JPH05168481A

JPH05168481A - 生体触媒を包括した固定化ゲルの作製法及びその使用法

Info

Publication number: JPH05168481A
Application number: JP33841591A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Ito; 伊藤　　潔; Naokazu Naito; 直和内藤; Daisuke Ura; 大輔浦; Kiyoteru Nagahara; 長原　　清輝; Nobuhiro Fukuhara; 信裕福原
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1991-12-20
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1993-07-02

Abstract

(57)【要約】【構成】ポリビニルアルコールとκ−カラギーナンか
らなる高分子素材をゲル基材として用い、微生物または
酵素などの生体触媒を包括的に固定化させたゲルを作製
する場合において、ゲル成形時に用いる無機塩溶液が、
高濃度の炭酸イオンを含む条件下での固定化ゲル作製
法。【効果】ゲルの成型と強度付加を一度に達成出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリビニルアルコール
と水溶性高分子多糖類をゲル基材とした包括法による固
定化ゲルの作製法、および、その使用法に関するもので
ある。

【０００２】ポリビニルアルコールと水溶性高分子多糖
類をゲル基材として用いて、微生物または酵素などの生
体触媒を保持・安定化させた粒状成型物（いわゆる固定
化ゲル）を作製し、包括した生体触媒に特異的な生化学
反応を利用して、種々の物質の生産・分解等を行う技術
は従来より探究されている。ここで、‘固定化ゲル’に
ついては、以後単にゲルと呼ぶ。また、‘包括した生体
触媒に特異的な生化学反応’については、これ以後単に
‘反応’と呼ぶ。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ゲルの
作製法については、既に種々の技術が提案されている。
特に、微生物菌体そのものを固定化するためには、いわ
ゆる‘包括法’と呼ばれるゲル作製法が採用されるのが
一般的である。特開平２−２１１８７２、特開昭６３−
１０９７７９、特開昭６２−１３８１９３等がこの様な
包括法によるゲル作製法を開示している。

【０００４】すなわち、ゲル基材である高分子素材（た
とえば、ポリビニルアルコール及びκ−カラギーナン等
の水溶性高分子多糖類）と生体触媒（微生物または酵
素）を均一にまぜた後に、注射針・噴霧器や円盤成型器
などを用いて、適当な条件の無機塩溶液中に滴下するこ
とにより、ゲルは球状に成型される。一般的には、この
後で成型されたゲルの強度・耐水性・安定性を高める処
理を行う。たとえば、凍結・融解処理、ほう酸水溶液中
での懸濁などの手法が用いられてる。

【０００５】工業的に利用することのできるゲルを作製
するためには、ゲルは反応中にある一定の強度および安
定性を維持している必要がある。すなわち、反応を進行
させるためには、ゲルを反応槽内で連続撹はんしたり、
反応槽内に充填する必要が生じる。また、ゲルは長期間
の連続使用や数回の再使用に耐えられることが望まし
い。このため、従来の技術では、ゲル成型時または成型
後にゲルに強度を付加する処理が特に重要なプロセスで
あり、かつ、その特徴ともなっている。

【０００６】ところが、このような強度付加処理は、そ
れ自体が工業的には煩雑な処理であることは言うまでも
ない。たとえば、凍結処理によりゲルに強度を付加する
ためには、ゲルを一旦この溶液から取り出す必要が生じ
る。一方、強度付加処理が行われていないゲルは、成型
に用いられた無機塩溶液中での懸濁状態では比較的安定
であるが、非懸濁状態ではゲル相互の密着が起こり、
‘団子状態’となり易い。このため、ゲル相互の密着を
防止しつつ、ゲルを効率よく回収しなければならない。

【０００７】また、特開昭６２−１３８１９３で開示さ
れているほう酸を含む水溶液中でゲルの成形と強度付加
を同時に行う方法は、ほう酸自体の人間に対する毒性を
考慮した場合、食品業・飼料業等に応用することには限
界があり、また、ゲル成形後にゲルを洗浄する必要も生
じる。

