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JP5524610B2 - トランスコバラミン受容体ポリペプチド、核酸およびその調節因子、ならびに細胞の増殖の調節ならびにガンおよびコバラミン欠損症の処置に使用する関連方法 - Google Patents

トランスコバラミン受容体ポリペプチド、核酸およびその調節因子、ならびに細胞の増殖の調節ならびにガンおよびコバラミン欠損症の処置に使用する関連方法 Download PDF

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Description

政府の利益の陳述
本発明は、一部が、米国政府より提供された基金に基づいて行われた。したがって、米国政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。
発明の分野
本発明の分野は、トランスコバラミン受容体ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびに、コバラミン欠損症、腫瘍、免疫性および炎症性の疾患および障害の予防、診断、および処置におけるその調節因子の使用である。
関連技術についての記載
ビタミンＢ１２（コバラミン、Ｃｂｌ）は、中心のコバルト原子、低い軸上のヌクレオチド（ジメチルベンズイミダゾール）、および高い軸上のリガンド（これは、哺乳動物細胞の中では、メチル、５’デオキシアデノシル、またはヒドロキソ基のいずれかである）が含まれている平面的なコリン環からなる、構造が複雑な水溶性分子である。メチル−Ｃｂｌは、酵素であるメチオニンシンターゼ（ＭＳ）によって触媒されるメチオニンの新規の合成において、Ｎ５メチルテトラヒドロ葉酸（メチル−ＦＨ４）からホモシステインへのメチル基の転移において機能を担う。５’デオキシアデノシル（Ａｄｏ−Ｃｂｌ）は、酵素であるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ＭＭＵ）によって触媒される、メチルマロニル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡへの再配置のための補因子である（１４）。ヒドロキソ−Ｃｂｌの補酵素機能は不明であるが、これはＣｂｌの相互変換における中間型であり、Ｃｂｌ補酵素の新規の合成におけるＣｂｌレダクターゼの基質である。
Ｃｂｌの大きさが大きいこと（ＣＮ−Ｃｂｌのｍｏｌ ｗｔ＝１３５５）、複雑な三次元構造、そしてその親水性の特性は、細胞膜を通じたこのビタミンの受動拡散を妨げる。哺乳動物においては、消化管から組織細胞の中のその最終的な場所までのＣｂｌの吸収のために２つの担体タンパク質と２つの膜受容体を必要とする複雑なプロセスが発達している。食物から放出されたＣｂｌは、胃の中の酸性ｐＨが好む唾液のＲタンパク質に優先的に結合し、続いて、Ｒタンパク質が膵臓のトリプシンによって消化される空腸の中の中性のｐＨで内因子（ＩＦ）に乗り換える。ＩＦ−Ｃｂｌ複合体は、回腸末端部に運ばれ、ここでこれは、微絨毛膜上の特異的な受容体に結合する。最近の報告では、腎臓から精製され、卵黄嚢および回腸の中で同定されている４６０ｋＤａの膜結合タンパク質であるクビリン（ｃｕｂｉｌｉｎ）として、ＩＦ受容体が同定された。このタンパク質は、Ｃａ＋＋の存在下でＩＦ−Ｃｂｌに結合し、クビリンが結合したＩＦ−Ｃｂｌのエンドサイトーシスに関係している膜貫通タンパク質であるアムニオンレス（ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）と相互作用する。吸収されたＣｂｌは、血管内皮によって分泌されたＣｂｌ結合血漿タンパク質であるトランスコバラミン（ＴＣ）に結合して循環の中に放出される。上皮細胞の中で発現されたマルチリガンド結合タンパク質であるメガリン（ｍｅｇａｌｉｎ）は、腎臓でのＴＣの再吸収に関係している。クビリンをコードするｃＤＮＡがクローニングされており、予想されるアミノ酸配列は、クビリンがマルチリガンド結合タンパク質のクラスにも属することを示している。
回腸からのＣｂｌの吸収は、Ｃｂｌホメオスタシスを維持するためには不可欠である。このプロセスに何らかの摂動があれば、最終的には、細胞内Ｃｂｌ欠乏症に至るであろう。そのうちの１つが葉酸の代謝に関係しており、結果として、核酸の合成に関係している基本的な代謝反応におけるＣｂｌの基本的な役割のため、Ｃｂｌ欠乏症は、Ｃｂｌと葉酸の欠乏の両方によって生じる巨赤芽球性貧血において観察されるような異常な細胞分裂と分化を導くであろう。Ｃｂｌ欠乏症の神経学的合併症は、中枢神経系に、さらには末梢神経系にも不可逆的な損傷を引き起こすことが知られている（２５）。
食事での摂取不足と吸収不良のような二次的原因（例えば、熱帯性スプルーと寄生虫の繁殖）を除き、Ｃｂｌ欠乏症の根本的原因は、悪性貧血の患者において観察されるようなＩＦの欠乏、食物からのＣｂｌの放出の障害、先天性ＩＦ欠乏症、および先天性ＴＣ欠乏症である。Ｃｂｌ吸収不良とタンパク尿は、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ−Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群として知られている別の障害の特徴であり、この場合、回腸末端部でのＩＦ−Ｃｂｌの吸収は、受容体が結合したＩＦ−Ｃｂｌのインターナライゼーションの障害によって影響を受ける。
Ｃｂｌの組織分布と細胞による取り込みの基本的なプロセスは、血漿タンパク質であるＴＣと、ＴＣ−Ｃｂｌに結合し、エンドサイトーシスによりこれをインターナライズするＴＣ−Ｃｂｌの膜受容体（ＴＣｂｌＲ）によって媒介される。ＴＣはまた、回腸末端部で吸収されたＣｂｌの移動にも必要であり、この機能は、先天性ＴＣ欠乏症において損傷している。血漿中でのこのタンパク質の正常な濃度は０．４〜１．２ｐＭであり、そのうちのおよそ１０〜３０％が、正常なＣｂｌホメオスタシスの条件下でＣｂｌによって飽和状態にある。ＴＣの高いレベルは、特定の自己免疫疾患および骨髄増殖性疾患において報告されている。ＴＣはヒトの血漿から精製されており、このタンパク質をコードするｃＤＮＡは、内皮ｃＤＮＡライブラリーから単離されている。
様々な組織の中でのＴＣおよびＴＣ ｍＲＮＡを同定した報告によっては、タンパク質の供給源としてのこれらの組織の中の特異的な細胞は特定されなかった。加えて、培養物中の肝細胞、マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、および回腸粘膜によるＴＣの合成を示す実験によっても、インビボでのＴＣの供給源についての情報はもたらされていない。これらの細胞は全て培養物中でＴＣを合成することができるが、ヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が他の細胞よりもこのタンパク質を有意に合成すること、およびエキソビボで潅流された臍帯静脈がＴＣを合成することの知見により、血管内皮がおそらくは血漿ＴＣの供給源であろうという証拠が提供される。広い内皮表面により、６０〜１２０分の比較的短い半減期を有しているＴＣの循環レベルを維持する能力が提供される。
トランスコバラミン受容体（ＴＣｂｌＲ）
細胞内でのＣｂｌの取り込みについての生理学的プロセスには、高い親和性でｈｏｌｏ−ＴＣに結合する細胞表面上の特異的受容体が必要である。血清中のＣｂｌ結合タンパク質は同定されており、Ｃｂｌの細胞による取り込みにおけるＴＣの役割は十分に特性決定されている。Ｃｂｌの細胞による取り込みについての情報は、原核生物中の膜受容体に対するＣｂｌの直接の結合によって最初に、次いで哺乳動物細胞の中のさらに複雑なプロセス（それによって、膜受容体がＴＣ−Ｃｂｌに特異的に結合し、複合体をインターナライズする）によって導かれた。このプロセスは、最初のＣａ＋＋依存性であり温度依存性である、受容体へのＴＣ−Ｃｂｌの結合と、その後の細胞にビタミンを移動させ、代謝エネルギーを必要とするよりゆっくりとした第２の温度依存性の工程を含む２相性である。ＴＣによって媒介されるＣｂｌの取り込みは、実験した全ての哺乳動物細胞の中で同定されており、肝臓（ここでは、血液中の別のＣｂｌ結合タンパク質である、ハプトコリンに結合したＣｂｌの取り込みが、アシアロ糖タンパク質受容体を介して生じる）を除く細胞へＣｂｌを送達するための唯一のシステムのようである。
ヒトの皮膚線維芽細胞の中での実験により、ＴＣ−Ｃｂｌの受容体によって媒介されるエンドサイトーシスと、その後の、Ｃｂｌを放出するＴＣのリソソーム分解が確立された。近年の実験では、受容体が主に微絨毛膜の上で発現され、ＴＣ−Ｃｂｌのインターナライゼーションがクラスリン被膜を有しているピットを介して起こることが示された。１細胞あたり２０００〜６０００個の間のＴＣ−Ｃｂｌ受容体が細胞の増殖期の間に発現され、分裂していない、完全に分化した細胞の中では３００個未満の受容体となるようにダウンレギュレートされる。細胞複製の初期の間の細胞内Ｃｂｌの高い必要性により、これらの細胞の中の受容体の１０〜３０倍の増加をもたらすことができる、活発に分裂する細胞の中での受容体の高い発現が誘導される。ＴＣ受容体のこの発現により、最もビタミンを必要とする細胞（すなわち、活発に分裂している細胞）の中でのＣｂｌの取り込みを選択的にブロックするため、および代謝拮抗物質アナログおよびＣｂｌ−薬物結合体を迅速に増殖している細胞に対して優先的に送達するための特有の標的が提供される。
ＴＣｂｌＲタンパク質の構造についての情報はわずかしかなく、様々な研究室による結果は一致していない。ＴＣｂｌＲを可溶化させるための最初の試みは、非特許文献１によって、ＴＣｂｌＲの供給源として胎盤膜を使用して報告された。彼らは、ＴＣ−Ｃｂｌの胎盤膜への、および膜のＴｒｉｔｏｎ可溶性画分への、特異的Ｃａ＋＋依存性の結合を示すことができた。非特許文献２には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−Ｃｂｌ−ウサギＴＣカラム上での親和性精製と組み合わせて従来のタンパク質精製技術を使用した可溶性受容体の精製が報告されている。彼らは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって主要な４６０ｋＤａと少数の４０ｋＤａの受容体を、そしてスクロース密度勾配遠心分離によって５０ｋＤａのタンパク質を同定した。ゲルの中のＴＣ−Ｃｂｌ結合活性に対応する主要なタンパク質染色領域が非変性ＰＡＧＥによって同定されたが、純度と大きさについてさらに良好な指標を提供することができる最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは報告されなかった。彼らの実験では、機能性受容体の活性を、ｍｉｎｉ ＤＥＡＥイオン交換カラムを使用してモニターして、遊離のＴＣ−Ｃｂｌから受容体が結合したＴＣ−Ｃｂｌを分離した。この方法では、最良の条件の下でのみ、２つの画分の部分的な分離とＴＣｂｌＲ活性の過剰な概算（ＰＩ、個人的な観察）がもたらされ、したがって、６つの胎盤から回収したＴＣｂｌＲ活性の２．９ｎｍｏｌｅは、おそらく、過剰な概算であった。報告されたタンパク質の特異的活性とタンパク質含有量に基づくと、最良の最終産物は６０％の純度であり、したがって、報告されたアミノ酸と炭水化物の分析は正確ではあり得なかった。精製したＴＣｂｌＲに対する重要ではない修飾を加えて、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｎの手順を使用し、そして、還元条件と非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいた非特許文献３は、精製したＴＣｂｌＲが、それぞれ、７２ｋＤａまたは６２ｋＤａのタンパク質として移動したと結論した。彼らは、最終産物の機能的活性の量、純度、または特異的活性についてのデータは何一つもたらすことはできなかった。彼らの実験は、ＴＣｂｌＲが血漿膜の脂質二重層の中に非共有二量体として存在し得ることを示していた。彼らは、このタンパク質の一次構造とこのタンパク質をコードする遺伝子は同定しなかった。彼らの結果が以前の報告とは異なることに注目することが重要である。
ヒトの胎盤に由来するＴＣｂｌＲを特性決定するための実験（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０８：１９２−９，１９９４）は、受容体が５８ｋＤａのタンパク質であり、４１ｋＤａのコアポリペプチドが含まれていることを示していた。タンパク質の質量の残りは炭水化物からなり、そしてシアル酸（４７％）、Ｎ結合糖（２４％）とＯ結合糖（２９％）から構成されている。これらの結果は、ＴＣに架橋されたＴＣｂｌＲの酵素消化と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での複合体の分子量の変化によって導かれた。全ての公開されているデータを考慮しても、ＴＣｂｌＲの構造の完全な特性は未だに解明されておらず、この重要な受容体タンパク質をコードする遺伝子も同定されていない。
中枢神経系（ＣＮＳ）の中のＣｂｌ
末梢神経系および中枢神経系の中の神経病理学的変化と、その結果としてのＣｂｌ欠乏症における機能の異常により、正常な神経系を維持することにおけるこのビタミンの役割を裏付ける説得力のある証拠が提供される。しかし、ＡＤおよび他の認知症におけるＣｂｌ欠乏症の明確な証拠は不足している。これらの障害において観察される生化学的変化および形態学的変化のうち、細胞性の構成成分とアポトーシスによる細胞死の低メチル化が脳の中で観察されている。そのような病理学的変化は、Ｃｂｌの欠乏および／または葉酸の欠乏の両方によって引き起こされ得る。これらの２つのビタミンが関与している代謝経路は、脳組織の中では十分には特性決定されていない。成体の脳の中のＣｂｌの濃度は約４０〜１３０ｐｇ／ｍｇ組織であり、脾臓および腎臓の中でのレベルに類似するレベルであろう。脳を含むほとんどの組織の中のＣｂｌ濃度は誕生の時点では低く、年齢とともに増大する。胎児の脳および肝臓の中では、酵素ＭＳを必要とするＣｂｌは、胎芽形成の初期に最も高く、胎児の発育とともに減少する。この組織の中のＭｅＣｂｌのレベルは、酵素の活性と同調する。脳の中のＴＣおよびＴＣｂｌＲについてはほとんど知られておらず、加齢や様々な脳の障害におけるこれらの必須のタンパク質の発現については何も知られていない。脳組織へのＴＣ−Ｃｂｌの結合が測定されており、脊髄からよりも大脳皮質から調製された膜の中で高いことが明らかである。加えて、ＴＣ−Ｃｂｌの取り込みは、培養物中のグリア細胞においても報告されている。
ＴＣは脳脊髄液（ＣＳＦ）中の主要なＣｂｌ結合タンパク質であり、脳細胞によるこのタンパク質の合成についての報告は、Ｃｂｌの取り込みに必要なＴＣが脳組織の中でインサイチュで合成され得るとの概念をサポートするであろう。様々な認知症におけるＣｂｌ欠乏症と葉酸欠乏症についての役割は、血清とＣＳＦの中での全Ｃｂｌレベルおよび全葉酸レベルを測定することによっては確立することはできなかった。なぜなら、これらは曖昧な結果を提供するからである。しかし、脳の中でのメチル化を評価するために設計された実験では、ＣＳＦ中のＳ−アデノシルメチオニンのＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＭ／ＳＡＨ）に対するメチル化の割合の変化が同定された。Ｃｂｌが欠乏している動物に由来する脳、ならびに、ＡＤおよび認知症の個体から死体解剖時に得られた脳組織の中での低メチル化が報告されている。これらの実験は、Ｃｂｌと葉酸が関係しているトランスメチル化経路の障害が、ＡＤと認知症の病因に寄与している可能性があることを示している。食事性欠乏症をのぞき、細胞による取り込みの減少は細胞内での欠乏を引き起こす可能性がある。
ガン治療におけるＴＣ−ＴＣｂｌＲ経路
モノクローナル抗体技術（例えば、免疫原性であるマウスタンパク質成分のほとんどを排除するように抗体を操作すること、またはトランスジェニックマウスの中でヒト抗体を生産させること）における最近の進歩により、抗体治療の有害な作用のいくつかが有意に減少し、そしてガンおよび自己免疫疾患において特異的抗原を標的化するためのモノクローナル抗体の使用が進歩された。抗血管新生治療を用いて、または特異的な栄養素の細胞による取り込みもしくは細胞内代謝をブロックすることにより腫瘍の新血管形成を予防することは、新生物の増殖を抑制するための実験的アプローチである。葉酸の再利用と、ＤＮＡ合成のために葉酸を提供すること、およびメチル化反応のための細胞内ＳＡＭレベルを維持することにおいてＣｂｌは不可欠な役割を果たしているため、細胞内Ｃｂｌの枯渇によっては、細胞の複製が阻害されるであろう。ヒトにおいては、吸収不良または食事摂取量の不足が原因であるＣｂｌの欠乏は、肝臓に多量のＣｂｌが貯蔵されているとの理由から、臨床的に現れるまでに数年かかる。先天性ＴＣ欠乏症をもって生まれてきた幼児は、ＴＣ−Ｃｂｌが母親から供給されるので、子宮内では正常に発育する。しかし、彼らは、すぐに、すなわち、ＴＣが不足するので生後数ヶ月後に、Ｃｂｌ欠乏症を発症する。肝臓での貯蔵と、腸内の微生物叢によるＣｂｌのプールへの寄与が原因で、Ｃｂｌの枯渇によるＣｂｌ欠乏症の動物モデルを得ることは難しい。Ｃｂｌ欠乏食で長期間飼育したアフリカオオコオモリ（Ａｆｒｉｃａｎ ｆｒｕｉｔ ｂａｔｓ）を用いたいくつかの成功が報告されている。インビトロでの培養に必要な血清または血清因子補助食品によるＴＣ−Ｃｂｌの寄与が原因で、培養された細胞の中でインビトロでＣｂｌ欠乏症を生じさせることはなおさらに難しい。しかし、注意深く管理した実験により、全ての細胞がＣｂｌを絶対的に必要としており、細胞内Ｃｂｌが基準濃度よりを下回るほど低下してしまうと、複製できないことが示された。細胞の複製に対するＣｂｌ欠乏症の効果を裏付ける証拠はまた、酸化窒素（Ｎ２Ｏ）を、急性白血病を有している患者に彼らの白血病を管理するために、または大きな外科手術後の患者に彼らの痛みを緩和するために、そしてＣｂｌ欠乏症において見られるような巨赤芽球性貧血を発症した血族がいるこれらの患者のいずれかに、長期間投与した実験からも得ることができる。Ｎ２Ｏは、Ｃｂｌ分子の中のコバルトの還元状態に影響を与え、これは次いで、酵素ＭＳの補因子であるメチル−Ｃｂｌの合成に影響を与える。
Ｃｂｌの細胞による取り込みを阻害するためのストラテジーは、血中のＣｂｌトランスポーターであるＴＣに対するエピトープ特異的モノクローナル抗体と、ＴＣ−Ｃｂｌの細胞による取り込みを促進する血漿膜受容体であるＴＣｂｌＲに対するエピトープ特異的モノクローナル抗体を利用できる。ヒトＴＣに対するｍＡｂが作成されている（Ｍｏｒｇａｎら、１９９６年３月２１日に公開された特許文献１を参照のこと）。これらのマウスｍＡｂの特性決定により、３種類の異なるｍＡｂのタイプ（すなわち、ＴＣｂｌＲによるＴＣ−Ｃｂｌの取り込みを妨げるｍＡｂ（受容体をブロックする）、ａｐｏ ＴＣに対するＣｂｌの結合を妨げるｍＡｂ（Ｃｂｌをブロックする）、および受容体の結合とＴＣのＣｂｌ結合機能を損傷させることのないｍＡｂ（結合性ｍＡｂ））がもたらされた。受容体をブロックする抗ＴＣ ｍＡｂとＣｂｌをブロックする抗ＴＣ ｍＡｂは、単独で、または組み合わせてのいずれかで、Ｃｂｌの細胞による取り込みを妨げるために使用することができた。同様の効果が、ＴＣ−Ｃｂｌの結合をブロックするＴＣｂｌＲに対するｍＡｂを用いても得ることができた。これらのｍＡｂは、不可欠な栄養素を選択的に枯渇させることにより細胞増殖を停止させるための生物学的調節因子として作用することができた。抗ＴＣ ｍＡｂを用いた実験は、これらのｍＡｂがＣｂｌの取り込みをブロックし、インビトロでの細胞の複製を阻害することを示している。薬物、毒素、または放射性核種に結合させられると、ＴＣ−Ｃｂｌ結合性ｍＡｂは、ＴＣ−ＴＣｂｌＲ経路を介してこれらの化合物を腫瘍細胞へ送達することができた。ＴＣｂｌＲの発現は、細胞周期の増殖期の間に増大し、そしてガンにおいては、細胞の大部分が活発に分裂しており、したがって、この経路を複製しつつある細胞に対してｍＡｂ−薬物またはＣｂｌ−薬物結合体を送達するために利用することができた。Ｃｂｌに結合させられた放射性分子または蛍光化合物は、周辺組織と比較してより多量のこれらの化合物が腫瘍細胞の中に蓄積するので、画像化技術によって腫瘍の塊の位置を決定するために使用されている。
明らかに、コバラミン欠乏症、ならびに細胞増殖、免疫応答、および炎症に関係するガンおよび他の疾患を処置および予防するさらに別の方法が、当該分野で必要とされている。本発明は、ＴＣｂｌＲポリペプチドとポリヌクレオチドを提供することにより、この長期間放置されてきた必要性を満たし、これらがＣＢＬの取り込みおよびＴＣｂｌＲ活性の調節因子を同定することにおいて有用である。加えて、本発明により、新規のＴＣｂｌＲ調節因子（ＴＣｂｌＲに特異的なｓｉＲＮＡと抗体を含む）と、これを作成するための方法が提供され、これらは、Ｃｂｌの取り込みを調節するため、ならびに細胞増殖、免疫応答、および炎症に関係するガンおよび他の疾患を処置するために、治療用組成物において使用される。
国際公開第９６／０８５１５号パンフレット Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９７７）５９：５１−８ Ｓｅｌｉｇｍａｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７８）２５３：１７６６−７２ Ｂｏｓｅ ａｎｄ Ｓｅｅｔｈａｒａｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８１：２８１−９
本発明により、コバラミンの細胞による取り込みと細胞増殖を調節することにおいて有用な新規の組成物および方法が提供され、これには、トランスコバラミン受容体の発現および／または活性の調節因子が含まれる。したがって、本発明の組成物および方法はまた、トランスコバラミンの取り込みが関係している疾患および障害を処置および／または予防するために、ならびに、腫瘍細胞を同定し、そして腫瘍細胞に対して治療薬を標的化させるためにも有用である。
１つの実施形態においては、本発明により、細胞によるコバラミンの取り込みを阻害する方法が提供される。この方法には、細胞をトランスコバラミン受容体の阻害因子と接触させる工程が含まれる。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。１つの実施形態においては、阻害因子は、トランスコバラミン受容体の発現を阻害し、特定の実施形態においては、阻害因子はアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはＲＮＡｉ分子である。第２の実施形態においては、阻害因子は、トランスコバラミン受容体の活性を阻害し、特定の実施形態においては、阻害因子はポリペプチド、ペプチド、低分子有機化合物、または抗体である。様々な実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体またはヒト化抗体である。１つの実施形態においては、阻害因子は、トランスコバラミン受容体に対するトランスコバラミンの結合を妨害する。
さらなる実施形態においては、本発明により、腫瘍細胞へ治療薬を送達する方法が提供される。この方法には、腫瘍細胞を、トランスコバラミン受容体に特異的に結合する抗体に結合させられた治療薬と接触させる工程が含まれる。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
本発明の関連する実施形態には、細胞の中でアポトーシスを誘導する方法が含まれる。この方法には、細胞を、トランスコバラミン受容体に対する抗体と接触させる工程が含まれる。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、この場合、上記抗体は細胞によるコバラミンの取り込みを阻害する。特定の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
なお別の関連する実施形態においては、本発明により、細胞によるコバラミンの取り込みを促進する方法が提供される。この方法には、細胞に、トランスコバラミン受容体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを導入する工程が含まれる。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはその断片を有する。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドにはさらに、トランスコバラミン受容体をコードする配列に対して動作可能であるように連結されたプロモーター配列が含まれる。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは発現ベクターである。別の特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは標的化ベクターまたは相同組み換え構築物である。
別の関連する実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミン取り込みの調節因子を同定する方法が含まれる。この方法には、（ａ）トランスコバラミン受容体またはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、候補の調節因子の存在下で接触させる工程、（ｂ）トランスコバラミン受容体に結合したトランスコバラミンの量を決定する工程、および（ｃ）候補の調節因子が存在しない条件下で結合した量に対して、結合したトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、結合したトランスコバラミンの量の減少または増加が、候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、トランスコバラミン受容体またはその断片は組み換えによって生産される。特定の実施形態においては、調節因子は抗体または低分子有機化合物である。
関連する実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子を同定する方法が含まれる。この方法には、（ａ）トランスコバラミン受容体をコードする配列が含まれている外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を、候補の調節因子の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程、（ｂ）細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定する工程、および（ｃ）候補の調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量に対して、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少または増加が、候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す。１つの実施形態においては、トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、調節因子は組み換えによって生産される。特定の実施形態においては、調節因子は抗体または低分子有機化合物である。
１つの実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子を同定する方法が含まれる。この方法には、単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、候補の調節因子の存在下で接触させる工程、トランスコバラミン受容体に結合したトランスコバラミンの量を決定する工程、および抗体が存在しない条件下で結合した量に対して、結合したトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、候補の調節因子が存在しない条件下と比較して、候補の調節因子の存在下で結合したトランスコバラミンの量の増加または減少が、候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す。
関連する実施形態においては、本発明により、細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子を同定する方法が提供される。この方法には、トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を、候補の調節因子の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定する工程、および候補の調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量に対して、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、候補の調節因子が存在しない条件下と比較して、候補の調節因子の存在下で細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少または増加が、候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す。
本発明の特定の実施形態においては、候補の調節因子は、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、またはトランスコバラミン受容体の断片である。
さらに関連する実施形態においては、本発明により細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を同定する方法が提供される。この方法には、単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体の存在下で接触させる工程、トランスコバラミン受容体に結合したトランスコバラミンの量を決定する工程、および抗体が存在しない条件下で結合した量に対して、結合したトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、候補の調節因子の存在下で結合したトランスコバラミンの量の減少が、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す。
別の実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を同定する方法が含まれる。この方法には、外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を、トランスコバラミン受容体ポリペプチドに特異的に結合するヒト抗体の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定する工程、および抗体が存在しない条件下で取り込まれた量に対して、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を比較する工程が含まれる。ここでは、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少が、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す。
本発明にはまた、関連する実施形態において、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を生産する方法も含まれる。この方法には、精製された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその免疫原性部分で、ヒト抗体ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することにより、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体を生産する工程が含まれる。ここでは、上記組み換え生成されたトランスコバラミンポリペプチドは、プロモーター配列に動作可能であるように連結されているトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞（その結果、細胞は、組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現する）から精製される。
本発明の方法の様々な実施形態にはさらに、以下により、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを明らかにすることが含まれ得る。すなわち単離された組み換え発現されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、抗体の存在下で接触させる工程、トランスコバラミン受容体ポリペプチドに結合したトランスコバラミンの量を決定する工程、および抗体が存在しない条件下で結合した量に対して、結合したトランスコバラミンの量を比較する工程である。ここでは、結合したトランスコバラミンの量の減少は、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す。
本発明の方法の他の実施形態にはさらに、以下により、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを明らかにすることが含まれ得る。すなわち、外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現する細胞を、トランスコバラミンと、候補の調節因子の存在下で接触させる工程、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定する工程、および抗体が存在しない条件下で取り込まれた量に対して、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を比較する工程である。ここでは、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少が、抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す。
本発明の方法の特定の実施形態においては、トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片には、配列番号１に示されるアミノ酸またはその断片が含まれる。さらなる関連する実施形態においては、本発明には、患者の腫瘍を視覚化する方法が含まれる。この方法には、ＴＣｂｌＲに特異的に結合する薬剤を患者に導入する工程（ここでは、上記薬剤は、検出標識に結合させられている）、および検出可能な標識を腫瘍細胞に特異的に結合させるために十分な時間のあと、検出可能な標識の患者における位置を決定し、それにより、患者の中の腫瘍を視覚化する工程が含まれる。特定の実施形態においては、検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識、または化学発光標識である。
さらなる実施形態においては、本発明により、細胞によるコラバミンの取り込みを阻害する方法が提供される。この方法には、細胞を、トランスコラバミン受容体をコードするポリヌクレオチドに対して標的化させられた、８から３０ヌクレオチドの長さの二本鎖のオリゴヌクレオチドの有効量と接触させる工程が含まれる。ここでは、上記オリゴヌクレオチドは、トランスコバラミン受容体の発現を阻害する。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、配列番号２または３のいずれか１つに示される配列の一部が含まれる。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、配列番号６〜１８のいずれか１つに示される配列が含まれる。
関連する実施形態においては、本発明には、細胞の中でのトランスコバラミン受容体遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が含まれる。ここでは、上記ｄｓＲＮＡには、互いに相補的である少なくとも２つの配列が含まれ、ここでは、センス鎖には第１の配列が含まれ、アンチセンス鎖には、トランスコバラミン受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対して実質的に相補的である相補性の領域が含まれており、上記相補性の領域は３０ヌクレオチド未満の長さであり、上記ｄｓＲＮＡは、上記トランスコバラミン受容体を発現する細胞と接触すると、上記トランスコバラミン受容体の発現を少なくとも２０％阻害する。他の関連する実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、上記トランスコバラミン受容体の発現を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害する。１つの実施形態においては、センス鎖には、配列番号２または３のいずれか１つに示される配列の一部が含まれる。
さらなる実施形態においては、本発明には、患者の腫瘍、神経学的疾患、免疫関連疾患、炎症、または神経疾患を処置あるいは予防する方法が含まれる。これらの方法には、上記患者に本発明のｄｓＲＮＡを投与する工程が含まれる。
別の関連する実施形態においては、本発明には、細胞によるコバラミンの取り込みを促進する方法が含まれる。この方法には、細胞に、トランスコバラミン受容体またはその断片をコードする配列が含まれているポリヌクレオチドを導入する工程が含まれる。１つの実施形態においては、上記ポリヌクレオチドにはさらに、トランスコバラミン受容体またはその断片をコードする配列に動作可能であるように連結されたプロモーター配列が含まれる。特定の実施形態においては、トランスコバラミン受容体またはその断片をコードする配列には、配列番号２または３のいずれか１つに示される配列、あるいはそれらの断片が含まれる。
さらに関係する実施形態においては、本発明には、細胞によるコバラミンの取り込みを阻害する方法が含まれる。この方法には、細胞を、トランスコバラミン受容体の細胞外ドメインが含まれている組み換え生成されたポリペプチドの有効量と接触させる工程が含まれる。ここでは、上記組み換え生成されたポリペプチドはトランスコバラミンに結合する。１つの実施形態においては、上記トランスコバラミン受容体は、配列番号１に示される配列を有している。
関連する実施形態においては、本発明には、患者の腫瘍、神経学的疾患、免疫関連疾患、炎症、または神経学的疾患を処置あるいは予防する方法が含まれる。この方法には、上記患者に、トランスコバラミン受容体の細胞外ドメインが含まれている組み換え生成されたポリペプチドの有効量を投与する工程が含まれる。ここでは、上記組み換え生成されたポリペプチドはトランスコバラミンに結合する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子を同定する方法であって、
（ａ）単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、候補の調節因子の存在下で接触させる工程、
（ｂ）該トランスコバラミン受容体に結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、抗体が存在しない条件下で結合した量と比較する工程、
を含み、該候補の調節因子が存在しない条件下と比較した、該候補の調節因子の存在下で結合したトランスコバラミンの量の減少または増加が、該候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す、方法。
（項目２）
細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子を同定する方法であって、
（ａ）トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を、候補の調節因子の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程、
（ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を、該候補の調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程、
を含み、該候補の調節因子が存在しない条件下と比較した、該候補の調節因子の存在下で該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少または増加が、該候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す、方法。
（項目３）
前記外因性ポリヌクレオチドに、配列番号２もしくは３に示される配列、またはそれらの断片が含まれている、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記候補の調節因子が抗体である、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を同定する方法であって、
（ａ）単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体の存在下で接触させる工程、
（ｂ）該トランスコバラミン受容体に結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で結合した量と比較する工程
を含み、該抗体の存在下で結合したトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す、方法。
（項目６）
細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を同定する方法であって、
（ａ）外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を、該トランスコバラミン受容体に特異的に結合するヒト抗体の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程、
（ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程
を含み、該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す、方法。
（項目７）
細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を生産する方法であって、精製された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその免疫原性部分で、ヒト抗体ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することにより、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体を生産する工程を含み、該組み換え生成されたトランスコバラミンポリペプチドは、細胞が該組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現するように、プロモーター配列に動作可能であるように連結されているトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む該細胞から精製される、方法。
（項目８）
前記外因性ポリヌクレオチドに、配列番号２もしくは３に示される配列、またはそれらの断片が含まれている、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを実証する工程をさらに含む、項目７に記載の方法であって、
（ａ）単離された組み換え発現されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンまたはその断片と、該抗体の存在下で接触させる工程、
（ｂ）該トランスコバラミン受容体ポリペプチドに結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で結合した量と比較する工程
を含み、結合したトランスコバラミンの量の減少が、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す、方法。
（項目１０）
前記抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを実証する工程をさらに含む、項目７に記載の方法であって、
