JPH0195792A

JPH0195792A - 新規４６ｎｗ−０４ａ物質，その製造法およびそれを有効成分とする抗ウィルス製剤

Info

Publication number: JPH0195792A
Application number: JP62251592A
Authority: JP
Inventors: Isamune Kamei; 勇統亀井; Yoshio Ezura; 絵面　良男; Takahisa Kimura; 木村　喬久; Yoshifumi Arai; 新井　好史; Masanobu Munakata; 正信棟方; Minoru Kamimura; 稔上村
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1987-10-07
Publication date: 1989-04-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規４６Ｎｔ−０４Ａ物質、その製造法および
それを有効成分とする抗ウィルス製剤に関するものであ
る。

〔従来の技術２発明が解決しようとする問題点〕現在、
動物性タンパク資源確保の観点から世界的に魚介類の増
養殖が活発に行なわれる様になってきている。それに伴
ない疾病被害が大きな問題となっている。特にウィルス
病はその伝帳が早く、被害も極めて大きい。しかるに、
従来はこれらの被害を有効に防止しうる薬剤がなく、そ
の開発が強く望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、魚類生息域から分離した微生物の中から
魚類病原ウィルスに対する抗ウィルス活性を有するシュ
ードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）を発
見し、その培養液から抗ウィルス作用を有する４６ＮＷ
−０４Ａ物質を単離・精製したところ、従来の報告にな
い新規な物質であることが判明した。本発明はこのよう
な知見に基づき完成されたものである。

本発明の新規な４６Ｎｔ−０４Ａ物質は下記の物理化学
的性質を有している。

（イ）分子量：１１２６（ＳＩ−マススペクトルによる
）（ロ）元素分析（実測値）：炭素５４．６８％、水素８
．４９％、窒素１０．０％（ハ）融点：２０６〜２０８℃ （ニ）比施光度：　〔α〕も５−４７．５　（Ｃ＝２．
０゜メタノール）（ネ）紫外線吸収スペクトル；第１図のとおり（へ）赤
外線吸収スペクトル：第２図のとおり（ト）水素核磁気
共鳴スペクトル：第３図のとおり（チ）炭素核磁気共鳴
スペクトル：第４図のとおり（す）シリカゲル薄層クロ
マトグラフィーのＲｆ　値：０．３２（展開溶媒　クロ
ロホルム：メタノール＝３：１）０．５Ｎ展開溶媒　酢
酸エチル：メタノール−１：１）０．０（展開ン容媒　
酢酸エチル）０．０（展開溶媒　ベンゼン：アセトン−２：１）（ヌ
）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキ
サイドに易溶；クロロホルム。

酢酸エチル、ベンゼン、ピリジンに可溶；ジエチルエー
テルに難溶；ｎ−ヘキサン。

石油エーテル、水に不溶（＋））呈色反応：ブロモクレゾールグリーン、ジニトロフェニールヒドラ
ジン、ドラーゲンドルフ、８−ヒドロキシキノリン−Ｎ
Ｈ，ｌ、アニスアルデヒドの各試薬に陽性；過マンガン
酸カリウム、アンスロン、バートン、　酢酸ｍ、　　リ
ーガル、モーリシュ、ニンヒドリン、ローダミンの各試
薬に陰性（才）安定性：ｐＨ３〜１０で安定（ワ）外観点性状：白色粉末上記４６ＮＷ−０４Ａ物質は、シュードモナス属に属す
る上記４６ＮＷ−０４Ａ物質生産菌を培地に培養し、培
養液から該物質を採取することによって製造することが
できる。

上記４６ＮＷ−０４Ａ物質生産菌の１例として、本発明
者らが北海道大学水産学部附属上飯養魚実習施設の用水
路の水から分離した細菌シュードモナスｓｐ、　４６　
ＮＷ−０４株がある。このシュード、モナスｓｐ、４６
　ＮＷ　−０４株の菌学的性質は次の通りである。