【０００８】本発明者らは、ゲルの成型と同時にゲルに
強度を付加できることが、工業的に必要なゲル作製法で
あると考え、種々の検討を加えた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ゲルの成
型と強度付加を一度に達成できる無機塩溶液の種類と濃
度について種々の検討を加えた結果、高濃度の炭酸イオ
ン水溶液、好ましくは炭酸アンモニウム水溶液が最も最
適であるとの結論を得て本発明を完成させた。

【００１０】さらに、高濃度の炭酸イオン水溶液中にて
作成されたゲルは、高濃度の無機塩溶液中、好ましくは
高濃度の炭酸イオン水溶液中、さらに好ましくは高濃度
の炭酸アンモニウム水溶液中では、連続撹はん・充填な
どの諸操作下でも十分その成型性と強度を長期間保持す
ることを見い出したのである。

【００１１】特に、本発明によると、従来開示されてい
るような単なるカチオンの存在だけではなく、高濃度の
炭酸イオンが同時に存在することが、成型と同時に強度
をゲルに付加するにあたっては必須である。

【００１２】即ち、本発明は、ポリビニルアルコールと
κ−カラギーナンからなる高分子素材をゲル基材として
用い、微生物または酵素などの生体触媒を包括的に固定
化したゲルを作製する場合において、ゲル成形時に用い
る無機塩溶液が、高濃度の炭酸イオンを含む条件下での
ゲル作製法と、このゲルの高濃度の無機塩溶液中での使
用法である。

【００１３】具体的には、以下のような諸操作により工
業上有効なゲルを作製することができる。まず、ポリビ
ニルアルコールとκ−カラギーナンとからなる固定化用
高分子素材と生体触媒（微生物または酵素など）を、１
０℃から５０℃、好ましくは１５℃から３５℃の恒温下
にて、均一に撹はん・混合する。以下、この溶液を菌体
懸濁液と呼ぶ。この場合、用いるポリビニルアルコール
としては、例えば、重合度５００〜２０００、けん化度
８７．０〜８９．０のものをその代表例として選ぶこと
ができる。

【００１４】また、ゲル基材として使用する水溶性高分
子多糖類としては、κ−カラギーナンが好適な例であ
り、κ−カラギーナンを用いた場合は、その後の反応に
用いるのに十分な成形性と強度を持つゲルを作製するこ
とができる。

【００１５】次に、上述の方法で調製した菌体懸濁液
は、注射針・噴霧器や回転円盤成形器などを用いて、撹
はん状態である高濃度の炭酸イオン水溶液中に逐次滴下
され、粒子径の均一な球状のゲルに成型される。この高
濃度の炭酸イオン水溶液は、その温度が０℃から５０
℃、好ましくは２０℃から３０℃である。このようにし
て、少なくとも直径１ｍｍから１０ｍｍ以下の任意の大
きさの球状のゲルを成形させることが可能である。続い
て、３０分以上撹はんを続けることで、十分な強度のゲ
ルを調整することができる。

【００１６】本発明における高濃度の炭酸イオン水溶液
とは、具体的には、炭酸イオン濃度としては１．５Ｍ以
上、好ましくは２．０Ｍ以上であればよい。含有するカ
チオンとしては、アンモニウムイオンが最も望ましい
が、水素イオンを除く他の無機陽イオンを選ぶこともで
きる。例えば、ナトリウムイオン・カリウムイオン・マ
グネシウムイオン・カルシウムイオン・バリウムイオン
・アルミニウムイオン等の単原子陽イオンをその代表例
に挙げることができる。

【００１７】高濃度の炭酸イオン水溶液中で成形し強度
を付加したゲルは、そのまま高濃度の無機塩溶液中で反
応に供することができる。この時の無機塩溶液の種類に
ついては、ゲルの成形性と強度を維持するのに十分な高
濃度に維持されている限りにおいては、任意に選択する
ことが可能である。好ましくは、以下の（イ）と（ロ）
の２条件を同時に満足していればよい。

【００１８】（イ）含有するアニオンとしては、炭酸イ
オンが最も好ましいが、水酸化物イオンを除く無機陰イ
オンを選ぶことができる。例えば、塩化物イオン等の単
原子陰イオンや硫酸イオン等の多原子陰イオンをその代
表例に挙げることができる。また、陰イオンは、上記に
例示した陰イオン単独、もしくは複数の混合状態で用い
ることができる。さらに、総アニオン濃度としては、
１．５Ｍ以上、好ましくは２．０Ｍ以上が望ましい。

