JPH07508174A - ビタミンｂ１２／トランスコバラミン２レセプターに対する抗−レセプター剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ビタミン８１２／　ｌ−ランスコバラミン■レセプターに対する抗−レセプター 剤 技術分野 本発明は一般的に、ビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レセプターに対す る抗−レセプター剤、及び特定には、ビタミンＢ１２／　トランスコバラミン■ レセプターを拮抗し又は調節し、それによって正常な細胞又は腫瘍細胞の細胞分 裂を阻害することによってビタミンＢ１２の細胞収奪を引き起こすことができる 剤に関する。

発明の背景 インビトロ実験データ、予備臨床動物モデル及び患者研究は、ビタミンＢ１２の ための正常な及び腫瘍細胞を増殖することの必要条件を示して来た。この栄養物 は細胞分裂及び細胞代謝において必要な酵素のための補因子である。前記栄養物 は、食事摂取に由来し、そしてタンパク質を輸送するために複合体化される条件 しゆうに輸送される。輸送タンパク質及びビタミンＢ１２の複合体は、その複合 体を内部のものにし、そしてビタミンを細胞内に放す細胞レセプターにより認識 される。全体の方法は最近、再調査されている（ＧＵＴ　３１：５９．１９９１ ）　、ビタミン８１２は食事を通して摂取される。唾液（Ｒ−結合体）及び腸（ 内因子（ＩＦ）　）における結合タンパク質は、酵素の作用により内因性結合タ ンパク質からの開放の後、Ｂ１２と複合体化し、そして胃におけるｐＨを下げる 。Ｂ１２は、トランスコバラミン１１（ＴｃＩｌ）へのレセプター特異的態様で 腸内皮を通してトランスファーされる。ビタミンＢ１２／　トランスコバラミン ■複合体は次に、身体しゆうに輸送され、そして分裂細胞上に存在するレセプタ ーにより認識され、インターナライズされ、そして補因子として一定酵素により 利用される細胞内に開放される。

Ｂ１２のインターナライゼーシッンを担当する分裂組織又は細胞における高親和 性レセプターは、ビタミンＢ１２と複合体化されるトランスコバラミン■を認識 する。そのＢ１２／Ｔｃ　Ｕレセプターは、ビタミンＢ１２／　トランスコバラ ミン複合体のみを認識し、そして血清輸送タンパク質又はビタミンのみは認識し ない、そのレセプターは非分裂細胞上では検出できず；ビタミンＢ１２を非分裂 細胞に供給するためのに機構はほとんど理解されていない、しかしながら、ビタ ミンＢ１２が代謝の間よりも細胞分裂の間により必要とされ、そして８１２／Ｔ ｃＩＩレセプターが細胞分裂の間、ビタミンＢ１２の細胞摂取のために単に高い 親和性手段であることは知られている０分裂を刺激される場合、細胞は、実際の ＤＮＡ合成を優先するＢ１２摂取を導びくレセプターの過渡発現を示す（Ｊ、　 Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　１０３　：　７０．１９８４）、ビタミンＢ １２　レセプターのレヘルは、血清を含まない化学的に定義された培地において 増殖される同型培養に基づいてトランスコノくラミン■（血清に存在する）に複 合体化される”ｃｏ−コバラミンの結合により測定され得る。レセプター介在摂 取は、キャリャータンノぐり質の不在下では生しない。

分化を誘発される分裂細胞は、レセプター発現を失ない、そしてもはやビタミン Ｂ１２を摂取しない。より重要なことには、ビタミンＢ１２を消耗されている白 血病細胞は分裂を停止し、そして死滅する（Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔ、　８１　 ：　６１．１９８９）　、典型的な実験においては、白血病細胞培養物は３日間 、血清を数音され、そして次に、血清（Ｂ１２のｆ！ｉ＞又はＢ１２の非代謝性 類似物のいづれかにより補充され、そして５日間まで培養された。ビタミンＢ１ ２により補充された細胞培養物は増殖し続け、ところが活性栄養物を収奪された 細胞培養物は増殖を停止し、そして死滅した。

それらの観察に基づけば、ビタミン８１２の全身底意が癌の処理に有用であり得 ることが示唆された。さらに、細胞分裂においてのビタミン８１２含有酵素によ る演しられる臨界的な役割のために、Ｂ１２取奪は、細胞複製を阻害する化学療 法薬物と組合して使用され得ると思われる。たとえば、ビタミンＢ１２取奪がメ トトレキセートと組合される場合、それらの２つの様式は共に、いづれか１つの みよりも白血病細胞におけるフオレートレベルの収奪においてより効果的であっ た（ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　４　：　１４５０．１９９０　；　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

２７０　：　７２９．１９８９　；　Ｌｅｕｋｅ＋ｗｉａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 １５　：　１６５．１９９１）　、フオレートはＤＮＡ及びタンパク質の生成に おける前駆体である。典型的な実験において、白血病細胞の培養物が、内因性Ｂ １２の活性形を不活性形に転換するために、数時間、窒素性酸化物に暴露された ０次に、同型培養を追加の処理を伴わないで放置され、又はメトトレキセートに よりさらに処理された。細胞フォートレベルは、３日後に測定された。前記組合 せ（すなわちメトトレキセート及び不活性Ｂ１２）により処理された細胞は、前 記２つのアプローチのいづれかによるよりも細胞フォートレベルにおいてより著 しい低下を示した。この組合せはまた、インビトロでの高い細胞殺害をもたらす 、このアプローチが動物モデルにおいて高い攻撃的な白血病／リンパ腫の処理に 適用される場合（Ａｍ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　３４　：　１２Ｂ、　１ ９９０　；＾ｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ、　６　：　７３７．１９８６　；　Ｃ ａｎｃｅｒ　ＣｈｅｍｏＬｈｅｒ、　Ｐｈａｒｗａｃｏｌ、　１７　：　１１４ 　；１９８６　；　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５０　：　７９３．１９８４ ）、抗−腫瘍作用の付加性又は相集性が観察され、長期の軽減及び治癒をもたら す０次の第１表に結果が要約される。

」」−表 骨髄球性白血病／ラント　シクロロイシン　付加性ｓ　−ｐｕ　付加性 メトトレキセート　相集性 急性白血病／ラット５−ＦＵ　付加性 急性白血病／ラット　メトトレキセート　相集性急性白血病／ラット　シクロロ イシン　相集性上記実験における重要な発見は、ビタミンＢ１２の短期間（数時 間〜数日）全身底意が腫瘍増殖を阻害し、そして白血病／リンパ腫の動物を治癒 するために化学療法薬物（たとえば、メトトレキセート及び５−ＦＵ）と共に相 集的に作用することであった。相集性抗−腫瘍活性にもかかわらず、正常な細胞 を増殖するために短期間ビタミンＢ１２取奪に寄与する毒性は存在しなかった。

この組合せの治療は複数の動物モデルにおいて示された。患者における観察は、 長期間（数か月〜数年）のビタミンＢ１２取奪が有意な正常組織毒性を生成する ために必要とされることを示した。それらの場合においてさえ、Ｂ１２の続く注 入は症候学を容易に逆転することができる（Ｂｒ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　５　：　８１０．１９８９）　。

この治療アプローチの見込みにより、種々の方法が、ビタミンＢ１２の一時的な 収奪を効果的且つ調節可能的に実施するために調査された。しかしながら、その ような方法は、ビタミンＢ１２の身体中の貯蔵のすべてに影響を及ぼす、それら は食事制限、高い投与量のコバラミン類似体（酵素インヒビターとして作用する 非代謝性競争拮抗剤）及び窒素酸化物（形を不活性化するために８１２のトラン スフォーメーション）を包含する。それらの異なった方法はビタミンＢＩ２を収 奪するために培養システム及び動物において使用されて来た。最とも効果的且つ 最とも利用される方法は、窒素酸化物（笑気）の吸入である。動物は典型的には 、数時間〜数日間、５０％〜７０％の窒素酸化物の雰囲気下で維持され、内因性 Ｂ１２の不活性形への転換を引き起こす、この方法は、白血病／リンパ腫の治療 のために薬物と組合して利用されて来た。ビタミンＢ１２取奪のための追加の方 法は、活性形を実質的に希釈するＢ１２の非代謝性類似体の注入を包含する。こ の形の治療は細胞分裂に対して特異的ではないが、しかし肝臓依存性代謝工程に 影響を及ぼす、他のアプローチはビタミンＢ１２の食事摂取の制限を包含する。