■、形態学的性質ダラム陰性の桿菌で、芽胞を形成せず、数本の極鞭毛を
有する好気性細菌である。

■、生理学的性質（１１生育温度＝５〜３０℃９至適温度：２０℃（２）
酸素に対する挙動：好気性（３）ゼラチン液化：陽性（４）脱窒素能：陰性（５）　　レシチン分解能：陽性（６）アルギニンヒドラーゼ：陽性（７）ＰＨＢの蓄積：陰性（８）蛍光色素産生：陽性（９）オキシダーゼ：陽性００）　　Ｉ！の発酵性：陰性（１１）　　シュークロースからのレバン形成：陽性θ
２）デンプン分解能；陰性０３）酪酸資化性：陽性圓　プロピレングリコール資化性：陽性０（ルレハロー
ス資化性：陰性００　　モルＧＣ％：５９．９％本望はバージ−のマニュアル・オブ・システマチック・
バタテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、　Ｖｏｌ、　Ｌ　１９８４年版）の記載によりシュー
ドモナス・フローレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
千１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ｂｉｏｙａｒａ）に類似した
苗と推定された。ただし、本望は醋酸、プロピレングリ
コールを資化し、トレハロースを資化しない点で該公知
菌と異なっている。それ故、本発明者らは本望を新菌株
シュードモナスｓｐ、４６ＮＷ−０４（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｓｐ、　４６　ＮＷ−０４）株と命名した。

本望は工業技術院微生物工業技術研究所に受託されてお
り、その受託番号はＦＥＲＭ　　Ｐ−９５７９）である
。

新規な４６ＮＷ−０４Ａ物質を生産するための微生物は
上記４６ＮＷ−０４株に限定されず、その変異株のほか
４６ＮＷ−０４株以外のシュードモナス属に属するもの
であっても、当該物質生産能を有する菌株であれば使用
することができる。

４６ＮＶＬ−０４Ａ物質はシュードモナス属に属する４
６ＮＷ−０４Ａ物質生産菌を通常の細菌用液体培地に培
養することによって製造することができる。

本発明により上記４６ＮＷ−０４Ａ物質生産菌を培養す
るために用いる培地としては、当該菌体が利用しうる炭
素源、窒素源、無機塩類等を含有するものであればよい
。炭素源としては例えばグルコース、マルトース、ガラ
クトース、シュークロース等が用いられ、窒素源として
は例えば肉エキス、酵母エキス、大豆粉、ペプトン、カ
ザミノ酸、硫酸アンモニウム等が用いられる。その他必
要に応じて適宜の無機塩類、消シ包剤等を添加すること
ができる。

前記のごとき栄養源を有する液体培地で大量培養するに
は、深部通気液体培養が有利であり、培養温度は２０〜
３０℃１特に２５〜２７℃が最適である。

４６ＮＶ／−０４Ａ物質の生産に最も適した培地。

例えばカザミノ＃０．５％、酵母エキス０．０５％、グ
ルコース０．１％、塩化ナトリウム０．６８％。

塩化カリウム０．０４％、硫酸マグネシウム０．０２％
。

塩化カルシウム０．０２６％を含むｐＨ７，２のＣＹＧ
培地を用い、２５℃でロータリー振盪培養を行なった場
合、３日間培養すると培養液の抗ウィルス活性は最大と
なる。

４６ＮＷ−０４Ａ物質の培養液中からの分離・精製は次
のようにして行なうことができる。培養液に酢酸エチル
を添加して攪拌し、酢酸エチル層を集めて減圧濃縮後、
シリカゲル、シリシックアシド等に吸着させ、クロロホ
ルム：メタノール（９：１）からクロロホルム：メタノ
ール（１：１）で溶出され、抗ウィルス活性を示す分画
を集め減圧濃縮後、分取用シリカゲル薄層クロマトグラ
フィーまたは分取用高速液体シリカゲルクロマトグラフ
ィーで精製する。次いで、この例では最終的には高速液
体ＣＩｌ＋フェニルゲルクロマトグラフィーで単離した
。このようにして得られた４６ＮＷ−０４Ａ物質の物理
化学的性質を表−１および表−２に示す。

表−１４６ＮＷ−０４Ａ　　　　の　　　、　　′　・形　　
状：　　　　　　　　白色粉末融　　点＝　　　　　　　　　　　２０６〜２０８℃比
施光度：　　　　　　　　　〔α）　２５−４７．５（
Ｃ・２゜メタノール）分子量（マススペクトル）：１１２６紫外線吸収スペクトル：　　第１図赤外線吸収スペクトル：　　第２図水素核磁気共鳴スペクトル：第３図炭素核磁気共鳴スペクトル：第４図溶解性：易溶　メタノール、エタノール、アセトン、ジ
メチルズルホキサイド可溶　クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、ピリジン不溶　ｎ〜ヘキサン、石油エーテル、水星色反応：陽性
　ブロモクレゾールグリーン。

