ニュージャージー州イーストラザフォード、マチ
ソン社（Matheson）製〕を45分間通して行った。生成物
H2N−Gly−Gly−Arg−NH−AMCは低温のジエチルエーテ
ル〔ニュージャージー州フィリップスバーグ、ベーター
・ケミカル社（Baker Chemical Co.）製〕を添加して沈
殿させ、無水エタノール〔ペンシルバニア州リンフィー
ルド、パブリッカー・インダストリーズ社（Publicker
Industries Co.）製〕に溶解した。無水エタノール中の
４−フルオロフェニルヒドラジン〔ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Ch
emical Co.）製〕を等モル量撹拌しながら加えた。室温
で２時間遮光した状態でインキュベートした後、反応混
合物を４℃で遮光状態で貯蔵した。その結果得られた生
成物（フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC）は以
下の構造式を有する。
本化合物は、紫外線で励起すると蛍光について（＋）で
あり、ヒドラジン基の存在についても（＋）であった。
トリペプチドに結合したヒドラジンは、ヒドラジンの比
色定量測定のため0.1％トリニトロベンゼンスルフォン
酸水溶液をスプレーして薄層クロマトグラフィー（TL
C）により検出した（ピンクがかった、またはオレンジ
がかった茶色がヒドラジンの存在を示す）。TLCの結果
は、トリペプチド−AMCの移動バンドにヒドラジン基の
存在を示した。
あり、ヒドラジン基の存在についても（＋）であった。
トリペプチドに結合したヒドラジンは、ヒドラジンの比
色定量測定のため0.1％トリニトロベンゼンスルフォン
酸水溶液をスプレーして薄層クロマトグラフィー（TL
C）により検出した（ピンクがかった、またはオレンジ
がかった茶色がヒドラジンの存在を示す）。TLCの結果
は、トリペプチド−AMCの移動バンドにヒドラジン基の
存在を示した。
図５に示したフェニヒドラジン−トリペプチド−AMC化
合物の吸収および発光スペクトルはトリペプチド−AMC
スペクトルとの類似性を示すが、トリペプチド−AMCの
共有結合修飾と一致した最大励起および発光のシフトを
示す。フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC化合物
の最大励起および発光は各々345nmと385nmである。生成
物は冷却したジエチレエーテルを用いて溶液から沈殿さ
せ、洗浄して、ジメチルスルホキシド（ニージョージー
州フィリップスバーグ、Baker Chemical社製）に溶解し
た。
合物の吸収および発光スペクトルはトリペプチド−AMC
スペクトルとの類似性を示すが、トリペプチド−AMCの
共有結合修飾と一致した最大励起および発光のシフトを
示す。フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC化合物
の最大励起および発光は各々345nmと385nmである。生成
物は冷却したジエチレエーテルを用いて溶液から沈殿さ
せ、洗浄して、ジメチルスルホキシド（ニージョージー
州フィリップスバーグ、Baker Chemical社製）に溶解し
た。
5.3.フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMCと抗体分
子の酸化炭水化物成分との共有結合 上記第5.1節に記載した酸化モノクローナル抗体調製物
を0.1Mアセテートバッファー（pH5.0）少量を添加してp
H5.1に調製した。抗体溶液へフェニルヒドラジン−トリ
ペプチド−AMC（第5.2節で製造）を約10倍量加えて、こ
れを遮光状態で37℃で一晩インキュベートした（約14時
間）。その後、反応混合物をセファデックスＧ−25カラ
ム（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Fi
ne Chemicals製）でクロマトグラフィーにかけ、末反応
のフェニルヒドラジン−トリペプチド−AMCを取り除い
た。
子の酸化炭水化物成分との共有結合 上記第5.1節に記載した酸化モノクローナル抗体調製物
を0.1Mアセテートバッファー（pH5.0）少量を添加してp
H5.1に調製した。抗体溶液へフェニルヒドラジン−トリ
ペプチド−AMC（第5.2節で製造）を約10倍量加えて、こ
れを遮光状態で37℃で一晩インキュベートした（約14時
間）。その後、反応混合物をセファデックスＧ−25カラ
ム（ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia Fi
ne Chemicals製）でクロマトグラフィーにかけ、末反応
のフェニルヒドラジン−トリペプチド−AMCを取り除い
た。
蛋白分画の分光蛍光測定分析によって、抗体に共有結合
したフェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC（抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMCまたは抗体結
合と以下称する）の存在を確認した。結合体の最大励起
および発光は各々325nmと385nmである（図６）。結合体
の励起スペクトルにおいて285nmで大きいピークが見ら
れたが、これは385nmでの残留蛍光によるトリプトファ
ン吸収によって説明ができ、また抗体分子のアミノ酸ト
リプトファンからAMCへの共鳴エネルギー移動の結果か
も知れない。
したフェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC（抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMCまたは抗体結
合と以下称する）の存在を確認した。結合体の最大励起
および発光は各々325nmと385nmである（図６）。結合体
の励起スペクトルにおいて285nmで大きいピークが見ら
れたが、これは385nmでの残留蛍光によるトリプトファ
ン吸収によって説明ができ、また抗体分子のアミノ酸ト
リプトファンからAMCへの共鳴エネルギー移動の結果か
も知れない。
6.実施例：シリーズII 本シリーズの実施例の目的は、本発明による抗体結合体
の製造法はカルボジイミド反応が抗体の抗原結合特性に
影響を与えるようには抗原結合特性に悪影響を与えない
ことを示すことにある。このため、ホスホリルコリン基
に特異性を有するマウスのモノクローナルIgMの炭水化
物を酸化し、1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAを形成する
エチレンジアミン ジ−（Ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸）〔EDDHA〕の1,6−ジアミノヘキシル誘導体へ共有結
合させた。比較のために、1,6−ジアミノヘキシル−EDD
HAと未修飾EDDHAとをカルボジイミド反応を利用してIgM
