JPH04504713A - 共役ポリペプチドとその調製および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′ポリペプチドとその−および 本発明は、厚生省（保険社会福祉省）により付与された助成金契約Ａｌ−２４６ ９５号および海軍研究局により付与された助成金契約Ｎ０００１４−８７−に− ０２５６号に基づいて政府の援助の下で実施されたものである。政府は本発明に 対し、成る種の権利を留保する。 水出願書と同日に提出されたＰｅｔｅｒ　５ｃｈｕｌｔｚを単独発明人として挙 げている特許出願明細書第　（代理人事件整理番号２３０７１１−２５５号）は 、関連する内容を含んでいる。この関連出願明細書の開示は全て本書中に参考と して内含される。 及丑旦五１ １、及五曳分亘 本発明は、一般に結合部位近（に共有結合させられた活性官能基を有するボ、リ ペプチド化合物に関する。さらに限定的にいうと、本発明は、活性官能基がリポ ータ分子または化学療法剤であるようなポリペプチド、ならびにこのようなポリ ペプチドの調製方法に関する。 静電結合、水素結合およびファンデルワールス結合を含む分子間結合力の結果と して、数多くの生物学的タンパク質がその他の生物学的分子に特異的に付着する 能力を持つ。このような結合は、一般に結合部位と呼ばれるタンパク賃上の一つ の部位において発生し、結合はこの結合部位に相捕的な特異の分子幾何形状をも つ、標的配位子とのみ起こる。このような相互作用の例としては、抗体−抗原結 合、酵素−基質結合、ホルモン−受容体結合、リンフォカインーリンフォカイン 受容体結合等がある。このような特異的結合相互作用の利用可能性は、免疫検定 、治療的処置、免疫組織化学療法、タンパク質分離、遷移状態安定化による反応 触媒作用などを含む、さまざまな科学的、医学的および商業的プロセスに依存し ている。 数多くの場合において、特異的結合タンパク質またはポリペプチドに対し結合部 位近くで１つの構成要素つまり官能基を備えることが望ましく、この場所でこの 構成要素は標的配位子との望まれる相互作用を提供することができることになる 。例えば、特定の標的配位子に特異的なポリペプチド結合部位の近くで、検出可 能なすなわち治療的または触媒的活性をもつ構成要素を提供することがおうぉう にして望まれる。病気にかかった細胞を結合することのできる特異的結合タンパ ク質上の結合部位近くに化学療法剤を具備させること（その他の場所では不在で ある）により、そうしなければ存在するはずの毒素効果およびその他の副作用を 低減させながら化学療法的な活性を高めることができる。特定の物質に特異的な タンパク質結合部位近くにリポータ分子を具備させること（その他の場所では不 在である）により、基質の存在がリポータ分子からの観察された／グナルの直接 的変調を提供することができる。 これまで、抗体といった特異的結合タンパク質に活性官能基と共有結合させるた めの方法は一般に結合部位の近くに局所化されてぃなかった。すなわち、結合は 結合部位の近くの場所に限られずタンパク質表面の様々な場所で発見できるアミ ノ酸側鎖および炭水化物を通して達成されていた。酵素が活性部位近（でコツア クタといった官能基を含むよう修飾された一方で、タンパク質結合部位近くでの 化学療法剤およびリポータ分子の局所化された結合は一般に教示されなかった。 さらに、構造的に特徴づけされていないタンパク質に対する方法は、タンパク質 のタイプ及び活性官能基のタイプの如何に関わらず、一般にまだ知られていない 。 上述のことからみて、化学療法剤またはリポータ分子が結合部位近くで結合され 、しかもポリペプチドの残りの部分にはほぼ不在であるような結合部位をもつポ リペプチドを提供することが望ましい。さらに、たとえポリペプチドの構造が未 知である場合でさえ、リポータ分子、化学療法剤、触媒基、反応基などを含む活 性官能基を共有結合させるための方法を提供することが望まれる。 ２、皿１旦茨五旦説皿 細胞リポータおよびその他の標的に対して特異的な抗体に共有結合された毒素お よび薬剤を含む免疫毒素は既に知られている。例えば、米国特許４．３４０．５ ３５号；４、３６８．１４９号；　４．４８９．７１０号および４．６７１．９ ５８号を参照されたい。しかしながら、これらの特許のうちいずれも、抗体結合 部位近くでの毒素および薬剤の部位特異的結合を開示してはいない。欧州特許出 願明細書第１８７．６５８号は活性化剤に共有結合された抗体を開示している。 抗体は宿主内の罹患部位に結合し、活性化剤は宿主内の不活性物質と相互作用し て活性物質を生成する。活性化剤の結合は抗体結合部位に限られていない。米国 特許第３．８１７，７５２号はハプテンが結合されている検出可能な酵素を用い た相同酵素免疫検定を記述している。このハプテン（部分抗原）に対して特異的 な抗体に対し酵素を露呈することにより、酵素活性の調節を達成することができ る。酵素活性を研究するために酵素に結合されたスピンラベルを使用することは 、Ｊｏｎｅｓ他著（１９７３）　Ｅｕｒ、　Ｊ、旧ｏｃｈｅｔ　３４＋２８−４ ０内に開示されている。コツアクタ結合部位を用いて、ポリクローナル抗体が生 成された［Ｒａ５ｏおよび５ｔｏｌｌｅｒ共著（１９７５）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　（生化学）　１４；５８４−５９１］　、コツアクタ結合部位をもつ モノクローナル抗体の生成は、５ｈｏｋａｔ他著（１９８ｇ）＾ｎｇｅ豐、　Ｃ ｈｅ霞。 １００：１２２７−１２２９に記載されている。抗体組合わせ部位のための親和 標識の生成はにｏｈｅｎ他著（１９８０）　ＰＥＢ５　Ｌｅｔｔ、１１１：４２ ７−４３１：　Ｍｅｔｚｇｅｒ他著（１９７０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ窒■ ９：１２６７−１２７８：およびＧｉｖｏｌ他著（１９−７１）　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ｌｏ：３４８１−３４６６により記述されている。酵素結合部位 の構造および触媒作用におけるこのような部位の機能を分析するための高解像度 のＸ線結晶構造解析と合わせて部位指向性突然変異誘発が用いられてきた。Ｈ１ ｋｉｎｓｏｎ他著（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　（自然）　３０７：１８フー１ ８８：Ｃｒａｉｋ他著（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　（科学）２２８：２９１ −２９フ；　５ｅｕｌｔＺ他著（１９８５）　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　（ 生化学）　２４：６８４０−６８４８：　Ｂａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎ ｄ　（１９８２）　０ｒｏｃ、　Ｎ≠狽戟B Ａｃ１ｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　（米国国立科学アカデミ−会報）　７９：６４ ０９−６４１３；およびＳｉｇａｌ他著（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｔ　（生物学、科学ジャーナル）　２５９：５３２７−５３３２．酵素パパイ ンの活性領域内のシスティンが７ラビンコフアクタで修飾されてきた。ＫａＩｓ ｅｒ他著（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１ｉ：５０５−５１０ｏチオールが 酵素ブドウ球菌性ヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）Ｓの中に導 入され、その後オリゴヌクレオチドと誘導体合成された。Ｃｏｒｅｙ他著（１９ ８））　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１４０１−１４０３゜スプチリシンの活性部 位セリンはシスティンへと化学的に変換された。Ｂｅｎｄｅｒ他著（１９６６） 　Ｊ、　Ａ■、　Ｃｈｅ■。 Ｓｏｃ、　８８：　３１５３−３１５４およびＫｏｓｈｌａｎｄ他著（１９６６ ）Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡA５８： １６０６−１６１１゜ 及五〇監！ 本発明に従うと、結合部位近くに結合された活性官能基を有し、リポータ分子お よび化学療法剤からなる群からこの活性官能基が選ばれることを特徴とするポリ ペプチドが提供される。活性官能基は、結合部位近く以外のポリペプチド上の場 所ではほとんど不在であり、官能基の存在は、結合部位に結合する配位子と実質 的に干渉しない。ポリペプチドは通常抗体または抗体フラグメントの形をしてお り、ここで抗体は特定の標的配位子を結合することができるが、酵素、ホルモン 、膜結合細胞受容体、可溶性受容体、ウィルス外皮タンパク質、構造タンパク質 等を含むその他の結合タンパク質形態も使用できる。問題の分析物に特異的な結 合部位を有するポリペプチドを、蛍光体、化学発光剤、生物発光剤、染料、スピ ンラベル、フラビン、圧電分子、ビオチン、酸化還元活性分子等のりボーク分子 に結合させることも可能であり、このようなポリペプチドはりボーク分子の活性 または検定可能性が分析物への結合により直接調節できるような検定を実施する 上で役にたつ。罹患細胞、腫瘍抗原、病原体などに特異的な結合部位を持つポリ ペプチドを毒素、殺菌剤、遊離基捕捉剤、基土成剤、酸化剤、アルキル化剤等の 化学療法剤に結合させることもでき、このようなポリペプチドは化学療法剤の活 性を最大限にでき副反応性を最小限に抑えることのできる治療的処置のために役 立つ。 本発明の第２の聾様においては、問題の活性官能基を導入するためのポリペプチ ドの翻訳後修飾により検出可能なかつ化学療法的なポリペプチドを調製する方法 が提供されている。ポリペプチドは天然のものでも合成のものでもよく、ここで 合成ポリペプチドには、組換え型および固相合成の両方の技術によって調製され たものが含まれる。合成ポリペプチドは結合部位近くで単数または複数のアミノ 酸が置換されるかまたは付加された典型的な天然のポリペプチドの修飾であって よい。稀なアミノ酸または非天然アミノ酸を結合部位近くに導入し、稀なまたは 天然でないアミノ酸を通して特異的に活性官能基を付着させることによって、結 合部位から離れたポリペプチド内部位への官能基の非局所化結合を最小限に抑え るかまたは避けることができる。結合部位近くでの非天然アミノ酸の導入は、導 入されている活性官能基が確実に結合部位近くの場所でのみ付着するようにでき る固有の反応性部位をこれらのアミノ酸が与えることができることから、特に有 利である。 天然ポリペプチドすなわち天然の供給源から単離されたポリペプチドを修飾する 場合には、本発明は結合部位近くでの活性官能基の局所化された結合を確実なも のにする新規な方法を提供する。この方法は、ポリペプチド上に構造情報がない 場合でも有効である。この方法は、開裂可能なリンカ−を通して配位子に開裂可 能な形で結合された第１の反応基を含む「親和標識（アフィニティラベル）」を 使用し、ここでこの配位子はこのポリペプチドの結合部位に特異的である。第１ の反応基は、１つのアミノ酸側鎖、通常はポリペプチド上で結合部位近く（およ びその他の場所）に存在すると思われる共通の側鎖に対して共有結合する能力を 持つ。ポリペプチドを親和標識と組み合わせることにより、配位子は結合部位を 伴う複合体を形成し、かくして第１の反応基を結合部位近（の局所まで運ぶ。 この第１の反応基は次に、結合部位近くでアミノ酸側鎖に共有結合されうる。次 に、反応基はポリペプチドから開裂され、配位子はポリペプチドから除去される 。 ポリペプチドは結合部位近くに共有結合された第１の反応基の一部分（アーチフ ァクト二人工産物）と共に残される。いくつかのケースでは、この部分自体が活 性反応基であってよい。しかしながら、より一般的にはこの部分は、問題の活性 官能基を結合させるための付着部位として役立つことになる。活性官能基は、ポ リペプチド上のその他の場所での結合を最小限に抑えるか、あるいはまた完全に 防ぐような条件の下で部分付着部位に結合される。活性官能基を付着させるため のこの方法は、リポータ分子および化学療法剤に制限されるわけではなく、本出 願と同一日に提出されその開示が本書に参考として内含されている同時継続出願 第　号（代理人事件整理番号２３０７０−２５５号）に記されているような触媒 官能基および反応官能基を含む広範なさまざまな官能基にとって有効である。 区ｉ盆１星鼠区咀 図１は実験の部の例１で用いられた開裂可能な親和標識を例示している。 図２は図１の親和標識を合成するための方法を概略的に示している。 図３は例１においてＭＯＰＣＢ１５の結合部位内ヘチオール官能基を導入するた めの戦略を示している。 図４は例１で記述されているような、紫外線吸収性物質（実線）および放射線（ 破線）で監視されたｌで標識づけられたＦａｂ　（図１）の重鎮のトリプシン硝 化物の高速液体クロマトグラフィーのグラフである。 図５は例１のチオール化Ｐａｂとの反応のため基質として用いられたＤＮＰ含有 エステルを示す。 図６は例１において左で標識づけられたチオール化Ｆａｂによるエステル１４の 開裂のＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロットである。 図７はフルオレセイン−Ｆａｂ付加物を伴うＤＮＰ−グリシン（ロ）対フルオレ セインプラス未誘導体合成Ｆａｂを伴う対照（ム）についての蛍光消光結合検定 の結果を示す。蛍光消光実験は、励起のため４９２　ｎｍを用い５２１ｎ■で発 光を測定して１０°Ｃにて行われた。フルオレセイン−Ｆａｂ付加物は０．１０ μＭになるまで検定緩衝液（上記）で希釈された。２．４−ＤＮＰ−グリシンの アリコートが加えられ、混合の後蛍光が観察された。類似の実験において、各々 ０．ｌＯμＭの遊離Ｎ−フルオレセインチオウレイド−２−メルカプトエチルア ミンおよび未誘導体合成Ｆａｂが処理された。 