しかしながら、この方法はひじょうに長期間の食事制限を必要とし、そしてビタ ミンＢ１２の貯蔵貯蔵により補足される。それらのすべての方法は特異性の問題 を有する。なぜならば、それらはＢ１２依存性増殖及び基本代謝の両者に影響を 及ぼし、そして従って抗−増殖性医薬製品の開発に特に適合されないからである 。

従って、ビタミン８１２の細胞収奪を引き起こし、そして分裂細胞を選択的に影 響する剤が当業界において必要とされている０本発明はこの必要性を満たし、そ して追加の関連する利点を提供する。

発明の要約 本発明は、ビタミンＢ１２／　トランスコバラミン■レセプターを拮抗し、又は 調節する抗−レセプター剤を開示する。そのような剤は、ビタミンＢ１２／　ト ランスコバラミン■複合体のレセプター認識を妨害し、従って細胞分裂を妨害し 又は阻害することによってビタミン８１２の細胞収奪を引き起こす。ビタミン８ １２／）ランスコバラミン■レセプターを拮抗する（たとえばブロックする）抗 −レセプター剤は、レセプターに競争的に結合し、それによってビタミンＢ１２ の細胞１ｎ取を妨げることによって機能する。他方、その拮抗剤は、レセプター に十分に近くで結合することによってレセプターによる複合体の認識を立体的に ヒンダーし、そして従って、ビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げる。ビタミンＢ１ ２／　トランスコバラミン■レセプターを調節する本発明の抗−レセプター剤は 、レセプターに結合し、そして一定期間、レセプターの除去又は清浄を引き起こ し、そして従ってビタミンＢ１２の細胞摂取を阻害する０本発明の抗−レセプタ ー剤は、ビタミンＢＩ２／）ランスコバラミン■レセプターを拮抗し、又は調節 し、そしてビタミンＢ１２の細胞収奪を引き起こし、それによって正常又は腫瘍 細胞の細胞分裂を阻害できる、タンパク質（たとえば抗体及び抗体誘導体）、ペ プチド及び小有機分子を包含する。

本発明の１つの態様においては、ビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レセ プターに対する抗−レセプター剤が開示される。この剤はビタミン８１２の細胞 摂取を妨げるためにレセプターを競争的に拮抗し又は調節できる。好ましいＢ様 において、抗−レセプター剤は、ビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レセ プターに対する抗体（又はその誘導体）である。

追加の態様において、本発明はビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レセプ ターに対する抗−レセプター剤を動物に投与することによって温血動物における 細胞分裂を阻害するための方法を開示し、ここで前記剤はビタミン８１２の細胞 摂取を妨げ又は阻害するためにレセプターを拮抗し又は調節できる。

さらにもう１つの態様においては、ビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レ セプターに対する抗−レセプター剤を動物に投与することによって温血動物にお けるビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するための方法が開示されており 、ここで前記剤はレセプターを拮抗し又は調節できる。

図面の説明 第１図は、抗体を誘発するためにレセプターのための固和親相性収着剤から成る 免疫原を用いてのレセプターに対するネズミモノクローナル抗体の生成、続くハ イブリドーマ生成及び結合及び機能的両アッセイを用いてのスクリーニングによ るビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■レセプター抗体の発生を例示する。

第２図は、完全な又は完全に近いレセプターしゃ断のために必要レベル以上の血 清濃度（二分線により示される）を維持するためにビタミンＢ１２抗−レセプタ ー抗体の投与（すなわち２又は３日ごとでの注入）を例示する。その必要な濃度 は、機能的アッセイにより評価されるように、培養された白血病細胞（Ｋ５６２ ）中へのビタミンＢ１２の摂取の９０％以上をブロックするのに必要とされる抗 体の量により決定される。

第３図は、ビタミン８１２抗−レセプター抗体によるビタミンＢ１２／トランス コバラミン■レセプター調節の評価を示す、　１００　ｎｇ／ｍｌの抗体が百万 個のＲａｊｉ　Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞と共にインキュベートされた。その 細胞の半分が４０°Ｃで維持され、そして他の半分が洗浄の後、３７°Ｃに移さ れた。　３０分〜２時間後、サンプルが流動細胞計測法により細胞に結合される 残留マウスＩｇについて評価される（ＭＦＩ　＝すべての細胞の平均螢光強度） 。

発明の詳細な説明 本発明は、ビタミンＢ１２／　）ランスコバラミン■（Ｂ１２／Ｔｃｌ１　”　 ）レセプターに対する抗−レセプター剤を開示する０本発明において、“抗−レ セプター剤”は、Ｂ１２／Ｔｃ　■レセプターに対しての競争拮抗剤又はｉｉ節 剤として作用することによってビタミンＢ１２の細胞収奪を引き起こす、競争拮 抗剤は、Ｂ１２／Ｔｃ　ＩＩｌレセプター競争的に結合しく又は立体的に妨害し ）、それによってビタミン８１２の細胞摂取を妨げ又は阻害する剤である。調節 剤はＢ１２／Ｔｃ　Ｕレセプターに結合し、そして一定時間（一般的に数時間） レセプターの清浄又は除去をもたらし、続いてレセプターの再生及び再発現をも たらす（ｉｌｉ節剤はもはや存在しないと仮定して）０本発明の抗−レセプター 剤は、タンパク譬（たとえば抗体）、ペプチド及び小さなを機化合物を包含する 。

本発明は、Ｂ１２／Ｔｃ　■複合体に対する抗−レセプター抗体を動物に投与す ることによって温血動物における細胞ビタミンＢ１２の数音のための新規方法に 向けられ、ここで前記抗体はビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するため にレセプターを競争的に拮抗し又は調節する。　８１２／ＴＣＩＩレセプターの 低発現（たとえば細胞当たり数十個のみ）及び生物学的応答を誘発する（たとえ ばビタミン８１２の細胞収奪を引き起こす）機能的抗体の生成の必要性により、 機能的抗体を誘発するための免疫化方法が本明細書に記載される（弱い免疫原性 及び不完全に発現された抗体に対する応答を増強するために固相免疫原の使用と 共にレセプターの親和性増強を組合す）、これらの抗−レセプター抗体の一部の みが、拮抗剤として又は細胞レセプターを調節するように機能する。適切な抗体 は、第１図に示されるようにバイオアッセイにより同定され得る。

種々の特異性の抗体（及び抗体誘導体）が８１２／Ｔｃ■レセプターに対して生 成され得る。本発明の抗体はいくつかの機能的及び特異的カテゴリーに分かれ、 そして異なった医薬用途を有する。　Ｂ１２／ＴｃＩ［レセプターに対する抗− レセプター抗体は、（１）結合するが、しかし生物学的応答を生成せず；　（２ ）レセプターの表面を架橋し、調節し、そして清浄し、そして調節する抗体の濃 度が十分なレベルで患者の循環に維持されるなら、それが再発現される場合、い づれか新規に合成されたレセプターを調節しくＩｇＭ抗体が典型的には最とも効 果的な調節剤である）；そして（３）ビタミン８１２結合のための競争拮抗剤と して機能するものを包含する。それらの個々のタイプの抗体は、初期ハイブリド ーマ培養物を用いての一部スクリーン、クローンの二次スクリーン及び最終的に 、最後の、安定して分泌するクローンのより労力を要する集中的アッセイにより 開始する一連のスクリーンでの特異的結合又は選択的アッセイにより区別され得 る。（下記例１及び２を参照のこと）、生成されるネズミ抗体は、ビタミンＢ１ ２の窒素酸化物転換に対しての及び培養物における腫瘍細胞の死を引き起こすこ とにおける抗体介在数音の適合性を示すために使用される。

しかしながら、ネズミ抗体の医薬用途は、患者における抗−ネズミ抗グロブリン 応答（すなわら、免疫原性）のための可能性により制限される。従って、ネズミ 抗体は、ヒト−マウスキメラへのそれらの転換のために遺伝子操作を必要とする 。多くの方法が、Ｈ及びＬ鎖不変領域がヒトバージジンにより置換されているか 又はＣＤＲ（相補的決定／領域）を除くすべてがそれらのヒト同等物により置換 されているキメラへのネズミ抗体の転換のために存在する。　（Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

