JPS62500175A - 抗体−治療剤接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

抗体−治療剤接合体 １、発明の分野 本発明は、生体内の目標部位に治療剤を配分することのできる抗体システムの一 般範囲に関する。治療剤はリンカ−（ｔｉｎｋｅｒ）を介して、或いは直接的付 着により抗体或いは抗体フラグメントに共有結合的に付着し、抗体接合体（ａｎ ｔ　ｉ　ｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成する。抗体−治療剤接合体は、 もとの抗体−治療剤接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｈｅｒａｐｅｎｔｉＣａＱｅ ｎｔ　Ｃ０ｎｊＬＩ（ｌａｔｅ）は、もとの抗体の免疫特異性及び免疫反応性を 実質的に保持している。 好適な具体例において、本発明は、開裂可能な或は不可能なものでありうるリン カ−を介しての治療剤の付着に関する。これらの抗体−治療剤接合体は、リンカ −を介して抗体分子と付着している治療剤を有し、接合されない抗体の免疫特異 性及び免疫反応性を基本的に保持している。本発明の特定の具体例は、たんばく 質分醒酵素による開裂可能なリンカ−を介して付着することであり、その結果の 接合体は、抗原と結合し、補体を活性化する能ツノを保持している。また、本発 明は、ウロキナーゼ、プラスミン、トリプシン、粗織プラスミノーゲン活性化因 子或はたん白質分解活性をもつ他の酵素により開裂可能なリンカ−を介しての付 着を含む。これらの具体例すべてにおいて、リンカーの開裂は治療剤が活性な形 態は活性化可能な形態で目標部位で放出されることを促進する。 本発明の他の好適な具体例は、特定な治療剤が、抗体分子に付着することを含み 、その結果ｊｑられる接合体は、特定の目標部位に配され、そして、治療剤が放 出されることなく、その治療剤は、目標部位で活性化され１ｑる。 また他の好適な只体例は、酵素が抗体分子に付着することに関し、それにより、 得られる接合体は、特定の目標部位に配され、そこで、酵素は、治療価値のある 反応を触媒活性化する。 本発明はまた、そのような抗体−治療剤接合体のいくつかの製法、新規な治療剤 である接合剤の製造に有用な中間体：及びそのような治療剤の使用方法に関する 。 ２、　発明の背景 種々の担体分子が作用部位に治療剤を分配するについて、限定的な成功ながら、 利用されてぎた。実際上、担体は、非毒性で目標部位は特異なものでなければな らない。理想的には、それらは、治療剤の活性形態が担体から目標部位保持或い

【ま放出される機構のものである。 ２．１　担体システム 多数の剤が、薬剤分配システムにおいて限定的な成功ながら担体として利用され てぎた。実用上担体は非毒性で目標部位は、特異なものでな【プればならない。 理想的には、それらは、治療剤の活性形態が担体から目標部位に対して保持或は 放出される機構のものである。ＤＮＡ、リポソーム類、たん白質類、ステロイド ホルモン類、及び抗体類（完全抗体分子及びフラグメント）のような担体分子は 、放射性化合物（例えば　■、　Ｔ）、ＤＮＡと結合する作用物質、例えば、ア ルキル化剤、或は多種の抗生物質、メトトレキセイトのような抗代謝物質；細胞 表面上で作用する作用物質（例えば、静脈ホスホリパーゼ及び微生物毒素類）； 及びたん白質合成明害剤（例えば、ジフテリア毒素及び重性植物たん白質）のよ うな薬剤或は細胞傷害剤の広いスペクトラムと、結合して利用されてきた。 多くの研究者は、化合物或は薬剤が、通常の抗体、モノクロナール抗体、或は腫 瘍抗原に対して指向する抗体のＦａｂたん白質と直接に付替する標的システムに ついて報告してきた。プライスマンら、１９８１年、ネイチャー２９０：１４５ 〜１４６；ディビスとプレス１〜ン、１９８１年、サイエンス２１３：１３８５ 〜１３８８：ホールワイツら、１９７９年、インターナショナル　ジャーチル　 オプ　キャンサ−λ４　：　４６１〜４７１：米国特許第４．０９３．０６７号 ；および英国特許第１．４４６．５３６号［Ｂ１１Ｂ１１７ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、 、１９８１．Ｎａｔｕｒｅ　２９０：１４５−１４６；Ｄａｖｉｓ　ａｎｄ　Ｐ ｒｅｓｔ。 ｎ、１９８１，５ｃｉｅｎｃｅ　２１３：１３８５−１３８８；Ｈｕｒｗｉｔｚ 　ｅｔ　ａｌ、、１９７９．Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２４：４６１−４７０ ；Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４，０９３，６０７；ａｎｄ　Ｕ。 Ｋ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、１，４４６，５３６］を参照のこと。ウルダルとハコ モリ（１９８０年、ジャーナル　オブ　バイオロジー　アンド　ケミス１〜リ− ２５５（２１）：　１０５０９〜１０５７９　［ｔＪｒｄａｌ　ａｎｄ　Ｈａｋ ｏｍｏｒｉ（１９８０，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５　（２１月０５０９〜 １０５７９）］は、抗体目標にされアビジンに媒介された、腫瘍細胞の薬剤膜化 について述べる。 抗体担体システムは、目標部位に対して、非常な特異性があるが、治療剤はその 部位に放出され得ないという重大問題が存在するのである。放出が必要な場合、 抗体−薬剤接合体は、腫Ｓ細胞によって内部化されなければならない。 そこで、放出はりリゾーム酵素による開裂を通しておこる。 更に、治療剤が抗体分子上の（ランダム）部位に部位特異なく結合するために、 抗原結合能力を阻害し、それにより、システムの効果は減少する。 ２．２．抗体に対する共有結合性付着 いくつかの異なる反応が、化合物を抗体と共有結合的に付着させるために用いら れてきた。これは、リシンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離 カルボン酸基、システィンのスルフヒドリル基及び芳香族アミノ酸の種々の部分 を含む抗体分子のアミノ酸残塁の反応によって為された。 この抗体分子のポリペプヂド母格に対する共有結合的付着による方法には重大な 欠点がおる。免疫グロブリンの軽鎖みよび重鎖のアミノ酸配列は、抗原結合領域 を含む分子全体にわたり比較的に規則的に分配されるおよび、ラングがこの抗原 結合領域中で生じる程度で、抗体の認識要素中に変更を与えた。このような変更 は、予期されたものであり、そして、事実抗体と抗原に対する親和力と特異性を 変えるものである。種々の抗体の母集団において、抗原結合領域のこのような変 更があると、いくつかの抗体が完全に不活性になり、そして、他のものは抗原結 合部位への変更の近接に関連して、不活性になる程度がより少ないものとする。 この不活性化は、抗原結合部位を不活性なものとするように該結合部位の立体配 座を変える抗原結合部位の内での或はその非常に近くでの変化によるものである 、或は、抗原の接近を抗原結合領域に限定するような抗原結合領域の外側の領域 における変化によるものである。抗体全体にわたり、比較的に規則的におよびラ ンダムに分散されたアミノ酸を含む方法は、部位特異性のない方法として示され る。 共有結合的付着の最も通常に使用される非特異性〈ランダムの）の方法の１つは 、カルボジイミド反応であり、化合物のカルボキシ（或はアミノ基）を、抗原の アミノ（或はカルボキシ）基に結合するものである。更に、ジアルデビド類（或 はイミドエステル類のような２官能性剤が、化合物のアミン基を、抗体分子のア ミノ基に結合するために用いられている。 ある研究者は、シェフ塩基反応を用い、化合物を抗体分子に結合させている。こ の方法は、グリコール或はヒトロキシ基を含む薬剤或は細胞障害性剤の過ヨウ素 酸酸化によるものでおり、それにより、アルデヒドを形成し、次に抗体分子を反 応せしめるものである。シェフ塩基の形成を通して、抗体分子のアミン基との付 着が生じるのである。−イソチオシアー１〜類は、化合物を抗体に共有結合的に 付６せしノめる結合剤として用いられている。この方法により、螢光化合物は、 螢光顕微鏡用（ブランドデザーグ、１９７３、スカンジナビアン　ジャーナル　 刺ブ　イムノロシイ（［Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ、１９７３，５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　２　：２ｉ’３−２９０］）及び細胞選別システム用（ローケ ンとハーゼンバーブ、１９７５年、アナルス　ニューヨーク　アカデミ−サイエ ンス２５４：１６３〜１７１　（［Ｌｏｋｅｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ 、１９７５．Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、ＡＣａｄ、２５４　；１６３−１７１］） のために、抗体分子に付着された。 項内のジスルフィド結合も共有結合付着の部位として用いることができる。し７ かし乍ら項内のジスルフィド結合のみを選択的還元することが成功する場合でも 、抗体のいくつかの官能性の特性が害され得、例えば、官能性親和力凝集能力及 び補体固定能力が悪影響を受けることがある。 ２．３．モノクロナール抗体を用いる担体システムコーラ−とミルスティン（１ ９７５年、ネイチャーＨ６：４５９〜４９７：１９７６年、ヨーロピアン　ジャ ーナル　オブ　イムノロシイ　６；５１１〜５１９　）　（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎ ｄ　Ｈｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｅｒ　２５６　：４９５−４９７； １９７６、Ｅｕｒ、Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１−５１９）のハイブリドーマ技術或は関連技術によ り製造したモノクロナール抗体は、作用部位（、二治療剤を配するための担体と して使用リ−るために著しい利点をもつものである。第１に、モノクロナール抗 体は、１分子部位のみに（即も、１つのエビ［〜−ブ）、特異な結合定数で結合 する。第２に、このような抗体は均質で、従って比較的に容易に精製される。第 ３に、モノクロナール抗体は、特定のハイブリドーマ細胞系より入車に製造でき る。　腫瘍生成或は腫瘍関連の抗原を発見したことにより、ヒｌ〜結腸、胸部、 肺癌（ヘパトーマ）、黒色腫（メラノーマ）、発芽細胞腫如き固体腫瘍に対して 免疫特異性のあるモノクロナール抗体が製造できるようになった。（カラスクイ リオら、１９８４年、キャンサー、トリートメント　レポーツ旦旦：３１７〜３ ２８；ケネルら、１９８４年、バイオロジックａｔ　、、１９８４．Ｂｉｏ、Ｓ ｃｉ、３４：１５０−１５６］のレビコーを参照のこと。） 例えば、ギリランド（ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）らは、ジフテリア毒素Ａに結合した 抗−結腸直腸炎モノクロナール抗体を用いた治療適性を示した（１９８０年ブロ ク、ナルｌ〜、アカド。 て、この接合体で処置されたほとんど全ての癌細胞は、殺された。 ２．４　光照射治療 光学的技術の進歩及び、光化学及び光生物学の大きな進展により、種々の病状を 処置するための光照射治療技術に対する関心が高まった。腫瘍細胞の光増感のた めの″ヘマトポルフィリン誘導性（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　ｄｅｒｉ ｖａｔｉｖｅ）”（ＩＩＤＤ）を用いた光昭射治療は、数年の間開発下にありい くつかの成功があった。ＨｐＤを用い、患者に、例えば第１次及び転移性皮膚癌 、肺、気管、食道、膀胱、眼の癌及び腹膜腔内の内部転移性のもののような癌を 処置してきた。 適切な波長の光が、ＨｐＤと相互作用する場合、細胞障害性媒介因子（即ら、シ ングレット酸素）は、化学反応をおこし、腫瘍細胞を破壊する。事実、Ｈｌ）　 Ｄは、隣接細胞組織と比べて、多くの腫瘍に選択的に吸収され、そして保持され ているように思われる。（ドアリテイー、プロフィリン　フォトセンシイティゼ ーション、ニューヨーク：プレナン　パブリッシング　コーポレーション、１９ ８３年３〜１３頁［Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、　Ｉｎ　Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　Ｐｈｏ ｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉ。 ｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、１９ ８３，１）ｆ）、３−１３］を参照のこと）。多くの場合、腫瘍と周辺域を、レ ーザーを用いた適切な波長の光にさらすことになり、腫瘍に選択的な効果を与え ることが可能である。レーザー出力ビームは、適切な大きさの光ファイバーに連 結され、腫瘍に直接に、或いは、腫瘍の一般的位置に外部から適用される。 しかしながら、約束された開発にもかかわらず、光化学品（例えば、ヘマトポル フィリン及び他の光増感剤）は、臨床用としていくつかの欠点がある。第１に、 腫瘍に隣接する領域を保護していない場合通常の組織を損傷する可能性が高いこ とでめる。 薬剤投与と光照射の間は、正確なタイミングがなければならない。第２の欠点は 、光照射治療を受けた患者が、一般的に、太陽光に非常に敏感になることであり 、太陽にさらされることを避けなければならず、よく、それが４週間にもなるこ とである。第３に、治療に必要な光増感剤の投与量は、非常に高く、正常の組織 に負の効果を与えることである。 理想的な光増感剤は腫瘍特異性がより大きく、より低い治療投与量でよく、これ によってより高い投与量の有害な効果を和らげるものにすべきである。より高い 腫瘍特異性があると、作用部位に、より効率よく局在化でき、身体全体にわたる 分配の機会はなくなるのである。 メウ（ＭｅＷ）らは、生体内及び試験管内の抗ガン剤として、カルボジイミド結 合を介してヘマトポルフィリンに接合したモノクロナール抗体を用いることを示 した。（１９８３年、ジャーナル　オブ　イムノロシイ　１３０　：　１４７３ 〜１４７７　［１９８３，Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３０　：１４７３−１４７ ７１　＞。 ３、　発明の概要 本発明の一般方法によると、治療剤は、抗体或は抗体）ラグメントに対して共有 結合的に付着するものでおる。この治療剤の共有結合的付着は、得られる抗体結 合体が抗原と結合する能力を保持するようになされるものである。特に、このよ うな方法は、抗体或は抗体フラグメントの酸化炭水化物（カルボハイドレート） 部分に対する、或は、還元された抗体或いは還元された（Ｆａｂ’）　２フラグ メントのスルフヒドリル基に対する付着を含むものである。 特に、本発明は、抗体−治療剤接合体の製法に関し、それは、 （ａ）抗体或は抗体フラグメントを酸化剤を反応せしめ、抗体或は抗体フラグメ ントのカルボハイドレート部の中にアルデじド基を形成せしめ： （ｂ）得られた酸化抗体或は抗体フラグメントのアルデヒド基をリンカ−のアミ ン基を反応せしめ、（ここで該リンカ−は第１アミン、第２アミン、ヒドラジン 、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、）Ｉニルヒドラジン、セミカルバジド及び チオ−セミカルバジド基よりなる群から選択された）７ミン阜を含むものである ）接合されていない抗体或いは抗体フラグメン１〜と同じ免疫活性と免疫特異性 を実質的に有する抗体−リンカ−中間体を形成し；そして、（Ｃ）抗体−リンカ −中間体のリンカ一部分を、治療剤と共有結合的にイ」着ぜ（）め抗体−治療剤 接合体を形成−ｕしめることを含んでいる。 おる状況では、上記の抗体−治療剤接合体の製法を、２つの部分に分けることが 望ましい。第１の部分は、最終の抗体−治療剤接合体の製法の１工程と考えるこ とのできる抗体−リンカ−中間体を鋳造するものでおる。このような抗体−リン カ−中間体は、後の特定治療剤と組合せるために貯蔵しておくことができる。従 って、２部分方法の第１の部分は、上記の工程（ａ）及び（ｂ）であり、中間体 抗体−リンカ−中間体を形成するものである。第２の部分、多分時間的に後にあ る部分は、抗体−リンカ−中間体のリンカ一部分を治療剤と共有結合的に付着さ せ、最終の抗体−治療剤接合体を作るものである。 このような抗体−治療剤接合剤は、また、代替方法により、例えば、第１に、リ ンカー−を治療剤と共有結合的に付６せしめ、そして、次に、抗体或は抗体フラ グメントを、ワ〕７カー治療剤のリンカ一部のアミン基と反応Ｕしめて、抗体− 治療剤接合体を形成する方法によっても作ることができる。従って、本発明は、 更に、 （ａ）抗体或は抗体フラグメン１−を酸化剤と反応せしめて、抗体或は抗体フラ グメン１へのカルボハイド１ノ一１〜部の中（３−アルデヒド基を形成せしめ； そして （ｂ）得られた酸化抗体或は抗体フラグメン１〜のアルデヒド基を、リンカー− 治療剤中間体のリンカル部のアミン基と反応せしめ、（ここで該リンカー−治療 剤中間体は、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル アミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びびチオセミカルバジド基より なる群からｊ式択されるアミン基を含みかつ治療剤に共有結合的に付着されたリ ンカ−からなるもので必る。）接合されていない抗体或は抗体フラグメン１へと 同一の免疫反応性及び免疫特異性を実質的に有する抗体−治療剤接合体を形成す ることによりなる；抗体−治療剤接合剤−の製法を含むものである。 上記の実施態様のいずれにおいても、リンカ−は、スペーサー要素と開裂性要素 を有し得る。スペーサー要素の一つの機能は、開裂性要素を抗体分子のコアから 離れた位置にするものでき、これにより開裂性要素は、開裂に応答する酵素にざ らに、反応するものにできるものである。これらの実施態様は、 （ａ）抗体或は抗体フラグメントを酸化剤と反応せしめて、抗体或は後退フラグ メントの炭水化物（カルボハイドレート）部分の中にアルデヒド基を形成し；（ ｂ）得られた酸化抗体或は抗体フラグメントのアルデヒド基をリンカ−のアミン 基と反応せしめ（ここでそのリンカ−は、開裂性要素に共有結合的に付着したス ペーサー要素を有し、そして、該スペーサー要素上に位置する該アミン基は、第 １アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシアミン、フェニル じドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基よりなる群から選択され たアミン基を含むものでおる。）接合されていない抗体或は質的に有する抗体− リンカ−中間体を形成し；そして（Ｃ）抗体−リンカ−中間体の開裂性要素を、 治療剤に共有的に付着せしめ、抗体−治療剤接合体を形成することを特徴とする 抗体−治療剤製法である。 或いは、抗体−治療剤接合体の上記の製法は、２つの別の部分に分けることがで きる。第１の部分（上記の工程（ａ）と（ｂ）〉は、治療剤との後の組合せ（上 記の工程（Ｃ））のために貯蔵できる抗体−リンカ−中間体を作るものである。 リンカ−がスペーサー要素と開裂性要素を有する抗体−治療剤接合剤は、第１に 、リンカ−を治療剤に共有結合的に付着せしめ、次に、抗体或は抗体フラグメン トをリンカー−治療剤のリンカ一部に反応せしめ、抗体−治療剤接合体を形成す ることにより、作ることができる。従って、抗体−治療剤接合体（スペーサー要 素と開裂性要素とをもつリンカ−を有する）のこの製法は； （ａ）抗体或は抗体フラグメントを酸化剤と反応せしめ、抗体或は抗体フラグメ ントの炭水化物部分の中にアルデじド基を形成し；そして （ｂ）得られる酸化抗体或は抗体フラグメントのアルデヒド基をリンカー−治療 剤中間体のアミン基と反応せしめ（ここで該リンカー−治療剤中間体は、開裂性 要素と共有結合的に付着したスペーサー要素からなり、そして、該スペーサー要 素上の位置するアミン基は、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド 、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカル バジド基よりなる群から選択されるものである。）、結合されていない抗体或は 抗体フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性とを実質的にｈ゛する抗体− 治療剤接合体を形成づる ことＪ：り構成されるものである。 