の　の實　Ｉ 予め定められた標的配位子を特異的に結合することのできる新規のポリペプチド は、結合部位近（に少なくとも一つの活性官能基を含んでいる。結合部位以外の ポリペプチド上の場所には、官能基により提供される活性がこの結合部位に局所 化されるように、活性官能基がほとんど存在しない。活性官能基はリポータ分子 であってよく、かくしてポリペプチドは予め定められた標的配位子を含んでいる 疑いのある種本中でのかかる配位子の検出に有効である。ポリペプチドに対する 配位子の結合は、活性官能基により提供される活性を調節し、標本中に存在する 基質の検出および（オブシ璽ンとして）定量を可能にする。代替的には、活性官 能基は化学療法剤であってよく、これによりこのポリペプチドは部位特異的薬物 デリバリによる罹患状態の治療において有効となる。結合部位近（での薬物の局 在化は、合計所要薬物用量を減少し薬物デＩＪ　／＜す効率を増大することにな る。 非特異的デリバリに関連する薬物の副作用も同様に低減される。 本発明に基づくポリペプチドは以下の化学式を有する。 Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｚ なお、式中、ＰＳ　Ｘ、Ｙおよび２は以下の様に定義づけされる。 Ｐは、問題の標的配位子を特異的に結合する能力を持つ結合部位を有するポリペ プチドである。このポリペプチドは天然のものでも合成のものでもよく、ここで いう「天然の」という語は一般に、例えば細胞培養、動物組織、植物源等の生体 から単離されたポリペプチドのことを指し、「合成」という語は一般に、例えば 固相合成技法といった化学的合成技術および組換え型ＤＮＡ法により生成された ポリペプチドのことを指している。これらのポリペプチドは、単鎖であってもよ いしあるいはまた多重鎖を含んでいてもよく、グリコジル化されていても、グリ コジル化されていないものであってもよい。ポリペプチドのサイズは重要でなく 、２キロダルトン（ｋＤ）から１０００ｋＤの範囲内にあり、通常は２０ｋＤか ら２００ｋＤの範囲内にある。ポリペプチドは抗体、酵素、ホルモン、レクチン 、リンフ才力イン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）、膜結合細胞受容体 、可溶受容体、ウィルス外皮タンパク質、構造タンパク質およびそのフラグメン トといった天然の生物学的タンパク質ならびに、分析物、ビオチン、罹患細胞、 腫瘍細胞（例えばＴ−リンパ球）；細菌性、真菌性およびウィルス性病原体；寄 生体；マイコプラズマ等を含む標的分子（配位子）を特異的に結合することので きるその他のタンパク質の形をしていることが考えられる。特に有利なのは、問 題の標的配位子に対して生成された抗体である。 オブシッンとしては、問題の活性官能基の導入を容易にするため予め定められた 要領で天然の抗体（すなわち免疫原に対して確立されたもの）またはその他の天 然タンパク質の構造を修飾することができる、例えば結合部位近くに固有のまた は稀少な付着部位を提供するためアミノ酸を付加、欠失、または置換させること ができるような合成ペプチドを調製することができる。このような修飾ポリペプ チドは一般に、その誘導源である天然発生タンパク質を模擬する能力を保持し、 特に問題の標的配位子に結合する能力を保持することになる。酵素、ホルモン、 リンフ才力イン等の活性タンパク質の場合、相応するポリペプチドがそのタンパ ク質に通常結び付けられる機能を遂行することなく問題の標的を結合することが できるように、その活性を低減または削除することが望まれることが多い。 代替的には、本発明のポリペプチドは公知のクラスの生物学的タンパク質の特徴 ではない新たな立体構造をとる可能性がある。このような場合、ポリペプチドは 、組換え体技術または固相合成技術のいずれかにより合成され、問題の標的配位 子に対するこのポリペプチドの結合を可能にするような望ましい配列および立体 構造をもつ生成物を提供する。 形状および供給源の如何に関わらず、ポリペプチドは問題の標的配位子に対する 親和力をもつ結合部位を有していることが必要である。この親和力は少なくとも 約１０−”Ｍ−’、通常は少なくとも約ｔｏ−’Ｍ−’、好ましくは少なくとも １０−’Ｍ−’、さらに好ましくは少なくとも１０−’Ｍ”以上である。修飾ポ リペプチド、すなわち天然のまたは典型タンパク質に比べそのアミノ酸配列に変 化があるポリペプチドの場合、修飾の結果として結合親和力の多大な損失が全く あってはならず、修飾ポリペプチドは一般に、たとえ親和力の損失が発生した場 合でも以上に設定した親和力レベルに適合しなくてはならない。 所望の親和力を有するポリペプチドは、問題の標識配位子またはその類似体に対 して抗体特にモノクローナル抗体を生成することにより、最も容易に調製される 。この抗体は、ＩｇＧ％ＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥおよびＩｇＭを含む如何な るクラスのものであってもよいが、ＩｇＧおよびＩｇＭが最も一般的である。抗 体フラグメント、特にペプンン開裂により調製されたＦａｂフラグメントは、お うおうにして無傷の抗体分子の使用よりも好ましい。 特定のハブテンまたは抗原標的基質に対する抗体およびモノクローナル抗体をＩ ｌ製する方法は、Ｇｏｄｊｎｇ著［モノクローナル抗体：原則と実践方法Ｊ　Ａ ｃａｄｅ＋＊１ｅＰｒｅｓｓ、第２版（１９８６）　；　Ｋｅｎｎｅｔｔ他、「 モノクローナル抗体Ｊ　（１９１１０）　；米国特許４．４２３．１４７号；　 ４．３８１．２９２号；　４．３６３．７９９号：　４．３５０．６８３号およ び４．１２７．１２４号の中で教示されており、これらの文書の開示は本書中に 参考として内含されている。 ポリペプチドの結合部位は、問題の標的配位子に特異的に付着することのできる アミノ酸の集まりによって構成されている。この結合部位は通常、約２個ないし １５個のアミノ酸を含み、更に一般的には約２個ないし１０個のアミノ酸を含み 、ここでアミノ酸はポリペプチドの一次配列に沿って隣接していても分離してい てもよい。アミノ酸は、隣接していない場合、通常ポリペプチドのひだ形成（二 次構造）により一緒にされることになる。結合部位は通常、結合されつつある反 応物または反応性中間体の一部分と相補性ある空洞またはその他の三次元構造を 構成する。 特に、結合部位内のアミノ酸の側鎖は、標的配位子上の特定の構造（抗体結合の 場合エピトープまたは決定因子の部位と呼ばれる）と相互作用することになる。 Ｘは、ポリペプチドＰ上の結合部位近くのアミノ酸側鎖である。この側鎖Ｘは通 常結合部位の三次元構造の外側にあるが、場合によっては活性官能基の存在がポ リペプチドと標的配位子の間の結合に著しく干渉しないかぎり結合部位内にあっ てもよい。しかしながら、一般に側鎖Ｘは活性官能基と標的配位子の間の望まし い相互作用（例えば薬物デリバリまたは蛍光リポータ分子の消光）を提供するの に十分近い距離のところで結合部位周辺に位置付けされる。側鎖Ｘおよび結合部 位との間の距離は通常約２０人未満であり、さらに一般的には約１０人未満、好 ましくは約５人未満である。 この側鎖Ｘは、天然のアミノ酸側鎖（すなわち天然発生アミノ酸のうちの１つの 側鎖）であってもよいし、或はまた合成のアミノ酸側鎖（すなわち天然には発生 せず以下にさらに詳しく説明するような合成調製法により特異的にポリペプチド に導入されたアミノ酸の側鎖）であってもよい。いずれの場合でも、アミノ酸は 以下により詳しく説明するように、適切な連鎖基Ｙを通しての活性官能基２の結 合を可能にするに十分な反応性をもつ。 側鎖Ｘが天然に発生するアミノ酸上にあるとき、側鎖は通常非脂肪族であり、好 ましくは塩基性側鎖（リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖）、酸性側鎖 （アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩）、脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン およびスレオニン）、チオール（システィン）、硫化物（メチオニン）、フェノ ール（チロシン）およびアミノインドール（トリプトファン）の群から選ばれる ものである。 好ましくは、アミノ酸側鎖はポリペプチドの露出された表面の残りの部分ではほ ぼ不在である一方、ポリペプチドの結合部位近くに存在するよう選ばれた比較的 稀なアミノ酸上に存在する。当然のことながら、このような稀アミノ酸を以下に より詳しく説明するように合成技術によりポリペプチドの一次構造を修飾するこ とによって結合部位近くの場所に意図的に導入する（そして結合部位から離れた 場所から欠失させることも可能である）。アミノ酸が稀であるか否かは、究極的 には特定のポリペプチドの構造により左右される。結合部位の近くのポリペプチ ド表面に露出されているもののこの表面のその他の場所ではほぼ不在であるよう な全てのアミノ酸は、稀アミノ酸とみなすことができる。通常、稀アミノ酸はポ リペプチド２表面（結合部位の近く以外の）のｌＯ力力量以下場所に存在し、好 ましくは５カ所以下の場所に存在し、さらに好ましくは結合部位から離れた如何 なる場所にも存在しない。 場合によっては、ポリペプチドの結合部位近くに合成アミ酸を与えることにより 唯一のアミノ酸側鎖を導入することが望ましい。合成アミノ酸の使用は、天然に 発生するアミノ酸側鎖のものとは全（異なる化学反応性をもつ側鎖の導入を可能 にする。このようにして、結合部位近くでの活性官能基の局所的結合が確認でき る。活性官能基の共有結合に特に適した合成アミノ酸側鎖としては、アリールお よびアルキルアミン（アルキルハロゲン化物およびα−ハロケトンのアルキル化 、アルデヒドの還元アミノ化、イソシアン酸塩またはインチオンアン酸塩のアシ ル化、またはα、β不飽和エノンの１．４付加により調製されたもの）；アルデ ヒド（アルキルまたはアリールアミンの還元アミン化により調製されたもの）； Ａ・アルキル、アリールまたはそれに類するものとしたＣ（０）Ａの形のカルボ ン酸誘導体（アルキルまたはアリールアミンでのトランスアシル化により調製さ れたもの）：α、β不飽和エノン（アミンおよびチオールを含む核性試薬での付 加反応により調製されたもの）等がある。 Ｙは、活性官能基Ｚ上の反応基とアミノ酸側鎖の間に必要な共有架橋を提供する のに選択された連鎖基である。典型的な反応基としては、チオール、ジスルフィ ド、エステル、アルデヒド、α−ハロケトン、ジアゾニウム、イソシアン酸塩、 α、β不飽和ケトンおよびエノン等がある。連鎖基の性質は重要ではないが、連 鎖基を導入するのに用いられる化学が、活性官能基のその他のアミノ酸側鎖への 結合を防ぐべく望ましい側鎖Ｘに対して選択的なものであることが好ましい。連 鎖基Ｙの長さは重要ではなく、約１．５人から２５人の間で変化してよ（、通常 約５人と１２人の間で変化する。おうおうにして、連鎖基は例えばチオエステル 、アゾ、ヒドロアゾ、ヒドロキシアミン、スルフェン酸塩、スルフィン酸塩、ス ルフォン酸塩、過酸化物物、無水物といったアミノ酸側鎖と活性官能基上の反応 基を反応させた結果である。連鎖基は二官能性架橋剤によって形成される。連鎖 基によって提供される連鎖は、連鎖完了後の浄化手順に耐えるのに十分な安定性 をもち、使用条件に耐えられるものでなくてはならない。しかしながら、場合に よっては予め選定された条件下で劣化するような生物学的および／または化学的 に不安定な連鎖基を提供することが望ましいときもある。例えば、抗体に連結さ れた毒素を含む免疫毒素は、毒素の陥入を可能にするため結合された細胞の表面 で毒素が開裂可能であることを必要とする。アミノ酸側鎖に分子を結合させるた めの一般的な技法は、特許および科学文献に十分記述されている。例えば、ｃｕ ａｔｒｅｃａｓａｓ他著（１９５９）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（生物・ 化学ジャーナル）　２４４：４３１６：　Ｇｌｖｏｌ他著（１９７１）　生化学 １０：３４６１；米国特許４．３４０．５３５号；　４．３６８．＋４９号、４ ，４８９．７１０号。 ４．６７１．９５８号；および欧州特許出願明細書１８７，６５８号を参照のこ と。なお、これらの文書の開示内容は本書に参考として内含されている。 典型的連鎖基Ｙは、以下のような活性官能基Ｚ上でアミノ酸側鎖Ｘおよび反応基 の間に直接形成されてもよい。 ム限１ヱ　Ｘ　たはその　の−　ｌ上旦父麦基アゾベンゼン　チロシン　アリー ルジアゾニウムアミン　アリールまたはアルキルアミン　α−ハＯ’７）ンチオ 尿素　アリールまたはアルキルアミン　インチオシアン酸塩アミド　アリールま たはアルキルアミド　無水物代替的にアミノ酸側鎖Ｘと活性官能基２の間に連鎖 基Ｙを導入するために、二官能性架橋剤を用いることができる。典型的な架橋剤 以下の通りである。 ンノフ塩基を還元 ３　、５−Ｃ−Ｎ　／）−’５”　ＳＧ　−ＮＨＲここで、Ｇは適切な保護基例 えばチオピリジルまたはアシルであり、ＡはＣＩ２．ＯＮまたはＮＨであり；Ｒ はアリールまたは水素；Ｘは無水物、アンヒドロキシスクシンイミドエステルま たはその他の活性アシル基である。 活性官能基Ｚは、リポータ分子と化学療法剤からなる群から選ばれた分子である 。活性官能基分子の大きさは重要ではないが、一般に約１００ダルトン（Ｄ）〜 ２０００ダルトン、より一般的には約２００Ｄ〜１００ＯＤの範囲内にある。活 性官能基の構造は、そのタイプおよび意図されている用途に応じて大きく変わる が、直接または二官能性架橋剤を介してポリペプチドＰに共有結合するために利 用できるような反応基を必ず含んでいる。自然の状態では適当な反応基を含んで いない活性官能基は、所望の活性と干渉しない形でこのような基を提供すべく修 飾されなくてはならない。活性官能基上の適切な反応基は、上記の通りである。 強さまたはその他の特性が標的配位子（分析物）にポリペプチドを結合すること により影響を受けるまたは修飾され得るような１つの検出可能なシグナルを提供 されるよう、リポータ分子および化合物が選定される。適当なリポータ分子とし ては色素原（例えば染料および蛍光体）、化学発光剤、生物発光剤、スピンラベ ル、フラビン、圧電分子、ビオチン等がある。