Ｊ、　２８１　：　３１７．１９９２　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６　：　１００２９゜１９８９　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｌｗｏｌ、　１７８　：　５１５＋　１９８９　；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、　５１　：１Ｂ１．１９９１　；　Ｂｉｏｔｅｃｈａｉｑｕｅｓ　７　：　 ３６０．１９８９　；　Ｊ、　Ｉ＋ｗ＋５ｕｎｏ１．１４３　：３５８９、１９ ８９　；　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４４　：　４２４．１９８９　；　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　３８３３．１９８９を参照のこと）、免疫原性の 問題を解決する他に、長い血清半減期を付与するであろうＨ鎖不変領域を選択す ることが、ビタミンＢ１２レセプター拮抗剤の生物学的活性のために重要である 。競争拮抗剤を用いる場合、その親和性のみならず、また標的細胞への暴露の長 さが効能への臨界的重要性のものである。

ビタミン８１２の細胞を任意に数音するために、レセプターのしゃ断が数時間〜 数日間維持されるべきである。ヒ）ＩｇＧ抗体は２４時間〜数日間の半ｆＩＩｉ 期を有する。キメラ性１ｇＧ抗体は、この性質のために評価される必要がある。

ヒＨｇＭは、数日を越える半減期を有し、そしてそれらの＆ｌ繊織中の侵入の遅 い速度にもかかわらず、レセプター拮抗又は調節が長期間維持されるべき適用に 最とも適切である。

ヒトモノクローナル抗体はまた、ネズミハイブリドーマ生成に使用される特定の 吸着剤を用いて、インビトロ免疫化方法により完全に創造され得る。下記例１及 び第１図を参照のこと、さらに、種々の技法がインビトロ免疫化及びヒト抗体生 成のために存在する（Ｊ。

ｌ＋ｕ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１４５　：　７１．　１９９１　；　Ｈ ｙｂｒｉｄｏｍａ　９　：　８１＋　１９９０　；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：３９９５．　１９８８　；　Ｉｍ−ｕｎｏｌ、Ｌｅ ｔｔ、１７：　２９．１９８８　；　ＢＢＲＣ１４８：　９４１．１９Ｂ７　； 　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　１６　：　７５゜１９８７　；　Ｔｉ５ｓｕ ｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　３０　：　２５．１９８７）　、また、アメリカ特許第 ４．８７９，２２５号（引用により本明細書に組込まれる）も参照のこと。

キメラ抗体の他に、遺伝子工学技法が、フラグメント、ペプチド又は有機分子模 倣物を包含する種々の抗体誘導体、及び親和性又はエフェクター機能に関して変 性される種々の抗体を生成するために使用され得る。それらのすべての種々の抗 体誘導体が８１２／Ｔｃ　Ｉｌレセプターに対する存在するネズミ抗体から生成 され得る。実質的に、その抗原組合せ部位内に、その標的と組合し、そして生物 学的応答を誘発する必要がある情報を含むような抗体を考慮することができる。

この情報は、異なったサイズ及び異なった形の分子中に配置され得、そして“抗 体誘導体”として本明細書において集合的に言及される。

前述のキメラ抗体（典型的には完全なＩｇＧである）は、多くの異なったアプロ ーチにより構築されるが、しかし実質的には、ヒト起源の領域とネズミ不変領域 とを置換するために探求される。他方、ＣＤＲ（すなわち抗原と相互作用する特 定の領域）は抗原組合せ部位からＩＩされ、そして次に、ヒト可変及び不変領域 の骨格中にグラフトされ得る。この後者のタイプの抗体は、不変領域のみが置換 されているキメラ抗体よりも低い免疫原性であるべきである。つい最近、抗グロ ブリン又はＨＡＭ＾応答を誘発するネズミ抗体構造内の最とも可能性ある残基を 同定することに努力が開始されている。実質的には、それらは溶媒と接触して存 在し、そして抗体遺伝子の変異誘発により同定され、そして置換され得る親水性 残基である。

ある用途のためには、組織中への良好な侵入を提供し、又はバックグラウンド血 液レベルを明らかにするために血清半減期を短くすることが好ましい、これは、 第２表に同定される種々のフラグメントの１つ中に完全な抗体を構築することに よって達成され得る。遺伝子工学により生成される最とも通常の抗体フラグメン トはＦａｂ又はＦｖフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは完全なＩｇＧの 酵素消化により創造されるが、しかしこれは通常、生成物における有意な…失、 及び最終抗体形における不一致を残す、従って、遺伝的に構築されたＦａｂは、 より合致した生成物であると思われ、そして細菌発現システムにおいてｇ／ｌの 量で生成され得る。そのような構築されたフラグメントを生成する重要な段階は 抗原結合に包含される抗体の領域（すなわちＣＤＲ）を単離し、そしてそれらを ヒト骨格内に配置することである。実質的には、ＦｖはＦａｂに類似する態様で 創造されるが、但し、Ｃｈｉ及びｖｈドメインはＣＤＲ９１１域にそってクロー ン化されない、これは、Ｈ及びＬ鎖成分を連結するためにペプチドリンカ−を要 する小さなフラグメントを生ぜしめる。さらに、一定のＨ鎖ドメインがＬ鎖ドメ インの関与を伴わないで標的抗原と組合うことができると思われる。これは、た ぶん、かなり原始的な抗体及び抗原−結合特異性に制限されるかも知れない、最 小の抗体フラグメントはＣＤＩ？における情報に由来するペプチドから成るが、 しかし標的構造体に結合する能力を保持する。それらの抗体フラグメント（並び にＦａｂ及びＦｖ）の親和性はクローニングにより維持されるべきであるので、 二価抗体フラグメントが創造され、ここで変異誘発及び選択が高い親和性バージ ョンを選択するために適用されている。

】じし表 レセプ　−士　としで撥能ズＪる゛　−・に　た　禾゛その標的構造体のための 抗原組合せ部位の保持する高い親和性は、その有効性がその結合親和性（半減期 と組合して）により決定されるので、レセプター拮抗剤のために重要である。天 然の抗体よりも２〜３倍（及び時々、５倍まで）高い親和性の上昇を可能にする 種々の技法が開発されて来た。さらに、第２表に示されているように、相補的活 性化能力、又はエフェクター細胞と相互作用する能力を高め又は（多分）低める エフェクター機能を変性することができる。

レセプター拮抗剤として使用される完全な抗体のエフェクター機能は、レセプタ ー拮抗剤の選択性を劣化し、そして毒性のための可能性を付与する。

抗体フラグメントの多量体又は二量体形は親和性又はエフェクター機能の観点か ら利点を付与する。高められた親和性を導びく二又は多量体形中への単量体抗体 の非共有結合を可能にする後翻訳技法は知られている。そのような二又は多量体 分子は、また表面からのレセプターの調節においてより効果であり得る。

下記に詳細に記載されるように、小分子レセプター拮抗剤は、それらの低価格、 それらの経口投与への利用性及び製造の容易性のために一定の医薬用途のために より有用であると思われる。抗体に由来するペプチド構造体（分子認識単位）の 他に、分子調節技法は、ペプチド類似中間体を用いて抗体から有機分子類似体を 製造するために使用され得る。

Ｂ−１２／ＴｃＩＩレセプターの単離及びクローニングは、競争体としての可溶 性レセプターの創造を可能にする。しかしながら、そのようなレセプター形は短 い血清半に期及び良好でない生物利用性を有する。それらのクローン化されたレ セプターの半減期及び生物利用性を高めるための１つの手段は、組換え技法によ りそれらを免疫グロブリン−不変領域に結合することである。これは、レセプタ ー拮抗剤の活性において有用である長い血清半減期及び可能性あるエフェクター 機能を提供する。レセプター及び免疫グロブリンＨ及びＬ鎖不変領域遺伝子のそ のような組合せは、免疫粘着と呼ばれる。

Ｂ−１２／Ｔｃ■レセプターに対する機能的抗体の組合せ部位に存在する情報を 用いて、第１抗体の組合せ部位を認識する第２抗体が生成される（抗−イディオ タイプ抗体と呼ばれる）。そのような抗体は第１抗体の鏡像であり、そしてそれ によって、レセプター自体に対する類似体である。従って、それは免疫粘着のＢ 様に類似する態様で利用され得る。