ジニトロフェニールヒドラジン。

ドラーゲンドルフ。

８−ヒドロキシキノリン−ＮＨ４゜アニスアルデヒド陰性　過マンガン酸カリウム。

アンスロン、バートン、酢酸銅。

リーガル、モーリシュ、ニンヒドリノ、ローダミン安定性：ｐｌ＋３〜ｌＯで安定表−２クロロホルム：メタノール（３Ｘ２）　　　０．３２酢
酸エチル：メタノール（１：１）　　　　０．５１酢酸
エチル　　　　　　　　　　　　　　０．０ベンゼン：
アセトン（２：１）　　　　　　ｏ、。

本物質は第２図に示した赤外線吸収スペクトルより３５
００〜３２００ｃｍ−’　：アルコール、アミノ基、１
７３０ｃｍ−’　：ケトン伸縮振動、１６５０ｃｍ−’
：カルボニル伸縮振動等を持つ化合物であることがわか
る。また、第３図水素核磁気共鳴スペクトル、第４図炭
素核磁気共鳴スペクトルよりアミノ基、カルボキシル基
のピークが認められ、ペプチド系の物質と推定される。

本発明の４６Ｎｔ−０４Ａ物質の抗ウィルス活性は、サ
ケ科主要病源ウィルスであるサケ科魚類ヘルペスウィル
ス（ＯＭＶ）および伝染性造血器壊死ウィルス（ＩＨＮ
Ｖ）に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗ウィルス活性で示
し、その結果を表−３に示した。

表−３１２，５６０５８＊１：サケ科魚類ヘルペスウィルス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎ
ｃｈｕｓｍａｓｏｕ　ｖｉｒｕｓ）＊２：伝染性造血器壊死症ウィルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｕｓｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　
ｖｉｒｕｓ）本抗ウィルス物質４６ＮＷ−０４Ａを１５
℃で１時間ウィルス懸濁液と反応させ、サケ科細胞のｃ
Ｈ８Ｅ−２１４細胞に接種後、ウィルス吸着の後、細胞
をＲａｎｋｓ’　ＢＳＳで洗浄を行なった場合、ＤＮＡ
ウィルスであるＯＭＶに対しては２５μｇ／ｍｌの濃度
で完全にプラーク形成で阻止した。一方、ＲＮＡウィル
スのＩ　ＨＮＶに対しては５０μｇ／ｍｆｆ１の濃度で
完全にプラーク形成を阻止した。１２．５μｇ／ｍｆｌ
の濃度での両ＯＭＶおよびＩＨＮＶへのプラークリダク
ションはそれぞれ６０％と５０％であり、Ｉ　ＨＮＶに
対しては２５μｇ／ｍｌ！の濃度で９４％のプラークリ
ダクションが観察された。この抗ウィルス物質４６ＮＷ
−０４Ａの抗ウィルス作用機序はウィルスの細胞吸着阻
害かウィルス粒子の崩壊であることから、ウィルス感染
を阻止する新規抗ウィルス物質として魚類ウィルス病の
防疫対策に役立つのみならず、広く動物ウィルス病の予
防・治療への利用が期待される。

４６ＮＷ−０４Ａ物質はそのまま魚、動物または人に投
与することもできるが、一般には生理学的に許容される
種々の担体と組み合わせて抗ウィルス製剤として通常使
用されている剤形で投与される。そのような製剤の例と
しては、例えばカプセル剤、顆粒剤、散剤１錠剤、粉剤
、トローチ剤。

火剤、シロップ剤、軟膏剤、坐剤、注射剤、注入剤等の
他、特に魚や動物に対しては添加物としての形態が挙げ
られる。

また、そのような製剤には必要に応じて上記担体の他に
補助剤、安定剤、賦形剤２着色剤、芳香剤等を含有せし
めてもよい。さらに、４６ＮＷ−０４Ａ物質は単独で、
または抗生物質等の他の薬剤との合剤として使用するこ
とができる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１シュードモナスｓｐ、４６ＮＷ−０４Ａ株（ＦＥＲＭＰ
−９５７９）をＣＹＧ液体培地（０，５％　カザミノ酸
（Ｄｉｒｃｏ）、　０．０５％　酵母エキス（Ｄｉｒｃ
ｏ）。