リンカ−がスペーサー要素と開裂性要素とを有するそのような抗体−治療剤接合 剤は、他の方法、例えば、第１に、抗体をスペーサー要素に付着せしめ、次にそ の中間体のスペーサー要素を、治療剤と共有結合的に何着した開裂性要素を有す る他の中間体の開裂性要素にイ」着せ（）めることにより作ることができる。こ のような方法は：（ａ）抗体或は抗体フラグメントを酸化剤と反応せしめて、抗 体或は抗体フラグメンＩ〜の炭水化物部分の中にアルデヒド基を形成し； （ｂ）得られた酸化抗体或は抗体フラグメントのアルデヒド基を、第１アミン、 第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジ ン、及びチオセミカルバジド基よりなる群から選択されたアミン基を含むスペー サー要素と反応せしめて、接合されていない抗体或は抗体フラグメン［〜と同一 の免疫反応性と免疫特異性とを実質的に有する抗体−スペーサー要素中間体を形 成し；そして、 （Ｃ）抗体−スペーサー要素中間体のスペ−サー要素を、開裂性要素−治療剤中 間体の開裂性要素と共有結合的に付着せしめ、抗体−治療剤接合体を形成するこ とにより構成されるもので必る。 これらの抗体−治療剤接合体のもう一つの製法は、先ず、抗体−スペーサー要素 中間体を調製し、この中間体のスペー１す一要素に開裂性要素を付着せしめて抗 体−スペーサー要素−開裂性要素中間体を形成し、そして、最後に、この中間体 の開裂性要素に、治療剤を付着せしめるものである。 この方法は： （ａ）抗体或は抗体フラグメントを、酸化剤と反応ぜしめて、抗体或は抗体フラ グメントの炭水化物部分の中にアルデヒド基を形成し； （ｂ）　Ｉられた酸化抗体或は抗体フラグメントのアルデヒド基を、第１アミン 、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラ ジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基よりなる群から選択されるアミ ン基を含むスペーサー要素と反応せしめて、接合されていない抗体或は抗体フラ グメントと同一の免疫反応性と免疫特異性とを実質的に有する抗体−スペーサー 要素中間体を形成し； （Ｃ）抗体−スペーサー要素中間体のスペーサー要素を、開裂性要素に共有結合 的に付着せしめて、抗体−スペーサー要素−開裂性要素中間体を形成し； （ｄ）抗体−スペー音大−要素−開裂性要素の中間体の開裂性要素を、治療的に 共有結合的に付着せしめて、抗体−治療剤接合体を形成することにより構成され るものである。 上記の方法の工程の他の順列も、当業者の知識から開発することができ、そ（） て、水門ＩＢ出の開示のものにできる。 ある場合にスペーサー要素の伯の機能は、開裂性要素或いは治療剤、或は開裂性 要素−治療剤中間体を後に付着するための多官能性部位を添加することができる ことである。 従って、抗体分子のアルデヒド（或はスルフヒドリル）に、多官能部位をもつ″ 分校されたスペーサー要素″を付着せしめることができる。このような部位は、 アルデヒド或はスルフヒドリル基または開裂性要素、治療剤或は開裂性要素−治 療剤中間体が付着できる任意の化学的部位であることができる。 更に、これらの方法は、治療剤が抗体から開裂できない場合、即ち、リンカ−中 に開裂性要素がない場合に、応用できることが容易にわかる。これらの実施態様 において、リンカ−は、直接に治療剤に付着するための多官能部位をもつ″分枝 状リンカー″であることができる。また、官能部位は、アルデヒド或はスルフヒ ドリル基または、治療剤が付着できる任意の化学的部位であるものである。 上記の実ＩＭ態様のすべてにおいて、分岐状リンカ−を含むいくつかのリンカ− は、同じ抗体分子に付着でき、抗体分子１つ当り多数の治療剤をもつ接合体を形 成できる。 本発明は、上記の方法の中間体及び最終生成物に関してもいる。特に、本発明は 、共有結合を介して、酸化抗体或は抗体フラグメントの炭水化物部分に付着した リンカ−からなる抗体−リンカ−中間体を含むものであり、その抗体−リンカ− 中間体は、もとの抗体或は抗体フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性を もつものである。このような中間体において、リンカ−は、スペーサー要素（炭 水化物部と付着している）を有することができ、それは、いいかえれば、開裂性 要素と共有結合的に付着している。 本発明は、上記方法で述べた、抗体−スペーサー要素中間体、開裂性要素−治療 剤中間体及びリンカー−治療剤中間体に関する。リンカ−が開裂できない中間体 は、本発明に含まれるものである。 更に、本発明は、酸化抗体或は抗体フラグメントの炭水化物に（直接に、或はリ ンカ−を介して〉共有結合的に付着した治療剤を有する抗体−治療剤接合体を含 むものであり、その抗体−治療剤接合体は、接合されていない抗体或は抗体フラ グメントと同一の免疫反応性を実質的に有するものである。 また、本発明に含まれるものには、リンカ−或は治療剤が、還元された抗体或は Ｆａｂ’フラグメントの硫黄原子に付着されている相当する中間体及び抗体−治 療剤接合体がおる。本発明のこの実施態様は： （ａ）抗体或は抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントを、緩かな還元剤と反応せし め、スルフヒドリル基をもつ還元抗体或はＦａｂ“フラグメントを形成し： （ｂ）該スルフヒドリル基を、リンカ−の反応基と反応せしめ（ここで該リンカ −は、ハロアルキルＬ　ｏ−メルカリベンゾエート基及びミツシェル型付加反応 のできる基よりなる群から選択される反応基を含むもので必る。）接合されてい ない抗体或は（Ｆａｂ’）２フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性を実 質的にもつ抗体−リンカ−中間体を形成し； （Ｃ）抗体−リンカ−中間体のリンカ一部分を治療剤と共有結合的に何着せしめ て、抗体−治療剤結合体を形成することにより構成される抗体−治療剤結合体の 製法を含むものである。 この方法は、２つの部分、すなわち上記の工程（ａ）と（ｂ）を含む第１工程並 びに時間的に分けられる、上記の工程（Ｃ）にある最終接合体を作るものである 第２工程にヅ月ブることができる。 或いは、同一の抗体−治療剤接合体は；（ａ）抗体或は抗体の（Ｆａｂ’）２フ ラグメントを緩やかな還元剤と反応せしめて、スルフヒドリル基をもつ還元抗体 或はｔａｂ’フラグメントをを形成し； （ｂ）該スルフヒドリル基を、リンカー−治療剤接合体の反応基を反応せしめ、 （ここで該リンカー−治療剤中間体は、ハロアル−キル塁、Ｐ−メルカリベンゾ エート基及びミツシェル型附加反応のできる基よりなる群から選択されかつ治療 剤に共有結合的に付着しでいる反応基を含むもので必る。）接合されていない抗 体或いは（Ｆａｂ’）２フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性を実質的 に有する抗体−治療剤接合体を形成することより構成される他の方法によっても 調製され得る。 上記の実施態様のいずれにおいても、ワンカーは、開裂性要素と共有結合的に付 着したスペーサー要素を有し得る。 上記の如く、スペーサー要素は、抗体のコアから開裂性要素を離すように位置さ せることのできるものであり、それにより、開裂性要素は、開裂酵素に、より感 応するものとなる。これらの実施態様は； （ａ）抗体或は抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントを緩やかな還元剤と反応せし めてスルフヒドリル基をもつ還元抗体或は、Ｆａｂ”フラグメンｌ−を形成し； （ｂ）該スルフヒドリル基をリンカ−の反応基と反応せしめて（ここでそのリン カ−は開裂性要素に共有結合的に付着しているスペーサー要素を有し、そのスペ ーサー要素上にある該反応基は、ハロアルキル基、ｐ−メルカリベンゾ工−ト基 、およびミツシェル型附加反応のできる基よりなる群ｈロジ選択されるものであ る。）、接合されていない抗体或いは（Ｆａｂ’）２フラグメントと同一の免疫 反応性と免疫特異性を実質的にもつ抗体−リンカ−中間体を形成し：ぞして　（ Ｃ）開裂要素−抗体−リンカー中間体を治療剤と共有結合的に内容せしめて抗体 −治療剤接合体を形成することにより構成される方法を含むものである。 明らかに、上記の方法は、２つの部分、すなわち、工程（ａ）と（ｂ）の第１の もの並びに上記の工程（Ｃ）の第２のものの２つに分けることができる。 スペーサー要素と開裂性要素とを有するリンカ−をもつこれらの抗体−治療剤接 合体は、先ず、リンカ−を治療剤に共有結合的に内容せしめ、そして、還元抗体 或いはＦａｂ　’フラグメントをリンカー−治療剤のリンカ一部分と反応せしめ て、抗体−治療剤接合体を形成することにより作ることができる。この方法は； （ａ）抗体或いは抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントを緩かな還元剤と反応せし めて、スルフヒドリル基をもつ還元抗体或いはＦａｂ’フラグメントを形成し； （ｂ）このスルフヒドリル基を、治療剤と共有結合的に付着した開裂性要素に共 有結合的に付着したスペーサー要素をもつリンカー−治療剤中間体の反応基と反 応せしめて（ここでその反応基は、そのスペーサー要素上にあり、ハロアルキル 基、ｐ−メルカリベンゾエート基及びミツシェル型の付加反応のできる基よりな る群から選択されるものであ る。）、接合されていない抗体或いは（Ｆａｂ’）２フラグメントと同一の免疫 反応性と免疫特異性を実質的に有する抗体−リンカ−中間体を形成することによ り構成されるものである。 スペーサー要素と開裂性要素をもつこれらの抗体−治療剤接合体は、他の方法、 即ち、第１に、抗体をスペーサー要素と付着せしめ、次に、その中間体のスペー サー要素を治療剤に共有結合的にイ」着した開裂性要素からなる他の中間体の開 裂性要素と付着せしめるような方法により作ることができる。これらの方法は； （ａ）抗体或いは抗体のけａｂ“）２フラグメントを、緩かな還元剤と反応せし めて、スルフヒドリル基をもつ還元抗体或いはＦａｂ’フラグメントを形成し： （ｂ）そのスルフヒドリル基をハロアルキル基、ｐ−メルカリベンゾエート基及 びミツシェル型付加反応のできる基よりなる群から選択される反応基を含むスペ ーサー要素の反応基と反応せしめ、接合されていない抗体或いは（Ｆａｂ’）２ フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性を実質的に有する抗体−スペーサ ー要素中間体を形成し；そして、（Ｃ）抗体−スペーサー要素中間体のスペーサ ー要素を、開裂性要素−治療剤中間体の開裂性要素に共有結合的に付着せしめて 、抗体治療剤接合体を形成することより構成されるものでおる。 これらの抗体−治療剤接合体の他の製法は、まず抗体−スペーサー中間体を調製 し、次に、この中間体のスペーサー要素に、開裂性要素を付着ゼしめて抗体−ス ペーサー要素−開裂性要素中間体を形成し、そして、最後に、この中量体の開裂 性要素に治療剤を付着１！シめるもので必る。 この方法は； （ａ）抗体或いは、抗体の（Ｆａｂ’　）２フラグメン１〜を緩かな還元剤と反 応せしめて、スルフヒドリル基をもつ還元された抗体或いはｒａｂ’フラグメン トを形成し；（ｂ）そのスルフヒドリル基を、ハロアルキル基、ｐ−メルカリベ ンゾエート基及びミツシェル付加反応のできる基よりなる群から選択される反応 基を含むスペーサー要素の反応基と反応せしめて、接合されていない抗体或いは （Ｆａｂ’）２フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性を実質的にもつ抗 体−スペーサー要素中間体を形成し；そして （Ｃ）抗体−スペーサー要素中間体のスペーサー要素を、開裂性要素と共有結合 的に付着せしめて、接合していない抗体或いは（ｔａｂ’　）２フラグメントと 同一の免疫反応性と免疫特異性を実質的にもつ抗体−スペーサー要素−開裂性要 素中間体を形成し；そして、 （ｄ）抗体−スペーサー要素−開裂性要素中間体の開裂性要素部分を、治療剤と 付着せしめることにより構成されるものである。 Ｅ配力法の工程の順序を、他に順列組合せたものも、この開示をもとに当業者に より行うことができる。 更に、スペーサー要素は、治療剤、開裂性要素、或いは開裂性要素−冶療剤中間 体を後に付着させるための多官能性部位を有することができる。これらの官能性 部位は、アルデヒド或いはスルフヒドリル基または、治療剤、開裂性要素或いは 開裂性−治療剤が付着できる任意の化学的部位であり得る。 同様に、抗体のスルフヒドリル基に付着せしめる上記の方法は、非開裂性・リン カ−を用いる場合、或いは、“分校状リンカ−″が治療剤に直接的に付着する場 合に、適用できるものである。 これらの方法のすべてに加えて、本発明は、抗体−リンカ−中間体、抗体−スペ ーサー要素中間体、抗体−スペーサー要素−開裂要素中間体、リンカー−治療剤 中間体、開裂性要素−治療剤中間体を含む付着が、抗体分子の硫黄原子に対する ものであるこれらの方法の中間体を含むものである。これは、リーンカーが開裂 性でない中間体および接合体を含むものである。 抗体−治療剤接合体は、還元された抗体或いはｒａｂ’フラグメントの硫黄原子 に共有結合的に（直接的に或いはリンカ−を介して）付着した治療剤を有し、そ の抗体−治療剤接合体が、接合していない抗体或いは（Ｆａｂ’　）２フラグメ ントと同一の免疫反応性と免疫特異性を実質的に有するものである。 本発明の抗体−治療剤接合体は、生体内治療に理想的に適切なものである。治療 剤を特定の目標部位に配することは、動物或いはヒトに、抗体−治療剤接合体の 有効量を投与することを含むものであり、ここで抗体−治療剤接合体は、該特定 組織の抗原決定因子に免疫反応性で特異性のものであり、また、非特定組織に対 しては、実質的に非免疫反応性で、非免疫特異性であり、そして該抗原決定因子 は、非特定組織には、実質的な量で見られることはないものである。 また、本発明は、特定の細胞、組織、器官、或いは、生体内の他の部位に分配す るために抗体を使用すること、そして、目標部位において治療剤をその後に放出 せしめること或いは活性化せしめることを含むものである。本発明の一実施態様 において、化合物の放出は、活性化された補体、すなわちプラスミノーゲン活性 化因子、プラスミン、ウロキナーゼ、トリプシン、或いはたん白質分解能をもつ 他の酵素により媒介され得るものである。その放出が望まれない本発明の他の実 ＩＭ態様においては、細胞毒性の副産物の生成により基質修飾を触媒作用する光 増感性化学品或いは酵素が抗体分子に付着される。 最も一般的な概念において、本発明は、治療剤を、抗体或いは抗体フラグメント の当該領域に部位選択的に付着せしめることを意図しており、その当該領域は、 その分子の抗原部位の一部でなく、直接的に含まれるものでもない。 従って、これらの部位（抗原結合領域の外側の位置で）の１つに選択的に付着し た後に、形成された抗体接合体は、非接合抗体或いは抗体フラグメントと実質的 に同一の免疫反応性と免疫特異性を有している。 所望の部位（例えば、腫瘍細胞、ウィルス、真菌、細菌、或いは寄生体の抗原決 定因子）に対して指向する抗体は、担体分子として使用できる。通常の抗体が担 体分子として使用できるが、モノクロナール抗体は、抗原に対して高められた特 異性を有し、分配システムの改良された効率を有し、生産が容易である点で有利 である。 本発明の１つの方法によると、治療剤は、補体活性化のできる免疫グロブリン・ クラスの抗体担体分子に付着せしめられる。この付着は、上記で挙げられたよう な酵素により開裂可能なリンカ−を介して、達成される。コないしそれ以上の異 なる治療剤を各抗体分子に付着させることができる。得られた抗体−治療剤接合 体は、個体に投与される。 抗体−治療剤接合体が、生体内抗原に結びつけられた後に、個体の血清補体は活 性化され、そして、化合物は、目標部位において選択的に開裂され、そして、放 出される。 治療剤が、補体系のもの以外の酵素により放出されるために、上記と同じリンカ −が、補体を活性化しないクラスの抗体担体分子に付着せしめられる。 本発明の他の１つの方法によると、光増感剤が、非開裂性リンカ−により、抗体 担体分子に付着されるか、或いは、抗体分子に直接付着される。目標部位に抗体 接合体を配した後に、光増感剤が適切な波長の光により活性化され、近傍細胞に おける細胞溶解効果が、シングレット酵素分子及び酸素フリーラジカルの生成を 通して媒介される。 本発明の代替的実Ｍ態様においては、目標部位でのリンカ−の開裂が望ましくな いものである。利用されたリンカ−が、血清たん白質に非感応性であり得、或い は、抗体分子が、補体活性化のないクラス或いはタイプであり得る。 必る化合物、例えば、ホルモン類、或いは神経伝達物質類を分配するために、補 体カスケードの活性化なしで化合物を開裂することが望まれることもめる。ウロ キナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、トリプシン、或いは 補体を固定するあるいは固定しない抗体に付着したプロアアーゼ感応性リンカ− を用いることもできる。 本発明の実施に関り、て抗体の抗原結合能、補体を活性化する能力（又は、補体 固定とも称される〉、或いは、治療剤の酵素開裂或いは光活性化も（〕くは酵素 基質の治療剤による細胞毒性副産物への転化の過程のいずれをも阻害することな く治療剤を抗体分子に付着せしめることが望ましい。 本発明は、新規なリンカ−および治療剤を補体活性化のできる抗体に付着するた めに使用できる付着方法とを述べるもので必る。 ４、【図面の簡単な説明】 本発明は、更に、次の詳細な記載、発明の特定の実ＩＭ態様の例及び添付図によ り、より充分に理解できる。即ち、第１図は、抗腫瘍性薬剤、アルケラン［八Ｉ ｋｅｒａｎ　］　（バローズーウエルカム［Ｂｕｒｒｏｕｑｈｓ−Ｗｅｌｌｃｏ ｍｅ］　）の、ペプチドＣＢＺ−（Ｉ　Ｉｙ−ｇ！ｙ−ａｒｃ＋への付着に関す る一般的反応機構を示す。 第２図は、非修飾抗体（・−・〉；本発明方法により修飾された抗体（Δ−Δ） ；アスパラギン及び／又はグルタミンアミノ酸に対する付着（カルボジイミド） により修飾された抗体（ローロ）を用いた螢光消光データのシップスプロット［ ５ｉｐｓ　ｐｌｏｔ　］を示す。 第３図は、（ａ）非酸化抗体及び（１））第７゜１節により酸化された抗体に対 する励起スペクトルを示す。 第４図は、第７．２節により製造されたフェニルヒドラジド−１〜リペプチド− ＡＭＣ化合物の励起及び発光スペクトルを示す。 第５図は、第７．３節により製造された抗体−フェニルヒドラジド−トリペプチ ドーＡＭＣ（ＡＰＴＡ＞接合体の励起及び発光スペクトルを示す。 第６図は、ある制御により、ＡＭＣを特異性補体を媒介として放出させた実験の 結果を示す。蛍光は３８０ｎｍでの励起を有して４６０ｎｍで監視された。蛍光 の増加は、ＡＭＣが抗体−フェニルヒドラジンートリベ１ヂドーＡＭＣ（ＡＰＴ Ａ）接合体から放出されたことを示し：（ａ）は、グルタルアルデヒド固定化ヒ ツジ赤血球細胞とヒト補体とインキュベートされたＡＰＴＡ接合体を示し、（ｂ ）は、グルタルアルデヒド固定化ラット赤血球細胞及びヒト補体とインキュベー トされたＡＰＴＡ接合体を示し、（Ｃ）は、グルタルアルデヒド固定化ヒツジ赤 血球細胞とインキュベートされたＡＰＴＡ接合体を示し、（ｄ）は、ＡＰＴＡ接 合体のみを示す。 ５、発明の詳細な説明 本発明は、治療剤を、目標抗原に対して指向した抗体或いは抗体フラグメントに 付着せしめることにより製造した抗体−治療剤接合体に関する。治療剤は、直接 に、或いは、リンカ−を介して、抗体或いは抗体フラグメントに付着される。こ のような治療剤或いはリンカ−は、抗体或いは抗体フラグメン１〜のそれらの領 域に選択的に付着され、その抗体或いは抗体フラグメントは、分子の抗原結合部 位の一部でなく、又、直接それに関するものでもない。 ５．１．抗体 本発明によると、いかなる抗原或いはハプテンに対して指向する抗体も用いられ る。通常の抗体が用いられ得るが、モノクロナール抗体がいくつかの点で有利で ある。各モノクロナール抗体は、１つの抗原決定因子に対して特異性がある。更 に各々のモノクロナール抗体が大量に生産できる。 本発明に用いられる抗体は、決定因子、例えば、腫瘍の、細菌の、真菌の、ウィ ルスの、奇生体の、マイコプラズマの、組織適合性の、分化及び他の細胞膜の抗 原、病原体表面抗原、毒素、酵素、アレルゲン、薬剤及び任意の生物学的活性分 子、に対するものでおることができる。 抗原のより完全なリストをめげるため、米国特許第４．１９３．９８３＠、特に ７−１１項を参照ずべきており、その特許明細書を本明細書に参考文献として含 有させる。 更に、異なる抗原決定因子に対して反応する抗体の組合せを用いることができる 。 抗体に付着した化合物の分配及び放出が望まれる場合、補体を活性化すると知ら れる免疫グロブリン・クラスを用いる。他の応用において、補体活性のできない 担体免疫グロブリン類を、用いることができる。このような免疫グロブリン担体 には、ＩＣＩＭ、ＩＱＡ、ＩＣＪＤ、ＩＣＩＥのような抗体のいくつかのクラス 、ＩＣＩＧのいくつかのサブクラス、或いは免疫グロブリンのいくつかのフラグ メント、例えば、半抗体分子（単一の重：軽の鎖対）、或いはＦａｂ、Ｆａｂ“ 或いは（Ｆａｂ’　）２フラグメント、などが含まれる。 