JPH04169191A - 新規な抗真菌物質ｋｒｆ―００１複合体の発酵および精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な微生物たるハノラス・サフチリス亜種り
リッチェンノス＜Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓｓｕｂｓｐ、Ｋｒ１ｃｔｉｅｎｓｉｓ　）ま１こはこ
の変異株を培養または醗酵させ新規な抗真菌物質ＫＲＦ
−００１複合体を生産する方法およびこれを精製する方
法に関するものである。

本発明の発明者等は、無公害抗真菌物質を探索するため
の微生物スクリーニング研究を遂行して新規且つ有用な
菌種を選別し、この菌株か生産する一連の抗真菌物質等
が新規なペプチド化合物なることを確認した（本出願と
同日付出願の「新規なバシラス・サブチリス亜種および
それから生産される抗真菌物質ＫＲＦ−００１複合体」
の明細書参照）。

本発明の発明者等は上記一連の新規ペプチド系抗真菌物
質等をＫＲＦ−００１と命名し、この産業化過程におい
て必須的な生産収率の増大のための醗酵方法と生産され
たＫＲＦ−００１を効率的に収得することのできる精製
方法を開発して本発明を完成した。

結局、本発明の目的はＫＲＦ−００１を１９９０年７月
２６日アメリカ合衆国菌株保存協会（ＡＴＣＣ）に寄託
された新規なバシラス・サブチリス亜種フリッチエンシ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　５ｕｂｓｐ、
Ｋｒ１ｃｔｉｅｎｓｉｓ、　ＡＴＣＣ５５０７９）およ
びバシラス・サブチリス亜種フリッチエンシスＭ　ｌ　
８−９１　　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ
　５ｕｂｓｐ。

Ｋｒ１ｃｔｉｅｎｓｉｓ、　Ｍ　１８−９１．　ＡＴＣ
Ｃ５５０７８）から醗酵させ収得可能な量を極大化する
ことのてきる方法と、その生産されたＫＲＦ−００１を
純粋に分離精製する方法であって効率的に最大量収得可
能な方法を提供するにある。

〔従来の技術〕

従来の抗真菌物質を生産すｇ菌株による生産工程におい
て、産業化過程で必須的な生産収率の増大および生産さ
れた抗真菌物質の精製か効果的に行われていなかった。

〔発明か解決しようとする課題〕

このような状況の下に、無公害抗真菌物質を探索するた
めの微生物スクリーニングおよび生産物質の生産収率増
大のための醗酵方法および効率的な精製方法の開発か要
求された。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の発明者等は上記課題を解決するために微生物ス
クリーニング研究を行って、新規且つ有用な菌株を選別
し、この菌株か生産する一連の抗真菌物質等か新規なペ
プチド化合物なることを確認した（本出願と同日付に出
願の「新規なバシラス・サブチリス亜種およびそれから
生産される抗真菌物質ＫＲＦ−００１複合体」の明細書
参照）。

本発明の発明者等は上記一連の新規なペプチド系抗真菌
物質等をＫＲＦ−００１と命名し、この産業化過程にお
いて必須的生産収率の増大のための醗酵方法と生産され
たＫＲＦ−００１を効率的に収得可能な精製方法を開発
して本発明を完成した。

以下、本発明の詳細な説明することにする。

本発明で用いる新規の枯草菌中野生菌株は大韓民国忠清
南道鶏龍山甲寺附近において、採集した土壌試料から分
離され、変異菌株は実施例に詳細に説明された通常の紫
外線に因る方法によって、作製された。これら微生物の
分類学的同定は文献（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ。

Ｖｏｌ、２．　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ
　Ｃｏ、　（１９８６））に記述の方法に基ついて行っ
た。

本発明で用いる新規微生物等は標準菌株として用いられ
たバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ　：　ＡＴＣＣ６６３３）と殆ど同等の微生物と
して同定されたが、胞子の位置やオキシターゼ反応に陰
性であり、塩分許容度か僅かに低く、ラクトース利用か
可能であり、０．０’０１％のライソサイムにより感受
性のあること等は、特記する程のものであった（下記表
２参照）。

