JPH03505211A

JPH03505211A - 好酸球増加症の予防または鎮静用薬剤

Info

Publication number: JPH03505211A
Application number: JP2500322A
Authority: JP
Inventors: コフマン，ロバート・エル; レニック，ドナ・エム
Original assignee: シェリング・コーポレーション
Priority date: 1988-11-03
Filing date: 1989-11-01
Publication date: 1991-11-14
Anticipated expiration: 2010-01-11
Also published as: PH26476A; IE63063B1; AU4644889A; EP0441891A1; NZ243939A; ATE98872T1; KR900701320A; CA2002144A1; ZA898322B; MY107386A; EP0367596A1; ES2062032T3; CA2002144C; JPH07563B2; KR960002183B1; DE68911653D1; EP0367596B1; AU633034B2; WO1990004979A8; DK81691A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】好酸球増加症の予防または鎮静法ユ盟り公立本発明は、ｉ＋、て、好酸球集団の増加に関係した疾患を治療するための方法、更に詳しくは、インターロイキンージ（ＩＬ−＝５）の刺激効果を阻止することによって好酸球の産生および蓄積を防止する方法に関する。

二型の賀意好酸球は顆粒球系統の白自球である。それらの通常の機能は、寄生生物による感染、特に、螺出による感染と戦うことであると思われる。しかしながら、組織内での好酸球の蓄積は、好酸球増加症の他にいくつかの疾病状態と関係があり、最も顕著には、喘息に関係する０例えば、フリガス（Ｆｒｉｇａｓ）ら、ムΔ１上二二呈ヱー且旦亘−皇土１ユ上立且土−１エエ且ユ旦上−１７７巻、５２７〜５３７頁（１９８６）　；グライヒ（Ｇｌｅｉｃｈ）、旦立且三し１旦土頁（１９８４）　、激しい喘息発作での気管支気道の上皮内膜への損傷は、好酸球を脱顆粒することによって放出される化合物によって主として引き起こされると考えられる。

現在、グルココルチコイドステロイドは、喘息などのアレルギー性疾患の急性の作用を治療するのに最も効果的な薬剤である。しかしながら、長期間のステロイド治療は多くの有害な副作用に関係する。グンドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン（Ｇｉｌｌｍａｎ）、Ｔｈｅ　　ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｔｈｅｒａ　　ｅｕｔｉｃｓ、第６版（マクミラン・パブリッシング・カンパニー（ＭａｃＭｉｌｌａｎ　　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍａｎｙ）　、二ニー・ヨーク、１９８０＞　、更に、ステロイドは、罹患組ｉでの好酸球などの顆粒球細胞の産生または蓄積に影響を及ぼさないことは明らかである、好酸球増加症に関係した障害を治療する別のまたは補足的な方法の利用可能性は、重要な臨床的有用性を有すると思わｈる。

北閃Ｑ！致本発明は、ヒトインターロイキン−”５（ＩＬ−５）に対するアンタゴニスト（拮抗物質）の有効量を投与することによって好酸球増加症を予防するまたは鎮静させる方法である。好ましくは、ＩＬ−５に対するアンタゴニストは、単クローン性抗体または標準法によってそれらから誘導される結合組成物である。

２匡Ω嘔巣を脱明図１に、寄生生物に感染したマウスにおいて、ＩＬ−ヲを阻止する単クローン性抗体を用いる治療によるおよび治療なしての好酸球の（全白血球の百分率としての）末梢血Ｊ４度についてのデータをグラフによって例示する。

光肌の詳岨皇説朋本発明は、ＩＬ−５が好酸球の産生を増加させることおよびＩＬ−５のアンタゴニストが好酸球の産生および組織でのそれらの蓄積を減少させるという発見に基づく１本発明の方法は、ヒト１し−５に対するアンタゴニストの有効量または疾患を快復させる量を投与することを含む。

好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ヒトＩＬ−５に特異的な抗体から誘導される。更に好ましくは、本発明のアンタゴニストはＩＬ−５に特異的な断片または結合組成物を含む。