（ａ）外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現する細胞を、トランスコバラミンと、候補の調節因子の存在下で接触させる工程、
（ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
（ｃ）該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程
を含み、ここで、該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す、方法。
（項目１１）
前記トランスコバラミン受容体ポリペプチドに、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはその断片が含まれている、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
細胞によるコバラミンの取り込みを阻害する方法であって、細胞を、トランスコバラミン受容体をコードするポリヌクレオチドに対して標的化させられた８から３０ヌクレオチドの長さの二本鎖オリゴヌクレオチドの有効量と接触させる工程を含み、該オリゴヌクレオチドがトランスコバラミン受容体の発現を阻害する、方法。
（項目１３）
前記オリゴヌクレオチドに、配列番号２または３のいずれか１項に示される配列の一部が含まれている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記オリゴヌクレオチドに、配列番号６〜１８のいずれか１項に示される配列が含まれている、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
細胞の中でのトランスコバラミン受容体遺伝子の発現を阻害するための二本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含み、センス鎖には第１の配列が含まれ、アンチセンス鎖には、トランスコバラミン受容体をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対して実質的に相補的である相補性の領域を含む第２の配列が含まれており、該相補性の領域は３０ヌクレオチド未満の長さであり、該ｄｓＲＮＡは、該トランスコバラミン受容体を発現する細胞と接触すると、該トランスコバラミン受容体の発現を少なくとも２０％を阻害する、二本鎖のリボ核酸。
（項目１６）
前記センス鎖に、配列番号２または３のいずれかに示される配列の一部が含まれている、項目１５に記載のｄｓＲＮＡ。
（項目１７）
患者の腫瘍、神経疾患、免疫関連疾患、炎症、または神経疾患を処置あるいは予防する方法であって、項目１５に記載のｄｓＲＮＡを該患者に投与する工程を含む方法。
（項目１８）
細胞によるコバラミンの取り込みを促進する方法であって、細胞に、トランスコバラミン受容体またはその断片をコードする配列が含まれているポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法。
（項目１９）
前記ポリヌクレオチドに、前記トランスコバラミン受容体またはその断片をコードする配列に動作可能であるように連結されたプロモーター配列がさらに含まれている、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
細胞によるコバラミンの取り込みを阻害する方法であって、細胞を、トランスコバラミン受容体の細胞外ドメインを含む組み換え生成されたポリペプチドの有効量と接触させる工程を含み、該組み換え生成されたポリペプチドがトランスコバラミンに結合する、方法。
（項目２１）
前記トランスコバラミン受容体が配列番号１に示される配列を有している、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
患者の腫瘍、神経疾患、免疫関連疾患、炎症、または神経性疾患を処置あるいは予防する方法であって、該患者に、トランスコバラミン受容体の細胞外ドメインを含む組み換え生成されたポリペプチドの有効量を投与する工程を含み、該組み換え生成されたポリペプチドがトランスコバラミンに結合する、方法。
本発明は、トランスコバラミン受容体（ＴＣｂｌＲ）のクローニングと分子の特性決定に基づく。これには、ＴＣｂｌＲのｃＤＮＡ配列およびポリペプチド配列の解明、さらには、ＴＣｂｌＲの生物学的活性に関与している機能的ドメインと、ＴＣｂｌＲの発現を調節するＴＣｂｌＲ遺伝子の中のｃｉｓ配列の同定が含まれる。本発明はさらに、コバラミン（Ｃｂｌ）の取り込みにおけるＴＣｂｌＲの重要な役割の同定と、トランスコバラミン（ＴＣ）とＣｂｌの結合および取り込みに関与しているＴＣｂｌＲの複数の領域の同定にも基づく。加えて、本発明の複数の態様は、ＴＣｂｌＲの発現の特性決定に基づき、これは、ＴＣｂｌＲが、腫瘍細胞を含む、増殖および分裂しつつある細胞の中で過剰発現されることを示している。
ＴＣｂｌＲの配列と生物学的特性の同定および特性決定に基づいて、本発明により、Ｃｂｌの取り込みと細胞増殖を調節するための新規の組成物および方法が提供される。これには、Ｃｂｌの取り込みの不足が関係している疾患および障害、ならびに、過剰増殖または細胞増殖の脱調節が関係している疾患および障害（例えば、腫瘍）を処置する方法が含まれる。さらなる態様においては、本発明により、ＴＣｂｌＲ活性の調節因子を同定するためのスクリーニング方法と、ＴＣｂｌＲに結合して、腫瘍細胞を同定し、治療薬を腫瘍細胞に送達する分子を使用する方法が提供される。
本発明の実施には、逆のことが具体的に示されていない限りは、当業者の能力の範囲内であるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来法が使用されるであろう。これら多くは、説明の目的のために以下に記載される。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
本明細書および添付の特許請求の範囲の中で使用される場合は、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、その状況が他に明記されていない限りは、複数についての言及も含まれる。
Ａ．トランスコバラミン受容体ポリペプチドおよび核酸
本発明の組成物および方法の多くの実施形態には、ＴＣｂｌＲポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそれらの変異体断片（組み換え生成されたＴＣｂｌＲポリペプチドとポリヌクレオチドが含まれる）が含まれるか、あるいはそれらが利用される。本発明にしたがって同定されたＴＣｂｌＲポリペプチド配列は、８Ｄ６抗原、またはＣＤ３２０抗原として以前に同定されていたが、これらの抗原がＴＣｂｌＲに相当することはこれまで知られていなかった。８Ｄ６抗原は、ｇｅｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ細胞の増殖を刺激する濾胞樹状細胞分子として最初に同定された（Ｌｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１０７７−１０８３（２０００）およびＺｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４９−５６（２００１））。ヒトＴＣｂｌＲタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示され、そしてｍＲＮＡに対応するヒトＴＣｂｌＲ ｃＤＮＡの配列は配列番号２に示され、ｃＤＮＡのコード領域は配列番号３に提供される。
様々なトランスコバラミン受容体ポリペプチドとポリヌクレオチド配列を、以下の登録番号のもとでＮＣＢＩの公開配列データベースから入手することができる：ＮＭ＿０１６５７９、ヒトＣＤ３２０抗原（ＣＤ３２０）、ｍＲＮＡ、ｇｉ｜５１７０２２２５｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１６５７９．２｜［５１７０２２２５］（配列番号２）；ＣＲ４５７１７４、遺伝子８Ｄ６Ａについてのヒトの完全なオープンリーディングフレームｃＤＮＡクローンＲＺＰＤｏ８３４Ａ０９１２Ｄ、８Ｄ６抗原；完全なｃｄｓ、ｉｎｃｌ．Ｓｔｏｐｃｏｄｏｎ、ｇｉ｜４８１４６４６４｜ｅｍｂ｜ＣＲ４５７１７４．１｜［４８１４６４６４］（配列番号３）；ＢＣ０００６６８、ヒトＣＤ３２０抗原、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：８２８、ＩＭＡＧＥ：３３４７５６９）、完全なｃｄｓ、ｇｉ｜３４７８４７７７｜ｇｂ｜ＢＣ０００６６８．２｜［３４７８４７７７］（配列番号１９）；ＢＣ００７０８３、ヒトＣＤ３２０抗原、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：１４６２３、ＩＭＡＧＥ：４０７６２３７）、完全なｃｄｓ、ｇｉ｜１３９３７９４２｜ｇｂ｜ＢＣ００７０８３．１｜［１３９３７９４２］（配列番号２０）；ＮＴ＿０８６８９４、ヒト１９番染色体ゲノムのコンティグ分析、別のアセンブリ、ｇｉ｜５１４７５０３３｜ｒｅｆ｜ＮＴ＿０８６８９４．１｜Ｈｓ１９＿８６５５８［５１４７５０３３］；ＮＴ＿０７７８１２、ヒト１９番染色体ゲノムのコンティグ分析、ｇｉ｜３７５７４７２１｜ｒｅｆ｜ＮＴ＿０７７８１２．２｜Ｈｓ１９＿７７８６１［３７５７４７２１］；ＮＰ＿０５７６６３、８Ｄ６抗原［ヒト］、ｇｉ｜７７０６１１１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０５７６６３．１｜［７７０６１１１］（配列番号１）；ＣＡＧ３３４５５、８Ｄ６Ａ［ヒト］、ｇｉ｜４８１４６４６５｜ｅｍｂ｜ＣＡＧ３３４５５．１｜［４８１４６４６５］；ＡＡＨ０７０８３、８Ｄ６抗原［ヒト］、ｇｉ｜１３９３７９４３｜ｇｂ｜ＡＡＨ０７０８３．１｜［１３９３７９４３］；ＡＡＨ００６６８、８Ｄ６抗原［ヒト］、ｇｉ｜１２６５３７６５｜ｇｂ｜ＡＡＨ００６６８．１｜［１２６５３７６５］；Ｈｓ．３３３４２７、８Ｄ６Ａ：ＣＤ３２０抗原、ヒト、２９７配列（単数または複数）；ＣＤ３２０、公式表記（Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌ）：ＣＤ３２０および名称：ＣＤ３２０抗原［ヒト］他の名称：ＨＧＮＣ：１６６９２、８Ｄ６、８Ｄ６Ａ 他の表記：８Ｄ６抗原１９番染色体；位置９ｐ１３．３−ｐ１３．２遺伝子ＩＤ：５１２９３。
本発明により、ＴＣｂｌＲまたはその断片をコードする任意のポリヌクレオチド配列、ならびに非コード配列の使用が意図される。したがって、本発明の様々な実施形態においては、コード配列または非コード配列のいずれかが利用され、センス配列またはアンチセンス配列のいずれかが利用される。
１．ポリペプチド
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味において（すなわち、アミノ酸の配列として）使用される。ポリペプチドは、特異的な長さの生成物に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義に含まれ、そのような用語は、他の場所に具体的に示されてない限りは、本明細書中では互換的に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化など）、ならびに、当該分野で公知の他の修飾（自然界において起こるものと自然界においては起こらないものの両方）は意味しないか、またはそれらは含まれない。ポリペプチドは、完全なタンパク質またはその一部であり得る。本発明の状況における目的の特定のポリペプチドは、ＴＣｂｌＲの機能的ドメインが含まれているアミノ酸のサブ配列であり、これには、ＴＣおよび／またはＣｂｌに結合することができる断片、ならびに以下に記載されるような優性陰性変異体が含まれる。本明細書中で使用される場合は、ＴＣは、他の場所に示されていない限りは、ｈｏｌｏ−ＴＣおよびａｐｏ−ＴＣの両方をいう。ＴＣｂｌＲポリペプチドがＴＣに結合するかどうかを決定する方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。
本発明にはまた、ＴＣｂｌＲポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、または１００個の連続しているアミノ酸、またはそれ以上（全ての中間の長さを含む）が含まれているポリペプチド断片の使用も含まれる。
特定の実施形態においては、本発明には、図３に示されるＴＣｂｌＲポリペプチドの細胞外領域が含まれている、原則としてこれから構成されている、またはこれから構成されているポリペプチド断片が含まれる。ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインは、３１アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜３１）と１９８アミノ酸の細胞外領域（配列番号１のアミノ酸３２〜２２９）からなる。この細胞外断片は、ＨＥＫ２９３細胞の中で組み換え体タンパク質として発現されている。この断片（配列番号１の１〜２２９）には、特異的な高親和性のＴＣ−Ｃｂｌ結合活性が含まれており、ａｐｏタンパク質ではなくＣｂｌ（ｈｏｌｏ−ＴＣ）によって飽和されているＴＣに対して２８倍高い親和性を有している。この差は、インビボでｈｏｌｏ−ＴＣだけが、細胞内にＣｂｌを送達するための受容体に優先的に結合することと生理学的に関係している。したがって、特定の実施形態においては、本発明には、配列番号１のアミノ酸１〜２２９またはアミノ酸３２〜２２９が含まれている、原則としてそれから構成されている、またはそれから構成されている断片が含まれ、そして本発明の方法の特定の実施形態ではそのような断片が使用される。
したがって、ＴＣｂｌＲの組み換えによって精製されたかもしくは合成の細胞外断片、またはＴＣに結合するその機能的断片は、細胞表面ＴＣｂｌＲに対するｈｏｌｏ−ＴＣの結合をブロックすることにおいて有用である。
ＴＣｂｌＲの免疫原性部分もまた本発明に含まれる。「免疫原性部分」は、本明細書中で使用される場合は、それ自体が、ポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原受容体と免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）本発明の免疫原性ポリペプチドの断片である。免疫原性部分は、一般的には、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびその中で引用されている参考文献にまとめられている技術のような、周知の技術を使用して同定することができる。そのような技術には、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程が含まれる。本明細書中で使用される場合は、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、それらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出できるほどには反応しない）場合に「抗原特異的」である。そのような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知の技術を使用して調製することができる。
１つの好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性圧制において）全長のポリペプチドの反応性と実質的に同様であるレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長のポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてもっとも好ましくは約９０％を超える。いくつかの場合には、対応する全長のポリペプチドの免疫原性活性よりも大きな免疫原性活性のレベルを有する、例えば、約１００％もしくは１５０％より大きい、またはそれ以上の免疫原性活性を有する好ましい免疫原性部分が同定される。
別の態様においては、本発明には、ＴＣｂｌＲの変異体の使用が含まれる。例えば、本発明により、ＴＣｂｌＲ変異体（１つ以上のＴＣｂｌＲの機能を有している変異体（例えば、ＴＣに結合できる変異体）を含む）の使用が意図される。ポリペプチド「変異体」は、この用語が本明細書中で使用される場合は、通常は、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入によって、本明細書中に具体的に開示されるポリペプチドとは異なるポリペプチドである。そのような変異体は自然界に存在しているものである場合も、また例えば、本発明の上記ポリペプチド配列の１つ以上を修飾することによって合成により作成されたものである場合もある。ポリペプチド変異体は、通常、その長さに沿って、ＴＣｂｌＲポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、あるいはそれ以上の同一性（上記のように決定される）を示すであろう。
１つの好ましい実施形態においては、ＴＣｂｌＲ断片および変異体は、全長のＴＣｂｌＲポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。別の好ましい実施形態においては、ＴＣｂｌＲ断片および変異体は、全長のＴＣｂｌＲポリペプチドによって示される免疫原性活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、またはそれ以上の免疫原性活性のレベルを示す。
多くの場合には、変異体には保存的置換が含まれるであろう。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的には変化しないであろうと予想する、アミノ酸配列が類似する特性を有している別のアミノ酸で置換されるものである。
ポリペプチド配列が比較される場合には、２つの配列は、それらの２つの配列の中のアミノ酸の配列が以下に記載されるように最大の一致のためにアラインメントされた際に同じであれば「同一」であると言われる。２つの配列の間での比較は、通常、配列類似性の局所的な領域を同定し、比較するための比較ウィンドウ全体にわたって配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合は、その中の配列が、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続する位置を含む参照配列に対して比較され得る、少なくとも約２０個の連続している位置、通常は、３０から約７５、４０から約５０個の位置のセグメントをいう。
比較のための配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズムを含む様々な方法によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＴＦＡＳＴＡ）、あるいは目視試験によって行うことができる。
配列同一性および配列類似性の割合（％）を決定するために適しているアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムである。これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に、それぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５は、例えば、本明細書中に記載されるパラメーターとともに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについて配列同一性の割合（％）を決定するために使用することができる、ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に入手することができる。
本明細書中で使用される場合は、ＴＣｂｌＲには、任意の種に由来するＴＣｂｌＲポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、ならびにそれらのホモログが含まれる。
本発明のポリペプチドは、任意の様々な周知の合成および／または組み換え技術を使用して調製される。一般的には、約１５０アミノ酸未満のポリペプチド、一部、および他の変異体は、合成手段によって、当業者に周知の技術を使用して作成することができる。１つの代表的な例においては、そのようなポリペプチドは、市販されている固相技術（例えば、成長しつつあるアミノ酸鎖に対してアミノ酸が連続して付加されるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）のうちの任意のものを使用して合成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための機器は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販されており、製造業者の説明書にしたがって操作することができる。
本発明のＴＣｂｌＲポリペプチドはまた、組み換え生成されたポリペプチドでもあり得る。そのようなポリペプチドを組み換えによって発現させ、単離または精製する方法は当該分野で公知である。例えば、これらは、細胞の中に一時的に、または安定に存在することができる外因性のＴｃｂｌＲポリヌクレオチド配列が含まれている細胞の中で発現させることができる。そのような外因性のポリヌクレオチド配列は、通常、プロモーターに動作可能であるように連結させられ、例えば、これらは発現構築物（例えば、上記に記載されるもの）の中に存在する場合も、あるいは細胞のゲノムの中に存在する場合もある。本明細書中で使用される場合は、「外因性」ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、外因性のポリヌクレオチド配列が含まれている組換え体発現ベクター、またはそのような発現ベクターから発現された外因性ポリペプチドとして、細胞の中に導入されている配列である。用語「外因性」は、外因性配列を含む細胞が、その外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じ配列を有する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をも含むかまたは産生する可能性を排除しない。
一般的には、本発明のポリペプペプチドは単離される。「単離された」ポリペプチドは、そのもともとの環境から取り出されたポリペプチドである。例えば、自然界に存在しているタンパク質またはポリペプチドは、それが、自然界のシステムにおいて一緒に存在している物質のいくつかまたは全てから分離されている場合に、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも約９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
２．ポリヌクレオチド
本発明によってはまた、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチド組成物も提供される。ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドには、ＴＣｂｌＲをコードする全てのポリヌクレオチド、ならびにそれらの断片、変異体、および相補物が含まれる。ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドには、ＴＣｂｌＲをコードする遺伝子、ならびにそれらのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列が含まれる。ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドにはさらに、センスまたはアンチセンスＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列に対応する、一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドが含まれる。通常、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドは単離される。「単離された」は、本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチドが他のコード配列と実質的に離れていること、およびポリヌクレオチドに、無関係な配列（例えば、大きな染色体断片または他の機能性の遺伝子もしくはポリペプチドコード領域）が大きな割合では含まれないことを意味する。もちろん、これは、最初に単離されたポリヌクレオチドを意味し、人の手によってＴＣｂｌＲポリヌクレオチドに対して後に加えられた配列を排除しない。
本発明のポリヌクレオチド組成物には、ゲノム配列、ゲノム外のプラスミドによってコードされる配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、および小さな操作された遺伝子セグメントが含まれる。そのようなセグメントは、自然界から単離されたものである場合も、また、人の手によって合成によって修飾されたものである場合もある。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）である場合も、二本鎖である場合も、また、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成のもの）である場合も、ＲＮＡ分子である場合もある。特定の実施形態においては、これらは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子であり、他の実施形態においては、これらは一本鎖ＲＮＡまたはアンチセンス分子である。ＲＮＡ分子には、ＨｎＲＮＡ分子（これには、イントロンが含まれ、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する）とｍＲＮＡ分子（これにはイントロンは含まれない）が含まれ得る。さらに別のコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチドの中に存在する場合があるが、これらは必ずしも必要ではなく、そして１つのポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に対して連結させることができるが、これも必ずしも必要ではない。
ポリヌクレオチドには、天然の配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質またはその一部をコードする内因性の配列）が含まれる場合があり、また、変異体、断片、または誘導体（好ましくは、そのような配列の免疫原性の変異体、断片、または誘導体）をコードする配列が含まれる場合もある。
全長のＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡおよびそのコード領域に対応するヒトＴＣｂｌＲのｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号２および３に提供される。したがって、本発明の別の態様にしたがうと、配列番号２もしくは配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列の一部または全体、配列番号２もしくは配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列の相補鎖、対応するＲＮＡ配列、および配列番号２もしくは配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列の縮重変異体が含まれている、ポリヌクレオチド組成物が提供される。配列番号２および３に提供される配列はＤＮＡ配列である。しかし、本発明の特定の実施形態では対応するＲＮＡ配列が利用され、これを標的とすることが理解される。したがって、本発明の方法および組成物には、本明細書中に示される任意の配列（配列番号２および３に示される配列を含む）に対応するＲＮＡ配列が含まれ得る。特定の実施形態においては、そのようなＲＮＡ配列は、チミジンがウリジンに置き換わっていることを除き、ＤＮＡ配列と同じである。
他の関連する実施形態においては、本発明により、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号２または配列番号３に示される配列）に対して実質的な同一性を有している、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載されるような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列と比較した、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはさらに高い配列同一性を有している配列を含むポリヌクレオチド変異体が提供される。
ＴＣｂｌＲ遺伝子のプロモーター配列は、図１０および配列番号４に提供される。様々な実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドには、図１０または配列番号４に示される配列を有しているポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片、またはその相補物が含まれる。
通常、ポリヌクレオチド変異体には、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入が含まれるであろう。好ましくは、その結果、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性は、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較すると実質的に小さくはならない。用語「変異体」はまた、異種起源の相同遺伝子を含むように理解されるべきである。
さらなる実施形態においては、本発明により、本明細書中に開示される配列の１つ以上と同一であるかまたは相補的である配列の様々な長さの連続するストレッチを含むポリヌクレオチド断片が提供される。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、もしくは１０００個、またはそれ以上の連続しているヌクレオチド、ならびにそれらの間のあらゆる中間の長さを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。「中間の長さ」は、この状況においては、１６、１７、１８、１９など、２１、２２、２３など、３０、３１、３２など、５０、５１、５２、５３など、１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３などのような引用される値の間の任意の長さを意味し、これには、２００〜５００、５００〜１０００などの全ての整数が含まれることが、容易に理解されるであろう。
本発明の別の実施形態においては、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列もしくはその断片、またはその相補配列に対して、中程度から高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野で周知である。説明の目的のために、本発明のポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための適切な中程度のストリンジェントの条件には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中でのプレ洗浄、５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション、その後の、０．１％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣのそれぞれで、２０分間の６５℃での２回の洗浄が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを、例えば、ハイブリダイゼーションが行われるハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／または温度を変更することによって容易に操作できることを理解するであろう。例えば、別の実施形態においては、適切な高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーションの温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除き、上記の条件が含まれる。
特定の好ましい実施形態においては、上記に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド変異体、断片、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態においては、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有するポリペプチドをコードする。
本発明のポリヌクレオチドまたはその断片は、それ自体のコード配列の長さとは無関係に、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらに別の制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と結合させることができ、結果として、それらの全体の長さは相当に変化し得る。したがって、ほぼあらゆる長さの核酸断片を使用することができ、意図される組み換えＤＮＡ組み換えプロトコールにおける調製および使用の容易さによって、全体の長さが制限されることが好ましいことが意図される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含む）の全長を有している代表的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
ポリヌクレオチド配列が比較される場合には、２つの配列は、それらの２つの配列の中のヌクレオチドの配列が以下に記載されるように最大の一致のためにアラインメントされた際に同じであれば「同一」であると言われる。２つの配列の間での比較は、通常、配列類似性の局所的な領域を同定し、比較するための比較ウィンドウ全体にわたって配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合は、その中の配列が、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続する位置を含む参照配列に対して比較され得る、少なくとも約２０個の連続する位置、通常は、３０から約７５、４０から約５０個の位置のセグメントをいう。
比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメーターを使用して、バイオインフォマティックスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｕｉｔｅにおいて、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。このプログラムには、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームが含まれる。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ 第５巻，Ｓｕｐｐｌ．３，３４５−３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ６２６−６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，ＷＪ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２）の局所同一性アルゴリズムを含む様々な方法によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）；５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＴＦＡＳＴＡ）、あるいは目視試験によって行うことができる。
好ましくは、「配列同一性の割合（％）」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウ全体にわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定される。ここでは、比較ウィンドウの中のポリヌクレオチド配列の一部には、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これには、付加または欠失は含まれない）と比較して、２０％またはそれ未満、通常は、５から１５％、または１０から１２％の付加あるいは欠失（すなわち、ギャップ）が含まれ得る。割合（％）は、同一である核酸塩基が両方の配列の中に生じる位置の数を決定して、適合する位置の数を得ること、適合する位置の数を参照配列の中の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で割り算すること、そして結果に１００を掛けて配列同一性の割合（％）を得ることによって計算される。
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者に明らかであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の自然界に存在している遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差が原因で異なるポリヌクレオチドが、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列が含まれている遺伝子の対立遺伝子が本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子は、１つ以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換）の結果として変化した内因性の遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は異なる構造または機能を有する場合があるが、これは必ずしも必要ではない。対立遺伝子は標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列の比較）を使用して同定することができる。
本発明の他の実施形態においては、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして有利に使用することができる。このように、本明細書中に開示されるものと同じ配列、または本明細書中に開示される１５ヌクレオチドの長さの連続する配列に対して相補的である、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さの連続する配列の配列領域が含まれている核酸セグメントについて、特定の有用性が見出されるであろうことが意図される。さらに長い連続する同一配列または相補配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（あらゆる中間の長さを含む）、およびさらには全長配列までのもの）もまた、特定の実施形態において使用されるであろう。
そのような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力により、これらを、所定の試料中の相補配列の存在を検出することにおいて使用することが可能になるであろう。しかし、他の用途、例えば、変異体種のプライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝子構築物の調製において使用されるプライマーとしての使用もまた想定される。
小さいポリヌクレオチドセグメントまたは断片は、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して一般的に行われているように、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することによって、容易に調製することができる。また、断片は、米国特許第４，６８３，２０２号（引用により本明細書中に組み入れられる）のＰＣＲ（登録商標）技術のような核酸複製技術の適用によって、組み換え生産のための組み換えベクターへの選択された配列の導入によって、および分子生物学の分野の当業者に一般的に公知である他の組み換えＤＮＡ技術によって得ることができる。
３．発現構築物
以下に記載されるように、特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの活性または発現は、ＴＣｂｌＲ、その機能的断片または変異体、あるいはＴＣｂｌＲの調節因子（例えば、アゴニストまたは阻害因子）を発現する、組み換えによって操作された構築物の使用を通じて変化させられる。特定の実施形態においては、発現構築物は細胞の中に一次的に存在し、一方、他の実施形態においては、これらは細胞のゲノムに安定に組み込まれる。さらに、遺伝子コードの固有の縮重の理由から、実質的に同じであるかもしくは機能的に等価なアミノ酸配列またはその変異体をコードする他のＤＮＡを生産することができ、これらの配列を任意のポリペプチドを発現させるために使用できることが理解される。
目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、ＴＣｂｌＲ、またはその断片、突然変異体、もしくは変異体）をコードする配列と、適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するために使用することができる多くの方法が、当業者に周知である。これらの方法には、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組み換えが含まれる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｉｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。１つの実施形態においては、本発明の発現構築物には、ＴＣｂｌＲポリペプチドの全てまたはその１つの領域をコードするか、あるいは、ＴＣｂｌＲ ｃＤＮＡ配列の全てまたはその１つの領域を含むポリヌクレオチド配列が含まれる。
発現ベクターの中に存在する調節配列には、ベクターの非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）が含まれ、これらは転写および翻訳を行うために宿主の細胞性タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは、それらの長さおよび特異性が異なり得る。利用されるベクターシステムと細胞に応じて、任意の数の適切な転写および翻訳エレメント（構成性プロモーターと誘導性プロモーターを含む）を使用することができる。
哺乳動物細胞においては、哺乳動物遺伝子に由来するか、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが一般的には好ましく、多数のウイルスをベースとする発現システムが一般的には利用される。加えて、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を、哺乳動物宿主細胞の中での発現を増大させるために使用することができる。特異的な開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のさらに効率的な翻訳を行わせるために使用することができる。そのようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。外因性の翻訳エレメントと開始コドンは様々な起源のものであり得、天然のもの、および合成のもののいずれでもあり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞に適しているエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されているもの）を含めることによって高めることができる。