モノクローナル抗体の同一サンプルへ結合した。これら
の条件下では、1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAがアスパ
ラギン酸とグルタミン酸残基に結合し、未修飾EDDHAが
リジンに結合するだろう。
の製造法はカルボジイミド反応が抗体の抗原結合特性に
影響を与えるようには抗原結合特性に悪影響を与えない
ことを示すことにある。このため、ホスホリルコリン基
に特異性を有するマウスのモノクローナルIgMの炭水化
物を酸化し、1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAを形成する
エチレンジアミン ジ−（Ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸）〔EDDHA〕の1,6−ジアミノヘキシル誘導体へ共有結
合させた。比較のために、1,6−ジアミノヘキシル−EDD
HAと未修飾EDDHAとをカルボジイミド反応を利用してIgM
モノクローナル抗体の同一サンプルへ結合した。これら
の条件下では、1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAがアスパ
ラギン酸とグルタミン酸残基に結合し、未修飾EDDHAが
リジンに結合するだろう。
これらのサンプルの結合特性を天然抗体と比較して親和
性と均質製を評価した。
性と均質製を評価した。
6.1.マウスモノクローナルIgMの酸化 リガンドのホスホリルコリンに対する特異性を有するマ
ウスモノクローナルIgM抗体を食塩加燐酸バッファー（P
BS,0.01M燐酸,0.15M塩化ナトリウム）pH7.0中で2mg/ml
の濃度で酸化した。抗体含有溶液を氷水浴で冷却し、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウム56.8μｇ（1.42mg/ml溶液を40
μl:最終過ヨウ素塩濃度＝0.26mM）を添加した。この反
応混合物を１時間インキュベートした後、エチレングリ
コール２μｌを加えた。これを更に30分間インキュベー
トした。それからサンプルPBSで平衡化したセファデッ
クスＧ−25カラムを通し、蛋白分画をプールした。
ウスモノクローナルIgM抗体を食塩加燐酸バッファー（P
BS,0.01M燐酸,0.15M塩化ナトリウム）pH7.0中で2mg/ml
の濃度で酸化した。抗体含有溶液を氷水浴で冷却し、メ
タ過ヨウ素酸ナトリウム56.8μｇ（1.42mg/ml溶液を40
μl:最終過ヨウ素塩濃度＝0.26mM）を添加した。この反
応混合物を１時間インキュベートした後、エチレングリ
コール２μｌを加えた。これを更に30分間インキュベー
トした。それからサンプルPBSで平衡化したセファデッ
クスＧ−25カラムを通し、蛋白分画をプールした。
6.2.リンカーとEDDHAの結合 EDDHA（1.5g,4.2mmole）およびトリエチルアミン（1.2m
l,8.4mmole）を水40mlと混合した。この不均質な溶液を
60℃に加熱し、0.5時間激しく撹拌した。溶液を真空乾
燥し、無水N,N−ジメチルホルムアミド400mlに溶解し
た。それから溶液を氷浴の中で冷却し、インブチルクロ
ロホルメート（0.56ml,4.2mmole）を加えた。反応混合
物を冷却しながら0.5時間撹拌した。その結果生じたト
リエチルアミン塩酸塩析出物を濾過して取り除いた。ED
DHAの混合カルボキシ炭酸無水物を含む濾液は赤色をし
ていた。
l,8.4mmole）を水40mlと混合した。この不均質な溶液を
60℃に加熱し、0.5時間激しく撹拌した。溶液を真空乾
燥し、無水N,N−ジメチルホルムアミド400mlに溶解し
た。それから溶液を氷浴の中で冷却し、インブチルクロ
ロホルメート（0.56ml,4.2mmole）を加えた。反応混合
物を冷却しながら0.5時間撹拌した。その結果生じたト
リエチルアミン塩酸塩析出物を濾過して取り除いた。ED
DHAの混合カルボキシ炭酸無水物を含む濾液は赤色をし
ていた。
１−アミノ−６−トリフルオロアセトアミドヘキサン
（0.8g,4.1ミリモル）を上記EDDHAのカルボキシ炭酸無
水物に加えた。均質溶液を0.5時間４℃で撹拌し、凍結
乾燥して油状生成物を得た。油状物をアセトン／エーテ
ル（4:1）混合物で洗って、黄色の粗生生物を得た。固
体の１−アミノ−６−トリフルオロアセトアミドヘキシ
ル−EDDHAを採取して、７％K2CO3で加水分解し、pH4でH
Clで再析出させて、純粋な1,6−ジアミノヘキシル−EDD
HA（1.4g）を得た。この化合物は、ニンヒドリンテスト
では陽性で、薄膜クロマトグラフィーでは１スポットの
みを示す。等モル量のTbCl3塩基性溶液の存在下では295
nmでの励起は545nmでの発光をもたらしたが、これはEDD
HAとテルビウムイオンとの特徴的なエネルギーを転移キ
レート複合体の形成による。
（0.8g,4.1ミリモル）を上記EDDHAのカルボキシ炭酸無
水物に加えた。均質溶液を0.5時間４℃で撹拌し、凍結
乾燥して油状生成物を得た。油状物をアセトン／エーテ
ル（4:1）混合物で洗って、黄色の粗生生物を得た。固
体の１−アミノ−６−トリフルオロアセトアミドヘキシ
ル−EDDHAを採取して、７％K2CO3で加水分解し、pH4でH
Clで再析出させて、純粋な1,6−ジアミノヘキシル−EDD
HA（1.4g）を得た。この化合物は、ニンヒドリンテスト
では陽性で、薄膜クロマトグラフィーでは１スポットの
みを示す。等モル量のTbCl3塩基性溶液の存在下では295
nmでの励起は545nmでの発光をもたらしたが、これはEDD
HAとテルビウムイオンとの特徴的なエネルギーを転移キ
レート複合体の形成による。
6.3.IgM−リンカー−EDDHA結合体の製造 第6.1節の方法で酸化した抗体に第6.2節の方法で製造し
た1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAを約270倍過剰モル加
え、室温で１時間インキュベートした。これに引続い
て、固体のナトリウムシアノボロハイドライドを加えて
最終濃度を10mMとし、それから更に室温で４時間インキ
ュベートした。混合物を４℃でPBSを何度か変えて透析
し、限外濾過して濃縮した。
た1,6−ジアミノヘキシル−EDDHAを約270倍過剰モル加
え、室温で１時間インキュベートした。これに引続い
て、固体のナトリウムシアノボロハイドライドを加えて
最終濃度を10mMとし、それから更に室温で４時間インキ
ュベートした。混合物を４℃でPBSを何度か変えて透析
し、限外濾過して濃縮した。
6.4.リンカー−EDDHAのIgMへのカルボジイミド結合 IgM抗体（1.9mg/ml）263μｌに１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg/m
l溶液の1ml、pH5.0）とPBS（pH5.0）を添加して2.5mlと
した。混合物を室温で２時間インキュベートした。水2.