抗体は、ジスルフィド架橋によって互いに結合したポリペプチド鎖のアッセンブリーを含む、ＬｆｌおよびＨ９と呼ばれる２種類の主要なポリペプチド鎖が、抗体の主要な構造クラス（インタイブ）を全て構成している。Ｈ鎖およびｌはいずれも、可変部および不変部と呼ばれる部分領域に更に分類される。Ｈ鎖は１か所の可変部および３か所の異なる不変部を含み、ＩＪＩは１か所の可変部（Ｈ！ＩＩの可変部とは異なる）および１か所の不変部（Ｈｆｌの不変部とは異なる）を含む。

ＨｆｌおよびＬｆｌの可変部はその抗体の結合特異性の原因となっている。

本文中で用いられる７Ｈ鎖可変部」という用語は、（１）長さかアミノ酸１１０〜１２５個であり且つ（２）アミノ酸配列か本発明の単クローン性抗体のＨ！ＩＩＩのアミノ酸配列に対応し、そのＨｆｌのＮ−末嶌アミノ酸から開始するポリペプチドを意味する。同様に、胃！鎖可変部ヨという用語は、（１）長さがアミノ酸９５〜１１５個であり且つ（２）アミノ酸配列が本発明の単クローン性抗体のｌのアミノ酸配列に対応し、そのｌのＮ−末端アミノ酸から開始するポリペプチドを意味する。

本文中で用いられる７単クロ一ン性抗体」という用語は、ヒトＩＬ−５に特異的に結合することが可能である免疫グロブリンの均一集団を意味する。

本文中で用いられるｒ結合組成物」という用語は、（１）操作上で結合させる場合、ヒトインターロイキン−５への結合親和性が高いコンホメーションをとり、しかも（２）ヒトインターロイキン−５に特異的な単クローン性抗体を産生するハイブリドーマから誘導される２種類のポリペプチド鎖を含む組成物を意味する。

゛操作上で結合させる」という用語によって、２種類のポリペプチド鎖を、様々な手段、例えば、ＦａｂまたはＦｖなどの本来の抗体断片の結合によって、またはカルボキシル末端で遺伝学的に工作されたシスティン含有ペプチドリンカ−によって互いに結合するのに相対的な位！に置くことかできるということを示すことを意味する０通常、２種類のポリペプチド鎖は、ヒトインターロイキンーヲに特異的な単クローン性抗体のＬ［可変部およびＨ錆可変部に対応する。好ましくは、結合組成物はＩｇＡイソタイプの単クローン性抗体から誘導され、その結果り鎖およびＨｆｆの可変部間の天然に存在するシスティン結合を用いてその鎖を操作可能な結合にすることかできる。

好ましくは、本発明のアンタゴニストはヒトＩＬ−５に特異的な単クローン性抗体から誘導される。ＩＬ−５を阻止することが可能な単クローン性抗体は、標準のＩＬ−５生物検定においてＩＬ−５によって生じる効果を防止するそれらの能力、例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏでのコロニー形成検定において好酸球の増殖および発生を刺激する能力、および１ｎｖｉ、ｖｏでのＢＣＬ１リンパ腫継代細胞のｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの増殖を増大させる能力によって選択される。前者の検定はいくつかの参考文献、例えばトッド（Ｔｏａｄ）−サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）−Ｃ１ｉｎｔｃａｌ　　Ｄｉａ　　ｎｏｓｉｓ　　ｂｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１５版、テビッドソン＜Ｄａｖｉｄｓｏｎ）およびヘンリー（Ｈｅｎｒｙ）監ｆｌｔＪ（１９７４）にｇこ載されている。後者の検定はハミブリン（Ｈａｍｉ　ｂ　Ｉ　ｉ　ｎ）およびオーカラ（０′Ｇａｒｒａ）によってＬ　　ｍ　　ｈｏｃ　　ｔｅｓ：Ａ　　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡ　　　ｒｏａｃｈ、クラウス（Ｋｌａｕｓ＞監修（アイアールエル・プレス（ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ）、オフスフオード、１９８７）の２０９〜２２８頁に記載されている。　Ｂ　ＣＬ　ｉ細胞は、ＡＴＣＣから寄託番号ＴｌＢ１９７として入手可能であり、Ｎａｔｕｒｅ、２７２巻、６２４〜６２６頁（１９７８）、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒ，ｅｖ、　、４８巻、１６９〜１９５頁（１９７９）−およびＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２５巻、９７６〜９８゜頁（１９８０）に記載されている。