このような理由て、本発明で用いる新規微生物はバシラ
ス・サブチリス亜種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ　　５ｕｂｓｐ、）に同定され、野性菌株はパンラス
・サブチリス亜種クリックチェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　５ｕｂｓｐ、Ｋｒ１ｃｔｉ
ｅｎｓｉｓ　）と、変異菌株はパンラス・サブチリス亜
種クリソクチェンソスＭｌ　８−９１）と各々命名され
た。

これら新規な微生物等は１９９０年７月２６日アメリカ
合衆国菌株保存協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　：　ＡＴＣＣ）に
、各々寄託番号ＡＴＣＣ５５０７９、およびＡＴＣＣ５
５０７８として寄託されている。

下記表１・２・３は本発明で用いる微生物の特性を記述
したものである。

表１　本発明で用いる新規微生物（艷竺規苦　芒匹■ｉ
ｓ　　５ｕｈｓｐ、Ｋｒｉ：ｎ１ｅｎｓｉｓ　）の形態
学的及び培養上の特徴 １　　　　　　　　　　　　　： Ｉ↓”°“′°“１− 表２　標準菌株と本発明で用いる新規な微生物の生理的
特性の比較１力タラーセ反応　　　　　　　　　　　−
−Ｉオキンターゼ反応　　　　　ｌ　　　　−−：ホブ
スープロス　　　　　　□　　　　−−１コスオ培地　
　　　　　　　： ］プロピオン酸利用　　　　　１　　　−　　　　　　
　　　−□ニドレイト還元性　　　　　　□　　　　　
十　　　　　　　　　　　−１、インドール生成　　　
　　　　　　　−−１硫化水素生成　　　　　　　１　
　　−　　　　　　　　　−：ウレアセ作用　　　　　
　　１　　　　′　　　　　□　　　　−（澱粉分解性
　　　　　　　　　　　　　士　　　　　　　　　　−
Ｉカゼイン分解性　　　　　　１　　　−　　　　　　
　　　　二１ゼ−）や、、、液化　　　　　　　１　　
　４　　　　　　　　−□ １塩分許容度　　　　　　　　１　０乃至１０９θ　　
、、　　０乃至τ０１１□ １ｐＨ５７における生育　　　１　　　　−　　　　　
　　　　　　、　　　　　　、。

：１アルギニン分解　　　　　　□　　　　−−■ ｌチロンノ分解　　　　　　　ニー−・］フェニル了ア
ラニンアミン　（Ｎ □ 表３　標準菌株と本発明で用いる新規微生物との糖料用
性の比較′１−７ラヒノース　　　　　ニー− ′ｄ−サイロス　　　　　　　　　　　　−−・ｄ−グ
′じ−１１“　　　　　　　　　　−：ｄ−マンニトー
ル　　　　　１　　　　＋　　　　　　　　　　−□ ：ラクトース　　　　　　　　　：、−一１サリンン　
　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　：□ 、イ／＞）４　　　　　　　　ｌ　　　　　＝　　　　
　　：　　　　　＝□ ：ｄ−１十ス　　　　　　　）−１−・　　　　−□ ′ｄ−ブラックトス　　　　　□　　　　−十ｉｄ−ト
レハロース　　　　　　　　　　−−□ １セロヒオース　　　　　　　１　　　−　　　　　　
　　　−： ・マルトース　　　　　　　　□　　　　−−１アト二
トル　　　　　　　１　　　−　　　　　　　　−１ダ
ルザイトル　　　　　　　　　　　　　−−■シュクロ
ス　　　　　　　　１　　　　＋　　　　　：　　　　
−１子ツクストリレ　　　　　　　１　　　　−　　　
　　　　　　　−本発明において、新規な微生物等から
生産された新規な抗真菌物質ＫＲＦ−００１は、上記新
規の微生物を培養するなり醗酵させることによって、生
産される一連のペプチド系化合物等の複合体を意味する
。