抗体フラグメントを用いることが、治療剤の分配には有利でおり得る。何故なら ば、それらの抗体フラグメントは、増加された速度で目標部位に浸透するからで ある。ＩＣＩＧ免疫グロブプロ類のＦａｂ’フラグメントは、抗体分子をペプシ ンによって開裂することで（二価フラグメント（Ｆａｂ’）２となる）、或いは パパインによって開裂することで（２つの一部フラグメント、（２Ｆａｂ）とな る）で得られる。バーハム、 １９８３年　ジャーナル　オブ　イムノロシイ　１３１　：２８９５〜２９０２ 　；ラモイとニソノフ、１９８３年、ジャーナル　オブイムノｉ］シック　メソ ッヅ　５６：２３５　ヘ−２４３［Ｐｕｔｎａｍ、　１９８３゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１３１：２８９５−２９０２；　Ｌａｍｏｙｉ　ａｎｄ　Ｎ１５ｏｎｏ ｆｆ、１９８３．Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）ｌｅｔｈ、　５６：２３５−２４３ ．１゜＝（曲の（Ｆａｂ’　）２フラグメン１〜は、１つ或いは２．３のジスル フィド結合の緩かな還元により分離され得、単価Ｆａｂ’フラグメントか１７ら れる。 Ｆａｂ及び（）ａｂ’）２フラグメントは、完全抗原分子よりも小さく、従って 、目標部位に、或いは、組織に、より容易に浸透する。これは、接合体は生体内 部位（例えば、腫瘍塊、感染部位など）に、より容易に浸透するものであるから 、生体内分配のための右利を与える。更に利点は、抗体フラグメントと形成され た接合体を用いる場合に、それらの断片は胎盤妨害を越えることはないゆえに得 られる。結果として、本発明のこの実施態様を用いて、治療剤を、胎児を化学物 にさらすことなく、妊娠女性に対して生体内部位（腫瘍の如き）に分配すること ができる。 本発明は、治療剤を抗体分子にイ１＠させるだめの数種の方法を利用する。即ち 、　（ａ）抗体或いは抗体フラグメントの炭水化物部分への付着、或いは　（ｂ ）抗体或いは抗体フラグメントのスルフヒドリル基への付着である。どちらの方 法を用いても、付着により、抗体或いは抗体フラグメントの本質的な特徴、例え ば、免疫特異性及び免疫反応性を著しく変えることはないものでなければならな い。更に考慮することには、反応の簡易性と、製造した抗体接合体の安定性がお る。 ５．２．１．酸化された炭水化物部分への付着糖たん白質は、生物学的に小間な マクロ分子であり、ポリペプチド骨格に共有結合的に付着している炭水化物基を 含む構造的な特徴があるものである。抗体は糖たん白質であるので、化合物は、 その分子の炭水化物部に付着できる。 いくつかの炭水化物部は、免疫グロブリンのＦＣ領域上に位置しており、ＣＩ結 合を起こすために必要でおる。免疫グロブリンのＦｃ領域の炭水化物部分はここ に述べる機構において利用され得る。或いは、炭水化物部分を含む任意の免疫グ ロブリン類の「ａｂ或いはｒａｂ’フラグメントは、ここに述べる反応機構にお いて利用され得る。このような免疫グロブリンの例は、プトナムら（１９７３年 、サイエンス１８２：２８７）　［Ｐｕｔｎａｍ　ｅｔ　旦、（１９７３，５ｃ ｉｅｎｃｅ　１８２：２８７）］により理路立てられたヒトＩｇＭである。 以下に詳細に説明するように、抗体或いはＦａｂもしくは「ａｂ’フラグメント の炭水化物側鎖は、選択的に酸化され、アルデヒドを生成する。得られたアルデ ヒドを次に、アミン基（例えば、第１アミン、第２アミン、ヒドロキシルアミン 、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジド或いはチオセ ミカルバジドのようなアンモニア誘導体）と反応させ、シッフ塩基、或いは還元 シッフ塩基（例えば、イミン、エナミン、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒド ラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン或いはそれらの還元形態）を形成 する。 或いは、抗体の炭水化物部分は、酵素技術により他の化学基と、付着させる或い は反応させることができるように修飾することができる。このような酵素の１例 は、ガラクトースオキシダーゼがあり、それは、酸素の存在下でガラクトースを 酸化し、アルデヒドを形成するものである。 ５．２．１．１．酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物部ないしは部分の酸化は、アルデヒド基の形成をもたらす。 種々の酸化剤、例えば、過ヨウ素酸、パラ過ヨ１り素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリ ウム及びメタ過ヨウ素酸カリウムを用いることができる。これらの中で、酸素酸 及び、その塩が、二次反応式或いは望ましくない副反応が希であるので好適であ る。一般的な検討に関しては、ジャクソン、１９４４年、オーガニック　リアク ションズ２、第３４１真中、パントン、１９６５年、オキシデーション　インオ ーガニツタ　ケミストリー第１巻（ワイベルグ編）、アカデミツク　プレス、ニ ューヨーク第３６７頁［ＪａＣｋＳＯｎ。 １９４４、ＩＮ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　２．ｐ、３４１；Ｂｕ ｎｔｏｎ、１９６５゜０ｘｉｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１（Ｗｉｂｅｒｇ、ｅｄ、）。 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ、３６７　］を参照のこ と。 これらの酸化剤による抗体酸化は、既知の方法により行われ得る。酸化において 、抗体は、一般的に、水溶液の形で用いられ、濃度は一般的に１００　ｍ’ｊ　 ／　ｄ以下、好適には、１〜２０＃Ｆ／ｄである。酸素酸或いはその塩を酸化剤 として用いる場合、一般的に水溶液の形で用いられ、そして、濃度は一般的に０ ．００１〜’ｌＱｍＭであり、好適には１゜０〜１０ｍ）ｌである。酸素酸或い はその温の咄は、抗体の種類に依存するが、しかし、一般的には、過剰で、例え ば、酸化する炭水化物の吊の２〜１０倍で用いる。しかし乍ら、最適な泄は、基 礎的実験により決定できる。 抗体を、酸素酸或いはその塩により酸化する方法において、任意の範囲は、約４ 〜８のｐＨ１Ｑ〜：、３７°Ｃの温度、および約１５分間〜１２時間の反応時間 である。 酸素酸或いはその塩による糖たん白質の酸化の間に、光は好適には排除し、糖た ん白質の過剰な酸化を防止する。 ５．２．１．２．酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化はまた、酵素、ガラクトースオキシダーゼにより 行うことができる（クーパーら、１９５９年　ジャーナル　オズ　バイオロジー 　アンド　ケミの濃度は一般的に０．５〜２０ｍ’Ｊ／彪である。酵素は一般的 に、溶液の１ｍｆ！当たり約５〜１００単位で用いられ、ＤＨの範囲は約５．５ 〜８．０である。 酵素反応のｐＨ，基質温度、緩衝剤及び緩衝剤濃度は、上記のクーパーらに報告 される。 ５．２．１．３．抗体−治療剤接合体の製造本発明の抗体接合体（或いは、抗体 リンカ−中間体）は、酸化された抗体を、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン 、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及び チオセミカルバジド基よりなる群から選択される利用できるアミン基を有する任 意のリンカ−或いは、治療剤と反応せしめることにより製造できる。迅速に得ら れた生成物は、最初の（４加生成物から水１分子消失することにより１ｕられる 炭素−窒素二重結合を含むものである。 抗体−０１）−〇＋ＮＨ２−Ｊ？→　抗体−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ十Ｈ２υアルデヒド類 とヒドラジド類の反応を一般的な論議に関しては、１９７８年３月、アドバンス ト　オーガニック　ケミストリー：リアクションズ　メカニズム　アンド　ス１ へラクヂャー、マツフグロウヒル　カンパニー・、ニューヨーク、第８２４　” 　８２５頁中［ＨａｒＣｏ、　１９７８．　ＩＮ　ＡｄＶａｒｒＣｅｄ　ｏｒｇ ａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ＭｅＣ１１ａｎ！ＳｍＳ　 ａｎｄ　Ｓｉｌ”ｕＣｔｔＪｒｅ、ＨＣＧｒａＷ−１ｌｉｌｌ　Ｃｏ、、Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、８２４−８２５１を参照のこと。 約０．５〜２０ｍｇ１威の濃度の酸化された抗体溶液を、治療剤或いはリンカ− と混合しハ　（反応性アミン基の抗体アルデヒドに対する七ル比は、約１〜１０ ，０００の範囲である〉溶液を、約１−１８時間インキュベー１へする。適する 温度は、０−３７°Ｃで、ｐＨは約６〜８である。 ５．２．１．４．抗体接合体の安定化 抗体−治療剤接合体（或いは抗体−１ノン力−中間体）が、第５．２．１．３ｔ に述べた如く抗体と治療剤或いはリンカ−との間に形成された後に、ナトリウム シアノボロハイドライド或はすＩヘリウムポロハイドライドの如き適する還元剤 により任意に安定化できる。 還元剤 抗体−ＣＨ＝　Ｎ−Ｒ→　抗体−〇Ｍ２−Ｎｌｌ−Ｒ還元剤は、一般的に、有効 なアルデヒド基より、約１０−１００倍モル過剰に加えられる。一般的検討に関 しては、ジエントフ１〜とｆアボーン、１９７９年、ジャーナル　Ａブパイオロ ジ　アンド　ケミス［・リ−２５４；４３５９　［Ｊｅｎｔｏｆｔａｎｄ　Ｄｅ ａｒｂｏｒｎ、１９７９．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４：４３５９　］を参 照のこと。 ５．２゜２．スルフヒドリル基への付着遊離スルフヒドリル基は、免疫グロブリ ン分子のジスルフィド結合から生成できる。これは、抗体分子を緩やかに還元す ることにより達せられる。一般的に最も還元されやずい■ΩＧのジスルフィド結 合は、２つの＠鎖を結合するものである。抗体分子の抗原結合領域近くに位置す るジスルフィド結合は、比較的に害されないで残る。このような還元は、補体を 固定する能力の損失をｂたらずが、抗体−抗原結合能を阻害することはない（カ ラッシュら、１９７９年、バイオケミストリー、１８：２２２６〜２２３２　［ Ｋａｒｕｓｈ　ｅｔ　ａｔ、。 １９７９、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：２２２６−２２３２　］。内部重鎮領域中 に生成される遊離スルフじドリル基は、次に、リンカ−或いは治療剤の反応性基 と反応でき、免疫グロブリンの抗原結合部位をｌ］害しない共有結合を形成する 。このような反応性基には、反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を 含む）、ｐ−メルカリベンゾエ−１へ基及び、ミツシェル型付加反応のできる基 （例えば、マレイミド類及び、ミ１〜うとラウ！ヘン、１９７ｉ３年、ジャーナ ル　オブ　アメリカン　ケミストリーソサエティーー工：３０９７〜３１１０［ Ｈｉｔｒａ　ａｎｄ　Ｌａｗｔｏｎ、７９７９．Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈａｍ、Ｓｏ ｃ、　１０１：３０９７−３１１０１に述べられるタイプの基を含む）がおるが 、それらに限定されるものではない。゛′ハロアルキル″という用語は、臭素、 ヨウ素、或いは塩素により置換された、１〜３コの炭素原子のアルキル基を意味 する。 ここに一般的に述べられる抗体及び抗体フラグメン１〜の緩やかな還元のために 適する条件、方法及び物質についての詳細は、スタンウオースとターナ−１１９ ７３年、ハンドブック　オブ　エクスペリメンシャル　イムノロシイ、第１巻、 第２版、ウニイア（編）、第１０章、ブラックウェルサイエンティフィック　パ ブリケーション、ロンドン中［Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｔｕｒｎｅｒ、１ ９７３．ＩＮ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｑｙ、Ｖｏｌ、１，５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｅｉｒ（ｃｄ、） 、Ｃｈａｐｔｅｒ　１０．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ。 Ｌｏｎｄｏｎ　］に児つけられ、その章は、参照のために本明細書に含まれる。 還元された免疫グロブリン或いは還元された抗体フラグメントの遊離スルフヒド リル基へのイ」着により調製された抗体−治療剤接合体（或いは抗体−リンカ− 中間体）は、補体を活性化しないものである。従って、これらの接合体は、治療 剤の開裂及び放出が望ましくない（例えば、治療剤が、特定の基質に作用する光 増感剤或いは酵素で必る）生体内システム内で用いられ得る。このような接合体 は、非補体介在放出が望ましい場合にも用いられ得る。このような実施態様にお いて、治療剤は、還元された免疫グロブリン或いは還元された抗体フラグメン１ 〜上のスルフヒドリル基と、たん白質分解能をもつ酵素、例えば、トリプシン、 ウロキナーゼ、プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子など（もちろんこ れらに限定されるわＣプではない）により開裂可能なリンカ−を介して結合され 得るものである。　□治療剤の抗体分子のスルフヒドリル基への付着は、接合体 の補体固定能力を破壊するが、このような付性方法は、補体介在放出システムに 使用する抗体接合体を作るために用いることができる。このような実施態様にお いて、補体感応性基質リンカ−と結びついた治療剤は、還元ＩＱＧ分子或いは抗 体フラグメントのスルフヒドリルに付着され得、そして、補体を活性化できる完 全抗体分子との混合物中の目標に対して配され得る。 後者のものは、補体を活性化し、それは、前者のものから治療剤を開裂するもの である。補体介在放出システム中の担体分子としての抗体フラグメンｌ〜の使用 は、妊娠女性の処置を可能とし、そして接合体を目標部位中に、より速く浸透せ しめるという利点を提供する。 本発明の一実施態様によると、還元抗体分子のスルフヒドリル基への付着のため に、基質リンカ−或いは治療剤は、ヨードアルキル基を、結合因子の一端に付着 することにより修飾される。リンカ−上の修飾されない部位は、治療剤と、共有 結合的に付着できる或いはできない。例えば、第５．３節で製造されるような治 療剤（第■表および第■表参照）と結合したニスデル或いはアミドである基質１ ノンカーは、ヨードアルキル基の添加により修飾され、それにより、以下に示す ようにヨードアルキル誘導体を形成する（注、＊の記号は、アミド或いはエステ ル結合を示す）。 前記の如く、リンカ−は、活性化された補体、トリプシン、プラスミン、組織プ ラスミノーゲン活性化因子、ウロキ１−ゼ或いはたん白質分解能をもつ他の特定 な酵素によりＵ（１裂可能或いは開裂耐性のもので必り１ｑる。 リンカ−基のヨードアルキル誘導体が、還元抗体分子或いは還元抗体フラグメン トと反応する場合、リンカ−基は、抗体分子或いはフラグメントと共有結合的に 付着することになる。これは、下記の如く示される。 （注、＊の記号は、アミド或いはエステル結合を示す）。 抗体はいかなる治療剤とも付着でき、治療剤は抗体との反応後もその本質的な特 性を保持し、そして、抗体の免疫特異性及び免疫反応性を実質的に保持するもの でおる。ここに用いる“治療剤″なる用語は、その生物学的活性を実質的に保持 する治療剤の化学的変更物及び誘導体をも含むものである。 主要な限定因子は、付着反応が競合する、望ましくない反応を制限する程に十分 選択的であること、また抗体反応性及び選択性を、著しく、阻害しない程度に十 分緩やかなものでなければならないことである。 抗体或いは抗体フラグメントの酸化された炭水化物部分を治療剤と付着せしめる ことが望ましい場合、治療剤は、−第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒド ラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセ ミカルバジド基よりなる群から選ばれるアミン基を含まなければならない。治療 剤は、そのようなアミン基を含まない場合、治療剤は、カップリングのために利 用できる適当なアミン基を導入するために修飾されることができる。 分配システムに使用する抗体に付着すべき治療剤は、意図する適用の目的（即ち 、殺すこと、細胞増殖の防止、ホルモン療法或いはＭ信子療法）に従い選択され る。このような治療剤には、例えば、製薬剤、毒素、毒素フラグメント、アルキ ル化剤、酵素、抗生物質、抗代謝物質、抗増殖性剤、ホルモン、神経伝達物質、 ＤＮＡ、放射線不透性染料、放射性アイソ１−一プ、螢光発生素化合物、マーカ ー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変える化合物及び光化学（ホ１〜ケミカル ）化合物が含まれる。 第工表は、ここで述べる発明で用いることのできる薬剤のいくつかを挙げたもの であり、余す所なき列挙を意味しない。最後に、治療剤の組合せを用いることが できる。 第工表 本発明の一実施例によると、光増感剤及び光熱分解剤を含む光化学量を、治療剤 として用いることができる。効率的な光増感剤には、ポルフィリン類及び変性ポ ルフィリン類（例えば、ヘマｌ〜ポルフィリン、ヘマ１〜ポルフィリンジヒドラ ジド、ジュープロポルフィリンジヒドラジド及びプロトポルフィリンジヒドラジ ド）、ローズベンガル、アク１リジン類、チアジン類、キサンテン類、アントラ キノン類、アジン類、フラビン及び非金属含有ポルフィリン類、ポルフィリン様 化合物、メチレンブルー、エオシン、エリスロシン、１ソラリンなどが含まれる が、それらに限定されるものではない。他の光増感剤には、テトラサイク１ノン 類（例えば、ジメチルクロールテトラサイクリン）、スルホンアミド類（例えば 、スルファニルアミド）、グリセオフラビン、フェノチアジン類（例えば、クロ ルブロムアジン）、デアシト類、スルホニルウレア及び他の多くのものがおるが 、それらに限定されるものではない。光化学量は、特定の波長の光を吸収するよ うに設計され、或いは合成的に製造され得る。光源により作用部位で活性化され る光熱分解剤、例えばアジンＡ　（Ａｚｕｒｅ　Ａ　）は、（アンダーソンとパ リッシュ、１９８３年、サイエンス２２０：５２４〜５２７［Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ　ＰａｒｒｉＳｈ、１９８３，５ＣｉｅｎＣｅ　２２０：５２４−５２７ ］を参照）治療剤として利用できる。 本発明の他の実施態様によると、細胞毒性副産物の製造を伴う基質修飾を触媒作 用する酵素は、治療剤として用いられる。このような酵素の例には、グルコース オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなどが含ま れるが、それらに限定されるものではない。 ５．４．リンカ一 本発明によると、抗体は、少なくとも２つの反応基、１つは、抗体と反応するも ので、１つは、治療剤と反応するものをもつ中間体リンカ−を介して治療剤に共 も一結合的に付着できる。 任意の適合性有機化合物を含むリンカ−は、抗体（或いは治療剤）との反応が、 抗体反応性と選択性を逆に害されないように選択されな【プればならない。更に 、リンカ−の治療剤への付着により、治療剤の活性を破壊するものであってはな らない。酸化抗体或いは酸化抗体フラグメントと反応するために適するリンカ− には、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン 、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基よりなる群か ら選択されたアミンを含むものを包含するものである。このような反応性官能基 は、リンカ−の構造の一部として存在できるものであり、或いは、そのような基 を含まないリンカ−を適当に化学修飾することにより導入できるものである。 本発明によると、還元抗体或いは抗体フラグメントに対して付着するための適当 なリンカ−には、還元抗体或いはＦａｂ’フラグメントのスルフヒドリル基と反 応できる特定の反応基をもつものか含まれている。そのような反応基には、反応 性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基を含む）、ｐ−メルカリベンゾエー ト基及びミツシェル型附加反応のできる基（例えば、マレイミド類、およびミト ラとラウトン、１９７９年、ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミストリー　ソ サエティ１０１：３０９７〜３１１０　［Ｈｉｔｒａ　ａｎｄ　Ｌａｖｔｏｎ。 １９７９、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１０１：３０９７−３１１０　 ］に述べられるタイプの基を含む）が含まれるが、それらに限定されるものでは ない。“ハロアルキル″なる用語は、臭素、ヨウ素或いは塩素で置換された、１ 〜３コの炭素原子のアルキル基を意味する。 治療剤は、リンカ−が抗体分子と付着する前或いは後に、リンカ−と付着できる 。ある適用においては、リンカ−が、連結される治療剤から遊離している抗体− リンカ−中間体を最初に作ることが望ましい。特定の適用に依存して、特定の治 療剤が、リンカ−と共有結合的に付着され１ｑる。 ５．４．１．分枝状リンカ− 治療剤と付着するだめの多くの部位をもつパ分枝状すンカーパに、更に関心があ る。多数部位リンカ−に関して、抗体或いは抗体フラグメントに単一の共有結合 的な付着をすると、いくつか部位で治療剤を結合することのできる抗体−リンカ −中間体が得られる。その部位は、アルデヒド或いはスルフヒドリル基或いは治 療剤が付着できる任意の化学的部位でおり得る。 あるいはまた、より高度な比活性ないしは、抗体分子に対する治療剤より高い比 率が、抗体或いは抗体フラグメント上の多数の部位での単一部位リンカ−の付着 により得ることができる。この多数の部位は、２つの方法のいずれかにより抗体 或いは抗体フラグメント中に導入できる。第１のものは、同じ抗体分子中に複数 のアルデヒド基及び／またスルフヒドリル基を作るものでおる。第２のものは、 抗体分子のアルデヒド或いはスルフヒドリルに、その後のリンカ−への付着のた めの多官能部位を有するパ分枝状リンカ−″を付着させ得るものである。分校状 リンカ−ないしは多数部位リンカ−の官能性部位は、アルデヒド或いはスルフヒ ドリル基であり得、或いは、リンカ−が付着し得る任意の化学的な部位であり得 る。更に、より高度な比活性が、これらの２つの方法を組合せることにより、即 ち、多数部位リンカ−を、いくつかの部位で、抗体或いは抗体フラグメント上に 付着せしめることにより得ることができる。 ５．４．２．開裂できるリンカ− 補体系の酵素、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、 プラスミン或いはたん白質分解能を有する他の酵素により開裂可能なペプチドリ ンカ−は、本発明の一実施態様において用いられ得る。本発明の１方法によると 、治療剤は、補体により開裂可能なリンカ−を介して付着される。抗体は、補体 を活性化できるクラスから選択される。従って、抗体−治療剤接合体は、補体力 スケートを活性化し、そして、目標部位において治療剤を放出する。本発明の他 の方法によると、治療剤の抗体へのスルフヒドリル基を介しての付着は、抗体− 治療剤の補体を活性化する能力を破壊する。補体による放出が望ましい場合、目 標部位に対して指向し補体活性化ができる他の免疫グロブリンが抗体−治療剤接 合体と組合せて投与されなければならない。本発明の他の方法によると、治療剤 がウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン或いは１〜リプ シンのようなたん白質分解能をもつｅ索により開裂可能なリンカ−を介して付着 される。 更に、治療剤は、ジスルフィド結合を介して（例えば、シスチン分子上のジスル フィド結合）、抗体分子に付着できる。多くの腫瘍は自然に高レベルのグリタチ オン（還元剤）を放出するので、これはジスルフィド結合を還元でき、次に、治 療剤を、分配部位で放出できる。 ５．４．３゜スペーサ及び開裂性要素 また更に他の実施態様においては、リンカ−を、治療剤と抗体との間の空間を最 適化するように構成することが必要であろう。これは、一般式： ％式％ （式中Ｗは−Ｎｌ−１−ＣＨ２−或いは一〇Ｈ２−で、Ｑはアミノ酸、ペプチド であり、ｎはＯ〜２０の整数である。）のリンカ−を使用することにより達せら れる。 更に他の実施態様において、リンカ−は、スペーサ要素と、開裂性要素を有する ことができる。スペーサ要素は開裂性要素が開裂に応答する酵素に対して、より 近づきやすくなるように開裂性要素に、抗体分子のコアから離れた位置を与える 。上記の″分枝状リンカー″の或ものは、スペーサ要素として動くことができる 。 この検討を通して、リンカ−の治療剤への付着（スペーサ要素の開裂性要素への 、或いは開裂性要素の治療剤への付着）は、付着或いは反応の特別なモートを必 要としないことを理解すべきである。適当な安定性と生物学的適合性の生成物を 与える任意の反応が用いられ得る。 ５．４．４．血清補体とリンカ−の選択本発明の１方法によると、治療剤の放出 が望ましい場合、補体を活性化できるクラスの抗体が用いられる。得られるもの は、抗原と結合し、補体カスケードを活性化する能力を保持している。 補体は、古典的系路およびプロベルジル系路の２つの方法の１つにおいて活性化 され得る血清たん白質の群に対する集合名である（ミュラー−エバーハード、ホ スピタルプラクティス、　１９７７年８月、　３３〜４３　［Ｍｕｌｌｅｒ　− Ｅｂｅｒｈａｒｄ、）（ｏｓｐｉｔａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｕｇｕｓｔ　１ ９７７：　３３−４３］　）。 古典的系路は、ＩｇＭクラスあるいはＩｇＧの或サブクラスの抗体の、その相当 する抗原への結合により開始され、一方プロペルジル系路は、血清たん白質、プ ロベルジン及び他の非免疫グロブリン血清因子に依存している。（レイドとポー ター　１９８１年、アン、レブ、バイオケム、廷：４３３〜４６４　［Ｒｅ１ｄ 　ａｎｄ　Ｐｏｒｔｅｒ、　１９８Ｌ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、　５０：　４３３−４８４］　）　ａ古典的系路は、本発明の実施の 特に重要である系路である。古典的系路は、ある抗体−抗原複合体（或いは免疫 複合体）の形成にＪ：り特徴づけられ、それは補体系のたん白質分解酵素を活性 化する（ボルソスとラップ、　１９６５年、ジャーナル　オブ　イムノロシイ　 ９５：　５５９〜５６６；コーエン、　１９６８年、ジャーナル　オブ　イムノ ロシイ　」ｙト　４０７〜４１３；］−エンとベラカー、　１９６８年　ジャー ナル　オブ　イムノロシイ　」匹：４０３〜４０６；イシザカら、　１９６８年 　ジャーナル　オブ　イムノロシイ　ユ００　：　１１４５〜１１５３［Ｂｏｒ ｓｏｓ　ａｎｄ　Ｒａｐｐ、　１９６５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９５：　５ ５９−５６６；Ｃｏｈｅｎ、１９６８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１００：　４０ ７−４１３；Ｃｏｈｅｎａｎｄ　Ｂｅｃｋｅｒ、１９６８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１００：　４０３−４０６；　ｌ５ｈｉｚａｋａｅｔ　ａｔ、、１９６８． 　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１００：　１１４５−１１５３］　）。これらの活性化 された補体酵素は、補体カスケードの他の成分を開裂し、そして活性化する。究 極的に、″攻撃複合体パ（或いは分解複合体）の形成が導入され、目標細胞膜集 合体が破壊される。 古典的系路において活性化される第１の成分は、Ｃ２およびＣ４上に作用するプ ロテアーゼとになるＣ１である。 活性化Ｃ１（Ｃ１）は、特定のエステラーゼ活性を有する。 時々、Ｃ３コンバーターゼと呼ばれる活性化されたＣ４゜２　（Ｃ４，２＞は、 Ｃ３をたん白質分解的に開裂する複合体であり、活性化Ｃ３（Ｃ３ｂ　）ととも に、Ｃ５を開裂する。Ｃ３の開裂は、補体活性化の古典的系路とプロベルジン系 路との間の共通で必る第１工程である。 Ｃ１とＣ４，２の両方の酵素活性は、カルボキシ末端エステル或いはアミド結合 で開裂されるものでおる合成ペプチド基質で（第１Ｉ表参照）試験管内で研究さ れている。これらの合成ペプチド基質は、本発明で説明したように、抗体分子と 治療剤との間のリンカ−として用いられ、或いは、スペーサ要素及び開裂性要素 を有するリンカ−の開裂性要素として用いられる。このようなリンカ−は、特異 的補体介在開裂およびその後の目標部位での活性形態における治療剤の放出をも たらす。しかしながら、補体の成分のいずれか、トリプシン、組織プラスミノー ゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミン或いはたん白質分解活性をもつ任意 の酵素により開裂可能な任意の基質はリンカ−として用いられ得る。 従って、本発明のこの実ｔＭ態様によると、治療剤は、開裂性リンカ−或いは開 裂性要素の１末端に結合され、そしてリンカ−基の他の末端は、抗体分子上の特 異的部位に付着される。例えば、治療剤がヒドロキシ基或いはアミノ基を有する アミノ酸或いは他の適当に選択されたリンカ−ペプチドのカルボキシ末端に１、 各々エステル或いはアミド結合を介して付着される。例えば、そのような治療剤 はすンカーペプチドに、カルバジイミド反応を通して付着され得る。治療剤がリ ンカ−への付着を阻害する官能基を含む場合、これらの阻害する官能基を、付着 前にブロックし、接合体或いは中間体製品がいったん作られると、ブロックをと くことができる。例えば、第１図ｊよ、抗腫瘍性薬剤、アルグラン（ハＩｋｅｒ ａｎ）　（バーラフ−ウェルカム［Ｂ　ｕｒｒ。 ｕｇｈｓ　−Ｗｅｔ　ｌｃｏｍｅ　］　）のペプチドｃｓｚ−ｇｌｙ　−ｑｌｙ 　−ａ「９への付着に関する一般的反応機構を示ず。リンカ−の逆の末端或いは アミン末端基が次に、そのまま、或いは、補体を活性化できる抗体分子に結合さ せるための付加的修飾を行なった後に用いられる。 リンカ−（或いはリンカ−のスペーサ要素）は、所望の長さのものにでき、その １端は抗体分子上の特異的部位に共有結合的に付着させることができる。リンカ −或いはスペーサ要素の他端がアミノ酸或いはペプチドリンカ−に付着され得る 。第１ＩＩ表は、本発明の抗体−治療剤接合体を作るワンカー基として用いるこ とのできるいくつかの開裂性要素を挙げる。（表においてｎは○を含む整数であ る。）これらの配列は、アミノ酸を同様な酸−塩基特性で置換することにより、 補体基質配列のそれらのものから誘導されたものでおる。このリストは、余すと ころなく挙げたものではない。 従って、これらの接合体が補体の存在下で抗原と結合する場合、治療剤をリンカ −へ付着するアミド或いはエステル結合が開裂され、活性形態においての治療剤 の放出がもたらされる。これらの接合体は、個体に投与されると、目標部位での 治療剤の分配および放出が）室せられ、そして、治療剤、抗生物質、抗代謝物質 、抗増殖剤、などの生体内分配に特に効果的である。 第■表 Ｎ−Ｂｏｃ−ヂロシンー〇−二トロフェニル　エステル　１Ｎ−ＢＯＣ−フェニ ルアラニン−〇−二トロフェニル　エステル　１Ｎ−ＢＯＣ−リシン−Ｏ−ニト ロフェニル　エステル　１Ｎ−ＣＢＺ−チロシン−ｐ−ニトロフェニル　エステ ル　２Ｃ４，２に対して： Ｎ−７レヂル−ｇｌｙ−１ｙｓ−メチル　エステル　３Ｎ−ＣＩ３１−１ｙ３− メチル　エステル　３Ｎ−アセデル−１ｙＳ−メチル　エステル　３Ｂｏｃ−１ ｅｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ−７−アミノ−４−メチルクマリン　４＊１．シムら、　 １９７７年　バイオケミカル　ジャーナル１６３　：　２１９〜２７　［Ｓｉｍ 　ａｔ　ａｌ、、１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、ｔ６３：２１９−２７コ２、 ピング、　１９６９年、バイオケミストリー　８　：　４５０３〜１０　［Ｂｉ ｎｇ１９６９、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８　：　４５０３−１０］３、ク ーパー　エヌ、アール、　、　１９７５年　バイオケミストリー１４　：４２４ ５〜５１　［Ｃｏｏｐｅｒ　Ｎ、Ｒ，、１９７５Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１ ４　：４２４５−５１］ ４、ケーパレルら、　１９８１年　ジャーナル　オブ　イムノロシイ１２８：１ ９６３〜６５　［Ｃａｐａｒａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１　Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１２８　：１９６３−６５］ 第■表 １に欠する′−」匹生九へ丸へ立ユ之左二１５．４．５．補体活性化のない放出 のためのリンカ−目標とされる分配のざらにまた他の適用においては、補体カス ケードの活性化が究極的に目標細胞を分解するものであるために補体活性化のな い治療剤放出が望まれる。従って、この方法は、治療剤の分配放出が目標細胞を 殺すことなく達されなければならない場合に有用である。目標細胞に対してホル モン類、酵素類、コルチコステロイド類、神経伝達物質類、遺伝子或いは酵素の ような細胞伝達物質の分配が望ましい場合に、そのようなものが最終目標である 。治療剤を血清プロテアーゼによる開裂が穏やかなものであるリンカ−を介して 、補体を活性化することのできない抗体分子或いはフラグメントに、付着せしめ ることにより、これらの接合体は作られる。この接合体を、個体に投与すると、 抗原−抗体複合体は急速に形成され、一方、治療剤開裂はゆっくりと生じ、目標 部位に化合物が放出される。 本発明の一実施態様によると、基質リンカ−は、例えば、ヒドラジン或いはヒド ラジド誘導体にリンカ−の１端を攻撃させることにより、修飾される。リンカ− 上の修飾されない部位は、治療剤に共有結合的付着され得る、或いは、付着され 得ない。例えば、第５．３節に）ホべた如く、治療剤に、エステル或いはアミド 結合を介して付着される（第ばフェニルごドラジン）を、ペプチド鎖の逆のアミ ン端末を攻撃することにより修飾される。この結果、式：（注ビの記号は、アミ ド或いはエステル結合を示す）の構造が得られる。 示された構造式の中で、ヒドラジンはバラ位におるが、オルソ或いはメタの位置 におるヒドラジン部分をもつ化合物を代わりに用いることができる。治療剤にエ ステル或いはアミド結合を介して付着されたペプチドリンカ−のこれらのヒドラ ジド誘導体は、次に、酸化された炭水化物を含む酸化免疫グロブリン或いは免疫 グロブリンフラグメントと反応せしめられる。これは、ヒドラゾン形成および補 体による開裂可能なリンカ−基を介しての治療剤の免疫グロブリンの炭水化物側 鎖への共有結合的な付着という結果となる。所望により、用いられたリンカ−は 、活性化補体或いは血清プロテアーゼのいずれかによる開裂に対して耐性のもの でおり得る。 リンカ−が、血清プロテアーゼによる開裂可能なように設計された実施態様にお いて、１つの得られる構造は、下記に図式的に示されるものである。（注：記号 ６は、アミド或いはエステル結合を示す。） Ａｂ−炭水化物側項一〇Ｈ一 本発明のざらに他の実ｆｉ態様においては、接合体は、治療剤が目標に分配され るが、放出されないように設計され得る。これは、治療剤を抗体或いは抗体フラ グメントに、直接に或いは非開裂性リンカ−を介して、付着せしめることによっ て達成できる。 ５．４．６．１．非開裂性リンカ− これらの非開裂性リンカ−には、アミノ酸類、ペプチド類、Ｄ−アミノ酸類或い は、本明細書に述べられる方法による抗体分子或いは抗体フラグメントへの付着 において後に利用できる官能基を含むように修飾され得る有機化合物が含まれる 。そのような有機リンカ−に関するひとつの一般式は、 Ｗ　−（ＣＩ−（２＞　ｎ　−Ｑ （式中、Ｗは−Ｎ　ｔ−１−ＣＨ２−或いは一〇Ｈ２−で、Ｑはアミノ酸、ペプ チドで必り、そしてｎはＯ〜２０の整数である。）であり得る。 ５．４．６．２．非開裂性接合体 或いは、化合物は、補体を活性化しない抗体分子或いは抗体フラグメントに付鴇 せしめられ得る。補体の活性化のできない担体抗体を用いる場合、この何着は、 活性化された補体により開裂可能なリンカ−を用いる、或いは活性化された補体 により開裂不可能なリンカ−を用いてなされ得る。 ５．５．抗体−治療剤接合体の使用 本発明の抗体−治療剤接合体は、種々の治療学的生体内適用に有用である。 この用途において、″細胞障害″なる用語は、ガン、腺腫、及び過形成を含むす べての腫瘍類；自己免疫疾患、対宿主性移植片病く例えば骨髄移植後）、免疫抑 制疾患（例えば腎臓或いは骨髄移植後）を含むいくつかの免疫学的疾患を含むこ とを意味するものである。このような細胞障害、例えば骨髄移植などの障害の処 置は、望ましくない細胞、例えば、悪性細胞、或いは成熟下リンパ球を排除する （殺すことにより）ことでおる。 治療的適用は、一般的に上記に広く述べられたものを含む種々の細胞障害の本発 明の抗体−治療剤接合体の効果的な量を投与することによる処置を中心とするも のでおる。 抗体の特性は、特定の抗原に対して免疫特異性があり、免疫反応性があるもので あり、特定の細胞、組織、器官、或いは、その特定の抗原をもつ他の部位に対し て、治療剤を分配するために理想的に適するものとなる。 本発明のこの見地によると、抗体−治療剤接合体の抗体或いは抗体フラグメント は、目標部位に、該接合体を分配する役目をする。 接合体を作るために用いられる抗体、リンカ−及び化合物の選択は、分配の目的 に依存するものでおる。特定の目標部位での治療剤の分配及び放出ないしは活性 化は、腫瘍細胞、ガン細胞、真菌、細菌、奇生体或いはウィルスの選択的な殺化 或いは増殖の抑制をもたらすものである。選択された部位に対するホルモン類、 Ｍ素或いは神経伝達物質の標的化分配もまた達せられ得る。究極的に、本発明方 法は、ＤＮＡ或いは特定遺伝子を、生体内或いは試験管内で特別の遺伝子の不足 する目標細胞に分配できる遺伝子治療プログラムにおける１つの適用を有し１ｑ る。更に、この接合体は、虱、二などの腫瘍遺伝子の活性化を″ターンオフ（中 断）′或いは防止するために用いられることができる。 生体内投与は、血清或いは生理的食塩水を含む適当なアジュバントにおいて、ヒ ト血清アルブミンの如き他のたん白質と一緒に、或いはなしで、抗体治療剤接合 体の治療剤を使用するものである。接合体の投与量は、当業者により容易に決定 でき、細胞障害の状態と、用いる治療剤に依存して異なるものである。投与の糸 路は、非経口的投与であり、一般的に静脈内投与が好適でおる。 ５．５．１．光照射療法 本発明の抗体−治療剤接合剤を有利に用いる光照射療法（ここでは、光免疫療法 とも称される）の１つのタイプは、ある化合物の光傷害効果と、目標部位に対す る抗体の部位特異性付着とを組合せることによる障害の処置を含むものである。 光増感剤は、光源により活性化され、その細胞障害効果は、近傍細胞に対する毒 性をもたらすシングレット酵素の生成を通して、媒介されるものである。この効 果は、分子酸素の参与をも包含するものである（この点について更により完全に 考察するには、バーラッシュ、　１９８１年、ジャーナル　オブ　インベスティ グーション　イン　ダーマトロジイ　７７：４５〜５０［Ｐａｒｒｉｓｈ、　１ ９８１．　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇ。 ［）ｅｒｍ、７７：　４５−５０］を参照されたい。）光化学反応の特異性は、 所望の生物学的効果に依存して、用いられるべき固有な波長と、特定の光増感剤 （或いは発色団）とを選択することによって維持され得る。目標部位に分配され るための１つ以上の光増感剤を付着せしめることが可能でおる。所望の波長と効 果とに依存して、治療剤は、相乗的に活性化されるであろう。光増感剤は、目標 部位において光ファイバー或いは他の適切な方法を介してレーザー或いは他の光 源で活性化され得る。 ５．２．２．基質の修飾 本発明の代表的な実施態様において、治療剤による基質活性化は、シングレット 酸素或いは過酸化物の形成を媒介するために用いられ、そして、細胞を殺すこと をもたらすものでおる。この特定の実施態様において、治療剤は酵素である。例 えばガラクｌ−−スオキシダーゼは、ガラクトース或いはガラクトース誘導体を Ｃ６位で酸化するものである。酸化反応の途中Ｃ１分子酵素は、近傍の酸素に毒 性である過酸化水素に転換される。、酵素グル」−スオキシダーぜ、フラボ酵素 は、本発明の実施態様において使用′Ｃ′きる。 この酵素は、β−Ｄ−グルコースに非常に特異性のあるものであり、過酸化物形 成により、抗生物質と（−）て作用て゛きるもので“ある。酵素（ま、抗体分子 に対して一１直接的に或いは非開裂性リンカ−を介ｌ）τ付着できる。個体は、 この接合体を４１効最与えられ、そして゛、次に基質で）Ｗ流される。 細胞を殺すことは、上記方法により過酸化物形成を通してもたらされる。過酸化 物の毒性効果は、第２次の酵素を投与プるにより、好適には、ヒ１−を起源とす る第２次の酵素を投与することにより十分なものとされ過酸化物を、より毒性の ある次亜塩素酸に転換する。適切な酵素の例には、ミニロバ−オキシダーゼ、ラ フ１へパーオキシダーゼ、及びタロロバ−オキシダーゼがあるか、これらに限定 されるも本発明の１つの実）Ｍ態様によると、治療剤は、目標抗原に対して指向 する抗体に付着され得る。