簡潔に、好酸球の検定は、骨ａ細胞がまたは腰帯血球を用いて下記のように行なうことかできる。非血液疾患の患者から採取された骨髄細胞を、フィコール（４００型、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）、ミズーリ州、セント・ルイス）上に別層し且つ遠心分Ｍ　（６００ｘ　ｇ　）し、そして界面での細胞を取り出す、これらの細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むイスコヴズ・モディファイド・ダルベツコズ・メジウム（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ　　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）で２回洗浄し且つ同じ培地に再懸濁させ、そして付着細胞をプラスチック製ベト９皿に付着させることによって除去する。非付着、［胞を、２０％ＦＣ５，２−メルカプトエタノール５０マイクロモル、０．９％メチルセルロースおよび各種濃度のコロニー刺激活性を有することか知られている上澄み液かまたは試験用上澄み液を含むイスコヴズ・メジウムに、４Ｅ胞数１０５７ｉｔで加える。一部分であるＨｌｌｌずつを３５順のベトリ皿に平板に置き、空気中６％の００２で十分に加湿した雰囲気中３７℃で培養する。培黄開始後３日目に、エリトロポエチン１単位を各プレートに加える。ｔＪｆ粒球マクロファージコロニーおよび赤血球のバーストを、倒立矛徹鏡を用いて１０〜１４日目に計数する。

ヘパリン中に採取しな腰帯血球を６００Ｘｇで回転させる。血漿および赤血球最上部間の界面での白血球を、０．１７Ｎ塩化アンモニウムおよび６％ＦＣ３が入っている試験管に移す、水上で５分後に、その懸濁液を、ＦＣＳ４ｆｌｌｌを下層にし且つ６００Ｘｇで遠心分離する。細胞ベレットをタルベゾコのリン酸緩衝溶液て゛洗浄し且つ骨Ｎａ胞について前記に記載のフィコールおよびプラスチック付着段階を行なう。低密度の非付着細胞を集め、前記に記載の半固形培餐基に細胞数１０５／培養物で置く。

検定のｆｉｆ＆に、個々のコロニーをスライドカラスに塗布し且つライト・ギムザで染色した後、細胞組成物を確認する。前記に記載の好酸球はルクソール・ファスト・ブルーで染色することによって確認される１ジヨンソン・ジー（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇ、）およびメトカーフ・ディー（Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、）、Ｅｘ　　、Ｈｅｍａｔｏｌ、８巻、５４９〜５６１頁（１９８０）コ。

簡潔に、ＢＣＬｌを基にした検定用に、ＢＣＬＩｌｌ瘍かあるマウス（好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ４たはＢＡＬＢ／ｃｄＪ）から肺臓を取り出しく回収率はマウス当り細胞数８×１０８〜１．３刈０９である）、そのｍ胞懸濁液を調製し且つ抗Ｔｈｙ−１単りローン性抗体および補体で処理してＴ細胞を激減させる（例えは、ＲＰＭＩ　Ｔ５％ウシ胎児血清１０１１．１：３モルモット補体５１１１および予め処理された抗Ｔｈｙ−１の０．５ｎｌ中に肺臓１個）、同じ培地中の細胞（細胞数２．５　ｘｌｏ”　／ｍｌ）を、容量１００　ｕｌの微量滴定培養容器に入れる。ＩＬ−５活性について試験を行なう化合物を培地１００　ｕｔ中の培養物に加える。培養物を３７℃で２日間インキュベートした後、ＤＮＡ合成について検定を行なう。