本書に開示内容が参考として内含 されている米国特許第４．３６６、２４１号には数多くの適当なリポータ分子が 記述されている。 適当な色素原としては、色が見えるよう示差的範囲内で光を吸収し、或はまた特 定の波長または波長範囲の照射を受けたとき光を発する（例えば蛍光剤）ような 分子および化合物がある。 適当な染料としては利用可能なものが多種多様であり、先づ第１に環境による吸 収が最小限で強力な色素を提供するように選定される。染料の一例としては、キ ノリン染料、トリアリールメタン染料、アクリジン染料、アリザリン染料、フタ レイン、昆虫染料、アゾ染料、アントラキノイド染料、シアニン染料、フエナザ チオニウム染料およびフェナゾオクソニウム染料がある。 多種多様な蛍光剤を単独でまたは消光分子と合わせて用いることが可能である。 対象となる蛍光剤は、いくつかの−次官能基を有するさまざまなカテゴリーに入 る。これらの−次官能基としては、１−および２−アミノナフタレン、ｐ、ｐ− −ジアミノスチルベン、ピレン、第４級フェナントリジン塩、９−アミノアクリ ジン、ｐ、ｐ−−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボ シアニン、メロシアニン、３−アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベンゾオ キサザゾール、ビス−ｐ−オキサシリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、 レチ／−ル、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイク リン、ステロフェノール、ベンゾイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３ −クロメン、インドール、牛サンテン、７−ヒドロキシクマリン、フエノキザジ ン、サリチル酸塩、ストロフアンチジン、ホルフィリン、トリアリールメタンお よびフラビンである。 連鎖のための官能基を有するかまたはこのような官能基を内含すべく修飾されつ る個々の蛍光化合物としては、塩化ダンジル、３−６−シヒドロキシー９−フェ ニルキサントヒドルといったフルオロンイン、ローダミンインチオシアン酸塩、 Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−スルホン酸ナフタレン、Ｎ−フェニル−２−ア ミノ−６−スルホン酸ナフタレン、４−アセトアミド−４−インチオシアン酸ス チルベン−２，２−一ジスルボン酸、ピレン−３−スルホンＬ２−トルイジノナ フタレン−６−スルポン酸塩、Ｎ−フェニル、Ｎ−メチル２−アミノナフタレン −６−スルホン酸塩、臭化エチジウム、ステプリン、オーロミンー０．２−（９ −−アントロイル）パルミチン酸塩、ダンシルフォスファチジルエタノールアミ ン、Ｎ、Ｎ−−ジオクタデシルオキサカルボシアニン、メロシアニン、４−（３ −−ピレニル）酪１１塩、　ｄ−３−アミノデシキシエクイレニン、１２−（９ −−アントロイル）ステアリン酸塩、２−メチルアントラセン、９−ビニルアン トラセン、２、２−−（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾオキサゾール、 ｐ−ビス（２−（４−メチル−５−フェニル−オキサシル）］ベンゼン、６−シ メチルアミノー１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス（３−−アミノピ リジウム０．１０−デヵンディルジイオダイド、ヘリブリエニンのスルホナフチ ルヒドラゾン、クロロテトラサイクリン、Ｎ−（７−シメチルアミノー４−メチ ル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド、　Ｎ−［Ｐ−（２−ベンゾイミ ダゾリル）−フェニルコマレイミド、Ｎ−（４−フルオルアンチル）マレイミド 、ビス（ホモバニリン酸）、レサザリン、４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３ −ベンゾオキサジアゾール、メロ／アニン５４０、レゾルフィン、ローズベンガ ルおよび２．４−ジフェニル１−３＝（２Ｈ）−フラノンがある。 望ましくは、蛍光剤は約３００ｎ−以上、好ましくは約３５０ｎ−以上、さらに 好ましくは約４００＋ｖ以上の光を吸収し、通常吸収された光の波長よりも１ｏ 止以上高い波長で発光する。結合された染料の吸収および発光特性は、結合され ていない染料とは異なるものでありうるということに留意すべきである。従って 、染料のさまざまな特性およびさまざまな波長範囲について言及するとき、それ は使用されている状態のままの染料のことを意味し、仇役されておらず任意の溶 媒内で特徴づけされた染料を意味するものではない。 蛍光剤は一般に、単一の蛍光剤が１つのシグナルの増倍を提供できるかぎりにお いて、吸収性の染料よりも好まれる。蛍光剤に光を照射することにより、複数の 発光が得られるのである。従って、単一の標識が複数の測定可能な事象を提供す ることができる。 検出可能なシグナルは、化学発光剤および生物発光剤源によっても提供され得る 。化学発光剤源には、化学反応により電子的に励起された状態になり、次に検出 可能なジグノルとして役立つかまたは発光アクセプタに対してエネルギーを与え るような光を発し得るような化合物が含まれる。さまざまな条件の下でケミルミ ネセンス（化学発光）を提供するため、数多くの化合物群が発見されてきた。 そのうちの１つの群は２．３−ジヒドロ−１−４−フタラジンジオンである。最 も一般的な化合物は、５−アミノ化合物であるルミノールである。この群のその 他の組成員としては、５−アミノ−８，７，８−トリメトキシ−およびジメチル アミノ［Ｃａ］ベンズ類似体がある。これらの化合物は、アルカリ性過酸化水素 または次亜塩素酸カルシウムおよび塩基によりルミネセンス（発光）を示すよう にすることができる。もう１つの化合物群は、２．４．５−　）リフェニルイミ ダゾールであり、親生成物の一般名はロフィンである。化学発光性の類似物とし てはパラ−ジメチルアミノおよび一メト牛／置換基がある。ケミルミネセンス（ 化学発光）は同様に蓚酸塩、通常はｐ−二トロフェニルといったオ牛すリル活性 エステルおよび過酸化物水素といった過酸化物物を用いて、塩基性条件の下でも 得られる。代替的には、バイオルミネセンス（生物発光）を与えるためルシフェ ラーゼまたはルシゲニンと合わせてルシフェリンを用いることも可能である。 電子スピン共鳴（ＥＳＰ）分光学によって検出可能な不対電子スピンを伴うリポ ータ分子によりスピンラベルが提供される。典型的なスピンラベルとしては、有 機３ＩＩＩ１１基、遷移金属複合体、特にバナジウム、銅、鉄およびマンガン等 がある。典型的な１つのスピンラベルは、ニトロキシドの遊離基である。 化学療法剤は、治療されている疾病の状態および標識配位子との性質に応じて選 択される。このような製剤は、宿主の罹患細胞を殺し、病原体を殺し、細胞の増 殖を抑制し、ホルモン治療を提供し、または製剤と標的配位子の間のその他のさ まざまな有利な相互作用を提供することを目的としている可能性がある。典型的 な化学療法剤としては、毒素、毒素フラグメント、殺菌剤、遊離基捕捉剤、基生 成剤、アルキル化剤、神経伝達物質、放射性核種、抗ウィルス化合物、抗真菌化 合物、抗膿瘍剤、抗マイコプラズマ剤、重金属等がある。適切な薬剤のリストが 表１に与えられている。 ｌ肚ΔＬ乙ズ　■ 抗菌剤　スルファニル酸アミド ポリミキシン クロラムフェニフール アミノグリコシド： ストレプトマイシン ストレプトマイシンＢ スペクチノマイシン アンピシリン 抗ウィルス剤　アシクロビール 抗真菌剤　二スタチン 抗腫瘍剤　アドリアマイシン フルオロウラジル 放射性薬品　【１２５ ９９＠　７　ｃ　（テクネチウム） 重金属　バリウム 金 プラチナ 抗マイコプラスミド　チロシン スベクチノマインン 毒素　リンン リシンＡ鎖 ジフテリア毒素 ジフテリア毒素Ａ鎖 本発明のポリペプチドは一般に２段階技法により調製され、ここにおいて先づ第 １にポリペプチド（活性官能基無し）が生産され、その後活性官能基はこのポリ ペプチドの結合部位近くに部位特異的に導入される。ポリペプチドは細胞培養、 動物組織、植物性供給源といった天然の供給源から得てもよいし、或はまた以下 にさらに詳細に記述されているように合成的に生成してもよい。最も一般的には 、ポリペプチドは従来のやり方で問題の標的配位子（またはその類似物）に対し て惹起された抗体または抗体フラグメントである。 問題の標的配位子は抗原として使用することができ、また十分に小さい場合には 抗原性を与えるための適当な免疫原に付着させることもできる。抗原標的配位子 がひとたび得られると、基質に対して特異的なポリクローナル抗体を生体外また は生体内技法で生成することができる。生体外技法には、抗原標的基質に対する リンパ球の生体外露出が関与し、一方生体内技法には、さまざまなを椎動物内へ の抗原標的基質の注入が必要とされる。適するを椎動物はヒトではなく、マウス 、ラット、ウサギ、ヤギ等を含む。約１０ｋＤより小さい、特に約１ｉｋＤより も小さい標的基質は通常、望ましい免疫応答を惹起するべくより大きな分子に接 合させられる。生体内技法の場合、免疫原は予め定められたスケジュールに従っ て被験動物に注射され、被験動物は連続する採血の滴定ｌ＃度および特異性が改 善されＣいる状態で、定期的に採血を受１ブる。注射は筋肉、腹腔内、皮下など で行われてよく、不完全７０インドアシネバンドのようなアジュバントが用いら れることになる。 所望ならば、望ましい特異性をもつ抗体を生成することができる不滅にされた細 胞系統をＵ製することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。このよ うな不滅化された細胞系統はさまざまな方法で生成できる。マウスのような小さ なを椎動物を前述の方法により望まし抗原で過免疫するのが好都合である。次に 、このを椎動物を通常最終免疫から数日後に安楽死さゼ、動物の肺臓を除去し神 職細胞を不滅化する。不滅化の方法は重要ではない。現在第も一般的な技法は、 ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）εｕｒ、　Ｊ、Ｉｗ＋ａｕｎ ｏ１．６＋５１１−５１９に最初に記述されたように、骨髄腫細胞融合パートナ との融合である。その他の技法としては、ＥＢＶ形質転換、裸ＤＮＡ例えば腫瘍 遺伝子、レトロウィルス等での形質転換、または細胞系統の安定した維持および モノクローナル抗体の生成を提供するその他の方法がある。 融合パートナとの融合を用いる場合、融合の方法は重要ではな（、さまざまな技 法を用いることができる。非イオン洗浄剤、通常はポリエチレングリコールおよ びダルベツコの修飾イーグル培地といったその他の添加物が存在する下で数分間 肺臓細胞と骨髄腫細胞を組合せるのが好都合である。融合の終わりで非イオン洗 浄剤を細胞の清浄によって迅速に除去し、骨髄腫細胞に対しては致死でありなが ら雑種細胞の増殖を支持するよう選択された選択的培地の中で、ｌウェルあたり 約１〜５Ｘ１０’の比較的低い密度で小さい培養ウェル内（通常はマイクロタイ タブレート内）にいくつかの細胞をすばやく投入する。通常、骨髄種細胞系統は 致死製剤に対し感受性をもつように突然変異させられており、標準的にはＨＡＴ ｇ受性をもつ。 十分な時間の後（通常１週間〜２週間）雑種のコロニーを観察し、１ウエルあた り１つのコロニーしかもたないプレートおよびウェルを選定し、これらのウェル がらの上澄みを標的配位子に対する結合活性についてテストする。陽性ハイブリ ドーマ（雑種細胞）をひとたび識別すると、細胞系統を生存して増殖し得る培養 としておよび／′または凍結乾燥法および冷凍貯蔵により維持することができる 。 ハイブリドーマを一度選定すると、増殖するコロニーの上澄みからモノクローナ ル抗体を単離することができる。しかしながら、得られる抗体の収量は低い。 この収量は、細胞を受容する背椎動物宿主の腹腔内にハイブリドーマ細胞系統を 注入するといったようなさまざまな技術によって高めることができる。次にモノ クロ−、ナル抗体を腹水からまたは血液から採取することができる。タンパク様 のおよびその他の汚染物質は通常クロマトグラフ、ゲル濾過、沈降、抽出等の従 来の技術によりモノクローナル抗体から除去されることになる。 本発明のポリペプチドを生成するための合成および組換え体技術は、通常必須の 親和力をもつ標的配位子を結合するものと（、て知られているタンパク質の特徴 である典型的アミノ酸配列で始まる。このような典型的アミノ酸配列は、問題の 標的配位子に結合するものとして知られている酵素または前述のような標的基質 に対して生成された抗体から誘導され得る。ホルモン、リンフ才力イン、レクチ ン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨ Ｃ）のタンパク質、Ｔ細胞受容体、Ｇタンパク質、神経伝達物質受容体、ＤＮＡ 結合タンパク質例えば抑制因子などといった天然の受容体および配位子も、合成 ポリペプチド内に内含され得るような問題の結合部位を構成する上で用いること ができる。 約２００個未満のアミノ酸、通常は約１５０個未満、さらに一般的には１００個 以下のアミノ酸を有するポリペプチドを調製するためには、合成的方法を用いる ことが可能である。以下にさらに詳しく述べる合成的調製方法は、ポリペプチド の結合部位近くの望ましい場所で合成（非天然）アミノ酸を挿入できるようにす るのに特に適しているが、生物学的合成技法に比べると収量が低（グリコジル化 が欠如しているという欠点がある。 アミノ酸が成長しつつある鎖に対し逐次的に付加される周知のメリフィールド固 相合成方法に基づく適当な合成ポリペプチド調製方法も考えられる［Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ（１９６３）　Ｊ、ＡｔＣｈｅｔ　Ｓｏｃ、＋１５＋２１４９−２１ ５６］。