JPH0424991B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、糖尿病の治療を目的として脂肪酸分
解阻害剤として有用なＮ−アシルエメリアミンの
製造法に関する。 従来の技術 Ｎ−アシルエメリアミンは、本発明者らによつ
て、エメリセラ属菌を培地に培養することによ
り、培地中に生成蓄積させ得ることが見い出され
た（日本特開昭58−96049号公報；日本特許出願
昭和58年第93179号明細書参照）。 発明が解決しようとする問題点 Ｎ−アシルエメリアミンの培地中における生産
量を増大させると、該化合物の分離、精製の点で
工業的生産上有利である。 問題点を解決するための手段 そこで、本発明者らは、Ｎ−アシエメリアミン
の生成蓄積量を増大させる方法について鋭意研究
したところ、培地中にγ−ブチロベタインおよ
び／またはクロトニルベタインを添加し培養する
ことにより、該目的物を著量生成蓄積せしめるこ
とを見い出し、これに基づいてさらに研究した結
果、本発明を完成した。 本発明は、エメリセラ属に属し一般式（） （式中、ＲはCOCH₃、COCH₂CH₃または
COCH₂CH₂CH₃を示す。）で表わされるＮ−アシ
ルエメリアミンを生産する能力を有する微生物を
培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積さ
せ採取し該化合物を製造するにあたり、培地中に
γ−ブチロベタインおよび／またはクロトニルベ
タインを添加することを特徴とするＮ−アシルエ
メリアミンの製造法である。 本明細書において、式（）においてＲが−Ｈ
である化合物をエメリアミン（Emriamine）と
称する。 本発明に用いられる微生物としては、エメリセ
ラ（Emericella）属に属し、Ｎ−アシルエメリ
アミン（）を生産する能力を有するものであれ
ば、いずれをも用いることができる。その例とし
ては、たとえばエメリセラ・カドリリネアター
（Emericella quadrilineata）が挙げられ、さら
に具体的には、エメリセラ・カドリリネアター
IFO 5859株、その変異株であるエメリセラ・カ
ドリリネアターSc−10−125株が挙げられる。 エメリセラ・カドリリネアターの菌学的性状は
日本菌学会会報第20巻第４号481頁（1979年）、ト
ランスアクシヨンズ・オブ・ザ・ミコロジカル・
ソサエテイ・オブ・ジヤパン（Transactions of
The Mycological Society of Japan）vo1.20、
No.４、481（1979）に記載の菌学的性状と同一であ
る。 上記エメリセラ・カドリリネアターIFO5859株
は、財団法人発酵研究所（IFO）に昭和29年９月
14日に寄託され、該研究所（IFO）発行のリス
ト・オブ・カルチヤーズ第６版1978年（Institute
For Fermentation、Osaka、List of Cultures、
1978、Sixth Edition）に記載されている。 また、上記エメリセラ・カドリリネアターSc
−10−125株は、財団法人発酵研究所に昭和59年
３月22日に受託番号IFO 31501として寄託されて
いる。また、本微生物は、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（FRI）に昭和59年３月28
日に受託番号FERM Ｐ−7566として寄託されて
いる。 エメリセラ属は分類学上アスペルギルス属のう
ち完全世代が明らかになつた株をまとめたもので
あるので、菌株の有性世代や無性世代とは無関係
にＮ−アシルエメリアミンを生成する能力を有す
る菌株があれば、いずれの属の微生物を用いるこ
とができることは言うまでもない。 エメリセラ属菌は、微生物の一般的性質として
自然的にまたは変異剤によつて変異を起し得る。
たとえばＸ線、ガンマー線、紫外線等の放射線の
照射、更には単胞子分離、種々の薬剤による処理
または薬剤を含有する培地上での培養、その他の
手段で変異させて得られる多くの変異株、あるい
は自然的に得られた突然変異株等であつても、Ｎ
−アシルエメリアミンを生産する性質を有するも
のはすべて本発明の製造方法に利用し得る。 Ｎ−アシエメリアミンの製造方法の培養に用い
られる培地は用いられる菌株が利用し得る栄養源
を含むものなら、液状でも固状でもよいが、大量
を処理するときには液体培地を用いるのがより適
当である。培地には同化し得る炭素源、消化し得
る窒素源、無機物質、微量栄養素が適宜配合され
る。炭素源としては、たとえばブドウ糖、乳糖、
シヨ糖、麦芽糖、デキストリン、でん粉、グリセ
リン、マンニトール、ソルビトール、油脂類
（例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、ごま油、ラ