本発明のハイブリドーマは周知の方法によって生成される０通常、不滅化細胞系を、所望の抗体を産生ずる３９２３球と融合させる。或いは、不滅の抗体産生ｍ胞系を発生させる非融合法、例えば、ウィルスによって生じる形質転換が可能であり、本発明の範囲内である。カサ９（Ｃａｓａｌｉ）ら、「３９２３球の抗原特異的選択によるヒト単クローンおよびＦＢＶによる形質転換（ＨｕｍａｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ　　ｆｒｏｍ　　Ａｎｔｉｇｅｎ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＳｅｌｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｂ　　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　　ａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔ’ｉｏｎ　　ｂｙ　　ＥＢＶ）」、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４巻・４７６〜４７９頁（１９８６）。不滅化細胞系には、通常、補乳動物の細胞、特に、譬歯類、ウシ科およびヒト由来のミエローマ細胞を形質転換させる０便宜上および利用可能性上、ランドまたはマウスのミエローマ細胞系を用いることが最も多い。

標的抗原を注射された哺乳動物から適当なリンパ球を得るための方法は周知である。一般的には、ヒト由来の細胞が望ましい場合、末梢血液リンパ球（ＰＢＬＳ）を用い、または非ヒト哺乳動物源が望ましい場合、肺臓細胞またはリンパ節細胞を用いる。宿主哺乳動物に用量の精製された抗原を繰返し注射し、その哺乳動物が所望の抗体産生細胞を発生することを可能にしな後、これらを不滅化細胞系との融合用に採取する。融合方法も当該技術分野で周知であり、例えば、細胞をポリエチレングリコールなどの融合側と混合する。ハイブリドーマ′はＨＡＴ選択などの標準法によって選択される。これらのハイブリドーマの中から、所望の抗体を分泌するものを、標準免疫検定、例えはウェスタン法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等でそれらの培養基を検定することによって選択する。抗体は、標準タンパク質精製法を用いて培地から回収される：例えば、チュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒ　　　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　　Ｔｍｍｕｎｏａｓｓａｖｓ（エルゼビル（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、１９８５）　、多数の参考文献か、前記の方法のいずれかを用いる場合の指標として利用可能であり、例えは、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｈｖｂｒｊｄｏｍａ　　Ｔｅｃｈｎｉ　　ｕｅｓ（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− （Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニュー −ヨーク、１９８０＞　；チュツセン、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｖｍｅ１匹匹且ユ旦且旦旦且ヱ旦（エルゼビル、アムステルダム、１９８５）　；カンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　、Ａｎｔｉｂｏｄｙ工且立瓦ユ立上立呈ヱ（エルセビル、アムステルダム、１９８４）　；バレル（Ｈｕｒｒｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉ　　ｕｅｓ　　ａｎｄΔ Ｌ二±上立且工上立旦旦（シーアールシー・プレス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）、ポカ・ラドン・フランドル、１９８２）　；等かある。

抗体の断片の利用および発生についても周知であつ、例えば、Ｆａｂ断片；チュンセン、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｆ　　ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｖｓ　（エルゼビル、アムステルタム、１９８５）　Ｌ　；およびＦｖ断片３ホフマン（Ｈｏｃｈｍａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　、１２巻、１１３０〜１１３５頁（１９７３）　、シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｖ、１５巻、１５９１〜１５９４　（１９７６）およびエーリッヒ（ＥｒｈＩ　ｉ　ｃｈ）ら、米国特許第４．３５５．０２３号明細書；：および抗体１／２分子［オーディドア（Ａｕｄｉｔｏｒｅ）−ハーグリーブズ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）、米国特許第４、４７０．９２５号明細書］である。更に、本発明のこの種の化合物および組成物は、既知の方法によって、例えば、ハイブリドーマの更に別の融合（すなわち、いわゆるクアドロマス（ｑａｄｒｏｍａｓ）を生成すること）によって［リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）、米国特許第４．４７４．４９３号明細書］、または１７２分子の化学的再結合によって［ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１〜８３頁（１９８５）　Ｅ−二重特異性抗体を構成することかできる。