このような技術によりポリペプチドを合成するための自動化されたシス テムが現在、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、。 Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４４０４；　Ｎｅｗ　Ｂｒ ｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎ■磨@Ｊｅｒｓｅｙ ０８８１８：およびＰｈａｒｗ＋ａｃｉａ、　Ｉｎｃ、　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅ浴@Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５４、といった供給業者から入手可能である。 さらに　大きいおよび／またはグリコジル化されたポリペプチドのｇｉａのため には、通常組換え体Ｈ製技術が好ましい。このような組換え体技術には、望まし いポリペプチドアミノ酸配列をコード化する組換え型ＤＢＡ分子の培養細胞内で の表現が関与している。ＤＮＡ配列はそれ自体合成のものであるかまたは代替的 には天然の供給源すなわち典型的抗体、酵素、リンフ才力イン、ホルモンまたは その他のタンパク質の遺伝子から修飾される。合成りＮＡ配列（ポリヌクレオチ ド）は、周知の技術によって合成され得る。例えば、短一本＠ＤＮＡフラグメン トは、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｔ 、Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１８５９−１８６２、によって記述されたフォスフォ アミジド方法によって調製できる。このとき、２本鎖フラグメントは、相補鎖を 合わせてアニーリングすること、或はまた適切なプライマ配列をもつＤＮＡポリ メラーゼを用いて相補鎖を付加することのいずれかによって得ることができる。 便利なことに、合成りＮＡ配列をｇ製するためのき勧化された装置が、合成ポリ ペプチド装置を供給する者として上に列挙した供給業者から入手可能である。代 替的には、望ましいＤＮＡ配列は問題の典型的タンパク質を表現する細胞系統か ら得られた適当なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリから得ることができる。例え ば、問題のモノクローナル抗体を表現する遺伝子は、このような抗体を表現する ハイブリドーマ細胞系統から単離することができる。このとき遺伝子は、問題の 活性官能基を結合することのできるアミノ酸を置換または付加するため、以下に さらに詳しく説明するように修飾され得る。ハイブリドーマ細胞系統から抗体遺 伝子を分離するための技法は、科学的文献の中に十分記述されている。例えば、 Ｇｅａｒｈａｒｔ　ｌｔ！！著（１９８３）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｅｔ　ｌｌ５Ａ　８０：３４３９−３４４３を参照のこ■B 望ましい触媒または反応性ポリペプチドにってコード化する天然のまたは合成の ＤＮＡフラグメントは、生体外細胞培養への導入およびその中での表現の能力を もつＤＮＡ構成体の中に統合されることになる。このＤＮＡ構成体は、酵母また は細菌といった単細胞宿主内で複製に適したものでありうるが、おうおうにして 培養された哺乳動物のまたはその他の真核細胞系統のゲノム内への導入および統 合を目的としている。細菌または酵母内への導入のために調製されたＤＮＡ構成 体には、宿主により認識される複製システムつまり問題のポリペプチドをコード 化するＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ配列の５′未満に接合された転写および翻訳 開始調節配列およびＤＮＡ配列の３′未満に接合された転写・翻訳終止調節配列 が含まれることになる。 転写調節配列は、宿主により認識される非相同プロモータを含む。便利なことに 、表現されるべきＤＮＡ配列のための挿入部位と共に複写７ステムおよび転写・ 翻訳調節配列を含む入手可能な表現ベクトルを用いるごともできる。 通常は抗体、酵素、リンフ才力イン、ホルモンまたはそのフラグメントである典 型的タンパク質をコード化する単離された遺伝子で開始する場合には、通常活性 官能基を結合部位内またはその近くに結合させるアミノ酸を置換または付加する ように遺伝子を修飾することが望ましい。このような置換または付加を提供する ため、天然の遺伝子配列を変えるためのさまざまな方法が知られており、特許お よび科学文献内に十分に記述されている。例えば、［分子クローニング：実験室 マニュアルＪ　（Ｍａｎｉｔａｔｉｓ他刊）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌ ａｒｖｏｒ、Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ　（１９８２）および「分子クローニング技術の 手引Ｊ　（Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　ｋｉｍｍｅｌ、ｅｄｓ、）　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（酵素学における方法）　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ、　ｌｎｃ、、０ｒｌａｎｄｏ、ＦＩｏｒｉｄａ（１９８７）を参 照のこと。遺伝子内にこのような変化を与えるための特定の技術としては、Ｋｕ ｎｋｅｌ他著（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：８ ７６４に記述されているような部位指間型突然変異誘発、およびｔｅｌｌｓ他著 （１９８５）　Ｇｅｎｅ　（遺伝子）　３４：３１５−３２３により記述されて いるようなカセット突然変異誘発がある。このとき修飾された遺伝子を上述のよ うに細胞培養内で表現させることができ、従来の純化技術により修飾ポリペプチ ドが得られる。 未修飾タンパク質遺伝子によりコード化された典型的なタンパク質内の合成（非 天然）アミノ酸の置換のために第２の方法を用いることができる。上述のように して遺伝子を変化させ、その遺伝子の終止コドンとは異なるナンセンスコドンで 結合部位近くの望ましい場所でアミノ酸コドンを置換する。便利なことに、この ような置換のためにはオリゴヌクレオチド指同型突然変異誘発を用いることがで きる。ナンセンスコドンに対し指回されたサプレッサｔＲＮＡを望ましい合成ア ミノ酸で化学的または酵素的にアシル化し、修飾ＤＮＡ配列を表現すべくプログ ラミングされた生体外転写／翻訳システムに付加する。合成アミ酸は、ナンセン スコドンの場所で挿入されることになる。当然のことながら、このアプローチは 天然アミノ酸にも同様に利用できるが、望まれる天然アミノ酸をフード化するた めのＤＮＡ配列の単純な変化に比べて一層わずられしいことである。 望まれるユニークコドンは、天然アミノ酸挿入部位（天然ｔＲＮＡ認識部位）を コード化してはならず、適切なコドンはＴＡＧ終止またはアンバーコドンである 。終止コドン（ＴＡＧ、　ＴＡＡまたはＴＧＡ）を生成する遺伝子内に突然変異 があれば、終止因子を結合しこれと競争する能力を天然発生ｔＲＮＡがもってい ない結果として、ポリペプチド合成の早期の終結がもたらされることになる。こ のような修飾遺伝子は、当然２つの互生終止コドンのうちの１つを利用しなけれ ばならない。このアプローチは、互生アミノ酸の置換をアミノアシル化段階での 互生となる合成アミノ酸の調製により得ることができるという点で特に有利であ る。 数多くのｔＲＮＡ分子のアンチコドンループ内での突然変異は、アンバーサプレ ッサｔＲＮＡを導き出す。例えばｓｔｅｅｇｅおよび５ｏｉ１の「生物学的調節 および発達」第１巻（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ、　ｃｄ、　）Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒ ｅｓｓ（１９７ｇ）を参照のこと。５−−ＣＵＡ−３−アンチコドンループによ り特徴づけされるアンバサプレノサは、その野生型相対物により認識されるコド ンに対しもはや応答せず、その代わりアンバーコドン（ＵＡＧ）に応答してのみ アミノ酸を挿入する。合成アミノ酸を担持する望まれるｔＲＮＡは、Ｂｒｕｃｅ 他（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９ニア１ ２７−７１３１に記述されているように、アンチコドンルーブ置換によって生成 することができる。代替的には、合成アミノ酸を担持するｔＲＮＡをコード化す る遺伝子を合成し適当な表現シイテム内で表現させてもよいし、或はまたサプレ ッサｔＲＮＡをランオフ転写によって生成することができる。化学的または遺伝 的に構築されたサプレッサｔＲＮＡは、このとき本発明のポリペプチド内に統合 されるべき合成アミノ酸でアミノアシル化されなくてはならない。保護されたｐ ＣｐＡ−ＯＨでのＮ−遮断アミノ酸のカルボニルジイミダゾール媒介の共役を介 して合成されたＮ−遮断アミノアシルｐＣｐＡジヌクレオチドを用いる適切な化 学的アンル化方法は、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼの存在する中での短縮形ｔＲＮＡに より要約される。Ｈｅｃｋｌｅｒ他（１９８４）　ｒ四面体Ｊ　４０：８７−９ ４．適当な原核生体外転写／翻訳／ステムは、Ｐｒａｔｔ著「転写と翻訳、実践 的アプローチＪ　（Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈ４ｇｇｅｎｓ刊）ＩＲＬＰｒｅｓｓ 、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　（１９８４）内に記述されている。 抗体の組換え体による生産は、最近の数多くの特許出願明細書すなわち、ＥＰＯ ８４３０２６ｇ、０；　ＥＰＯ８５１０２６６５，Ｌ　ＥＰＯ８５３０５６０４ ，２＋　ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３９２；　ＥＰＯ８５１１５３１＋、４．　Ｐ ＣＴ／Ｅｌｓ！１６１００２２６９．および日本特許出願明細書８５２３９５４ ３号で教示されており、これらの開示内容は本書中に参考として内含される。同 様に本書に参考としてその開示が内含されている、哺乳動物のタンパク質の部位 指向壓突然変異誘発を記述する米国特許第４．５１８．５８４号も参照のこと。 上述の技術のいずれかにより一層ポリペプチドが得られたならば、活性官能基は 直接的にまたは前述のような三官能リンカ−を通して、ポリペプチドの結合部位 近くでアミノ酸側鎖に共有結合されることになる。結合部位近くに稀アミノ酸ま たは合成アミノ酸を与えることにより、連鎖基は結合部位に局在させられ、結合 部位の近く以外のポリペプチド上の場所からほぼ無くなることになる。代替的に は、以下にさらに詳しく記述されるように、共通のアミノ酸の側鎖にでも連鎖基 を部位特異的に導入するために新たな親和標識技術を用いることも可能である。 開裂可能な親和標識試薬を用いた新規な技術により、連鎖基および活性官能基を ポリペプチドに導入することも可能である。このような試薬は、例えばタンパク 質結合部位に対して特異的なハブテンといった親和標識に対して開裂可能な反応 基を接合させることによって得られる。開裂可能な親和標識を結合部位において タンパク質に結合させ、その後反応基の自由端を結合部位近くのアミノ酸側鎖に 共有結合させることにより反応基をハブテンから開裂させ、ハブテンをタンパク 質から除去し、反応基をポリペプチド上の所定の位置に残すことができる。親和 標識反応基の付着に役立つアミノ酸側鎖としては、カルボキシレート（アスパラ ギン酸塩およびグルタミン酸塩）、−級アミン（リジン）、イミダゾール（ヒス チジン）、フェノール（チロシン）およびチオール（システィン）がある。開裂 後に残る反応基部分はそれ自体活性官能基特に、すでに本書に参考として内含し た同時継続特許出願系　号（代理人事件整理番号２３０７Ｕ−２５５）の中にさ らに詳しく規定されているような触媒または反応官能基を含んでいる。しかしな がら、ポリペプチド上の反応基部分は活性官能基を共有結合するための付着部位 として役立つものとなることの方が多い。上述の共有結合方法は一般に、リポー タ分子および化学療法剤を含む官能基を、親和標識づけにより導入された反応基 に付着させるのに役立つ。このような親和標識を合成しこれらを抗体組合せ部位 に付着させるだめの特異的方法は、以下の実験の部の例１において教示されてい る。このような開裂可能な親和標識は特に、構造的に特徴づけされていないポリ ペプチドを選択的に修飾するのに適している。 （活性官能基に対するジスルフィド結合を形成するのに役立つ）チオールをポリ ペプチドの結合部位に導入することは、以下のような親和標識を用いて達成でき る。この親和標識はハブテンに結合されたジスルフィド反応基またはチオールエ ステルであってよく、部位特異的誘導体合成後の標識の開裂は、結合部位に遊離 チオールを取り込むことになる。ジスルフィドはジチオトレイトールで還元でき るが、チオールエステルはヒドロキシルアミンで開裂させることができる。ジス ルフィドは、タンパク質内にジスルフィドが埋没するのを避けるように選ばれた 穏やかな条件の下で還元される。開裂可能な連鎖（結合）に適したもう１つの官 能基はアセタルであり、これは還元アミノ化により誘導体合成され得るタンパク 質結合アルデヒド部分をもたらす。いかしながら、開裂のために必要な酸性条件 は、酸に敏感なタンパク質の不活性化に導く可能性がある。アゾベンゼン架橋は 還元により開裂され得、芳香族アミンを与えるが、この芳香族アミンは次に低い ｐＨで遺伝的に誘導体合成され得る。 親和標識試薬内の反応基の選択は数多くの要因により支配される。反応性連鎖基 は、均衡が打ち立てられた後先づタンパク質の結合部位にてまたはその近（で反 応するよう、十分低速で反応しなくてはならない。