上記抗体誘導体を生成することにおける重要な段階は、Ｂ−１２／Ｔｃ［Ｉレセ プターに対する抗体の相補的決定領域をコードする遺伝子の単離である。これは 、多くの技法により達成され得る。たとえば、適切な技法は、マウスの免疫化、 ハイプリドーマ形成及び適切な特異性の不ズミ抗体を生成するためへの選択を包 含する。ネズミ抗体が生成された後すぐに、そのＣＤＲが単離され、そして第２ 表に同定される抗体誘導体の１つに使用され得る。そのような抗体を誘発するた めには、例１に概略される免疫原手段が利用され得る。Ｗ４似する免疫原アプロ ーチがインビトロ免疫化スケムにおいて使用され、ここでＢ−１２／ＴｃＩ［レ セプターに対して特異的な抗体が誘発され、そして次に、ＥＢＶ感染、電気融合 又はハイブリッド−ハイブリドーマ形成を通して免疫化される。他方、その遺伝 子はＰＣＲ増幅により単離され、そして次に、前記抗体誘導体の１つ中にクロー ン化される。

ヒト抗体は、Ｂ−１２／　）ランスコバラミン■レセプターに対して感受性にさ れたＢ−細胞を存する患者からの特定の抗体−生成り一細胞から直接的に生成さ れ得る。そのような場合、ヒト抗体産生Ｂ−細胞が同定され、そして細胞技法又 は遺伝子増幅技法を通して不滅化される。そのようなり一細胞のための源は、悪 性貧血、すなわち低Ｂ−１２レベルに関連する先天性異常性を有する患者である 。

さらに、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のためにトランスジェニックで あるマウスを用いて生成され得る。これは、ヒトＩｇＧ遺伝子をマウスの生殖系 中に挿入することによって遺伝的に達成される（Ｎ、　Ｌｏｎｂｅｒｇ、　Ｆｉ ｒｓｔ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｃｏ＋ｖｓｅｒｃｉａｌｉｚｔ ｎｇｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｐｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｄｅｃｅｍ ｂｅｒ　１７−１８１１９９２Ｌ他方、重度の組合された免疫不全（ＳＣＩＤ） マウスが、マウスにおいて増殖し、そして免疫化のために利用できるヒト白血球 細胞により移植された（Ｄｕｃｈｏｓａｌなど、、　Ｎａｔｕｒｅ　３５５　： 　２５８〜２６２．１９９２）、この場合、Ｂ−１２／ＴｃＩＩレセプターに対 して特異的な抗体が、特定の抗体の誘発の頻度を高める免疫原によるヒト白血球 ψ免疫化の後、単離され得る（下記例１に記載されるようにして）、他方、適切 な特異性の抗体は、生殖系［ｇＧ遺伝子の組合せのライブラリーから生成され得 る。

そのような方法においては、Ｐａｂフラグメントのライブラリーが適切な特異性 （免疫化されていないＢ−細胞レパートリ−に実質的に等しい）の抗原への結合 についてスクリーンされる。同じライブラリー を同定するための機会を高める。さらに、この技法を用し）ての適切な特異性及 び／又は親和性の抗体を同定する可能性は、従来の免疫化が下記例１に開示され る技法に続いて実施される場合、増強される。

レセプター拮抗剤としての抗体及び抗体誘導体の可能性ある利用性にもかかわら ず、それらの費用、免疫原性のための可能性又番よ特定化された形の供給、たと えば正所性又は経口性投与のための必要性により、適切でない医薬適用が存在す る。それらの目的のために、小さな有機化合物又はペプチドがまた開発され得る 。そのようなペプチド及び化合物は、（１）ペプチド又は抗体可変領域インヒビ ターを同定するために、細菌ペプチド発現ライブラリー、抗体）Ｋラトープ（ｐ ａｒａ　ｔｏｐｅ）類似体又は抗体Ｆａｂ発現ライブラリーのスクリーニング（ Ｇｅｎｅ　７３　：　３０５．１９８８　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｋ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７　：６３７８、１９９０　；　Ｂｉｏ　Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ　５　：　２２．１９９０　；　ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ　３　：　６４１．１９８９）　；　（２）有機分子類似体を息１ １造するために“ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ“°としての抗体を用（１ての合 理的薬物企画）。

ログラム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｊａｎ、　１９．１９９１）又番よ ペプチド又番よ有機インヒビターを同定するために結晶化されたビタミンレセプ ターを用いての従来の合理的薬物企画プログラム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２ ６８　：２４９、１９９０　；　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８　：　１５４４．１９ ９０）　；及び（３）ビタミンＢ１２摂取の阻害のために微生物の発酵ブイヨン に存在するような有機分子のライブラリーのスクリーニングし、阻害化合物の生 化学的性質を同定し、そして構造−機能関係を探求し、そして可能なインヒビタ ーを同定するために化学的に類似体を合成することを通して開発され得る。

Ｂ−１２／Ｔｅ１ｌレセプターのための小さな有機化合物及びペプチドレセプタ ー拮抗剤は適切なアッセイの使用を通して同定され得る。１つのａｍにおいては 、このアッセイはそのキャリヤータンパク質、すなわちトランスコバラミン■と 複合体化される放射性ラベルされたビタミンＢ１２の摂取を包含する（下記例１ 及び２を参照のこと）。

他のアッセイ、たとえば競争拮抗側として作用する抗体を用いる特異的結合アッ セイもまた有用であることがわかっている。それらの手段を通して、ヒト使用の ために適切なタンパク質及び非タンパク質分子のレパートリ−が生成され、そし て細胞増殖における変更を必要とする異なった医薬用途のために８１２摂取及び 生物利用性を操作するため最適な手段を定義するために使用され得る。

本発明の抗体基材の生成物が使用される態様は、抗−レセプター抗体の作用の機 構及びそれらの血清半減期に依存する。１つの態様において、抗体は典型的な質 量作用態様においてビタミンＢ１２／　）ランスコバラミンＨの複合体の結合の 拮抗剤として作用する。患者への投与のための目的は、予定された期間、典型的 には１〜７日間、標的細胞中へのビタミンＢ１２の摂取の５０％以上、及びより 好ましくは９０％以上又はすべてをブロックするのに十分なレベルで抗体の血清 濃度を達成し、そして維持することである。しゃ断の持続期間は、標的細胞及び 誘発される生物学的応答（たとえば細胞の死又は細胞分裂の停止）により決定さ れる。多くの手段により摂取されるビタミンＢ１２の阻害の程度を実験的に決定 できる。標的細胞が容易に入手できるもの（たとえばリンパ球又は骨髄）である 場合、患者からのサンプルは、抗体投与に続く種々の時間で摂取される残留ビタ ミン８１２について評価され得る。他方１．患者サンプルは流動細胞計測法を用 いてＦ［ＴＣＣ接合−レセプター抗体との結合について評価され得る。患者サン プルを得るのが困難な場合（固体腫瘍の処理におけるように）、レセプターしゃ 断の直接的な評価が、特定のイムノア７セイを用いての抗体の血清レベルを測定 しくたとえば、ビタミンＢ１２　レセプター抗体の循環レベルを測定するために 個々の特異的抗−イノオタイプ抗−グロブリンの使用又は下記に開示されるよう な他のアッセイ）、そしてレセプターしゃ断をインビトロで維持するのに必要と される抗体の量を参照することによって実施され得る。

抗−レセプター抗体の置及び投与のタンミングはまた、第２図に例示されるよう に、血清濃度を測定することによって決定され得る。

たとえば、ｌ〜ｓｏｏ　ｍｇの用量範囲で投与される抗体は、固相レセプター源 （たとえばに５６２白血病細胞の界面活性剤抽出物からの糖タンパク質単離物） へのビオチニル化された抗−レセプター抗体結合を用いて固相競争ＥＬＩＳＡに より血清において定量化される。ラベルされていない抗体は標準曲線をもたらす ために競争体として使用され得る。第２図に示されるように、典型的なＩｇＧ抗 体の血清半減期は２４時間であり、最大しゃ断（三線により示される）のために 必要とされる濃度以上の血清濃度を維持するために約３６〜４８時間ごとに投与 を必要とする。抗−レセプター抗体の固有血清半減期が長いほど、必要とされる 投与回数は少ない。従って、数日の半減期を有するＩｇ−抗体は、一定の環境下 でより好都合であり得る。