本発明のハイブリドーマおよび単クローン性抗体は、組換え体によって生じた成熟ヒトインターロイキン−５のグリコジル化型かまたは非グリコジル化型に対して産生される。概して、ヒトＩＬ−５の非グリコジル化型は大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）で産生され、グリコジル化型は哺乳動物細胞宿主、例えば、サルのＣＶ］またはＣｏＳ細胞、マウスＬ細胞等で産生される０組換え体によって生じたヒトＩＬ−５は、標準プロトコルを用いて、発現ベクターを宿主細胞に導入することによって産生される０例えは、マニアテイス（Ｍａｎ　ｉ　ａ、ｔ　ｉ　ｓ　）ら、夕、１９８２）　；オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルク（Ｂｅｒｇ）　、Ｍｏｌ。

Ｃｅｌ　］、Ｂｉｏ１．．２巻、１６１〜１７０　（１９８２）および３巻、２８０〜２８９頁（１９８３）　；ハマー（Ｈａｍｅｒ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ　　１ｎｅｅｒｉｎ　　、２巻、８３〜１００　　（１９８０）および米国特許第４．５９９．３０８号明細書；カオフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、＋　２巻、１３０４〜１３１９（１９８２）　　；等。

所望のタンパク質を暗号化（コード）するヌクレオチド配列が既知であるが或いはまた利用可能であるならば、細菌またはｌｌＩ＠乳動物の発現ベクターの構成は当該技術分野で周知であり、例えば、デボアー（ＤｅＢｏｅｒ）は、米国特許第４．５５１，４３３号明細書で、細菌の発現ベクターで用いるためのプロモーターを開示しており；ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ　）らは米国特許第４，６０１，９８０号明細書で、およびリグス（Ｒｉｇｇｓ）は米国特許第４，４３１，７３９号明細書で、大腸菌の表現系による哺乳動物タンパク質の産生を開示しており：そして（前記に引用された）リグス、フェレッティ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、８３巻、５９９〜６０３頁（１９８６）　、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ、１３巻、２９５９〜２９７７頁（１９８５）−およびミュレンパック（Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１巻、７１９〜７２２頁（１９８６）に、細菌での表現用合成遺伝子の構成方法が開示されている。したがって、これらの文献を参考文献として引用する。成熟しトＩＬ−５のアミノ酸配列は、アズマ（Ａｚｕｍａ）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ、１４巻、９１４５〜９１５８頁（１９８６）に開示されており、ヒトＩＬ−５を暗号化する合成遺伝子は、ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（カリフォルニア州、フラートン）から商業的に入手可能である。多くの細菌の発現ベクターおよび宿主は、商業的に且つＡＴＣＣを介して入手可能である。

更に、本発明のハイブリドーマに特有の抗体および抗体断片を、メツセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃ　Ｄ　ＮＡライブラリーを横築し、そして抗体分子の断片を暗号化するクローンを選択することによる組換え体の方法によって生しることかできる０例えば、ウオール（Ｗａｌｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｊｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｃｈ、５巻、３１１３〜３１２８頁（１９７８）　；サクト（Ｚａｋｕｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ、８巻、３５９１〜３６０１頁（ｉ９８０）　；力ビリー（Ｃａｂ　ｉ　］　］　Ｖ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、８１巻、３２７３〜３２７７　（１９８４）　：ボス（Ｂｏｓｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　、八ｃｉｄｓＲｅｓｅａｃｈ、１２巻、３７９１〜３８０６頁（１９８４）　：アムスター（Ａｍｓｔｅｒ）ら、モーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、米国特許第４，６４２，３３４号明細書；およびスケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜１０４１頁（１９８８）　、特に、このような方法を用いて、一つの種の結合部を別の種の抗体の非結合部と結合させて免疫原性を低下させる相互特異的単クローン性抗体を生ずることができる。

例えば、ロウ（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、　、８４巻、３４３９〜３４４２頁（１９ｇ？）　。

本発明のアンタゴニストは薬剤組成物として投与される。この種の組成物は、本発明の少なくとも１種類の単クローン性抗体またはそれらの断片の治療学的量を薬学的に有効な担体中に含んでいる。菖剤担体は、本発明の組成物を患者に与えるのに適当な、相溶性で無毒性の任意物質であることができる。ｉｌ！Ｉ！２菌水、アルコール、脂肪、ロウおよび不活性固形物が担体に含まれることかできる。薬学的に容認可能なアジュバント（例えば、Ｍ衝剤、分散剤）も、薬剤組成物に配合することかできる。概して、この種の薬剤の非経口投与に有用な組成物は周知であＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）−ペンシルベニア州、イーストン、１９８０）　、或いは、本発明の組成物を、移植可能な薬剤供給系によって患者体内に導入してもよい、例えば、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、　、２４巻、１９９〜２３６頁（１９８４）　。