ード油、チキン油など）、各種脂肪酸類（例、ラ
ウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステア
リン酸、オレイン酸など）、窒素源としては、た
とえば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆
粉、コーン、スチープ、リカー、ペプトン、綿実
粉、廃糖蜜、尿素、アンモニウム塩類（例、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウムなど）その他が用いられ
る。さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、
マグネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、ニツケルなどの金属塩類、リン
酸、ホウ酸などの塩類や酢酸、プロピオン酸など
の有機酸の塩類が適宜用いられる。その他、アミ
ノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラ
ニン、リジン、バリン、メチオニン、プロリン
等）、ペプチド（例、ジペプチド、トリペプチド
等）、ビタミン類（例、B₁，B₂、ニコチン酸、
B₁₂、Ｃ等）、該酸類（例、プリン、ピリミジン
およびその誘導体）等を含有させてもよい。もち
ろん培地のPHを調節する目的で無機または有機の
酸、アルカリ類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡
の目的で油脂類、表面活性剤等の適量が添加され
る。 培地に添加されるγ−ブチロベタインおよび／
またはクロトニルベタインの添加量は、目的物の
蓄積量が最大になるように約0.05％〜、ｗ／ｖ％
に選択するのが良い。とりわけ約0.1％〜1w／ｖ
％の範囲で添加が望ましい。 その添加時期は、添加効果が認められる時期な
らいつでも良いが、とりわけ培養初期から添加し
ておいた方が、より大きな効果が期待でき望まし
い。 上記化合物は、塩の形のものを用いてもよく、
該塩の例としてはたとえば、塩酸、硫酸、硝酸、
蓚酸、酢酸などが挙げられる。 培養の手段は静置培養でも、振盪培養あるいは
通気撹拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の
処理には、いわゆる深部通気撹拌培養によるのが
望ましいことはいうまでもない。培養の条件は培
地の状態、組成、菌株の種類、培養の手段等によ
つて一定しないのは当然であるが、それらは通常
約15℃〜37℃の温度で、初発PH約３〜８付近に選
択するのがよい。とりわけ、培養中期の温度は約
23℃〜32℃、また初発PHは約４〜６の条件が望ま
しい。培養期間も前記の諸条件により一定しない
が、該化合物（）の濃度が最大となるまで培養
するのがよい。これに要する時間は液体培地を用
いる振盪培養または通気撹拌培養の場合は通常約
１〜12日間程度である。 生成したＮ−アシルエメリアミンは主として培
養液中に存在するので、培養物を遠心分離ある
いは過によつて上澄液と菌体とに分離し、その
上清液から精製するのが有利である。しかし培養
物から直接に精製することも可能である。 さらにこのＮ−アシルエメリアミンを採取する
には微生物が生産する代謝産物を採取するのに通
常用いられる手段を適宜利用することが出来る。
たとえば遠心分離によつて菌体を除去したのち、
その液から一般に有効物質を分離、採取、精製
する方法を用いる。 すなわち適当な溶媒に対する溶解性および溶解
度の差、溶液からの析出法および析出速度の差、
種々の吸着親和力の差、イオン交換体によるイオ
ン交換クロマトグラフイー、あるいは減圧濃縮、
凍結乾燥、結晶化、再結晶、乾燥などの手段が単
独あるいは任意の順に組合わせて、または反復し
て利用される。 作 用 本発明方法によつて得られるＮ−アシルエメリ
アミンは、脂肪酸分解阻害作用を有する（日本特
開昭58−96049号公報；日本特許出願昭和58年第
93179号明細書参照）。 毒性については、エメリアミンの急性毒性
LD₅₀値は、マウス静脈内注射で400mg／Kg以上で
あり、化合物（）においてＲ＝COCH₃、Ｒ＝
COCH₂CH₃およびＲ＝COCH₂CH₂CH₃である化
合物の急性毒性は、いずれもマウス静脈内注射で
400mg／Kg以上であるので、Ｎ−アシルエメリア
ミンの毒性は低い。 したがつて、本発明の化合物（）またはその
塩は、たとえば脂肪酸分解阻害剤として有用であ
る。化合物（）またはその塩を脂肪酸分解阻害
剤として用いるには、たとえば哺乳動物（例、マ
ウス、ラツト、人など）の糖尿病の治療を目的と