ここに述べられる化学的結合法は、得られた抗体接合 体に抗原に結びつく能力および補体カスケードを活性化できる能力を維持するこ とを許容するものである（接合されていない抗体或いは抗体フラグメン１〜がそ のような能力を有する場合。）。結果としで、接合体が個体に投与された場合、 生体内の目標抗原との免疫接合体のこれに続く形成は、個体の血清補体を活性化 することとなる。リンカ−が補体により開裂可能であるように設計されている場 合、化合物は目標部位にａ３いて、補体カスケードの酵素の１ないしそれ以上に より開裂されるものであろう。化合物の放出が目標部位への分配の後に生じるの で、目標分配システムの効率は非常に改善される。 本発明の方法は、仙の目標システムよりも右利なまた別の点を提供する。例えば 、腫瘍のケベでの細胞が、目標抗原決定因子をもつものでないことが知られる。 従って、目標細胞中への内存化が必要である分配システムでは、抗原決定因子を もちそして、接合体を内存化できる腫瘍細胞にのみに対して成功裏に分配するこ とができる。抗原決定因子を所持しないか、或いはこの内存化の不可能な腫瘍細 胞は、処置をのがれるものでおる。 本発明の方法によると、抗体担体分子は、治療剤を目標細胞に分配する。しかし ながら、より重要なことには、ひとたび目標細胞に付着すると、本発明に述べら れる方法は、活性な或いは活性化できる治療化合物の放出或いは活性化をなさせ るものである。放出或いは活性化は、個体の活性化された補体酵素、組織プラス ミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミン或いはたん白質分解活性をも つ他の酵素により媒介され得る、或いは光増感剤の活性化もしくは基質修飾によ り媒介され得るものである。ひとたび放出されると、治療剤は、］」標部位、例 えば、腫瘍塊に浸透することを自由に行なう。結果として、治療剤は、抗原決定 因子を所持しない腫瘍細胞に作用するものである。更に、完全な処理法は、接合 体の内存化に依存していない。 以下の実施例は、本発明の本質を更に典型的なものとするために与えられたもの であり、その範囲を限定するものこのシリーズの実施例の目的は、本発明に説明 される抗体接合体の製法が抗体の抗原結合特性に、カルボジイミド反応がそのよ うな特性に影響を及ぼすという点において、悪影響を与えないものであることを 示すためのものでおる。 この目的のために、ホスホリルコリン基に対する特異性のあるマウス　モノクロ ナールＩ（ＩＭの炭水化物部分が酸化され、そして、エチレンジアミンジ−（Ｏ 〜ヒドロキシフェニル酢酸）［ＥＤＤＨ△］の１，６−ジアミツヘキシル誘導体 に共有結合的に付着され、１．６−ジアミノへキシル〜ＥＤＤＮＡを形成した。 比較のために、１，６−ジアミツヘキシルーＥ　Ｄ　Ｄ　ＨＡは、非修飾ＥＤＤ ＨＡと同様に、カルボジイミド反応を用いるＩＣＩＭモノクロナール抗体の同一 試料へ付着せしめられた。これらの条件下で、１，６〜ジアミノへキシル−ＥＤ ＤＨＡは、有効なアスパラギン酸あよグルタミン酸残塁と結合し、一方、非修飾 ＥＤＤＮＡは、有効なりシン類と結合する。これらの試料の結合特性は、親和力 と均質性を評価するために、もとの抗体と比較された。６，１．マウス　モノク ロナールＩｇＭの酸化リガンド、ホスホリルコリンに対して特異性のあるマウス 　モノクロナールＩｇＭ抗体は、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．０１Ｍ燐酸塩 、’０．１５Ｍ塩化す１〜リウム）ｐＨ６，０中で２ｍ（Ｊ／ｍｌの濃度で酸化 された。抗体含有溶液は、水−氷浴中で冷却され、そして、５６，８μｇのメタ 過ヨウ素酸ナトリウムを添加（１，４２ｍＭｍ！！溶液４０μｐ；最柊の過ヨウ 素酸塩濃度＝０．２６ｍ　Ｍ）Ｌ、た。この反応混合物は、１時間インキュベー トされ、その後、２μΩのエチレングリコールが添加された。これを、更に３０ 分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ 　−２５（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５）カラムを通過させ、そしてたん白質 分画をプールした。 ６．２．リンカ−のＥＤＤＨＡへの１寸着ＥＤＤＨＡ　（１，５（］　、４．２ ｍｍｏｆ）とトリエチルアミン（１，２ｍ１．８．４＋ｎｍｏｌ）が４０ｍ！！ の水で混合された。 この不均質溶液は、６０’Ｃに加熱され、そして０．５時間はげしく撹拌された 。溶液は真空中で乾燥され、そして、次いで、４００ｄの乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチル ホルムアミド中に溶解された。次いで、溶液は、水浴中で冷却され、そして、イ ソブチルクロロホルメート（０，５６ｄ、４．２ｍｍ０１）が添加された。反応 混合物は０．５時間冷却しながら攪拌された。得られたトリエヂルアミンハイド ロクロライト沈澱物は濾過により除去され、そして、ＥＤＤＨＡの混合カルボキ シカルボン酸無水塩を含む濾液は、赤色であった。　１−アミノ−６−１〜リフ ルオロアセトアミドヘキサン（０，８ａ　、　４．１ｍｍ０１＞がＥＤＤＨＡの 上記のカルボキシカルボン酸無水塩に添加された。均質溶液は、４°Ｃで０．５ 時間撹拌され次いで凍結乾燥され、油状の生成物が得られた。この油はアセトン ／エーテル（４：　１　）混合物で洗浄され、黄色の粗生成物が得られた。固体 １−アミノ−６−ドリフルオロアセトアミドヘキシルーＥＤＤＨＡが集められ、 ７％に２　ＣＯ３で加水分解され、ＨＣΩでｐＨ４で再沈澱せしめ、純粋な１， ６−ジアミツヘキシルーＥＤＤＨＡ　（１，４ｇ＞を得た。この化合物はニンヒ ドリンテストで陽性を与え、薄層クロマトグラティは１スポツトのみを示してい る。ＴｂＣＣ５の等モル泄の塩基性溶液の存在下で、２９５　ｎｍでの励起は、 ５４５１ｍの発光をもたらした。それはＥＤＤＮＡとテルビウムイオンとの間に 特性エネルギー転換キレート錯体が形成するためである。 ６．３．ＩｇＭ−リンカー−ＥＤＤＨＡ接合体の製造第６．１節の方法により酸 化された抗体は、第６．２節の方法で調製された１、６−ジアミツヘキシルーＥ ＤＤＨＡの約２７０倍モル過剰により１時間室温でインキュベートされた。これ に次いで、固体ナトリウムシアノポロハイドライドを１０ｍＭの最終ｍ度へと添 加し、更に４時間室温でインキユベーした。次いで、混合物は４°ＣでＰＢＳの いくつかの順列に対して透析され、そして、限外濾過により濃縮された。 ６．４．リンカー−Ｅ　Ｄ　Ｄ　Ｉ−１△のＩＵＭへのカルボジイミド付着 ２６３μΩ　Ｉ（ＩＩＭ抗体（１，９ｍＭ威）に対して、１０ｍｇの１−エチル −３−（３−ジメチルアミノブロピル）カルボジイミド（’＋　１１１１２（７ ）　１０ｍｇ／ｍ溶液、ｐＨ５，０）及びＰＢＳ　（ｐ　Ｈ５，０＞を添加し、 ２．５ｄにした。混合物は、２時間室温でインキュベートされた。次いで２．５ ｍｌの水の中の２７５μΩの０．１Ｍ　１．６−ジアミツヘキシルーＥＤＤＨＡ 　（ｐ　Ｈ５，５）が添加され、そして、溶液は２時間室温でインキュベー１〜 された。１０μΩの１Ｍエタノールアミンが次に添加され、１時間室温でインキ ュベートされた。次いで、これを−夜ＰＢＳ　（ｐ　Ｈ７，０＞に対して透析さ れた。 ６．５．ＥＤＤＨＡのＩ（ＩＭへのカルボジイミド付着肴２６３μΩ　ＩＯＭ抗 体（１，９ｍＭｄ）に、’ＩＯｍ（ｌの１−エチル−３−（３−ジメヂルアミノ プロピル）カルボジイミド（１ｄの１０ｍｇ／ａ！溶液、ｐ　Ｈ５，０＞とＰＢ Ｓ（ｐ　Ｈ５，０＞を添加し、２．５Ｉｎｆｌにした。混合物は、２時間室温で インキュベートされた。これに２．７５ｄの０゜０１Ｍ　ＥＤＤＨＡ　（ｐ　Ｈ ５，５）が添加され、そして、溶液は２時間室温でインキュベートされた。１０ μｐの１製物は、更に、より低減された結合を有していた。この抗体調製物に対 する会合定数は、少なくとも非修飾抗体の測定値よりも低いオーダーの大きざで あった。（この技法によっては正確に測定するには低すぎるものである。）シッ プス分析に単一の抗体異性度指数の仮定は、試料が均質（モノクロナール）であ る場合のみ、データ低減に関して有効でおる。試料の実際の均質性（モノクロナ ール性）にあけるチェックは、シッププロットにあける計算された線との実験デ ータ点の相関関数或いは適合である。第２図のプロットの観察は、非修飾抗体と 炭水化物−付着抗体の良好な一致およびこれらのカルボジイミド−付着のものと の乏しい一致を明白に示すものである。これは、カルボジイミド付着法の選択性 の欠如にほぼ帰因すると思われる。 リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸が、抗体分子の抗原結合領域も含めて 全ての部分で生じている。結果として、抗体の少なくともいくつかは、抗原との 相互作用におけるその後の効果がある結合部位で、或いはその近くで修飾される 。しかしながら、炭水化物への付着の部位は、特異性があり、結合部位よりも遠 い所にあり、これらの実験で示した如く結合特性には、あったとしても、はとん ど変化がないものである。 ７、実施例ニジリーズＩＩ 次の実施例は、抗体分子を関心のある化合物にリンカ−を介して特異的に付着せ しめる方法を例示するものである。 Ｍエタノールアミンが添加され、混合物は１時間室温でインキュベートされた。 ６．６抗体への炭水化物介在付性の効果非修飾マウスモノクロナール抗体及び第 ６．３．６．４及び６．５ｎＨにより調製された抗体接合体（全てホスホリルコ リン基に特異的である）の親和性がロッドウェルと力ｍｍｕｎｏ１．−其毀：　 ３１３−３１６）　（ここに参考のため組込まれる。 ）により示される方法による蛍光クエンチングによって測定された。 本発明の抗体カルボジイミド接合体及び抗体接合体に関するデータを示ずシップ プロットは、第２図に示される。 結合測定は、本発明の炭水化物付着法により修飾された試料（Δ−Δ）に関する 特異性、親和性及び均質性の保持を非修飾のもの（・−・）と比較して、明白に 示すものである。ホスホリルコリン誘導体の結合に関する会合定数は、非修飾抗 体に関して８．１Ｘ１０５　Ｍ−１でおり、炭水化物−付着抗体接合体に関して １．ｌＸ１０６Ｍ−１でおると測定された。 これと反対に、カルボジイミド反応により修飾された第６．４節の抗体調製物（ ローロ）は、多分２．４Ｘ１０５Ｍ−１の計算値より以下のものに結合を低減し た。そして、カルボジイミド反応により修飾された第６．５節の抗体調これらの 実験にあいで付着される化合物は、治療剤と考えられるが、その使用は、抗体の 酸化された炭水化物部分へのリンカ−を介しての特異的な共イｊ結合的付着を例 示するものである。同様のメカニズムにより、治療剤が付着され得、抗体−治療 剤接合体が製造されるものである。 ７．１．抗体分子の炭水化物部分の酸イしこの実施例で用いた抗体分子は、ヒツ ジ赤血球上の抗原決定因子に特異性のあるモノクロチールＩｇＭ　（Ｎｏ、１７ １と呼称される）である。モノクロナール抗体を製造するために、ルイス［１− ｅｗｉｓ］ラツ１〜が、ヒツジ赤血球細胞の単回注射で免疫処置された。３日後 、免疫処置されたラッ１−から稗細胞が収穫され、そしてマツカーン［ＭＣ１（ ｅａｒｎ］ら１９７９年、イムノロシイ　レビュー　４７　：　９１〜１１５　 ［１９７９゜）ｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、　４７：９１−１１５］の方法により 骨髄腫系ＳＰ２１０Ａｇ１４と融合された。クローン化された細胞を次に増殖せ しめ、そして、得られたモノクロナール抗体をキルマンとマッカーン、　１９８ １年、ジャーナル　オブ　イムノロジック　メソツズ　４２　：　１〜９　［Ｋ ｌｉｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｃ　Ｋｅａｒｎ、　ｊ９７１．　Ｊ、［ｍｕｎｏｌ、　 Ｍｅｔｈ、４２：　１−］により説明されるように精製した。 抗体炭水化物の酸化は、抗体をクーパー［Ｃｏｏｐｅｒ　］ら（上記）の方法の 変更によりガラクト−ス　オキシダーゼと反応せしめることにより達成された。 この目的のために、３．８ｍｃ＋のＮｏ、１７１モノクロナ一ル抗体は、０．１ ３５Ｍ　ＮａＣｆ１．０．０１５　トリス−１」ｃ！Ｑ　（ｐＨ７，０＞、０． ５ｍＭ　Ｍ（］　ＣＣ２，及び０．１５ｍＭ　ＭｇＣＱ２よりなる緩衝液１ｍｌ へ添加された。次に、ガラクトースオキシダーゼの）８液（ウォーシントン　バ イオケミカルカンパニー、ニコージャージー州　フリーホルト［ＷＯｒｔｈｒｎ ｇｔｏｎ　Ｂ　ｉｏｃｂｅｍｉｃａｌ　ｃｏ　２．　Ｆｒｅｅｆ）ｏｌｄ、　Ｎ Ｊ　コ　）　の０．１ｉ部分標本を、同じ緩衝液１ｍｌ当り５２単位の酵素濃度 で抗体溶液に添加した。最後に、同じ緩衝液の別の０゜１　ｍｌの中に溶解した カタラーゼ（つＡ−−シン１ヘン　バイオケミカル　カンパニー、ニューシャー シー州　フリーホルト）４３μｇを、反応混合物に添加した（カタラーゼは酸化 反応中に生成した過酸化水素を分解するように添加された。〉反応混合物は、４ ８時間苗温でインキュベートされ、次いで４°Ｃで貯蔵された。第３図は、酸化 されていない抗体（ａ　）と酸化された抗体（ｂ　）の励起スペク１〜ルを示す 。 ７．２．抗体分子への付着のための１−リベブチドーＡＭＣの製造　−一 本実施例のために、合成の蛍光発生素化合物が、接合体パートナ−として利用さ れた。この合成化合物の特性は、蛍光発生素化合物の結合及び遊離の状態が、蛍 光分光区別できるというものである。用いた合成蛍光発生素化合物はセルレバ　 ファイン　バイオケミカル　インコーボレーテツド、ニューヨーク州ロングアイ ランド　ガーデン　シティパーク［５ｅｒｖａ　ＦｉｎｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ、Ｉｎｃ、、Ｇａｒｌｊｅｎ　Ｃ１ｔｙ　Ｐａｒｋ、Ｌ　Ｉ、　ＮＹ］から 得られた（カタログナンバー５１４７４）。この化合物は、アミド結合を介して 蛍光化合物７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＭＣ）に付着している１〜リ ペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）であり、グリシンのアミノ基は、カルボベ ンゾキシクロライド（Ｃｂｚ）によりブロックされでいる。この化合物（以下、 トリベプヂドーＡＭＣ１或いはＧｌｙ−ＧＩＶ−ＡｌＣｌ−ＡＭＣと示す。）の 溝造は、以下に示される。 遊離のＡＭＣの励起及び発光の最大（各々３４５ｎｌｌｌと４４５ｎｍ）は、ト リペプチドに結合したＡＭＣのもの（各々３２５ｎｍと３９５ｎｍ）とは異なる 。これにより蛍光分析検定法を用いるＡＭＣ分子の結合形態と遊離形態とを区別 する手段が得られる。３８３　ｎｍと４５５ｎｍの励起波長と発光波長は、検定 の目的のために最適の差異として用いることができる；これらの波長では、遊離 ＡＭＣは、その最大蛍光の２０％を保持するが、結合ＡＭＣの等モル量よりは、 ５００倍大きい相対蛍光度をもつものである（シマーマンら、１９γ８年、ブロ ク、ナトル、アカド、ソサイ、ニーニスエイ　７５　（２）　：　７５０〜７５ ３　［Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７Ｂ。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７５（２）：　 ７５０−７５３］　）。 トリペプチド−ΔＭＣ化合物のヒドラジン誘導体が製造された。抗体分子の酸化 炭水化物側鎖のアルデヒド基を次に、とドラジン誘導体と反応せしめ、ヒドラゾ ンを形成した。 ヒドラジン誘導体（例えば、４〜フルオロフエニルヒドラジン）を付着するため 、トリペプチドーＡＭＣは、まず、Ｃｂｚｌの除去によりグリシンアミノ末端で ブロックをとく。 これは、トリペプチド−ＡＭＣをトリフルオロ酢酸（シグマ、ミズーリー州セン トルイス［５ｉ（Ｊｌｌｌａ、　Ｓｔ、１−ＯＵｉＳ。 ＭＯ］　”）中に溶解し、モしてＨＢｒガス（マセーソン、ニューシャーシー州 イーストラザーフォード［Ｍ　ａｔｈｅｓｏｎ。 Ｅ　ａｓｔ　Ｒａｔｈｅｒｆｏｒｄ、Ｎ　Ｊ　］　）を溶液中に４５分間発泡さ せることにより行なわれた。生成物、Ｈ２Ｎ　−ａｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒ（］−Ｎ Ｈ−ＡＭＣは、冷却ジエヂルエーテル（ベーカー　ケミカルカンパニー、ニュー シャーシー州フィリップスバック［１３ａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、 　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇｈ、　ＮＪ］を添加することにより沈澱され、無水 エタノール（パブリッカー　インダストリーズ　カンパニー、ペンシルバニア州 ’）））イー／Ｌ／ド［Ｐｕｂｌｉｃｋｅｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｃｏ、。 Ｌ　１ｎｆｉｅｌｄ、ＰＡ］　）中に沈澱させた。無水エタノール中の４−フル オロフェニルヒドラジン〈アルド！ノツチ　ケミカル　カンパニー、ウィスコン シン州ミルウォーキーｒＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ｌｖｌ ｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗ　Ｉ　］　）の等モル量か混合しながら添加された。暗 所で室温で２時間インキュベートされた後、反応混合物を暗所に４°Ｃで貯蔵し た。 得られた生成物（フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ＞は、次の構造を 有する。 この化合物は、紫外線光で励起すると蛍光陽性であり、ヒドラジン基の存在も陽 性であることが示された。１〜リペプチドに結合したじドラジンは、ヒドラジン の色分析測定のために０．１％トリニトロベンゼンスルホン酸水溶液のスプレィ を用いて薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により検出された（ピンク帯色或いは オレンジ−褐色は、ヒドラジンの存在を示す。）ＴＬＣの結果は、トリペプチド −ＡＭＣの移動バンドにヒドラジン基の存在を示していた。 第４図に示されるように、フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ化合物の 吸収スペクトル及び発光スペクトルは、トリペプチド−ＡＭＣスペクトルと同様 であることが分るが、励起最大及び発光最大のシフトは、フェニルヒドラジンー トリベプヂドーＡＭＣの共有結合的修飾と一致している。フェニルヒドラジン− トリペプチド−ＡＭＣ化合物の励起及び発光の最大は、各々３４５ｎｍと３８５ ｎｌｌｌである。生成物は冷却ジエチルエーテルにを用いて溶液から沈澱され、 洗浄され、そして、ジメチルスルホキシド（べ−カー　ケミカルカンパニー、ニ ューシャーシー州フィリップスブラックｒＢａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇｈ、ＮＪ］）中に溶解された。 ７．３．フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣの抗体分子の眞北炭水化物 部分への付着 上記の第７．１節に述べた酸化モノクロナール抗体調製物は、少量の０１１Ｍ酢 酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ５，０＞の添加によりＩ）Ｈ５，１に調整された。計算で（ １０倍過剰な）工二ルヒドラジンートリペプチドーＡＭＣ（第７．２節で製造） を抗体溶液に添加し、次に３７°Ｃで暗所に一夜（約１４時間）インキュベート した。次に反応混合物はセファデックスＧ　−２５（５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２ ５）カラム（ファラマシア　ファイン　り゛ミカルズ、ニューシャーシー州ピ− スカタウエイＵＰｈａｒｍａｃｒａ　「ｒｎｅ　ｃｈｅｍｒｃａ＋ｓ、　ｐｒｓ ｃａｔａＷａｇ、ＮＪ］）上に、反応していないフェニルヒドラジン−トリペプ チド−ＡＭＣを除去するために、クロマトグラフにか【プられた。 たん白質分画の蛍光分光測定は、抗体く抗体−フェニルヒドラジン−トリペプチ ド−ＡＭＣ＞に共有結合的に付着したフェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭ Ｃの存在を確かなものとした。接合体の励起と発光の最大は、各々３２５ｎｍと ３８５ｎｍにある（第５図）。接合体の励起スペクトルにおける２８５ｎｍの大 きいピークは、３８５ｎｌｌｌでの残余蛍光とのトップ１〜フアン吸収により説 明でき、そして、また抗体分子のアミノ酸トリプトファンからＡＭＣへの共鳴エ ネルギー移動の結果でもある。 ８、実施例ニジリーズＩＩＩ 次の実施例は、第７節の方法により製造された抗体接合体からの化合物の特異的 放出を示すものである。