本発明のアンタゴニストを抗体から誘導する場合、通常、それらを非経口で、好ましくは、静脈内に投与する。この種のタンパク質またはペプチドアンタゴニストは免疫原性であることがあるので、それらを、通常のＩＶ投与方式によってかまたは皮下蓄積質から、例えば、トマシ（Ｔｏｍａｓｉ）らの米国特許第４、７３２．８６３号明細書に示されたように徐々に投与するのが好ましい。

非経口的に投与する場合、抗体または断片を薬学的に容認可能な非経口用賦形剤と一緒の注射可能な単位剤形に（典型的には、液剤、懸濁剤または乳剤に）配合する。このような賦形剤は、本質的に無毒性且つ非治療学的である。このような賦形剤の例は、標準食塩水、リンカ−溶液、デキストロース溶液およびハンクス液である。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性状形剤も用いることができる。好ましい賦形剤は５％テキストロース／：１に塩水である。賦形剤には等両性および化学的安定性を増大させる物質などの少量の添加剤、例えは緩衝剤および防腐剤を含むことかできる。抗体は、集塊および他のタンパク質を実質的に含まない精製形態で、濃度的５〜３０１ｇ／１１、好ましくは１０〜２（ｌｎａ／ｍｌで配合するのが好ましい。

アンタゴニストについての投与養生法を苗択することは、いくつかの要因、例えばアンタゴニストの血清回転率、好酸球増加症に関係したＩＬ−５の血清濃度、アンタゴニストの免疫原性、標的ＩＬ−５の利用可能性（例えば、非血清１１− ５が阻止されることになっている場合）、アンタゴニストに対するＩＬ−５の親和性に相対する１個または複数個のＩＬ−５レセプターに対するその親和性、等に関係する。好ましくは、投与養生法は、副作用の容認可能な水準に一致する患者に与えられるアンタゴニストの量を最大にする。したがって、与えられるアンタゴニストの量は、特定のアンタゴニストおよび治療される疾患の過酷さにある程度関係する。適当な用１を選択する場合の措標は、抗体の治療学的利用に関する参考文献に見出たされる６例えば、フェロン（Ｆｅｒｒｏｎｅ）ら監修、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａ、ｎｔ、１ｂｏｄｉｅｓ　（ノージズ・パブリゲーションズ（Ｎｏｇｅｓ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニュー・シャーシー州、パーク・リンノ、１９８５）の、バンク（Ｂａｃｈ）ら、１２章：およびハーバ−（Ｈａｂｅｒ）ら監修、Ａｎｔｆｂｏｄｆｅｓ　　ｆｎ　　ＨｕｍａｎＤｉａｇｎｏｓｉｓ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｒａ　　ｖ（ラーヴエン・プレス（Ｒａｖｅｎ　　Ｐｒｅｓｓ）、ニュー・ヨーク、１９７７）の、ラッセル（Ｒｕ　ｓ　ｓ　ｅ　Ｉ　Ｉ　）　、　３０３〜３５７頁およびスミス（ＳｍｉｔｈＪら、３６５〜３８９頁、好ましくは、アンタゴニストか単クローン性抗体またはそれらのＦａｂ型断片（結合組成物など）を含む場合は常に、その用量は一日当り約１〜２（ｌｎＭｋｇ、更に好ましくは一日当り約１〜１０ｎｇ／ｋｇの範囲である。

寒橿倒下記の笑施例は、本発明の態様を例示するためのものである。選択されたベクター、宿主、融合相手、並びに試薬の濃度、温度および他の可変数値は、単に本発明を例示するものであり、それらを制限するものと考えるべきではない。