この基は複数のタイプのアミ ノ酸残基と反応することができ、これは誘導体合成の成功の可能性を最大にする ために有利なことである。これはまた、標識づけされたタンパク質の特徴づけを 複雑にする可能性があるという点で不利である。理想的にはポリペプチド上の単 一（ユニーク）の残基が修飾されて相同な付加体を与えな（ではならない。もう １つの重要な問題は、標識づけ試薬の合成である。タンパク質内への標識の取り 込みを最適化するために試薬の長さを容易に変化させることが可能でなくてはな らない。親和標識は同様に、標識の取り込みを定量するのを容易にするため放射 線標識づけされた形で容易に合成されなくてはならない。最後に標識はタンパク 質配列決定において用いられる分解方法を含むその後のタンパク質操作条件に対 して安定していなくてはならない。 親和標識を用いて導入され得る２つの好ましい反応基は、ジアゾケトンと芳香族 アジドである。これらの基は、光化学照射によりタンパク質結合部位内で反応種 に形質転換でき、従ってタンパク質の結合部位内で特異的に活性化され得る利点 をもつ。その他のい（つかの反応性化学官能基も適当である。ジアゾニウム基は 、チロシンのフェノール側鎖と特異的に反応する。エポキシド基は一般アミン（ リジン）およびカルボキシレート（アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩）を 含む核側鎖と反応する。アルデヒドはリジンの一般アミン側鎖と反応して、シア ノ硼酸水素化ナトリウムで還元され得るシッフ塩基中間体を形成する。トリウム 標ｍＮａｃＮＢ３Ｈｓを使用すると、トリチウムの取り込みがもたらされ、標識 づけされたタンパク質の特徴づけが容易になる。最後にα−ブロモケト〉′は、 汎用の親和標識試薬である。その反応性は十分に低速であるため、これらの試薬 はタンパク質をその結合部位においてほぼ化学量論的に標識づけすることができ る。さらに、α−ブロモケトンはカルボキシレート、−級アミン（リジン）、イ ミダゾール（ヒスチジン）およびフェノール（チロシン）を含む数多くの核性側 鎖と反応する。 リポータ分子を付着した形で宵する本発明のポリペプチドは、生物学的なおよび その他の試料における分析物のための検定を実施する上で役立つ。一般に、これ らの検定はポリペプチドの標的配位子の存在を検定するために役立つ。すなわち 、分析物は標的配位子となるのである。試料内の標的配位子の存在は、リポータ 分子により与えられるシグナル内に見られた変化、つまり通常はりボーク分子と 、結合された標的配位子の間の相互作用により引き起こされたシグナルの強度の 減少に基づいて検出でき、オプションとして定量することもできる。従って、観 察されたシグナルは、試料内に存在する標的配位子の濃度または量に反比例する ことになる。特異的システムにおいては、望まれる分析物を定量的にまたは半定 量的に測定するためシグナルを較正することができる。 本発明の化合物は、それらが非競合性の相同検定の実施を可能にするという点で 、特に有利である。ポリペプチドは標的配位子と直接結合し標的配位子の濃度に 反比例するシグナルを提供できることから、いかなる配位子変位も必要でない。 さらに、シグナルの調節は試料培地の中で達成できるため、いかなる分離段階も 必要とされない。 本発明は同様に、検定の実施においる第２の結合システムの使用を可能にする。 中間結合種例えばビオチン、ハブテン等を結合部位近くでポリペプチドに付着さ せることにより、リポータ分子は中間結合種例えばアビジンに対し特異的な結合 タンパク質またはハブテンに対し特異的な抗体を通して、システムに導入され得 る。従って、ビオチンおよびハブテンが本発明の目的のためにはリポータ分子と 考えられている。 化学療法剤を付着した形で有している本発明に基づくポリペプチドは、ヒトおよ びその他の動物の治療的処置を提供する上で役立つ。特に、新生細胞が通常腫瘍 抗原に対して指向された抗体を通してポリペプチドの特異的付着を可能とする開 存（ユニーク）の腫瘍抗原によって特徴づけされているようなさまざまな形の癌 を治療するのに、細胞毒素に結合されたポリペプチドを用いることができる。 付加的にには、抗生物質といった適切な殺菌剤に結合された細菌に対し特異的な 抗体によって細菌感染を治療することが可能である。 化学療法剤を結合された形で有している本発明に基づ（ポリペプチドは、ヒトお よびその他の動物に対して投与するための従来の薬剤処方の中に取入れることが できる。このような薬学化合物は、適当な薬学的に有効な担体の中に治療的用量 のポリペプチドを含んでいなくてはならない。薬学的担体は、患者に対しポリペ プチドを運搬（デリバリ）するのに適したいがなる相客性ある非毒性物質であっ てもよい。担体としては、無菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固 体を用いることができる。薬学的に受容できるアジュバント（補助剤）、緩衝剤 、分散剤等も同様に、本発明の薬剤組成物の中に取り込むことができる。このよ うな薬剤組成物は本発明に従った単一のポリペプチドを含んでいてもよいし、或 はまた２以上のこのようなポリペプチドを含んでいてもよい。付加的には、その 他の治療的に活性の成分が含まれていてもよい。異なる特異性および／または異 なる治療作用を有する２つ以上のポリペプチドおよび／または活性成分を含むこ のような「カクテル」は、さまざまな状況の下で有利であり得る。 本発明に基づく薬剤組成物は、経口投与または非経口投与特に皮下、筋向および 静脈内注射を含む非経口投与のために適している。箱内注射のための標準的な薬 剤組成物は、１１の無菌緩衝水とＳｏＩｌｇの本発明に基づ（ポリペプチド組成 物を含む。静脈内注射および誘拐のための標準的組成物は、約２５０ｍ１の無菌 リンゲル液と１５０讃ｇのモノクローナル抗体を含む。非経口投与できる組成物 を調製するための現行の方法は当業者にとって既知のものであり、特許、医学文 献および科学文献に十分に記述されている。特にＲｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学、第 １５版、Ｍａｅｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　 Ｐｅｎ５ｙｌｖａｎｉａ　（１１８０）を参照されたい。なお、その開示内容は 本書中に参考として内含されている。本発明に基づくポリペプチドは、貯蔵のた め凍結乾燥させることができ、使用前に適切な担体中で再構成される。この技術 は、さまさざまな抗体およびその他のタンパク質について有効であることが立証 されている。当業者であれば、凍結乾燥および再構成は程度が可変的な抗体の活 性損失をもたらし得ること、および薬剤組成物中の抗体またはその他のポリペプ チドの量はこのような損失を補償するよう調整されなくてはならない可能性があ ることがわかることだろう。 以下の実施例は、制限的な意味をもたない一例として提供されるものである。 Ｌ狡 １、　・　いた　に・　る゛　の 以下の研究は、５ｘｉｏ’から１０”Ｍ−’の結合定数で置換２．４−ジニトロ フェニル（ＤＮＰ）配位子を結合するＩｇＡ　ＭＯＰＣ３１５について実施され た［Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ他著（１９７４）、　Ｂｉｏｃｈｅ■１ｓｔｒｙ　（生 化学）コ。三次元構造は利用不可能であるものの、抗体結合部は、分光法（紫外 線、蛍光光度法、ＮＭＲ）　、化学的変性および可変的領域のアミノ酸配列決定 によって特徴づけされた。さらに、変化する構造の試薬についての早期親和１識 づけ研究［ＧｉｖｏｌおよびＷｉｌｅｂｅｃｈ（１９７７）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｔ ｙ、４６：４７９；Ｇｉｖｏｌ他著（１９７１）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １０：３４６１；および５ｔｒａｕｓｂａｕｃｈ他（１９７１）Ｂｉｏｅｈｅｍ ｊｓｔｒｙ　ＩＱ：４３４２］は結合部の近辺に数多くの反応性アミノ酸側鎖を 規定した。 図１に示すように、ＭＯＰＣ３１５結合部に特異的な親和標識内に開裂可能な鎖 を取り込ませた。これらの親和標識試薬は、開裂可能なジスルフィドまたはチオ フェニル連鎖を介して電子性アルデヒドまたはα−ブロモケトン基に連鎖された ＤＮＰ基を含んでいる。抗体に対する標識の共有結合とそれに続く架橋の開裂お よび：ｉＩｌ離配位子の除去は、抗体結合物内への遊離チオールの部位特異的取 り込みといった結果をもたらす。親和性標識試薬上−１の幾何形状は請求核リジ ン、ヒスチジン、またはチロシンの側鎖の位置が正確に判っていないことから、 ＤＮＰ基と電子性部分の間の距離に関して変化する。親和性標識上−１の合成は 図２に概略的に示されており、以下に詳述されている。 （Ｎ−２，４−ジニトロフェニル）−２−アミ／エチル２−（１，３−ジオ牛ソ ラニル）−エチルジスルフィド６゜ 親和標識上および２Ｇ以下のように調製した：　トリエチルアミン（５０ミリ） を伴うジメチルホルムアミド（２００■ｌ）中のＮ、　Ｎ’−ビス−（２，４− ジニトロフェニル）−シスタミｙ　［Ｃｈｅｎ他著（１９〕９）　Ｐｈｏｓｐｏ ｒｏｕｓ　５ｕｌｆｕｒ　（燐硫黄）７：４１］　（４，８４ｇ、　１０ミリモ ル）の＠濁液に対して、２−（２−メルカプトエチル−１，３−ジオキソオラン （２，４５ｇ。 １８ミリモル）を加え、混合物を６０℃で２４時間撹拌した。過酸化水素（３０ ％溶液２ｍ１）を加え、ジメチルホルムアミドを真空下で除去した。 残留油は、塩化メチレン（１００■ｌ）で溶解した。塩化メチレンの層を水（３ ×５１）で洗浄し、Ｍｇ５Ｏａ上で乾燥させ、油になるまで真空下で濃縮した。 ３：２のヘキサン：酢酸エチル（Ｒｆ−０，３１）での７リカゲルカラムクロマ トグラフイーにより、オレンジ色の油として６　（１，３７ｇ、３．６５ミリモ ル、２０％）得られた。ｌ１ｌ（薄膜）　：３３５３、２９２３．　１６２３． １５２５．１３４２．１１３８　ａｍ−’；　’Ｈ−ＮＭＲ，ＣＤＣ１ａ：δ２ ．０８（ｍ、２Ｂ）、　２．１１Q （ｔ、２１（、Ｊ＝７．１１１ｚ）、　３．００（ｔ、２Ｈ１Ｊ＝６．６Ｈｚ） 、　３．８−４．０（ｌ６ｌ）、　４．９５（ｔ、ｌ■、　i＝４．３Ｈｚ）。 ７．００（ｄ、ｌ［１，ｌ１ｌ９．５Ｈｚ）、　８．３０（ｄ、１Ｂｊ＝９．６ Ｈｚ）、　８．８０（ｓ、１Ｂ＞、　９．１６（ｄ、１Ｂ、i＝２．６Ｈｚ）； 質量スペクトル（Ｅｌ）３７５（Ｍ＋）。Ｃｌ　３１１１　ｒｏｓｉ６ｓｔにつ いて計算上の分析値（Ａｎａｌ。 Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，４１，６０；　Ｈ，４，５３；　Ｎ、１１．２０；　Ｓ 、１７．０７゜実測値：　Ｃ，４１，５？、　Ｈ，４，６７G　Ｎ。 １１．１０．Ｓ、１６．９９゜ （Ｎ−２，４−ジニトロフェニル）−２−アミノエチル３−オキソプロピル　ジ スルフィド上水（２ｍｌ）　、アセトニトリル（２ｍｌ）および酢酸（８１）中 のジオキソラン６（０，５０ｇ、１．３３ミリモル）の溶液を２０時間還流で加 熱した。この時点で、混合物を連星にまで冷却し、低温飽和水性ＮａＨＣＯａ　 １５０ｍ１にゆっくりと加えた。水性層を塩化メチレン（３ｘ５０ｍｌ）から抽 出した。合せた抽出物をＭｇ５ｏａ上で乾燥させ、オレンジ色の油になるまで真 空下で濃縮した。ヘキサン内の３０〜４０％の酢酸エチルの勾配を用いたシリカ ゲルクロマトグラフィーによりオレンジ色の半固体として上（０，３０ｇ、　０ ．９１ミリモル、６８％〉が得られた。３：２のヘキサン：酢酸エチル中Ｒｆ− ０，２２：　ＩＲ（ＫＢｒペレｙ　ト）３３５３．１７２２．１６２３．１５２ ５．１５０４．１４２ｇ、　１３４２．１１３１ａｍ−’；　’！１−ＮＭＲ， ＣＤＣｌ５：　δ２．９０−３．０４（ｌ６ｌ）、３．７９（ｔ、２Ｈ，ｌ１ｌ ６．５Ｈｚ）、７．０１（ｄA１［１，Ｊ− ９，５Ｈ２）、８．３１（ｄ、ＩＨ，Ｊ−９，５Ｈｚ）、　８．８０（ｍ、ＩＨ ）、　９．１５（ｄ、！Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、　９．８３iｓ、ＩＨ）； 質量スペクトル（Ｅｌ）３３１（Ｍ＋）。ＣＩＩＨ＋　３Ｎ３０５Ｓ２について 計算上の分析値（Ａｎａｌ。 Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，３９，８８；■、３．９３；　Ｎ、１２．８９：　Ｓ、 １９Ｊ４．実測値：　Ｃ１４０，０１，［１，３，９１；　m。 １２．６６、　Ｓ、１９．３４゜ （Ｎ−２，４−ジニトロフェニル）−２−アミノエチル３−（１，３−ジオ牛ソ ラニル）−プロピルジスルフィドＬ。 この化合物は、Ｎ、　Ｎ’−ビス−（２，４−ジニトロフェニル）−ンスタミン （２，４２ｇ。 ５ミリモル）および３−（３−メルカプトプロピル）−１，３−ジオキソオラン （１，４８ｇ、　１０ミリモル）から出発して、ｉについて前述した通りに調整 し、オレンジ色の油として７　（０，６０ｇ、　１．５４ミリモル、１５％）が 得られた。３・２のへ牛サン：酢酸エチル中Ｒｆ−０，４３：　ＩＲ（薄膜）　 ３３６０．２９２３．１６２３．１５９２．１５２１１．１４２６．１３３５． １１３１　ｃｍ−’；ＩＩ−ＮＭＲ，ＣＤＣｈ：　δ１．８０−１．９５（ｍ、 ６Ｈ）、　２．７８（ｔ、２＋１．Ｊ−７，０Ｈｚ＞、２．９９（ｔ、２Ｈ，Ｊ −U，７１１ｚ） 、３．８−４．０（ｍ、６１１）、４．８７（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）、フ 、０１．（ｄ、Ｉｌｌ、Ｊ−９，５Ｈｚ）、８．３２（ｄ、P［１，Ｊ− ９，５Ｈｚ）、　！１．７９（ｓ、１１１）、　９．１６（ｄ、１■、Ｊ＝２． ６Ｈｚ）　；質量スペクトル（Ｅｌ）３ｇ９（Ｍ＋）、　３W＋１゜ ３５９、２９４．２７９．２５６．２２５．２１０．１９６゜Ｃｌ　ａＬ　９Ｎ ３０８Ｓ２について計算上の分析値（Ａｎａｌ。 Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，４３，１９；　Ｈ，４，８８：　Ｎ、１０．