特定の実施形態においては、本発明により、ＴＣｂｌＲ、またはその断片もしくは変異体、あるいは、ＴＣｂｌＲ活性の阻害因子の条件的発現が提供される。様々な条件的発現システムが公知であり、細胞および動物の両方での使用のために当該分野で利用されている。本発明によっては、ＴＣｂｌＲの発現または活性を調節するための任意のそのような条件的発現システムの使用が意図される。本発明の特定の実施形態においては、原核生物のリプレッサーまたは活性化因子タンパク質の使用は、対応する原核生物の配列（真核生物細胞の中では通常見られない）に対するそれらの特異性の故に有利である。このタイプの誘導性のシステムの一例は、テトラサイクリンによって調節される誘導性プロモーターシステムであり、その様々な有用なバージョンが記載されている（概要については、例えば、Ｓｈｏｃｋｅｔｔ ａｎｄ Ｓｃｈａｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５１７３−７６（１９９６）を参照のこと）。本発明の１つの実施形態においては、例えば、分子の発現は、ＲＥＶ−ＴＥＴシステムの制御下におくことができる。このシステムの成分と、遺伝子の発現を制御するためにこのシステムを使用する方法は文献の中に十分にまとめられており、テトラサイクリンによって制御されるトランス活性化因子（ｔＴＡ）または逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現するベクターが市販されている（例えば、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、およびｐｔＴＡ−２／３／４ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。そのようなシステムは、例えば、米国特許第５６５０２９８号、同第６２７１３４８号、同第５９２２９２７号、および関連する特許に記載されており、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲ調節因子またはＴＣｂｌＲポリペプチド、あるいはそれらの断片もしくは変異体が、ウイルスまたはバクテリオファージベクターを使用して細胞に対して提供される。多種多様なウイルス発現システムが公知であり、当該分野で利用されている。これらは全て、本発明にしたがって使用することができる。したがって、特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲのポリヌクレオチド阻害因子、またはＴＣｂｌＲの阻害因子もしくはＴＣｂｌＲをコードするポリヌクレオチド、あるいはそれらの断片または変異体が、適切な哺乳動物宿主細胞または患者に、多数の公知のウイルスをベースとするシステムのうちのいずれかを使用して導入される。１つの代表的な実施形態においては、レトロウイルスにより、遺伝子送達システムについての便利であり効果的な基本骨格（ｐｌａｔｆｏｒｍ）が提供される。選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を使用してベクターに挿入し、そしてレトロウイルス粒子の中にパッケージすることができる。その後、組み換え体ウイルスを単離し、被験体に送達することができる。多数の代表的なレトロウイルスシステムが記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。加えて、多数の代表的なアデノウイルスをベースとするシステムもまた記載されている。宿主ゲノムに組み込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存在し、それにより、挿入突然変異に付随するリスクが最小となる（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６）。
遺伝子導入により本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するために有用なさらに別のウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよびニワトリポックスウイルス）に由来するウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明の方法ではレンチウイルスが利用される。他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、それらの遺伝的情報をコードするＲＮＡのコアを有している、エンベロープをもつウイルスである。レンチウイルスは、レンチウイルスが分裂していない細胞の染色体に組み込むことができる唯一のレトロウイルスである点で特有である。アンギオスタチンとエンドスタチンを発現する組み換え体自己不活化レンチウイルスベクターは、血管新生阻害活性を有していることがこれまでに示されており（Ｓｈｉｃｈｉｎｏｈｅ Ｔ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１年１１月；８（１１）：８７９−８９）、同様の方法が、ＴＣｂｌＲ阻害因子、またはＴＣｂｌＲポリヌクレオチド、ポリペプチド、あるいは、それらの機能的断片もしくは変異体を送達するために、本発明にしたがって使用される。
これらおよび他の公知のウイルスをベースとする送達システムについてのさらに別の例示的な情報は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４，１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１．２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１４９８−１１５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８，１９９３；およびＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７，１９９３に見ることができる。
Ｂ．トランスコバラミン受容体調節因子
特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの活性を調節することに関係する本発明の方法は、ＴＣｂｌＲの発現または活性を阻害するかあるいは促進する調節因子を使用して実施される。例えば、特定の実施形態においては、そのような調節因子は、ＴＣに結合するか、またはＴＣの細胞による取り込みを媒介するＴＣｂｌＲの能力を特異的に増大させる、低下させる、あるいは阻害する。他の実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲの発現を増大させるかまたは低下させる。特定の実施形態においては、調節因子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド核酸、抗体およびその断片、ウイルス、低分子、無機化合物および有機化合物である。調節因子には、ＴＣｂｌＲのアゴニストとアンタゴニストが含まれる。
ＴＣｂｌＲ活性を増大させる調節因子としては、ＴＣｂｌＲポリペプチドおよびポリヌクレオチドが挙げられ、これには、上記に記載されたもの、ならびに、ＴＣｂｌＲの発現または活性を促進する他の分子が含まれる。ＴＣｂｌＲ活性を低下させる調節因子には、ＴＣｂｌＲの発現または活性を低下させる任意の分子が含まれる。特定の実施形態においては、阻害因子は、例えば、ＴＣに対するＴＣｂｌＲの結合を阻害すること、またはＣｂｌの取り込みおよび／もしくは細胞の増殖を導く下流のシグナル伝達事象を阻害することを含む様々な手段のうちのいずれかにより、ＴＣｂｌＲ活性を妨害する。
１．ペプチドおよびポリペプチド
特定の実施形態においては、本発明の方法は、ＴＣｂｌＲのペプチドまたはポリペプチド調節因子を使用して実施される。
１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲの発現は、全長のＴＣｂｌＲ、またはその機能的変異体もしくは断片を発現する発現構築物を使用して増大させられる。
別の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの活性は、ＴＣｂｌＲの優性陰性阻害因子の過剰発現によって変化させられる。ＴＣｂｌＲの優性陰性阻害因子は、通常は、ＴＣｂｌＲの変異体形態であり、これは、例えば、ＴＣに対する結合について競合するが、ＴＣｂｌＲのシグナル伝達または取り込み経路を完全に活性化させることができないことにより、野生型ＴＣｂｌＲの活性を低下させるかまたはブロックする。通常、ＴＣｂｌＲの優性陰性阻害因子は、野生型ＴＣｂｌＲと比較すると細胞増殖を促進する能力は低い。様々なＴＣｂｌＲ優性陰性阻害因子の例としては、ＴＣに結合する能力が低い変異体ＴＣｂｌＲ、およびＴＣに結合するがＴＣおよび／またはＣｂｌをインターナライズすることができない変異体ＴＣｂｌＲが挙げられる。例えば、１つの優性陰性は、細胞内ドメインの中に１つ以上のアミノ酸置換を有しているＴＣｂｌＲであり、その結果、変異体ＴＣｂｌＲはＴＣに結合するが、ＴＣおよび／またはＣｂｌの取り込みの減少を示す。
ポリペプチド阻害因子にはまた、野生型ＴＣｂｌＲと比較して低い生物学的活性を有しているＴＣｂｌＲの他の変異体および断片も含まれる。変異体ＴＣｂｌＲ阻害因子の一例は、ＴＣに結合する領域が、ＴＣ結合能力が低下するように変異させられているＴＣｂｌＲである。阻害因子の一例は、ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインを含み、そしてＴＣに結合できるが、ＴＣおよび／またはＣｂｌの取り込みを促進することはない、ＴＣｂｌＲの可溶性断片である。したがって、１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲの阻害因子には、図１３に示されるＴＣｂｌＲの細胞外断片、またはその機能的断片が含まれる。特異的な実施形態においては、これには、配列番号１のアミノ酸１〜２２９またはアミノ酸３２〜２２９が含まれる、これらから構成される、または原則としてこれらから構成される。１つの特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子には、ＴＣｂｌＲタンパク質の最初の２２９個または２４７個のアミノ酸が含まれるか、あるいはこれらから構成される。関連する実施形態においては、これには、ＴＣｂｌＲのアミノ酸３２〜２２９または３２〜２４７が含まれるか、あるいはこれらから構成される。特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインの断片が含まれているか、またはＴＣｂｌＲの細胞外ドメインの断片からなるポリペプチド調節因子には、シグナルペプチド（アミノ酸１〜３１）は含まれないが、特定の実施形態においては、シグナルペプチドが、例えば、タンパク質を培地への分泌のために血漿膜へと向けさせるために、含まれる。
ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインは、３１アミノ酸のシグナルペプチド（アミノ酸１〜３１）と１９８アミノ酸の細胞外領域（アミノ酸３２〜２２９）からなる。この細胞外領域には、特異的な高親和性ＴＣ−Ｃｂｌ結合活性が含まれ、そしてａｐｏタンパク質ではないＣｂｌ（ｈｏｌｏ−ＴＣ）で飽和しているＴＣに対して２８倍高い親和性を有する。この差は、インビボでｈｏｌｏ−ＴＣだけが、細胞内にＣｂｌを送達するための受容体に優先的に結合することと生理学的に関係している。したがって、可溶性の細胞外ドメイン（例えば、シグナルペプチドを有しているもの、またはシグナルペプチドを含まないもの）を、細胞表面に結合したＴＣｂｌＲに対するｈｏｌｏ−ＴＣの結合をブロックし、Ｃｂｌの細胞による取り込みをブロックするために使用することができる。受容体のこの特性により、ガン治療の１つのストラテジーとして、Ｃｂｌの細胞による取り込みをブロックするさらに別の方法が提供される。これは、患者の血液中の循環しているＴＣを、組み換え体受容体断片で飽和させることによって行うことができる。これは、ｈｏｌｏＴＣの細胞表面上の受容体への結合を妨げ、Ｃｂｌの細胞による取り込みをブロックする。
加えて、本明細書中に提供される実施例に記載されるＴＣｂｌＲの他のドメインもまた、本発明の方法にしたがって使用することができる。
２．ポリヌクレオチド
様々なポリペプチドについて、ＴＣｂｌＲの発現および／または活性の調節因子としての使用が想定される。１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするポリヌクレオチドが、ＴＣｂｌＲの発現を増大させるために使用される。これらのポリヌクレオチドには、細胞のゲノムへの組み込みのために設計された、遺伝子治療に適している発現ベクター、および置換または挿入ベクターが含まれる。特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲのポリヌクレオチド阻害因子は、当該分野で公知であり利用できる方法にしたがってＴＣｂｌＲを特異的に標的化するように設計された、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、またはＲＮＡ干渉試薬である。他のポリヌクレオチド阻害因子としては、例えば、ゲノムへの組み込みのために設計された、ＴＣｂｌＲ対立遺伝子の全てまたは一部を欠失させるか、あるいはＴＣｂｌＲ対立遺伝子を（例えば、挿入突然変異によって）変異させるために適している標的化ベクターが挙げられる。
ａ．アンチセンス
１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲ阻害因子は、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドまたはＴＣｂｌＲシグナル伝達カスケードの他の成分に特異的なアンチセンスＲＮＡである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効な標的化された阻害因子であることが明らかにされており、結果として、標的化された遺伝子によるタンパク質の合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害することについてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は十分に確立されている。例えば、ポリガラタウロナーゼおよびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦを用いて明らかにされている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年６月１０日；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１９９８年６月１５日；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号、および米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、様々な異常な細胞増殖（例えば、ガン）を阻害し、これを処置するために使用することができるアンチセンス構築物もまた記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号、および米国特許第５，７８３，６８３号）。
したがって、特定の実施形態においては、本発明は、ＴＣｂｌＲ標的ポリヌクレオチド配列またはその相補物に特異的に結合することができる任意の配列の全体または一部を含むオリゴヌクレオチド配列を提供する方法に関する。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチド配列には、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列またはその相補物に特異的に結合することができる任意の配列の全てまたは一部が含まれる。１つの実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡまたはその誘導体が含まれる。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドには、ＲＮＡまたはその誘導体が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾された骨格を含む修飾されたＤＮＡであり得る。また、オリゴヌクレオチド配列には、ペプチド核酸またはその誘導体が含まれ得る。それぞれの場合において、好ましい組成物には、ＴＣｂｌＲ標的遺伝子またはポリヌクレオチド配列の１つ以上の部分に相補的である、そしてさらに好ましくは完全に相補的である配列領域が含まれる。特定の実施形態においては、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドには、配列番号２もしくは３に示される配列の断片、またはその相補物が含まれる。別の実施形態においては、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドには、図１０に示される配列の断片、またはその相補物が含まれる。
アンチセンス分子を生産する方法は当該分野で公知であり、ＴＣｂｌＲを標的化するアンチセンス分子を生産するように容易に適応させることができる。所定の配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析と、二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンス組成物は、それらが、二量体、ヘアピン、または宿主細胞の中の標的ｍＲＮＡに対する特異的な結合を減少させるかまたは妨げるであろう他の二次構造を形成することが比較的できないことに基づいて選択することができる。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその近くの領域、およびｍＲＮＡの５’領域に対して実質的に相補的であるそのような配列が含まれる。これらの二次構造の分析と標的部位の選択の検討は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４、および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して行うことができる。
ｂ．リボザイム
本発明の方法の別の実施形態にしたがうと、リボザイム分子は、ＴＣｂｌＲ標的遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現を阻害するために使用される。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有している特異的触媒ドメインを含むＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８７年１２月；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ，１９８７年４月２４日；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムは、高い特異性で、ホスホエステル転移反応を加速させ、多くの場合には、オリゴヌクレオチド基質の中のいくつかのホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ，１９８１年１２月；２７（３Ｐｔ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０年１２月５日；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年５月１４日；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応の前に、基質がリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に対して特異的塩基対合相互作用を介して結合することの必要性に寄与している。
自然界に存在している酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な変種が現在知られている。それぞれが、生理学的条件下で、トランスのＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般的には、酵素的核酸は、標的ＲＮＡに最初に結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素部分に対して非常に近位に維持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸は、最初に標的ＲＮＡを認識し、その後、相補性塩基対合によって標的ＲＮＡに結合し、一旦正確な部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断により、コードされるタンパク質の合成を指示するその能力が破壊されるであろう。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合し、これを切断した後、酵素的核酸は、別の標的を検索するためにそのＲＮＡから解離させられ、繰り返し新しい標的に結合して、これらを切断することができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と結合した）、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフの形態であり得る。ハンマーヘッド型モチーフの特異的な例は、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２年９月１１日；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピン型モチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６０２５７）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９年６月１３日；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０年１月２５日；１８（２）：２９９−３０４、および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの一例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年１２月１日；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されている。ＲＮａｓｅＰモチーフの一例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａら、Ｃｅｌｌ，１９８３年１２月；３５（３Ｐｔ２）：８４９−５７によって記載されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ，１９９０年５月１８日；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１年１０月１日；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３年３月２３日；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており、そしてグループＩイントロンの一例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明にしたがって使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、これらが標的遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つ以上に対して相補的な、特異的な基質結合部位を有していること、およびこれらが、分子に対してＲＮＡ切断活性を付与するその基質結合部位の中の、またはそれらの周囲のヌクレオチド配列を有していることである。したがって、リボザイム構築物は必ずしも、本明細書中に記載される特異的モチーフに限定されない。
ＴＣｂｌＲに対して標的化されたリボザイムを生産する方法は当該分野で公知である。リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／２３５６９、および国際特許公開番号ＷＯ９４／０２５９５（それぞれ、引用により本明細書中に具体的に組み入れられる）に記載されているように設計することができ、本明細書中に記載されるように、インビトロおよびインビボで試験されるように合成される。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させること、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防ぐ修飾を有しているリボザイムを化学合成すること（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／０７０６５；国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１３６８８を参照のこと、これらには、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に対して行うことができる様々な化学的修飾が記載されている）、細胞の中でのそれらの効力を高める修飾、ならびに、ＲＮＡ合成時間を短くし、化学的必要性を低下させるステムＩＩ塩基の除去によって、最適化させることができる
ｃ．ＲＮＡｉ分子
ＲＮＡｉ分子を使用するＲＮＡ干渉方法もまた、目的の遺伝子またはポリヌクレオチド（ＴＣｂｌＲ遺伝子、またはＴＣｂｌＲシグナル伝達カスケードに関係している別の遺伝子を含む）の発現を破壊させるために使用することができる。最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両方が含まれているＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを媒介できることが、現在明らかになっている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１１１−１１９）。したがって、本発明には、これらの様々なタイプの二本鎖分子のうちのいずれかが含まれているＲＮＡｉ試薬の使用が含まれる。加えて、ＲＮＡｉ試薬を、様々な形態で使用して細胞に導入することができることが理解される。したがって、本明細書中で使用される場合は、ＲＮＡｉ試薬には、細胞の中でＲＮＡｉ応答を誘導することができる任意の、および全ての試薬が含まれる。これには、２つの異なる鎖（すなわち、センス鎖とアンチセンス鎖）が含まれている二本鎖のポリヌクレオチド、相補的配列のヘアピンループが含まれているポリヌクレオチド（これは、二本鎖領域（例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子）を形成する）、および単独で、もしくは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖のポリヌクレオチドを形成することができる１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
１つの特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドを標的とし、その分解を誘導するｄｓＲＮＡ分子が細胞に導入される。実際の機構は本発明には必須ではないが、標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡの会合は、ｄｓＲＮＡと実際のおよび／または予想されるｍＲＮＡ転写物との間での相同性によって定義されると考えられている。この会合は、標的遺伝子を破壊するｄｓＲＮＡの能力に影響を与えるであろうと考えられている。ＤｓＲＮＡ方法および試薬は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／６８８３６、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０２／４４３２１、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／９６５８４、およびＷＯ０１／７５１６４（それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
本発明の１つの実施形態においては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＴＣｂｌＲの標的発現を特異的に阻害するために使用することができる。遺伝子および核酸の発現の二本鎖ＲＮＡによって媒介される抑制は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを細胞または生物に導入することによって、本発明にしたがって行うことができる。３０ヌクレオチド未満の長さのｄｓＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡ分子について上記に記載されたような非特異的遺伝子抑制を誘導することは明らかではない。実際には、ｓｉＲＮＡの細胞への直接の導入によって、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉが誘発され得た（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１））。さらに、哺乳動物細胞の中での抑制はＲＮＡレベルで起こり、標的化された遺伝子について特異的であり、ＲＮＡとタンパク質の抑制との間には強い相関関係がある（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４６−９７４７（２００１））。加えて、広範な種々の細胞株（ＨｅＬａ Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−ＫＩ、およびＭＣＦ−７細胞を含む）が、ある程度のｓｉＲＮＡサイレンシングに対して感受性であることが示されている（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．ら、ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ ９（１）：１−７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ（９／１／０２）で入手することができる）。
ＴＣｂｌＲを標的化するＲＮＡｉ試薬は、当該分野で公知の手順にしたがって容易に調製することができる。有用なｓｉＲＮＡ分子の構造的特性は同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８およびＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）、ＥＭＢＯ ２０：６８７７−６８８８。したがって、当業者は、多種多様な様々なｓｉＲＮＡ分子を特異的遺伝子または転写物を標的化するために使用することができることを理解するであろう。様々な実施形態においては、ＲＮＡｉ配列は、５０ヌクレオチド未満またはそれに等しい長さ、４０ヌクレオチド未満またはそれに等しい長さ、３０ヌクレオチド未満またはそれに等しい長さ、あるいは２０ヌクレオチド未満またはそれに等しい長さである。特定の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、１６〜３０、または１８〜２５ヌクレオチドの長さであり、これにはそれらの間のあらゆる整数が含まれる。１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡは２１ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、０〜７ヌクレオチドの３’突出または０〜４ヌクレオチドの５’突出を有する。１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は２ヌクレオチドの５’突出を有する。１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチドの長さであり、２ヌクレオチドの３’突出を有している（すなわち、これらには、センス鎖とアンチセンス鎖の間に１９ヌクレオチドの相補性領域が含まれる）。特定の実施形態においては、突出はＵＵまたはｄＴｄＴの３’突出である。一般的には、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ分子の一方の鎖に対して完全に相補的である。なぜなら、わずかに１つの塩基対の不適合でもなお、サイレンシングが減少してしまうことが示されているからである。したがって、特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２もしくは３に示される配列、または図１０に示される配列の１つの領域に対して相補的である。
特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、修飾された骨格組成、例えば、２’−デオキシ修飾または２’−Ｏ−メチル修飾を有する場合がある。しかし、特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡの鎖の全体が、２’デオキシ修飾された塩基または２’−Ｏ−修飾された塩基のいずれかによって作成されることはない。
特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合は、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結させられたヌクレオシド単位によって形成されるポリヌクレオチドをいう。そのようなオリゴヌクレオチドは、既存の核酸の供給源（ゲノムまたはｃＤＮＡを含む）から得ることができるが、合成方法によって生産されることが好ましい。好ましい実施形態においては、個々のヌクレオシド単位には、１つの複素環塩基と、１つのペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノース、またはヘキソース糖基が含まれる。ヌクレオシド残基は、多数の公知のヌクレオシド間結合のうちのいずれかによって、互いに結合させることができる。そのようなヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボロノ、チオエーテル、架橋されたホスホルアミデート、架橋されたメチレンホスホネート、架橋されたホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が挙げられるが、これらに限定されない。用語「オリゴヌクレオチド」にはまた、１つ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有しているポリヌクレオシドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドには、自然界に存在しているヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド、またはそれらの混合物が、これらがＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列の一部またはその相補物からなる、原則としてそれらからなる、またはそれらが含まれる限りは、含まれ得る。本明細書中で使用される場合は、用語「修飾されたヌクレオシド」は、修飾された複素環塩基、修飾された糖部分、またはそれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、本明細書中に記載される場合は、自然界には存在しないピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、２’−置換されたリボヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、または２’−デオキシ−２−置換アラビノシドである。
本明細書中で使用される場合は、用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」には、ペントース部分の２’位のヒドロキシル基が２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドを生じるように置換された、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドが含まれる。好ましくは、そのような置換は、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または６〜１０個の炭素原子を有しているアリール基を用いて行われ、ここでは、そのようなアルキルまたはアリール基は未置換である場合も、また、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基で置換されている場合もある。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例としては、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシド、および２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」にはまた、２’−ヒドロキシル基が１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む低級アルキル基で、またはアミノもしくはハロ基で置き換えられている、リボヌクレオシドあるいはアラビノヌクレオシドも含まれる。そのような２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例としては、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドが挙げられるが、これらに限定されない。用語「オリゴヌクレオチド」には、ハイブリッドオリゴヌクレオチドおよびキメラオリゴヌクレオチドが含まれる。
「キメラオリゴヌクレオチド」は、１つ以上のタイプのヌクレオシド間結合を有しているオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの１つの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはホスホロジチオエート領域と、非イオン結合（例えば、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合）を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，６３５，３７７号および同第５，３６６，８７８号を参照のこと）。
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１つ以上のタイプのヌクレオシドを有しているオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの１つの好ましい例には、リボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド領域と、デオキシリボヌクレオチド領域が含まれる（例えば、Ｍｅｔｅｌｅｖ ａｎｄ Ａｇｒａｗａｌ、米国特許第５，６５２，３５５号、同第６，３４６，６１４号、および同第６，１４３，８８１号を参照のこと）。
本明細書中で議論されるｓｉＲＮＡ試薬には、それ以外には修飾されていないＲＮＡ、さらには、（例えば、効力を改善するために）修飾されているＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーが含まれる。未修飾のＲＮＡは、核酸の構成成分（すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分）が自然界に存在しているものと（好ましくは、自然界においてヒトの体内に存在しているものと）同じであるかまたは本質的に同じである分子をいう。当該分野では、珍しいか、または一般的ではないが、自然界に存在しているＲＮＡが、修飾されたＲＮＡと呼ばれている（例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３−２１９６を参照のこと）。そのような珍しいか、または一般的ではないＲＮＡは、多くの場合に修飾されたＲＮＡと呼ばれ（明らかに、これらが通常は、転写後修飾の結果存在することが理由で）、これらは、本明細書中で使用される場合には、用語「未修飾のＲＮＡ」に含まれる。
修飾されたＲＮＡは、本明細書中で使用される場合は、核酸の構成成分（すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分）の１つ以上が、自然界に存在しているものとは異なる（好ましくは、ヒトの体内に存在しているものとは異なる）分子をいう。これらは修飾された「ＲＮＡ」と呼ばれるが、これらにはもちろん、修飾の理由から、ＲＮＡではない分子が含まれる。ヌクレオシド代用物は、リボホスフェート骨格が、正確な空間的関係で塩基が存在することを可能にし、結果としてハイブリダイゼーションが、リボホスフェート骨格を用いた場合に見られるものと実質的に類似する、リボホスフェート以外の構築物（例えば、リボホスフェート骨格の電荷を有していない模倣物）で置き換えられている分子である。
高いヌクレアーゼ耐性と標的ｍＲＮＡに対する結合親和性のために、オリゴヌクレオチド試薬には、例えば、２’−修飾リボース単位および／またはホスホロチオエート結合を含めることができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾するかまたは置き換えることができる。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；「ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＬＮＡ）（ここでは、２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合させられている）；Ｏ−ＡＭＩＮＥおよびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）だけが含まれているオリゴヌクレオチドが、強い（ｒｏｂｕｓｔ）ホスホロチオエート修飾で修飾されたオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことに注目される。
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分に特に関係している）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびに、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは、状況に応じて、例えば、アミノ酸官能基で置換することができる）が含まれる。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。ヌクレアーゼ耐性を最大にするためには、２’修飾を、１つ以上のホスフェートリンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。
オリゴヌクレオチド骨格の中にフラノース糖を含めることによってはまた、エンドヌクレアーゼ的切断を減少させることもできる。オリゴヌクレオチド試薬は、さらに、３’陽イオン基を含めることによって、または３’末端のヌクレオシドを３’−３’結合に転化させることによって、さらに修飾することができる。別の代換えにおいては、３’末端は、アミノアルキル基（例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴ）でブロックすることができる。他の３’結合体は３’−５’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論には束縛されないが、３’結合体（例えば、ナプロキセンまたはイブプロフェン）は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合することを立体的にブロックすることによって、エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。さらに小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環結合体もしくは修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）は、３’−５’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