ビタミンＢ１２　レセプターを調節又は゛キャッピングできる抗体は競争拮抗剤 に類似する態様で使用され得る。しかしながら、レセプター調節のパラメーター の知識は治療を最適化するために必要である。ｔｌｉ節、キャッピング、パッチ ング又は固定化は、細胞表面抗原又はレセプターと抗体との相互作用をもたらす 、その用語は、膜内の抗原移動性の阻害〜表面からの抗原の完全なりリアランス の広範囲の応答を記載する。どのタイプの相互作用が生じても、抗体結合は、抗 原の性質に依存して、生物学的応答の機能又は促進の損失をもたらす、抗体によ り結合される場合、調節を受けることが示されている多くの種類の抗原及びレセ プターが存在するが、しかし抗原数と調節される能力との間の関係はほとんどな いように思われる（Ａｃｔａ　Ｈａｅ禦ｏｔｏ１．７３　：　１９６．１９８５ ）、二価（又は多価）が抗原を架橋し、そして調節を引き起こすために必要とさ れるので、そのようにするための能力は抗原密度及び分布、並びに抗体によりス パンされる距離により支配される（たとえばＩｇＭはＩｇＧよりも長い距離をス パンででる）、さらに、補助抗原、抗体又は細胞はまた、調節を高めることがで きる。たとえば、レセプターの調節は、補体の存在により、Ｔ−細胞上のＣＤ− ４のための旧Ｖ　ｇｐ１２０タンパク質により及びＴ−細胞上のＣＤ−５調節の ための単球により増強される（Ｊ、　Ｉ畢−ｕｎｏｌ。

１３３　：　２２７０．　１９８４　；　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５　：　１３８ ０．　１９８９　；　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４４　：　２３９．１９９０）。

抗体により認識される標的抗原上のエピトープは調節のために不可欠である（Ｊ 、　Ｉｍ＋＊ｕｎｏ１．１３７　：　２２Ｂ６．１９８６）　、　Ｂ−細胞上の 細胞表面ＩｇＤ免疫グロブリンの場合、抗体は結合される細胞表面ＩｇＧ分子の 部分に従って調節する（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９　：　２８７３．１９ ８７）　、　１５節された後すぐに、抗原又はレセプターはいくつかの運命を有 する：細胞表面上への固定化又はクラスター化、インターカレ−ション及び劣化 又は脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）　ｅ調節の程度は、同じ抗体、抗原及び標的細胞 集団に関してさえ有意に異なる（Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　７６：　１１ ９．１９８６）。どんな運命にせよ、生物学的応答は調節により抑制され又は開 始せしめられ、そして抗原又はレセプターの再発現を伴って、２４〜７２時間、 再確立されない。

選択性はまた、調節において達成され得る。はとんどのタイプの細胞は、繊維芽 細胞（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　９８　：　１９１．１９９１）、脂肪細胞（ Ｉｎｔ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｃｏ１．６　：　１９３＋　１９ ８４）、膵島細胞（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　２４　：　１１７．１９８３） 、精子（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１４４　：２７５、１９８３）、糸球 体上皮（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５　：　２４０９．１９８５）及び腫瘍 細胞（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４４８　：　１０９５．１９８５）につ いて記載されているようにして抗体によりｉｌＴされ得る。しかしながら、調節 は、リンパ球に対して最とも容易に達成される。組織の位置に依存して、そのよ うなリンパ球は多かれ少なかれ、３１！１節に対して敏感である。

たとえば、テンジクネズミのＴ−細胞上での０ＫＴ−３株抗原に対する抗体は、 すべてのリンパ球Ｕ織（ｒＩＩ腺を除く）に存在する場合、調節に対して敏感で あった（Ｊ、　Ｉ＋ｎｓ＋ｕｎｏ１．１３８　：　２５００．１９８７）　、Ｃ Ｄ−５抗原又はヒトＴ−細胞は、抗体の用量を制御することによってリンパ節に おけるＴ−細胞のｌ！節を伴わないで末梢細胞上で調節され得る。その逆もまた 、末梢細胞のために調節量のＴｌ０Ｉ　（抗−ｃＤ−５）をγ玉入し、そして続 いて、リンパ節Ｔ−細胞に対して選択的に供給されるＴ１０１の続く第２の注入 により達成され得る（Ｊ、　Ｉｗｍｕｎｏｌ、　１３３：　１６４１．　＋９８ ４　；　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１５　：　６７３．１９８６）　 、調節は単に抗体のみに制限されず；小さな化合物及びペプチドはまた、レセプ ターの再分布を引き起こす（Ｊ、　Ｂｉｏｉ、　Ｃｈｅｎ＋、　１６７　：　３ ５３０．１９９２）。

疾病工程自体、又はその徴候が抗増殖剤、たとえばビタミンＢ１２レセプター拮 抗剤の使用により一旦停止され又は改善され得る段階は多くの非腫瘍疾病工程に 共通する。それらの共通して認識される段階は、感作化又は誘発比相（ここで、 疾病に対して応答する免疫細胞が抗原特異的又は非特異的手法により開始される ようになる）、続いて増殖相（ここで、免疫細胞の数が拡張し）、そして最終的 に、徹候相（ここで、その拡張された免疫細胞が直接的に又は間接的に＆ｇ織損 傷を創造する）を包含する。このために、抗−増殖性化学療法薬物が癌以外の多 くの疾病の処置に共通して利用され得るが、しかし、それらの関連する毒性のた めに生命に脅威を与える情況への使用に制限される。抗−増殖剤、たとえば本発 明の１つの剤（化学療法剤の直接的な毒性をほとんど有さない）が、より広く使 用され得る。より特定には、本発明の抗−レセプター剤は血漿膜工程（たとえば イオン輸送）に対して破壊的ではない、さらに、抗−増殖活性は、ビタミンＢ１ ２の投与により可逆性である。さらに、本発明の剤は、それらが血漿膜のレベル で作用し、そしてインターカレーション又は架橋による核及びＤＮＡのレベル（ 多くの化学療法薬物が作用するように）で作用しないので、変異誘発性、奇形誘 発性又は発癌性ではない。

Ｂ１２／Ｔｃ　ＩＩレセプター拮抗剤のための医薬用途の理解は、そのような治 療により標的化される細胞タイプの知識を必要としない、最後に、種々の医薬用 途が下記の第３表に開示されている。

」じＬ表 ビ　ミン８１２　レセプ　−　のための　・活性化された　ＩＬ−２レセプター 　移植片対宿主疾病Ｔ−細胞　トランスフェリンレセプター　器官移植物インス リンレセプター　自己免疫ｆｆｌ患クラり■組織適合性　ぜん息 抗　原　クローン病 Ｉｔｌ瘍細胞　腫瘍関連抗原　Ｍｌ瘍治療に；６７　（単独で及び化学療法 トランスフェ１ルレセブター　剤と＆ｌＬで）骨ｕＴＩ？細胞　ＣＤ−３４同種 免疫骨髄トランスフェリンレセプター　移植物 クラス■組織適合性　化学療法の毒性 抗　原　の低下 ＩＬ−１，ＩＩ、−３レセプター 増殖する　ｒｈｙ　１．１　癒着、ｙＡ痕、繊維芽細胞　トランス７　ｘ　’ｌ 　＞　ｂ亡ブタ−強皮症のＩｌ害インスリン　＆　インスリン　株 増殖因子レセプター 繊維芽細胞増殖因子 レセプター 増殖する　ＥＧＦ　レセプター　乾　廚上皮又は表皮　プヒトー８１１遺伝子 （表皮ケラチン細胞） 増殖し、そして活性化されたＴ−細胞は、クローン病の慢性炎症からより急性の 器官移植拒絶までの範囲の広い種類の疾病を引き起こずことができる。それらの 疾病のすべてにおいて、′ｒ−細胞は中心の病原的役割又は付随する役割を提供 する。抗−増殖性化学療法薬物は、徴候を減じるように作用し、そして多くの場 合、長期間の軽減を導びく。同様に、増殖性繊維芽細胞及び上皮細胞は細胞の過 剰増殖により特徴づけられる疾病を生ぜしめる。ビタミンＢ１２レセフ゛ター剤 は、それらの疾病における存在する化学療法に取って代わって使用され、又はそ れと組合して使用され得る。それらの疾病における抗−増殖性ビタミン８１２　 レセプター剤の使用の重要な観点は、正常な治癒（癒着、廠痕）又は細胞再生（ 強皮症）工程がまた阻害されるような攻撃的に又は不適切なタイミングでそれを 通用することではない。それ自体では、低量の抗−レセプター剤が治癒の間に使 用され、そして高い投与量は、治癒が完結された後すぐに使用される。他方、抗 −レセプター剤は、治癒が完結された後、まったく投与され得ない。