5ml（pH5.5）中に0.1M 1,6−ジアミノヘキシル−EDDHA
を275μｌ加えて、溶液を室温で２時間インキュベート
した。ここへ1Mエタノールアミン10μｌを加えて、室温
で１時間インキュベートした。これをPBS（pH7.0）で一
晩透析した。
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg/m
l溶液の1ml、pH5.0）とPBS（pH5.0）を添加して2.5mlと
した。混合物を室温で２時間インキュベートした。水2.
5ml（pH5.5）中に0.1M 1,6−ジアミノヘキシル−EDDHA
を275μｌ加えて、溶液を室温で２時間インキュベート
した。ここへ1Mエタノールアミン10μｌを加えて、室温
で１時間インキュベートした。これをPBS（pH7.0）で一
晩透析した。
6.5.EDDHAのIgMへのカルボジイミド結合 IgM抗体（1.9mg/ml）263μｌへ１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg/m
l溶液を1ml、pH5.0）とPBS（pH5.0）を添加して2.5mlと
した。混合物を室温で２時間インキュベートした。これ
に0.01M EDDHA（pH5.5）を2.75ml添加し、溶液を２時間
インキュベートした。1Mエタノールアミン10μｌを添加
し、混合物を室温で１時間インキュベートした。これを
PBS（pH7.0）で一晩透析した。
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド10mg（10mg/m
l溶液を1ml、pH5.0）とPBS（pH5.0）を添加して2.5mlと
した。混合物を室温で２時間インキュベートした。これ
に0.01M EDDHA（pH5.5）を2.75ml添加し、溶液を２時間
インキュベートした。1Mエタノールアミン10μｌを添加
し、混合物を室温で１時間インキュベートした。これを
PBS（pH7.0）で一晩透析した。
6.6.抗体の炭水化物により媒介される結合の効果 未修飾のマウスモノクローナル抗体と第6.3節，第6.4
節，第6.5節により製造した抗体結合体（全てホスホリ
ルコリン基に特異性を有する）の親和性をパーキン・エ
ルマー型512ダブルビーム蛍光分光計（コネチカット州
ノーウォーク、Perkin−Elmer社製）を用いて蛍光消光
により測定した。励起および発光波長は各々295nmと345
nmであり、温度はラウダ（Lauda）Ｋ−2/R循環水浴（Br
inkmann Instruments社製）で25℃とした。
節，第6.5節により製造した抗体結合体（全てホスホリ
ルコリン基に特異性を有する）の親和性をパーキン・エ
ルマー型512ダブルビーム蛍光分光計（コネチカット州
ノーウォーク、Perkin−Elmer社製）を用いて蛍光消光
により測定した。励起および発光波長は各々295nmと345
nmであり、温度はラウダ（Lauda）Ｋ−2/R循環水浴（Br
inkmann Instruments社製）で25℃とした。
抗体濃度の計算はε280 1 ％＝13.5を用いて行い、7.5×1
0-8から9.7×10-8Mであった。結合部位はすべて活性を
有すると見なした。サンプル量は3.0mlであった。リガ
ンドであるＮ−（2,4−ジニトロフェニル）−ｐ−アミ
ノフェニルホスホリルコリン（DPPC）の原液濃度は1.17
×10-4Mであった。滴定は食塩加リン酸バッファー中pH
7.4で行った。リガンドを撹拌しながら連続的に、モー
ター駆動シリンジを使って9.01μl/分の速度で加え、蛍
光度を2040デュアルドライブフロッピーディスクと2023
プリンターを備えたCBM2001シリーズコンピュータ（Com
modore Buisness Machines）にアナログ／デジタル変換
用プレセットＩ（Connecticut Microcomputers）をイン
ターフェースとしてモニターした。減衰およびサンプル
の希釈を修正するため、非特異的なヒトワルデンシュト
レーム・マクログロブリンまたは抗ラクトースネズミハ
イブリドーマ抗体〔Mandal and Karush,1981,J.Jmmuno
l.127:1240〕を滴定した。合計180μｌのリガンド溶液
を滴定ごとに添加した。結合パラメータの計算には、シ
ップスの分布関数〔Sips,1948,J.Chem.Phys.16:490〕を
反復して用い、抗体異性度指数（heterogeneity inde
x）が１の0.002以内となるまで最大消光（maximum quen
ch）を変化させた。
0-8から9.7×10-8Mであった。結合部位はすべて活性を
有すると見なした。サンプル量は3.0mlであった。リガ
ンドであるＮ−（2,4−ジニトロフェニル）−ｐ−アミ
ノフェニルホスホリルコリン（DPPC）の原液濃度は1.17
×10-4Mであった。滴定は食塩加リン酸バッファー中pH
7.4で行った。リガンドを撹拌しながら連続的に、モー
ター駆動シリンジを使って9.01μl/分の速度で加え、蛍
光度を2040デュアルドライブフロッピーディスクと2023
プリンターを備えたCBM2001シリーズコンピュータ（Com
modore Buisness Machines）にアナログ／デジタル変換
用プレセットＩ（Connecticut Microcomputers）をイン
ターフェースとしてモニターした。減衰およびサンプル
の希釈を修正するため、非特異的なヒトワルデンシュト
レーム・マクログロブリンまたは抗ラクトースネズミハ
イブリドーマ抗体〔Mandal and Karush,1981,J.Jmmuno
l.127:1240〕を滴定した。合計180μｌのリガンド溶液
を滴定ごとに添加した。結合パラメータの計算には、シ
ップスの分布関数〔Sips,1948,J.Chem.Phys.16:490〕を
反復して用い、抗体異性度指数（heterogeneity inde
x）が１の0.002以内となるまで最大消光（maximum quen
ch）を変化させた。
Qmax値の計算はかなり不確実であって、多分10％如何で