これらの抗体接合体は、溶血補体固定検定法により明ら かにされるような補体を固定する能力を保持している。更に、補体系による酵素 的開裂を介しての抗原細胞表面での抗体接合体からの化合物の特異的放出が非溶 血性検定法により示される。 以下の例において、化合物は、蛍光発生性である。従って、蛍光化合物の補体介 在放出は、蛍光分子の結合形態と遊離形態とを区別することのできる検定法によ り検出できる。 この実施例において放出される化合物は、治療剤と考えられないが、その使用は 、補体系おるいはたん白質分解能をもつ血清酵素によるリンカ−の酵素的開裂を 説明するものである。同様の開裂別横により、治療剤が抗体−治療剤接合体から 放出され得る。 第７．１節の物質と処理法を、モノクロナール抗体（Ｎｏ、１７１）の炭水化物 部分を酸化するために記述したように用いた。 ヒツジ赤血球と血清補体の存在において、これらのモノクロナール抗体（Ｎｏ、 １７１＞は、補体酵素カスケードを活性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体 固定は、ヒツジ赤血球の溶解をおこし、ヘモグロビンの放出となる。放出された ヘモグロビンは、分光測光的に検出でき、従って、補体固定のための検定法を供 する。 トリペプチド−ＡＭＣは、第７．２節に述べるように製造された。蛍光発生素化 合物（ＡＭＣ）の特性は、蛍光発生素化合物の結合状態と遊離状態を分光蛍光測 定的に区別できるものである。これは、抗体接合体の補体固定能力の測定に関す る正確な検定法を与えるものである。より重要なことには、それは化合物のその 後の補体介在放出を定量化する手段を与える。 フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣの抗体の酸化された炭水化物部分へ の特異的な共有結合的付着は、第７．３節に述べたように行なわれた。 ８．１．補体固定検定法 用いられた補体固定検定法の２つのタイプは、溶血的と蛍光分析的である。これ らの検定法は、抗体−フェニルヒドラジンートリペプチドーＡＭＣ接合体が、補 体固定能力を有しているか否か、そして、ＡＭＣが補体により開裂されたか否か を決定した。 ８．１．１．ヒト補体の製造 新鮮な採取ヒト仝血１０ｄの試料は、１７時間氷上で凝固させられた。血餅は、 遠心分離によって除去され、そして、得られたヒト血清は、０．５ｍ１ｍ１部分 群において凍結された。ヒ１〜補体は、第８．１．２節に述べろ溶血検定法によ り、これらの試料において活性であることが示された。 ε３．１．２．　神体固定のための溶面検定法約２Ｘ１０８細胞／ｍ！、の）門 度のヒツジ赤血球細胞（ジ１」　ダイアゴノスデツクス、ウィスコンシン州マー ジンソン［Ｇｉｂｃｏ　Ｄｉａｕｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ　Ｉ 　］　）　懸濁液の２００μＱ部分標本を、第７゜３節で調製された抗体−フ丁 ニルヒドラジンー１〜リベプヂド−ΔＭ　Ｃ接合体混合物２０μΩ（約２μ９の だ／υ白質）と混合した。１５分間の混合ｔ３　Ｊ：び３８°Ｃでのインキュベ ージ〕ンの後に、１００μＱのヒ１〜血清補体く第８．１．１節で調製）を混合 物に添加した。３０分間〜１時間３７°Ｃで゛インキ１ベートしｔ、：ｙ２、混 合物を・遠心分離し、細胞をべ１ノツ１へ化した。補体介在細胞溶解の捏度は、 上）ａ液中へ放出されたヘーしグ１］ビンを分光測光的に（４１２ｎｍ）測定す ることにより測定された５、口の検定法の結果は、完全な溶解と、抗体の■１胞 表面への本′ｊ１的に１００″３６の結合・勺承すものであった。例えば、２０ ０μΩのヒツジ赤面法懸濁液を遠心分離することによって形成されたベレツ１〜 へ蒸溜水の添加は、完全に細胞を溶解し、ヘモグ［コビンを放出１−る、、蒸溜 水中で完全に溶解されたじツジ赤血球細胞のト（α液の１：２０希釈は、０１６ ４６のＯ，Ｄ、　を有していた。接合体と補体の添加により溶解されたヒツジ赤 血球の同じ希釈は、０．６７２のＯ，Ｄ、　を右していた。従って、接合体は、 抗原を結びつ（プ、そして、補体を固定する能力を保持していた。 ８．１．３．ＡＭＣの神体介在放出の非溶血性検定法非溶面性検定法の条イ！■ は、グルタルアルデヒド−固定化ヒツジ赤血球細胞（シグマ、ミズーリー州ヒン トルイス）を、正常なヒツジ赤血球細胞の代りに用いた以外、下記と同じ条件と された。グルタルアルデヒド固定化赤血球細胞は、抗体と補体の存在下では溶解 せず、従って、ヘモグロビンは放出されない。八ＭＣの放出を示すために代りに 、蛍光測定検定法か用いられるっ非溶血性システムが、蛍光測定検定法の使用の ために必要て゛ある。なぜなら、ヘモグ１」ビンの存在がこのシステム中で蛍光 測定を阻害するからである。検定法における使用に先だち、これらの固定化赤血 球細胞は、非修飾の抗体と、第７．３節で調製された抗体−フェニルヒドラジン −１ヘリペプチド−ＡＭＣの両方と結σつ（Ｊられる（−とが示された。 抗体接合体からのＡＭＣの特異的補体介在放出を示すために非溶面性検定法が用 いられた。溶血性検定法と同様に、約２Ｘ１０８細胞、・′威のＦｘ、のグルタ ルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球細胞が３７°Ｃで１５分間抗体−フェニルヒド ラジンートリペプヂドーＡ　Ｍ　Ｃ接合体とインキュベ−１〜されｊこ　。 遠心分離し、緩衝液中に再懸濁した後、５０μΩのヒｌ−補体調製物（第８．１ ．１節）が添加され、そして、時間の関数どじで４６０ｎｍでの蛍光が、３８０ １ｍでの励起と共に監視された。（カポレールら、　１９８１年、ジャーナル　 オブ　イムノロシイ、ユ赴：　１９６３〜６５　［Ｃａｐｏｒａｌｅ旦　旦、。 １９８１、、）、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　１２８　：　１９６３−６５］　、比較 対照として、接合体が、ヒツジ赤血球細胞のみで：クツ１〜赤血球細胞及びヒ１ 〜補体（使用したモノクロナール抗体は、ラッ１へ赤血球細胞とは結合しない。 〉の存在°ドで；及びヒツジ赤血球細胞及び補体（使用したモノクロナール抗体 は、ラット赤血球細胞とは結合しない。）の両方の不在下でインキュベートされ た。第６図は、これらの実験の結果を示す。 グルタルアルデヒド−固定化ヒツジ赤血球細胞及びヒト補体どインキュベートし た接合体を示す曲線（ａ　）の（ｂ〉。 （Ｃ）及び（ｄ　”）と名称を付された比較対照との比較は、特異的抗体目標と ヒト補体を含む試料の中での遊離ＡＭＣの放出を明らかに示すものである。従っ て、グルタルアルデヒド固定化ラット赤血球細胞及びヒト補体とでインキュベー トした接合体を示す曲線（ｂ）、グルタルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球細胞で 培養した接合体を示す曲線（Ｃ）、そして、接合体のみを示す曲線（ｄ　）は、 ＡＭＣの放出のないことを示すもので必る。 ９３友施例ニジリーズＩＶ 本発明の一実施態様によると、治療剤は、補体或は他のたん白質分解酵素ににり 開裂可能なリンカ−を介して、抗体或は抗体フラグメントに（４肴され得る。こ のような抗体接合体は、特に身体の中の目標部位で治療剤を放出することが望ま れる治療的適用に有用である。第５節に詳論した如く、抗体−治療剤接合体は、 治療剤を抗体−リンカ−中間体に付着せしめることにより、或は、抗体をリンカ ー−治療剤中間体に付着せしめることにより製造されることができる。 本発明のもう−の方法によると、抗体或は抗体フラグメントを還元する付着のた めに、リンカ−（例えばＧｌｙ−ＧＩＶ−Ａｒり）は、還元された抗体或はＦａ ｂ’　フラグメントのスルフヒドリル基と反応できる反応基を含むように修飾さ れなければならない。このような反応基には、反応性ハロアルキル基（例えば、 ハロアセチル基を含む）・、ｐ−メルカリベンゾエー１〜基、ミッチェル型附加 反応のできる基（例えば、マレイミド類及びミトラとラウトン、　１９７９年。 ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサエティむ）があるが、これらに 限定されるものではない。゛′ハロアルキル″なる用語は、臭素、ヨウ素或は塩 素で置換された１へ・３の炭素原子のアルギル基を意味する。 以下の実権例（シリ−てＩＶとＶ）において、リンカ−１例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ −Ａｒｙと共有結合的に付性した（ＡＭＣ）Ｃｆｆｉはアミノ酸チロシンが、酵 素による開裂を介して放出された。これらの実施例においてリンカ−の開裂によ り放出された化合物（ＡＭＣとチロシン）は、治療剤でないと考えられるが、そ の使用は、トリプシン、ウロキナーぜ及びプラスミンと組１熾プラスミノーゲン 活性化因子のような血清酵素による酵素的開裂を説明するものである。Ｉｉ′ｉ １様の機構により、治療剤が、そのような酵素により、本発明のリンカー−治療 剤中間体から開裂されることができる。 シリーズＩＶにおいて、ＡＭＣ或はチロシンは、遊離リンカ−から酵素的に開裂 された。シリーズＶにおいては、ＡＭＣ或はチロシンが、遊離抗体−リンカ−接 合体から、そして、目標細胞に結合した抗体−リンカ−接合体から酵素的に開裂 された。従って、２つのシリーズの実験結果の比較は、開裂速度にあＣプる分離 ）３　（ＡＭＣ或はチロシン）の効果、更に、環境の効果（即ち、３！ｉ７離リ ンカ一対遊離抗体−リンカ−接合体対目標細胞に結合した抗体−リンカー−接合 体）が示される。 ９．１．　トリプシンとウロキナーぜによるトリペプチド−ＡＭＣの開裂 この実験のために、ニューヨーク州ガーデンシティーパークのセルバ　フッイン 　バイオケミカル　インコーホレーデラド［５ｅｒｖａ　Ｆｉｎｅ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｇｒｄｅｎ　Ｃ１ｔｙＰａｒｋ、ＮＹ　ｊから （１，）だ合成蛍光発生素化合物Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＨＣを利用した。 ペグチドリン力−の開裂速度は、パーキン　エルマーＪＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅ ｒ］　６！１０−１０５蛍光分光光度計（パーキン　エルマー　］−ボレーシ〕 ン、］ネチカツ１−州　ノルウオーク［Ｐｅ「ｋｌｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ、　Ｎ０ｒＷ旧に、ＣＴ］　）を用い、蛍光消光により測定し・た 。励起波長と発光波長は、各々３８Ｑｎｍと４６０μｍであり、そして、温度は 、２５°Ｃに、ラウダ［Ｌａｕｄａ　］　Ｋ−２／Ｒ還流水浴（プリンクマン　 インスツルメンツ、ニューヨーク州　ウェストバリー［Ｂｒ　ｉ　ｕｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　ＮＹ　］　）により保持され た。 ＋Ｆ／１ Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−＾ｒ（］−ＡＭｆｌ：の初期濃度は、光学温度ニＪ’：　ｌ／ ）　Σ３２５＝　１６．０００と測定された。溶液は１μＭ濃度に調整された。 １）Ｈ７，４のＰＢＳ中の１μＭｌ液１ｍｅを、キュベラ１〜中に入れた。次に 、酵素の適切♀（１／、１ｇ／ｄのトリプシンン或は１Ｑｕ、ｇ、、／７！のウ ロキナーゼ）が、室温で攪拌しながら；ドーター駆動注射器を用いて添加され、 そして、反応活動は、数分間涜けられた。遊離ＡＭＣの既知濃度の蛍光強度を確 立し、そして、この蛍光検定系に８【プる遊ＨＩＡＭＣの１　ｎＭ／分当りの単 位の変化を測定するための基線として用いた。検定の結果を第１Ｖ表に記す。 第１Ｖ表 放出基の　プシン　ナーゼ ９、　Ｉ　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｔ−１ｃ　１μ）ｌ　３５　１６９、Ｉ 　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ）Ｉｃ　１１．ｔＭ　７５　６０９、　Ｉ　Ｇｌ ｙ−Ｇｌｙ−ＡＩＣＩ−Ａ）Ｉｃ　１μ）ｌ　１７０　７８９．１　デキストラ ン−Ｇｌｙ　ｉμｌ（８，４，９−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭ’Ｃ ９、Ｉ　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ１００μＭ　２０，０００　不検出９ ．３　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−丁ｙｒ’　０．１μＩ（４，０１９，４Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−０，１μＭ　３　．０ｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ 　’ １、節＝実験を記）ホした節 ２．１００μ／ｄトリプシンは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ％貿溌度で１ ００μＭでおる実験で用いた。 他の実験において、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＨＣ９度は１００μＭで必り、 用いたトリプシンは１００μＱ、／ｄであった。この検定の結果も第１Ｖ表に示 した。 本発明の他の実施態様において、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｑ−ＡＭＣが、第５．４ ．３節に示したようにスペーサーとして与えられ得る酸化デキストラン（ｉｏ、 　ｏｏｏ分子量）（）７ラマシアフアイン　ケミカルズ、ニューシャーシー州　 ビス力タウエイ［円）ａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉ ｓｃａｔａＷａｙ、　ＮＪ］　）と本発明方法により、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＡＨＣとデキストランのモル比　５８：１を用いて接合された。デキストンー ＧＩＶ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣは、６．５ｍｌのセファデックスＧ−２５カ ラム（ファラマシア　フン・イン　ケミカルズ、ニューシャーシー州　ビス力タ ウエイ）で分離された。 この節の方法を用いるデキストラン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの酵素的 開裂も、第１Ｖ表に概要した。 同様の補体成分であるペプチド配列が、トリプシン（０゜１μｇ／戴）、ウロキ ナーゼ（０，１μＣＩ／ｍＩり　、プラスミン（１μｇ／ｄ）および精製補体成 分（４０μΩ／ｄ）により開裂された。第７表のデータは、これらの配列の開裂 速度（ｎＭ／分）を比較するものある。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒａ−Ａｔ４Ｃの開 裂のための第８節に示した蛍光検定法をここで用いた。補体成分は精製され、そ して、タックとプラール（バ定された。 つ。 援 両液、ｐＨ８，６中で高電圧（１２０Ｖ／ｃｍ）で泳動された。３μりのブロモ フェールブルー溶液か、泳動の終了を決定するマーカーとして用いられた。次い で、アガロース　ゲルは、区画に細分化され、ＬＫＢ　１２７１ガンマ−カウン ター（エルケービー　インスツルメンツ、メリーランド州ガイぜルスバーグ［［ Ｋ８丁ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＨＤ　］）中て 、Ｔｒｙ＊がもとのところに保持されたか或は、ゲルを通して移送されるかを決 定するために計数された。或は、上記のように丁ＩＣにより試料は分離され、そ して、同定された。試料は、酵素とインキュベートされた後Ｔ　Ｉ−（ブタノー ル：酢酸：水）中で行なわれた。プレー１〜を乾燥し、１０区画に分りで、ガン マ−カウンターで計数した。 １２５■標識されたチロシン残塁は、この系において標識されていないペプチド よりも更に移動するものである。 双方の系において、下記のようにペプチドは開裂される。 トリプシン及びウロキナーゼの開裂速度は、第１Ｖ表に概略されている。 ９．４．１−リプシン及びウロキナーゼによるプラスミノーゲン同類体の開裂 次の実験においてｔよ、　■敢躬ｉ生標識されたプラスミノーゲン同類体Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　＊が、標準的ペプチド同 相合成法（バラニーとメリーフィールド、ザペプチドズ、第２巻、イー、グロス とジエイ、メインホノ７−編、アカデミツク　プレス、ニューヨーク州、　１９ ８０年　第１〜１８０頁中［Ｂａｒａｎｙａｎｄ　）ｔｅｌ’ｒｉｌ’１ｅｄｌ ｄ、　ＩＮ　ｒｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｖｏｌ、　２．　Ｅ、　Ｇｒｏｓｓ 　ａｎｄ　Ｊ、　ｔ−１ｅｉｎｈｏｆｅｒ、　ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９８０．　ｐＤ　１−１８０」）により合成された。 それを、上記のように、酵素トリプシン（１μＣｌ／ｄ）及びウロキナーゼ（１ ０μｇ／ｍｌ）より開裂し、そして上記のＢＡＷ溶媒系において丁ＬＣにより検 定した。ペプチドは下記のように開裂される。 酵素 Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｔ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−丁ｙｒ　＊　→Ｐｒｏ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ　＋　Ｖａｔ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−丁ｙｒ　＊これらの検定において 、ペプチドの放射性標識されたＴｙｒ＊残塁は、標識されていない部分よりも更 に移動した。 開裂速度は第１ｖ表に概略されている。 ９．５．　精製された補体成分同類体の開裂更にもう１つ、の実験において、固 相合成（バラニーとメリフィールド、上記）により製造されたフェニルヒドラジ ンアミノカブロン酸に共有結合的に付着した、　Ｉ放射性標識されたＣ３補体成 分同類体 は、精製された補体成分Ｃ１Ｓ　（１０μＱ、／ｍρ）とＣ１Ｎ、Ｃ４，２（４ ０ｆｌＱ／ｄ）により開裂された。補体成分は、タックとブ゛ラール、　１９７ ６年　バイオケミストリー１５：　４５１３〜４５２１　ｉ’Ｔａｃｋ　ａｎｄ 　Ｐｒａｈｌ、１９７６、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５：４５１３−４５２１　］の 方法により精製された。ペプチドは、次のように開裂された。 ＮＨ２−ＮＨ（）ＮＨ−Ｃａｔ）−１ｅｌ−Ａｌａ−Ａｒ（１−３ｅｒ−ＡＳｎ −丁ｙｒ　”−Ｌｅｕ　−＋酵素 これらの検定において、ペプチドの放射性、標識されたＴｙｒ“残基は、標識さ れていない部分よりも更に移動した。 開裂速度は、第ＶＩ表に概略されている。 第Ｖ１表 開裂速度 ｎＨ／分 放出単基質　Ｃ１ｓ　Ｃ１ｓ、Ｃ４，２阜　′ｌ″？　濃　度１０μｇ／…１４ ０μｇ／ｍ１Ｎｆ１２　−ＮＨ−ＮＨ−Ｃａｔ）−ＬｅＵ　５μ）ｌ　、０１　 ．０１−へｌａ−Ａｒｇ−３ｅｒ−八５ｎ− Ｔｙｒ　＊−Ｌｅｕ １０、実施例ニジリーズ■ ２つの特異的モノクロナール抗体が、次の実験（ヒツジ球細胞に対１−るＮＳ４ 　：　１−マウスＩＱＭ及びヒツジ赤血球細胞に対するＬＬ−１１５１−マウス Ｉ　ｇＧ）に利用さ放射性標識された抗体−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｙ−Ｔｙｒ　 が、下記の如く本発明の１方法により製造された。抗体＜ＬＬ　１１５１）の炭 水化物部分は、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の約１ｍｇ／ｍＲの抗体を、ｐＨ ６で１００ｍＭメタ過ヨウ素酸塩（ＮａＩＯ＞１１０μＮ　（１０ｍＭ（Ｎａｔ ０４　）の最終濃度となる）と、１時間氷上で暗所にて反応せしめることにより 酸化された。 第９゜３節の方法により製造されたＧｌｙ−ＧＩＶ−Ａｒｇ−丁ｙｒ＊は、下記 の第１２．１節の方法で酸化された正常ヒトＩＣＩＧ或はＬＬ１１５１或【よＮ Ｓ４　：　１抗体と、０．１Ｍ燐酸ｔＷ　ｍ　’ｔＮ液ＤＨ６，０中の３００倍 モル過剰なＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ　”で抗体をインキュベートするこ とにより結びつけられた。イミンを還元するために、ナ１ヘリウム　シアノボロ ハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３）が、１０ｎＭの最終濃度へと添加され、そして 、反応混合物は、室温に２時間保持された。