前記のように、Ｂ１２／Ｔｃ　Ｕレセプター拮抗剤は、ビタミン腫瘍細胞からビ タミンＢ１２を電電するために使用され得る。十分な電電が容易に増殖するリン パ球Ｍｌ瘍、たとえば白血病及びリンパ腫での死を導び（ことはすでに示されて いる。さらに、存在する化学療法剤と組帛さ４１．る、この栄養物の細胞÷１１ 用能力を減しるだめの短期間の処置は、治療効能を著しく改良する。

固体腫瘍に関しては、Ｂ１２取奪は細胞性塞栓及び分化並びに細胞死を誘発する 。従って、Ｂ１２／Ｔｃ　ｆＪレセプター拮抗剤は、ホルモン的に応答する固体 腫瘍における分化を誘発するために使用され得る。

分化された表現型を発現する細胞の数の増加は、ホルモンレセプターの発現にお ける上昇を解釈すべきである。腫瘍、たとえば乳癌及び前立腺癌のホルモンレセ プター状態は、ホルモン治療に対するそれらの応答に直接的に関連している。従 って、Ｂ１２／Ｔｃ　Ｕレセプター拮抗剤は、レセプター陽性ＩＩ！ｉ瘍細胞の 数を高め、又は続くホルモン治療の効能を高めるためにレセプター密度を高める ために使用され得る。

ビタミンＢ１２　レセプター拮抗剤は、複製するＬｌ瘍及び正常細胞の両者に影 響を及ぼす。しかしながら、骨髄前駆体は異なった感受性又は応答を示す。従っ て、Ｂ１２　レセプター拮抗剤は、化学療法剤の毒性効果に対するそれらの耐性 を高めるために骨髄前駆体の感受性を調節するために使用され得る。そのような 化学療法薬物は複製細胞に対して王に作用し、そして非複製細胞はより低い感受 性である。

抗体は、高い入手可能な骨髄νＳ、正常な器官及び固体ｌＩｌ瘍への供給はより 容易に達成されるので、この用途のために十分に適切である。

さらに、レセプターを調節する能力を有するＢ１２／Ｔｃ　ＩＩ抗−レセプター 抗体は、リンパＬｉｖ　ｓ　、上皮ｍ織に異なって影響を及ぼす。毒性薬物に対 する前駆体の感受性の低下は骨髄貯蔵物を高め、そしてコロニー刺激因子への続 く応答を高め、そして高い用量の化学療法を可能にし又は再構成の間隔を戚しる 。癌のための８１２　レセプター治療の天然の結果のような骨髄前駆体に対する 陽性効果は、５−ＦＵ及びメトトレキセート以外の化学療法薬物の治療インデッ クスが改良され得る追加の機構であることがまた認識されるべきである。

種々の自己免疫疾巴、すなわち移植片νＳ宿主疾病、異所性アレルギー及び器官 移植においては、初期゛誘発”相（ここで、患者は自己又は同種抗原に対して感 作されるようになる）の後、Ｂ−又はＴ−細胞の禁しられている又は調節されて いないクローンが拡張される°′増殖パ相が続く。誘発に続く、抗−増殖性化学 療法薬物による処置は禁しられたクローンの拡張を阻害し、疾病の進行を阻害し 、そして安定した状態の耐性をたくわえることができることは長く知らｒている 。同種−抗原一宮作されたＴ−細胞の増殖を制御する抗体、０ＫＴ−３は、急性 同種移植物拒絶の処置のために許可されている。

本発明の抗−レセプター抗体は、ひしように高い化学療法薬物又は高い免疫原性 の抗体、たとえば０ＫＴ−３のためにｉ換され得、そしてそれらの関連する欠点 を伴わないで１（ＩＩする状態の耐性を達成できる。

炎症は抗体がすでに存在する作用であり、これは臨床試験において利用される。

この主な強調は、レクルートメントの阻害又は傷ついた＆１１織の血管内皮への 炎症性細胞の結合により炎症の初期出現を阻害することに基づかれて来た。炎症 の部位での細胞の増殖は病理学及び急性及び慢性の炎症のＭｉ織破壊に寄与する ことはまた良く認識されている。最後に、抗−増殖性化学療法薬物は、炎症の後 遺症を阻害するために広く使用されて来た。

メトトレキセートは、リウマチ様関節炎に関連する徴候を処理するために通常使 用される１種の薬物である。この薬物は、疾病の進行に関連する局在化された（ たとえば滑液）及び−膜化された炎症の両者を滅しるように作用する。メトトレ キセートは、白血病の治療においてビタミンＢ１２取奪により相集的に作用する 。従って、Ｂ１２拮抗剤は、リウマチ様関節炎における効能を高めるためにメト トレキセートと組合され得る。他のメトトレキセート用途は、慢性心臓疾愚及び 大腸炎に関連する破壊的炎症の処置を包含する。

腹部の手術、腹部への放射線投与又は化学療法はしばしば、組織癒着の進行によ り合併化される。それらは相当の臨床問題を提供する。なぜならば、それらは腸 封鎖を導びき、そして手術介入を要するからである。腹膜癒着は、腸の内部の腹 膜の細胞の増殖の結果として生しる。そのような増殖を妨害する非毒性手段は、 それらの正常な細胞の恒常性制御機構への修復を導びき、そしてそれによって癒 着形成の阻害を導びく。良性増殖及び続く廠痕の類似する工程は、網膜の合併症 である。抗体レセプター拮抗剤の小分子類似物の直接的な注入は、そのような作 業不能な合併症を妨げる。

次の例は、一定のビタミンＢ１２／Ｔｃ　［ルセブター拮抗剤及び調節剤の生成 及び医薬使用を例示する。この例に使用されるタイプのレセプター拮抗剤及び調 節剤は、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（ＡＲＬ）、特に攻撃的な形のＡＩＤＳ患者に発 生する癌の処置並びに他の医学的用途に適用され得るヒト又はキメラ性抗体であ る。ペプチド類似体の小分子はまた、癌の処置のために使用され得るが、しかし 、より最適には、他の医薬用途にもより使用される０次の例は、例示的であって 、本発明を制限するものではない。

桝 拠−上 ビ　ミンＢ１２　レセプ　−に・する　・モノクローナル　の−及ｐ」Ｉ１化 ハイブリドーマを、第１図に示されるようにして免疫化されたマウスからの不ズ ミ牌臓細胞及びＮＳ−１のようなＨＧＰＲＴ−骨髄腫細胞のＰＥＧ介在融合によ り生成する。免疫原のためには、Ｃｏｈｎ−精製された血清タンパク質に存在す るトランスコバラミン■を共有固定しくＣｎ　Ｂｒセファロース）、そして小量 の可溶化されたレセプターを吸着するために使用する０次に、その複合体を用い て、マウスを免疫化する。融合の後、４〜６週で、ハイプリドーマ上清液を、Ｃ ｏｈｎ画分からのトランスコバラミンＨにより複合体化された５ｆｆＣ０−コバ ラミンを含む、変性された放射性ラヘルされたアッセイを用いての化学的に定義 された培地において培養されたに５６２白血病細胞におけるビタミンＢ１２摂取 の阻害のために機能的アッセイにおいてスクリーンする。マイクロタイタープレ ートにおけるその一次スクリーンの結果は下記第４表に示されており、そして阻 害されなかった対Ｈ＋　（ウェルＡｌ）の両分として表わされる。ウェル１１１ ２は陽性対照（最大の阻害）として作用し、そして競争体としてトランスコバラ ミン口に複合体化されたラヘルされていないビタミンＢ１２の源のような血清を ｆＩＩ用する。

■１表 ハイブリドーマの−゛　スクリーン 八　１．０００　．９Ｂ６　．９９５　．９７３　．３２２　．８９８　．９９ ４　．９９３　．９８２　．９８８　．９８７　１．０００Ｒ，７８Ｆｌ　、９ ２２．８８Ｂ　、９６５．９Ｂ６．９２３　．８９８．９９３．９４２．９Ｂ６ ．８９７　．９５４Ｃ，９７２＞１．０００．９Ｂ４．８３２．９６４．７７７ 　．８８５．９２４．９８７．８４５．８９２１．００Ｏｎ　、９Ｒ，１，１１ １，９８６，７９９，９１２，９４３１，０００，９５６，９６４，９５５，９ １３，９８７Ｅ　、７８８　．９２２．８８Ｂ　、９６５．９Ｂ６．９２３　． ８９Ｂ　、９９３．９４２．９Ｂ６．８９７　．９５４Ｆ　＋、０００　．９８ ６．９９５．９７３．９８８．８９Ｂ　、９９４．９９３．９８２．１９Ｂ　、 ９８７１．０００ｃ　、９８３　．９８６．９８６．７９９．９１２．９４３１ ．０００．９５６．９６４．９５５．９１３　．９８７＋ｌ　、９７２　１．０ ００．９Ｆ１４　、Ｒ３２，９６４，７７７，８８５，９２４，９８７，８４５ ，８９２，０８９この一次スクリーンにおいて同定されるノλイブリドーマ（Ａ ５．　Ｃ２゜Ｄ２及びＦＩＯ）を、胸腺供給細胞による制限希釈によりクローン 化する。