はないと思われるが、これはこの値を得るために用いた
反復法のためである。この不確実性は、活性部位の実際
の濃度と光学密度から計算した濃度との間の違いが、抗
体異性度指数１という基準を用いた場合に、Qmaxの指導
値において補償される事実がら生じる。この補償は結合
リガンドの濃度が抗体濃度とQmaxの値の比に依存してい
るところから生じるものである。こうした依存という事
実の故に、会合定数が得られた値の精度は活性部位の濃
度によって限定されない。
はないと思われるが、これはこの値を得るために用いた
反復法のためである。この不確実性は、活性部位の実際
の濃度と光学密度から計算した濃度との間の違いが、抗
体異性度指数１という基準を用いた場合に、Qmaxの指導
値において補償される事実がら生じる。この補償は結合
リガンドの濃度が抗体濃度とQmaxの値の比に依存してい
るところから生じるものである。こうした依存という事
実の故に、会合定数が得られた値の精度は活性部位の濃
度によって限定されない。
図７に未修飾抗体とカルボジイミド結合体と本発明の抗
体結合体のデータを示すシップスグラフを示す。結合測
定は明らかに、未修正抗体（・−・）と比較した時の、
本発明の炭水化物結合方法を介して修飾したサンプル
（Δ−Δ）の特異性、親和性、均質性の保持を示してい
る。ホスホリルコリン誘導体の結合について会合定数を
測定したところ未修飾抗体は8.1×105M-1であり、炭水
化物抗体結合体は1.1×10-6M-1であった。これと対照的
に、カルボジイミド反応による修飾をうけた抗体調製物
（□−□）は大幅に結合が減少しており、計算値である
１−２×105よりもずっと低い。シップス解析における
抗体異性度指数１の仮定は、サンプルが均質（モノクロ
ーナル）である場合にのみデータ換算に有効である。サ
ンプルの実際の均質性（モノクローナル性についてのチ
ェックは相関係数であるか、または実験データがシップ
スプロットの計算線と一致する場合に適合する。図７の
グラフを見ると、未修飾抗体と炭水化物結合抗体につい
ては良く一致しており、カルボジイミド結合のものにつ
いてはあまり一致していないことがわかる。これは多分
カルボジイミド結合方法の選択性の欠如のためであろ
う。リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸は抗原結合
領域を含む抗体分子全ての部分に存在する。その結果、
抗体の少なくともいくつかは結合部位でまたはその近く
で修飾され、その結果抗原との相互作用に影響を与え
る。しかしながら、炭水化物への結合部位は特定的であ
り、結合部位から離れているので、これらの実験でみら
れる結合能力には変化が殆んどみられない。溶液中の共
有修飾抗体について得られたものではあるが、本研究の
結論は固定化抗体にも応用できると考えられる（固定化
抗体を使った同一実験は技術上の理由から実施不能であ
る）。通常用いられる結合化学（臭化シアン活性化ゲ
ル、グルタルアルデヒドビーズ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルゲル等）の不規則性では、本発明の部
位特異的結合とくらべて結合能力の劣ったマトリックス
を生成するはずである。
体結合体のデータを示すシップスグラフを示す。結合測
定は明らかに、未修正抗体（・−・）と比較した時の、
本発明の炭水化物結合方法を介して修飾したサンプル
（Δ−Δ）の特異性、親和性、均質性の保持を示してい
る。ホスホリルコリン誘導体の結合について会合定数を
測定したところ未修飾抗体は8.1×105M-1であり、炭水
化物抗体結合体は1.1×10-6M-1であった。これと対照的
に、カルボジイミド反応による修飾をうけた抗体調製物
（□−□）は大幅に結合が減少しており、計算値である
１−２×105よりもずっと低い。シップス解析における
抗体異性度指数１の仮定は、サンプルが均質（モノクロ
ーナル）である場合にのみデータ換算に有効である。サ
ンプルの実際の均質性（モノクローナル性についてのチ
ェックは相関係数であるか、または実験データがシップ
スプロットの計算線と一致する場合に適合する。図７の
グラフを見ると、未修飾抗体と炭水化物結合抗体につい
ては良く一致しており、カルボジイミド結合のものにつ
いてはあまり一致していないことがわかる。これは多分
カルボジイミド結合方法の選択性の欠如のためであろ
う。リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸は抗原結合
領域を含む抗体分子全ての部分に存在する。その結果、
抗体の少なくともいくつかは結合部位でまたはその近く
で修飾され、その結果抗原との相互作用に影響を与え
る。しかしながら、炭水化物への結合部位は特定的であ
り、結合部位から離れているので、これらの実験でみら
れる結合能力には変化が殆んどみられない。溶液中の共
有修飾抗体について得られたものではあるが、本研究の
結論は固定化抗体にも応用できると考えられる（固定化
抗体を使った同一実験は技術上の理由から実施不能であ
る）。通常用いられる結合化学（臭化シアン活性化ゲ
ル、グルタルアルデヒドビーズ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルゲル等）の不規則性では、本発明の部
位特異的結合とくらべて結合能力の劣ったマトリックス
を生成するはずである。
7.実施例：シリーズIII 本実施例シリーズの目的は、抗体がその炭水化物成分を
介して効率良く不溶性の担体に結合され、かつ結合体が
特異的抗原結合能を保有する証拠を提供することにあ
る。
介して効率良く不溶性の担体に結合され、かつ結合体が
特異的抗原結合能を保有する証拠を提供することにあ
る。
7.1.アミノヘキシル−セファロースへの抗体結合 第6.1項に記載の過ヨウ素塩酸を用いてIgMとIgG抗体を
酸化したが、但し反応を停止するためエチレングリコー
ルの代わりにセファロースCL−4B（ニュージャージー州
ニューマーケット、Pharmacia Fine Chemicals社製）を
用いた。セファロースCL−4Bを除去したのち、抗体をア
ミノヘキシル−セファロースCL−4B（Pharmacia Fine C