同様に、５’結合体は、５’−３’エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。理論には束縛されないが、５’結合体（例えば、ナプロキセンまたはイブプロフェン）は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合することを立体的にブロックすることによって、エキソヌクレアーゼ的切断を阻害することができる。さらに小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環結合体もしくは修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）が、３’−５’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
他の実施形態においては、オリゴヌクレオチド試薬は５’−リン酸化されるか、または５’プライム末端にホスホリルアナログを含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣによって媒介される遺伝子のサイレンシングに匹敵するものが含まれる。適切な修飾としては以下が挙げられる：５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−−Ｏ−−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−−Ｏ−５’）；５’−トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−−Ｏ−−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−−Ｏ−−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−−Ｏ−−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−−Ｏ−−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドキャップ構造。他の適切な５’−リン酸修飾は当業者に公知であろう。
１つの実施形態においては，ｓｉＲＮＡ標的部位は、ＡＡの２ヌクレオチド配列の出現について標的ｍＲＮＡ転写物の配列をスキャンすることによって選択される。３’に隣接するおよそ１９ヌクレオチドと組み合わせられたそれぞれのＡＡの２ヌクレオチドの配列は、ＳｉＲＮＡ標的部位である可能性がある。１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡ標的部位は、５’末端および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または開始コドンに近い（およそ７５塩基以内）領域には、優先的には配置されない。なぜなら、調節領域に結合するタンパク質は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する可能性があるからである（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。加えて、可能性のある標的部位は、適切なゲノムデータベース（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍでＮＣＢＩサーバーから利用できるＢＬＡＳＴＮ ２．０．５）と比較することができ、他のコード配列に対して有意な相同性を有している可能性のある標的配列は排除される。
短いヘアピンＲＮＡはまた、本発明の遺伝子または核酸の発現を阻害するか、あるいはノックダウンさせるために使用することができる。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を配列特異的に低下させることができるヘアピンＲＮＡの１つの形態である。短いヘアピンＲＮＡは、遺伝子発現の抑制においてｓｉＲＮＡを上回る利点を付与することができる。なぜなら、これらは一般的には、細胞環境の中でより安定であり、分解されにくいからである。そのような短いヘアピンＲＮＡによって媒介される遺伝子のサイレンシング（ＳＨＡＧｇｉｎｇとも呼ばれる）は、様々な正常な細胞株およびガン細胞株の中で、ならびに、哺乳動物細胞（マウス細胞およびヒト細胞を含む）の中で作用することが確立されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８（２００２）。さらに、操作されたｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子を有しているトランスジェニック細胞株が作成されている。これらの細胞は、ｓｈＲＮＡを構成的に合成することができ、それにより、子孫細胞に受け継がれ得る、長期間持続するかまたは構成的な遺伝子のサイレンシングを手助けすることができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９（３）：１４４３−１４４８（２００２）。
ｓｈＲＮＡにはステムループ構造が含まれる。特定の実施形態においては、これらには、様々なステムの長さ（通常は、１９から２９ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の数）が含まれ得る。特定の実施形態においては、ヘアピンには、１９から２１ヌクレオチドのステムが含まれるが、他の実施形態においては、ヘアピンには、２７から２９ヌクレオチドのステムが含まれる。特定の実施形態においては、ループの大きさは４から２３ヌクレオチドの長さであるが、ループの大きさは、２３ヌクレオチドよりも大きい場合があり、これによってはサイレンシング活性に有意な影響はない。ｓｈＲＮＡ分子には、不適合（例えば、効力を低下させることのない、ｓｈＲＮＡステムの２つの鎖の間でのＧ−Ｕ不適合）が含まれ得る。実際、特定の実施形態においては、例えば、細菌の中での増殖の間にヘアピンを安定化させるために、ｓｈＲＮＡは、ヘアピンステムの中に１つまたは数個のＧ−Ｕ対合が含まれるように設計される。しかし、標的ｍＲＮＡ（アンチセンス鎖）に結合するステムの部分とｍＲＮＡとの間での相補性が通常は必要であり、この領域の中のわずか１塩基対の不適合によってサイレンシングが回避されてしまう可能性がある。５’および３’突出は、ｓｈＲＮＡ機能にとって重要であることが明らかではないので必要ないが、存在する場合もある（Ｐａｄｄｉｓｏｎら、（２００２）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。
ヒトおよびマウスのＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡの中の特異的ｓｉＲＮＡ標的配列の例が、図１５および１９に示される。したがって、特定の実施形態においては、これらの標的配列、またはそれらの相補物もしくはホモログもしくはオルトログの全体あるいは１つの領域が含まれているｓｉＲＮＡが、本発明にしたがって意図される。
ｄ．ノックアウト構築物
特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの活性は、ＴＣｂｌＲ分子をコードする遺伝子、またはＴＣｂｌＲ生物学的経路の別の構成成分をコードする遺伝子を変異させることによって変化させられる。内因性の遺伝子を変異させる様々な方法が公知であり、当該分野で利用されている。これには、例えば、挿入突然変異およびノックアウト方法が含まれる。したがって、本発明には、ＴＣｂｌＲ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子をノックアウトさせる方法が含まれる。本発明のノックアウトベクターに、ＴＣｂｌＲ遺伝子の発現または活性を破壊させることができる任意のベクターが含まれることが理解され、特定の実施形態においては、これには遺伝子トラップベクターおよび遺伝子標的化ベクターの両方が含まれる。
好ましい方法においては、標的化ベクターは、ＴＣｂｌＲ遺伝子を選択的に破壊させるために使用される。本発明のノックアウトベクターには、例えば、ＴＣｂｌＲ遺伝子の調節エレメントを破壊すること（例えば、遺伝子発現を低下させる調節エレメントを挿入すること、または標的遺伝子の転写にポジティブな影響を与える内因性エレメントを欠失させること、もしくは標的遺伝子の転写にポジティブな影響を与える内因性エレメントの活性を別の方法で低下させることを含む）によって、遺伝子発現を変化させるものが含まれる。他の実施形態においては、本発明のノックアウトベクターは、例えば、ＴＣｂｌＲ遺伝子の５’領域、３’領域、またはコード領域を破壊する（例えば、欠失させるかまたは変異させる）。いくつかの実施形態においては、ノックアウトベクターは、ＴＣｂｌＲ遺伝子の１つの領域またはコード領域全体を欠失させる。特定の実施形態においては、ノックアウトベクターは、ＴＣｂｌＲ遺伝子の１つの領域を欠失させるが、他の実施形態においては、これらは、ＴＣｂｌＲ遺伝子に外因性の配列を挿入する。加えて、置換ベクターを使用する実施形態を含む特定の実施形態においては、ノックアウトベクターは、遺伝子の１つの領域を除去して、なおかつ外因性配列を導入する。
本発明の標的化ベクターには、内因性ＴＣｂｌＲ遺伝子との相同組み換えを受けることができるあらゆるベクターが含まれ、これには置換ベクターも含まれる。標的化ベクターには、ポジティブ選択、ネガティブ選択、ポジティブ−ネガティブ選択、およびポジティブスイッチ選択の方法において使用されるものが全て含まれる。標的化ベクターを使用するポジティブ選択、ネガティブ選択、およびポジティブ−ネガティブ選択は当該分野で周知であり、代表的な例が、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版（２０００）およびその中で引用されている参考文献に記載されている。
ｅ．アプタマーおよびＡｖｉｍｅｒｓ（登録商標）
特定の実施形態においては、本発明により、ＴＣｂｌＲの調節因子としてのアプタマーの使用が意図される。アプタマーは、特異的な標的分子（例えば、ＴＣｂｌＲ）に結合するポリヌクレオチドまたはペプチド分子である。アプタマーは、一般的には、抗体と同様の親和性で標的に結合する。しかし、アプタマーは、抗体を上回る利点を付与する。なぜなら、これらは、完全に試験管の中で操作することができるので、化学合成によって容易に生産することができ、望ましい保存特性を有しており、治療適用においてほとんど免疫原性を誘発しないか、全く免疫原性を誘発しないからである。アプタマーは、それらの標的分子の存在下で自己切断するように、リボザイムと混合される場合がある。
ＡＳ１４１１と呼ばれる治療用アプタマーは、現在、腎臓ガンおよび非小細胞性肺ガンの処置についての臨床試験の段階にある。このアプタマーは、未修飾のホスホジエステル結合を有している２６塩基の一本鎖ＤＮＡ鎖を含む、Ｇを多く含むポリヌクレオチドである。ＡＳ１４１１は、自身にアニーリングして、血清酵素による分解に対して耐性がある四量体構造を形成する。ＡＳ１４１１は、腫瘍細胞の表面上で発現されるヌクレオリンに結合し、これによりそのインターナライゼーションと強い抗増殖性の細胞応答を導く。投与実験により、７日間までの４０ｍｇ／ｋｇ／日までの用量が十分に寛容化されることが明らかになり、進行した転移性腎細胞ガンの患者において１７％の応答率と７５％の臨床的有用性が、初期の試験において観察された。
ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーは、通常、短いオリゴヌクレオチド鎖から構成されている。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドアプタマーは、インビトロでの選択、または、同等の、ＴＣｂｌＲへの結合についての指数的富化によるリガンドの体系的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ））によって進化的に操作されている核酸種である。
ペプチドアプタマーは、通常、短い可変性ペプチドドメインからなる。本発明のペプチドアプタマーは、通常は、ＴＣｂｌＲに結合するか、またはＴＣｂｌＲに対するＴＣもしくはＣｂｌの結合を妨害する。特定の実施形態においては、これらには、タンパク質足場に対して両方の末端を結合させた様々なペプチドループが含まれるか、そのようなペプチドループからなる。この二本鎖構造の制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）にまで大幅に増大させる。可変ループの長さは、通常、１０から２０アミノ酸であり、足場は優れた溶解度とコンパクトさ（ｃｏｍｐａｃｉｔｙ）の特性を有している任意のタンパク質であり得、例えば、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ａ）が、最も多く使用されている足場タンパク質であり、野生型タンパク質の中のＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−（配列番号２１）ループである可変性ループが還元性の活性部位の中に挿入されており、２つのシステイン側鎖はジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は、様々なシステムを使用して行うことができるが、酵母ツーハイブリッドシステムが、現在は最も多く使用されている。
特定の実施形態においては、本発明のアプタマーの活性は、アプタマー（すなわち、リガンドによって調節されるペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡ））に対するリガンドの結合によって調節される。例えば、三量体ＦＫＢＰ−ラパマイシン−ＦＲＢ構造に基づく新規の足場タンパク質に由来する７アミノ酸のペプチドを提示することにより、無作為化されたペプチドと標的分子との間での相互作用を、低分子ラパマイシンまたは非免疫抑制性アナログによって制御することができる。
アプタマーは、通常、大きなランダム配列のプールから、例えば、上記のようなＳＥＬＥＸ、インビトロでの選択、または酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用して、それらを選択することによって作成される。目的の標的（例えば、ＴＣｂｌＲ）に特異的なアプタマーを同定し、そして生産する様々な方法は、以下の参考文献に記載されている。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ，Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年８月３０日，３４６（６２８７）：８１８−２２；Ｂｏｃｋ ＬＣ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ＬＣ，Ｌａｔｈａｍ ＪＡ，Ｖｅｒｍａａｓ ＥＨ，Ｔｏｏｌｅ ＪＪ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年２月６日，３５５（６３６０）：５６４−６；Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ，Ｂｕｔｅ Ｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０００；７８（８）：４２６−３０；Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ ＪＭ，Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈ ＳＣ，Ｄａｖｉｓ ＪＨ，Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００４年４月２８日；１２６（１６）：５１３０−７；Ｃｏｈｅｎ ＢＡ，Ｃｏｌａｓ Ｐ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，ＰＮＡＳ １９９８年１１月２４日；９５（２４）：１４２７２−７；Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ ＢＦ，Ｍｉｌｌｅｒ ＲＡ，Ｂｅｌｓｈａｗ ＰＪ，Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ．２００５年７月，１２（７）：８４７−５５；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ＢＡ，Ｇｉｌｂｏａ Ｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８：２５２−２５８；およびＮｇ ＥＷ，Ｓｈｉｍａ ＤＴ，Ｃａｌｉａｓ Ｐ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＥＴ，Ｊｒ．，Ｇｕｙｅｒ ＤＲ，Ａｄａｍｉｓ ＡＰ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００６，５：１２３−１３２。アプタマーはまた、ファージディスプレイ技術（抗体およびその断片の同定について以下に記載されるものを含む）を使用しても同定することができる。
他の実施形態においては、本発明により、ＴＣｂｌＲまたはコバラミンの取り込みの調節因子としてのＡｖｉｍｅｒｓ（登録商標）の使用が意図される。Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）は、１本鎖タンパク質であり、通常は２５ｋＤａ未満の大きさであり、これは、複数の結合ドメインから構成されている。個々の結合ドメインは、特定の標的部位に結合するように設計される。特定の実施形態においては、これらの結合ドメインは同じタンパク質標的に結合するか、または複数の、もしくは異なるタンパク質標的に結合することができる。調節因子結合ドメインは、細胞外受容体ドメインのエキソンシャッフリングによって作成される場合がある。したがって、特定の実施形態においては、本発明のＡｖｉｍｅｒ（登録商標）には、トランスコバラミンまたはＴＣｂｌＲに結合する１つ以上の結合ドメインが含まれる。
特定の実施形態においては、本発明のＡｖｉｍｅｒ（登録商標）には、トランスコバラミンまたはＴＣｂｌＲに結合する結合ドメインに加えて、免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、ＩｇＧ）が含まれる。免疫グロブリン結合ドメインの結合は、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）の血清安定性の増大をもたらすと理解されている。
他の実施形態においては、本発明により、ＴＣｂｌＲまたはトランスコバラミンの取り込みの調節因子としてのレセプターボディー（ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｏｄｉｅｓ）の使用が意図される。特定の実施形態においては、本発明は、免疫グロブリン定常領域に融合させられたＴＣｂｌＲの細胞外ドメインが含まれているレセプターボディーに関する。特定の実施形態においては、細胞外ドメインは、トランスコバラミンに結合することができるＴＣｂｌＲの断片である。したがって、特定の実施形態においては、レセプターボディー、アプタマー、およびＡｖｉｍｅｒｓ（登録商標）を患者に投与することができ、この場合、これらはトランスコバラミンに結合してこれを隔離し、それにより、細胞表面ＴＣｂｌＲへのその結合と、細胞による取り込みを妨げる。
３．抗体
ＴＣｂｌＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書中に記載される方法にしたがうＴＣｂｌＲの活性化因子または阻害因子でもある。抗体またはその抗原結合断片は、それがポリペプチドと（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルで反応し、同様の条件下で無関係なポリペプチドとは検出できるほどに反応しない場合に、本発明のポリペプチドに対して「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」、および／または「免疫学的に反応性である」と言われる。抗体は、結合親和性が少なくとも１×１０−７Ｍ、または好ましくは、少なくとも１×１０−８Ｍである場合に、標的ポリペプチドに特異的に結合すると見なされる。１つの実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体である。
本発明の方法において使用される抗体としては、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体は、当業者に公知の様々な技術のいずれかにより調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的には、抗体は細胞培養技術によって生産することができる。細胞培養技術には、組み換え抗体の生産を可能にするための、当該分野で公知の従来技術によるか、または適切な細菌細胞宿主もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションによるモノクローナル抗体の作成が含まれる。目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術とその改良を使用して調製することができる。キメラ抗体およびヒト化抗体を作成する方法は当該分野で周知である（例えば、それぞれ、米国特許第４，８１６，５６７号、国際特許出願番号ＷＯ８４／０３７１２を参照のこと）。
特定の実施形態においては、モノクローナル抗体の調製方法には、所望される特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有している抗体を生産することができる不死化細胞株の調製が含まれる。そのような細胞株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から生産することができる。その後、脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫化された動物と同系のもの）との融合によって不死化させられる。様々な融合技術が使用できる。例えば、脾臓細胞と骨髄腫細胞を、非イオン性界面活性剤と数分間混合し、その後、骨髄腫細胞ではなくハイブリッド細胞の増殖をサポートする選択培地上で低密度でプレートすることができる。好ましい選択技術では、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択が使用される。十分な時間（通常は、１から２週間）の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。１つのコロニーが選択され、それらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有しているハイブリドーマが好ましい。
モノクローナル抗体は、増殖しつつあるハイブリドーマコロニーの上清から単離することができる。加えて、様々な技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）が、収量を増大させるために使用される場合がある。モノクローナル抗体は、その後腹水または血液から回収され得る。混入物は、従来技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去することができる。本発明のポリペプチドは、精製プロセスにおいて（例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程において）使用され得る。
多数の治療上有用な分子は当該分野で公知であり、これには、抗体分子の免疫学的結合特性を示すことができる抗原結合部位が含まれる。タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生じる。そのような断片のうちの２つ（「Ｆ（ａｂ）」断片）にはそれぞれ、完全な抗原結合部位が含まれている共有ヘテロ二量体が含まれる。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかの断片を提供することができ、これには、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」断片が含まれる。「Ｆｖ」断片は、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解的切断によって、そしてまれに、ＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって生じ得る。しかし、Ｆｖ断片は、より一般的には、当該分野で公知の組み換え技術を使用して導かれる。Ｆｖ断片には、天然の抗体分子の抗原認識および結合能力の大部分を保持している抗原結合部位を含む、非共有ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体が含まれる。Ｉｎｂａｒら、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６。
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは共有結合させられたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、これは、ペプチドをコードするリンカーによって連結させられた、ＶＨをコードする遺伝子とＶＬをコードする遺伝子が含まれている遺伝子融合体から発現させられる。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１６）：５８７９−５８８３。抗原結合部位の構造に実質的に類似している三次元構造に折り畳まれるであろうｓＦｖ分子になるように、抗体Ｖ領域に由来する自然な状態で凝集している−−しかし、化学的に分離されていない−−軽鎖および重鎖ポリペプチドを変換させる化学的構造を識別するための多数の方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号、および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
特定の実施形態においては、上記分子のそれぞれには、重鎖および軽鎖ＣＤＲのセットが含まれ、これらはそれぞれ、ＣＤＲに対してサポートを提供し、互いに相対的なＣＤＲの空間的関係を定義するＦＲのセットが、重鎖と軽鎖の間に介在させられている。本明細書中で使用される場合は、用語「ＣＤＲのセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端の前にあるこれらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と記載される。したがって、抗原結合部位には６個のＣＤＲが含まれ、これらには重鎖および軽鎖のＶ領域のそれぞれに由来するＣＤＲのセットが含まれる。１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）が含まれているポリペプチドは、本明細書中では、「分子認識単位」と呼ばれる。多数の抗原−抗体複合体の結晶学的分析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合した抗原と広範囲の接触を形成し、ここでは、最も広い抗原接触が重鎖ＣＤＲ３とともに起こることが示されている。したがって、分子認識単位は、抗原結合部位の特異性に主に関与する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ＦＲのセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲの骨組みを構成する、４個の隣接しているアミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接触し得る。しかし、ＦＲは、抗原結合部位（具体的には、ＣＤＲＳにすぐ隣接しているＦＲ残基）の中のＶ領域の折り畳みに主に関与している。ＦＲの中の特定のアミノ酸残基および特定の構造的特徴は、極めて高度に保存されている。これに関して、全てのＶ領域配列には、９０前後のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループが含まれる。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する、突出しているループモチーフとして提示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列とは無関係に、特定の「カノニカル」構造になるように折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響を与えるＦＲの構造領域が保存されていることが、一般的に理解されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化させる、非共有的ドメイン内接触に関与していることが知られている。
本発明にはさらに、ベニヤフレームワーク（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ（ＦＲ））抗体が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ベニヤＦＲ」および「組み換えによりベニヤリングされたＦＲ」は、天然のＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持している抗原結合部位が含まれている異種分子を提供するための、（例えば、齧歯類の重鎖または軽さＶ領域に由来する）ＦＲ残基の、ヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニヤリング技術（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖ＣＤＲのセットの構造と相対的配置によって主に決定されることの理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。したがって、抗原結合特異性は、ヒト化抗体だけにおいて保存することができる。ここでは、ＣＤＲ構造、それらの互いの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が、慎重に維持される。ベニヤリング技術を使用することにより、免疫システムに容易に遭遇する外部（例えば、溶媒に接近することができる）ＦＲ残基は、ヒト残基で選択的に置換されて、弱い免疫原性、または実質的に非免疫原性のいずれかのベニヤ表面を含むハイブリッド分子が提供される。
ベニヤリングのプロセスでは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）によって編集されたヒト抗体可変ドメインについての配列データが利用され、Ｋａｂａｔデータベースと、他の利用できる米国および外国のデータベース（核酸とタンパク質の両方）が更新される。Ｖ領域アミノ酸の溶媒接近性は、ヒトおよびマウスの抗体断片についての公知の三次元構造から予想することができる。マウスの抗原結合部位のベニヤリングにおいては、２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。その後、最も相同性の高いヒトＶ領域が、対応するマウスのアミノ酸に対して１残基ずつ比較される。マウスのＦＲ中のヒトの対応物とは異なる残基が、当該分野で周知の組み換え技術を使用して、ヒト部分の中に存在する残基によって置き換えられる。残基の交換は、少なくとも一部が露出している（溶媒に接近することができる）部分を用いてのみ行われ、そしてＶ領域ドメインの三次構造に有意な影響を与える可能性があるアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシン、および電荷を有しているアミノ酸）の置換には注意が払われる。
従って、この様式では、得られる「ベニヤリングされた」マウス抗原結合部位が、マウスのＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接している残基、埋まっているかまたはほとんど埋まっている（溶媒に接近することができない）と同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有的（例えば、静電気的および疎水性）接触に関与していると考えられている残基、ならびに、ＣＤＲループの「カノニカルな」三次構造に影響を与えると考えられているＦＲの保存されている構造領域に由来する残基を保持するように設計される。その後、これらの設計基準は、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組み換え体ヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用することができるＦＲを呈するように、ヒトの中にマウスの抗原結合部位の重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲを組み合わせる組み換え体ヌクレオチド配列を調製するために使用される。
ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、完全に動物由来またはヒト由来のものである場合も、またこれらは、定常ドメインがヒト免疫グロブリンの定常領域に由来し、可変領域がもとのマウスＭＡｂに由来するキメラ形態である場合もある。あるいは、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２は、相補性決定領域（ＣＤＲ）だけが動物のＭＡｂに由来し、可変領域の定常ドメインとフレームワーク領域がヒト起源のものであるように、ヒト化させることもできる。これらのキメラ断片およびヒト化断片は、それらの完全に動物のものである対応物よりも免疫原性が低く、したがって、インビボでの使用、特に、長期にわたる使用により適している。
ヒト以外の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位が含まれている多数の「ヒト化」抗体分子が記載されており、これには、齧歯類のＶ領域とヒト定常ドメインに融合させられたそれらの会合させられたＣＤＲを有しているキメラ抗体（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒトのサポートＦＲの中に移植された齧歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５）、ならびに、組み換えによりベニヤリングされた齧歯類ＦＲによってサポートされた齧歯類ＣＤＲ（１９９２年１２月２３日に公開された欧州特許公開番号５１９，５９６）が含まれる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントの中でのそのような部分の治療適用の期間および有効性を制限する、齧歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小にするように設計される。
ヒト以外の抗体をヒト化させるための方法は、当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源に由来する抗体の中に導入された１つ以上のアミノ酸を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、多くの場合は「輸入」残基と呼ばれ、通常は「輸入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、原則的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがって、ヒト抗体の対応する配列で超可変領域配列を置換することによって行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、ヒト可変ドメインの実質的に全体よりも小さい部分が、ヒト以外の種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際、ヒト化抗体は、通常は、いくつかの超可変領域の残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の中の同様の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作成において使用されるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選択は、抗原性を小さくするために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従うと、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。その後、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域として利用される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの完全なヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域が使用される。同じフレームワークが、いくつかの様々なヒト化抗体に使用される場合がある（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
抗体が、抗原に対する高い親和性と、他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するためには、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、もとの配列と、もとの配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する様々な概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用されており、当業者によく知られている。選択された候補の免疫グロブリン配列の適切な三次元立体構造を説明し、提示するコンピュータープログラムを利用することができる。これらの提示の検討により、候補の免疫グロブリン配列の機能における複数の残基についての可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補の免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能になる。この方法では、ＦＲ残基は、所望される抗体の特徴（例えば、標的抗原（単数または複数）に対する高い親和性）が得られるように、レシピエント配列と輸入配列から選択することができ、組み合わせることができる。一般的には、超可変領域の残基は、抗原結合への影響に直接、そしてほとんどは実質的に関与している。
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を作成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリンの生産がない条件下で、免疫化されるとヒト抗体の完全なレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を得ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系列変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型の欠失によっては、内因性抗体の生産の完全な阻害が生じることが記載されている。そのような生殖細胞系列変異体マウスへのヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原でチャレンジされると、ヒト抗体の生産が生じるであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。
１つの実施形態においては、本発明のヒト化抗体または完全なヒト抗体は、米国特許第５，７７０，４２９号、同第５，８３３，９８５号、同第５，８３７，２４３号、同第５，９２２，８４５号、同第６，０７１，５１７号、同第６，０９６，３１１号、同第６，１１１，１６６号、同第６，２７０，７６５号、同第６，３０３，７５５号、同第６，３６５，１１６号、同第６，４１０，６９０号、同第６，６８２，９２８、および同第６，９８４，７２０号（全てＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に記載されている方法にしたがって調製される。
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、免疫化されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子のレパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術にしたがうと、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主要なまたは主要ではないコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片として提示される。繊維状粒子にはファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーが含まれるので、抗体の機能的特性に基づく選択によってもまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が生じる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のうちのいくつかを模倣する。
ファージディスプレイは様々な形式で行うことができ、それらの概要については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離することができた。免疫化されたヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体は、原則としてＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２．７２５−７３４（１９９３）に記載されている技術にしたがって単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号もまた参照のこと。
ファージディスプレイは、様々な方法にしたがって合成抗体またはヒト抗体（およびアプタマー）を作成するために使用することができる。例えば、特定の実施形態においては、ファージディスプレイは、完全なヒト抗体またはその断片のライブラリーを生じさせるために利用され、これは、標的ポリペプチド（例えば、ＴＣｂｌＲ）に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。そのようなライブラリーのスクリーニングは、例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって市販されている。ヒト抗体のライブラリーとその使用方法は、例えば、米国特許第７，０４９，１３５号、同第６，８２８，４２２号、同第６，７５３，１３８号、同第６，７０６，４８４号、および同第６，６９６，２４８号、ならびに、米国特許出願公開番号２００６／０１２１５６３、同２００６／０００３３３４、および同２００４／０１５７２９１（全て、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓのもの）に記載されている。