４〜６週後、その−次ウエルからのクローン（連続数により同定される）を機能 的アッセイにおいて再スクリーンし、両親の特徴的な活性を保持するクローンを 同定する。さらに、他のアッセイを行ない、癌νＳ白血病細胞又は正常な分裂促 進剤刺激性リンノく球に対するビタミンＢＩ２摂取の阻害によるクローンの特異 性を特徴づける。その特異性の評価の結果は下記第５表に示される。

辺シロ良 背１よしＩ１値 Ａ５／８　：３８６　：３３３　：２８７Ａ５／１２ ＞　１．０００　＞　１．０００ Ｃ２／２　：将　、１．。。。　＞１．００００２／２０　：６５６　：？９２ 　：１５４Ｄ２／７ ＦＩＯ／８　：’ｚ’ｔ：　：ｉ：：　：：：：ＦＩＯ／４ それらの結果に基づけば、抗体Ｄ２／２０がリンパ腫の処置における追加の評価 のために選択される。この抗体は、Ｌｏｎｇ／ｍｌはどの低い抗体レベルでビタ ミンＢ１２　ｔＦ！取を強く阻害することができる（示されていない）、さらに 、その抗体はリンパ細胞においてビタミンＢＩ２の摂取を阻害するように思える が、しかし上皮起源の細胞においては上記の通りではなく、この特徴は、腸上皮 における複製陰窩細胞に対する毒性を低めることにおいて有用である。他の評価 においては、抗体は分裂促進剤刺激性ネズミ牌臓細胞におけるビタミンＢ１２の 摂取を阻害せず、これはヒトレセプターに対するその特異性ビタミンＢ１２　− レセプ　−　のみ　び　、゛と　人しての　ｄ″　可　のインビトロｔＦＪｔ 一定濃度範囲での抗体０２／２０を、化学療法薬物と共に及びそれを伴わないで 、マイクロタイタープレートにおいてＲａｊｉ　Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ傳細胞と 共に３日間インキエヘーする。細胞生存率を、テトラゾリウム染料の還元により 評価する。生存細胞のみが、染料を不溶性の着色された生成物に代謝し、この生 成物は続いて可溶化させ、そしてスペクトロメーターで読み取られる。このアッ セイの結果は下記第６表に示される。

ｌ裏 、２６８　．４３５　．７２３　．９８７　０．０４７　．０４８　．０５４　 ．５６３　１０１００％溶解制御＝、０４７ それの結果に基づけば、ビタミンＢ１２　レセプターに対する抗体は、それらか らビタミン旧２を飢えさせることによって、リンパ腫細胞の細胞死を誘発できる 。さらに、メトトレキセートと組合される場合、その組合せは相集的であると思 われる。なぜならば、それは単独での２種の剤のいづれかよりも相当により活性 的であるからである。その結果は、ビタミン８１２取奪の他方法により得られた 結果とＮｕ／ｎｕマウスに、百万個のＲａｊｉ　Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞を 皮下注射する。２週間後、わずかに手でされれる手痛がその注射部位に存在する 。測定が平面測定器（ｐｌａｎａｒｉ蒙ｅｔｅｒ）により立体的に行なわれ、そ して等しいサイズのＭＩＪＩが１０匹のマウスの実験グループに割り当てられる 。マウスに、薬物、メトトレキセート（３種の投与量レベルー５０．１０、及ヒ ５　ｍｇ／Ｍ２）及ヒ１ｏｏｔＩｇ／マウステノ抗体Ｄ２／２０を静脈内注射す る。治療は週１度、行なわれる。抗体及び薬物のみの対照、並びにビークルの対 照が含まれる。マウスを、８週間、週ごとに、毒性、死亡及び腫瘍サイズについ て眼によりモニターし、８週目に実験は停止され、マウスを殺害し、そして腫瘍 を除去し、そして重量を計る０重量（ｇ）に転換された一連の腫瘍測定値の平均 が下記第７表に示される。

ビークル、０５　．１２　．３４　．６７　１．３　２．９　６．０　−（−） 　＝ＩＩＩ瘍壊死により測定不能。

吋、Ｄ、−検出できない。

それらの結果に基づけば、ビタミンＢ１２抗−レセプター抗体がヒトＢｕｒｋｉ ｔｔ　リンパ腫のこのモデルにおける腫瘍増殖の阻害において活性的であり、そ してメトトレキセートとのその組合せがより効果的な手段を提供することが結論 づけられ得る。

拠−土 ｍ　ム　てのビ　ミンＢ　−レセ　−　９ＡＩｓ又漣刃」２」［Ｌ１１Φ昼Ｉ ＡＩＤＳ関連リンパ腫として診断された患者を、処置のために病院に入れる。そ の患者はＣＮＳ包含及び良好でない予後を示し、そして未知起源の発熱を有する 。その患者は２００／〃ｌ以下のＣ０−４計数を有し、そしてＡＰＬの診断の前 、抗−レトロウィルス治療、すなわちＡＺＴ（シトプシン：　ｚｉｄｏνｕｄｉ ｎｅ）を受けていた。患者は、次の手段に従って、骨髄支持体（ｒＧＭ−Ｃ５Ｆ ）と化学療法とを組合す攻撃的な手段を与えられる： Ａ、１〜５日目に毎日３０分間にわたってのシクロホスファミド、２００　ｓｇ ／Ｍ”、　ＴＶ　； ８．２Ｍｇ／用量を越えない、１日目でのビンクリスチン、１．４　ｍｇ／門” 、ＩＶ。

Ｃ１高い投与量のメトトレキセート、１日目で１５００ｍｇ／Ｍ”、　３０分間 にわたって投与される１５ｏ　ｍｇ／Ｍ！、続いて次の２３．５時間にわたって 投与される１３５０＋ｓｇ／Ｍ”、急速な尿の流れがｐＨ＞７．５の尿を維持す るために炭酸水素ナトリウムにより補充された尿のｐＨにより維持され；Ｄ、ｑ ６ｈで投与されるフォリン酸、３０ｍｇ　ＩＶ又はＰＯ、メトトレキセート注入 の完結後１２時間で開始、フォリン酸は血清メトトレキセート注入ルが０．０１ μＭになるまで続ける：Ｅ、４及び５日目に投与されるミドキサントロン、１０ ｍｇ／Ｍ”、　ＩＶ　；Ｆ、４及び５日目に投与されるデカドロン、５ｍｇ／Ｍ ”、　ＩＶｉＧ、絶対顆粒球計数が１，０００／μ］以下になるまで、６日間、 ｒＧＭ−Ｃ３Ｆ。

３μｇ／ｋｇの１日２回の皮下注入；及びト１．コース１０１日目での槽内ソト ラビン（５０ｍｇ）　；その後、他の治療のコースの個々のために１日目での艙 内メトトレキセート（１２ｍｇ）及び１６６日目の軸内シトラビン。

、■１．Ｐｔはまた、抗生物質及びジフルカン（Ｄｉｒ　Ｉｕｃａｎ）を予防的 に投与される。ＡＺＴは化学療法の間、中断される。患者は７コースの治療を受 け、そして結節性成牛の部分応答及びＣＮＳ疾患の完全応答を経験したことが評 価される。７力月後、周囲に再発する疾病を有する■、者は病院に戻った（但し 、ＣＮＳ包含のためにはまだ陰性である）。

患者は次の例外を伴って、前記と同じ組合せの手段により処理される：　ｒＧＭ −Ｃ５Ｆが１１１１増殖を促進に関係のために包含されず、軸内処理は伴わず、 そしてビタミン旧２レセプター抗体の包含は存在する。特に、抗体は化学療法の 個々のコースの１日目に投与される。