即ち、ＫＲＦ−００１は、各々成分Ａ、Ｂ、Ｃ。

Ｄ、ＥおよびＦと命名の一連のペプチド系化合物の複合
体であって、本発明て用いる新規微生物を培養したり醗
酵させた後、生産された抗真菌物質を精製して高圧液体
クロマ）・グラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した時、上記
６種類のペプチド成分に分離された。分離された成分等
をＦＡＢ−ＭＳ　（ＪＥＯＬ社製品、Ｍｏｄｅｌ　ＤＸ
　３０３゜ｐｏｓｉｔｉｖｅ　１ｏｎｉｚａｔｉｏｎ、
　ａｒｇｏｎ　ｇａｓ、　ｇｕｎ　ｖｏｌｔａｇｅ３ｋ
ｖ、　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　３０ｍＡ）で分析した結果、
分子量か各々１０４２．１０５６．１０５６．１０７０
．１０７０および１０８４と確認された。

ＫＲＦ−００１の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上
におけるＲｆ値は展開溶媒としてメタノールだけを用い
た場合０７５、メタノール：アセトニトリル（１：　］
）を用いた場合は０．５３として現われ、水やメタノー
ルに良く溶解され、クロロホルムやヘキサンには良く溶
解されないことから見て、親水性の物質であることを知
り得る。更に、ＫＲＦ−００°１はｐＨ１，Ｏ乃至１１
．０で比較的安定であり、高温処理（１００−１２ピＣ
）　した時相当期間（１００°Ｃて５時間、１２１℃で
１５分）安定な物質として明らかにされた。

ＫＲＦ−００１はニンヒドリン反応に対して陰性を現し
たか、６Ｎの塩酸て加水分解した後分解産物をＧＣ−Ｍ
Ｓで分析した結果、アスパラギン、グルタミン、プロリ
ン、セリン、チロシンか各成分に共通的に存在すること
を確認した。更に、元素分析結果に伴うと、上記ＫＲＦ
−００１からの各ペプチド成分中ＡはＣ＋ｔＨ２ｓＮＯ
ｚ　、ＢとＣとはＣＩ　６８２１　Ｎ　Ｏ□、ＤとＥと
はＣ，、Ｈ２２ＮＯ，およびＦはＣ１□Ｈ２ｓ　Ｏ２の
特異アミノ酸を含有するものと各々確認された。

これらを各々６Ｎ　　ＨＣＩに溶解させ１１６℃で６時
間反応させアミノ酸自動分析器（ａｍｉ　ｎ。

ａｃｉｄ　ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ、　Ｗａｔｅｒｓ
　Ｃｏ、製品）で分析した結果、アスパラギン、グルタ
ミン、セリン、プロリン、チロシン等の存在か確認され
、そのモル比は３：１：１：ｌ：１と明らかになった。

したがって、ＫＲＦ−００１はアスパラギン３モル、グ
ルタミン１モル、セリン１モル、プロリン１モル、チロ
シン１モルおよび特にアミノ酸１モルのオリゴペプチド
化合物複合体として見ることができ、キモトリップシン
（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）蛋白質分解酵素によって
、加水分解されないため、このようなオリゴペプチドは
、下記の一般式のような環状構造（ｃｉｒｃｕｌａｒ　
５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）なることを判るこ上記構造不明の
特異アミノ酸の構造を高分解Ｈ’−ＮＭＲに解釈した結
果、この構造にはメチレン鎖に基づくδ１．２５におけ
る積分値と３番炭素（Ｃ−３）の陽性子が外の４個の陽
性子とカップリングしていることを現す吸収かδ４，２
５て現れたため、上記アミノ酸の構造がβ−アミノα いることを判ることができた。

更に、各成分Ａ、Ｂ、Ｃ，ＤＳＥおよびＦのペプチド化
合物の６０．９に現れるメチル基のシグナルを通じて確
認されるβ−アミノ酸の末端構造は、ペプチドＡは正常
タイプ（δ０．９．３Ｈ１ｔ）、ペプチドＢはａｎｔｅ
ｉｓｏタイプ（δ０．９．６Ｈ，ｍ）、ペプチドＣはｉ
ｓｏタイプ（δ０．９．６Ｈ，ｄ）、ペプチドＤはｉｓ
ｏタイプ（δ０．９．６Ｈ，ｏ）、ペプチドＥは正常タ
イプ（δ０．９．３Ｈ，ｔ）、そしてペプチドＦはａｎ
ｔｅｉｓｏタイプ（δ０．９．６Ｈ，ｍ）、であること
を判ることができる。