ファージディスプレイを使用するヒト抗体およびアプタマーのライブラリーの作成およびスクリーニングのさらに別の方法は、例えば、以下に記載されている：Ｓｔｅｕｋｅｒｓ，Ｍ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年３月２０日；３１０（１−２）：１２６−３５；Ｈｕａｎｇ Ｌ．ら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ ８０．２００６年１０月；Ｗａｓｓａｆ，Ｄ．ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６年４月１５日；３５１（２）：２４１−５３；Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００５年９月；１８（９）：４１７−２４；Ｓｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５年５月１９日；３３（９）；Ｈｏｇａｎ Ｓ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５年４月；３８（４）：５３６，５３８；Ｈｏｅｔ ＲＭ，ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年３月；２３（３）：３４４−８；Ｈｕａｎｇ Ｌ，ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００５年２月１０日；Ｂｌａｉｓｅ Ｌ，ら、Ｇｅｎｅ．２００４年１１月２４日；３４２（２）：２１１−８；Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｔ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４，１７：１−９；Ｊｏｓｔｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４年６月；２８９（１−２）：６５−８０；Ｋｅｌｌｅｙ Ｂ，ら、Ｊ Ｃｈｒｏ．０４ ２００４年６月 ２００４；１０３８（１−２）：１２１−１３０；Ｌａｄｎｅｒ ＲＣ，ら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ．２００４年６月；９（１２）：５２５−５２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ，Ｂａｉｒｄ ＬＧ，Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉ．２００３年１２月；２９（３）：２５５−２５８；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｃｋｅｎ Ｔ，ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００３年７月１０日；５４６（２−３）：２８８−２９４．２００３年７月１０日；５４６（２−３）：２８８−２９４；Ｓａｔｏ Ａ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００３年７月，７１（３）：３１６；および、Ｎｉｘｏｎ ＡＥ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２００３年７月；７１（３）：３０２，３９８。
ヒト抗体はまた、インビトロで活性化させられたＢ細胞によって作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
１つの実施形態においては、抗体は、ＴＣｂｌＲ（例えば、細胞外ドメイン）に対して結合し、それにより、ＴＣのＴＣｂｌＲに対する結合を阻害することにより、ＴＣｂｌＲのシグナル伝達の阻害因子として作用する。
４．低分子
本発明の調節因子（阻害因子または活性化因子）にはさらに、大きなまたは小さな、無機または有機分子が含まれる。特定の実施形態においては、調節因子は有機低分子、またはその誘導体もしくはアナログである。
特定の実施形態においては、調節因子には保護基が含まれる。用語「保護基」は、少なくともいくつかの反応性部分をブロックし、そして保護基が除去される（または「切断される」）まで、そのような基が化学反応に関与することを妨げる化学的部分をいう。ブロック基／保護基の例は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９に記載されている。
調節因子のうちのいくつかは、１つ以上のキラル中心を有することができ、それぞれの中心は、ＲまたはＳ立体配置で存在し得る。本発明の調節因子には、全てのジアステレオマー、エナンチオマー、およびエピマー形態、ならびにそれらの混合物が含まれる。立体異性体は、所望される場合には、例えば、キラルクロマトグラフィーカラムによる立体異性体の分離のような、当該分野で公知の方法によって得ることができる。調節因子にはさらに、任意の阻害因子の、Ｎ−オキサイド、結晶形態（多形としても知られている）、および薬学的に許容される塩、ならびに活性な代謝物が含まれる。全ての互変異性体が、本明細書中に示される調節因子の範囲に含まれる。加えて、本明細書中に記載される調節因子は、溶媒和されていない状態で存在することができ、さらに、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒で溶媒和された形態として存在することもできる。本明細書中に示される調節因子の溶媒和形態もまた、本発明に含まれる。
特定の実施形態においては、低分子阻害因子は、ＴＣｂｌＲに結合する。１つの実施形態においては、低分子は、ＴＣｂｌＲの細胞外領域に結合し、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合を妨害するかまたは減少させる。
ＴＣｂｌＲの調節因子（有機低分子化合物が含まれる）は、当該分野で利用されている日常的に行われているスクリーニング手順にしたがって、例えば、そのような化合物の市販のライブラリーを使用して同定することができる。
５．トランスコバラミン受容体調節因子の同定方法
本発明によりさらに、治療特性を有している阻害因子および誘導因子を含む、ＴＣｂｌＲの発現および／または活性の調節因子（アンタゴニストおよびアゴニストを含む、阻害因子および誘導因子）を同定し、生産する方法が提供される。特定の実施形態においては、阻害因子および誘導因子は、ＴＣｂｌＲの機能的特性（例えば、ＴＣに結合する、Ｃｂｌの取り込みを促進する、または細胞の複製もしくは増殖を増進するＴＣｂｌＲの能力、）の１つ以上を調節する。
一般的には、ＴＣｂｌＲの調節因子は、例えば、上記の様々なタイプの分子の全てを含む候補の分子をスクリーニングすることによって同定される。ＴＣｂｌＲ機能または活性の決定に適している任意のアッセイを利用することができ、これには、本明細書中に記載される結合アッセイと生物学的機能のアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
候補の調節因子は、例えば、特異的な分子が阻害因子または誘導因子／活性化因子として機能すると予想される場合に、個別にスクリーニングすることができる。あるいは、化合物または分子のライブラリーをスクリーニングすることができる。市販されており容易に入手することができるそのようなライブラリーの例としては、組み換え発現ライブラリー、無機低分子化合物のライブラリー、抗体またはその断片（アプタマーを含む）を発現するファージディスプレイライブラリー、および有機低分子化合物のライブラリーが挙げられる。
本発明により、少なくとも２つの異なるタイプのＴＣｂｌＲの阻害因子が意図される。これには、（１）ＴＣｂｌＲの機能的活性を低下させる分子；および（２）ＴＣｂｌＲの発現レベルを低下させる分子が含まれる。ＴＣｂｌＲの阻害因子は、ＴＣｂｌＲの活性の１つ以上または発現を、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または１００％低下させる分子あるいは化合物として同定される。
一般的には、本発明により、２つの異なるタイプの誘導因子が意図される。これには、（１）ＴＣｂｌＲの機能的活性を増大させる分子；および（２）ＴＣｂｌＲの発現レベルを増大させる分子（ＴＣｂｌＲ発現構築物が含まれる）が含まれる。ＴＣｂｌＲの誘導因子は、ＴＣｂｌＲの活性の１つ以上を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、またはそれ以上増大させる分子あるいは化合物として同定される。ＴＣｂｌＲの過剰発現の状況においては、誘導因子は、ＴＣｂｌＲの発現を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、またはそれ以上増大させる分子あるいは化合物である。
１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲの機能的活性はＴＣに対する結合である。別の実施形態においては、誘導因子または阻害因子は、ＴＣｂｌＲまたはその機能的断片に結合するそれらの能力によって同定される。候補の分子および化合物のスクリーニングに適している日常的に行われている結合アッセイは当該分野で周知であり、これには、例えば、組み換え生成されたＧＳＴ−ＴＣｂｌＲ融合ポリペプチドを使用するＧＳＴプルダウンアッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、ファージディスプレイ、ＴＣｂｌＲに対する抗体を使用してＴＣｂｌＲ複合体を沈殿させるために適している低いストリンジェンシーの条件下での免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、および放射免疫アッセイが含まれる。
ＴＣｂｌＲの調節因子はまた、ＴＣｂｌＲまたはコバラミンの１つ以上の生物学的活性を変化させる（例えば、増大させるかまたは低下させる）それらの能力に基づいても同定することができる。例えば、調節因子は、候補の調節因子の存在下、またはそれが存在しない条件下で、ＴｃｂｌＲを発現する細胞によって取り込まれたコバラミンの量を比較するための細胞をベースとするアッセイを行うことによって同定することができる。特定の実施形態においては、ＴｃｂｌＲの阻害因子の存在によってはコバラミンの取り込みの減少が生じ、ＴｃｂｌＲの誘導因子の存在によっては、コバラミンの取り込みの増大が生じる。コバラミンは細胞増殖に関係しているので、ＴｃｂｌＲの調節因子はまた、細胞の成長または増殖を調節するそれらの能力に基づいて同定することもできる。例えば、ＴｃｂｌＲを発現する細胞は、候補の調節因子の存在下、またはそれが存在しない条件下でコバラミンと接触させられる。その後、細胞が、適切な時間の間培養され、細胞増殖が、例えば、それらの培養の前および後に生存している細胞の数をカウントすることにより、決定される。培養培地中のＴｃｂｌＲの阻害因子の存在により、そのような阻害因子が存在しない条件下での増殖と比較して、増殖の減少が生じる。同様に、培養培地中のＴｃｂｌＲの誘導因子の存在によっては、そのような誘導因子が存在しない条件下での増殖と比較して、増殖の増大が生じる。特定の実施形態においては、使用される細胞には、外因性のＴｃｂｌＲポリペプチドまたは組み換えによって発現させられたＴｃｂｌＲポリペプチドが含まれる。
本発明の特定の実施形態においては、ＴｃｂｌＲの調節因子のスクリーニングは、組み換えによって発現させられたＴＣｂｌＲまたはその断片を使用するか、あるいは、外因性のＴＣｂｌＲまたはその断片（これは通常、組み換え発現構築物から細胞の中で発現させられる）を含む細胞を使用して行われる。組み換え体ＴＣｂｌＲを利用する方法は、組み換え体タンパク質が、通常は、得ること、および精製することがより容易であるという点で有用である。
１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子は、アプタマー（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドアプタマー）である。したがって、本発明により、細胞へのコバラミンの取り込みを調節するアプタマーを同定するための、例えば、本明細書中に記載される技術のうちの任意のものを使用する、アプタマーのスクリーニングが意図される。そのようなアプタマーは、以下に記載されるものを含む、様々な診断的、予防的、および治療的用途に使用することができる。
１つの実施形態においては、ＴｃｂｌＲの調節因子は抗体（例えば、ヒト抗体）であｒ。したがって、本発明により、細胞へのコバラミンの取り込みを調節する抗体を同定するための、抗体（ヒト抗体を含む）のスクリーニングが意図される。そのような抗体は、以下に記載されるものを含む、様々な診断的、予防的、および治療的用途に使用することができる。
１つの実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを調節する抗体を同定する方法が含まれる。この方法には、ＴｃｂｌＲに特異的なヒトモノクローナル抗体を生産する工程、およびＴｃｂｌＲに対するＴｃの結合を妨害または促進するために結合するその能力、ＴｃｂｌＲを発現する細胞によるコバラミンの取り込みを調節するその能力、あるいは、コバラミンまたはＴｃｂｌＲの１つ以上の生物学的活性を変化させるその能力について、抗体を試験する工程が含まれる。
特定の実施形態においては、抗体は、精製された、または単離されたＴｃｂｌＲタンパク質を用いて、ヒト抗体鎖を発現するトランスジェニックマウスを免疫化することによって作成される。特定の実施形態においては、精製された、または単離されたＴｃｂｌＲタンパク質は、組み換え生成されたＴｃｂｌＲタンパク質である。そのようなマウスの例としては、Ｍｅｄａｒｅｘによって生産されたＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ、Ｋｉｒｉｎ ＴＣ Ｍｏｕｓｅ、およびＫＭ−Ｍｏｕｓｅが挙げられる。ＨｕＭＡＢ−Ｍｏｕｓｅトランスジェニックマウスにおいては、抗体を作成するためのマウスの遺伝子が不活化させられており、ヒトの抗体遺伝子によって置き換えられている。本発明者らのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅトランスジェニック株には、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードする、再配置されていないヒト抗体遺伝子に由来する重要な遺伝子配列が含まれる。これらの遺伝子によって、どの抗体タンパク質が作成されるかが決定されるので、これらのトランスジェニックマウスはヒト抗体タンパク質を作成する。Ｋｉｒｉｎ ＴＣ Ｍｏｕｓｅマウスには、対応する天然のヒト免疫グロブリン遺伝子座の中で見られる、可変遺伝子と定常遺伝子の完全なセットが含まれる。これらのマウスは「トランスクロモソミック（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ）」であり、これは、抗体を作成するためのマウス遺伝子が不活化させられており、ヒト抗体遺伝子の全て（全てのイソ型（ＩｇＧ１〜４、ＩｇＡ１〜２、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）をコードする全ての重鎖のクラスを含む）を含むヒト染色体によって置き換えられていることを意味する。ＴＣ Ｍｏｕｓｅはまた、完全なヒトモノクローナル抗体を作成する能力も有している。ＫＭ−Ｍｏｕｓｅは、強い免疫応答を有する全てのヒト抗体イソ型を生産する能力を保持しているＫｉｒｉｎ ＴＣ Ｍｏｕｓｅと、本発明者らのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅの特性とを兼ね備えている、交配されたマウスである。その後、ハイブリドーマが、従来技術を使用して免疫化されたマウスから得られた細胞（例えば、脾臓細胞）から生産され、ハイブリドーマ上清がＴｃｂｌＲに特異的な抗体についてスクリーニングされる。あるいは、または加えて、上清が、１つ以上のＴｃｂｌＲ活性（例えば、Ｔｃに結合する能力、または細胞によるコバラミンの取り込みを媒介する能力）を調節するそれらの能力について試験され得る。ＴｃｂｌＲに特異的な抗体を生産するか、またはＴｃｂｌＲ活性を調節するハイブリドーマがクローニングされ、増殖させられる。
特定の実施形態においては、スクリーニングアッセイは、ハイスループット技術を使用して行われる。例えば、結合アッセイは、複数のウェルを有しているマイクロタイター皿（例えば、９６ウェル皿）を使用して行われ得る。１つの実施形態においては、阻害因子または誘導因子は、マイクロタイター皿のウェルにＴＣｂｌＲを発現する細胞を入れること、個々のウェルの中に試験される様々な分子または化合物を加えること、ウェルに対して放射標識されたＴＣを加えること、および結合しなかった過剰な放射標識ＴＣを洗い流した後に個々のウェルの中の結合した放射標識ＴＣの量を決定することによって同定される。
特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子は、組み換えによって発現させられたＴＣｂｌＲポリペプチド（例えば、全長のＴＣｂｌＲポリペプチドまたはその断片、例えば、細胞外ドメイン）を使用して同定される。特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子のスクリーニング方法は、精製された組み換え体ＴＣｂｌＲタンパク質を使用してインビトロで行われる。他の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子のスクリーニング方法は、それらの表面上にＴＣｂｌＲを発現する細胞を使用して行われる。ＴＣｂｌＲは内因性のＴＣｂｌＲであり得るが、特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲは外因性であり、細胞に導入された発現構築物を介して細胞の中で発現させられる。特定の実施形態においては、細胞は、配列番号１に示される配列またはその断片を有している外因性ＴＣｂｌＲを発現する。
他の実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲ結合パートナーを同定する他の手段（例えば、ファージディスプレイ技術および酵母ツーハイブリッドスクリーニング）によって同定される。重ねて、これらは、外部から導入されたＴＣｂｌＲまたはその断片（例えば、その細胞外ドメイン）を発現する細胞を使用して行うことができる。
１つの実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を生産する方法が含まれる。この方法には、ヒト抗体ポリペプチドを発現するトランスジェニックであるヒト以外の動物を、精製された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその免疫原性断片で免疫化することによって、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体を生産する工程が含まれる。ここでは、上記組み換え生成されたトランスコバラミンポリペプチドは、細胞が組み換え生成されたＴＣｂｌＲポリペプチドまたはその断片を発現するように、プロモーター配列に動作可能であるように連結されたＴＣｂｌＲまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から精製される。
別の実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するＴＣｂｌＲ調節因子（例えば、アプタマー、ヒト抗体、またはＴＣｂｌＲのポリペプチド断片）を同定する方法が含まれる。この方法には、精製された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその免疫原性断片を、候補のＴＣｂｌＲ調節因子（例えば、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体）の存在下で、トランスコバラミンまたはその断片と接触させる工程、トランスコバラミン受容体に結合したトランスコバラミンの量を決定する工程、および、結合したコバラミンの量を、候補のＴＣｂｌＲ調節因子が存在しない条件下で結合した量に対して比較する工程が含まれる。ここでは、結合したトランスコバラミンの量の減少は、候補のＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す。
別の実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するＴＣｂｌＲ調節因子（例えば、ヒト抗体）を同定する方法が含まれる。この方法には、外因性のトランスコバラミン受容体を発現する細胞を、候補のＴＣｂｌＲ調節因子の中でトランスコバラミンと接触させる工程、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定する工程、および、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を、候補のＴＣｂｌＲ調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量に対して比較する工程が含まれる。ここでは、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、候補のＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す。
さらなる実施形態においては、本発明には、細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するモノクローナル抗体を生産する方法が含まれる。この方法には、プロモーター配列に動作可能であるように連結されたＴＣｂｌＲポリペプチドまたはその断片をコードする外因性のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞から、組み換え生成されたＴＣｂｌＲポリペプチドまたはその免疫原性断片を単離する工程、上記組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドで動物を免疫化する工程、および、上記動物から得られた細胞に由来する上記トランスコバラミン受容体ポリペプチドに特異的な抗体を精製する工程が含まれる。
本発明の方法にはさらに、トランスコバラミン受容体またはその断片を、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子の存在下で、トランスコバラミンまたはその断片と接触させること、トランスコバラミン受容体に結合したトランスコバラミンの量を決定すること、および、結合したトランスコバラミンの量を、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子が存在しない条件下で結合した量に対して比較することによって、抗体または他のＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを明らかにすることが含まれ得る。ここでは、結合したトランスコバラミンの量の減少は、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す。
本発明の方法にはさらに、トランスコバラミン受容体を発現する細胞を、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子の存在下で、トランスコバラミンと接触させること、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を決定すること、および、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量に対して比較することによって、抗体または他のＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを明らかにすることが含まれ得る。ここでは、細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、抗体またはＴＣｂｌＲ調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す。
ＴＣｂｌＲの阻害因子または誘導因子は、例えば、上記のような分子を同定することによって、そして、上記で同定された分子を生産することによって、製造することができる。加えて、同定された分子は当該分野で利用できる標準的な手順を使用して誘導することができ、さらに、ＴＣｂｌＲの発現または活性（例えば、ＴＣへの結合）の阻害因子または誘導因子として、改善された機能を有している分子を同定するためにスクリーニング、あるいは試験することができる。特定の実施形態においては、ＴｃｂｌＲを調節するヒト抗体は、１つ以上のヒト抗体鎖を発現するトランスジェニック動物をＴｃｂｌＲポリペプチドまたはその断片で免疫化すること、免疫化された動物に由来する細胞をハイブリドーマを生産するために使用すること、ＴｃｂｌＲに特異的に結合するハイブリドーマを同定するためにハイブリドーマ上清をスクリーニングすること、および上記ハイブリドーマをクローニングすることによって、製造される。特定の実施形態においては、ハイブリドーマ上清はまた、ＴｃｂｌＲを調節するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
６．修飾されたトランスコバラミン調節因子
本発明の別の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの調節因子（例えば、ＴＣｂｌＲに特異的に結合するモノクローナル抗体または有機低分子化合物）を、１つ以上の検出可能な標識または治療薬に結合させることができる。適切な標識および治療薬には、放射性核種、分化誘導因子、薬物、毒素、およびそれらの誘導体が含まれる。特定の実施形態においては、放射性核種には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれる。特定の実施形態においては、調節因子は、金属ではない放射性核種に結合させられ、これは例えば、炭素−１１、ヨウ素−１２４、フッ素−１８、臭素−７６、またはヨウ素−１２３であり得る。好ましい薬物としては、化学療法薬が挙げられる。
治療薬は、適切な調節因子またはモノクローナル抗体に対して、直接または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）させることができる。薬剤と抗体との間での直接の反応は、それぞれが互いに反応できる置換基を有している場合に可能である。例えば、一方の上にある求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）が、他方の上にあるカルボニルを含む基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）と、または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することができる。リンカー、および本発明の調節因子に対して治療薬（例えば、放射性核種）を結合させる方法の例は、例えば、以下に記載されている。米国特許第７，１７９，４４５号、同第７，１４１，２３３号、同第６，８３８，０７３号、同第６，８０６，３６３号、同第６，６１３，３０５号、同第６，２１１，３５５号、同第６，０９６，２９０号、同第６，００４，５３３号、および同第５，７３９，３１３号（全てＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）。これらの特許にはまた、様々な治療目的、抗腫瘍の目的、および画像化の目的のためにコバラミン結合体を利用する方法も記載されている。これらは、コバラミンの代わりに本発明の調節因子（またはその結合体）を利用するように容易に適応させることができる。
特定の実施形態においては、治療薬と抗体をリンカー基によって結合させることが所望される場合がある。リンカー基は、結合能力の妨害を回避するために、薬剤から抗体までの間隔をあけておくためのスペーサーとしての役割を果たすことができる。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増大させるように、したがって、結合効率を増大させる役割を果たすこともできる。化学的反応性の増大はまた、そうでなければ不可能である薬剤、または薬剤上の官能基の使用を可能にする場合がある。
様々な二官能性または多官能性試薬（ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログに記載されているもの）をリンカー基として使用できることは、当業者に明らかであろう。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を通じて行うことができる。そのような方法を記載している参考文献が多数存在している（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号）。
治療薬が、本発明の免疫結合体の抗体部分から遊離しているとより強力である場合には、細胞へのインターナライズの間に、またはその際に切断することができるリンカー基を使用することが所望される場合がある。多数の様々な切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基から細胞内で薬剤を遊離させるための機構には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒの米国特許第４，４８９，７１０号）、光解離性結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｌｅｒの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号）および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が含まれる。
抗体に対して１つ以上の薬剤を結合させることが所望される場合がある。１つの実施形態においては、１つの薬剤の多数の分子が１つの抗体分子に結合させられる。別の実施形態においては、１つ以上のタイプの薬剤が１つの抗体に結合させられる場合がある。１つ以上の薬剤を含む免疫結合体は、特定の実施形態にかかわらず様々な方法で調製することができる。例えば、１つ以上の薬剤を抗体分子に直接結合させることができ、また、結合のための複数の部位を提供するリンカーを使用することもできる。あるいは、担体を使用することもできる。
担体は、直接、またはリンカー基を介してのいずれかの共有結合を含む、様々な方法で試薬を有することができる。適切な担体としては、タンパク質（例えば、アルブミン）（例えば、Ｋａｔｏらの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、および多糖類（例えば、アミノデキストラン）（例えば、Ｓｈｉｈらの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。担体はまた、非共有結合により、または（例えば、リポソーム小胞の中への）カプセル化によって、薬剤を有することもできる（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種物質に特異的な担体には、放射線でハロゲン化させられた（ｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ）低分子およびキレート化合物が含まれる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号には、代表的な放射線でハロゲン化された低分子およびそれらの合成が開示されている。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種に結合するためのドナー原子として窒素および硫黄原子が含まれているものを含むキレート化化合物から形成させることができる。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらの米国特許第４，６７３，５６２号には、代表的なキレート化化合物とそれらの合成が開示されている。
Ｃ．ＴＣｂｌＲ調節因子の使用方法と薬学的組成物
本発明により、ＴＣｂｌＲのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列が同定され、それにより、ＴＣｂｌＲ活性に関係している細胞性のプロセスを調節するためのこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびに同定されたその調節因子の使用が可能となる。当業者によって容易に理解されるように、ＴＣｂｌＲは、Ｃｂｌによって調節されるプロセスを含む様々な細胞性のプロセスに関係している。したがって、ＴＣｂｌＲの調節因子は、これらの細胞性のプロセスを変化させ、患者の関連する疾患および障害を処置ならびに予防するために使用することができる。特定の実施形態においては、患者はヒトまたは別の動物である。１つの実施形態においては、患者は哺乳動物である。
ＴＣｂｌＲは、腫瘍および他の増殖性の障害を含む様々な疾患において過剰発現されることが示されている。具体的には、トランスコバラミンＩＩ受容体の数のアップレギュレーションが、いくつかの悪性細胞株において、それらの加速されたチミジンの取り込みとＤＮＡ合成の間に明らかにされている（米国特許第６，８０６，３６３号、Ｊ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｓら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１８４，４４９（１９８９）；Ｔ．Ａｍａｇａｓａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ，２６，１３８（１９９０）、およびＪ．Ａ．Ｂｅｇｌｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５６，４３（１９９３）を参照のこと）。したがって、ＴＣｂｌＲの調節因子および本明細書中に記載される他の組成物は、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルの増大を特徴とする疾患を処置あるいは予防するために使用することができる。
細胞性の増殖をブロックするためのストラテジーとしてのＣｂｌ枯渇は、抗ＴＣ ｍＡｂｓを使用して、インビトロで有効であることが示されており、したがって、抗ＴＣｂｌＲ ｍＡｂもまた有効なはずである。突き詰めていくと、両方のタンパク質に対するｍＡｂの組み合わせが最も有効であることが証明される可能性があり、これは本発明の範囲に含まれる。加えて、この基本的な入口（ｇａｔｅｗａｙ）は、これらの細胞の中でのＴＣｂｌＲの過剰発現が原因である新生物細胞に対してＣｂｌ−薬物結合体を送達するために使用することができる。新生物の増殖の停止を、選択的な栄養の枯渇によって実現できるという仮説は、Ｃｂｌ欠乏症または葉酸欠乏症を呈しており、診断されていない白血病を有する患者で、その欠乏症が処置されると、完全に症状を発症した白血病を発症する患者において偶然発見された知見によってサポートされる。このアプローチは従来の化学療法とは異なり、したがって、化学療法に伴う副作用および毒性の多くを軽減することができる。ＴＣｂｌＲをベースとする治療ストラテジーの有害な効果について考えられる懸念の中には、毒性（特に、造血系および神経系に対する毒性）の懸念がある。Ｃｂｌ欠乏症の神経病理学的合併症は、通常、発症するまでに数年かかり、したがって、短期間の治療においては主要な懸念ではない。しかし、骨髄および他の正常な再生組織（例えば、粘膜表面）は、影響を受ける可能性がある。Ｃｂｌ欠乏症またはＣｂｌ代謝拮抗物質の作用は、メトトレキセート治療後の葉酸のレスキューと同様のアプローチである、生理学的経路をバイパスすることができるＣｂｌの大きなボーラスを投与することによって容易に逆転させることができた。増殖しつつある細胞の中でのＣｂｌの取り込みおよび回転率は、利用することができるＴＣ−Ｃｂｌおよび発現されたＴＣｂｌＲによってのみ限定される、動的プロセスである。細胞のこの特性により、細胞内Ｃｂｌの迅速な交換または置き換えが可能である。
ＴＣｂｌＲポリペプチド配列は、８Ｄ６抗原またはＣＤ３２０抗原として以前に同定されたが、これらの抗原がＴＣｂｌＲに相当することは知られていなかった。８Ｄ６抗原は、ｇｅｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ細胞の増殖を刺激する濾胞樹状細胞分子として最初に同定された（Ｌｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１０７７−１０８３（２０００）およびＺｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４９−５６（２００１））。８Ｄ６は、これまでに、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株によるリンパ腫の形成（ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ）をサポートすることにおいてＣＤ４４と共同して作用することが示されている（Ｌｉ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０４：８１５−８２１）。したがって、本明細書中に記載されるＴＣｂｌＲ調節因子はまた、腫瘍（固形と液体の両方、例えば、白血病およびリンパ腫）に加えて、様々な免疫学的疾患および炎症性疾患を診断、処置、あるいは予防するためにも使用することができる。例えば、１つの特定の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫）を処置するために使用することができる。
特定の実施形態においては、Ｃｂｌ欠乏症（細胞内Ｃｂｌ欠乏症を含む）が関係している疾患または障害を処置または予防することに関係する本発明の方法には、機能性のＴＣｂｌＲポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはＴＣｂｌＲの活性もしくは発現の他のエンハンサーを、細胞または患者に提供する工程が含まれる。対照的に、過増殖、炎症、または脱調節された細胞増殖が関係している疾患あるいは障害を処置あるいは予防することに関係する本発明の方法には、通常、細胞または患者に対してＴＣｂｌＲの阻害因子を提供する工程が含まれる。
１．コバラミンの取り込みを阻害する方法
本明細書中に記載されるように、ＴＣｂｌＲは、ＴＣまたはＣｂｌの細胞による取り込みを支配している主要な受容体である。したがって、Ｃｂｌの取り込みは、本発明の調節因子を使用して、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合をブロックすることによって阻害することができる。したがって、本発明により、細胞による細胞に対するＴＣの結合を阻害する方法、および細胞によるＣｂｌの取り込みを阻害する方法が提供される。これには、細胞をＴＣｂｌＲ活性の調節因子と接触させる工程が含まれる。ここでは、上記調節因子は、ＴＣｂｌＲに対するｈｏｌｏ−ＴＣの結合、および細胞によるＣｂｌの取り込みを阻害する。
特定の実施形態においては、調節因子は抗体であり、例えば、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに結合する有機低分子化合物である。別の実施形態においては、調節因子はＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列に特異的なｓｉＲＮＡである。特定の実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲ上のＴＣ結合部位に、またはその近くに結合し、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合を競合的または立体的のいずれかで、阻害するか、または減少させる。
他の実施形態においては、調節因子は、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸１〜２２９）の少なくとも一部を含むＴＣｂｌＲの断片である。特異的な実施形態においては、この断片には、配列番号１のアミノ酸１〜２２９または３２〜２２９が含まれるが、原則としてそれから構成されるか、あるいはそれから構成される。
細胞には、培養された細胞、ならびに患者の体内に存在する細胞の両方が含まれる。加えて、細胞には、正常な細胞と罹患した細胞の両方が含まれる。１つの特定の実施形態においては、細胞は腫瘍細胞であるか、または、脱調節された細胞増殖もしくは過増殖を示す別の細胞である。
１つの実施形態にしたがうと、調節因子は、培養された細胞の培地に対して提供され、その結果、これは、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに容易に結合することができる。別の実施形態においては、調節因子は、患者の血液または血清に対して提供され、その結果、これは、ＴＣｂｌＲに対する結合について血清ＴＣと競合することができる。
２．細胞増殖または複製を阻害する方法、アポトーシスを誘導する方法、ならびに、ガン、炎症、骨髄増殖性（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）および自己免疫疾患を処置する方法
本明細書中に記載されるように、ＴＣｂｌＲの発現は、腫瘍細胞、および成長もしくは増殖の促進または低下を示している細胞において上昇する。同様に、ＴＣｂｌＲは、特定の骨髄増殖性および自己免疫性の障害において過剰発現されている。加えて、ＴＣｂｌＲは、Ｂ細胞および樹状細胞の増殖および分化において１つの役割を果たしており、さらには、リンパ腫の形成（ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ）をサポートしているとして同定されている。腫瘍細胞、および脱調節された増殖を示している他の細胞が、増殖因子が枯渇するとアポトーシスを受けることは当該分野でさらに理解されている。
したがって、本発明により、細胞または患者を、ＴＣｂｌＲの活性または発現の阻害因子と接触させることにより、細胞の増殖または複製を阻害し、アポトーシスを誘導する方法が提供される。そのような方法はまた、培養物中の細胞に対して適用される場合も、また患者の中の細胞に対して適用される場合もある。したがって、患者の状況においては、これらの方法は、脱調節された細胞増殖の過増殖に関係している疾患および障害（例えば、ガン、自己免疫性および骨髄増殖性の障害）を処置または予防することにおいて、さらには、血管形成を阻害することにおいて有用である。任意の特定の理論に束縛はされないが、そのような阻害因子は細胞内Ｃｂｌレベルを低下させ、細胞の成長および増殖の低下を導き、結果として特定の状況においてアポトーシスを生じると考えられている。
１つの実施形態においては、本明細書中に記載される阻害因子および方法は、任意のタイプのガンまたは腫瘍を処置するために使用することができる。具体的には、これらの方法は血液およびリンパ管系の固形腫瘍またはガン（リンパ腫、白血病、および骨髄腫を含む）に適用することができる。本発明にしたがって処置することができる特異的なガンの例としては、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（様々な分類システム（例えば、Ｗｏｒｋｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ分類、および好ましくは、ＲＥＡＬ分類）のいずれかにしたがって定義される任意のタイプのＮＨＬを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリンパ腫としては、低悪性度、中悪性度、および高悪性度のリンパ腫、ならびに、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられるが、これらに限定されない。これらのカテゴリーには、様々なタイプの小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、分割細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、小胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、ＣＮＳリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、成人リンパ芽球性リンパ腫、無痛性リンパ腫、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、形質転換型リンパ腫、ならびに他のタイプのリンパ腫が含まれる。本発明の方法にしたがって処置することができる特異的な骨髄増殖性障害の例としては、例えば、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄性白血病が挙げられる。本発明の方法は、成人型または小児型のリンパ腫、ならびに任意の病期（例えば、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期）のリンパ腫に使用することができる。様々なタイプのリンパ腫が当業者に周知であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ（例えば、ｗｗｗ３．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）に記載されている。