実力　Ｈ，ＩＬ５阻害ククり−ン性ＰＴＲＦＫ−５の製造ＴＲＦＫ−５ハイブリドーマの製造は、参考文献として引用されているシューマッヒャ−（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１４１巻、１５７６〜１５８１　（１９８８）に記載されている６１２週令０ルイスラット２匹に、完全フロインドアジュバント中の精製マウスＩＬ−５を０．４〜１．６■ずつ３回の注射を４〜５週間間隔で行なった。双方のラットを３回目の注射後１０〜１８日目に放血させた。

より高い阻止血清力価を示すラットに、精製マウスＩＬ−５の２■のｆ＆後の静脈内注射を行なった。３日後、その肺臓および腋窩リンパ節細胞を、ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８゜６５３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から寄託番号ＣＲＬ１５８０として入手可能）を用いて、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　ｙ、ワイア（Ｗｅｉｒ）監修（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オフスフオード、１９８Ｂ＞　、４巻のキップス（Ｋｉｐｐｓ）およびヘルツエンベルブ（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）の方法によって融合させた。赤血球を蒸留水中で溶解させ、それらの生理学的重量オスモル濃度を、ＨＢＳＳ　（ハンクス緩衝塩溶液）で直ちに回復させた。５０％ポリエチレングツコール（分子量７５００〜ｉｇｏｏ、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、）から入手可能）を用いて融合した後、細胞をＨＡＴ選択培地中、細胞数８．５　ｘｌｏ”　／ｎｌの密度、１００　ｕｌ、／ウェルで平板培養した。翌日、ＨＡＴ培地１５０　ｕｌを各ウェルに加え、その培地を５〜８日目日月補給した。１０日目に、培地を１００マイクロモルヒボキサンチン／１６マイクロモルチミジン培地に変更し、細胞をこの培地中で更に１４日関係持しな、融合して１４日後に、ハイブリドーマ上澄みを、ＢＣＬ□検定でマウスＩＬ−５の０．５ｎΩ／印１の増殖刺激活性を直接的に阻止することによって選別しな。ハイブリドーマの増殖を含むウェル２＋７６　＠　（全ウェルの４３％〉の内、− 貫した抗体活性を生ずる４種類のハイブリドーマについて、維持培地での限界稀釈によって、安定なサブクローンか単離されるまでクローニングを行なった。これらの内のＴＲＦＫ−５を示した１種類が、マウスおよびヒト双方の１１−５を阻止することができる抗体を産生し且つ析出物として選択された。

免疫原として用いられるＩＬ−５を、ギードリン（Ｇｔｅｄｌｉｎ）ら、Ｃｅ　１１．Ｉｍｍｕｎｏ　１．．９７巻、３５７頁（１９８６）に記載されたＴ［胞クローンＭＢ２−１の上澄みから、ボンド（Ｂｏｎｄ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３９巻、３６９１頁（１９８７）に記載された方法によって精製した。これらの文献は参考文献として引用されている。

ＴＲＦＫ−５によって産生される抗体は、マウスＩＬ−５およびヒトＩＬ−５双方の生物学的活性を阻止することが分かった。

例■、　′＃生生物によって生じたマウスの　　球場ａ症に対する　ＩＬ〜５菰生Ω勿遍各種組繊での好酸球の濃度を減少させるＩＬ−５アンタゴニストの能力を試験するために、Ｂａ１ｂ／ｃマウス２０匹を下記のように処１しな、Ｏ日月に、全マウスに、第三期の二ノボストロンギルス・ブラジリエンシス（Ｎｊｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　　ｂｒａｓｉｌｊｅｎｓｉｓ＞幼虫８００を皮下注射しな０例えば、オーグルビ（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、Ｅｘ　　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ　　　、２９巻、１３８〜１７７（’１９７ｉ）を参照されない０次に、そのマウスの内の５匹に、リンＢ緩衝溶液中の精製単クローン性抗体ＴＲＦＫ−５を２．０１ＤＱ　（同じくＯ日月に）腹腔内に注射した。５匹のマウスに、対照としてマウスＩＬ−４を阻止する精製単クローン性抗体２．１ｇを腹腔内に注射した。５匹のマウスに、対照として精製マウスＩｇＧ１を２．０１１ｇ腹腔内に注射した。そして、５匹のマウスはもう一つの対照として未処１の、！マ残した。注射後３．７．１１および１４日目に、末梢血液試料を全マウスから採取し且つ好酸球を計数した。その結果を図１に例示する。ＩＬ−５阻止抗体で処１したマウスの末梢血液は棒めで明確な好酸球の減少を示す。