したかって、ＮＨＲ分析によるＫＲＦ−００１複合体を
構成する各ペプチドのβ−アミノ酸構造は下記一般式の
ようである。

成分Ａ　：　ＣＨ，（ＣＨ２）１．ｃＨ（ＮＨ２）ＣＨ
２ＣＯＯＨ成分Ｂ二ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２）　（Ｃ
Ｈ２）　、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯＨ成分Ｃ：　成
分、ＣＨ（ＣＨ３ＸＣＦ（２）、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２
ＣＯＯＨ成分Ｄ　：　成分、ＣＨ（ＣＨ，）（ＣＨ２）
、。ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯＨ成分Ｅ　：　成分、
（ＣＨ２）、、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯｌ（成分Ｆ
　：　ＣＨ，ＣＨ２Ｃｌ（ＣＨ２ＸＣＨ２）、、ＣＨ（
ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯＨ本発明による醗酵および精製方
法は一般的に下記のように行われた。

ＫＲＦ−００１の検出および定量 ＫＲＦ−００１の定量はピリキュラリア・オライゼ（Ｐ
ｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　　ｏｒｙｚａｅ）を被検菌とし
て寒天平板上において生物学的検定（ｂｉｏａｓｓａｙ
）を行って決定した。基準物質としては純粋分離のＫＲ
Ｆ−００１を用い、通常の生産量は阻止環の直径（ｍｍ
）て現わした。例えば、ボテイトテキストロース平板寒
天培地上に被検菌胞子を接種した後、無菌ステンレスコ
ツプを平板上において、コツブの中に醗酵濾過液（０，
２２％ｍの無菌ミリボーフィルターで濾過した醗酵液）
を入れて２４時間乃至２日間培養した後に現れる成育阻
止環の直径を測定した。醗酵液と部分精製の試料のＫＲ
Ｆ−００１存在如何は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ
）上において紫外線照射による蛍光斑点確認とヨードに
よる黄色斑点の反応で確認した。

この開用いた（ＴＬＣ）板はメルク社（ＭｅｒｃｋＣＯ
ｌ）のシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０　Ｆ２
５４、厚さ０．２ｍｍ）であり、展開溶媒としては主に
クロロホルム、メタノール、アンモニア水（１５％）お
よびイソプロパツール（４：　３　：　２　：　１、　
体積比）を用いた。上記ＴＬＣ条件においてＫＲＦ−０
０１のＲｆ値は０．５７であり、ピリキュラリア・オラ
イゼを被検菌とした生物自家検定（ｂｉｏａｕｔｏｇｒ
ａｍ）て抗真菌活性を見せる部分を確認した。展開溶媒
としてメタノールだけを用いた場合、Ｒｆは０．７５て
あり、メタノールアセトニトリル（１・１）を用いた場
合Ｒｆは０．５３てあった。

菌体量の測定 ５５０ｎｍにおける吸光度（直線区間０がら０．３まて
の間）と菌体の量は、試料の一定体積に対する乾燥細胞
の重さて現わした。この時、菌体を１０５℃で一夜乾燥
させた後、乾燥菌体の重さを測定した。

種菌培養 種菌は液体状態で一８０’Ｃに保管した後、対数増殖期
後期に低温状態で回収した菌体を新鮮なＬＢ培地（バク
トートリブトン１％、バクトーイースト抽出物０．５％
、ＮａＣｌ　　１％、ｐＨ７，０）に懸濁させ、更に同
じ体積のグリセロールを混合した後（最終細胞濃度　Ａ
５．。＝０．０１）、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌ宛無
菌状態のバイアル（Ｎｕｎｃ社製品）に株分して一回に
１゜Ｏ乃至２００個のストック（ｓｔａｃｋ　）を造っ
て置いて、−８０℃の冷凍機に保管しながら用いた。