８０；　Ｓ 、１６．４５゜実測値：　Ｃ，４３，２７：　［＋、４．６T；　Ｎ。 １０．７９．　Ｓ、１６．４０゜ 前述したとおりに調製され、オレンジ色の固体として２　（３４０ｍｇ、　０． ９９ミリモル、９９％）が得られた。＋＋ｐ（融点）　６４−６５°Ｃ；　３： ２（Ｄへ牛サン：酢酸エチル中Ｒｆ＝０．２５；ＩＲ（ＫＢｒへＬ／　ソト）　 ３３３１．　３０９２．　２９２３．　２８４６．　１７２２．　１６３０．　 １５ｇ９．　１５２５．　１S１５゜ １３４２、１２４７．１１４６　ａｍ−’；　’Ｈ−ＮＭＲ，ＣＤＣｌ５：δ２ ．０６（ｔ、２１１．Ｊ＝７．３Ｈ２）、　２．６３（ｔ、QＨ，Ｊ＝ ７．０Ｈｚ）、２．７５（ｔ、２＋１．Ｊ＝７．１Ｈｚ＞、３．００（ｔ、２） １．Ｊ−６，６Ｈｚ）、３．８１（ｔ、２Ｈ，Ｊ−６，１Ｈ噤j。 ７、０１　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ−９，５■ｚ）、　８Ｊｌ（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝９．５ Ｈｚ）、　８．７９（ｓ、ＩＨ）、　９．１６（ｄ、ＩＨ，i１１２．６［１ｚ ）。 ９、８０（ｓ、　ＩＨ）　；質量ｘ　ヘク）　ル（Ｅ　Ｉ　）３４５　（Ｍ＋） 。Ｃｌ２ＨＩＳＮ３０Ｓｓ２１．：ライフ計算上の分析値（Ａｎａｌ、　Ｃａ１ ｃｄ、）：　Ｃ，４１，７４；■、４．３５；　Ｎ、１２．１７：　Ｓ、１ｇ、 ５５゜実測値：　Ｃ，４１，７１，P＋。 ４Ｊ８．　Ｎ、１２．１１．　Ｓ、１８．４９゜親和標識１、工およびｌは以下 のようにして調製した。：３−＜５−ＤＮＰ）−メルカプトプロピオン酸ｌ。 ２、０Ｍの水性酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）　７０ｍ１の３−メルカプトプロ ピオン酸＜１．ｓ９ｇ、１５ミリモル）の溶液に対して、窒素下で室温にて撹拌 しながら１５分間５ｏＩＩｌの無水エタノール中の２．４−二トロフルオ口ベン ゼン（３，３２ｇ、　１８．０　ミリモル）の溶液を加えた。２４時間後、薄黄 色の固体沈澱物を収集し、水で洗ってｌを得た。（３，４０ｇ。 １２．５ミリモル、８３％）　；　ｓｐ、１５４．５−１５７．５’Ｃ；　ＩＲ （ＫＢｒ）　３６３０．　３４７６（Ｂｒ）、３１１３、３０８２．　１？１８ ．１５８９．１５１１．１３４４．１０５５．９２２　ａｍ−’；　’トＮＭＲ （アセトン−ｄａ）：　６２．７１（ｔ、２■、Ｊ＝７．５１１ｚ）、　３．４ ０（ｔ、２１１．Ｊ＝７．５！１ｚ）、　３．４０（ｔ、２■、Ｊ＝７．４Ｈｚ ）、　R．４０（ｓ、ｌＢ）。 ７．８７（ｄ、ＩＨ，Ｊ−９，ＩＲ２）、　８．３２（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ−２，５ ，９，０［１ｚ）、　８．７６（ｄ、ｌＢ、Ｊ−２，５ＨｌпF質量ス ペクトル（ＦＡＢ−）２７１（Ｍ−１１）−、２４９，１９９，１８３，１４１ ，１１３，１０９゜　Ｃ９Ｈ１ｌＮ２０６Ｓにッｌ＋’て計算上の分析値（Ａｎ ａｌ、　Ｃａ１ｃｄ、）：　ＣＪ９．７１；　Ｈ，２，９６；　Ｎ、１０．２９ ；　Ｓ、１１．７８゜実測値。 Ｃ，３９，９２；　Ｈ，２，９６，Ｎ、１０．１５；　Ｓ、１１．６４゜乾燥ジ オキサン（１０ｍ１　）内の８　（０，７０ｇ、　２．５ミリモル）の溶液に対 して、塩化チオニル（Ｓｍｌ）を加えた。混合物を窒素下で１２時間撹拌した。 真空下で揮発性物質を除去し、黄色の残゛渣を乾燥ジオキサン（２５ｓｌ）中に 溶解させた。ジエチルエーテル（２５ｓｌ）のジアゾメタン（ｏ、６りの溶液を 加えた。混合物を０℃で４時間撹拌し、その後、真空下で揮発性物質を除去した 。９：１の塩化メチレン：酢酸エチルを溶離液として用いたシリカゲルクロマト グラフィーにより残渣を純化し、黄色の固体として９　（０，２９ｇ、０．９２ ミリモル、３６％）を得た。ｍｐ　１１７−１１９℃；　上記溶１１１液中Ｒｆ 富０．５２；　ＩＲ（ＫＢｒペレット）　３４５８（Ｂｒ）、　３０９０．２１ １１．１６３７．１５８３．　１５０８゜１３４０、　１０９６　ｃｍ−’：　 ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：　δ２．７５（ｔ、　２Ｈ，Ｊ＝７．１［Ｉｚ） 、３．３５（ｔ、　２h１．　Ｊ＝７．３［１ｚ） 、５．３２（ｓ、ＩＨ）、７．６１（ｄ、１■、Ｊ−９，０１１２）、８．４８ （ｄｄ、ｌ［１，Ｊ−２，５，９，０Ｈｚ）、９．０７（ｄAｌＩ！。 Ｊ＝２．５　Ｈｚ）；質量スペクトル（ＦＡＢ−）２９６（Ｍ−）、　１９９． １８３．１４１．　１０９゜　Ｃｌ１ｌ■５Ｎ４０５ｓについて計算上の分析値 （Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，４０，５４；　Ｈ，２，７２；　Ｎ、１ ８．９１；　Ｓ、１０．８２゜実測値：　Ｃ，４０，８１：　Ｈ，２，８９；　 Ｎ、１８．５９；　Ｓ、１０．７９゜ｌ−ブロモ−２−オキソ−４−（Ｓ−ＤＮ Ｐ）−メルカプトブタン１窒素下２５℃で乾燥ジオキサン（５寵ｌ）中の９　（ ９５＋ａｇ、０．３２　ミリモル）の溶液に、ジオキサン（２１）中のＨＢｒの 飽和溶液を加えた混合物を１０分間撹拌させ、この時点で真空内で揮発性物質を 完全に除去し、黄色の固体として純粋な３（１３０園ｇ、０Ｊ７３ミリモル、８ ６％）を得た。ｕｐ　９９−１０１”Ｃ；　９：ｌの塩化メチレン：酢酸エチル 中Ｒｆ＝０．７８；　ＩＲ（ＫＢｒベレット）　３１０６．３０９７．３０１２ ．２９５８．１７２４．１５９２゜１５１０、１３３９．１０６８．１０５３　 ｃ＋＊−’；　’トＮＭＲ（アセトン−ｄａ）：　δ３．２４（ｔ、２Ｈ，Ｊｓ ７．０１１ｚ）B ３．４６（ｔ、２Ｈ，Ｊ１１７．０Ｈｚ）、　４．２８（ｓ、２［１）、７．９ ８（ｄ、ＩＨｊ！９．０Ｈｚ）、　８．４８（ｄｄ、１Ｈｊ|２，５゜ ９、０１１２）　；質量スペクトル（ＦＡＢ−）２＋１６（Ｍ−ＨＢｒ）−，２ ３３，１９９，１８３，１０９ｏ　Ｃｌ＊ＨｅＢｒＮ２０ｓr について計算上の分析値（Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，３４，４０：　 Ｈ，２，６０；　Ｂｒ、２２．８９：　Ｎ、８．０２；Ｓ、９．１８゜実測値： 　Ｃ，３４，５０；　Ｈ，２，６０；　Ｂｒ、２２．７０ＨＮ、７．８８；　Ｓ 、９．０４゜４−（Ｓ−ＤＮＰ）−メルカプト酪酸上ｌこの化合物は、４−メル カプト酪酸（１，８０ｇ、　ｉｓミリモル）で出発して、ｌについて前述した要 領で調製され、薄黄色の固体として上０　（３，２１ｇ、　１１．０９モル、７ ５％）が得られた。ｍｐ　１２６．５−１３０℃；ＩＲ（にＢｒペレット）　３ ５２８（ｂｒ）、　３１１７．３０９０゜２９４８、　１７０９．　１５８７． 　１５１８．　１３４１　ｃｍ−’：　’！１−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ）：　 δ　１．８５（嘗、２P１）、２．３４ （ｔ、２８．Ｊ＝７．０）Ｉｚ）、３．１８（ｔ、２Ｈ，Ｊ−７，５［１ｚ）、 ３．７８（ｓ、ＩＨ）、　７．９５（ｄ、ｉｌｌ、Ｊ！９．PＨｚ）。 ８．４１（ｄｄ、１Ｂ、Ｊ−２，５，９，０１１２）、　８．８４（ｄ、ＩＨｊ −２，４Ｈ２）　；質量スペクトル（ＦＡＢ−）２８５（Ｍ−ＥＴ）−、２４９ ，１９９，１３９゜Ｃ１１１１１１＠Ｎ２０８Ｓについて計算上の分析値（Ａｎ ａｌ、　Ｃａ１ｅｄ、）：Ｃ。 ４１．９８．　Ｈ，３，５２，Ｎ、９．７９．　Ｓ、１１．２０゜実測値　Ｃ， ４１，９４：　［ｌＪ、５０．　Ｎ、９．６０．　Ｓ、１０D９７゜ １−ジアゾ−２−オキソ−４−（Ｓ−ＤＮＰ）−メルカプトペンタンＬ上この化 合物は、Ｊｌ　（１，ＯＯｇ　３．４９　ミリモル）で出発してｌについて前述 した要領で調整され、黄色の固体としてＬ±（ｏ、ａａｇ、　ｚ、ｚｏミリモル 、６３％）が得られた。 ｍｐ　８４−８６℃：９：１の塩化メチレン：酢酸エチル中Ｒｆ□０．５２；　 ＩＲ（ＩｆＢｒベレット）３１０６、２９３９．２８６６、２１０４．１６２６ ．１５ｇ９．１５１３．１３４３　ａｓ−’；　’■−ＮＭＲ（ＣＤＣ１ａ）　 ＋　６２．１０（ｍ、２Ｂ）、　２．５５（ｔ、２Ｈ，Ｊ−５，７Ｈｚ）、　３ ．１０（ｔ、２Ｈ，Ｊ１１７．５［１ｚ）、　５．２９（ｓ、ＩＨj、７．７４ （ｄ。 ＬＨ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、　８．３８（ｄｄ、ｌＨ，Ｊ−２，５，９，０Ｈｚ） 、　９．ｏ６（ｄ、１８．Ｊ−２，４Ｈｚ）　；質量スペクgル （ＦＡＢ−）３１０（Ｍ）−、２４９，１９９，１３９，１０？。ＣｕＨ＋＠Ｎ ｔ０５Ｓについて計算上の分析値（Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｅｄ、）：　Ｃ，４２， ５８：　Ｈ，３，２５；　Ｎ、１８．０６：　Ｓ、１０．３３゜実測値：　Ｃ， ４２，７９，g。 ３Ｊ９．　Ｎ、１７．９３．　Ｓ、１０．１４゜１−ブロモ−２−オ牛ソー５− （ｓ−ＤＮＰ）−メルカプトペンタン土この化合物は、＋　１　（１０１１ｇ、 　０Ｊ２６ミリモル）で出発して主について前述した要領で調製され、黄色の固 体として４　（１１６ｍｇ、　０．３２４リモル、９８％）が得られた：　ｍｐ 　８？−９０℃、９：１の塩化メチレン：酢酸エチル中Ｒｒ！０．７８；　ＩＲ （ＫＢｒ＞　３１１３．３００９、２９５３．１？２３．１５９２．１５１２． １３４３　ｅ＋＊−’；　’＋１−ＮＭＲ（ＤＳＭＯ−ｄｏ）δ　１．８９　（ ｔ　２Ｈ）。 ２．７９　（ｔ、２１　Ｊ！７．１　Ｈｚ）、３．１７　（ｔ、２■、Ｊ−７， ４Ｈｚ）、４．３６　Ｃ８，２１１）、７．８８　（ｄ。 ＩＨ，Ｊ＝９．１　Ｈｚ）、　８．４３　（ｄｄ、　ＩＨＪｌ＋２．５．９．０ 　Ｈｚ）、　８．８５　（ｄ、　ＩＬ　Ｊ＝２．６　Ｈｚ）G Ｃ＋２＋３ＢｒＮ２０５Ｓについての計算上の分析値：　Ｃ９３６，３８；■、 　３．０５：　Ｂｒ、　２．００；　Ｎ。 ７．７１：　Ｓ、　８．８３．実測値：　Ｃ，３８，５７；　Ｈ，３，１７；　 Ｂｒ、　２１．８３；　Ｎ、　７．４９；　Ｓ、　９．０１K ５−（Ｓ−ＤＮＰ）−メルカプト吉草酸１主この化合物は、４−メルカプト吉草 酸（２，００ｇ、　ｉｓミリモル）で出発してｌについて前述した要領で調製さ れ、薄黄色の固体として１２　（４，２０ｇ、　１４．０ミリモル、９３％）が 得られた：　ｍｐ　１５９−１８１’Ｃ；　ＩＲ（ＫＢｒ）　３１１７．２９４ ８．　（ｂｒ）、　１７０７．１５８７゜１５８？、１５１７．　１３４１　ａ ｍ−’；　’Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄｏ）δ　１．８３（＋＊、４Ｈ）、２． ３９　（ｔ、２Ｈ。 ＪＩＩ６．８　Ｈｚ）、　２．８３　（ｓ、　ＩＨ）　３．２６　（ｔ、２＋１ ．　ＪＩｌｌ、ＯＨ２）、　７．９５　（ｄ、　ＩＨ１Ｊ＝X．Ｏ１ｌｚ）。 ８．４５　（ｄｄ、　１８　Ｊ１１２．５．９．０　Ｈｚ）、　８．９６　（ｄ 、ｉｌｌ、Ｊ＝２．５　Ｈｚ）；質量スペクトル（ＦＡＢ−）　２９９　（Ｍ− Ｈ）−、１９９，１８３，１４１，１１，３，１０９，Ｃ＋＋ＨｔａＮ２０ａＳ についての計算上の分析値・Ｃ，４４，００，Ｈ９４，０３；　Ｎ、９．３３； 　Ｓ、　１０Ｊ８゜実測値：　Ｃ，４３，８３，１１，３，９２，Ｎ、９．４２ ；　Ｓ、１０．５９゜ ■−ジアゾー２−オキソ−６−（Ｓ−ＤＮＰ）−メルカプトヘキサンＬ１この化 合物は、ｌ　２　（１，００ｇ、　３．３３ミＩＪモル）で出発してｌについて 前述した要領で調製され、黄色の固体として１３　（０，７０ｇ、　２．１５ミ リモル、６５％）が得られた：　ｉｐ　１．２０−１２２℃：９：１の塩化メチ レン：酢酸エチル中Ｒｒ−Ｑ、５０；　ＩＲ（ｌ（Ｂｒ）　３０９３゜２９３７ 、　２１１０．　１６３７．　１５ｇ４．　１５０８．　１３３６．　１１０９ 　Ｃｍ−’；　’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）６１．W３（簡。 ４Ｈ）、２．３９　（ｔ、２Ｂ、Ｊ冨５．８　１１ｚ）、３．０４　（ｔ、２Ｈ ，Ｊ＝７．４　Ｈｚ＞、５．２５　（ｓ、ＩＨ）、７．５３（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝ ９．０　Ｈｚ）、　８．３７　（ｄｄ、　１１　Ｊ＝２．５．９．０　［１ｚ） 、　９．０７　（ｄ、　１Ｂ、　Ｊ１１Q．５　Ｈｚ）； 質量スペクトラム（ＦＡＢ−）　３２４．３０７．２６？、　１９９．１８３． １４１．１０９゜Ｃｌ２Ｈ１２ＮａＯ６Ｓについての計算上の分析値　Ｃ，４４ ，４４；　Ｈ，３，７３，Ｎ、　１７．２ｇ、　Ｓ、　９．８９゜実測値：Ｃ１ ４４，６０；　Ｈ，３，７４；　Ｎ、　１６．９９．　Ｓ、　９．６５゜ｌ−ブ ロモ−２−オキソ−６−（Ｓ−ＤＮＰ）−メルカプトヘキサン１コノ化合物は、 上３　（１１９ｍｇ、０．３６８℃リモル）から出発して、主について前述した 要領で調製され、黄色の固体として５　（０，１２７ｇ、　０．３６６ミリモル 、９２％）が得られた：　、ｐ　８０−８３℃：９・１の塩化メチレン：酢酸エ チル中Ｒｒ雪０．７８；　ＩＲｆｌＢｒ）　３１２１、　２９３７．　２８７２ ．　１？１９．　１５８６．　１５１３．１３３９．１０９５．　１０５３．　 Ｉｎ−ＮＭＲ（アセトン−ｄａ）U １．８１　（ｍ、　４Ｈ）、　２．７９　（ｔ、　２１１．　Ｊ−６，６Ｈｚ） 、　３．２４　（ｔ、　２１１．　Ｊｌ１８．８　Ｈｚ）、@４．１８　（ｓ。 ２１１）、　７．９３　（ｄ、　ｉｌｌ、　Ｊ−９，０Ｈｚ）、　８．４５　（ ｄｄ、　ＩＨＪ−２，５，９，０Ｈｚ）、　８．９５　（ｄA　１Ｂ。 Ｊｌ１２．５　Ｈｚ）；質量スペクトル（ＦＡＢ−）　３７！ｌ　（Ｍ−）、３ ０７．２６３．１９９．１１１３．１４１．１０９゜Ｃ＋２８＋３ＢｒＮ２０５ Ｓについての計算上の分析値：　Ｃ１３＋１．２１；　Ｈ，３，４１：　Ｂｒ、 ２１．１８；　Ｎ。 ？、４３．　Ｓ、８．５０゜実測値：　ＣＪ８．４０；　１１．３．４５；　Ｂ ｒ、２１．３４；　Ｎ、７．３４；　Ｓ、８．４６゜区旦塩腹 １・　アフィニティラベリング ＭＯＰＣ３１５の結合部位内にチオールを導入するための戦略は図３に概略的に 説明されている。