上記に記載されたように、本明細書中に記載される調節因子および方法は、成人型および小児型の疾患形態を含む、任意の形態の白血病に適用することができる。例えば、任意の急性、慢性、骨髄性、およびリンパ球性の疾患形態を、本発明の方法を使用して処置することができる。さらなるタイプの腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、骨髄腫、前立腺ガン、小細胞性肺ガン、結腸ガン、卵巣ガン、非小細胞性肺ガン、脳腫瘍、乳ガンなど）もまた、本明細書中に記載される方法を使用して処置することができる。
本明細書中に記載される調節因子は、多発性硬化症および関節炎を含むがこれらに限定されない、神経学的、免疫関連、および炎症性の疾患ならびに障害を処置するために使用することができる。加えて、本明細書中に記載される調節因子は、免疫応答を調節するために使用される場合もある。
用語「免疫関連疾患」は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態を引き起こす、媒介する、または別の方法で哺乳動物の病的状態に寄与する疾患を意味する。免疫応答の刺激または介入が疾患の作用または進行を緩和する疾患もまた含まれる。この用語には、免疫によって媒介される炎症性疾患、免疫によっては媒介されない炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、新生物などが含まれる。
本発明にしたがって処置することができる免疫関連疾患および炎症性疾患の例（そのいくつかは免疫細胞またはＴ細胞によって媒介される）としては、以下が挙げられる。全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミオパチー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性の血小板減少）、甲状腺炎（グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、アトピー性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発神経障害、またはギランバレー症候群）、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆汁性疾患、例えば、感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、および他の非肝臓向性（ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、およびホイップル病、自己免疫性または免疫媒介性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎を含む）、乾癬、アレルギー性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、食品に対する過敏性、および蕁麻疹）、肺の免疫性疾患（例えば、好酸球増加性肺炎、特発性特発性肺線維症、および過敏性肺炎、移植関連疾患（移植拒絶および移植片対宿主病を含む）。
本発明の調節因子および方法は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症）を処置または予防するためにも使用される場合がある。
特定の実施形態においては、本発明の方法は、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む）（これは、濾胞性リンパ腫またはびまん性大Ｂ細胞リンパ腫である）に罹患している患者を処置するために使用される。これらのリンパ腫は、西側諸国の成人のリンパ腫の最も一般的なタイプである。
本発明の調節因子は、最初の処置として投与される場合も、また、二次的な処置として投与される場合もある。加えて、これらは、一次化学療法として投与される場合も、また、補助化学療法もしくは新術前化学療法として投与される場合もある。
特定の実施形態においては、調節因子は抗体であり、例えば、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態においては、調節因子は有機低分子化合物であり、これは、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態においては、調節因子は、ＴＣｂｌＲ上のＴＣ結合部位に、またはその付近に結合して、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合を競合的または立体的のいずれかで阻害するかあるいは減少させる。他の実施形態においては、調節因子はｓｉＲＮＡ分子、すなわち、ＴＣｂｌＲポリヌクレオチドに結合し、それによりＴＣｂｌＲの発現を低下させる一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドである。
他の実施形態においては、調節因子は、細胞外ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜２２９）の少なくとも一部を含むＴＣｂｌＲの断片である。特異的な実施形態においては、この断片には、配列番号１のアミノ酸１〜２２９またはアミノ酸３２〜２２９が含まれるか、原則としてこれらから構成されるか、またはこれらから構成される。特定の実施形態においては、そのような断片が患者に投与され、これらはここで、ｈｏｌｏ−ＴＣに対する結合について内因性の細胞表面ＴＣｂｌＲと競合し、それにより、細胞（例えば、腫瘍細胞）によるＣｂｌの取り込みを妨げる。
特異的な実施形態においては、ＴＣｂｌＲ活性の調節因子は局所的に提供されるが、他の実施形態においては、これは全身的に（例えば、静脈内または動脈内に）提供される。したがって、本発明の方法の特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲの発現または活性の調節因子（例えば、抗体またはＴＣｂｌＲの細胞外断片）は、患者の血流に提供され、これはここで、細胞表面ＴＣｂｌＲに対するｈｏｌｏ−ＴＣの結合と、対応するコバラミンの取り込みを阻害する。したがって、そのような調節因子は、例えば、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメイン（例えば、配列番号１）が含まれている、原則としてそれから構成されている、またはそれから構成されているポリペプチドで、患者の血液中の循環しているＴＣを飽和させ、それにより、細胞表面上の受容体に対するｈｏｌｏ−ＴＣの結合を妨げ、そしてそれによりＣｂｌの細胞による取り込みをブロックすることによって、ガンを処置するために使用することができる。
３．腫瘍の検出、画像化、および標的化の方法
上記のように、ＴＣｂｌＲは、休止中の細胞または分裂していない細胞と比較して、増殖している細胞において過剰発現される。腫瘍細胞が正常な細胞と比較して増殖の増大を示すと仮定すると、正常な細胞と比較して、腫瘍細胞の中ではそれに対応するＴＣｂｌＲの高い発現が存在する。実際、標識されたコバラミン誘導体を、多種多様な腫瘍（原発性および転移性の乳房、肺、結腸、甲状腺、肉腫変性、前立腺、および中枢神経系の悪性腫瘍）の画像化ならびに検出のために使用することができることが明らかにされている（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．Ａ．ら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７５：５６８−５８０（２０００））。したがって、特定の実施形態においては、本発明には、腫瘍を、ＴＣｂｌＲに特異的に結合する薬剤（例えば、検出可能な標識に結合させられたＴＣｂｌＲに結合する薬剤および／または治療薬）と接触させることによる、腫瘍細胞を検出および画像化する方法、ならびに腫瘍細胞に対して治療薬を優先的に送達する方法が含まれる。これらの方法は、一般的には、様々な腫瘍（本明細書中に具体的に記載されているものを含む）に適用することができる。
腫瘍の検出の状況においては、ＴＣｂｌＲに特異的に結合する薬剤は、通常、検出可能な標識に結合させられ、患者に送達される。その後、患者が試験され、検出可能な標識の存在および／または位置が決定され、腫瘍の存在と関係付けられる。通常、腫瘍の存在は、正常な対照患者において検出されるレベルよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍多い検出と関係付けられる。
関連する実施形態においては、患者から得られた組織試料の中の腫瘍細胞の存在は、組織試料に対するＴＣｂｌＲに特異的に結合する薬剤の結合の量を、対照の正常な組織試料に対する結合の量、またはあらかじめ決定されたカットオフ値に対して比較することによって決定される。通常、腫瘍細胞の存在は、正常な対照組織試料中で検出される結合したＴＣｂｌＲ結合試薬よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍多い量と関係付けられる。
これらの方法は、診断目的に容易に適応させることができる。例えば、ＴＣｂｌＲに結合する薬剤を使用して検出されたＴＣｂｌＲの量は、処置前と処置後に決定することができる。この量が処置後に減少した場合には、これは処置が有効であることを示唆する。しかし、この量が処置後に増加した場合は、これは処置が有効でないことを示唆する。
特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲ結合試薬は抗体であり、例えば、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態においては、ＴＣｂｌＲ結合試薬は、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに結合する有機低分子化合物である。
本発明により、任意のタイプの検出可能な標識（例えば、色素、蛍光色素分子、および放射性標識のような、視覚的に検出することができる標識）の使用が意図される。加えて、本発明により、磁気ビーズ、および電子密度の高い物質（例えば、金属、例えば、金）を標識として使用することが意図される。例えば１４Ｃ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、１９２Ｉｒ、１０３Ｐｄ、１９８Ａｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、２０１ＴＩ、１５３Ｓｍ、１８Ｆ、および９０Ｓｒのような、多種多様な放射性同位元素を使用することができる。使用しうる他の放射性同位体としては、例えば、タリウム−２０１またはテクネシウム９９ｍが挙げられる。
特定の実施形態においては、検出可能な標識はＣＴ造影剤であり、これはまた「色素（ｄｙｅｓ）」とも呼ばれる。一般的に使用される造影剤の例としては、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、およびガルトログラフィンが挙げられる。
他の実施形態においては、検出試薬は、蛍光色素原子（例えば、フルオレセインまたはローダミン）である。様々な生体適合性の蛍光色素原子が市販されている。
適切な治療薬としては、放射性核種、分化誘導因子、薬物、毒素、およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、例えば、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８５Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、化学療法薬が挙げられる。
４．コバラミン欠乏症の処置方法
Ｃｂｌ欠乏症は、様々な疾患および障害に関係しており、これには、例えば、巨赤芽球性貧血、および中枢神経系と末梢神経系の両方に影響を与える神経学的合併症（例えば、脊髄の変性、末梢神経障害、およびＣＮＳの異常）が含まれる。特定のタイプのＣｂｌ欠乏症は、Ｃｂｌの不十分な血漿レベルの結果であるが、他のＣｂｌ欠乏症は、十分な量のＣｂｌの血漿レベルの存在下で起こり、これはＣｂｌの細胞による取り込みの不足が原因である。したがって、本発明により、１つの実施態様において、ＴＣｂｌＲのレベルまたは活性を増大させ、それによりＣｂｌの細胞による取り込みを増加させることによる、Ｃｂｌ欠乏症が関係している疾患および障害を処置する方法が提供される。
本発明には、細胞内のＴＣｂｌＲの量を増加させる様々な方法が含まれる。これらの方法には、ＴＣｂｌＲポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはその機能性変異体もしくは断片を細胞に導入する工程が含まれる。１つの実施形態においては、ＴＣｂｌＲをコードする配列が含まれているポリヌクレオチドが細胞に導入される。様々な実施形態においては、ポリヌクレオチドは発現ベクターであり、これには、上記のように、細胞内でコードされるＴＣｂｌＲの発現を駆動するプロモーターおよび／または他の調節配列が含まれる。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムにＴＣｂｌＲをコードする配列を導入することができる挿入ベクターまたは標的化ベクターである。したがって、ポリヌクレオチドは、細胞内に一次的に存在するか、または細胞のゲノムに安定に組み込まれるかのいずれかであり得る。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される、当該分野で公知の方法にしたがって、ウイルスをベースとするベクターを使用して細胞内に導入される。
細胞の中のＴＣｂｌＲの量または細胞内でのＴＣｂｌＲの発現量を増加させることに関する本発明の方法は、以下を含む、ただしこれらに限定されない、Ｃｂｌ欠乏症が関係している様々な疾患または障害を処置あるいは予防するために使用することができる。巨赤芽球性貧血、悪性貧血、神経学的機能不全（例えば、運動失調（不安定な動き、および不安定歩行）を含む）、筋力低下、痙性、失禁、低血圧、視覚障害、認知症、精神病、認知症、記憶喪失、および気分障害）、喘息、鬱病、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、耳鳴り、糖尿病性神経障害、胃炎、セリアック病、ならびに極端に少ない精子数。
ＴＣｂｌＲの細胞レベルを増大させることに関する本発明の方法は、内因性のＴＣｂｌＲの発現または活性の低下に関係しているＣｂｌ欠乏症の処置に特に適しているが、これらの方法は、これらがＴＣｂｌＲの結合と、血漿中に存在しているわずかなｈｏｌｏ−ＴＣの細胞による取り込みを増強するので、血漿Ｃｂｌのレベルの低下が付随するＣｂｌ欠乏症の処置においても有用である。
５．治療用組成物
さらなる実施形態においては、本発明には、単独で、または１つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで細胞または動物に投与される、薬学的に許容される担体の中に本明細書中に開示される調節因子の１つ以上が含まれている薬学的組成物が含まれる。
所望される場合には、本明細書中に開示される組成物は、他の薬剤（例えば、他のタンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的活性のある薬剤）と組み合わせて投与することができることが理解されるであろう。実際、さらなる薬剤が標的細胞または宿主の組織と接触しても有意な有害作用を引き起こさない限りにおいてそれらもまた含めることができる他の成分については、実質的に制限はない。したがって、組成物は、特定の場合に必要であれば、様々な他の薬剤とともに送達され得る。そのような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製される場合も、あるいは、本明細書中に記載されるように化学合成される場合もある。同様に、そのような組成物にはさらに、置換されたかまたは誘導されたＲＮＡあるいはＤＮＡ組成物が含まれ得る。
したがって、本発明の別の態様においては、生理学的に許容される担体と組み合わせて本明細書中に記載される調節因子の１つ以上が含まれている薬学的組成物が提供される。本明細書中に記載される組成物のうちの任意のものに、本発明の調節因子の薬学的に許容される塩が含まれ得ることは明らかであろう。そのような塩は、例えば、薬学的に許容される非毒性の塩基（有機塩基（例えば、第１級、第２級、および第３級アミン、ならびに塩基性アミノ酸の塩）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩）を含む）から調製することができる。
当業者に公知の任意の適切な担体を本発明の組成物において使用することができるが、担体のタイプは通常、投与形態に応じて様々であろう。本発明の組成物は、例えば、局所、経口、鼻腔、粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、および筋肉内への投与を含む、任意の適切な投与様式のために処方することができる。
そのような薬学的組成物の中で使用される担体は生体適合性であり、生体分解性でもあり得る。特定の実施形態においては、処方物により、比較的一定のレベルでの有効成分の放出が提供されることが好ましい。しかし、他の実施形態においては、投与されると直ちにさらに迅速な放出速度が所望される場合がある。そのような組成物の処方は、公知の技術を使用して、十分に当業者のレベルの範囲内である。これに関して有用な代表的な担体としては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の代表的な遅延放出型の担体としては、超分子バイオベクターが挙げられる。これには、脂質ではない親水性のコア（例えば、架橋された多糖またはオリゴ糖）と、状況に応じて、両親媒性化合物（例えば、リン脂質）が含まれている外部層が含まれる（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号、ならびにＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２００７８、同ＷＯ／９４／２３７０１、および同ＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放処方物の中に含まれる活性のある化合物の量は、移植部位、放出速度および期待される期間、ならびに処置または予防される症状の性質に応じて様々である。
別の例示的な実施形態においては、生体分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸）が、本発明の組成物の担体として使用される。適切な生体分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号、同第５，０７５，１０９号、同第５，９２８，６４７号、同第５，８１１，１２８号、同第５，８２０，８８３号、同第５，８５３，７６３号、同第５，８１４，３４４号、同第５，４０７，６０９号、および同第５，９４２，２５２号に開示されている。修飾されたＢ型肝炎コアタンパク質キャリアシステム（例えば、ＷＯ９９／４０９３４およびその中で引用されている参考文献に記載されている）もまた、多くの用途について有用であろう。米国特許第５，９２８，６４７号に記載されているような別の例示的な担体／送達システムでは、粒子−タンパク質複合体が含まれている担体が使用される。これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。
本発明の組成物には、多くの場合、１つ以上の緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水もしくはリン酸緩衝化生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化物質、制菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、もしくはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物をレシピエントの血液と等張性、低張性、もしくは弱い低張性にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、および／または保存剤が含まれるであろう。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方される場合もある。
本明細書中に記載される組成物は、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルのような、単位用量用または多用量用の容器の中に提示することができる。そのような容器は、通常、使用されるまで処方物の滅菌性および安定性を保つための方法で、密封される。一般的には、処方物は、油性または水性の媒体の中に、懸濁液、溶液、またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、組成物は、使用の直前に滅菌の液体担体を加えることだけを必要とする、凍結乾燥させられた状態で保存される場合もある。
様々な処置レジュメ（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内での投与を含む）のうち本明細書中に記載される特定の組成物の使用に適している投与および処置レジュメ、ならびに処方物の開発は当該分野で周知であり、そのいくつかが、一般的な説明の目的のために以下に簡単に議論される。
特定の適用においては、本明細書中に開示される組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤もしくは吸収される食用の担体とともに処方される場合があり、またこれらは、ハードもしくはソフトゼラチンカプセルの中に閉じ込められる場合も、錠剤に圧縮される場合も、また、食事療法用の食品に直接取り込まれる場合もある。
当然、個々の治療上有用な組成物の中の活性のある化合物（単数または複数）の量は、任意の所定の単位用量の化合物の中に適切な投与量が得られるであろう方法で調製され得る。溶解度、生体利用性、生物学的半減期、投与経路、生成物の保管期限のような要因、ならびに、他の薬理学的考慮事項が、そのような薬学的処方物を調製する当業者によって意図されるであろう。そのようなものとして、様々な投与量および処置レジュメが所望され得る。
特定の状況においては、本明細書中に開示される組成物を、非経口で、静脈内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に、送達することが所望されるであろう。そのようなアプローチは当業者に周知であり、そのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号、および同第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。特定の実施形態においては、遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性のある化合物の溶液が、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水の中に調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物の中に、さらには油の中に調製される場合もある。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物には、一般的に、微生物の増殖を防ぐための防腐剤が含まれるであろう。
注射可能な用途に適している例示的な薬学的形態としては、滅菌の水溶液または分散液と、滅菌の注射可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌の粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易に注射器の中に入れることができる程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存の条件で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用から守られなければならない。担体は、溶媒または分散媒体であり得、これには例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物性油が含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、および／または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって容易に得ることができる。多くの場合には、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチン）を組成物の中で使用することによってもたらされ得る。
１つの実施形態においては、水溶液の中での非経口投与のためには、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤が最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内への投与に特に適している。これに関連して、使用できる滅菌の水性媒体は、本発明の開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性のＮａＣｌ溶液に溶解させられ得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられるか、または提案される注入部位に注射されるかのいずれかが行われる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版，１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。投与量のいくらかの変動が、処置される被験体の症状に応じて必然的に起こるであろう。さらに、ヒトへの投与については、調製物はもちろん、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄにより求められる滅菌性、発熱性、ならびに全般的な安全性、および純度の基準を満たすであろうことが好ましい。
本発明の別の実施形態においては、本明細書中に開示される組成物は、中性の形態または塩の形態で処方され得る。例示的な薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基とともに形成される）が挙げられ、これは、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）とともに形成される。遊離のカルボキシル基とともに形成された塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）からも誘導することもできる。処方されると、溶液は、投与処方物と適合する様式で、治療上有効であるような量で投与されるであろう。
担体にはさらに、任意の、そして全ての、溶媒、分散媒体、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれ得る。薬学的活性のある物質についてのそのような媒体と薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除き、治療用組成物の中でのその使用が意図される。補助的な有効成分もまた、組成物に配合することができる。表現「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に、アレルギー性または同様の有害な反応を生じることのない分子的実体および組成物をいう。
特定の実施形態においては、組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアゾール送達媒体によって送達される場合がある。遺伝子、核酸、およびペプチド組成物を鼻腔エアゾールスプレーによって肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内マイクロ粒子樹脂を使用する薬物の送達（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８年３月 ２；５２（１−２）：８１−７）およびリソホスファチジルグリセロール化合物を使用する薬物の送達（米国特許第５，７２５，８７１号）もまた、薬学の分野で周知であり、ポリテトラフルオロエチレンサポートマトリックスの形態での例示的な粘膜を介する薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。
特定の実施形態においては、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、脂質粒子、小胞などが、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用される。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、そのような担体媒体の表面に対して、共有結合または非共有結合のいずれかにより結合させることができる。
Ｄ．トランスコバラミン受容体ノックアウトマウス
本発明によってはまた、動物の中のＴＣｂｌＲ遺伝子の発現を崩壊させ、ノックアウト動物および細胞を生じさせる方法も提供される。ノックアウト動物を得るための方法は当該分野で周知である。遺伝子の破壊が導入されているマウスを作成する方法は、例えば、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ａｎｄ Ｊｏｙｎｅｒに記載されている。１つの実施形態においては、細胞または動物のゲノムを修飾するために相同組み換えを使用する方法である遺伝子標的化を使用して、培養された胚性幹細胞に変化を導入することができる。ＥＳ細胞中の目的のＴＣｂｌＲ遺伝子を標的化することにより、これらの変化を動物の生殖細胞系列に導入して、キメラおよびＴＣｂｌＲノックアウト動物を作成することができる。
一般的には、ノックアウト動物を得るために使用されるＥＳ細胞は、作成されるノックアウト動物と同じ種であろう。したがって、例えば、マウスの胚性幹細胞がノックアウトマウスの作成に使用される。胚性幹細胞は、例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８７：２７−４５（１９８５）に記載されている方法のような当該分野で周知の方法とその改良を使用して作成され、維持される。任意のＥＳ細胞株を本発明にしたがって使用することができる。しかし、株の選択は、通常、発生中のマウスの胚の生殖細胞系列に組み込み、その一部となり、その結果、ノックアウト構築物の生殖細胞系列による伝達を作成する細胞の能力について選択される。ＥＳ細胞の生産に通常使用されるマウス株の一例は、１２９Ｊ株である。他の例としては、マウス細胞株Ｄ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＫＬ１９３４）およびＷＷ６細胞株（ｌｏｆｆｅら、ＰＮＡＳ ９２：７３５７−７３６１）が挙げられる。細胞は、例えば、以下に示される方法のような当業者に周知の方法を使用して、培養され、ノックアウト構築物への挿入のために調製される。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７）；Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３５７−３７１（１９８６）；およびＨｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６）。
簡単に説明すると、特定の実施形態においては、ＴＣｂｌＲ遺伝子は、胚性幹細胞の中で破壊され、適切な位置にノックアウト構築物を含む細胞が、日常的に行われている選択技術を使用して同定される。適切なＥＳ細胞が同定された後、細胞は胚に挿入され得る。挿入は、当業者に公知の様々な方法において行うことができるが、好ましい方法はマイクロインジェクションである。細胞は、着床前の胚（通常は、胚盤胞）に注入され得る。ＥＳ細胞の挿入に使用される胚として適切な発生段階は、種依存性が極めて高いが、マウスについては、適切な年齢の一つは３．５日である。
胚への細胞の導入後、胚は、妊娠のかわりに偽妊娠させた乳母の子宮に移植され得る。あるいは、ＥＳ細胞は、マウスが生じるように、桑実胚の段階の胚と凝集させられ得る。生殖細胞系列キメラが当該分野で周知の方法にしたがって選択され、破壊についてホモ接合性である動物が交配によって作成される。本発明の好ましい方法にしたがうと、ＥＳ細胞は、着床前の胚への注射の前にリコンビナーゼで処理され、それによって破壊された遺伝子の正常な発現が可能となり、そして破壊された遺伝子の欠失によって生じるであろう胚性致死が防がれる。本発明の動物にはあらゆる種が含まれる。本発明の好ましい動物としては、マウス、ヒト、霊長類、ラット、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、およびウシが挙げられる。本発明の他の好ましい方法としては、ＰＣＴ出願番号ＷＯ／００４２１７４および同ＷＯ／００５１４２４に記載されている方法が挙げられ、これには、二重の核導入（ｄｏｕｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が含まれる。
本発明により、さらに、リコンビナーゼ部位を含むベクターを使用する、条件的ＴＣｂｌＲノックアウト（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＴＣｂｌＲ ｋｎｏｃｋｏｕｔ）細胞および動物の作成が意図される。条件的ノックアウト動物を作成する特定の方法においては、破壊された遺伝子が含まれている胚性幹細胞が、キメラの作成または動物への移植の前に、リコンビナーゼで処理される。この手順は、破壊された遺伝子が胚発生に必要である場合に特に有用である。なぜなら、これにより、適切なリコンビナーゼでの処理後にほぼ正常な遺伝子発現が可能となるからである。別の実施形態においては、リコンビナーゼは、少なくとも１つの破壊された遺伝子の対立遺伝子が含まれている動物の作成後に、破壊された遺伝子が含まれている動物を、リコンビナーゼを発現する動物と交配させることによって送達される。リコンビナーゼを発現する動物はこれを偏在的に発現させる場合があり、また、その発現は、例えば、組織に制限されるかもしくは時間的に制限される場合もある。リコンビナーゼは、交配によって（例えば、本発明のマーカーカセットを含む動物を、マーカーカセットの中のリコンビナーゼ部位に結合することができるリコンビナーゼを発現する動物と交配させることによって）、本発明の動物に導入することができる。そのような方法の記載は、例えば、その全体が引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ９９５３０１７Ａ３に提供されている。
特定の実施形態においては、本発明の条件的ノックアウトベクターには、２つのリコンビナーゼ認識部位が含まれる。好ましくは、ＴＣｂｌＲ配列の１つの領域に隣接しているこれらのリコンビナーゼ認識部位はベクターの中に存在し、特定の実施形態においては、マーカー配列はまた、ベクターの中に存在する。好ましい実施形態においては、リコンビナーゼ認識部位は、マーカー配列のリコンビナーゼによって媒介される欠失、その後の所望される組み込み事象の同定または選択を指示するように配置される。
適切なリコンビナーゼ部位の例として、ＦＲＴ部位およびｌｏｘＰ部位が挙げられる。これらはそれぞれ、ｆｌｐおよびｃｒｅリコンビナーゼによって認識される（米国特許第６，０８０，５７６号、同第５，４３４，０６６号、および同第４，９５９，３１７号を参照のこと）。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰおよびＦｌｐ−ＦＲＴリコンビナーゼシステムは、２つの基本的なエレメントからなる：リコンビナーゼ酵素と、特定のリコンビナーゼによって特異的に認識されるＤＮＡの小さい配列。いずれのシステムも、標的部位の方向と位置に応じて、関連するＤＮＡの欠失、挿入、反転、または転座を媒介することができる。リコンビナーゼシステムは、米国特許第６，０８０，５７６号、同第５，４３４，０６６号、および同第４，９５９，３１７号に開示されており、遺伝子の破壊または置換のためにリコンビナーゼシステムを使用する方法は、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｓｔｒｉｃｋｌｅｔｔ，Ｐ．Ｋ．ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｓ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｋｕｈｎ，Ｒ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（１９９７），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供されている。
ＣｒｅおよびＦｌｐについての代表的な最小標的部位はそれぞれ、３４塩基対の長さであり、当該分野で公知である。ＤＮＡのセグメント上の２つの標的部位の互いに相対的な方向は、リコンビナーゼによって触媒される修飾のタイプを指示する。すなわち、正方向に向けられた部位によっては、介在するＤＮＡの切り出しが導かれるが、逆方向の部位によっては、介在するＤＮＡの反転が生じる。特定の実施形態においては、変異したリコンビナーゼ部位が、組み換え事象を不可逆的にするために使用される場合がある。例えば、個々のリコンビナーゼ標的部位には、単独の場合には組み換え効率を有意に妨げることはないものの、両方の変異が存在する場合にはリコンビナーゼ部位だけをほぼ不活化させる、様々な変異が含まれ得る。組み換え後、再生されたリコンビナーゼ部位には両方の変異が含まれ、その後の組み換えは有意に阻害されるであろう。
本発明において有用なリコンビナーゼとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。ＣｒｅおよびＦｌｐ、ならびにその機能的変異体（例えば、ＦｌｐＬ（これにはＦ７０Ｌ変異が含まれる）、およびＦｌｐｅ（これにはＰ２Ｓ、Ｌ３３Ｓ、Ｙ１０８Ｎ、およびＳ２９４Ｐ変異が含まれる）。ＣｒｅまたはＦｌｐｅは、これらがＦｌｐＬまたはＦｌｐよりもＥＳ細胞の中で効率よく染色体基質を切断することが示されているので、好ましくは、ＥＳ細胞の中で使用される（Ｊｕｎｇ，Ｓ．，Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．ａｎｄ Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ａ．，（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，９８４）。
本発明のＴＣｂｌＲノックアウト細胞および動物は、様々な目的のために使用することができる。これには例えば、ＴＣｂｌＲ機能の分析、ならびに、Ｃｂｌ欠乏症の細胞および動物モデルを作成することが含まれる。加えて、条件的ノックアウトは、例えば、様々な発生段階、または様々な組織の中でのＴＣｂｌＲの役割を特定するために使用され得る。本発明によってはまた、化合物（例えば、低分子を含む）の機能を分析するためにノックアウト細胞および動物を使用する方法、ならびに、新しい薬物または既知の薬物についての新しい薬学的適応症を特定するために化合物をスクリーニングする方法も提供される。関連する方法においては、本発明によりＴＣｂｌＲの活性を阻害または増強する化合物を特定するための手段が提供される。本発明によってはまた、ＴＣｂｌＲの活性に影響を与える化合物を特定し、そして選択するためのハイスループットスクリーニングアッセイも提供される。
（実施例１）
トランスコバラミン受容体の精製および特性決定
この実施例では、ＴＣｂｌＲタンパク質の精製と特性決定が記載される。
ＴＣｂｌＲの精製
胎盤膜の調製、ＴＣｂｌＲの可溶化、および親和性精製のための最初のプロトコールは、その上にウサギＴＣが固定されたＳｅｐｈａｃｒｙｌまたはＥｍｐｈａｚｅマトリックスに結合させられたアミノプロピル−Ｃｂｌの使用を除き、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ａｎｄ Ａｌｌｅｎの原型の手順に基づいた。この精製により、機能的活性に基づくとわずか２５％の純度である生成物が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーで染色した場合には、ＴＣｂｌＲの予想される大きさに相当する領域の中で複数のタンパク質バンドがＬＣ−ＭＳによって同定された。
ＴＣｂｌＲのＴＣ−Ｃｂｌ結合活性をモニターするための簡単な機能的アッセイが、精製の間の向上を追跡するために極めて有用であることが証明されている。このアッセイでは、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）−アガロースのいずれかが、ＴＣｂｌＲに結合させるために利用される。この方法では、これらのレクチンおよびＣＴに結合するＴＣｂｌＲ、結合しない非グリコシル化タンパク質の炭水化物含有量が利用される。
［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ−ＴＣ（１０，０００ｃｐｍ）を、５００μｌの緩衝液中の１〜２μｌのそれぞれの画分とともに４℃でインキュベートし、１時間後に、１００μｌのＣｏｎ Ａ−アガロースの５０％懸濁液を添加し、一定速度で混合しながらさらに１時間インキュベーションを継続した。１ｍｌの緩衝液をそれぞれのチューブに添加し、アガロースを１０００ｒｐｍで５分間、ペレット状にし、１ｍｌの緩衝液で１回洗浄し、ペレットの中の放射活性を決定した。２％未満の放射活性は１０ｍＭのＥＤＴＡの中のアガロースに付随するものであったか、またはＴＣｂｌＲが反応から排除された場合のものであった。親和性マトリックスから溶出させた画分の中の機能性のＴＣｂｌＲ活性についてのアッセイを図６に示す。
従来のタンパク質精製技術（例えば、陰イオンおよび陽イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー、ＣｏｎＡおよびコムギ胚芽レクチン−アガロースマトリックス、ならびに２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によっては、配列分析に適している十分に純粋なＴＣｂｌＲが得られたことを示す結果は生じなかった。これらの多数の精製工程の際の１つの主要な懸念は機能的活性が失われることであり、これにより最終産物の実体を確認することが難しくなってしまう。別のＴＣ−Ｃｂｌマトリックスに対して、第１の親和性マトリックスから溶出させられた物質を再度アプライすることが、１つの考えられる選択肢である。このプロトコールについては、精製の早い段階の工程の間に機能性の受容体を回収することが不可欠である。この段階で、可溶化およびアフィニティークロマトグラフィーのための手順を再検討した。なぜなら、機能的活性の大部分の最初の消失は、１０ｍＭのＥＤＴＡで親和性マトリックスから溶出させられたＴＣｂｌＲの中で観察されたからからである。この消失は、十分な透析によって、または１０倍のモル過剰のＣａ＋＋の使用によっても、完全に回復させることはできなかった。