０．１％グルコース、０．６８％　ＮａＣ１，０，０４
％　ＫＣＩ、０．０２％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ９０．
０２６％　Ｃａ　ＣＡｚ・２ＨｚＯを含む。ｐｎ　７．
２　）１００戚１５００滅容フラスコに接種し、２５℃
で２日間１６０ｒ、ｐ、ｍ、で振とう培養した。培養液
２５戚ずつを４木の５２容三角フラスコ中のＣＹＧ液体
培地　２．！Ｍ！に接種し、２５℃で３日間１６０ｒ、
ｐ、ｍ、で振とう培養した。得られた培養上清液１０！
を同量の酢酸エチルで２回抽出した。２０ｆｆｉの酢酸
エチル層を２ｎまで濃縮し、無水硫酸ナトリウムで脱水
後、褐色の粗抽出物１．２ｇを得た。

同じ操作を３回行ない計３０！！、の培養液から３．７
ｇの油状粗抽出物を得、これを少量のメタノール−クロ
ロホルムに溶解させ、シリカゲル（キーゲルゲル６０，
２３０〜４００メツシユ、メルク社）を充填したカラム
（５０ｍ＋ｎＸ　１５０ｍｍ）上に加えた。クロロホル
ム、クロロホルム：メタノール（９：１）から同（７：
　Ｉ）、　　（５：　１）。

（３：１）、　　（１：１）に順次極性を上げながら溶
出させた。

活性画分を濃縮後、少量のメタノール−クロロホルム混
液に溶解させ、展開溶媒をクロロホルム。

クロロホルム：メタノール（９：１）から同（７：ｌ）
、（５：１）に順次極性を高めなからＴＬＣ（キーゼル
ゲル６０Ｆ２５４、メルク社）を行なった。ＴＬＣを５
回行ない最終的に７０９■の精製４６ＮＷ−０４Ａを得
た。なお、４６ＮＷ−０４Ａの検出はアニスアルデヒド
呈色反応と、サケ科魚類病源ウィルスの１つである伝染
性造血器壊死症ウィルス（ｒＨＮＶ）対する抗ウィルス
活性をプラークリダクション法で確認すること番こより
行なった。種々の展開溶剤によるＴＬＣで単一スポット
であることを確認し、精製を終了した。

〔発明の効果〕

本発明の新規物質４６Ｎｔ−０４Ａ物質はシュードモナ
ス属に属する該物質生産菌を培養することによって得ら
れる。また、この４６ＮＷ−０４Ａ物質は抗ウィルス活
性を有しており、特に魚類病理ウィルスに対する抗ウィ
ルス活性を有している。

【図面の簡単な説明】

第１図ば４６Ｎｔ−０４Ａ物質をメタノールに溶かして
測定した紫外線吸収スペクトル（実線は中性１点線はア
ルカリ性、鎖線は酸性での結果を示す。）である。第２図は４６ＮＷ−０４Ａ物質を臭化カリウム錠／剤法
で測定した赤外線吸収スペクトルである。第３図は４６ＮＷ−０４Ａ物質を重メタノールに熔かし
て測定した水素核磁気共鳴スペクトルである。第４図は４６ＮＷ−０４Ａ物質を重メタノールに溶かし
て測定した炭素核磁気共鳴スペクトルである。第１図