【００１９】（ロ）含有するカチオンとしては、アンモ
ニウムイオンが最も好ましいが、水素イオンを除く無機
陽イオンを選ぶことができる。例えば、ナトリウムイオ
ン・カリウムイオン・マグネシウムイオン・カルシウム
イオン・バリウムイオン・アルミニウムイオン等の単原
子陽イオンを挙げることができる。また、陽イオンは、
上記に例示した陽イオン単独、もしくは複数の混合状態
で用いることができる。さらに、総カチオン濃度として
は、１．５Ｍ以上、好ましくは３．０Ｍ以上が望まし
い。また、アンモニウムイオンの場合は、５．０Ｍ以上
が望ましい。

【００２０】微生物または酵素等の生体触媒に特徴的な
多種多様な生化学反応は、各々に特異的な無機塩濃度を
要求しており、極低濃度から高濃度まで広い範囲に及ん
でいる。この反応が、高い無機塩濃度を特異的に要求す
る場合、または、高い無機塩濃度下でも十分に反応性を
失わない場合には、本発明で開示した方法により、その
生体触媒をゲル中に包括することができる。

【００２１】また、ある種の反応では、高塩濃度下で平
衡反応が一方に片寄ることがあり、このような反応にも
本発明を応用することができる。すなわち、本発明は、
高塩濃度を特異的に要求する反応や高塩濃度下で反応性
を失わない反応のみならず、高塩濃度下において平衡反
応がいずれか一方の側に片寄るような反応すべてについ
ても、その利用が可能である。

【００２２】たとえば、本発明によるゲルを利用できる
反応例として、Ｌ−フェニルアラニン・アンモニア・リ
アーゼによるＬ−フェニルアラニン生成反応を挙げるこ
とができる。同酵素は、低アンモニウムイオン濃度下で
は、Ｌ−フェニルアラニンが分解されて桂皮酸とアンモ
ニアが生じるが、高濃度のアンモニウムイオン溶液中で
は、逆に桂皮酸とアンモニアを基質としてＬ−フェニル
アラニンが生成する。そこで、同酵素または同酵素を生
産している微生物菌体をゲル中に固定して、高濃度の炭
酸アンモニウム溶液中で、桂皮酸とアンモニアよりＬ−
フェニルアラニンを生成・蓄積させることができる。

【００２３】本発明によるゲルに包括固定化することが
できる微生物としては、以下のような属をその代表例と
して挙げることができる。エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ロドスポリジュウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍ）リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）

【００２４】また、本発明によるゲルに包括固定化する
ことができる酵素としては、以下のような酵素をその代
表例として挙げることができる。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．
３．１．５．）ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＥＣ．４．
３．１．３．）アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ＥＣ．４．
３．１．１．） α−アミラーゼ（ＥＣ．３．
２．１．１．）

【００２５】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明方法についてさ
らに具体的に説明する。実施例１重合度１５００、けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール１０重量部およびк−カラギーナン２重
量部を５０℃の温水８８重量部と混合し、よく撹はんし
て均一な溶液にした。この混合物１重量部に対して、乾
重量換算で１０％のエシェリシア・コリー菌体懸濁液１
重量部を加えて、撹はんしながら混合した。以下、この
様な菌体と固定化用高分子素材の混合液を固定化用菌体
懸濁液と呼ぶ。

【００２６】ここで、エシェリシア・コリー菌は、通商
産業省工業技術院生物工業研究所に寄託されており、受
託番号はＦＥＲＭ−ＢＰ３５６９である。以下、この菌
株をＢＰ３５６９と呼称する。

【００２７】また、このエシェリシア・コリー菌体（Ｂ
Ｐ３５６９）は、特開昭６３−３１７０８７と同様にジ
ャーファーメンターを用いて培養を行い、遠心・集菌し
て調製した。

【００２８】一方、アンモニウムイオン濃度で１１．６
Ｍ、炭酸イオン濃度を１．６Ｍ〜４．０Ｍまで変化させ
た種々の炭酸アンモニウム緩衝溶液を調製した。

【００２９】上述の種々の炭酸イオン濃度を有する炭酸
アンモニウム緩衝溶液をゆるやかに撹はんし、続いて、
注射針の先端より固定化用菌体懸濁液をこの溶液中に２
５℃にて滴下して、粒径２．０ｍｍ程度のゲルを作製し
た。