hemicals社製）へ添加し、温度で30分間撹拌した。ナト
リウムシアノボロハイドライドを最終濃度5mMとなるよ
うに添加し、混合物を16時間撹拌した。その結果得た抗
体結合樹脂（Ab−CHO−SEPH）をPBSでよく洗った。アミ
ノヘキシルーセファロースへ結合した抗体の量は125I−
IgGと125I−IgM抗体を用いて測定した。表４は抗体の炭
水化物成分を介した抗体の固定化が非常に高能率でおこ
ることを示す。
酸化したが、但し反応を停止するためエチレングリコー
ルの代わりにセファロースCL−4B（ニュージャージー州
ニューマーケット、Pharmacia Fine Chemicals社製）を
用いた。セファロースCL−4Bを除去したのち、抗体をア
ミノヘキシル−セファロースCL−4B（Pharmacia Fine C
hemicals社製）へ添加し、温度で30分間撹拌した。ナト
リウムシアノボロハイドライドを最終濃度5mMとなるよ
うに添加し、混合物を16時間撹拌した。その結果得た抗
体結合樹脂（Ab−CHO−SEPH）をPBSでよく洗った。アミ
ノヘキシルーセファロースへ結合した抗体の量は125I−
IgGと125I−IgM抗体を用いて測定した。表４は抗体の炭
水化物成分を介した抗体の固定化が非常に高能率でおこ
ることを示す。
7.2.分離 2,4−ジニトロフェニル（DNP）ハプテン基に対するマウ
スのモノクローナルIgG抗体を酸化して第7.1項にその概
略を記した方法によりアミノヘキシル−セファロースへ
結合させた（Ab−CHO−SEPH）。抗体はクアトレカサス
（Cuatrecasas）らの方法〔19 68,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.61:636〕により臭化シアンで活性化したセフ
ァロースへも結合させた。
スのモノクローナルIgG抗体を酸化して第7.1項にその概
略を記した方法によりアミノヘキシル−セファロースへ
結合させた（Ab−CHO−SEPH）。抗体はクアトレカサス
（Cuatrecasas）らの方法〔19 68,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.61:636〕により臭化シアンで活性化したセフ
ァロースへも結合させた。
DNP基と結合したリボヌクレアーゼ（DNP−RNase）は2,4
−ジニトロフルオロベンゼン（ウィスコンシン州ミルウ
ォーキー州のアルドリッチケミカル社製）とリボヌクレ
アーゼ（ミズーリ州セント・ルイスのシグマ社製）を等
モル量ずつ、0.1M炭酸塩バッファーpH9.0中で、４時間
室温で混合して製造した。PSBに対して十分に透析した
後、DNP−RNaseを測定し、その結果、リボヌクレアーゼ
１モル当りNDP基は平均0.8モルであることが明らかとな
った。DNP−RNaseはクロラミン−Ｔ（Aldrich Chemical
社製）を用いて125Iで標識をつけた。
−ジニトロフルオロベンゼン（ウィスコンシン州ミルウ
ォーキー州のアルドリッチケミカル社製）とリボヌクレ
アーゼ（ミズーリ州セント・ルイスのシグマ社製）を等
モル量ずつ、0.1M炭酸塩バッファーpH9.0中で、４時間
室温で混合して製造した。PSBに対して十分に透析した
後、DNP−RNaseを測定し、その結果、リボヌクレアーゼ
１モル当りNDP基は平均0.8モルであることが明らかとな
った。DNP−RNaseはクロラミン−Ｔ（Aldrich Chemical
社製）を用いて125Iで標識をつけた。
二つの固定化された抗DNP抗体樹脂、Ab−CHO−SEPHとAb
−CNBr−SEPHについて、125I−DNP−RNaseの結合能をテ
ストした。3Mチオシアン酸ナトリウムがどちらかの抗体
調製物からも結合DNP−RNaseを放出できないという事実
からも明らかなように、二つの抗体調製物はDNP−RNase
に対して非常に高度の結合親和性を有していた。従っ
て、抗原結合を可逆的にできるようこのシステムを改良
するため、実験を4M尿素の存在化で行なった。表５のデ
ータは、炭水化物結合により固定化された抗体（Ab−CH
O−SEPH）がリジン残基で固定化された同じ抗体（Ab−C
NBr−SEPH）よりも効率よくDNP−RNaseと結合すること
を示している。
−CNBr−SEPHについて、125I−DNP−RNaseの結合能をテ
ストした。3Mチオシアン酸ナトリウムがどちらかの抗体
調製物からも結合DNP−RNaseを放出できないという事実
からも明らかなように、二つの抗体調製物はDNP−RNase
に対して非常に高度の結合親和性を有していた。従っ
て、抗原結合を可逆的にできるようこのシステムを改良
するため、実験を4M尿素の存在化で行なった。表５のデ
ータは、炭水化物結合により固定化された抗体（Ab−CH
O−SEPH）がリジン残基で固定化された同じ抗体（Ab−C
NBr−SEPH）よりも効率よくDNP−RNaseと結合すること
を示している。
8.実施例：シリーズIV 以下の実施例は、アミドまたはエステル結合を介して対
象の化合物（化合物と称する）へ結合させたペプチドの
抗体分子への特異的結合の方法を示すものである。生成
した抗体結合体は溶血補体結合アッセイから明らかなよ
うに補体結合能を保有している。
象の化合物（化合物と称する）へ結合させたペプチドの
抗体分子への特異的結合の方法を示すものである。生成
した抗体結合体は溶血補体結合アッセイから明らかなよ
うに補体結合能を保有している。
更に、補体系による酵素開裂を介して抗原細胞表面で化
合物が特異的に放出されることが非溶血アッセイにより
実証される。
合物が特異的に放出されることが非溶血アッセイにより
実証される。
以下の実施例では、化合物は蛍光原物質である。従っ
て、蛍光化合物の補体を媒体とする放出は、蛍光分子の
結合した形と遊離した形を区分することができるアッセ
イによって検出できる。
て、蛍光化合物の補体を媒体とする放出は、蛍光分子の
結合した形と遊離した形を区分することができるアッセ
イによって検出できる。
第5.1節の材料と方法を用いてモノクローナル抗体（No.