反応していないＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａ ｒｇ−丁ｙｒ　＊はゲル濾過により抗体接合体より分離された。試料は、１威の １０％ＢＳＡで予め被覆した５威のセファデックスＧ−５０カラム（ファラマシ ア　ファイン　ケミカルズ、ニューシャーシー州ビスカタウエイ）を通過させ、 ＰＢＳ、ｐＨ７，４で流した。たん白質分画はプールされた。 １０．２．　トリプシン及びウロキナーゼによる抗体−ＧＩＶ−Ｇｌｙ−Ａｒ（ １−Ｔｙｒ″　接合体の開裂第１０．１節の方法により製造した抗体−Ｇｌｙ− ＧＩｙ−Ａｒ（］−Ｔｙｒ　”　接合体が、リンカ−の開裂の後にゲル濾過によ り１２５■チロシン残塁の放出に関して検定された。該接合体は、第９．２説に 述べたように酵素１〜リシン（ｔｒｙｓｉｎ）（１００μ０／ｒｄ或は１０μｇ ／ｍｌ）或はウロキナーゼ（１００μΩ／ｌｔｄ！’）により開裂され、そして 、混合物は、セファデックスＧ−５０カラム上でクロマトグラ、フにかけられた 。この系において、開裂されたＴＹｒゞはカラムにより遅延された。従って、開 裂は、カラム上のゲル濾過後の小イドホリュームピーク中の放射能の損失によっ て測定された。抗体−ペプチドは下記の如く開裂された。 抗体−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ　’−抗体−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−へｒｇ＋ Ｔｙｒ　′酵素 この実験の結果は、第Ｖｌ１表に概略されている。 １０．３．　細胞に対する抗体−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−丁ｙｒ’接合体の付 着と、酵素【こよる開裂 この実験【よ、抗体−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒａ−丁ｙｒ　接合体からの ＴＶｒ“の開裂を例示するものありであり、ここにおいて抗体接合体は、細胞の 抗原決定因子へ付着された。 ２０彪のグルタルアルデヒド−固定化ヒツジ赤血球細胞（ＧＳＲＢＣｌｌ　Ｘ　 １０９細胞／／ｎ１）を、緩衝液１（０゜１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０５Ｍｈリス （Ｔｒｉｓ）　、０．　１ｍＥ、ｉｍｆ！　Ｂｓ△、Ｉ）Ｈ８゜０）中に洗滌さ れ、そして、２ｄの緩衝液■中に再懸濁された。細胞は、第１０．１節の方法で ＷａしたＩ　Ｓ　１１５１−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｏ−丁ｙｒ　（或はＮＳ　４ 　、１　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−丁ｙｒ　）と、３０分間Ｏ′Ｇでインキュベ ートされ、モして、更に、３０分間３７°Ｃでインキュベートされ、緩衝液■で 数回洗滌され、そして、最後に、１（Ｍの緩衝液■中に再懸濁された。酵素トリ プシン（１０Ｍｇ／ｍｌ）或はウロキナーゼ（１０μＱ／ｄ）のいずれかが１威 の細胞部分標本に添加され、０，１５．６０及び１８０分間３７°Ｃでインキュ ベートされた。比較対照群は、酵素の添加がない以外は同じ方法で処理された。 ３７°Ｃでのインキュベーションの後に、細胞は緩白液で洗滌され、ｌＮ　Ｎａ ＯＨ中に再縣濁すレ、ソシテ、ＬＫＢ１２７１ガンマ−カウンター（エルケービ ーインスツルメンツ、メリーランド州力イゼルバーグ［ＬＫＢ］［Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、　ＭＤ　］　）中でδ１数された。開 数／分（ＣＰ　Ｍ　）の損失の％は、比較対照のものと比較され、開裂されたＴ Ｖｒ９の最か計綽された。 結果は、第Ｖ１１表に概略されている。 １０．４．　細胞抗体Ｇ　ｌ　ｙ−吐り卸七Ａ凹ヨレ成と開裂この実験は、目、 漂細胞に付着した抗体−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ）Ｉｃ接合体からのＡＭＣ の開裂を示すものである。 ２威のグルタルアルデヒド固定化じツジ赤血球細胞（ＧＳＲＢＣ１１Ｘ１０９細 胞／ｍｆ！、）が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酸１）−ＶＢＳゲル緩衝 液中で洗滌された。 ペレットは、下記の第１２．１ｆｆｆｌに示されると同じ方法を用いて製造され たＬ　Ｌ　１１５１　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ接合体とインキュベート され、そして、３０分間３７℃でインキュベートし、更に、３０分間Ｏ°Ｃでイ ンキュベ−１〜した。こ混合物は、ＥＤＴＡ−ＶＢＳゲル緩衝液で洗滌され、そ して、２．２厩のＰＢＳ、ｐＨ７，４中に再懸濁された。混合物は、２つの部分 に分けられた。 次に、トリプシン（１μｇ／ｄ）或はウロキナーゼ（１μｇ／ｍｌ）が、再懸濁 された原料の１つに添加された。他の部分は、比較対照とした。次に、接合体は 、３７°Ｃでインキュベートされた。インキュベーション期間中の種々の時間で 、混合物は、遠心分離にかけられ、そして、上澄液の蛍光が、第９．１項で述べ たようにパーキン　エルマー６５０−１０５蛍光分光光度計を用いて測定された 。結合ＡＭＣ（比較対照）の既知濃度の蛍光を測定し、開裂後のｎＭ・′分によ る変化を計停した。 結果１ま、第７１１１表に概略されている。 第７１１１表 目標細胞に何台した抗体接合体 からのＡＭＣの開裂 開裂速度 酵素 基　質　１ヘリプシン−ウロキナーゼ ＧＳＲＢＣ−１１１１５１− Ｇｌｙ−Ｇ１１７−Ａｒｇ−ＡＭＣＯ，４８０，１４１１、実施例：ポルフィリ ン誘導体の製造法の実施例は、特異的に抗体分子に何着した場合、生体内治療の ため光活性化性細胞傷害剤（或は光増感剤）として用いることのできる新規なポ リフィリン誘導体を示すもウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ　ケ ミカルズ’　［ＡＩｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｈｉｌｖａｕｋｅｅ、 　Ｗｌｌから得た市販のジュウテロポルノイリンジメヂルーエステル（９８％、 ０．０５ｇ、０．０９３ｍｍｏｌ　）が、１０ｍ（７）Ｕ燥メタ／−ル中に懸濁 され、そして、１０μｐの無水ヒドラジン（９，０ＩｎＦＪ、　０．２８ｍ　ｍ ｏｌ　）が添加サレタ。溶液ハ、約４時間還流され、そして、蒸発されて、深赤 色の固体を得つィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ　り゛ミカルズか ら得た市販のプロトポルフィリン　ジメチルエステル（３４５ｍｇ、６０ｍｍｏ ｌ＞が３０ｍ１の乾燥メタノール中に懸濁された。無水ヒドラジン（４，８，０ ｍｆｆ、１．５ｍｍｏｌ　、４７．４μ夛）が添加され、そして、その溶液は２ ４時間還流された。蒸発は、深赤色固体を与え、それは多くの有機溶媒において ほんのわずかしか溶けなかった。 １１．３、　ヘマトポルフィリン　ジメチルエステルの製造 市販のへマ］−ポルフィ１ノン（３，０ｇ、５ｍｍｏｌ　）がウィスコンシン州 ミルつ片−ギーのアルドリッチ　ケミカルズから得られ、磁石撹拌器を備える２ ５０ｍｊ！のエーレンメーヤー　フラスコ中の５０ｍ１乾燥メタノール中に懸濁 され、そ（）て、氷浴中でＯｏＣに冷却された。エーテル性ジアゾメタン溶液（ 約１２５ｄエーテル中に約１７ｍｍｏｌ）が、ゆつくりと、２５分間かけて、定 常的に攪拌しながら添加された。１昆合物は、０°Ｃで１時間攪拌され、次に、 窄温で一夜暗所にて攪拌された。溶液の蒸発は、深赤色固体を与え、それは、薄 層クロマトグラフィ技法、（ソノとアサクラ。 ）により５％メタノールと９５％クロ［］ホルムよりなる５展聞溶媒を用いて分 離された。数種の成分が、同定され、それには、０．１４のＲｆ値をもつ大きな ピンクスポットを与える主成分が含まれていた。ジメチル　エステルは、メタノ ール性ヒドラジンによる標準処理により相当するヒドラジドに添加され得た。 １１．４．　ヘマトポルフィリン　ジヒドラジドの製造へマドポルフィリン遊離 塩Ｍ　（０，５ｇ、　８．３５　ｘｌＯ−４ｍｏｌｅ。 シグマ　ケミカル　カンパニー　ミズーリー州セントルイス）が、２００ｄの乾 燥Ｎ、Ｎ−ジメチルボルムアミド中に溶解され、そして、０．２４ｄのトリエチ ルアミンが添加され、窒素ガス下で、２０分間室温で攪拌された。この均質な溶 液は水浴中で冷却され、そして、０．２１８ｄのイソブヂルクロロホルメート（ １，６７ｘ１０−３モル）が添加された。１時間攪拌した後に、０．１３２ｍ！ ！（４，１６ｘ１０−３モル）の無水ヒドラジンか添加された。溶液は暗所で４ °Ｃで１時間攪拌し、そして、更に１時間室温で攪拌した。 溶液は、ロータリー　エバボレイタ（ロタパップ、バチ。 ブリンクマン　インスツルメンツ、ニューヨーク州ウェストバリー［Ｒｏｔａｖ ａｐ、　Ｂｕｃｈｉ、　Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｗｅ ｓｔｂｕｒｙ、　ＮＹ　］　）で乾燥され、深赤色の残渣か得られた。蒸溜水が 、該残渣に添加され、該溶液がｐｌ−１１２にＩＮ　ＮａＯＨにより調整され、 更に多くの沈澱物が得られた。固体生成物は、濾過により除去され、蒸溜水で洗 滌され、真空乾燥器で乾燥され、深赤色の結晶を生成した。 １１．５．　フィコルーｌ＝ドラジドーホマトボルフィリンの製造 フィコルア０　［Ｆｉｃｏｌｌ　７０　］はファラマシア　ファインケミカルズ 　インコーホレーテッドにュージャージー州ビス力タウエイ）から１Ｕられた。 フィコルーア００カルボキシメヂルＷ％体（ＣＭ−フィコル）がインマン（Ｉｎ ｍａｎ　）更法により製造された。２ｇのＣＭ−フィコルが、１００ｍ１の水に 溶解され、１０Ｃ］のアジピン酸ジヒドラジドがゆっくりと添加された。ｐＨが 、１ＨＨＣρの滴加により４．７に調整され、次に、１．２５０の１−エチル− ３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミドが添加され、そしてｐＨ は、１Ｎ　ＨＣρにより４．７に再調整された。 次に、反応混合物は２０時間２３〜２５°Ｃで攪拌された。 粗反応生成物はゲル濾過クロマトグラフィにより、セファデックス　Ｇ−２５の ４．５ｘ５５ｄカラム上で精製された。カラムは、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、 ０．０１Ｍ燐酸ナリトウム、０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐｉ−１７，４＞で 溶出され、そして、ボイドホリューム分画がたくわえられた。次に、ビドラジド ーフィコルは水に対して透析され、そして凍結乾燥された。最終生成物【よ、ソ イコル１モル当り約１５０ミリモルのヒドラジドを含んでいた。 ヒドラジド　フイ」ル（０，２５ｇ、０．００４ｒａｍｏｔノイ」ル　０．２３ １１１ｅＱ、ヒｌ′ニラシト）が１０ｄの水（Ｊ溶解され、ｐＨ５，０に調整さ れた。ヘマトポルフィリン（０，０６９Ｃｌ、Ｑ、１２ｍ　ｍｏｆ　）が、添加 され、次（Ｊ、史に、１・丁チル−３−（３−ジメチル−アミ７〕１０ピル）（ ０゜４、４　ｇ、２．３ｍ　ｍｏｌ　）が添加され、反応五合物Ｇ、に一夜攪拌 された。次に、溶液（よ、Ｎａ２００３溶液、ＤＨ９，０に対して約５８間透析 された。次に、溶液は凍結乾燥され、そして、褐色を帯びた粉末は０°Ｃで貯蔵 された。 １２．１．　実施例：ヘン１−ポルフィリン　ジヒドラジドの抗体への付着 次の実験で利用される特異的マウス　ｔ−ツクＤ太−ルＪｉｉ体は、０７丁−０ ２１−Ｃ必っだ。この抗体は、ヒ１へ細胞傷害７′抑制因子　丁−リンパ球上の 糖たん白質抗原に対して特異性のあるモノクロナールＩｇＧである。 １２．１．　抗体−へ７１〜ポルフイリン　ジヒドラジド接合体の製造 ヘマトポルフィリンジヒドラジドは、細胞障害の光照射処置における使用のため のＣＹＴ−０２１抗体に付着せしめられた。抗体−へマドポルフィリン　ジヒド ラジド接合体は、本発明方法の１つにより、先ず抗体成分の炭水化物部分を酸化 することにより製造された。ＣＹＴ−０２１抗体の炭水化物部分は、燐酸塩緩衝 食塩水（ＰＢＳ）中の約”１ｍ９／ｄ、の抗体を、Ｉ’）Ｈ６て１１０μＮの１ ００ｍＭ　メタ過ヨウ素酸す１ヘリウム（ＮａＩＯ３）と、（１０ｍＭさＪａＩ ○４の最終濃度を与える）１時間暗所で氷の上で反応させることにより酸化され た、。 過剰なＮａ１Ｏ４は、燐酸塩緩衝音Ｊｉ水中の１ｍρのウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ△）溶液で予め洗滌した１０ｍｅのセフン７デックスＧ−２５カラム（）？ラ マシア　ノ／フィン　ケミカルズ、ニューシャーシー州ビス力タウエイ）上を通 すことにより除去された。たん白質は、ＰＢＳ、ＤＨ６で溶出され、そして、１ ｍ分画が集められ、０Ｄ２８０測定され、そしてたん白質分画をプールした。酸 化されたＣＹＴ−〇２１抗体は、次いで、■−Ｆ述べるようにへ７１〜ポルフイ リン　ジビトラジｌへに付１ｔｂめられ、そして、、ＣＹＴ−〇２１２１ｍへ７ １へポルフィリン　ジビ゛１−ランド接合体は、直ちに使用される、或は、光か ら遮蔽されて一２０°Ｃで凍結貯蔵された。 ヘマトポルフィリン　ジヒドラジドは、以下の如く酸化された０７丁−０２１抗 体と結合された。ヘマトポルフィリン　ジヒドラジド溶液は、５ｍ’Ｊのへマド ポルフィン　ジヒドラジドを５０ｇｇのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）中に溶解することによって製造された。ヘマトポルフィリン　ジヒドラジドの ９９は、５ｍ１の脱イオン水を添加することより”Ｉｍｐｌ厩に調整された。 ＰＢＳ、ｐＨ６，０中の５００μ９の酸化ＣＹＴ−０２１抗体は、等量のへ７１ ヘボルフイリン　ジヒドラジド溶液と暗所で３０分間窄温石インキュベ−１へさ れた。ヒドラゾン生成物を還元するために、ナ１ヘリウム　シアノボロハイドラ イド（ＮａＣＮＢＨ３）が、１０ｍＭの最終濃度へと添加され、そして、反応混 合物が一夜至温でインキュベートされた。 ＰＢＳ、１）Ｈ６，Ｏ中の遊離へマドポルフィリン　ジヒドラジドは、ＰＢＳ中 のＢＳ△１０％溶液１ｍ！溶液１ウ！！洗ｉｉ条された１０ｄのセファデックス Ｇ−５０カラム（ファラマシア　ファイン　ケミカルズ、ニューシャーシー州ビ ス力タウエイ）上に反応混合物を通すことにより除去された。 たん白質は、ＰＢＳ、ｐＨ６で）８出され、１ｍの分画が集められ、そして、た ん白質分画がプールされた。ＣＹＴ−０２１抗体に結合したヘマトポルフィリン 　ジヒドラジド量は、２８０ｎｍてのたん白質の澗衰計数と３７４　ｎｍでのへ マドポルフィリン　ジヒドラジドの消衰計数を用いることにより分光測光的に測 定され、そして４〜８モル１モル抗体の範囲のものであった。 １２．２．　抗体−へマドポルフィ１ノン　ジどドラシト接合体を用いる細胞傷 害性検定法 生体内細胞傷害性検定法は、９６個の窪み（ウェル）のり底コースタ−［Ｃｏ５ ｔｅｒ　］組織培養プレート（コースタ−、マサヂューセッン州ケンブリッジ［ Ｃｏ５ｔｅｒ、　Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＭＡＩ）中で行なわれた。目標細胞（ＭＯ ＬＴ−４、ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８２）は、メリーランド州ロックビルのアメリ カン　タイプ　カルチアコレクション［Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　）ＩＤ　］から、比 較対照細胞（ラジ［Ｒａｊｉ］　ＡＴＣＣＣＣＬ　８６）と同様に得られた。Ｍ ＯＬＴ−４細胞系は、急性リンパ芽球耳白血症の患者のヒト末梢血から誘導され た下−細胞系であるラジ細胞系は、バーキットリンパ腫の患者から得られリンパ 芽球種様細胞系である。細胞は、ＲＰＭＩ　１６４０細胞培地（１０％　胎生血 清、２％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）（エム、ニー、バ イオプロダクツ。 ／威の濃度に希釈された。ＣＹＴ−０２１抗体−へマドポルフィリン　ジヒドラ ジド接合体は、０．４５ミクロンシリンジフィルタ（ゲルマン、ミシガン州アン アルポア［ＧｅＩｍａｎ、八ｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　ｔ（ｒ　］　）を通して濾過 されて、１：１０の希釈度の接合体が製造された。 ］威の細胞は接合体或は適切な比較対照１ｍｌと混合され、そして、暗所で２時 間、？！ｉｉ！　；ｌ■化された３７°Ｃの５％ＣＯ９の培養器でインキュベ− １へされた。細胞は、ＲＰＭＩ　１６４０培養培地（明条件に保持）で３回洗滌 され、そして、ペレッ１〜はＲＰＭＩ　１６４０培地中に再懸濁された。１０４ 或は１ ０５ａｌｌ胞数の部分標本（第■Ｘ表参照）（１００１の容積で）は各々微小力 価プレート上で３重に平板付（プされ、そして２重のプレート群か製造された。 微小力価プレート群の１セツトが、上記の如く暗所で２４時間インキュベー１・ された。微小力価プレー１〜群の他のセットは、次いで、標準蛍光光源にざらし 乍ら、上記の如く、−夜インキユベートされた。 次いで、細胞の生存能力が、３Ｈ−チミジンにューイングランド　ヌクレア　マ サチューセッツ州ボストン［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏ ｓｔｏｎ、　、）ＩＡ、　］　）消Ｒｆｆｉを測定することにより測定された。 微小力価プレートは、Ｔ　Ｊ　−６遠心分離器（ベックマン　インスツルメンツ 、カルフォルニア什しくロアルート［Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 、　Ｐａ１ｏ　八ｌｔｏ、　ＣＡ］　）で、５分間１５００ｐｐｍで遠心分離さ れた。上澄液が除去され、そして１．１μｃｒ　３ｚ−チミジンにューイングラ ンド　ヌクレア　マサチューセッツ州ボストン［ＮｅＷ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ　］　）を含む、１００μ、ｆｌのＲＰＭ ｌ培地が各ウェルに添加された。細胞は、少なくとも４時間Ｃ０２培養器中で、 ＭＡＳＨ（スカトロン　インコーポレーテット、パージニア州ステルリング［５ ｋａｒｔｒｏｎ　Ｉｎｃ、、　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、　ＶＡ　］　）を用いたフィ ルターペーパー上に収穫づ−る萌にインキ−Ｌべ−１・された。７戸ルターペー パーは、３彪のアクアゾル−２［Ａｑｕａｓｏｌ−２１にューイングランド　ヌ クレア　ンリーチコーヒッツ州ボス［・ン［ＮｅＷ　［ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ！ ｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ　］　）中に溶解され、ＬＫＢ　１２１２）） 々シンチレーション　カウンター上で計数された。 第１Ｘ表 抗体−へマドポルフィリン　ジじドラシト（Ａｂ　−Ｈｄ）　接合体　の細胞毒 性細胞膜化率　％ 細胞型　Ａｂ−Ｈｄ　ｍｌ／　ｍ３　暗　明）１ｏｆｔ−４０００ ０，０５１５９９ ０，００５１４９５ 第１Ｘ表に示されるように、Δｂ−Ｈｄ接合体で培養され、光にざされた目標細 胞を殺した率は、１００％に近いものであった。ＣＹＴ−〇２１抗体−ヘマ１ヘ ボルフイリンージヒドラジド接合体と培養され、暗所に保存された対照細胞は、 最大量の３日−チミジンか含有されているものあり、そして、著しい死亡率はな かった。 １３、　実施例：スルフヒドリル付着を介しての抗体フィコルアＱは、ファラマ シア　ファイン　ケミカルズ。 インコーホレーテッドにュージャージー州ビス力タウエイ）から得られた。ヒド ラジドーフィコルは、第１１．５節に示した方法により製造された。 １３．２．　（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾイックヒドラジドーフィコ ル ３０　ミリグラムのＮ−サクシンイミジルー（４−ヨードアセチル）−アミノベ ンゾエート（ニスアイエイビー、ペースケミカル　カンパニー、イリノイ州ロッ クフォード［５ＩＡＢ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋ ｒｏｒｄ、　ＩＬコ）を３ｍｌのアセトニトリル中に溶解した。６コのＳ　ＩＡ Ｂ溶液０．４８ｄの部分標本が、０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝両液Ｈ７，０に溶 かしたヒドラジドーフィコル（第１３．１節に示したように製造した）の５ｍ９ ７ｍｆ！溶液２０ｆｌ中に３０分間間隔て添加された。