この表現形のさらなる評価は、１）Ｃａ＋＋の付加は機能性のＴＣｂｌＲを測定するためには必要なく、そしてＣａ＋＋の付加によってはこの活性は増大することはないことを示しており、このことは、ＴＣｂｌＲは、胎盤膜の中に存在する場合には、Ｃａ＋＋で完全に飽和されていることを示しており、そして、２）ＥＤＴＡはＴＣ−Ｃｂｌの結合を減少させ、１０ｍＭの濃度では完全に阻害することを示していた。この阻害は、試料を、２倍のモル過剰のＣａ＋＋とともに１時間インキュベートすることによっては改善できなかった。５０および１００ｍＭの高いＣａ＋＋は、それ自体がＴＣｂｌＲ活性に対していくらかの影響を及ぼした。これは、ＥＤＴＡがＣａ＋＋に取って代わり、Ｃａ＋＋がもはやＥＤＴＡに代わることができないようにその部位に固く結合することを明らかにしている。別の溶出プロトコールを開発する試みにおいては、高いｐＨおよび低いｐＨ、高い塩濃度、および穏やかなカオトロピック条件を試験した。親和性マトリックスからのＴＣｂｌＲの効率的な溶出を提供し、活性の消失を引き起こさなかった１つのプロトコールは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中の０．５ＭのＭｇＣｌ２であった。完全な機能的活性は、溶出させた物質を１ｍＭ未満のＭｇＣｌ２になるように希釈すること、または一晩透析することによって回収した。胎盤膜からの可溶性受容体の回収率を改善するために、多数の界面活性剤を試験した。ＣＨＡＰＳＯに匹敵する可溶性ＴＣｂｌＲが得られた１つのコスト効果の高い界面活性剤はＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢであり、これは０．５％の濃度の両性イオン性界面活性剤である。ＴＣｂｌＲを可溶化させ、親和性マトリックスから溶出させるためのこの改良型のプロトコールを使用して、３工程の精製プロトコールを、その最終的な精製形態でＴＣｂｌＲを得るために様々な親和性マトリックスを使用して開発した。
ａ．最初の親和性精製
胎盤膜を、先に記載したように、しかしＥＤＴＡでの洗浄は行わずに調製し、３倍容量の０．５％Ｅｍｐｉｇｅｎ／２０ｍＭのＴｒｉｓ／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の中で可溶化させた。１００，０００ｇの上清画分（それぞれ３００ｍｌのアリコート）を、１０倍モル過剰量のＢ１２で予め飽和させた１０μｇのｒｈＴＣ（ＴＣの６倍モル過剰量を示す）と混合した。４℃で４〜６時間の後、親和性マトリックス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合させたヒトＴＣに対するモノクローナル抗体）を添加し、４℃で一晩、回転させながら混合した。このマトリックスについて選択したｍＡｂは、高い親和性で結合するｍＡｂであり、これは、受容体結合部位またはＣｂｌ結合部位を妨害しなかった。このｍＡｂは、溶液中のＴＣを効率よく捕捉し、そうすることにより、形成されたＴＣｂｌＲ−ＴＣ−Ｃｂｌを捕捉した。マトリックスを、０．２および０．５ＭのＮａＣｌでの２回のさらなる洗浄と、０．５ＭのＭｇＣｌ２での溶出の前の０．１および０．２ＭのＭｇＣｌ２での２回の洗浄を除き、先に記載したように洗浄した。図１Ａは、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける３つの別々の調製物と、銀染色により視覚化したタンパク質を示している。これらの調製物の中には多数のタンパク質バンドが存在していた。溶出させたＴＣｂｌＲを、抗ＴＣ親和性マトリックスまたはＴＣ−Ｃｂｌ−Ｅｍｐｈａｓｅマトリックスに再度アプライすること、そして図７Ａに記載するように試料を分析することによって、図１Ｂ、レーン１に示すように純度が改善した（レーン２は、２回目のアプライの際に親和性マトリックスに付着しなかったタンパク質を示している）。しかし、予想した受容体バンド（矢印）の付近に４〜５個のバンドがあった。
ｂ．２回目の親和性精製
最初の親和性精製から、多数のタンパク質がマトリックスに対して非特異的に、またはＣａ＋＋依存性の機構によって付着し、これらはＥＤＴＡで溶出されることが明らかであった。この問題を回避するために、様々な溶出手順を使用した。最初の親和性精製による、溶出させたＴＣｂｌＲの小さいアリコートを、５０μｌのアミノプロピルＣｂｌ−ＴＣ親和性マトリックスにアプライし、洗浄し、そしてＴＣｂｌＲを、ＥＤＴＡ溶出の代わりに、ＴＣ−Ｃｂｌの光解離によってマトリックスから遊離させた。この手順によって、ＴＣとＴＣｂｌＲの両方が複合体として遊離させられ、親和性マトリックスは再利用できなかった。光解離させたタンパク質をヨウ素化して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）によって分析した。図２に示すように、光解離によって遊離させたタンパク質には２つの主要なタンパク質（ＴＣに相当する４５ｋＤａのタンパク質（標識されたＴＣ）と５８〜６０ｋＤａのタンパク質（おそらくＴＣｂｌＲ（標識されたＴＣＲ）））が含まれていた。このタンパク質は、還元条件（レーン１；１ｍＭのＤＴＴ）および非還元条件（レーン２；ＤＴＴを含まない）のいずれにおいても同様の分子量を有していた。
上記手順を、さらなるＴＣｂｌＲの精製のためにスケールアップした。親和性マトリックスを、１ｍｌのアミノプロピル−Ｅｍｐｈａｚｅを０．５ｍｇの部分精製したａｐｏ ｒｈＴＣと一晩混合することによって調製した。これにより、マトリックス上に９０％未満のＴＣが生じた。マトリックスを、１ＭのＮａＣｌを含む緩衝液で十分に洗浄した。最初の親和性マトリックスから溶出させた画分を機能的活性についてアッセイし、プールし、透析し、そして第２の親和性マトリックスと一晩混合した。マトリックスを再度回収し、緩衝液で洗浄し、そしてＴＣｂｌＲ−ＴＣ−Ｃｂｌ複合体を、マトリックスからのＣｂｌの光解離によって遊離させた。
ｃ．３回目の親和性精製
上記精製による物質をＣｏｎＡアガロースマトリックスにアプライした。この３回目の精製工程の２つの目的は、光分解させた試料中の遊離のＴＣのほとんどを除去すること（なぜなら、マトリックス上の全てのＴＣがこの手順によって遊離させられるので大過剰量のＴＣ−Ｃｂｌがこの試料中に存在すると予想されるからである）、次いでマトリックスからＴＣｂｌＲを溶出させ、それによりさらに別の精製工程に加えることである。第２の親和性工程から回収されたタンパク質を、０．５ｍｌのＣｏｎＡアガロースと一晩混合し、緩衝液で洗浄し、その後、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）／５ｍＭのＣＨＡＰＳＯ中のそれぞれ０．４Ｍのメチル−Ｄ−マンノシドおよびマルトースを含む１ｍｌの溶出緩衝液とともに、４時間インキュベートした。マトリックスを小さいカラムに移し、緩衝液を回収し、マトリックスをもう１ｍｌの同じ溶出緩衝液で洗浄した。この試料を透析し、濃縮し、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離させた（図１Ｃ）。見ることができるように、約５８〜６０ｋＤａの１つの均質なバンドが、クマシーブルー色素染色によって観察された。このバンドを切り出し、トリプシンで消化し、そしてＬＣ−ＭＳによって分析した。ペプチドのピークについてさらなるＭＳ−ＭＳ分析を行い、アミノ酸配列を得た。
ＴＣｂｌＲの同定と特性決定
Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した配列のデータベース検索は、１００％の同一性と、２００の確立をベースとするＭｏｗｓｅスコアを用いて得られた４ペプチドの配列（図３に下線をつけた）と一致し、このことは、ＴＣｂｌＲとして新しく同定されたデータバンクタンパク質との明確な一致を示している。ヒトＴＣｂｌＲのアミノ酸配列は配列番号１に提供する。
予想したアミノ酸配列に基づくと、ＴＣｂｌＲは、２つのＬｄｌ Ａ型受容体ドメイン、カルシウム結合ドメイン、３１アミノ酸のシグナルペプチド、１９８アミノ酸の細胞外領域、２４アミノ酸の膜貫通配列、および２９アミノ酸の細胞質ドメインを有しているＬＤＬ受容体ファミリーに属することが明らかである。ＬＤＬ受容体様タンパク質の多くは、多リガンド結合タンパク質である。しかし、ＴＣｂｌＲはＴＣ−Ｃｂｌに特異的であるようである。なぜなら、これは、内因性因子またはハプトコリン（ｈａｐｔｏｃｏｒｒｉｎ）には結合しなかったからである（データは示さない）。多くのＬＤＬ受容体様タンパク質とは異なり、ＴＣ−ＣｂｌのＴＣｂｌＲに対する結合は、２０〜４００倍のモル過剰量のＬＤＬ、またはリガンド結合の調節に関係しているタンパク質である３００〜３０００倍のモル過剰量の受容体結合タンパク質（ＲＡＰ）（図４）によっては影響を受けなかった。ＴＣｂｌＲタンパク質はかなりグリコシル化されており、加えて、リン酸化およびミリスチル化される可能性がある部位を有していた。
（実施例２）
トランスコバラミン受容体ｃＤＮＡおよび遺伝子の同定と特性決定
ヒトゲノムデータバンクの検索により、ヒトＴＣｂｌＲ遺伝子の完全な遺伝子配列と染色体位置が明らかになった（図５）。ヒトＴＣｂｌＲのｃＤＮＡ配列は配列番号２に提供する。
ＴＣｂｌＲの発現を調節するシス（ｃｉｓ）ゲノムエレメントの同定
ＴＣｂｌＲの発現は活発に分裂している細胞の中で最大発現を有するように調節されるので、このディファレンシャルな発現を使用して、この遺伝子の転写による調節を特性決定し、この調節に関与しているトランス活性化因子を同定した。様々な初代細胞株（例えば、末梢皮膚線維芽細胞、様々な内皮細胞）、および悪性細胞（例えば、Ｋ５６２、ＨＬ６０、およびＥＣＶ３４０）の中でのＴＣｂｌＲ転写物およびタンパク質の発現レベルについての実験により、高いまたは低いＴＣｂｌＲの発現についての正確な時間枠、そして細胞周期全体を通じたＴＣｂｌＲの発現についての情報が提供された。
ＴＣｂｌＲの発現の調節を、ＴＣｂｌＲ遺伝子の５’隣接領域の中の上流の調節エレメントを同定することによって、以下に記載するように分析した。ヒトＴＣｂｌＲ遺伝子の１０２２ｂｐの５’配列を図１０に示す。この領域には、トランス活性化因子がそれに対して結合することが公知である多数の同定されているモチーフが含まれている。プロモーター活性に必要な最小５’配列を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が含まれているレポーター遺伝子構築物の中の３０００ｂｐの断片全体と、ＡＴＧ開始部位のすぐ上流にある１０００ｂｐの断片を別々に試験することによって決定した。プロモーター活性の変化が観察されなかった場合には、制御エレメントが全てＴＣｂｌＲコード配列のすぐ５’領域にある１０００ｂｐの中に存在すると見なすことは差し支えなく、この領域について、ＴＣｂｌＲの発現に関与しているポジティブおよびネガティブの両方のシスエレメントを同定するためのさらなる分析を行った。プロモーター活性の低下が、２０００ｂｐの５’領域を欠失させることによって観察された場合には、この断片を、ｐＣＡＴエンハンサープラスミドの中にクローニングすることによってエンハンサー活性についてさらに試験した。
プロモーターの中のシス作用エレメントの分析
活性に必要な最小プロモーターを同定するために、制限酵素で５’末端を欠失させた、または５’末端からのネスト欠失を含む短い断片を構築し、プロモーター活性について試験した。このストラテジーによってはまた、遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関与している領域についての情報も提供された。一旦、この配列に特異的な配列モチーフと転写因子が同定されると、ＴＣｂｌＲプロモーターを調節することにおけるこの転写因子の役割の確認が、プロモーター−レポーター構築物とともに、転写因子をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを同時トランスフェクトすることにより得られた。
ＤＮＡ／タンパク質相互作用のさらなる証明は以下の実験によって得た。
ｉ）ＤＮａｓｅＩフットプリント：Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚの手順（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｂｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｐ１２．１０−１２．１６，１９９２）を使用して、ＤＮＡｓｅＩ消化から保護されたＤＮＡ配列を同定した。これらの実験のために、プロモーター領域に由来する断片を含むプラスミドを、１つの部位を切断する制限エンドヌクレアーゼで直鎖状にした。直鎖状プラスミドを、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を使用してα−［３２Ｐ］−ｄＮＴＰで標識したか、またはγ−［３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識し、第２の制限酵素で消化し、そして断片が含まれているＴＣｂｌＲ配列をアガロースゲル電気泳動によって回収した。滴定した量のＤＮＡｓｅＩを使用して、核タンパク質の存在下および核タンパク質が存在しない条件下で末端標識したＤＮＡ断片（約５〜１０×１０５ｃｐｍ）を消化し、ＰＡＧＥによって分離させ、オートラジオグラフィーによって同定した。ここでは、特異的配列への核タンパク質の結合により、ＤＮＡｓｅによる消化から保護された配列の中の領域を同定した。Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ ａｎｄ Ｌｕｂｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：７２１−７３５，１９８７）に記載されているように調製した核抽出物を、保護された配列における差異を同定するために、増殖の対数期初期の細胞から、そしてコンフルエントな分裂していない細胞から得た。これにより、細胞の増殖期の間にＴＣｂｌＲの発現をアップレギュレートする因子についての情報がもたらされた。
ｉｉ）ＤＮａｓｅＩ過感受性：Ｔｕａｎ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎのアッセイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８１：２７１８−２７２２，１９８４）を使用して、転写開始部位の５’にある転写活性化領域を同定した。転写活性化領域は、転写開始前のオープンクロマチン立体構造に達し、これは、これらに領域を膵臓のＤＮａｓｅＩでの消化に対して敏感にする。これらの実験のために、核を対数期初期の細胞と、分裂していない細胞から単離した。核を様々な濃度のＤＮａｓｅＩとともにインキュベートし、ＤＮＡを抽出し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化して特異的な領域の中でＤＮＡを切断して、予測した大きさの断片を生じさせた。消化したＤＮＡをＰＡＧＥによって分離させ、予想した大きさの断片の５’および３’末端に対するオリゴヌクレオチドプローブを使用してサザンブロッティングによって分析した。本当にこの断片の中にＤＮａｓｅに対してそれを過感受性にする領域が存在するならば、サザン分析により、ＤＮａｓｅＩに対して感受性のある領域に応じた大きさが異なる２つの小さい断片が同定されるであろう。
ｉｉｉ）転写開始部位：転写の開始位置を正確に決定するために、ＲＮＡｓｅ保護アッセイおよび５’ＲＡＣＥを使用した。後者のアッセイによっては、転写が開始される正確なヌクレオチドを提供するための配列決定を行うことができる生成物が提供された。ＲＮａｓｅ保護アッセイによっては、そこからの転写開始が予想され得る保護された断片のおおよその大きさが提供された。このアッセイによってはまた、存在する場合には、複数の転写開始部位も同定された。
ｉｖ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：一旦、プロモーターの中の保護された領域が同定されると、オリゴヌクレオチド（約３０〜５０ｎｔ）の相補性の対を、推定されるＤＮＡ領域を含むように合成した。これらのオリゴヌクレオチドをγ−［３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識して、ＥＬＩＳＡアッセイのプローブとした。受容体を活発に発現している細胞に由来する核タンパク質抽出物を放射標識プローブとともにインキュベートし、ＰＡＧＥによって分析して、ＤＮＡ−タンパク質複合体の形成が原因でゆっくりと移動するプローブを同定した。非特異的結合を、予め滴定しておいた量のポリｄｌ−ｄＣを加えることによって減少させ、相互作用の特異性を、未標識の特異的ＤＮＡ断片と結合を競合させることによって決定した。プローブの中の領域を、より短いプローブを構築すること（タンパク質の結合には、結合モチーフのいずれかの側の上の２〜４ヌクレオチドが必要な場合があることに気をつけながら）、または６〜１０塩基が重複するより小さい断片を作成することのいずれか、そして競合アッセイもしくは直接結合アッセイにおいてこれらを使用することによってさらに同定した。一旦、特異的配列が転写因子（単数または複数）がそれに結合するモチーフとして同定され、そしてこの転写因子が既知のタンパク質であった場合には、これらのタンパク質に対する抗体を利用できることにより、特異的転写因子の実体を確認するためのＤＮＡ−タンパク質複合体のスーパーシフト分析が可能になる。
ＴＣｂｌＲ発現の翻訳調節
細胞の中で合成された特異的タンパク質の量は、ｍＲＮＡの定常状態での濃度と、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳速度の関数である。上流の調節エレメントとトランス活性化因子の制御下での転写の開始は、一次転写物を生じさせることにおいて不可欠な最初の工程である。一次転写物は、その後、ｍＲＮＡになるようにプロセシングされ、タンパク質に翻訳される。したがって、任意の定常状態では、ＲＮＡの転写速度は、ｍＲＮＡの崩壊速度に等しく、そしていずれの動的パラメーターも、それぞれ、転写物の合成の核流出（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎｏｆｆ）アッセイ、およびｍＲＮＡの崩壊速度によって定量することができる。受容体タンパク質の回転率（Ｔ１／２）は、発生期のタンパク質の代謝による放射標識によって定量される重要なパラメーターである。
ＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡの転写速度および安定性
高いＴＣｂｌＲの発現の間、およびＴＣｂｌＲのダウンレギュレーションの間の転写速度を、培養物中の細胞株から単離した核の核流出アッセイによって決定した。このシステムにより、培養条件、および他の要因（例えば、充分なＢ１２もしくはＢ１２の不足、またはＴＣｂｌＲ合成に影響を与える可能性がある培養培地中のＴＣ−Ｃｂｌ濃度）の影響を評価することができる。定常状態では、転写速度だけまたはｍＲＮＡの分解速度だけが決定される必要があった。なぜならこれらは等しくなければならないからである。しかし、受容体のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの間の両方のパラメーターの分析により、受容体の発現に先行し得る転写および翻訳事象に関するさらなる情報が提供され、これは、２つのプロセスのうちのどちらがＴＣｂｌＲの発現における任意の変化を開始させるかを示していた。ｍＲＮＡの回転率を計算するための積分運動方程式を使用する数学的分析は、Ｈｏｒｒｏｌｄら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８：２８１−２９２，１９９１）によって提供されており、定常状態のデータの分析のための積分運動方程式は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｕｒｅ，２４０：１０２−１０４，１９７２）によって提供されている。
ｍＲＮＡの分解を測定するための標準的なプロトコールは、アクチノマイシンＤまたは５，６ジクロロ１−β−リボフロノシルベンズイミダゾールで転写をブロックすることであり、このようにして、全細胞ＲＮＡのノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの消滅速度が測定される。リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、細胞内のｍＲＮＡを定量した。この方法は迅速であり、これによりノーザンブロッティングよりも良好なｍＲＮＡの定量が得られた。
得られた情報はＴＣｂｌＲ遺伝子に特有であり、これは、この遺伝子の構造および機能の理解に不可欠な構成要素であった。
（実施例３）
ヒト組織の中でのトランスコバラミン受容体の発現の特性決定
ＴＣｂｌＲに対する遺伝子プローブおよび抗血清を利用できることにより、それぞれ、インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学により、組織切片の中のＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の直接の同定が容易になった。
両方の手順のための技術は充分に確立されている。ＴＣｂｌＲに特異的なポリクローナル抗血清はＲ＆Ｄ Ｓｙｅｔｅｍｓ（ヤギ抗ヒト８Ｄ６ポリクローナル抗体；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＴＣｂｌＲに対するポリクローナル抗血清は、図１８に示すように免疫組織化学的分析において充分に反応した。ＮＩＨ ＩＭＡＧＥソフトウェアとホスホル−イメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒ）を使用して、組織切片の中のオートラジオグラフのシグナル、または蛍光シグナルの強度を定量した。
これらの分析のための組織は、組織アレイについての商業的な供給元から入手した。なぜなら、これらは、管理された条件下で回収され、特異的マーカーを使用して、タンパク質およびｍＲＮＡの完全性について試験されているからである。正常な組織と腫瘍組織の中の組織マイクロアレイの有用性は充分に実証されている。インサイチュハイブリダイゼーションと免疫組織化学的実験により、正常な組織の対応物と比較して、様々な腫瘍の中でのＴＣｂｌＲの発現のレベルを決定した。この分析により、様々な組織の中でのＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡおよびタンパク質のベースラインの発現を確立し、そしてＣｂｌ枯渇ストラテジーまたはＴＣｂｌＲ経路を介する薬物の標的化のための可能性のある候補として、ＴＣｂｌＲを過剰発現する腫瘍を同定した。これらの実験により、さらに、正常な細胞とガン細胞の中での細胞の複製に関係している構造エレメント、および正常な細胞とガン細胞の中での細胞の複製とのＴＣｂｌＲ遺伝子発現の関係を同定した。
（実施例４）
トランスコバラミン受容体タンパク質の特性決定
以下の実験により、受容体タンパク質の合成、転座、機能、および崩壊（ｆａｔｅ）に関する情報がもたらされた。
ＴＣ受容体の特性について報告する実験は、これまでのところＴＣ−Ｃｂｌの結合と取り込みに基づいている。ＴＣｂｌＲタンパク質のこの間接的な測定は、このタンパク質についての重要な機能を定義したが、この受容体の合成、転座、および崩壊、細胞周期の増殖期の間のその発現、ならびに分裂していない細胞におけるそのダウンレギュレーションは依然憶測に過ぎなかった。
ＴＣｂｌＲの合成速度
事前の実験により、ＴＣ−ＣＢｌの結合を、トリプシンまたはＥＧＴＡで処理したＫ５６２細胞の中で、４℃で１時間決定した。トリプシンで処理した細胞は、ＥＧＴＡで処理した細胞よりも少ない受容体を有していた（これにより表面受容体の測定がもたらされた）（データは示さない）。しかし、細胞表面上の新しい受容体の出現速度は、いずれの試料においても同様であった。これらの事前の実験によっては、ＴＣｂｌＲの発現の測定と、細胞表面上の新しい受容体の出現速度が提供された。
これらの実験を、［３５Ｓ］メチオニンでの発生期のＴＣｂｌＲのパルス追跡標識によって拡張し、ＴＣｂｌＲの合成速度を決定した。培養物中の細胞を、最初に、メチオニンを含まない培地の中でのインキュベーションによって内因性のメチオニンを枯渇させた。その後、［３５Ｓ］メチオニンを培養物に添加し、インキュベーションを３７℃でさらに６０分間継続し、続いて、未標識のメチオニンを含む完全培地を添加した。様々な時間の間隔で、細胞のアリコートを取り出し、洗浄し、ＣＨＡＰＳＯ界面活性剤の中で可溶化させた。可溶性画分を、ＴＣｂｌＲに対する抗血清とともにインキュベートして、［３５Ｓ］メチオニンで標識されたタンパク質を免疫沈降させ、これをその後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって分析した。細胞の別のアリコートをトリプシンで処理して、表面に結合したタンパク質を除去し、その後、細胞ペレットを上記のように分析した。２つの細胞のアリコートの中のＴＣｂｌＲ量の差により、細胞表面上のＴＣｂｌＲの測定が提供された。タンパク質合成を阻害するためにシクロヘキシミドの存在下で細胞を培養すること、その後、［３５Ｓ］メチオニンで標識されたタンパク質の減少を経時的に定量することにより、受容体タンパク質の分解速度または回転率が示された。
ＴＣｂｌＲの発現の採用周期関連性
ＴＣｂｌＲタンパク質はかなりグリコシル化されており、炭水化物が質量のほぼ５０％を占めており、したがって、血漿膜に対して標的化させられる前に、ＥＲおよびゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）を通じてプロセシングされなければならないことが明らかである。細胞周期の間のＴＣｂｌＲの発現を、放射標識したＴＣを使用して試験した。細胞表面上の受容体の出現は、細胞の倍化時間に応じて培養物中で最初の１２〜３０時間の間に増加し、ピークに達した。受容体は、細胞密度が増大するに伴って減少し、培養物中の分裂している細胞の割合は減少し、コンフルエントな培養物中の細胞あたり２００個未満の機能性受容体を有していた。これは、培養物中のＫ５６２およびＨＬ−６０細胞を使用して、細胞を［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ−ＴＣとともにインキュベートすることによって決定した（図１１）。
受容体の発現を細胞周期の正確な時期と関係付けるために、細胞を、ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに対する抗体、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた二次抗体を使用して、細胞表面ＴＣｂｌＲの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。細胞をエタノール中に固定させ、ヨウ化プロピジウムとともにインキュベートしてＤＮＡを染色した。ヨウ化プロピジウムはまたＲＮＡも染色することができるので、細胞をＲＮａｓｅで処理して内因性のＲＮＡを分解させた。これらの細胞のフローサイトメトリー分析により、細胞周期の様々な時期にある細胞を選別し、これらの細胞の中の受容体密度を、これらの細胞と会合したＦＩＴＣ蛍光によって定量した。これらの実験のために、細胞を、培養物中への播種の後の様々な時間の間隔で回収し、フローサイトメトリーを行った。この分析により、細胞の混合集団の中のＴＣｂｌＲを発現している細胞を同定し、ＴＣｂｌＲの発現が最も高い場合には、これらの細胞が存在している細胞周期の時期も正確に特定した。サイクリン特異的抗体での二重標識によって、細胞周期とのＴＣｂｌＲの関連性をさらに同定した。
細胞周期を、５−ブロモ−デオキシウリジンの存在下、および細胞周期の特異的阻害因子の存在下で細胞を培養することによって同調させて、ＴＣｂｌＲの発現に対するこれらの操作の影響を評価した。この実験ストラテジーを、Ｃｂｌまたは蛍光Ｃｂｌ化合物に結合させた化学療法薬および造影剤の標的化された送達に適しているガンを同定するために培養物中の様々な真性物細胞株に、ならびに、Ｃｂｌの細胞による取り込みを阻害し細胞増殖をブロックするためのＴＣｂｌＲの直接的な操作にまで拡張した。
ＴＣｂｌＲの発現を調製しているものについては多くは知られていない。例えば、細胞内Ｃｂｌ濃度または細胞外ＴＣ−ＣｂｌがＴＣｂｌＲの発現を調節するためのフィードバックシグナル伝達を提供するかどうか、あるいは、細胞周期のシグナル伝達分子がＴＣｂｌＲの発現を調節するための不可欠なシグナルを提供するかどうかは明らかではない。細胞中のＴＣｂｌＲの［３５Ｓ］メチオニン標識を用いた本明細書中に記載した実験、または抗体標識を用いた細胞表面上の受容体の定量により、ＴＣｂｌＲの発現における細胞内または内因性因子の役割を評価することが可能となった。
ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインさらには細胞内ドメインの中には、可能性のあるリン酸化部位が複数存在する。細胞外膜キナーゼまたは細胞内サイクリン依存性キナーゼは、ＴＣ−Ｃｂｌの取り込みの調節に関係している可能性がある。他のシグナル伝達事象がこのプロセスを調節しているかどうか、またはこのプロセスがシグナル伝達分子の発現を制御しているかどうかを、培養条件を操作することによって評価した。シグナル伝達におけるＴＣｂｌＲの関与を裏付ける証拠は、抗ＴＣｂｌＲ抗体が、樹状細胞と一緒に培養された場合に胚芽中心Ｂ細胞の増殖をブロックすることが示された実験により得られた。樹状細胞によるシグナル伝達がこのプロセスには必要であった。同様の効果が、バーキットリンパ腫Ｌ３０５５細胞を、濾胞性樹状細胞ＨＬおよびＴＣｂｌＲに対する抗体（ＨＫ細胞によるシグナル伝達をブロックすることが明らかである）とともに培養した場合に観察された。ＴＣｂｌＲをブロックすることによるシグナル分子の阻害、またはブロックされたＴＣｂｌＲが原因である細胞内Ｃｂｌの不足が、樹状細胞によるシグナル伝達の欠落に寄与しているかどうか、あるいはＢ細胞の増殖の阻害に直接寄与しているかどうかは、これらの実験からは明らかではない。実際にシグナル伝達事象とサイトカインの放出における役割がＴＣｂｌＲについて明らかにされれば、ＴＣｂｌＲをブロックすることによりガン細胞を阻害するためのストラテジーは、細胞内Ｃｂｌを枯渇させることと組み合わせてさらに有効であり得る。
ＴＣ−Ｃｂｌの結合、インターナライゼーション、および配置
ＴＣ受容体はＬＤＬ受容体様タンパク質のファミリーに属し、リガンドの取り込みおよび配置についてこれらの受容体の多くと同様の特性を有するようである。これらの受容体の多くは十分に特性決定されており、十分に試験された技術を用いたＴＣ受容体の本発明者らの実験を形にするための基本的なフレームワークを提供する。
細胞へのＣｂｌの取り込みについてのこれまでの理解は、細胞への放射標識されたＴＣの取り込みの測定、またはＴＣ−Ｃｂｌを含むラテックスビーズの結合によるいくつかの実験によって導かれた。これらの実験により、ＴＣ−Ｃｂｌの取り込みのための膜受容体の存在についての証拠が提供された。しかし、ＴＣ−Ｃｂｌの取り込み、ならびにリガンドの取り込みおよび配置のプロセスにおけるこの受容体の運命（ｆａｔｅ）を調節する因子であるこの受容体の構造的ならびに機能的決定要因は知られていない。ＴＣｂｌＲをコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、ならびにこのタンパク質に対するポリクローナル抗血清を利用できることにより、このタンパク質の合成、プロセシング、および回転率を詳細に直接試験するためのツールと、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスによるＣｂｌの取り込みを媒介するプロセスが提供される。
（実施例５）
トランスコバラミン受容体に対するトランスコバラミン−コバラミン結合の特性決定
ＴＣｂｌＲに対するＴＣ−Ｃｂｌ結合の特性決定
ｈｏｌｏタンパク質として（例えば、ＴＣ−Ｃｂｌ）、およびａｐｏタンパク質としてのＴＣに対するＴＣｂｌＲの結合親和性についての情報はほとんどない。これまでの実験は、方法論の限界に苦しみ、そして結合実験において使用したａｐｏＴＣおよびｈｏｌｏＴＣの試算に頼っていた。ａｐｏＴＣが血漿ＴＣの８０％以下を占める生理学的条件下での、受容体に対するａｐｏＴＣの２倍低い親和性についての以前の報告に基づくと、このシステムは、細胞へのＣｂｌの輸送には極めて不十分であった。以前の結果についての１つの説明は、これらの実験ではａｐｏＴＣの供給源として血清が使用され、結果が、内因性のｈｏｌｏＴＣにより影響を受けた可能性があることであり得る。補正が行われてもなお、試料中のｈｏｌｏＴＣの試算は、ｈｏｌｏＴＣについての直接のアッセイを利用することができないので、正確ではない可能性がある。
ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合をさらに特性決定するために、精製したＴＣｂｌＲと組み換え体ＴＣを使用してこれらの実験を繰り返した。図１２に示すように、ｈｏｌｏＴＣおよびａｐｏＴＣの親和性には２８倍の差があった。この差は、ｈｏｌｏＴＣの優先的な結合および取り込みを可能にするには十分である。
ＴＣｂｌＲの組み換え体細胞外ドメインを使用した実験は、ｈｏｌｏＴＣに対して同様の特異性を示し、これは、血漿膜中の完全なタンパク質またはその自然な方向は、リガンドの結合には必要ないことを示していた。しかし、グリコシル化は、マウスの骨髄腫ＮＳＯ細胞の中で生産された機能性の細胞外ドメインが完全にグリコシル化されているので、不可欠である可能性があった。精製したＴＣｂｌＲ、ならびに組み換え体細胞外断片の結合を決定した。完全なタンパク質は、コムギ胚芽ならびにｃｏｎＡレクチンの両方に結合したが、細胞外断片は、Ｎアセチルグルコサミンを含むＮ結合オリゴ糖に特異性を有しているコムギ胚芽にしか結合せず、シアル酸残基にはより少ない程度に結合した。これらの結果は、ＣｏｎＡの結合が、膜とＴＣｂｌＲの細胞質ドメインに限定されること、したがって、この領域には、連結されたマンノース残基を有しているコアオリゴ糖が含まれることを示していた。
ＴＣ−Ｃｂｌ結合に必要なＴＣｂｌＲの構造エレメントをさらに定義するために、以下の実験を行った：
ｉ）ＴＣｂｌＲの細胞外断片を、先に記載したようにノイラミニダーゼおよびエンドグリコシダーゼで脱グリコシル化させ、ＴＣ−Ｃｂｌ結合について試験した。図１３に示すように、このタンパク質の短い断片もまた試験した。これらの断片をＨＰＬＣによって分離させ、ＴＣ−Ｃｂｌ結合について試験した。断片は、高い親和性では結合しないが、結合に必要なペプチドの一部を含んでいる可能性があった。これを、ＴＣｂｌＲに対するＴＣ−Ｃｂｌの結合の阻害について、１０倍、１００倍、および１０００倍のモル過剰量の断片、あるいはこれらの混合物を競合させることによって試験した。結合に関与しているペプチド配列の最も短い領域のさらなる同定を、結合アッセイにおいてより短い重複している合成のペプチドを競合させることによって予想した。
ｉｉ）別のアプローチは、ｈｏｌｏＴＣとＴＣｂｌＲの複合体を形成させ、この複合体を１つ以上の架橋化合物と架橋させ、トリプシンで消化し、そしてＬＣ−ＭＳによってトリプシン断片を分析することである。架橋されたペプチドは作成された配列データから同定した。このアプローチの利点は、タンパク質の立体構造に起因する複数の相互作用部位が同定されることである。
これらの技術を、ＴＣの受容体結合ドメインを同定するために適用した。この場合、本発明者らは、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合をブロックする、ＴＣに対するエピトープ特異的モノクローナル抗体を使用した。ＴＣｂｌＲへの結合に関与している可能性がある領域を含むヒトＴＣの構造模式図を図１４に示す。ヒトＴＣｂｌＲの細胞外ドメインについて予想した構造（ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ予測）もまた図１４に示す。上記実験により、ＴＣ−Ｃｂｌが受容体にドッキングする（ｄｏｃｋ ｉｎｔｏ）方法、およびどの領域がこの相互作用に重要であるかを説明するための情報が提供された。この情報を、中和ペプチドの設計、およびＴＣ−Ｃｂｌの結合をブロックするｍＡｂの作成に使用した。
（実施例６）
トランスコバラミンおよびトランスコバラミン受容体の細胞による取り込みの特性決定
放射標識したＴＣおよびＴＣｂｌＲを使用して、細胞へのＣｂｌの取り込みのプロセスにおけるこれらの２つのタンパク質の運命をモニターした。ヨウ素化したタンパク質の使用は、ハロゲナーゼがこのタンパク質をモニターすることを難しくすることが原因でヨウ素が失われるので、不適切である。３５Ｓ−Ｍｅｔ標識したＴＣを、ｒｈＴＣを得るために使用したバキュロウイルスシステムにおいて作成した（Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｅ．Ｖ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８１：１２３９−４５，１９９３）。組み換え体ウイルスで昆虫細胞を感染させた４８時間後に培養培地を交換することにより、わずか２〜４時間で、適切な量の３５Ｓ−ｍｅｔで標識されたＴＣが得られた。放射標識された細胞性タンパク質を、３５Ｓ−ｍｅｔの中で細胞を培養することによって使用した。細胞性タンパク質（特に、ＴＣｂｌＲ）の放射標識は、細胞の生存性を損なうことのないメチオニンを含まない培地の中で細胞の生存期間を長くし、その後、放射標識したメチオニンの量と取り込み期間を最適化することによって、最適化させた。
以下のＴＣ−Ｃｂｌのインターナライゼーションの経路については、３５Ｓ−ｍｅｔ−ＴＣをＣｂｌで飽和させ、Ｋ５６２細胞とともに、３７℃で３０分、６０分、１２０分、および２４０分間インキュベートした。それぞれの時点で細胞を回収し、洗浄し、そして、細胞の外側に結合したＴＣ（ＥＴＧＡで切り離すことができる）、膜に結合したＴＣ（血漿膜および界面活性剤で可溶化させることができる他の細胞膜）、および可溶性の成分を免疫沈降によって決定した。免疫沈降した放射活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、なおも抗体に結合している完全なタンパク質と分解した断片を同定した。これによりＴＣの結合、取り込み、インターナライゼーション、分解、ならびに細胞の中でのＣｂｌの放出についての経時変化が提供された。氷上で維持した同じアリコートを対照とした。
ＴＣｂｌＲの運命をモニターするために、リガンドとして未標識のＴＣ−Ｃｂｌを使用したこと、および受容体タンパク質を免疫沈降させるために抗ＴＣｂｌＲ抗体を使用したことを除き、同じ時間経過およびプロトコールにしたがった。完全な細胞からトリプシンで切り離すことができるＴＣｂｌＲは、細胞の外側に結合したＴＣｂｌＲを示し、膜に結合した放射活性は、ＥＲ、ゴルジ、およびリソソームが原因であった。
同時に行った実験においては、３５Ｓ−Ｍｅｔ標識に加えて、完全な細胞をビオチンで標識して、細胞表面タンパク質をビオチニル化させた。細胞を上記のように分析して、３５Ｓ−ＴＣｂｌＲ（抗ＴＣｂｌＲ Ａｂに対する結合によって）と、このビオチニル化された画分（アビジンに対する結合によって）を決定した。この分析によっては、４時間（または必要に応じて、さらに長い）の時間的経過の間に、ビオチン−ＴＣｂｌＲが、細胞表面上では減少し、細胞内構成成分の中に出現し、そして細胞表面上に再度現れる、受容体の再利用についての提供がもたらされた。
受容体の再利用、グリコシル化、およびリソソームプロセシングの阻害因子を使用して、血漿膜に対するＴＣｂｌＲの移動、さらにはインターナライゼーションおよび再利用の経路を特定した。例えば、リソソーム向性化合物（例えば、メチルアミンおよびクロロキン）とともに細胞をインキュベートすることは、ＴＣｂｌＲがリソソームの中でプロセシングされて、ＴＣが分解され、Ｃｂｌが遊離させられる場合を示す。カルシウムイオノフォアであるモネンチン（ｍｏｎｅｎｃｉｎ）は、ゴルジからのタンパク質の放出をブロックし、受容体の再利用に影響を及ぼす。タンパク質イオノフォア活性を有しているスルホンアミドはＡＴＰの加水分解を阻害し、エンドソームおよびリソソームのｐＨを上昇させ、受容体の再利用に影響を及ぼす。カルシウム依存性酵素およびリン脂質依存性Ｃキナーゼの阻害因子であるトリフルオピペザリン（ｔｒｉｆｌｕｏｐｉｐｅｚａｒｉｎｅ）は、エンドサイトーシスと再利用の両方の阻害因子である。細胞内および細胞外の両方でのタンパク質輸送経路を定義するためにこれらの化合物を使用することは十分に記載されており、細胞へのＣｂｌの取り込みのためのＴＤ ＴＣｂｌＲ経路を定義するために利用されるであろう。
タンパク質のリン酸化もまた受容体の再利用に関与している。ＴＣｂｌＲの一次構造についてのこれまでの分析により、可能性のあるリン酸化部位が示唆された。サイクリン依存性キナーゼによるシグナル伝達は、リガンドの結合、インターナライゼーション、およびダウンレギュレーションに関して研究された。免疫組織化学分析の適用により、生化学実験を補った。
これらの実験により、ＴＣｂｌＲの合成経路、移動、リガンド結合、およびリガンドのインターナライゼーション後の受容体の運命を描き、それにより、ＴＣ−Ｃｂｌの取り込みをブロックするか、または薬物、放射性同位元素、もしくは造影剤化合物を腫瘍に送達するかのいずれかのためにこの受容体を利用することにおいて不可欠な情報がもたらされた。
（実施例７）
ｓｉＲＮＡを使用したトランスコバラミン受容体の発現の阻害の効果
Ｂ１２欠乏症は、脊髄、末梢神経障害、およびＣＮＳの異常の亜急性連合変性症の形態である、巨赤芽球性貧血および神経障害にいたる。血液学的異常は葉酸欠乏症のものと同様であり、これは、ＤＮＡ合成に葉酸が必要であること、そしてＢ１２欠乏症において葉酸メチルが捕捉されることに基づいて説明することができる。しかし、Ｂ１２欠乏症の神経病理学的変化についての生化学的理由は、依然謎である。なぜなら、Ｂ１２欠乏症を生じさせることは、培養物中、および動物モデルのいずれにおいても難しいからであろう。ＴＣｂｌＲ遺伝子のノックアウトにより、Ｂ１２欠乏症の効果を不活性である細胞へのＢ１２の輸送のための唯一の経路によって迅速に生じさせることができる、細胞と動物モデルが得られた。これによってはまた、胚発生（特に、神経系）に対するこの遺伝子のノックアウトの影響についての実験も可能となった。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用するＴＣｂｌＲ遺伝子の不活化
ｓｉＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による遺伝子のサイレンシングは、特に細胞培養システムの中で、不活化のために特異的な遺伝子を標的化することにおいて有効であることが証明された。このシステムの利点は、これが様々な細胞型において１つの遺伝子を不活化させることの効果を実験するために様々な培養条件下で行われることである。加えて、適切な発現ベクターを設計することにより、ｓｉＲＮＡを、特異的遺伝子をサイレンシングするためにマウスに導入した。これは、胚性致死であり、救うことのできない遺伝子ノックアウトの場合に特に有用である。このアプローチにおいては、二本鎖のＲＮＡｉを、細胞に導入するかまたは、配列の複数のコピーを生じさせるように誘導することができるプラスミドを導入することによって、インサイチュで作成した。これを、その後、ｓｉＲＮＡと同定したさらに小さい２１〜２３ｎｔのｄｓＲＮＡになるように、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）酵素によって処理した。ｓｉＲＮＡは、分解のために相補性ｍＲＮＡを標的化する多成分ヌクレアーゼ複合体の中のガイド配列としての役割を果たす。
ヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）のＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡについて予想したステム−ループ構造を、可能性のある標的領域に対するオリゴヌクレオチドとともに、図１５に示す。ＧＣ含有量と、それぞれのゲノムの中の他の遺伝子配列と有意な相同性がないことに基づいて、ｍＲＮＡの５’領域をｓｉＲＮＡ標的化のために選択した。合成の二本鎖ｓｉＲＮＡ（これは、インビボでのそれらの安定性を最適化させるように修飾した）を、エレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって細胞に導入し、ＴＣｂｌＲの発現をブロックするそれらの能力について試験した。これらの発現により、本発明者らの実験についての最良の候補ｓｉＲＮＡを同定した。このｓｉＲＮＡのスクランブル配列を、これらの実験の対照とした。
最も可能性があるｓｉＲＮＡをアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ−ｓｉＲＮＡ）の中に組み込んだ。最初に、ｓｉＲＮＡをサイレンサー１．０−Ｕ６の中にクローニングした。ここでは、Ｕ６プロモーターによってｓｉＲＮＡの発現が制御される。この構築物をＡＡＶベクタープラスミドｐＸＸ−ＵＦ（１３６）にクローニングした。ＴＣｂｌＲ ｓｉＲＮＡ（ｒＡＡＶ−ｓｉＲＮＡ）を含む組み換え体アデノウイルスを得るために、サブコンフルエントな２９３細胞を、ｐＸＸ−Ｕ６−ＴＣｂｌＲｓｉＲＮＡとＡＡＶへルパープラスミドｐＡＣＧ２−１で同時トランスフェクトした。その後、細胞をアデノウイルスＡｄ５ｄｌ３１２（Ｅ１Ａ変異体）に、２のＭＯＩで感染させ、この感染を６０〜７２時間進行させた。細胞を回収し、凍結／解凍サイクルによって溶解させ、溶解物中のＤＮＡをベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（２５０Ｕ／ｍｌ）で３７℃で１０分間消化し、そして細胞の破片を、１５００ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。細胞溶解物について、硫酸アンモニム分画、続いて、２回の連続する連続的ＣｓＣｌ勾配遠心分離を行った。ｒＡＡＶを含む画分をプールし、滅菌のＰＢＳに対して透析し、５６℃で４５分間熱処理し、そして−８０℃で保存した。
細胞培養物中でのｓｉＲＮＡの実験
これらの実験の目的は、様々な新生物細胞に対するＴＣｂｌＲ遺伝子のサイレンシングの影響を評価すること、および培養物中の細胞に対する影響を評価することであった。ｒＡＡＶ感染を使用することの１つの利点は、特に、遺伝子のノックアウトが致死性であり得る場合に、細胞をウイルスとともに維持して、より長い期間にわたってｓｉＲＮＡを生じさせて、代謝的および構造的変化を誘導できることである。これらの実験のためのストラテジーは、細胞内でのＴＣｂｌＲとｍＲＮＡの発現を、培養培地中のＭＭＡレベルおよびＨＣＹのレベル（これらの２つの代謝物は、細胞内Ｃｂｌが欠乏すると上昇すると予想した）とともにモニターすること、そして、培養物中での悪性細胞の増殖に対する影響を観察することである。このアプローチにより、ＴＣｂｌＲ遺伝子のサイレンシングに対して最も感受性があるものを同定するための多数の細胞株の試験が可能となる。神経細胞、グリア細胞、およびＳｃｈｗａｎｎ細胞の場合には、Ｃｂｌ欠乏症の指標である代謝的および形態学的変化を決定した。これらには、接続を行う神経細胞の能力、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎで刺激されるとミエリンを作成するＳｃｈｗａｎｎ細胞の能力が含まれる。
マウスの中でのｓｉＲＮＡの実験
ＴＣｂｌＲは全ての組織の中で発現されているので、様々な臓器および血管系の中での長期にわたるＴＣｂｌＲの阻害についての全身的な影響を、ｒＡＡＶ−ＴＣｂｌＲの静脈内投与によって試験した。胚発生に対するこのｓｉＲＮＡの影響は、ｒＡＡＶ−ＴＣｂｌＲを、妊娠前および妊娠後の両方のマウスに投与することによって試験した。血清ＨＣＹ、ＭＭＡ、ＴＣｂｌＲタンパク質およびｍＲＮＡを、細胞内Ｃｂｌ欠乏症およびＴＣｂｌＲの不活化の指標としてモニターした。これらのマウスおよび胎児に由来する組織を、構造変化について評価した。実際にＣｂｌが胚発生に不可欠な受容体であれば、ノックダウンにより、Ｂ１２欠乏症と同じ大きさの神経病理学的変化が生じるであろう。
（実施例８）
トランスコバラミン受容体ノックアウトマウスの作成
近年、遺伝子の不活化が、細胞レベルで、または生物体全体のいずれにおいても、特異的遺伝子の機能とその悪影響を特定するための強力なモデルであることが証明された。ＴＣｂｌＲ遺伝子のノックアウトにより、最初に、動物モデルにおいてＢ１２欠乏症の神経学的異常ならびに血液学的異常を迅速に生じるモデルを得た。
ＴＣｂｌＲ遺伝子のマウスホモログをクローニングし、１７番染色体上の遺伝子座を同定した。マウスＴＣｂｌＲ遺伝子の構造が定義されており、ゲノムクローン、ならびにＴＣｂｌＲ領域に広がるＢＡＣクローンを利用できる。マウスＴＣｂｌＲ遺伝子の構造を図１６に示す。マウスＴＣｂｌＲ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号３に提供する。
胚性幹細胞への挿入のための遺伝子標的化ベクターの構築
マウスＴＣｂｌＲゲノムクローンを使用して、置換遺伝子標的化ベクターを構築した。遺伝子の５’末端から０．９ｋｂの断片をＤｒａＩＩＩとＭｌｕＩでの消化によって切り出し、アガロースゲル中での電気泳動によって単離した。この遺伝子の３’末端から１．６ｋｂの別の断片をＥｃｏＲＩでゲノムクローンを消化することによって生じさせ、単離した。これらの断片はまた、ゲノムクローンからＰＣＲによって作成することもできる。このストラテジーにより、プライマーの中に特異的制限酵素部位を含めることが可能となり、結果として、特異的部位を、必要に応じてベクターへの挿入のために作成することができた。これらの断片を標的プラスミドｐＫＯにクローニングし、その後、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＫＯｓｅｌｅｃｔＮｅｏベクター）とネガティブ選択マーカーであるジフテリア（ｄｉｐｔｈｒｉａ）毒素Ａ鎖遺伝子（ｐＫＯｓｅｌｅｃｔＤＴベクター）を挿入した。最終的な構築物の模式図を図１７に示す。
直鎖状にした標的構築物を、エレクトロポレーションによって１２９／ｓｖｅｖ ＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８を含む培養物の中で増殖させて、ネオマイシン耐性について選択した。耐性クローンを、低温保存および分析用のＤＮＡの抽出のために選択した。これらの細胞から単離したゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、マウス遺伝子のエキソン１と２に対応するｃＤＮＡ断片をプローブとして使用してサザンブロッティングによって分析して、相同組み換えを同定した。これらの結果を、ネオマイシン遺伝子の５’側にあるマウスの配列と、ネオマイシン遺伝子の中の配列に対応する正方向プライマーと逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲによってさらに確認した。これにより、マウスＥＳ細胞のＴＣｂｌＲ遺伝子の遺伝子座への標的ベクターの挿入を確認した。
キメラマウスの作成とＴＣｂｌＲ変異体対立遺伝子の生殖細胞系列による伝達
１つのＴＣｂｌＲ変異体対立遺伝子を含むＥＳ細胞（ＴＣｂｌＲ＋／−）を、３．５日齢のＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射し、擬似妊娠させたＣＤ１マウスの子宮に外科手術によって入れて、アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）マウスを作成した。これらの動物を交配させて、ＴＣｂｌＲ変異体対立遺伝子についてヘテロ接合型であるマウスを作成した。変異体対立遺伝子および正常な対立遺伝子の存在を、ＴＣｂｌＲ遺伝子中の正方向プライマーと逆方向プライマーを使用し、逆方向プライマーがＮｅｏ遺伝子に対して作成された第２のプライマーのセットを使用して、これらのマウスに由来するゲノムＤＮＡのリアルタイムＰＣＲによって確認した。Ｆ１ヘテロ接合型を、Ｆ２ホモ接合型の子孫を作成するために交配させた。ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ、サザンブロッティング、続いて制限酵素での消化によって分析し、選択した組織に由来するＲＮＡについて、複数のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行って、野生型、ヘテロ接合型、およびホモ接合型マウスを区別した。
ＴＣｂｌＲ遺伝子の欠失の影響
Ｂ１２の生物学的機能と、葉酸の再利用におけるその役割に基づくと、遺伝子ノックアウトが胚に対して致死性であり得る可能性は高い。しかし、胚性致死が起こらない可能性もある。なぜなら、メガリン（ＴＣ−Ｃｂｌ結合タンパク質）が、ＴＣｂｌＲが存在しない条件において、代用受容体として作用する場合があるからである。メガリンは、発生の初期段階の間に胚の中で発現される。胚は移植すること、および増殖させることができないはずであるので、マウスをＢ１２を薬学的に投与して維持した。このアプローチでは、正常な細胞内Ｂ１２を維持するために、拡散と飲作用によって適切なＢ１２を提供した。このストラテジーを裏付ける証拠は、Ｂ１２の薬理学的投与に応答する先天性ＴＣ欠乏症の患者から得られた。
これらの実験により、胚発生（特に、神経系）に対するＢ１２の枯渇の効果が確立された。神経管欠損妊娠を有している女性、および脳葉酸欠乏症候群の小児における、葉酸受容体に対する自己抗体の最近の観察によっては、胚発生の初期、および幼児期の間の葉酸の重要な役割が示唆された。Ｂ１２欠乏症は葉酸の状態に間接的に影響を及ぼす。しかし、胚発生に対してＢ１２欠乏症の直接の効果があるかはわかっていない。実際にＴＣｂｌＲ遺伝子のノックアウトが致死性であれば、１）葉酸、２）葉酸＋Ｂ１２、３）Ｂ１２だけの薬理学的用量の上で、および４）ビタミンを補充しないで維持したホモ接合型マウスをこのプロトコールに含めて、胚発生と神経系の発達に対するＴＣｂｌＲノックアウトの影響を実験した。葉酸だけを与えたマウスは、Ｂ１２の不足が原因で異常性を顕すと予想した。葉酸とＢ１２を与えたマウスは正常でなければならず、Ｂ１２だけを与えたマウスも正常でなければならず、いずれのビタミンも与えなかったマウスは、両方のビタミンの複合的欠乏症が原因で異常性を示すはずであった。胚を、構造的異常性について形態学的、さらには組織学的に試験した。うまく救うことができた胎児については、Ｃｂｌ欠乏症を段階的に生じさせるように、救助物質（ｒｅｓｃｕｉｎｇ ａｇｅｎｔ）で続けて治療した。
これらの実験によってはまた、生後の同腹子におけるＢ１２欠乏症の影響も評価した。上記の４つのグループに由来する子供（ｐｕｐｓ）を、薬理学的ビタミンを全く補充せずに飼育し、成長および行動の変化についてモニターした。子供を、Ｂ１２、葉酸、ＭＭＡ、ＨＣＹ、およびＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡレベルについてアッセイするため、そして様々な組織の中での形態学的および構造的変化を試験するために、様々な時点で屠殺した。時点および実験期間は、これまでの知見から決定した。
いずれの救済ストラテジーもうまくいかないはずであり、組織特異的ノックアウトＣｒｅ／Ｌｏｘリコンビナーゼシステムを使用して、骨髄の中、およびＣＮＳの中（Ｂ１２欠乏症の影響が最も顕著に現れる２つの組織）でのこの受容体の役割を実験した。
これらの実験により、Ｂ１２欠乏障害の病因におけるＢ１２に役割についての知見が得られた。これらの実験により、細胞レベルで、さらには動物全体において、Ｃｂｌ欠乏症の影響を評価した。これらの実験により、Ｃｂｌ欠乏症の代謝的、機能的、および構造的異常を評価することができる動物モデルが得られた。
（実施例９）
抗体をブロックするトランスコバラミン受容体の作成と特性決定
ＴＣｂｌＲの細胞外（ＥＸＣ）ドメインをＮＳＯ骨髄腫細胞の中で発現させた。ＥＸＣのアミノ酸配列を配列番号４に提供する。この組み換えタンパク質を、ヒトＩｇＧのＦｃ領域との分泌型融合タンパク質として生産させ、続いて切断し、精製して、ＥＸＣ断片を生じさせた。ＥＸＣ領域に特異的なポリクローナル抗血清（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヤギ抗ヒト８Ｄ６ポリクローナル抗体；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を使用して、ヒト胎盤から精製したタンパク質の特性の多くを、組み換え体ＥＸＣ断片と直接比較した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、いずれのタンパク質もｈｏｌｏＴＣに対して類似する結合特性を有していた。
胎盤ＴＣｂｌＲのウェスタンブロットは、ＥＸＣ断片に対する抗血清がＴＣｂｌＲと反応し（図７）、そしてこの調製物の中に存在する別のタンパク質バンドのいずれとも反応しないことを示していた（図７Ａを参照のこと）。ＥＸＣ−ＴＣｂｌＲの大きさは、もとの融合タンパク質に由来するアミノ酸のいくつかが切断された断片の中に残っていたので、予想したよりも大きかった。この抗血清は、ａｐｏ受容体を抗体とともに事前にインキュベートした場合には、これが受容体に対するＴＣ−Ｃｂｌの結合をブロックしたという点で、ブロック特性を有していた（図８）。抗血清のブロック特性を利用して、Ｋ５６２細胞の中でのＴＣ−Ｃｂｌの取り込みを試験した。図９に示すように、抗血清は、細胞を１μｇの抗体とともに４℃で１時間プレインキュベートすると、ＴＣ−Ｃｂｌに対する細胞表面受容体に対する結合の９２％をブロックした。これにより、ＴＣ−Ｃｂｌの細胞による取り込みについて、血漿膜上の１つの受容体の存在を確認した。３７℃では、対照細胞の中での結合の増大と、ブロックされた受容体の中での減少によって示されるように、新しい受容体が発現された。
抗ＴＣｂｌＲ ＨｕＭＡｂについての免疫化およびスクリーニング
１回目の免疫化のために、３匹のトランスジェニックマウスに１０μｇのＴＣｂｌＲを注射し、その後、それぞれ５μｇの注射をさらに２回行った。この段階で、マウスを抗ＴＣｂｌＲ抗体について調べ、力価が低ければ、さらに免疫化を行った。マウスには、融合の前にさらに５μｇのＴＣｂｌＲを追加免疫した（ｂｏｏｓｔｅｄ）。ポジティブクローンを、ＴＣについて記載したようにヒトＩｇＧおよび抗ＴＣｂｌＲ抗体をスクリーニングすることによって、ＥＬＩＳＡにより同定した。ＥＬＩＳＡによる最初の２回のスクリーニングの主な目的は、分泌因子でないもの（ｎｏｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒ）を排除することである。上記スクリーニングによるポジティブクローンについて、ＴＣｂｌＲ特異的クローンを同定するために、以下のアッセイによってさらにスクリーニングを行った。
ａ）ＴＣｂｌＲ−ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌの直接の結合：
ハイブリドーマ上清のアリコートを、５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ膜の１０％懸濁液とともに４℃で１５分間インキュベートして膜上の抗体を捕捉し、その後、混入しているタンパク質を除去するために緩衝液で洗浄した。別のチューブの中で、精製したＴＣｂｌＲを、Ｃａ＋＋を含む緩衝液の中でＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌとともにインキュベートして、ＴＣｂｌＲ−ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌを形成させた。ＴＣｂｌＲ−ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌのおよそ５０００ｃｐｍを、ＭＡｂ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ膜を含むチューブに加え、ゆっくりと混合しながら４℃で１時間インキュベートした。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ膜を、１５０００ｒｐｍで１０分間ペレット化させた。ペレット中の放射活性は、ＴＣｂｌＲ−ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ複合体としての、ＭＡｂに結合したＴＣｂｌＲの量を示す。
ｂ）ＴＣｂｌＲの結合によるＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌのブロック
約５０００ｃｐｍの［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ−ＴＣに結合させるために十分な、精製したＴＣｂｌＲのアリコートを、ＭＡｂ−ＴＣｂｌＲ複合体を形成させるために、反応物中の全てのＴＣｂｌＲに結合させるために十分なハイブリドーマ上清のアリコートとともに、２時間インキュベートした。予め形成させたＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ（１０，０００ｃｐｍ）を、ＭＡｂ−ＴＣｂｌＲ複合体を含む反応に加え、さらに１時間インキュベーションを続けた。ＭＡｂ−ＴＣｂｌＲ−ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ膜を使用してＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌから分離させた。平行する対照反応を、１時間（ＭＡｂを含む反応の中でＴＣｂｌＲ−ＴＣ複合体を形成させるために使用したものと同じ時間）インキュベートしたＭＡｂを含めずに構成し、ＣｏｎＡアガロースを使用して停止させた。対照試料（ＣｏｎＡアガロースペレット）と比較した、ＭＡｂを含む試料（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａペレット）中で形成させられたＴＣｂｌＲ−ＴＣ複合体の量の減少は全て、ＭＡｂによるＴＣ−ＣｂｌのＴＣｂｌＲに対する結合のブロックが原因であろう。
これらの２つのスクリーニング試験を、１つのクローンを単離するために、ＴＣｂｌＲ特異的ハイブリドーマを含む全てのウェルを同定するように設計した。一旦クローンが限界稀釈によって単離され、ブロックＭＡｂについてポジティブであると同定されると、さらなる試験を、個々のクローンの特性のブロック特定を確認し、最適な効果に必要なＭＡｂの量を決定するために、培養物中の細胞を使用して行った。
ｃ）ＴＣ−Ｃｂｌの細胞表面受容体に対する結合をブロックするためのＨｕＭＡｂの試験
精製したＭＡｂまたは培養上清を、１０６個のＫ５６２細胞とともに、ＭＡｂについて４℃で１時間インキュベートして、細胞表面上で発現されたＴＣｂｌＲに結合させた。ＴＣ［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ（５０００ｃｐｍ）を添加して、インキュベーションをさらに１時間続けた。細胞を、１０００ｒｏｍで５分間の遠心分離によってペレット状にした。対照細胞と比較した、ＭＡｂとともにインキュベートした細胞の中での放射活性の減少は、ＴＣ−Ｃｂｌの受容体への結合のブロックが原因であり、これにより、ブロック活性の測定が得られた。
ｄ）細胞内Ｃｂｌを枯渇させ、細胞培養物中でアポトーシスを誘導する能力についての抗ＴＣｂｌＲ ＨｕＭＡｂの試験
活発に複製している培養物の中でＴＣ−Ｃｂｌの取り込みを防ぐために必要なＭＡｂの量を決定するために、１０５個のＫ５６２細胞を、３７℃で１ｍｌの最終容量の中に［５７Ｃｏ］Ｃｂｌで飽和させた１０％のＵＳと様々な濃度の精製したＭＡｂを含む１２ウェルプレートの中に構成した。細胞を、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間で回収し、細胞数と、細胞ペレットに付随している放射活性を記録した。
一旦、有効なＭＡｂ濃度が決定されると、さらなる培養を最適なＭＡｂ濃度を用いて構成して、細胞の複製に対するこれらのＭＡｂの影響を実験した。抗ＴＣ ＭＡｂを用いた実験に基づき、増殖を維持し、結果としてアポトーシスを誘導するために必要な臨界濃度よりも低いレベルにまでＣｂｌの細胞内貯蔵量を枯渇させるためには、細胞を、さらに７２〜９６時間、ＭＡｂを含む培地の中で維持しなければならないことを予想した。
これらの手順にしたがって作成したｈｕＭＡｂを使用して、ＴＣｂｌＲが関係している様々な疾患および障害を治療的に処置した（すなわち、ＴＣｂｌＲに対するＴＣの結合をブロックすることにより）か、あるいは、腫瘍細胞を同定するかまたは腫瘍細胞に対して治療薬を標的化させた。
（実施例１０）
ＴＣｂｌＲ ｓｉＲＮＡはトランスコバラミンの取り込みを阻害する
ＴＣｂｌＲに特異的なｓｉＲＮＡのコバラミンの取り込みを阻害する能力を、受容体遺伝子に対して３種類の合成ｓｉＲＮＡ構築物を使用して明らかにした。これらの３つの構築物のそれぞれには、二本鎖ＲＮＡの１つの領域を含め、これには、図１９に示すＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡ配列を含めた。これらのｓｉＲＮＡ分子または対照ｓｉＲＮＡを、ＨＥＫ２９３ヒト腎臓胚性幹細胞に一次的にトランスフェクトし、トランスコバラミンに結合する細胞の能力を、放射標識したトランスコバラミンを使用して決定した。
図２０に示すように、ＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡを標的化する３つのｓｉＲＮＡは全て、細胞表面上で発現された機能性受容体の減少によって示されるように、受容体の発現を効率よくブロックしたが、対照ｓｉＲＮＡは効果がなかった。２ｎｍｏｌ程度の極少量のこれらのｓｉＲＮＡは、ＴＣｂｌＲの発現をブロックすることにおいて７０％よりも大きく有効であった。これらのデータは、ｓｉＲＮＡの一時的トランスフェクションによって得られたが、結果により、ｓｉＲＮＡの他のアプローチ（例えば、インビトロまたはインビボでの送達のためにウイルスベクター（例えば、レンチウイルスおよびアデノウイルス構築物）を使用すること）を、ＴｃｂｌＲ受容体タンパク質のノックダウン、ならびに細胞によるトランスコバラミンの結合および取り込みの減少を生じさせるように代用できることが確立された。
（実施例１１）
組み換え体ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインはトランスコバラミンの取り込みを阻害する
全長の膜ＴＣｂｌＲは、細胞外ドメイン（ＥＸＣ）、膜貫通領域、および細胞質断片からなる。ＴＣ−Ｃｂｌの結合が細胞の外側にある細胞外ドメインに対して起こるので、このドメインは、膜結合ペプチド配列および細胞質ドメインとは無関係に、ＴＣ−Ｃｂｌに結合できると仮説を立てた。受容体ＥＸＣ断片のこの特性により、これを、循環しているＴＣ−Ｃｂｌに結合するための「おとり（ｄｅｃｏｙ）標的」として使用することが可能となる。このストラテジーは、ＴＣに対するモノクローナル抗体、または細胞へのＢ１２の細胞への取り込みをブロックするための受容体を使用することと同様であり、事実上、同様の結果が生じる。
この仮説を試験するために、ＴＣｂｌＲの組み換え体細胞外断片を、ヒト腎臓胚性幹細胞ＨＥＫ２９３の中で生産させた。この生産のために、受容体をコードするｃＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ１とＰｖｕＩＩで切断し、アガロースゲルの中で単離し、精製した。生じたこの断片は、ｃＤＮＡの最初の７４１ヌクレオチドからなり、受容体タンパク質の最初の２４７アミノ酸をコードしていた。これにはまた、培地中への分泌のために、タンパク質を血漿膜に対して向けさせるためのシグナルペプチドも含まれていた。この断片を、Ｋｐｎ１とＥｃｏＲＶで直鎖状にしたｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングした。受容体断片をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌の中で増幅させ、精製した。
この組み換え体プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、培養培地をＴＣ−Ｃｂｌの結合についてアッセイした。ＴＣ−Ｃｂｌの培養培地中のタンパク質に対する結合は、受容体の細胞外断片の合成と、培養培地への受容体の細胞外断片の分泌を示していた。このアッセイによって、これらの細胞によって生産され、分泌された受容体断片が、ｈｏｌｏＴＣ（すなわち、完全な全長の受容体タンパク質の親和性および特異性を有しているＥＸＣに結合したＢ１２を含むＴＣ）に結合した点で機能的であったこともまた確認した。
安定なトランスフェクタントを、抗生物質であるジェネチシンの存在下で細胞を増殖させる、ｐｃＤＮＡプラスミド中の抗生物質耐性遺伝子を利用することによって作成した。
このように、抗生物質耐性について選択したＨＥＫ２９３細胞は、受容体の細胞外断片を安定に発現し、そして分泌した。受容体断片を発現する安定なＨＥＫ２９３細胞クローンを、ジェネチシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させ、７２〜９６時間で培養培地を回収した。培養培地中の受容体タンパク質を２工程の親和性クロマトグラフィー手順によって精製した。最初に、Ｂ１２で飽和させた組み換え体ヒトＴＣを、１〜２リットルの培養培地と混合した。これにより、受容体断片とのＴＣ−Ｃｂｌの結合を生じさせた。
ヒトＴＣに対する精製したモノクローナル抗体を共有結合させたアガロースの形態の中の親和性マトリックスを、その後、添加した。受容体−ＴＣ−Ｃｂｌ複合体を、ＴＣに対する抗体の結合によって親和性マトリックス上に捕捉させた。マトリックスを洗浄し、受容体断片を、０．５ＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液で溶出した。この溶出によってＴＣ−Ｃｂｌから受容体を選択的に解離させ、ＴＣ−Ｃｂｌはなおもモノクローナル抗体に結合したままとした。溶出させた受容体を、結合と、コムギ胚芽アグルチニン−アガロース親和性マトリックスからの溶出によってさらに精製した。この高度にグリコシル化されているタンパク質の炭水化物部分はコムギ胚芽に特異的に結合する。最終産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、およびタンパク質バンドの染色によって判断すると、均一な純度であった（図２１）。精製したタンパク質の実体をウェスタンブロットによってさらに確認し、それにより、抗血清と反応させたタンパク質を、受容体の細胞外断片に対して作成した（図２１）。受容体のこの細胞外断片はｈｏｌｏＴＣ（Ｂ１２で飽和させたＴＣ）に対して、膜に結合した天然の受容体と同じ特異性および親和性で結合した。
コバラミンの取り込みをブロックするＴＣｂｌＲのＥＸＣ断片の能力をインビトロで決定した。Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞を、５７Ｃｏ−Ｂ１２で飽和させた組み換え体ヒトＴＣを含む培地の中で、３７℃でインキュベートした。図２２に示すように、受容体の細胞外断片の１５０倍の過剰濃度では、５７Ｃｏ−Ｂ１２の取り込みは、３時間のインキュベーション時間の全体にわたって完全にブロックされた。１５倍のモル過剰量では、７０％を上回る取り込みが、３時間のインキュベーション時間の全体の間にブロックされた。これらのデータは、組み換え体ＴＣｂｌＲ ＥＸＣ断片をコバラミンの取り込みを阻害するために使用できることを明らかに示している。血液中の正常なＴＣ濃度と、３リットルの血液の総量に基づき、１５０倍の過剰な量の可溶性受容体の濃度が、治療効力を容易に維持できると予想した。
本出願において言及され、そして／またはＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｓｈｅｅｔに列挙される上記の米国特許、米国特許第出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および特許以外の刊行物全ては、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
本発明の特異的実施形態が説明の目的のために本明細書中に記載されているが、様々な改良を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが、上記から明らかであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
銀染色した８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真であり、３段階の精製手順のそれぞれの段階を示す。図１Ａは、最初の親和性精製によって得られたＴＣｂｌＲの３つの別々の調製物（レーン１〜３）を示しており、一番左側のレーンは、分子量マーカーを示している。図１Ｂは、第２段階の精製の間に、抗ＴＣ親和性マトリックスに対して、またはＴＣ−Ｃｂｌ−Ｅｍｐｈａｓｅマトリックスに対して、溶出させたＴＣｂｌＲを再度添加した後の結果を示す。レーン１は、親和性マトリックスに付着したタンパク質を示しており、レーン２は、親和性マトリックスに付着しなかったタンパク質を示している。図１Ｃは、第３段階の親和性精製の間に、ＣｏｎＡアガロースマトリックスへの添加後に回収したタンパク質を示す。トランスコバラミン（ＴＣ）とトランスコバラミン受容体（ＴＣｂｌＲ）に相当するタンパク質を矢印で示した。 光解離によって抗ＴＣ親和性マトリックスから解離させられたヨウ素化タンパク質のオートラジオグラフを示す。レーン１は、１ｍＭのＤＴＴの存在下での光解離の結果を示し、レーン２は、ＤＴＴが存在しない条件下での結果を示す。トランスコバラミン（ＴＣ）とトランスコバラミン受容体（ＴＣｂｌＲ）に相当するタンパク質を矢印で示した。 全長のトランスコバラミン受容体のアミノ酸配列（ＴＣｂｌＲ；配列番号１）を示す。推定される機能的ドメイン、Ｎ−グリコシル化部位、リン酸化、およびミリストイル化部位に対応する領域を示した。精製したＴＣｂｌＲを配列決定する際に同定した４つのペプチドに対応する領域に下線を付けた。 指示された量のＬＤＬ（黒棒）またはＲＡＰ（白棒）のいずれかとともにプレインキュベートしたＴＣｂｌＲ（ＴＣＲ）に対する放射標識ＴＣ−Ｃｂｌの結合を示しているグラフである。 ヒト１９番染色体の模式図であり、ヒトＴＣｂｌＲの染色体位置と遺伝子構造を示している。 精製したＴＣｂｌＲ（図６Ａ）と、ＴＣｂｌＲの組み換え体である細胞外ドメイン（図６Ｂ）に対する、ＴＣ−Ｃｂｌの結合を示しているグラフである。 ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに対して作成されたポリクローナル抗血清と、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用した、還元性８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したＴＣｂｌＲのウェスタンブロットの写真である。レーン１は、最初の親和性精製によるＴＣｂｌＲを示す。レーン２は、切断された組み換え体の細胞外ドメインを示す。そしてレーン３は、ヒトＦｃ領域との融合タンパク質を示す。分子量を右側に示した。 漸増量の抗ＴＣｂｌＲポリクローナル抗血清の存在下での、精製したＴＣｂｌＲに対するＴＣ−Ｃｂｌの結合を示しているグラフである。縦軸は、ＣｏｎＡ結合アッセイによって決定した、形成されたＴＣｂｌＲ−ＴＣ−Ｃｂｌ複合体の量を示す。抗体の量は、それぞれの棒の下に示し、ブロックの割合をそれぞれの棒の上に示した。 ＴＣｂｌＲポリクローナル抗血清（抗ＴＣｂｌＲ ａｂ）が存在しない条件下（対照）またはその存在下での、Ｋ５６２細胞に対するＴＣ−Ｃｂｌの結合を示しているグラフである。黒色の四角は、４℃で１時間の抗体とのインキュベーション後の結果を示し、白色の四角は、３７℃で１時間の抗体とのインキュベーション後の結果を示す。 ＴＣｂｌＲ遺伝子の５’プロモーター領域の配列（配列番号４）を、示した推定の転写因子結合部位と特有の制限酵素部位とともに示す。 ３７℃で１５０時間の時間経過全体にわたる、培養物中のＫ５６２細胞（図１１Ａ）およびＨＬ−６０（図１１Ｂ）により放射標識したＣｂｌ−ＴＣの取り込みを示しているグラフである。［５７Ｃｏ］Ｃｂｌ−ＴＣの取り込みを、１時間の間、３７℃で決定した。経時的な細胞密度と、会合したＣＢＬ−ＴＣの経時的な量の両方を示した。 未標識のａｐｏ−ＴＣまたはｈｏｌｏ−ＴＣの存在下での、精製したＴＣｂｌＲに対する放射標識Ｃｂｌ−ＴＣの結合を示しているグラフである。存在するｈｏｌｏ−ＴＣまたはａｐｏ−ＴＣの量をｘ軸に示し、そして結合の割合（％）をｙ軸に示す。 ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）と、エンドペプチダーゼおよびＣＮＢｒを使用して作成したペプチド断片を示す表である。 ヒトＴＣの構造の模式図と、示したＴＣｂｌＲに対する結合に関与していると考えられるＴＣの領域を含むＴＣｂｌＲの細胞外ドメインについて予想される構造である。 ヒト（図１５Ａ）およびマウス（図１５Ｂ）ＴＣｂｌＲ ｍＲＮＡの予想されるステム−ループ構造、ならびに、これらのｍＲＮＡの中で同定されたしＲＮＡ標的領域に特異的なオリゴヌクレオチドの配列（配列番号６〜１５）を示す。 マウスの１７番染色体の模式図である。これは、マウスＴＣｂｌＲの染色体位置と遺伝子構造を示す。 マウスＴＣｂｌＲ遺伝子の標的化された破壊を示す模式図である。マウスＴＣｂｌＲ遺伝子を上に示し、標的化ベクター構築物を下に示した。 ＴＣｂｌＲの細胞外ドメインに特異的なポリクローナル血清を使用した、様々なガン細胞株およびヒト胎盤の中でのＴＣｂｌＲの免疫組織化学的局在化の顕微鏡写真を示す。 ３種類の異なるｓｉＲＮＡ（ＴＣｂｌＲ．８８（配列番号１６）、ＴＣｂｌＲ．８９（配列番号１７）、およびＴＣｂｌＲ．９０（配列番号１８））を標的化するＴＣｂｌＲの中に存在するＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列を提供する。 対照ＲＮＡ、またはＴＣｂｌＲポリヌクレオチド配列を標的化する示したｓｉＲＮＡの存在下での、ＨＥＫ２９８細胞に対するトランスコバラミンの減少を示しているグラフである。 組み換え体ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインの発現と精製を示す。左側のパネルは、精製した組み換え体ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインと分子量マーカーの、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。右側のパネルは、ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインに特異的なポリクローナル抗血清を使用した、精製した組み換え体ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインのウェスタンブロット染色を示す。 １５倍または１５０倍の過剰量の組み換え体ＴＣｂｌＲ細胞外ドメインの存在下での、Ｋ５６２細胞によるトランスコバラミンの取り込みの減少を示しているグラフである。

Claims (16)

  1. 細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子をインビトロで同定する方法であって、
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンと、候補の調節因子の存在下で接触させる工程であって、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片がトランスコバラミン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、工程、
    （ｂ）該トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片に結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、候補の調節因子が存在しない条件下で結合した量と比較する工程、
    を含み、該候補の調節因子が存在しない条件下と比較した、該候補の調節因子の存在下で結合したトランスコバラミンの量の減少または増加が、該候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す、方法。
  2. 細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子をインビトロで同定する方法であって、
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を、候補の調節因子の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程であって、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片がトランスコバラミン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、工程、
    （ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を、該候補の調節因子が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程、
    を含み、該候補の調節因子が存在しない条件下と比較した、該候補の調節因子の存在下で該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少または増加が、該候補の調節因子が細胞へのコバラミンの取り込みの調節因子であることを示す、方法。
  3. 前記外因性ポリヌクレオチドに、配列番号２もしくは３に示される配列、またはそれらの断片が含まれている、請求項２に記載の方法。
  4. 前記候補の調節因子が抗体である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体をインビトロで同定する方法であって、
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンと、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体の存在下で接触させる工程であって、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片がトランスコバラミン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、工程、
    （ｂ）該トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片に結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で結合した量と比較する工程
    を含み、該抗体の存在下で結合したトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す、方法。
  6. 細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体をインビトロで同定する方法であって、
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドに特異的に結合するヒト抗体の存在下でトランスコバラミンと接触させる工程であって、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片がトランスコバラミン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、工程、
    （ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程
    を含み、該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す、方法。
  7. 細胞へのコバラミンの取り込みを阻害するヒト抗体を生産する方法であって、
    精製された組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその免疫原性部分で、ヒト抗体ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することにより、トランスコバラミン受容体に特異的なヒト抗体を生産する工程を含み、
    該組み換え生成されたトランスコバラミンポリペプチドは、細胞が該組み換え生成されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現するように、プロモーター配列に動作可能であるように連結されている配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む該細胞から精製され、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片がトランスコバラミン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、方法。
  8. 前記外因性ポリヌクレオチドに、配列番号２もしくは３に示される配列、またはそれらの断片が含まれている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを以下の(a)-(c)により実証する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法：
    （ａ）単離された組み換え発現されたトランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片を、トランスコバラミンと、該抗体の存在下で接触させる工程、
    （ｂ）該トランスコバラミン受容体ポリペプチドに結合した該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該結合したトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で結合した量と比較する工程
    ここで、結合したトランスコバラミンの量の減少が、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することを示す、前記方法。
  10. 前記抗体が細胞へのコバラミンの取り込みを阻害することをインビトロでまたは非ヒト動物において、以下の(a)-(c)により実証する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法：
    （ａ）外因性のトランスコバラミン受容体ポリペプチドを発現する細胞を、トランスコバラミンと、該抗体の存在下で接触させる工程、
    （ｂ）該細胞によって取り込まれた該トランスコバラミンの量を決定する工程、および
    （ｃ）該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量を、該抗体が存在しない条件下で取り込まれた量と比較する工程
    ここで、該細胞によって取り込まれたトランスコバラミンの量の減少は、該抗体が細胞へのコバラミンの取り込みの阻害因子であることを示す、前記方法。
  11. 前記トランスコバラミン受容体ポリペプチドに、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはその断片が含まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 細胞によるコバラミンの取り込みを促進するための組成物であって、トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする配列が含まれているポリヌクレオチドを含み、該トランスコバラミン受容体ポリペプチドの断片が配列番号１に示される配列のアミノ酸３２〜２２９を含む、組成物。
  13. 前記ポリヌクレオチドに、前記トランスコバラミン受容体ポリペプチドまたはその断片をコードする配列に動作可能であるように連結されたプロモーター配列がさらに含まれている、請求項１２に記載の組成物。
  14. 細胞によるコバラミンの取り込みを阻害するための組成物であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むトランスコバラミン受容体の細胞外ドメインを含む組み換え生成されたポリペプチドの有効量を含み、該組み換え生成されたポリペプチドがトランスコバラミンに結合する、組成物。
  15. 前記トランスコバラミン受容体が配列番号１に示される配列からなる、請求項１４に記載の組成物。
  16. 患者の腫瘍、神経疾患、免疫関連疾患、炎症、または神経性疾患を処置あるいは予防するための組成物であって、トランスコバラミン受容体の細胞外ドメインを含む組み換え生成されたポリペプチドの有効量を含み、該ポリペプチドが配列番号１に示される配列のアミノ酸１〜３１を含まず、かつ該組み換え生成されたポリペプチドがトランスコバラミンに結合する、組成物。
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