171）の炭水化物成分を酸化した。
171）の炭水化物成分を酸化した。
ヒツジの赤血球細胞と血清補体の存在下では、これらの
モノクローナル抗体（No.171）は補体酵素カスケード反
応を活性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体の結合
はヒツジ赤血球細胞の溶解を生じせしめ、その結果ヘモ
グロビンが放出される。放出させたヘモグロビンは分光
光度計で検出でき、補体結合アッセイを可能とする。
モノクローナル抗体（No.171）は補体酵素カスケード反
応を活性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体の結合
はヒツジ赤血球細胞の溶解を生じせしめ、その結果ヘモ
グロビンが放出される。放出させたヘモグロビンは分光
光度計で検出でき、補体結合アッセイを可能とする。
トリペプチド−AMCは第5.2節で記載したように製造し
た。蛍光原化合物（AMC）の特性により、その化合物の
結合した形と遊離した形が分光光度計で識別可能とな
る。これにより抗体結合体の補体結合能を測定するため
の明確なアッセイを提供する。更に重要なことは、その
後の化合物の補体媒体放出の定量手段を提供することで
ある。
た。蛍光原化合物（AMC）の特性により、その化合物の
結合した形と遊離した形が分光光度計で識別可能とな
る。これにより抗体結合体の補体結合能を測定するため
の明確なアッセイを提供する。更に重要なことは、その
後の化合物の補体媒体放出の定量手段を提供することで
ある。
抗体の酸化炭水化物成分へのフェニルヒドラジン−トリ
ペプチド−AMCの特異的共有結合は第5.3節に記載の方法
により行った。
ペプチド−AMCの特異的共有結合は第5.3節に記載の方法
により行った。
8.1.補体結合アッセイ 補体結合アッセイの二つのタイプ、溶血タイプと蛍光分
析タイプを利用した。これらのアッセイにより、抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC結合体が補体
結合能を保持しているか否か、AMCが補体により開裂さ
れたか否かを判定する。
析タイプを利用した。これらのアッセイにより、抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC結合体が補体
結合能を保持しているか否か、AMCが補体により開裂さ
れたか否かを判定する。
8.1.1.ヒト補体の調製 ヒトの新鮮な全血10mlを17時間氷冷し、凝固させた。凝
固物は遠心分離により取り除き、その結果得られたヒト
の血清を0.5mlアリコートとして凍結させた。第8.1.2節
に記載した溶血アッセイにより、これらのサンプル中の
ヒト補体は活性を有していることが明らかとなった。
固物は遠心分離により取り除き、その結果得られたヒト
の血清を0.5mlアリコートとして凍結させた。第8.1.2節
に記載した溶血アッセイにより、これらのサンプル中の
ヒト補体は活性を有していることが明らかとなった。
8.1.2.補体結合のための溶血アッセイ 濃度が約２×108細胞/mlであるヒツジ赤血球細胞懸濁液
（ウィスコンシン州マディソン、Gibco Diagnostics
製）の200μｌアリコートを第5.3節で製造した抗体結合
体混合物（タンパク質約２μｇ）20μｌと混合した。撹
拌しながら37℃で15分間インキュベーションを行なって
後、ヒトの血清補体（第8.1.1節で製造）100μｌを混合
物へ添加した。37℃で30分から１時間インキュベートし
た後、混合物を遠心分離にかけ、細胞をペレット状にし
た。補体により媒介される細胞溶解の程度は、上澄み液
中へ放出されたヘモグロビンを分光光度計（412nm）で
測定して調べた。
（ウィスコンシン州マディソン、Gibco Diagnostics
製）の200μｌアリコートを第5.3節で製造した抗体結合
体混合物（タンパク質約２μｇ）20μｌと混合した。撹
拌しながら37℃で15分間インキュベーションを行なって
後、ヒトの血清補体（第8.1.1節で製造）100μｌを混合
物へ添加した。37℃で30分から１時間インキュベートし
た後、混合物を遠心分離にかけ、細胞をペレット状にし
た。補体により媒介される細胞溶解の程度は、上澄み液
中へ放出されたヘモグロビンを分光光度計（412nm）で
測定して調べた。
本アッセイの結果により、完全な溶血と抗体の細胞表面
へのほぼ100％の結合が明らかとなった。例えば、ヒツ
ジ赤血球細胞懸濁液200μｌを遠心分離にかけて得たペ
レットに蒸留水を添加すると細胞は完全に溶解し、ヘモ
グロビンを放出する。蒸留水で完全に溶解したヒツジ赤
血球細胞の上澄み液を1:20で希釈したものは、O.D.412
が0.646であった。結合体と補体を添加して溶解したヒ
ツジ赤血球細胞の同じ希釈物のO.D.412は0.672であっ
た。
へのほぼ100％の結合が明らかとなった。例えば、ヒツ
ジ赤血球細胞懸濁液200μｌを遠心分離にかけて得たペ
レットに蒸留水を添加すると細胞は完全に溶解し、ヘモ
グロビンを放出する。蒸留水で完全に溶解したヒツジ赤
血球細胞の上澄み液を1:20で希釈したものは、O.D.412
が0.646であった。結合体と補体を添加して溶解したヒ
ツジ赤血球細胞の同じ希釈物のO.D.412は0.672であっ
た。
すなわち、結合体は抗原結合能と補体結合能を保持して
いた。
いた。
8.1.3.AMCの補体媒介放出の非溶血アッセイ 非溶血アッセイの条件は上記と同じであるが、通常のヒ
ツジ赤血球細胞の代わりにグルタルアルデヒドで固定し
たヒツジ赤血球細胞（ミズーリ州セントルイス、Sigma
社製）を用いた。グルタルアルデヒドで固定した細胞は
抗体と補体の存在下では溶解せず、したがって、ヘモグ
ロビンは放出されない。その代わりに蛍光分析アッセイ
を用いてAMCの放出を検出する。蛍光分析アッセイでは
非溶血システムが必要であり、これはヘモグロビンの存
在が本システムの蛍光測定を干渉するからである。アッ
セイに用いる前に、これらの固定赤血球細胞は未修飾抗
体と、第5.3節で製造した抗体−フェニルヒドラジン−
トリペプチド−AMCの両方に結合することがわかった。
ツジ赤血球細胞の代わりにグルタルアルデヒドで固定し
たヒツジ赤血球細胞（ミズーリ州セントルイス、Sigma
社製）を用いた。グルタルアルデヒドで固定した細胞は
抗体と補体の存在下では溶解せず、したがって、ヘモグ
ロビンは放出されない。その代わりに蛍光分析アッセイ
を用いてAMCの放出を検出する。蛍光分析アッセイでは
非溶血システムが必要であり、これはヘモグロビンの存
在が本システムの蛍光測定を干渉するからである。アッ
セイに用いる前に、これらの固定赤血球細胞は未修飾抗
体と、第5.3節で製造した抗体−フェニルヒドラジン−
トリペプチド−AMCの両方に結合することがわかった。
非溶血アッセイを用いて、抗体結合体からのAMCの特異
的補体媒介放出を明らかにした。溶血アッセイの場合と
同じく、濃度が約２×108細胞/mlのグルタルアルデヒド
で固定したヒツジ赤血球細胞200μｌを抗体−フェニル
ヒドラジン−トリペプチド−AMC結合体と共に37℃で15
