JPH0632622B2 - 固定化菌体の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は固定化菌体の製法に関する。該固定化菌体は酵
素反応により種々の物質、例えば、アミノ酸を製造する
のに有用である。

従来の技術 酵素をグルタルアルデヒドや高分子物質で固定化するこ
と及び補酵素をヘキサメチレンジアミンで固定化するこ
とは知られている。〔千畑一郎編；固定化酵素、（株）
講談社(1975)〕。酵素又は微生物菌体をカラギーナンで
固定した後、グルタルアルデヒドとヘキサメチレンジア
ミンで処理することは知られている〔福井、千畑、鈴木
編；酵素工学、東京化学同人(1981)〕。

発明が解決しようとする問題点 長期間繰り返して使用できる固定化菌体の開発が求めら
れている。

問題点を解決するための手段 本発明方法によると、菌体をジアミンとジアルデヒドと
で処理した後、該処理物を高分子物質で固定化すること
により、長期間繰り返し使用に耐える固定化菌体を得る
ことができる。

本発明に用いられるジアミンとしては、アミノ基を二個
有する分子量２００以下の化合物、例えば、エチレンジ
アミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミ
ン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミ
ン、トリエチレンテトラミン、1,7−ジアミノヘプラ
ン、1,8−ジアミノオクタン、1,10−ジアミノデカン等
があげられる。

ジアルデヒドとしては、炭素数１０以下の脂肪族又は芳
香族アルデヒド、例えばグリオキサール、マロンアルデ
ヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジ
ピンアルデヒド、ピメリンアルデヒド、スベリンアルデ
ヒド、アゼラインアルデヒド、セバシンアルデヒド、マ
レインアルデヒド、フマルアルデヒド、フタルアルデヒ
ド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等が
あげられる。

高分子物質としては、ポリビニルアルコールゲル、ポリ
アクリルアミドゲル、カラギーナン、アルギン酸ナトリ
ウム等があげられる。

本発明に用いられる菌体としては、細菌、放線菌、糸状
菌、酵母、カビ、藻類等の菌体があげられる。本発明方
法は特に、菌体からの酵素漏出が著しいものに有効であ
る。具体的にはサルモネラ属、シトロバクター属等に属
する微生物の菌体があげられる。該微生物の代表例とし
ては、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhim
urium)ATCC19585及びシトロバクター・フロインディ(Ci
trobacter freundi)ATCC 6750があげられる。

本発明において、微生物菌体をジアミンとジアルデヒド
とで処理するには、微生物の培養液にジアミンとジアル
デヒドを添加するか、培養液から微生物菌体を分離した
後、該菌体をジアミンとジアルデヒドとを含む溶液に懸
濁してもよい。使用するジアミンとジアルデヒドとの重
量は共に微生物菌体の乾燥重量の1/100〜５倍、好まし
くは1/10〜1/2倍の範囲である。微生物菌体を処理する
液中のジアミン及びジアルデヒドの濃度は共に0.1〜５
％、好ましくは１〜３％の範囲である。処理は温度１〜
４０℃、好ましくは４〜２５℃、0.5〜３時間、好まし
くは１〜２時間、pH５〜８、好ましくは６〜７で行う。

上記の如くして、菌体処理物を得る。

前記菌体処理物を高分子物質で固定化する場合には、例
えば、次の様に行う。

ポリビニルアルコールを用いる場合には、菌体処理物を
ポリビニルアルコール水溶液に加え混合した後、凍結
し、融解する。

ポリアクリルアミドゲルを用いる場合には、アクリルア
ミドと架橋剤（例えばN,N′−メチレンビスアクリルア
ミド）を溶解した緩衝液に菌体処理物を懸濁させ、重合
促進剤（例えば、β−ジメチルアミノプロピオニトリル
及び重合開始剤（例えば、過硫酸カリウム）を加えて重
合する。

カラギーナン及びアルギン酸ナトリウムを用いる場合に
は、菌体処理物をカラギーナン又はアルギン酸ナトリウ
ム水溶液に加え混合した後、該混合液を塩化カリウム
（アルギン酸ナトリウムの場合は塩化カルシウム）水溶
液に滴下する。