Claims

【特許請求の範囲】１）、下記の物理化学的性質を有する新規４６ＮＷ−０
４Ａ物質。（イ）分子量：１１２６（ＳＩ−マススペクトルによる
）（ロ）元素分析（実測値）：炭素５４．６８％、水素８
．４９％、窒素１０．０％（ハ）融点：２０６〜２０８℃ （ニ）比施光度：〔α〕＿Ｄ＾２＾５−４７．５（Ｃ＝
２．０、メタノール）（ホ）紫外線吸収スペクトル：第１図のとおり（ヘ）赤外線吸収スペクトル：第２図のとおり（ト）水素核磁気共鳴スペクトル：第３図のとおり（チ）炭素核磁気共鳴スペクトル：第４図のとおり（リ）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０
．３２（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝３：１）
０．５１（展開溶媒酢酸エチル：メタノール＝１：１）
０．０（展開溶媒酢酸エチル）０．０（展開溶媒ベンゼ
ン：アセトン＝２：１）（ヌ）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、
アセトン、ジメチルスルホキサイドに易溶；クロロホル
ム、酢酸エチル、ベンゼン、ピリジンに可溶；ジエチル
エーテルに難溶；ｎ−ヘキサン、石油エーテル、水に不
溶（ル）呈色反応：ブロモクレゾールグリーン、ジニトロ
フェニールヒドラジン、ドラーゲンドルフ、８−ヒドロ
キシキノリン−ＮＨ＿３、アニスアルデヒドの各試薬に
陽性；過マンガン酸カリウム、アンスロン、バートン、
酢酸銅、リーガル、モーリシュ、ニンヒドリン、ローダ
ミンの各試薬に陰性（オ）安定性：ｐＨ３〜１０で安定（ワ）外観点性状：白色粉末２）、シュードモナス属に属し、下記の物理化学的性質
を有する４６ＮＷ−０４Ａ物質を生産する細菌を培地に
培養し、培養物から該４６ＮＷ−０４Ａ物質を採取する
ことを特徴とする新規４６ＮＷ−０４Ａ物質の製造法。（イ）分子量：１１２６（ＳＩ−マススペクトルによる
）（ロ）元素分析（実測値）：炭素５４．６８％、水素８
．４９％、窒素１０．０％（ハ）融点：２０６〜２０８℃ （ニ）比施光度：〔α〕＿Ｄ＾２＾５−４７．５（Ｃ＝
２．０、メタノール）（ホ）紫外線吸収スペクトル：第１図のとおり（ヘ）赤外線吸収スペクトル：第２図のとおり（ト）水素核磁気共鳴スペクトル：第３図のとおり（チ）炭素核磁気共鳴スペクトル：第４図のとおり（リ）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０
．３２（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝３：１）
０．５１（展開溶媒酢酸エチル：メタノール＝１：１）
０．０（展開溶媒酢酸エチル）０．０（展開溶媒ベンゼ
ン：アセトン＝２：１）（ヌ）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、
アセトン、ジメチルスルホキサイドに易溶；クロロホル
ム、酢酸エチル、ベンゼン、ピリジンに可溶；ジエチル
エーテルに難溶；ｎ−ヘキサン、石油エーテル、水に不
溶（ル）呈色反応：ブロモクレゾールグリーン、ジニトロ
フェニールヒドラジン、ドラーゲンドルフ、８−ヒドロ
キシキノリン−ＮＨ＿３、アニスアルデヒドの各試薬に
陽性；過マンガン酸カリウム、アンスロン、バートン、
酢酸銅、リーガル、モーリシュ、ニンヒドリン、ローダ
ミンの各試薬に陰性（オ）安定性：ｐＨ３〜１０で安定（ワ）外観点性状：白色粉末３）、シュードモナス属に属する４６ＮＷ−０４Ａ物質
生産菌が、シュードモナスｓｐ．４６ＮＷ−０４（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−９５７９）である特許請求の範囲第２項記載
の方法。４）、下記の物理化学的性質を有する新規４６ＮＷ−０
４物質を有効成分とする抗ウィルス製剤。（イ）分子量：１１２６（ＳＩ−マススペクトルによる
）（ロ）元素分析（実測値）：炭素５４．６８％、水素８
．４９％、窒素１０．０％（ハ）融点：２０６〜２０８℃ （ニ）比施光度：〔α〕＿ｄ＾２＾５−４７．５（Ｃ＝
２．０、メタノール）（ホ）紫外線吸収スペクトル：第１図のとおり（ヘ）赤外線吸収スペクトル：第２図のとおり（ト）水素核磁気共鳴スペクトル：第３図のとおり（チ）炭素核磁気共鳴スペクトル：第４図のとおり（リ）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０
．３２（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝３：１）
０．５１（展開溶媒酢酸エチル：メタノール＝１：１）
０．０（展開溶媒酢酸エチル）０．０（展開溶媒ベンゼ
ン：アセトン＝２：１）（ヌ）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、
アセトン、ジメチルスルホキサイドに易溶；クロロホル
ム、酢酸エチル、ベンゼン、ピリジンに可溶；ジエチル
エーテルに難溶；ｎ−ヘキサン、石油エーテル、水に不
溶（ル）呈色反応：ブロモクレゾールグリーン、ジニトロ
フェニールヒドラジン、ドラーゲンドルフ、８−ヒドロ
キシキノリン−ＮＨ＿３、アニスアルデヒドの各試薬に
陽性；過マンガン酸カリウム、アンスロン、バートン、
酢酸銅、リーガル、モーリシュ、ニンヒドリン、ローダ
ミンの各試薬に陰性（オ）安定性：ｐＨ３〜１０で安定（ワ）外観点性状：白色粉末