分間インキュベートした。
的補体媒介放出を明らかにした。溶血アッセイの場合と
同じく、濃度が約２×108細胞/mlのグルタルアルデヒド
で固定したヒツジ赤血球細胞200μｌを抗体−フェニル
ヒドラジン−トリペプチド−AMC結合体と共に37℃で15
分間インキュベートした。
遠心分離してバッファーに再懸濁した後、ヒト補体調製
物（第8.1.1節）を50μｌ添加し、460nmでの蛍光をモニ
ターし、380nmでの励起を時間の関数とした〔Caporale
et al.,1981,J.Immunol,128.1963−65〕。コントロール
として、結合体をヒツジ赤血球細胞とのみ；ラット赤血
球細胞とヒト補体の存在下で（用いたモノクローナル抗
体はラット赤血球細胞と結合しない）；およびヒツジ赤
血球細胞と補体の両方の不在下で（用いたモノクローナ
ル抗体はラット赤血球細胞と結合しない）各々インキュ
ベートした。図８にこれらの実験の結果を示す。グリタ
ルアルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト補体と
共にインキュベートした結合体を表わす曲線（ａ）をコ
ントロールを表わす曲線（ｂ），（ｃ），（ｄ）と比較
すると、特異的抗体標的とヒト補体を含むサンプルにお
ける遊離AMCの放出が明瞭である。従って、グルタルア
ルデヒドで固定したラット赤血球細胞とヒト補体とイン
キュベートした結合体を表わす曲線（ｂ）と、グルタル
アルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とインキュベー
トした結合体を表わす曲線（ｃ）と、結合体のみを表わ
す曲線（ｄ）はAMCの放出がないことを示している。
物（第8.1.1節）を50μｌ添加し、460nmでの蛍光をモニ
ターし、380nmでの励起を時間の関数とした〔Caporale
et al.,1981,J.Immunol,128.1963−65〕。コントロール
として、結合体をヒツジ赤血球細胞とのみ；ラット赤血
球細胞とヒト補体の存在下で（用いたモノクローナル抗
体はラット赤血球細胞と結合しない）；およびヒツジ赤
血球細胞と補体の両方の不在下で（用いたモノクローナ
ル抗体はラット赤血球細胞と結合しない）各々インキュ
ベートした。図８にこれらの実験の結果を示す。グリタ
ルアルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト補体と
共にインキュベートした結合体を表わす曲線（ａ）をコ
ントロールを表わす曲線（ｂ），（ｃ），（ｄ）と比較
すると、特異的抗体標的とヒト補体を含むサンプルにお
ける遊離AMCの放出が明瞭である。従って、グルタルア
ルデヒドで固定したラット赤血球細胞とヒト補体とイン
キュベートした結合体を表わす曲線（ｂ）と、グルタル
アルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とインキュベー
トした結合体を表わす曲線（ｃ）と、結合体のみを表わ
す曲線（ｄ）はAMCの放出がないことを示している。
本出願に記載し、クレームした本発明は、上記に開示し
た特定の実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。これらの実施例は本発明のいくつかの面を例示する
ためのものであり、これらと均等の他の実施例もすべて
本発明の範囲内にあるものである。ここに示し、説明し
たもの以外の本発明の様々な変更は、当該分野の技術者
にとって自明であろう。かかる変更は同時に添付の特許
請求の範囲内に含まれるものである。
た特定の実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。これらの実施例は本発明のいくつかの面を例示する
ためのものであり、これらと均等の他の実施例もすべて
本発明の範囲内にあるものである。ここに示し、説明し
たもの以外の本発明の様々な変更は、当該分野の技術者
にとって自明であろう。かかる変更は同時に添付の特許
請求の範囲内に含まれるものである。
第１（ａ），（ｂ）は抗体分子、即ちIgGクラス（ａ）
とIgMクラス（ｂ）の免疫グロブリンを示す概略図であ
る。 図２は古典的経路により活性化された補体カスケードの
一部を表す。C1からC9は補体タンパク質を示す。数字の
上の横線は活性化酵素を示す。Ｓ′は細胞膜上の部位を
示す。 図３は抗新生物剤アルケラン（Alkeran;バローズ−ウェ
ルカム社製）のペプチドCBz−gly−gly−argへの結合の
ための一般反応式を示す。 図４（ａ）は非酸化抗体の励起スペクトル図を示し、図
４（ｂ）は第5.1節に従って酸化した抗体の励起スペク
トル図を示す。 図５は第5.2節により製造したフェニルヒドラジン−ト
リペプチド−AMC化合物の励起および発光スペクトルを
示す。 ６図は第5.3節により製造した抗体−フェニルヒドラジ
ン−トリペプチド−AMC（APTA）結合体の励起および発
光スペクトルを示す。 図７は、修飾を加えない抗体（・−・）、本発明方法に
より修飾を加えた（Δ−Δ）、アスパラギン酸および／
またはグルタミン酸の結合（カルボイミド）により修飾
した抗体（□−□）を用いた蛍光消光データのシップス
プロット（Sips plot）を示す。 図８は、いくつかのコントロールと共にAMCの特異的補
体媒介放出を示す実験結果を表す。蛍光を460nmでモニ
ターし、380nmで励起している。蛍光の増加は、抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC（APTA）結合
体からのAMCの放出を示す。（ａ）はグルタルアルデヒ
ドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト補体と共にインキ
ュベートしたAPTA結合体を示す。（ｂ）はグルタルアル
デヒドで固定したラット赤血球細胞とヒト補体と共にイ
ンキュベートしたAPTA結合体を示す。（ｃ）はグルタル
アルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞と共にインキュ
ベートしたAPTA結合体を示し、（ｄ）はAPTA結合体のみ
を示す。
とIgMクラス（ｂ）の免疫グロブリンを示す概略図であ
る。 図２は古典的経路により活性化された補体カスケードの
一部を表す。C1からC9は補体タンパク質を示す。数字の
上の横線は活性化酵素を示す。Ｓ′は細胞膜上の部位を
示す。 図３は抗新生物剤アルケラン（Alkeran;バローズ−ウェ
ルカム社製）のペプチドCBz−gly−gly−argへの結合の
ための一般反応式を示す。 図４（ａ）は非酸化抗体の励起スペクトル図を示し、図
４（ｂ）は第5.1節に従って酸化した抗体の励起スペク
トル図を示す。 図５は第5.2節により製造したフェニルヒドラジン−ト
リペプチド−AMC化合物の励起および発光スペクトルを
示す。 ６図は第5.3節により製造した抗体−フェニルヒドラジ
ン−トリペプチド−AMC（APTA）結合体の励起および発
光スペクトルを示す。 図７は、修飾を加えない抗体（・−・）、本発明方法に