醗酵槽に接種される本発明の新規微生物の種菌用培地造
成は下記表４のようであり、ｐＨ値は加圧殺菌前７．０
に調節した。

表４１種菌培地の造成 葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　１０ｇバクトート
リップトン　　　　　　　　１０ｇバクトーイースト抽
出物　　　　　　　５ｇＮａＣ１１０ｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｌ　リアトル種菌培地１５０ｍ１を１０１
００Ｏ容量の基底にバフル（ｂａｆｆｌｅ）のあるフラ
ス：Ｉ　（Ｂｅｌｌｃｏ社製品）に入れ滅菌した後、室
温で冷却させ冷凍機からバイアル１乃至２個を取出して
解凍させた後、解凍された種菌１ｍｌを無菌的に上記種
菌培地に接種して４乃至６時間回転振盪培養器（回転幅
２．７ｃｍ、２０Ｏｒｐｍ）て温度３０°Ｃの下て培養
した。

醗酵 用いた醗酵槽は総容量１４リツトルの上部回転式醗酵槽
（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ社製品、ＭＪ−Ｎ　ｔｙｐｅ　）
と総容量１８リツトルの下部回転式醗酵槽（Ｂ。

Ｂｒｏｗｎ、　Ｂｉｏｓｔａｔ　Ｅ　ｔｙｐｅ　）てあ
った。典型的生産用培地造成は下記表５のよってあり、
その内炭素源およびＭｇＳＯ４、微量元素等は別に殺菌
して後で混合した。醗酵槽の殺菌は上部回転式醗酵槽の
場合１２１’Ｃて４０分間、下部回転式醗酵槽の場合は
、自体的な殺菌装置により同じ条件の下に滅菌した。

醗酵はｌＯリットルの醗酵液に２００ｍ１の種菌液を接
種した後、温度３０’Ｃ，ｐＨ７，０、攪拌速度４００
ｒｐｍ、通気量１　ｖｖｍの条件て行った。醗酵途中の
ｐＨ値の調整は５Ｎ　　ＨＣＩと５ＮＮａＯＨをポンピ
ングして７±０２以内に調節し、多過ぎる泡か生ずる場
合消泡剤としては、シリコン系列（ｓｉｌｉｃｏｎ　３
０％、高麗人参化学工場謹製）を１０倍稀釈して加圧殺
菌したり米糠油を加圧殺菌して用いた。

表５．典型的なＫＲＦ−００１生産用培地造成シユクロ
ース　　　　　　３０、Ｑｇ　　　　２０．０ｇソイト
ン　　　　　　　　　ｌｏ、ｏｇ　　　　　−酵母抽出
物（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）５．０ｇ　　　　４
．０ｇ（ＮＨ４）　２Ｓ０．　　　　　　　　　　　　
　　　４．　ｏ　ｇＫ２）（Ｐｏ、　　　　　　　　　
　　０．５ｇ　　　　　０．５ｇＭｇ５Ｏａ　　　　　
　　　　　　０．５ｇ　　　　０．５ｇ微量元素 ＭｎＣＬ　　　　　　　　　　４ｍｇ　　　　　４ｍｇ
ｃａｃｔ２　　　　　　　　　５ｍｇ　　　　　５ｍｇ
Ｆｅ５０．　　・７Ｈ２０２５ｍｇ　　　　２５　ｍｇ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１リブト
ル　　　　　　ｌリフドル用いた培地により僅か宛異な
るもののＫＲＦ−００１は醗酵開始後約７乃至８時間後
から生産され約４０時間か経過した後最高値に到達した
。）くシラス・サブチリス亜種フリッチエンシスの活性
突然変異体中には醗酵開始後１０乃至２０時間後に、Ｋ
ＲＦ−００１生産か最高値に至る場合もあった。殆とＫ
ＲＦ−００１生産に有益な条件は温度３０°Ｃ，ｐＨ７
，０、充分な酸素供給等であり、適当な種類の稀元素の
供給である。例えば４■／１のＭ　ｎ　Ｃ１２を入れて
やればピリキュラリア・オライゼ阻止環か１０乃至１３
ｍｍから２０乃至３０ｍｍに増加することを観察した。

ＫＲＦ−００１の生産は各種炭素および窒素源の種類に
よって多くの影響を受ける。ＫＲＦ−００１の生産に適
合する炭素源を発見するため基礎培地として酵母抽出物
１ｇ、（ＮＨ４）２　Ｓｏ、４　ｇ。