５ＩＡＢ溶液の２回目の 添加の前に、５ｉのテトラヒドロフランをヒドラジドーフィコルに添加し、溶液 を清澄化した。反応混合物を次に、２０時間２３−２５°Ｃて攪拌した。有機溶 媒は、Ｎ２ガスを反応混合物中に発泡させることにより除去され、そして、得ら れた濁った溶液は、遠心分離により清澄化された。透明な上澄み液は凍結乾燥さ れた。過剰な５ＩＡＢは、乾燥粉末をテトラヒな溶媒は減圧下の蒸溜によって除 去された。乾燥粉末は、！Ｍの水に溶解され、４時間４°Ｃで透析された。（４ −ヨードアセチル）−アミノベンゾイックヒドラジドーフィコルは、−７０’Ｃ で凍結貯蔵され、そして、ヒドラジドーフィコル　１モル当り約１６個のヨード アセチル基を含んでいた。 １３．３．　（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾイックヒドラジド−フィコ ルーアセチルチオ−Ｉ（ＩＧ１ミリグラムのマウス抗ナイセリ）ノ、ゴノロエエ ［Ｎ工ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　］モノクロナールＩｇＧを、０．２重Ｍ！のＰ ＢＳ、ｐＨ７，４に希釈した。ＩｇＧ溶液を次に、５ｍＭジチオトレイトールで 、３０分間で２３〜２５°Ｃで還元した。還元された抗体をＩ　Ｘ　１９　Ｃｍ セファデックスＧ−５０上に通過させ、１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸を 含む０．１Ｍのｌ〜リス　（ヒドロキシメチル）−アミノメタン緩衝液、ｐｔ− ＋ａ、０　（Ｔｒｉｓ　／ＥＤＴＡ）で溶離した。１ミリグラムのく４−ヨード アセチル）−アミノベンゾイックヒドラジドーフィコル（第１３．２節でｒ！ｌ ｉ造した）を還元抗体に添加し、そして、反応混合物を４°Ｃで１６時間インキ ュベートし、ヨードアセチルーアミノベンゾイックヒドラシト−フィコルーアセ チルチオ　ＩｇＧ接合体を得た。 これは、Ｇｄ金属イオンが錯体化された抗体接合体の製造の例でおり、接合体は 、抗体のスルフヒドリル塁で導入された復数部位での単部位リンカ−の付着によ り形成されるもので必る。同様のは描により、治療剤を、抗体或は抗体フラグメ ン１〜と付着せしめることかできる。 １３．４．　マレイミド　ヒドラジド　クイコル２２ミリグラムの４−（Ｎ−マ レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボンＭＮ−ヒトロキシサクシンイ ミド　ニスデル（ニスエムシーシー、シグマケミカルカンパニー、ミズーリー州 セン１〜ルイスｌ５）ＩＣＣ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ 。 Ｌｏｕｉｓ　ＮＯ］　）を３１ｎＩ！のテトラヒドロフラン中に溶解した。 ＳＭＣＣ溶液の０．５ｍ（！の部分標本を６個、０．１Ｍｔ７酸すトリウム援両 液、ｐｔ−１６，８中に）ｄ解した２０ｄのヒドラジドーフィコル（第１３．１ 節に示（〕たように製造した）の５ｍＭ戴溶液溶液中３０分間隔で添加した。２ ｍｌのテトラヒドロフランを、ＳＭＣＣ溶液の２回目及び３回目の添加の前に、 反応ン昆合物に添加した。有機溶媒は、次に、反応混合物中にＮ２を発泡させる ことにより除去され、そして、１−Ｉられた濁った溶液は、遠心分離により清澄 化された。 透明な上澄液を連結乾燥し、過剰なＳＭＣＣは、テトラフランにより抽出された 。次に、有機溶媒は、減圧熱温により除去された。最終生成物は、約１５モルの マレイミド／１モルのフィコルを含んでいた。この化合物は、第１３゜２節の方 法で製造した（４−ヨードアセチル）−７ミノベンゾイツクヒドラジドーフイコ ルと同様に使用できる。 ］４．　実施例：エリトロシン誘導体の製造法の実施例は、抗体分子に特異的に 付着した場合に、生体内治療のための光活性化性細胞溶解剤（或は光増感剤）し て用いることのできるエリ１〜ロジンの新規な＝ｉ体を例示するもので必る。 １／ｌ、１．５−エリトロシン　イソチオシアネー１〜の製造エリトロシン５− イソチオシアネー１〜（アルドリッチ　ケミカルズ、ウィスコンシン州ミルウｔ −キーＣＡＩｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＷＩ ］　）が、モーリーどガーランド［）（ｏｏｒｅ　ａｎｄ　Ｇａｒｌａｎｄ　］ 　（ババイオケミカルスズソ１ナエティ理法によりおる修正をして！￥１！潰さ れた。アミノ　エリトロシンのイソヂオシアネー１〜への転化は、次のように行 なわれた：チオ　ホスゲン（０，３４ＣＩ、０．２２７戒、３゜０ｍｍｏｌ　） をトルエン（２０ｍ！り中の５−アミノ　エリトロシン（１，２にＩ、１．４ｍ ｍ０＋　）の懸濁液にｏ　’ｃ　テ滴加した。チオホスゲンを１０分間に添加し た後に、溶液を、室温に暖め、次に２時間加熱還流した。溶媒の蒸発は、（シリ カゲル、エチル　アセテート：ピリジン：酢酸（Ｅ：Ｐ：Ａ＞（５０：１　：１ 　；Ｖ：Ｖ：Ｖ））よりなる展開溶媒を用いる薄層クロマ１〜グラフイ技法によ り１つの主成分を示す赤い固体を与えた。生成物の小量は、１．３３ＣＩで、生 成物は、赤外線スペクトルで２０４５０ｍ−１に強いイソチオシアネート帯を示 した。 １４．２．　５−エリトロシン　ヂオセミ力ルバジドの製造無水ヒドラジン（０ ，００７ｇ、０．００７ｄ、０．２２ｍｍ０１　＞を、テトラヒドロフラン（５ ｍｌ）中の５−エリトロシン　イソチオシアネート（０，１ｑ、０．１１ｍｍｏ ｌ　）溶液に添加した。溶液は、−夜、攪拌し、そして沈澱された固体を濾過し 、赤外線スペクトルにおいてチオシアネートＷ（２０４０ｃｍ−１＞のないこと を示している赤色結晶が得られた。 １４．３．　Ｎ−（２−アミノエチル）エリトロシン５−チオウレアの製造 エリトロシン　５−イソチオシアネート（０，４５ｑ　０゜５ｍｍｏｌ　＞を、 テトラヒドロフラン２０７！中に溶解し、０°Ｃに冷却した。エチレンジアミン （０，３Ｑ、０．３３４ｍ１．５．ＱｍｍＯ＋　）を１０分間かけて滴加し、そ して、室温で一夜攪拌し反応させた。固体赤色沈澱物を濾過し、次に、テトラヒ ドロフランを洗滌し、そして、ｓｏ’ｃて真空下で乾燥した。赤色固体は、０． ５２Ｑの工ざで、赤外スペクトルでは、約２０４０ｃｍ−１でイソチオシアネー トのピークはなかった。この生成物を、５％ＨＣｕに懸濁し、濾過し、乾燥する と、０．３４ｇの重さの赤色固体が得ら固体亜硝酸ナトリウム（０，ＯｌＱ、０ ．１５ｍｍｏｌ　）を６Ｎ１　［ト１ｃ、Ｑ　１０ｄ中のエリトロシン−５−ア ミン（０，１ｇ、０．１１ｍｍｏｌ　）（モーリーとガーランド、１９７９年、 バイオケミカル　ソサエティ　トランスアクション　７：９４５　〜９４６　［ Ｈｏｏｒｅ　ａｎｄ　Ｇａｒｌａｎｄ、１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 ５ｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　７：　９４５−９４６］の方法に より製造）にＯ′Ｃで添加した。ジアゾ化溶液を、３時間ｏ′ｃで攪拌し、そし て、３Ｍ］　［＋−（ＣＪＩ　２ｄ中の塩化第１錫（０，１ｇ、０．４４モル） の溶液を添加した。赤色溶液を、室温で３時間攪拌し、次いで濾過した。深赤色 沈澱物を水で洗滌し、乾燥した。赤い生成物は、ｐＨ８，８でアルデヒドに酸化 されたセフ１０−スビーズに結合し、非酸化の非アルデヒドのセファロースへの 結合はなく、ヒドラジン基の存在をフィコル　ヒドラジド（０，２５ｑ、０．０ ０４ｍｍｏｌ、０、２３ｍｃｑ、ヒドラジド）を５０％エタ／−／ｌｚ：水４゜ 厩の中に溶解した。エリ１へ［」シン　イソチオシアノート（０，０２２ｇ、０ ．０２５ｍｍｏｌ　）を添加し、そして、溶液を一夜攪拌した。Ｎａ２Ｃ○３　 、ｐＨ９，０に対しバ５日間透析し、続いて凍結乾燥すると、水溶性で、Ｄ　Ｈ ９緩衝液中で約５２４ｎｍの最大波長を示す桃Ｃ２扮未か（５Ｉられ７、ＴＯ 本明細出で説明され、請求される発明は、ここに開示された特定の実施態様によ り範囲が限定されるものではなく、これらの実施態様は、本発明のいくつかの局 面を例示するものとして意図されるものであるからである。いかなる等価の実施 態様も、本発明の範囲内のものであると意図するものである。事実、ここに示し 、説明したものに加えて、本発明の種々の変更例も、上記の説明から当業者に明 白になるものである。このような変更例も添附の請求の範囲内に該当するもので あると意図するものでおる。 ＦＩＧ、　１ ４．６　−６．４　−６．２　−６−０　−５．８　−５．６　−５．４　、− ５．２　−５．０Ｌｏｇ、。　必芋第１　リガ／ｌ−゛ −口 会 コ ３６π帆ス°′Ｏ相対望光 時１町（７亦） （閣　５！！ｉｌｌ　存　邦　告

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．接合していない抗体或は抗体フラグメントと同一の免疫反応性と免疫特異性 とを実質的に有する抗体−治療剤接合体を形成するために、抗体或は抗体フラグ メントの抗原結合領域の外にある位置に、選択的に形成されるもである共有結合 を介して抗体或は抗体フラグメントと付着して、細胞毒性効果を媒介するために 光熱解離剤として、光増感剤として或は基質活性化剤として作用することのでき る治療剤からなる抗体−治療剤接合体。
2. ２．治療剤は、共有結合を介して、酸化された抗体或は抗体フラグメントの炭水 化物部分と付着し、その共有結合は、イミン、エナミン、ヒドラゾン、オキシム 、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン或はそれらの還元 形である請求の範囲第１項に記載の抗体−治療剤結合体。
3. ３．該抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント 及び半抗体分子よりなる群から選ばれるものである請求の範囲第２項に記載の抗 体−治療剤接合体。
4. ４．抗体或は抗体フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナール抗体 フラグメントである請求の範囲第１項に記載の抗体−治療剤接合体。
5. ５．治療剤は、共有結合を介して還元された抗体或はＦａｂ′フラグメントの硫 黄原子に対して付着される請求の範囲第１項に記載の抗体−治療剤接合体。
6. ６．抗体或はＦａｂ′フラグメントはモノクロナール抗体或はモノクロナール抗 体Ｆａｂ′フラグメントである請求の範囲第５項に記載の抗体−治療剤接合体。
7. ７．細胞毒性効果を媒介する光増感剤として作用できる治療剤は、フォボルフィ リン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフイリン、ローズベンガル、アクリ ジン、チアジン、キサンテン、アントラキノン、アジン、フラビン、メチレンブ ルー、エオシンン、エリトロシン及びブソラリンよりなる群から選ばれるもので ある請求の範囲第１項に記載の抗体−治療剤接合体。
8. ８．細胞毒性効果を媒介する基質活性化剤として作用できる治療剤は、グルコー ス、オキシダーゼ、ガクトースオキシダーゼ及びキサンテンオキシダーゼよりな る群から選ばれるものである請求の範囲第１項に記載の抗体−治療剤接合体。
9. ９．接合していない抗体あるいは抗体フラグメントと同一の免疫反応と免疫特異 性とを実質的に有する抗体−治療剤接合体を形成するために、抗体あるいは抗体 フラグメントの抗原結合領域の外にある位置に選択的に形成されるものである共 有結合を介して抗体あるいは抗体フラグメントへ付着したリンカーに共有結合的 に付着した、細胞毒性を媒介するために光熱解離剤として、光増感剤としてある いは基質活性化剤として作用することのできる治療剤からなる抗体−治療剤接合 体。
10. １０．治療剤は、共有結合を介して、酸化された抗体或は抗体フラグメントの炭 水化物部分に付着するものであり、該共有結合は、アミン、エナミン、ヒドラゾ ン、オキシム、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、或 はそれらの還元形である請求の範囲第９項に記載の抗体−治療用接合体。
11. １１．抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ′）２フラグメント 及び半抗体分子よりなる群から選ばれるものである請求の範囲第９項に記載の抗 体−治療剤接合体。
12. １２．抗体或は抗体フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナール抗 体フラグメントである請求の範囲第９項の抗体−治療剤接合体。
13. １３．治療剤は、共存結合を介して、還元された抗体或はＦａｂ′フラグメント の硫黄原子と付着するものである請求の範囲第９項に記載の抗体−治療剤接合体 。
14. １４．抗体或はＦａｂ′フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナー ル抗体Ｆａｂ′フラグメントである請求の範囲第９項に記載の抗体−治療剤接合 体。
15. １５．細胞毒性効果を媒介する光増感剤として作用できる治療剤は、フォトポリ フィリン、ジュウテロポルフィリン、ローズベンガル、アクリジン、チアジン、 キサンテン、アントラキノン、アジン、フラビン、メチレンブルー、エオシン、 エリトロシン及びブソラリンからなる群から選ばれるものである請求の範囲第９ 項に記載の抗体−治療剤接合体。
16. １６．細胞毒性効果を媒介する基質活性化剤として作用できる治療剤は、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びキサンテンオキシダーゼより なる群から選ばれるものである請求の範囲第９項に記載の抗体−治療剤接合体。
17. １７．リンカーが、分枝状リンカーである請求の範囲第９項に記載の抗体−治療 剤接合体。
18. １８．リンカーは、活性化された補体により或は、たん白質分解活性をもつ酵素 により開裂可能であるものである請求の範囲第９項に記載の抗体−治療剤接合体 。
19. １９．接合していない抗体或は抗体フラグメントと同じ免疫反応性と免疫特異性 を実質的にもつ抗体−リンカー中間体を形成するために、抗体或は抗体フラグメ ントの抗原結合領域の外側に位置する部位に選択的に形成された共有結合を介し て抗体或は抗体フラグメントに付着された分枝状リンカーからなる、抗体−リン カー中間体。
20. ２０．分枝状リンカーは、共有結合を介して、酸化された抗体或は抗体フラグメ ントの炭水化物部分と付着され、その共有結合は、イミン、エナミン、ヒドラゾ ン、オキシム、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、或 はそれらの還元形である請求の範囲第１９項に記載の抗体−リンカー中間体。
21. ２１．抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ′）２フラグメント 及び半抗体分子よりなる群から選ばれるものである請求の範囲第２０項に記載の 抗体−リンカー中間体。
22. ２２．抗体或は抗体フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナール抗 体フラグメントである請求の範囲第２０項に記載の抗体−リンカー中間体。
23. ２３．分枝状リンカーは、共有結合的に還元抗体或はＦａｂ′フラグメントの硫 黄原子と付着せしめられている請求の範囲第１９項に記載の抗体−リンカー中間 体。
24. ２４．抗体或はＦａｂ′フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナー ル抗体Ｆａｂ′フラグメントである請求の範囲第２３項に記載の抗体−リンカー 中間体。
25. ２５．分枝状リンカーは、活性化された補体により、或は、たん白質分解活性を もつ酵素により開裂可能なものである請求の範囲第１９項に記載の抗体−リンカ ー中間体。
26. ２６．接合していない抗体或は抗体フラグメントと同じ免疫反応性及び免疫特異 性を実質的に持つ抗体−治療剤接合体を形成するために、抗体或は抗体フラグメ ントの抗原結合領域の外側に位置する部位で選択的に形成される共有結合を介し て抗体或は抗体フラグメントへ付着した分枝状リンカーへ共有結合的に付着され た治療剤からなる抗体−治療剤接合体。
27. ２７．治療剤は、共有結合を介して、酸化された抗体或は抗体フラグメントの炭 水化物部分へ付着した分枝状リンカーと共有結合的に付着し、その共有結合はイ ミン、エナミン、ヒドラゾン、オキシム、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン 、チオセミカルバゾン或はそれらの還元形である請求の範囲第２６項に記載の抗 体−治療剤接合体。
28. ２８．抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ′）２フラグメント 及び半抗体分子からなる群から選ばれるものである請求の範囲第２６項に記載の 抗体−治療剤接合体。
29. ２９．抗体或は抗体フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナール抗 体フラグメントである請求の範囲第２６項に記載の抗体−治療剤接合体。
30. ３０．治療剤は、還元抗体或はＦａｂ′フラグメントの硫黄原子と共有結合的に 付着されるリンカーと共有結合的に付着されるものである請求の範囲第２６項に 記載の抗体−治療剤接合体。
31. ３１．抗体或はＦａｂ′フラグメントは、モノクロナール抗体或はモノクロナー ル抗体Ｆａｂ′フラグメントである請求の範囲第３０項に記載の抗体−治療剤接 合体。
32. ３２．分枝状リンカーは、スペーサ要素及び開裂性要素を有するものである請求 の範囲第２６項に記載の抗体−治療剤接合体。
33. ３３．開裂性要素は、補体により、或は、たく白質分解活性をもつ酵素により開 裂可能なものである請求の範囲第３２項に記載の抗体−治療剤接合体。
34. ３４．接合していない抗体あるいは抗体フラグメントと同じ免疫反応性および免 疫特異性を実質的に有する抗体−治療剤接合体を形成するために、抗体あるいは 抗体フラグメントの抗原結合領域の外側の部位で抗体あるいは抗体フラグメント と選択的に共有結合的付着し得る反応基を有するものであって、治療剤に共有結 合的に付着した、リンカーよりなるリンカー治療剤中間体。
35. ３５．反応基は、第１アミン、第２アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキ シルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基よ りなる群から選ばれるものであり、該反応基は、酸化された抗体或は抗体フラグ メントの炭水化物部分と共有結合的に付着できるものである請求の範囲第３４項 に記載のリンカー−治療剤。
36. ３６．反応基は、ハロアルキル基、ｐ−メルカリベンゾエート基、ミッチェル型 付加反応のできる基よりなる群から選ばれるものであり、該反応基は、還元され た抗体或は抗体Ｆａｂ′フラグメントのスルフヒドリル基と共有結合的に付着で きるものである請求の範囲第３４項に記載のリンカー−治療剤中間体。
37. ３７．リンカーは、分枝状リンカーである請求の範囲第３４項３５或は３６項に 記載のリンカー−治療剤中間体。
38. ３８．治療剤は、細胞毒性効果を媒介できる光熱分解剤、光増感剤或は基質活性 化剤である請求の範囲第３４項に記載のリンカー−治療剤中間体。
39. ３９．該光増感剤は、フォトポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポ ルフィリン、ローズベンガル、アクリジン、チアジン、キサンテン、アントラキ ノン、アジン、フラビン、メチレンブルー、エオシン、エリトロシン及びプソラ リンよりなる群から選ばれたものである請求の範囲第３８項に記載のリンカー− 治療剤中間体。
40. ４０．細胞毒性効果を媒介する基質活性化剤として作用できる治療剤は、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びキサンテンオキシダーゼより なる群から選ばれるものである請求の範囲第３８項に記載のリンカー−治療剤中 間体。
41. ４１．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは、１〜３つの炭素原子を含む、アルキル、１〜３コの炭素原子を含む 、ヒドロキシアルキル、カルボキシル、アルキル基が１〜３コの炭素原子を含む アルキルカルボキシル、ビニル及びＨよりなる群から選ばれたものであり、Ｒ１ 及びＲ２はＮＨＮＨ２であるか、Ｒ１はＯＨでＲ２はＮＨＮＨ２であるか、或は Ｒ１はＮＨＮＨ２でＲ２はＯＨである）の化合物。
42. ４２．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘは、 ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼；及び▲数式、化学式、表等があります▼ よりなる群から選ばれるものである。）の化合物。