７４日後に、マウスをＮｎＬ且つそれらの肺を取り出し、切１所し、固定し、そして好酸球の染色を行なった。無作為に選択した顕微鏡視野での好酸球数を比較することにより、抗ＩＬ−５で処置したマウスでは、肺組識での好酸球の蓄積が約２０倍減少したことか示された。

本発明の前記の実施態様の説明は例示および説明の目的で示された。それらは、本発明を開示された形態に厳密に制限するためのものではなく、前記の内容を考慮にいれて多くの変更および変化が可能であることは明らかである８本発明の原理およびその実際的な用途を最もよく説明するために、実施態様を選択し且つ記載したもので、それによって当業者が種々の態様で、しかも予想される特定の利用に適当であるような種々の変更を用いて本発明を最もよく利用することができる。それは本発明の範囲か本文に添付の請求の範囲によって定義されることを意味する。

本出願人は、ハイブリドーマＴＲＦＫ−５をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国、メリーランド州、ロックビル（Ａ、ＴＣＣ）に寄託番号ＨＢ９８９７とじて寄託した。この寄託は、特許目的の培養物の寄託に関するＡＴＣＣの協定に基づいて提供される条件下で行なったものであり、その寄託が一米国特許法１２２および米国規制基準３７−１．１４に従って米国特許および商標局長に対して利用可能にされ、しかも、米国特許証の発行によって一般に利用可能にされることを確実にし、そしてその寄託が維持されることをも要求するものである。寄託された種類の利用可能性は、いずれの政府のその特許法に従うその代理るべきではない。

寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の要件を満たすように変更された。

ＦＩＧｔＪＲＥ　　１手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１０４７９６２、発明の名称好酸球増加症の予防または鎮静法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住所名　称　　シェリング・コーポレーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正の対象請求の範囲６、補正の内容（別紙）（１）請求の範囲を次の通りに補正する。

「１．ヒトインターロイキン−５に対するアンタゴニストの有効量を投与することを含む、患者の好酸球増加症を予防するまたは鎮静させる方法９２、好酸球増加症を予防するまたは鎮静させるための、ヒトインターロイキン−５に対するアンタゴニストの使用。

３、好酸球増加症を予防するまたは鎮静させるのに用いる薬剤の調製のための、ヒトインターロイキン−５に対するアンタゴニストの使用。ｊ以　　上国際調査報告ＤＥＣＬメ１日ノーＴＩＣ：Ｉ’０ＦＮＯＮ−ＥＳＴＡＪＩＬｉＳＦＡｊｉＴＯＦｌ：ＪＴＥＦ、ＮＡＴｌｏ？ＩＡＬＳＥＡＲＣＨＰＥ’ＯqＴ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトインターロイキン−５に対するアンタゴニストの有効量を投与することを含む、患者の好酸球増加症を予防するまたは鎮静させる方法。
２．前記のヒトインターロイキン−５に対するアンタゴニストが、ヒトインターロイキン−５の生物学的活性を阻止することが可能な単クローン性抗体、ヒトインターロイキン−５の生物学的活性を阻止することが可能な単クローン性抗体の断片、およびヒトインターロイキン−５の生物学的活性を阻止することが可能な単クローン性抗体のＨ鎖可変部およびＬ鎖可変部を含む綜合組成物から選択される請求項１に記載の方法。
３．前記の単クローン性抗体の前記の断片がＦａｂ断片である請求項２記載の方法。
４．前記の単クローン性抗体がヒト−ヒトハイブリドーマによって産生される請求項２記載の方法。
５．前記の単クローン性抗体の前記の断片がＦａｂ断片である請求項４記載の方法。
６．前記の投与する段階が、前記のアンタゴニストを１日当り前記の患者の体重の約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で静脈内に与えることを更に含む請求項２記載の方法。