より修飾を加えた（Δ−Δ）、アスパラギン酸および／
またはグルタミン酸の結合（カルボイミド）により修飾
した抗体（□−□）を用いた蛍光消光データのシップス
プロット（Sips plot）を示す。 図８は、いくつかのコントロールと共にAMCの特異的補
体媒介放出を示す実験結果を表す。蛍光を460nmでモニ
ターし、380nmで励起している。蛍光の増加は、抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−AMC（APTA）結合
体からのAMCの放出を示す。（ａ）はグルタルアルデヒ
ドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト補体と共にインキ
ュベートしたAPTA結合体を示す。（ｂ）はグルタルアル
デヒドで固定したラット赤血球細胞とヒト補体と共にイ
ンキュベートしたAPTA結合体を示す。（ｃ）はグルタル
アルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞と共にインキュ
ベートしたAPTA結合体を示し、（ｄ）はAPTA結合体のみ
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・ウオルタ−・フランク・ゴア−ズ アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジ−州08540 プリンストン・セイヤ・ドライブ38 (72)発明者 チヤイ−・リ− アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジ−州08820 イ−スト・ウインザ−・アビントン・ドラ イブ・ツイン・リバ−ス・アパ−ト・ビ− −22（番地なし) (56)参考文献 米国特許4256833（ＵＳ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】化合物またはリンカー−化合物のアミン基
と抗体または抗体フラグメントの酸化炭水化物成分のア
ルデヒド基との間で共有結合により結合した化合物また
はリンカー−化合物を含む抗体結合体であって、該化合
物のアミン基と該アルデヒド基との間の共有結合がエナ
ミン、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシムまた
はセミカルバゾンであり、該リンカーのアミン基と該ア
ルデヒド基との間の共有結合がイミン、エナミン、ヒド
ラゾン、フェニルヒドラゾン、オキシムまたはセミカル
バゾンであり、そして該抗体結合体が、抗体または抗体
フラグメントと本質的に同じ免疫反応性と免疫特異性を
有し、そして細菌、ウイルス、腫瘍、真菌、寄生体、マ
イコプラズマ、分化並びに組織適合性抗原からなる群か
ら選ばれた抗原部位に対してインビボで適用するのに適
する抗体結合体。 - 【請求項２】リンカーがペプチドまたはアミノ酸のアミ
ン基含有誘導体、または一般式： Ｗ−（CH2）ｎ−Ｑ （式中、Ｗは または−CH2−であり、Ｑはキレート剤またはキレート
剤誘導体であり、そしてｎは０から20の整数である）を
有する化合物のアミン基含有誘導体であり、該リンカー
が治療用または診断用化合物へ結合していることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の抗体結合体。 - 【請求項３】抗原部位が細菌抗原であり、化合物が抗生
物質であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の抗体結合体。 - 【請求項４】抗原部位がウイルス抗原であり、化合物が
抗ウイルス剤であることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の抗体結合体。 - 【請求項５】抗原部位が腫瘍抗原であり、化合物が抗腫
瘍剤であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の抗体結合体。 - 【請求項６】化合物がフルオロウラシルであることを特
徴とする特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項７】化合物がブレオマイシンであることを特徴
とする特許請求の範囲第５項に記載の抗原結合体。 - 【請求項８】化合物がメトトレキセートであることを特
徴とする特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項９】化合物がアドリアマイシンであることを特
徴とする特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１０】化合物がセルビジンであることを特徴と
する特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１１】化合物がアルケランであることを特徴と
する特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１２】化合物がヴァルバンであることを特徴と
する特許請求の範囲第５項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１３】抗原部位が真菌抗原であり、化合物が抗
寄生体剤であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の抗体結合体。 - 【請求項１４】抗原部位がマイコプラズマ抗原であり、
化合物が抗マイコプラズマ剤であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１５】抗原部位が分化または組織適合性抗原で
あり、化合物が細胞毒剤であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の抗体結合体。 - 【請求項１６】化合物が放射性薬剤または重金属である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗体結
合体。 - 【請求項１７】化合物が毒素または毒素フラグメントで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗
体結合体。 - 【請求項１８】化合物が神経伝達物質またはホルモンで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗
体結合体。 - 【請求項１９】化合物が酵素またはDNA配列であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗体結合
体。 - 【請求項２０】リンカーがキレート剤またはキレート剤
誘導体であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の抗体結合体。 - 【請求項２１】化合物が重金属であることを特徴とする
特許請求の範囲第20項に記載の抗体結合体。
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