【００３０】各炭酸アンモニウム緩衝溶液中で調製され
たゲルの相対強度を測定した結果を表１に示した。この
内、相対強度で７０以上を有するゲルは、長時間（２０
時間以上）同じ組成の炭酸アンモニウム緩衝溶液中に
て、１００ｒｐｍの撹はん条件下で十分な成型性と強度
を保つことができた。ここで、ゲルの強度測定の方法と
しては、左納らの方法（ケミカルエンジニアリング，Ｖ
ｏｌ．３６，Ｎｏ．６，１９９１）に準じて行った。

【００３１】

【表１】

【００３２】実施例２重合度１５００、けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール１０重量部およびк−カラギーナン２重
量部を５０℃の温水８８重量部と混合し、よく撹はんし
て均一な溶液にした。この混合物１重量部に対して、乾
重量換算で１０％のエシェリシア・コリー菌体懸濁液１
重量部をよく撹はん・混合した。ここで、このエシェリ
シア・コリー菌体（ＢＰ３５６９）は、実施例１と全く
同様の方法にて調製した。

【００３３】一方、アンモニウムイオン濃度で５．０
Ｍ、炭酸イオン濃度を０．５Ｍ〜２．５Ｍまで変化させ
た種々の炭酸アンモニウム緩衝液を調製する。

【００３４】上述の種々の炭酸イオン濃度を有する炭酸
アンモニウム緩衝溶液をゆるやかに撹はんし、続いて、
注射針の先端より固定化用菌体懸濁液をこの溶液中に２
５℃にて滴下して、粒径２．０ｍｍ程度のゲルを作製し
た。

【００３５】各炭酸アンモニウム緩衝溶液中で調製され
たゲルの相対強度を測定した結果を表２に示した。この
内、相対強度で７０以上を有するゲルは、長時間（２０
時間以上）同じ組成の炭酸アンモニウム緩衝溶液中に
て、１００ｒｐｍの撹はん条件下で十分な成型性と強度
を保つことができた。

【００３６】

【表２】

【００３７】実施例３重合度１５００、けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール１０重量部およびк−カラギーナン２重
量部を５０℃の温水８８重量部と混合し、よく撹はんし
て均一な溶液にした。この混合物１重量部に対して、乾
重量換算で１０％のエシェリシア・コリー菌体懸濁液１
重量部をよく撹はん・混合した。ここで、このエシェリ
シア・コリー菌体（ＢＰ３５６９）は、実施例１と全く
同様の方法にて調製した。

【００３８】一方、炭酸イオン濃度で２．５Ｍ、アンモ
ニウムイオン濃度を３．０Ｍ〜１１．０Ｍまで変化させ
た種々の炭酸アンモニウム緩衝液を調製する。

【００３９】上述の種々のアンモニウムイオン濃度を有
する炭酸アンモニウム緩衝溶液をゆるやかに撹はんし、
続いて、注射針の先端より固定化用菌体懸濁液をこの溶
液中に２５℃にて滴下して、粒径２．０ｍｍ程度のゲル
を作製した。

【００４０】各炭酸アンモニウム緩衝溶液中で調製され
たゲルの相対強度を測定した結果を表３に示した。この
内、相対強度で７０以上を有するゲルは、長時間（２０
時間以上）同じ組成の炭酸アンモニウム緩衝溶液中に
て、１００ｒｐｍの撹はん条件下で十分な成型性と強度
を保つことができた。

【００４１】

【表３】

【００４２】実施例４重合度１５００、けん化度８７．０〜８９．０のポリビ
ニルアルコール１０重量部およびк−カラギーナン２重
量部を５０℃の温水８８重量部と混合し、よく撹はんし
て均一な溶液にした。この混合物１重量部に対して、乾
重量換算で１０％のエシェリシア・コリー菌体懸濁液１
重量部をよく撹はん・混合した。