反応液から固定化菌体を分離する方法としては、遠心分
離方法、過方法等がある。

以下実施例を示す。

実施例１ グルコース５％、コーンスチープリカー２％、硫酸アン
モニウム１％、リン酸一カリウム0.05％、リン酸二カリ
ウム0.05％及び硫酸マグネシウム・７水和物0.025％か
らなる培地(pH7)にサルモネラ・チフィムリウムATCC 19
585を培養して得られた湿菌体５０ｇ（乾燥重量１２
ｇ）をアジピンアルデヒド２％及びトリエチレンテトラ
ミン２％を含む0.2Ｍリン酸緩衝液(pH7) １５０ｍｌに
懸濁し、４℃で３時間放置した。ついで、該懸濁液から
菌体を遠心分離した後、該菌体を生理食塩水１５０ｍｌ
で２回洗浄した。該洗浄した菌体をゴーセノールＮＨ−
２６〔ポリビニルアルコール，日本合成工業（株）製〕
の２０％水溶液５０ｇと混合し、−２０℃で１８時間放
置した後、解凍して３〜４mm角に細断して固定化菌体を
得た。該固定化菌体をフェニルピルビン酸0.2Ｍ、アス
パラギン酸ナトリウム0.24Ｍ及びリン酸ピリドキサール
0.01mMからなる基質液(pH7)１００ｍｌに懸濁させ、３
５℃で２４時間反応させフェニルアラニン2.9ｇを得
た。反応後、固定化菌体を金網により回収し、回収した
固定化菌体を新しい基質液に懸濁させて２回目の反応を
行った。このようにして繰り返し反応を行ったところ、
反応１５回目におけるフェニルアラニンの生成量は2.3
ｇであった。

一方、対照１として、前記操作と同様に培養したサルモ
ネラ・チフィムリウムATCC 19585の菌体をアジピンアル
デヒド及びトリエチレンテトラミンで前処理することな
く、ゴーセノールＮＨ−２６で固定化して、該固定化菌
体をフェニルアラニンの生成反応に用いる以外は前記と
同様な操作により、フェニルアラニンを得た。その結果
として、反応１回目及び１５回目におけるフェニルアラ
ニンの生成量はそれぞれ2.9ｇ及び0.1ｇであった。

対照２として、前記操作と同様に培養したサルモネラ・
チフィムリウムATCC 19585の菌体をゴーセノールＮＨ−
２６の２０％水溶液５０ｇと混合し、−２０℃で１８時
間放置した後、解凍して３〜４mm角に細断した固定化菌
体を得た。該固定化菌体をヘキサメチレンジアミン２％
及びグルタルアルデヒド２％を含む0.2Ｍリン酸緩衝液
(pH7)３００ｍｌに懸濁させ、４℃で３時間放置した。
固定化菌体を回収し、回収した固定化菌体を生理食塩水
３００ｍｌで２回洗浄した。性能した固定化菌体をフェ
ニルアラニンの生成反応に用い、前記と同様な操作によ
りフェニルアラニンを得た。その結果として、１回目及
び１５回目におけるフェニルアラニンの生成量はそれぞ
れ2.9ｇ及び1.7ｇであった。

実施例２及び３ 実施例１において、第１表に示すジアミン及びジアルデ
ヒドを用いる以外は実施例１と同様にして第１表に示す
結果を得た。

実施例４ シトロバクター・フロインディATCC 6750を実施例１と
同組成の培地に培養して得られた湿菌体５０ｇ（乾燥重
量１２ｇ）を２％ヘキサメチレンジアミン水溶液（塩酸
でpH７に調整したもの）１５０ｍｌに懸濁し、２５℃で
攪拌しながら、２５％グルタルアルデヒド水溶液１２ｍ
ｌを１５分間で滴下した。滴下中、液のpHは５％アンモ
ニア水で６〜７に維持した。さらに、３０分間攪拌を続
けた後、懸濁液から菌体を遠心分離し、該菌体を生理食
塩水２００ｍｌで２回洗浄した。該洗浄した菌体をソア
ギーナＭＶ−１０１〔カラギーナン，三菱アセテート
（株）製〕の３％水溶液５０ｇに懸濁させ、該懸濁液を
５％塩化カリウム水溶液に滴下して、約５mm径の球状固
定化菌体を得た。該固定化菌体をフェニルピルビン酸ナ
トリウム0.2Ｍ、フマル酸二アンモニウム0.3Ｍ、リン酸
ピリドキサール0.01mM、亜硫酸ナトリウム・７水和物0.
05％及び塩化マグネシウム0.005％からなる基質液(pH7)
５０ｍｌに懸濁させ、３０℃で２４時間反応させフェニ
ルアラニン1.5ｇを得た。

反応後、固定化菌体を金網により回収し、回収した固定
化菌体を新しい基質液に懸濁させて２回目の反応を行っ
た。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反応６
０回目おけるフェニルアラニンの生成量は1.5ｇであっ
た。

一方、対照１として、前記操作において、ヘキサメチレ
ンジアミン及びグルタルアルデヒドの代わりにヘキサメ
チレンジアミンを用いる以外は前記と同様にしてフェニ
ルアラニンの生成を行った。その結果、１回目及び１０
回目のフェニルアラニンの生成量はそれぞれ1.5ｇ及び
0.1ｇであった。

対照２として、前記操作において、ヘキサメチレンジア
ミン及びグルタルアルデヒドを用いない以外は前記と同
様にしてフェニルアラニンの生成を行った。その結果、
１回目及び２０回目のフェニルアラニンの生成量はそれ
ぞれ1.5ｇ及び0.2ｇであった。

発明の効果 本発明方法により、長期間繰り返し使用できる固定化菌
体を得ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】菌体をジアミンとジアルデヒドとで処理し
   た後、該処理物を高分子物質で固定化することを特徴と
   する固定化菌体の製法。