これらの工程は、還元されアルキル化されたＩｇＡをパパイン で処理しその後ＤＮＰ結合されたセファ０−ス４Ｂ　［Ｇｏｅｔｚｌ　（１９７ ０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９：１２６７］上ののアフィニティクロマト グラフィーに付することによって生成されたＦａｂフラグメントを用いて実施さ れた。Ｆａｂフラグメント（１０ｇＭ）を１．５当量のアルデヒド】または２の いずれかで１時間処理し、その後０．２Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）中の ７．５当量のＮａＣＮＢＨ３で２０時間３７℃で処理するかあるいはまたは０． １Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０）中の１．３当量のα−ブロモケトン、Ｌ ４または１で１６時間３７℃で処理した。両方の場合において、標識づけされた ＦａｂをｐＨ７，３の０．１Ｍの燐酸ナトリウム中のセファデックスＧ−５０上 のクロマトグラフィーにより精製させ、凍結乾燥の後ＤＮＰ結合されたセファロ ース４Ｂ　（Ｇｏｅｔｚｌ上述）上での次のアフィニティクロマトグラフィーに 対して標識づけされたＦａｂを除去した。誘導体合成の程度を分光計により（標 識上および主について、λｍａｘｍ３６０ｎｔｈ　ｅ　１１１２．８００Ｍ−’ ｃｍ−’）　、また付加的に、標識上および主についてＮａＣＮＢｓＨｓからの トリチウムの取り込み（１２＋ｉＣｉ／ミリモルのＮａＣＮＢＨ３を用いて）に より、測定した。標識ｌおよび土の場合、９０％以上の標識が取り込まれた（ア フィニティクロマトグラフィー後、８５％の収量）（表２）。両方の場合におい て、競合的阻害因子ＤＮＰ−グリジン１０時の存在下１０％未満の非特異性標識 づけしか発生しなかった。 表２ Ｆａｂ内への親和標識の取り込み 化合物　標識づけされたＦａｂ％　標識づけされたＦａｂ％（ＤＮＰ−グリシン 無し）　（ＤＮＰ−グリシン有り）−の　および　したＳ−チオピリジル・　の ３７℃で１２時間、２■ＭのＥ　ＤＴＡ％ｐＨ８，０のＯ，ＩＭの燐酸ナトリウ ム中の５０５Ｍジチオトレイトール（２ｍｌ）を用いて、ｌまたは４　（２，０ ■ｇ）で親和標識されたＦａｂを開裂させると、遊離チオールが得られた。２． ２°−ジチオジピリジンの４５ｍＭｍ液（１５ｚのアセトニトリルを含むｐＨ５ ，５の０．１鼠の燐酸ナトリウム内のファルマシアＦＰＬＣカラムを用いる急速 脱塩クロマトグラフィーによってチオールを含むＦａｂを収集した。この混合物 （最終容積ｆｏｗｌ）を１２時間２０℃で反応させ、その後、徹底的な透析によ り過剰２．２°−ジチオピリジンを除去した。１０４のジチオトレイトールでの 開裂後の３４３ｒｖでのチオピリジンの吸収度（＋ｔ７０６０ｍ−’ｃｍ−’） 　（Ｇａｓｓｅｔｉ他（１９６７）　Ａｒｃｈ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　１１９：４１）並びに２８０ｎ＋＊での タンパク質吸収度（Ｅ＠、　Ｉ＋＋”１．３７、ＦａｂについてＭＹ−５０，０ ００）に基づき９０％を越える収量（主の場合６５％の回収）で、チオル化され た抗体を誘導体合成した。 １隻凰血立犬主 ｌまたは土で標識づけされたＦａｂフラグメントを、トリプシン作用による消化 およびペプチド地図作成に付し、チオールの取り込みの選択性を調べた。Ｆａｂ は上述の通り、標識ｌおよびＮａＣＮＢＨ３ｓ　（１２ｍＣｉ／　ミリモル）の 存在する中で、または３ト標識づけされた４　（４冒Ｃ１／　ミリモル）を用い て親和標識させた。３ト標識づけされた土は、３．５−３■−２，４−ジニトロ フルオロベンゼンで出発して、土について記述した要領で調製した。次に標識づ けされたＦａｂ（１，０讃ｇ／ｍｌ）を、８鼠の尿素、０．１Ｍのトリス−■Ｃ １％ｐＨ８，０の中で修飾させ、２０ｍＭのジチオトレイトール（３７℃で１時 間）還元して６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０でアルキル化し、２０ｍＭ のジチオトレイトール（３７℃で１時間）還元し、６０叱のヨードアセタミドで アルキル化した（３７℃で１時間）。７Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、 　ｐａｌ　８．０に対する透析の後、ファルマンアモノ　ＱＦＰＬＣカラム上の 陰イオン交換クロマトグラフィーにより、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を分離し た。この分離は、３０分にわたり、４０＋＊Ｍから２００ｍＭの塩化ナトリウム の線形勾配で、７Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス−１１ｃＩＳｐＨ８，０中で１１ ０璽ｌ／分にて達成した。 左で標識づけされたＦａｂの場合、重鎮は、取り込まれたトリチウムを９５％以 上含んでいることが判った。土で標識づけされたＦａｂの場合、９５％以上のト リチウム標識が軽鎖上にあった。各々の場合において、放射線標識づけされた鎖 を２Ｍの尿素／１００ｍ１ｄの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８，２）に対して透析 させ、次に暗所で３７℃にて０．１ｍＭのＣａＣ１ｚの存在する中でトリプシン （重量比で１：２５のトリプシン：タンパク質）で処理した。８時間後、体積百 分率で１０％の酢酸で反応を消却させた。１．０ｍｌ／分で水中アセトニトリル ０から５０％の７０分線形勾配の逆相ＨＰＬＣにより、放射線標識づけされたペ プチドを精製した（それぞれ水とアセトニトリルに対して０．１％および０．０ ６％を加えた。）。２１４止での吸収度によりペプチドを検出し、１．０■ｌの 間隔で分画を収集し、放射能についてアリコートを係数した（図４）。放射能を 含む分画は、０．７５ｍ１／分で水中２−プロパツール０〜５０％の７０分線形 勾配を用いて再度クロマトグラフィーに付した。水および２−プロパツールには 、それぞれ０．１％および０．０１％のトリフルオロ酢酸が含まれていた。 純粋ペプチドのアミノ酸配列をアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｗｓ）　４７７Ａタンパク質シーケンサ−で決定した。主で標識 づけされたＦａｂから得た重鎮では、検定可能な誘導体合成の全てがロイシン５ ２Ｈ上のものであった。土で標識づけされたＦａｂからの軽鎖では、検出可能な 誘導体合成の全て、チロシン３４Ｌ上にあった。これらの残渣は、ブロモアセチ ル−Ｎ’−ＤＮＰ−エチレンジアミンといった試薬を用いてＧｉｖｉｏｌおよび その仲間［Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ他（１９７２）　Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌｌ ：２３８９］により、標識づけされたものと同じである。 チオール　ム　された　を　いたニスー二土…里触媒およびその他の基で選択的 にチオール化された抗体を修飾することに加えて、チオール自体は適当な気質の チオ開裂における核試薬として作用することができる。それぞれ２または土で標 識づけされたチオール化Ｆａｂとの反応のための基質としては、ＤＮＰを含むエ ステル工土および１５（図５）を選んだ。親和標識ｌ内の開裂可能な連鎖の位置 は、相応する基質り１内のエステルの位置とほぼ同じであり、かくして、チオー ルはエステルを攻撃すべく結合部位内に適切に位置づけされていることになる。 同様に、土で標識づけされたＦａｂ内のチオールは、エステルＬ１を付着するよ う位置づけされていなくてはならない。さらに、これらの基質は蛍光クマリンを 残す基を含んでおり、これらの基はす１モル濃度で容易に検出できる。 オキシ塩化リン（８ｍｌ）中のＮ−ＤＰＮ−３−アミノプロピオン酸（１，２８ ｇ、　５ミリモル）とヒドロキシクマリン（０，８１ｇ、　Ｓミリモル）の混合 物を２時間、窒素下で還流にて加熱した。混合物を室温まで冷却し、６０曽ｌの 冷却水に加えた。褐色固体を濾過し、冷水で洗い、真空下で乾燥させた。アセト ンでの研和により明褐色の固体として１土（０，７９ｇ、　２．０ミリモル、４ ０％）が得られた。ｍｐ（融点）　１５５−１５６℃；　ＩＲ（ＫＢｒベレット ）３３７４．　３１０７．　２３６８．　１フ５０．　１７２２．　１６２４． 　１５３２．　１４２６．　１３４９．　１１５９．　１P２７　ｃｍ−’ ；　’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．１０（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ ）、　３．９０（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、　６．４８iｄ、ＩＨ。 Ｊ１１９．６Ｈｚ）、　７．１７（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、　７．３０（ ｓ、ｌＨ）、　７．３７（６，１［１，Ｊ１１９．７Ｈｚ）A　７．７８（ｄ、 ＩＨ。 Ｊ−８，５Ｈ２）、８．０７（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．２９（ｄ、Ｉ Ｈ，Ｊ−９，６Ｈｚ）、８．８７（ｓ、１Ｂ）、８．９９（香AＩＨ） 、質量スペクトル（ＦＡＢ−）４００（ＭＷ”）−、Ｃ＋ｓＨ＋１ＮｓＯｓにつ いて計算上の分析値（Ａｎａｌ。 Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ，５４，１４；　Ｈ，３，２６；　Ｎ、１０．５３゜実際 検出値・Ｃ１５４，０５，［ＩＪ、２６．　Ｎ、１０．２３K ２．４−ジニトロ安息香酸、７−ヒトワキシクマリンエステル上１２．４−ジニ トロ安息香酸（１，０６ｇ、　５．０ミリモル）および７−ヒドロキシクマリン （０，８１ｇ、　ｓ、ｏミリモル）のオキシ塩化リン（４ｍｌ）中での混合物を 、４０分間硫酸カルシウム乾燥管で還流にて加熱した。混合物を室温まで冷却し 、水（４０ｍｌ）に加えた。褐色の固体を濾過し、冷水で洗い、真空中で乾燥し て、赤褐色固体として上ｓ　ｏ、　３２ｇ　３．７ミリモル、７４％〉を得た。 ｗｐ（融点）　２００−２０５℃；　ＩＲ（ＫＢｒペレ、ト）３１０７、３０５ ７．２３６４．１７３６．１６１９．１５４４．１３４ｇ、　１２４６．１１２ ２　ａｍ−’：　’［１−ＮＭＲ（ＤＭＳn− ｄｓ）　δ　６．５３（ｄ、　ＩＨ，Ｊ−９６Ｈｚ）、　７．３４（ｄｄ、　ｉ ｌｌ、　Ｊ＝２．２．８．５Ｈｚ）、　７．４７（ｄ、　ＩgｌＪ”２．ＩＨ２ ）。 ７．８９（ｄ、ＩＨ１Ｊ＃８．５［１ｚ）、　８．１２（ｄ、ＩＨ，Ｊｌ＝９． ６［１ｚ）、　８．４４（ｄ、ＩＨ，Ｊ４．４Ｈｚ＞、　８D７８（ｄｄ、ｔ［ Ｉ。 Ｊ＝２．２．８．４Ｈ２）、　８．９３（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝２．２Ｈ２）；質量ス ペクトル（Ｅｌ＞３５６　（Ｍ”）、　１９５，１６２゜１３４、１２２゜　Ｃ ＋ｅＨａＮｅＯａについて計算上の分析値（Ａｎａｌ、　Ｃａ１ｃｄ、）：　Ｃ ，５３，９４：　Ｈ。 ２．２６．　Ｎ、７．８６゜実測値　Ｃ，５２，１Ｂ、　Ｈ１２，２９；　Ｎ、 ７．５１０王ｑ七對良定 チオール含有抗体によるＤＮＰクマリンエステル１４および１５の開裂を、１２ ℃テ２４μＭの燐酸ナトリウムの存在下および非存在下で検定した。遊離クマリ ンの放出は蛍光光度法により定量し、３５５止で励起し、４５５ｎ■で発光を測 定した。まず検定に先立ち３０分間Ｓ−チオピリジルＦａｂを検定緩衝液に対し 透析し、チオピリジルＦａｂのアリコート（０，１９＋ＩＩ中０．１５ｍｇ）を ３．８＋＋Ｍのジチオトレイトールで２０℃で還元した。各検定について、チオ ール化されたＦａｂおよびジチオトレイトールの純濃度がそれぞれＯ１μＭおよ び２４μＭとなるように、検定緩衝液（２，９５ｍ１）で、還元されチオール化 されたＦａｂ（１８，８μｌ中１５μｇ）を希釈した。平衡化の後、基質を加え （アセトニトリル中の保存溶液３０μｌ）、蛍光の変化を監視する前に１０秒間 溶液を混合した。抗体の速度は、Ｆａｂがない状態での開裂速度を減算すること により補正した。 ｌで親和標識された抗体は等モルジチオトレイトール内での開裂反応に比べ、６ Ｘ１０’の率だけエステル１土の開裂を加速するものであることがわかった。反 応速度論は、ミカエリス複合体（図６）の形成を相客れるものである。反応に対 する速度定数Ｋｏａｔ及びに、はそれぞれ０．８７分−１および１．２μＭであ る。チオ開裂反応は、６８Ｍのに、でＤＮＰグリシンにより競合的に阻害された 。 ｋｌ　ｋａｓｔ １ｇ＋１＝　Ｉｇ−ｉ　→　Ｉｇ−Ｐ　＋　クマリンに−＋ 未開裂の親和標識抗体およびヨードアセトアミドデアルキル化された抗体のいず れも、チオ開裂反応の速度を背景速度以上に加速しなかった。生成物放出の化学 量論比は、１．０のＦａｂ−ＳＨに対し１．０クマリンに相当する。反応緩衝液 へのヒドロキシルアミンの付加は、多くの回転置換をもたらさなかった。しかし ながら、チオールおよび一般的塩基の両方を標議内に導入することにより触媒シ ステムがもたらされる可能性がある［Ｂｒｕｉｅｅ（１９５９）　Ｊ、　Ａｍ、 　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、　８１：　５４４４および５ｔｒｅｅｔ他（１９８５）Ｊ 、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｅ、　１０７：７６９９］　。興味深いことに、 ブロモケトン土で標識づけされたチオール化Ｆａｂはエステル６．７またはＤＮ Ｐ酢酸塩を加水分解しなかった。蛍光消光実験は、おそらくは抗体結合部（図７ ）の立体的障害の結果として誘導体合成Ｆａｂが顕著な親和力で基質に結合しな かったということを明らかにした。 ゛プローブでの　ム チオール化されたＦａｂをリポータ分子で更に誘導体合成できるということを立 証するために、ジスルフィド交換反応（図３）を介してＮ−フルオレセインチオ ウレイド−２−メルカプトエチルアミン［Ｚａｃｋｅｒｍａｎ他（１９８７）　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ。 １５：５３０５］を選択的に導入した。２　（ｐＨ７４の０．１Ｍの燐酸ナトリ ウム０．５０ｍ１中９．０ｎＭ）で標識づけされたＳ−チオピリジルＦａｂを２ ３℃でＮ−フルオレセインチオウレイド−２−メルカプトエチルアミン（１０％ のアセトニトリルを含むｐＨ７，５のＯ，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム０， ５０中５２ｎＭ）で処理した。この反応は３４３　ｎ＋＊でチオピリドンの放出 により監視した（Ｇｒａｓｓｅｔｔｌ及びＭｕｒｒａｙ著（１９６７）Ａｒｃｈ 、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏｐｙｓ、　１１９：４１］。３時間後、付加的なチ オピリドンは全く放出されず、混合物を検定緩衝液（ＳｏｄのＮａＣ１，ｐＨ７ ，０）に対して徹底的に透析させた。結果として得られた付加体を、９０％を越 える蛍光体取り込みで８４％の全体収量で単離した。 １立直光級含檎主 フルオレセイン−Ｐａｂ付加体に配位体ＤＮＰＮグーシンを付加すると結果とし て蛍光の減少がみられ、配位体結合（図７）の直接検定を提供した。蛍光消光実 験を、励起のため４９２ｎｍを用いて５２１ｎｍで発光を測定して１０℃で行っ た。フルオレセイン−Ｆａｂ付加体を、検定緩衝液（５０鶴のＮａＣｌ、　５軸 Ｍの燐酸ナトリウム、ｐ［１７，ｏ）で０．１０μＭまで希釈した。２．４−Ｄ ＮＰ−グリシンのアリコートを加え、混合した後、蛍光を観察した。フルオレセ イン−Ｆａｂ付加体に対するＤＮＰ−グリシンの結合定数は、３、　Ｏｘ　１０ ５Ｍ−１であることが測定された。これは２．　Ｏｘ　ｔ０５Ｍ−’という誘導 体合成されていないＭＯＰＣ３１５に対するＤＮＰ−グリシンのＫＡとほぼ同じ である。１当量の遊離Ｎ−フルオレセインチオウレイド−２−メルカプトエチル アミン及び誘導体合成されていないＦａｂ　（各々０．１０μＭ）の溶液に対す るＤＮＰ−グリシンの付加は検出可能な蛍光変化を全くもたらさなかった（図７ ）。 上述の発明は、理解しやすいように図および例を用いである程度詳細に説明され てきたが、添付のクレームの範囲内である程度の修飾および修正を加えることが できるということは明白である。 ０・１．２ ｎ・ｌ、２．３ ＦＩＧ、　Ｉ。 ＦＩＧ、　３゜ ＦＩＧ　４゜ ＦＩＧ、−５゜ ｍＮＦＬり゛°ルン人λ力可 ＦＩＧ−７゜ 国際調査報告 ＫＴ／ＵＳ８９１０５２５７ ＥＸＴＲＡ　５ＨＥＥＴ　＃１ ＰＣｒ／ＵＳ８９１０５２５７ Ｄｅｔａｉｌｅｄ　Ｒｅａｓｏｍ　Ｅａｔ　ｋｉｄ釦　Ｌａｃｋ　ｏｆ　ｔｌｎ ｉｔ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ＋ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　４８　 ａｎｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｕｂｓｅｉｔｕｔｉｏｎｓ　ａｎｄｌｏｒ　ａｄｄｉ ！１ｍ５ｔｈａｔ　ｒｅｐｒｅｓａｎｔ　ｄｉｓｅｉｒｌｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ 　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｔ’ｒ＊@ｎａｔｕ ｒｅ ｏｆ　ｔｈｅ　５ｉｄａ−ｃｈａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｃ Ｌｓ。 Ｋゴ／ＬＩ５８９１０５２５７ ＰＡＧＥ　２　ｏｆ　２ Ａｓｔｈａｆｉｒｓｔａｐｐｅａｒｉｎｇｇｒｏｕｐ、ｔｈｅｐｒｏセ５ｉｎｃ ａｎコＵ呂ａｔ・５ａｎｄｎ＊ｔｈｏｄｏｆｏｆｓｃｘｎａｏｒａｌｌｏｆｔｈ ａａｄｄｉｔｉｏｎａｌｃｏｎｊｕｇａｔａｓｗｈｅｒｅｉｎｓｉｘ（６）ａｄ ｄｉｔｉｏｎａｌ

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．結合部位近くでポリペプチドに対して活性官能基を導入するための方法にお いて、 開裂可能な形で付着された第１の反応基を有し、結合部位に結合することのでき る配位子とポリペプチドを組み合わせること、ポリペプチド上のアミノ酸側鎖に 対して第１の反応基を共有結合させること、配位子から第１の反応基を開裂させ 、かくして反応基の一部分はアミノ酸側鎖を通してポリペプチドに結合された状 態にとどまること、および配位子をポリペプチドから除去すること、を含む方法 。
2. ２．残りの部分は活性官能基であり、触媒官能基および反応官能基からなる群か ら選択されたものである第１項に記載の方法。
3. ３．前記部分がチオールである第２項に記載の方法。
4. ４．反応基の開裂はジアゾケトン、芳香族アジド、ジアゾニウム、チオール、α −ブロモケトン、エポキシドおよびアルデヒドからなる群から選ばれた一部分を 提供する第１項に記載の方法。
5. ５．さらに第２の官能基を反応基部分に共有結合することを含み、この第２の官 能基は触媒官能基、反応官能基、標識付け基、および化学療法剤からなる群から 選ばれた活性官能基である記載の方法。
6. ６．活性官能基は酸、塩基、酵素コファクタ（補助因子）、金属複合体、光活性 分子、求核試薬、求電子試薬および酸化還元活性分子からなる群から選ばれた触 媒官能基である第２項または第５項に記載の方法。
7. ７．活性官能基はアルキル化剤、酸化剤、還元剤、加水分解剤および光活性剤か らなる群から選ばれた反応官能基である第２項または第５項に記載の方法。
8. ８．活性官能基は蛍光性、化学発光剤、生物発光剤、染料、スピンラベル、フラ ビン、圧電分子およびビオチンからなる群から選ばれた検出可能な標識である第 ５項に記載の方法。
9. ９．活性官能基は毒素、毒素フラグメント、殺菌剤、遊離基捕捉剤、基生成剤、 アルキル化剤、神経伝達物質、放射性核種、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、 抗腫瘍剤、抗マイコプラズマ剤および重金属からなる群から選ばれた化学療法剤 である第５項に記載の方法。
10. １０．ポリペプチドは抗体、抗体フラグメント、酵素、酵素フラグメント、ホル モン、リンフォカイン、レクチン、アビジン、ＭＨＣのタンパク質、Ｔ細胞受容 体、Ｇタンパク質、神経伝達物質受容体およびＤＮＡ結合タンパク質からなる群 から選ばれる第１項に記載の方法。
11. １１．結合部位近くに活性官能基を持つポリペプチドを調製する方法において、 結合部位近くの予め選らばれた場所で少なくとも１つのアミノ酸が付加または置 換されている点を除いて、結合部位を持つ典型的なポリペプチドの少なくとも１ つのフラグメントとほぼ同じものである予め定められたアミノ酸配列を有するポ リペプチドを生成すること、および リポータ分子および化学療法剤からなる群の中から選ばれた活性官能基を付加さ れたまたは置換されたアミノ酸の側鎖に共有結合させること、を含むことを特徴 とする方法。
12. １２．付加されるまたは置換されるアミノ酸はアルギニン、アスパラギン酸塩、 システィン、メチオニン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニ ン、トリプトファンおよびチロシンからなる群から選ばれる第１１項に記載の方 法。
13. １３．付加または置換アミノ酸は天然に発生するアミノ酸以外のものである第１ １項に記載の方法。
14. １４．天然に発生するアミノ酸以外のものはアリールアミン、アルキルアミン、 アルデヒド、カルボン酸塩およびα−β不飽和エノンからなる群から選ばれた側 鎖を有している第１３項に記載の方法。
15. １５．結合部位を構成する既知のアミノ酸配列を有するポリペプチドを修飾する 方法において、 結合部位近くの予め選ばれた場所で少なくとも１つのアミノ酸が付加または置換 されている点を除いて、未修飾ポリペプチドのアミノ酸配列とほぼ同じものであ るアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を表現すること、表現生成物を回収す ること、および 付加されたまたは置換されたアミノ酸の側鎖に対して活性官能基を共有結合させ ること、 を含むことを特徴とする方法。
16. １６．付加されるまたは置換されるアミノ酸はアルギニン、アスパラギン酸塩、 システィン、メチオニン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニ ン、トリプトファンおよびチロシンからなる群から選ばれる第１５項に記載の方 法。
17. １７．少なくとも１つのアミノ酸はチオール側鎖を持つシスティンであること、 および活性官能基は、ジスルフィド交換、アルキル化または求電子付加によって 付着させられる第１２項または第１６項に記載の方法。
18. １８．アミノ酸はイミダゾール側鎖をもつヒスチジンであり、活性官能基は、α −ハロケトン、ジアゾケトンおよびアルキルハロゲン化物からなる群から選ばれ た求電子試薬との反応によって付着させられる第１２項または第１６項に記載の 方法。
19. １９．アミノ酸は一級アミン側鎖を有するリジンであり、活性官能基は、α−ハ ロケトン、イソチオシアン酸塩、アリールスルフォニルハロゲン化物からなる群 から選ばれた求電子試薬との反応またはアルデヒドとの反応により付着させられ る第１２項または第１６項に記載の方法。
20. ２０．アミノ酸はフェノール側鎖を有するチロシンであり、官能基はアリールジ アゾニウム化合物またはα−ハロケトンでのアルキル化あるいは硝化または還元 とその後に焼くアシル化またはアルキル化によって付着させられる第１２項また は第１６項に記載の方法。
21. ２１．アミノ酸はカルボキシル側鎖を有するアスパラギン酸塩またはグルタミン 酸塩であり、官能基は、カルボジイミドといった活性化剤を用いたアミノ付加ま たはジアゾアルカンでのアルキル化によって付着させられる第１２項または第１ ６項に記載の方法。
22. ２２．アミノ酸は脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するトレオニンまたはセリンであり 、官能基はα−ハロケトンまたはアリールスルフォニルハロゲン化物での縮合に より付着させられる第１２項または第１６項に記載の方法。
23. ２３．アミノ酸はインドール側鎖を有するトリプトファンであり、官能基はトリ プトファンの酸化とこれに続くアルキル化またはアシル化によって付着させられ る第１２項または第１６項に記載の方法。
24. ２４．１つの結合部位と、アミノ酸側鎖に共有結合された少なくとも１つの活性 官能基を有するポリペプチドにおいて、この結合部位は予め選択された標的配位 子と複合体を形成することができ、前記活性官能基はリポータ分子または化学療 法剤であり、かくして活性官能基と標的配位子はポリペプチドと配位子との間の 結合親和力を著しく損失することなく相互作用できることを特徴とするポリペプ チド。
25. ２５．前記ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである第２４項に記載の ポリペプチド。
26. ２６．活性官能基はリポータ分子であること、リポータ分子の検出可能性は標的 配位子に対する抗体の結合により調整される第２４項に記載の抗体または抗体フ ラグメント。
27. ２７．検出可能な標識は蛍光体、化学発光剤、生物発光剤、染料、スピンラベル 、フラビン、圧電分子およびビオチンからなる群から選ばれたものである第２６ 項に記載の抗体または抗体フラグメント。
28. ２８．活性官能基は化学療法剤であることおよび、この化学療法剤の標的配位子 に対する活性および特異性が高められている第２４項に記載の抗体または抗体フ ラグメント。
29. ２９．化学療法剤は毒素、殺菌剤、遊離基捕捉剤、基生成剤、アルキル化剤、神 経伝達物質、放射性核種、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗腫瘍剤、抗マイ コプラズマ剤および重金属からなる群から選ばれる第２８項に記載の抗体または 抗体フラグメント。
30. ３０．式Ｐ−Ｘ−Ｙ−Ｚを有するポリペプチド、式中Ｐは、１つの結合部位を持 ち、抗体、抗体フラグメント、酵素、酸素フラグメント、ホルモン、リンフォカ イン、レクチン、アビジン、ＭＨＣのタンパク質、Ｔ細胞受容体、Ｇタンパク質 、神経伝達物質受容体およびＤＮＡ総合タンパク質からなる群から選ばれたポリ ペプチドであり、 Ｘは、結合部位から約２０Åの範囲内にあるアミノ酸側鎖であり、Ｙは、ジスル フィド、エステル、アミンおよびジアゾからなる群から選ばれた共有結合（連鎖 ）基であり、 Ｚは、リポータ分子および化学療法剤からなる群から選ばれた活性官能基である こと、およびＺはＸおよびＹを通してＰに付着させられ、Ｐ上のその他の場所で はほぼ不在であることを特徴とするポリペプチド。
31. ３１．活性官能基Ｚは蛍光体、化学発光剤、生物発光剤、染料、スピンラベル、 フラビン、圧電分子およびビオチンからなる群の中から選ばれたリボーク分子で ある第３０項に記載のポリペプチド。
32. ３２．活性官能基Ｚは毒素、殺菌剤、遊離基捕捉剤、基生成剤、アルキル化剤、 神経伝達物質、放射性核種、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗腫瘍剤、抗マ イコプラズマ剤および重金属からなる群から選ばれた化学療法剤である第３０項 に記載のポリペプチド。
33. ３３．Ｐは抗体、抗体フラグメント、酵素、酸素フラグメント、ホルモン、リン フォカイン、レクチン、アビジン、ＭＨＣのタンパク質、Ｔ細胞受容体、Ｇタン パク質、神経伝達物質受容体およびＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選ばれ る第３０項に記載のポリペプチド。