して、化合物（）として約0.2ないし200mg／Kg
を１日投与量として投与する。また、化合物
（）またはその塩を投与するにあたつては、常
套手段によつてそれ自体あるいは適宜の薬理的に
許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、たと
えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの剤型
にして経口的に、またたとえば注射剤として非経
口的に投与することができる。 実施例 以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的
に説明する。以下において、パーセント（％）は
とくにことわりのないかぎり、重量／容量パーセ
ントを示す。 実施例 １ エメリセラ・カドリリネアターIFO 5859株ま
たはこれにより紫外線照射によつて誘導した高生
産性のエメリセラ・カドリリセアターSc−10−
125株（IFO 31501、FERM Ｐ−7566）を、大豆
油７％、ラクトーズ0.5％、乾燥酵母５％、
NaCl0.1％及びクロトニルベタイン添加又は無添
加からなる培値（PH6.0）40mlを含む200ml容三角
フラスコにそれぞれ接種し、28℃で10日間振盪培
養した。得られた培養液の除菌液中のＮ−アシ
ルエメリアミンの測定を行ない、下表の結果が得
られた。

【表】 なお、Ｎ−アシルエメリアミンの蓄積量は、下
記の方法に従つて高速液体クロマトグラフイーを
用いて測定した。後述の実施例２および３も同様
である。すなわち、0.1M酢酸緩衝液PH4.0で予め
緩衝化したDowex−50w×２〔ダウ・ケミカル社
（米国）製〕の１〜1.5mlを充めたカラムに培養
液の１mlをかけた後、0.1M酢酸緩衝液PH4.03ml
及び0.1M酢酸緩衝液PH5.51mlで洗つた。次いで
0.1M酢酸緩衝液PH5.53mlで溶出し、この画分の
15μを高速液体クロマトグラフイー（ポンプ；
ウオーターズ社モデル6000A、検出装置；ウオー
ターズ社モデル440214nｍ、注入器；ウオーター
ズ社モデルU6K、記録装置；クロマトグラムプ
ロセツサー7000AS シスラムインスツルメンツ
株式会社、カラム；YMC−PackA−312（６×
150mm）山村化学株式会社、移動相；４％アセト
ニトリル−0.004Mオクタンスルホオン酸ナトリ
ウム−0.02Mりん酸緩衝液PH3.7）に注入し測定
した。さらに必要に応じて移動相のアセトニトリ
ルの濃度を２〜８％の間で変化させ、各成分の定
量を容易にした。 実施例 ２ エメリセラ・カドリリネアターIFO 5859株ま
たはエメリセラ・カドリリネアターSc−10−125
株（IFO 31501、FERM Ｐ−7566）を、大豆油
７％、ラクトーズ0.5％、乾燥酵母５％、NaCl0.1
％及びγ−ブチロベタイン添加又は無添加からな
る培地（PH6.0）40mlを含む200ml容三角フラスコ
にそれぞれ接種し、28℃で９日間振盪培養した。
得られた除菌液中のＮ−アシルエメリアミンの
測定を行ない、下表の結果が得られた。

【表】 実施例 ３ エメリセラ・カドリリネアターIFO 5859また
はエメリセラ・カドリリネアターSc−10−125株
（IFO 31501、FERM Ｐ−7566）を、大豆油７
％、ラクトーズ0.5％、乾燥酵母５％、NaCl0.1
％、クロトニルベタイン0.1％及びγ−ブチロベ
タイン0.1％、PH6.0からなる培地40mlを含む200
ml容三角フラスコにそれぞれ接種し、28℃で９日
間振盪培養した。得られた除菌液中のＮ−アシ
ルエメリアミンの生成量を測定し以下の結果が得
られた。

【表】 発明の効果 本発明法によると、目的とするＮ−アシルエメ
リアミンの生成量を増大させることができる。ま
たこのように、Ｎ−アシルエメリアミンの生成量
を増大させることができれば、培養物からのＮ−
アシルエメリアミンの精製単離の工程がより容易
になるので、本発明法は、Ｎ−アシルエメリアミ
ンの工業的生産において有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エメリセラ属に属し一般式 （式中、ＲはCOCH₃、COCH₂CH₃または
   COCH₂CH₂CH₃を示す。）で表わされるＮ−アシ
   ルエメリアミンを生産する能力を有する微生物を
   培地に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積さ
   せ採取し該化合物を製造するにあたり、培地中に
   γ−ブチロベタインおよび／またはクロトニルベ
   タインを添加することを特徴とするＮ−アシルエ
   メリアミンの製造法。