前記手段における抗体成分は、４時間にわたってＴＶ点滴において１００　ｍｇ の用量で投与された、不ズミ抗体０２／２０に由来する“人化された”キメラ性 １ｇＭから成る。抗体は、患者において７２時間の血清半減朋を有することがこ れまで測定されている。

告、者は、ｒＧＭ−Ｃ５Ｆの欠乏のために非応答好中球計数によりたった３つの コースの後、処置から除かれる。しかしながら１．患者は周囲の疾告の完全な応 答を経験したことが評価される。患者は１７力月間、完全な応答で存続する。

阻−エ ビタミン壮２１ｚセプター爬肌１ム−６（−／−先二二汁」１Ｕ１悲鼠定摂取さ れるビタミンＢ１２の阻害についてのアッセイにおいて陽性のハイブリドーマ（ 上記例１）を、レセプター調節できるそれらのハイブリドーマを同定するように 企画された異なったアッセイでスクリーンする。バイブリドーマ上゛清液を、４ °Ｃで６０分間、ｌＸｌ０’個のに５６２白血病細胞と共にインキュベートする 。細胞を再懸濁し、洗浄し、そして等アリコートの細胞（５ＸＩＯ’個を、別々 の管に除き、そして３７°Ｃで６０分間インキュベートし、この間、他のアリコ ートは４°Ｃで同時期間維持される０個々のハイブリドーマからの両アリコート を、螢光イソシアネート−接合の抗−マウス免疫グロブリン（ＦＩＴＣ−αＭ１ ｇ）による染色により結合されたマウス免疫グロブリンについて分析する。結合 されていない第二抗体を洗浄により除去し、そして染色された細胞をＣｏｕｌｔ ｅｒ　Ｅｐｉｃｓ　Ｃ流動細胞計測針を用いて試験する。陽性細胞の平均螢光強 度（ＭＦＴ）及び結合プロフィールを、細胞の２つのアリコートに対して比較す る０例１で同定された抗体のうち、姉妹クローンＦＩＯ／４及びＦＩＯ／８のみ が、第３図に示されるようにレセプター調節に対して陽性である。３７“Ｃで維 持されたサンプルの螢光強度は４°Ｃで維持されたサンプルの強度よりも有意に 低く、そしてレセプター調節の予備証拠を構成する。

レセプター調節又は°゛キヤツピングためのパラメーターは、調節における細胞 骨格の必要性を示すために、コルミン又はビンブラスチンのような微細管及び微 小フィラメントインヒビターによる研究によりさらに詳細される。研究はまた、 細胞エネルギ一工程に対するキャッピングの依存性を示すために酸化ナトリウム により実施される。さらに、レセプターの発現を完結するための時間は２４時間 であることが決定され、そしてたったｎｇ／ｍｌレベルの抗体が７２時間以内で チミジン摂取の完全な阻害をもたらす、レセプターを欠いた細胞の維持を必要と されることが決定される。

上宜工６　、ａ渚夕臭ス 急性白血病を有する成人の患者は、骨髄移植の前、誘発手段のために病院に入る 。患者は、６日間１２時間ごとに、サイトシンアラビノンド、３ｇ／Ｍ”を受け 、続いて３日間、１日２度、２００　ｃＧｙ　（Ｊ）放射線を分割された全身に 投与される。患者は、ＧｖＨＤの予防のためにミクロスポリン及びメトトレキセ ートと共に、誘発に続いてＴ−細胞数音された組織適合性骨髄を投与される。シ クロスポリンは、初めの１５日間、１．５　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量レベルで１ 〜１８０日間、サイラスティックカテーテルを通して投与され、続いて、その後 、３ｍｇ／ｋｇ／日の投与量レベルで投与される。メトトレキセートは、１゜３ 、　６．　ＩＩ、　１８．２５及び３１日目、０．２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量 で投与される。

患者は移植片包含を示し、そして３力月まで、ＧＶＨＤの証拠を有さない、しか しながら、その時点で、患者は病院に再で入れられ、そしてシクロスポリンＡを 受けながら、グレードＩ［［ＧＶＨＤを有するとして診断される。患者はもう１ 度、メトトレキセートを投与されたが、ビタミンＢ１２抗−レセプター抗体と組 合される。この手段は、４時間にわたってＩＶ点滴での５０＋ｗｇの用量でのネ ズミ抗体ＦＩＯ／４に由来する“ヒト化された“°キメラ性１８Ｍ投与、続くメ トトレキセート注入（０，２５ｍｇ／ｋｇ／日）から成る。その手段は、シクロ スポリン投与を維持しながら、１，３，６、及び１１日目で投与される。２週間 後、ＧＶＨＤのほとんどの出現は解決し、そして患者はさらに６０日間、シクロ スポリンに対して維持される。患者は、２年間、ＧＶＩＩＤフリーで存続し、こ の時点で、患者は白血病及び死から再発する。

拠−ユ ビ　ミンＢ１２　−レセプ　−　による　、　゛　の　゛　・性４８［Ｌ 第■段階の結腸癌を、リンパ節及び肝臓包含の両者と共に有する患者を、処置の ために病院に入れる。患者は、ロイコボリン（２００ｍｇ／Ｍｚ）を１０分間の 注入として、続いて２週間ごとに１，０００／Ｍ”の５−フルオロウラシルを投 与される。治療は、第１１１／ＩＶグレードの白血球減少症及び血小板減少症の ために２力月後に停止される。患者は、肝臓及びリンパ節疾患の部分的応答及び 最少の神経毒性を経験する。

患者はビタミンＢ１２　レセプターを調節できる、抗体ＦＩＯ／４の“ヒト化さ れた”キメラ性１ｇＭの前もっての注入により予備処理される。

患者は２時間にわたって：２＋Ｈの抗体により注入され、その投与量は骨髄細胞 に対するレセプターをＩＩ４節することが前もって見出されているが、しかしこ れは患者の固体１１瘍病変のバイオプシーにおけるイムノペルオキシダーゼによ り実質的に検出できない、１８時間後、患者は前のようにして、５−フルオロウ ラシル及びロイコボリンを注入される。患者は、４力月間、２週間ごとに処理を 続続して受け、そしてグレードＩの血小板減少症のみと及び少々の神経毒性を経 験する。この第２の処理期間の後、患者は、肝臓疾患の実質的に完全な応答を伴 って、リンパ節疾患の完全な応答を経験したことが評価される。

本発明は、特定の態様により開示され、そして記載されて来たが、種々の変更又 は修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは当業者により理解されるであろう 。

手続補正書 平成６年１１月７１．日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するためにビタミンＢ１２／トラ ンスコバラミンＩＩレセプターを競争的に拮抗化し又は調節することができる、 前記レセプターに対する抗−レセプター剤。
2. ２．前記剤がタンパク質、ペプチド及び小さな有機分子から成る群から選択され る請求の範囲第１項記載の抗−レセプター剤。
3. ３．前記剤がタンパク質である請求の範囲第１項記載の抗−レセプター剤。
4. ４．前記剤が抗体又は抗体誘導体である請求の範囲第１項記載の抗−レセプター 剤。
5. ５．温血動物における標的細胞の細胞分裂を阻害するための方法であって、前記 標的細胞の表面上のビタミンＢ１２／トランスコバラミンＩＩレセプターに対す る抗−レセプター刑を前記動物に投与することを含んで成り、ここで前記剤が標 的細胞によるビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するために前記レセプタ ーを競争的に拮抗化し又は調節することができることを特徴とする方法。
6. ６．前記標的細胞が活性化されたＴ−細胞、腫瘍細胞、骨髄幹細胞、増殖する繊 維芽細胞、増殖する上皮細胞及び増殖する表皮細胞から選択される請求の範囲第 ５項記載の方法。
7. ７．温血動物におけるビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するための方法 であって、細胞の表面上のビタミンＢ１２／トランスコバラミンＩＩレセプター に対する抗−レセプター剤を前記動物に投与することを含んで成り、ここで前記 剤が前記細胞によるビタミンＢ１２の細胞摂取を妨げ又は阻害するために前記レ セプターを競争的に拮抗化し、又は調節することができることを特徴とする方法 。
8. ８．前記抗−レセプター剤がタンパク質、ペプチド及び小さな有機分子から成る 群から選択される請求の範囲第５又は７項記載の方法。
9. ９．前記剤がタンパク質である請求の範囲第５又は７項記載の方法。
10. １０．前記剤が抗体又は抗体誘導体である請求の範囲第５又は７項記載の方法。