【００４３】このエシェリシア・コリー菌体（ＢＰ３５
６９）は、ロドスポリジュウム・トルロイデス由来のフ
ェニルアラニン・アンモニア・リアーゼを菌体内で大量
に発現させてある。また、このフェニルアラニン・アン
モニア・リアーゼは、アルカリ性の高濃度炭酸アンモニ
ウム溶液中において、桂皮酸とアンモニウムイオンから
Ｌ−フェニルアラニンを生成させることができる。

【００４４】次に、アンモニウムイオン濃度で９．６
Ｍ、炭酸イオン濃度で２．５Ｍの炭酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ９．６）を調製し、ゆるやかに撹はんした。続
いて、固定化用菌体懸濁液を注射針の先端より、この炭
酸アンモニウム緩衝溶液中に滴下し、粒径２．０ｍｍ程
度のゲルを作製した。この際、滴下はすべて２５℃で行
った。

【００４５】さらに、５重量部の炭酸アンモニウム緩衝
溶液（アンモニウムイオン濃度で８．０Ｍ、炭酸イオン
濃度で１．６Ｍ）に対して、得られたゲル１重量部を加
えて、混合・撹はんした。ここで、このゲルは、この炭
酸アンモニウム緩衝溶液中において、１００ｒｐｍの撹
はん条件下で、その形態・強度を安定に保持することが
できた。

【００４６】続いて、菌体１重量部に対して１２重量部
の桂皮酸を、その濃度が０．３％から０．７％の間に保
ちながら装入することにより、約２０時間反応を行わ
せ、Ｌ−フェニルアラニンを緩衝液中に蓄積させた。ま
た、反応温度は３０℃で行った。

【００４７】反応終了後の、Ｌ−フェニルアラニンの濃
度は、５．０％であった。実施例４と比較例１の結果を
表４に併記した。

【００４８】比較例１固定化用高分子素材中に全く包括されていない菌体を用
いて、実施例４と同様の炭酸アンモニウム緩衝溶液中及
び反応条件下で、Ｌ−フェニルアラニンを生成・蓄積さ
せた。すなわち、実施例４と同重量の同一菌体を用い
て、固定化の有無のみを反応条件の差異として、Ｌーフ
ェニルアラニンを蓄積させた場合について、両者の比較
を行った。

【００４９】反応終了後の、Ｌ−フェニルアラニンの濃
度は、５．２％であった。実施例４と比較例１の結果を
表４に併記した。

【００５０】

【表４】

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば、高濃度の炭酸イオンを
含む条件下でゲルを作製し、さらに、このゲルを高濃度
の無機塩溶液中で使用する限りは、成形されたゲルに強
度を付加するプロセスを完全に省略できるので、ゲルの
工業上の利用がより容易になるという効果を期待でき
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者長原清輝福岡県大牟田市浅牟田町30 三井東圧化学株式会社内 (72)発明者福原信裕福岡県大牟田市浅牟田町30 三井東圧化学株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリビニルアルコールとκ−カラギーナン
からなる高分子素材をゲル基材として用い、微生物また
は酵素などの生体触媒を包括的に固定化させたゲルを作
製する場合において、ゲル成形時に用いる無機塩溶液
が、高濃度の炭酸イオンを含む条件下での固定化ゲル作
製法。
【請求項２】請求項１の無機塩溶液の炭酸イオン濃度
が１．５Ｍ以上である場合の固定化ゲル作製法。
【請求項３】請求項２の無機塩溶液が、５．０Ｍ以上
のアンモニウムイオンを含む場合の固定化ゲル作製法。
【請求項４】請求項１，２または３の方法にて調製し
た固定化ゲルを、高濃度の無機塩溶液中にて使用するこ
とにより、包括された微生物または酵素などの生体触媒
に特異的な生化学反応を進行させることを特徴とした固
定化ゲルの使用法。
【請求項５】請求項４の高濃度無機塩溶液が、１．５
Ｍ以上の炭酸イオンを含む場合の固定化ゲル使用法。
【請求項６】請求項４の高濃度無機塩溶液が、高濃度
の炭酸アンモニウム溶液である場合の固定化ゲル使用
法。
【請求項７】請求項６の高濃度の炭酸アンモニウム溶
液が、炭酸イオン濃度が１．５Ｍ以上、アンモニウムイ
オン濃度が５．０Ｍ以上である場合の固定化ゲル使用
法。