Ｎａ２ＨＰ０．２ｇ、ＫＨ４ＰＯ４０，３ｇ、Ｍｇ５Ｏ
＝　　・７８２０　０．５ｇ、ＣａＣＯ５２ｇ、　Ｍｎ
　Ｃ１２４ｍｇ、Ｆｅ５Ｏ１’７８２０　２５■、Ｃａ
Ｃｌ２５ｍｇおよび蒸留水１０１００Ｏか含まれた培地
を作った。そこに各炭素源３０ｇを入れた後（糖蜜の場
合は１００ｇ）ＫＲＦ−００１生産菌株を接種した。各
炭素源がＫＲＦ−００１生産性に及はす影響は下記表６
に記述した。

表６．各種炭素源とＫＲＦ−００１との生産比較更に、
ＫＲＦ−００１の生産に適合する窒素源を発見するため
に上記の基礎培地に３０ｇ／ｌのシュクロースを入れた
後、各種窒素源を入れてＫＲＦ−００１に対する生産性
を調査して下記表７に現した。

表７．各種窒素源とＫＲＦ−００１生産性比較酵母抽出
物　　　３０　　　　　　１１０菌体分離 ＫＲＦ−００１は細胞外に分泌されるため醗酵か終了す
れば冷却水（１０乃至１５°Ｃ）を循環させ醗酵液の温
度を下げ、遠心分離により菌体とＫＲＦ−００１とを分
離させた。冷却遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ■、ＲＣ５
ＣＧ５−３　ローター）を用いて７０００　ｒｐｔｎの
速度、５°Ｃて２０分間遠心分離して菌体を分離したと
ころ凡そ１リツトルの醗酵液当り菌体量は２０乃至６０
ｇ（ｆｉ潤型重量に至った。

粗ＫＲＦ−００１の分離・濃縮 多量の上澄液に存在するＫＲＦ−００１を分離・濃縮す
るため等電沈澱法（１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｒｅｃｉ
ｐｉｔａｔｉｏ口）と吸着クロマトグラフィー法を利用
した。

１、等電沈澱法 菌体が取除かれた上澄液の温度とｐＨを点検し５Ｎ　　
ＨＣｌ或いは、５ＮＨ２Ｓ○４を定められた量（５乃至
２０ｍ１／１）位−度に入れ、直径４ｃｍのイムペラを
用いて、１２０乃至２０　Ｏｒｐｍの速度で攪拌して完
全に混合した後、ｐＨか３．０乃至３５になれば５°Ｃ
で放置沈澱物か沈むようにした。２乃至１８時間が経過
すれは上澄液は捨て股部分を遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌ
ｌ■ＲＣ５ＣＧ５−３　。

−ター）を用い５°Ｃの７００Ｏｒｐｍで１０分間分離
した（ＫＲＦ−００］　　純度３乃至５％）。

２、吸着クロマトグラフィー アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ■）ＸＡＤ７樹脂
（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社製品）か充填されたカラム
において疏水性作用を結合力として、培養液中のＫＲＦ
−００１を樹脂に吸着させ、吸着させたＫＲＦ−００１
を蒸留水て洗浄した後メタノール（９８％）で溶出して
分画した。

その時、用いたカラムは直径１０ｃｍ、長さ９０−であ
り、底面から４５乃至５０ａｎの深さまで（約４５リツ
トル　ベドホリュウム）のＸＡＤ−７樹脂を充填して室
温で作業を行った。

試料は５乃至１０°Ｃて冷蔵保管したものをｐＨ確認後
そのまま用いており、吸着と脱着とは流速５０　ｍｌ／
ｌ／下に進行し、メタノールによる試料の溶出液は５０
０ｍ１三角フラスコに各々分画した後、各々の分画はメ
タノールを蒸発させて蒸留水に再稀釈して凍結乾燥させ
た（ＫＲＦ−００１純度２０乃至３０％）。

シリカゲルクロマトグラフィー シリカゲル（米Ｍｅｒｃｋ社製品７７３４．３００ｇ）
をクロロホルムに混せな後内径４　ｃｍ、長さ５０ａｎ
カラムに満たし、ＸＡＤカラムクロマトグラフィーにお
いて、得られた分離精製の試料をメタノールに溶解して
カラムに入れ、５秒に１ｍ宛メタノールを流してやりな
がら分画し、抗真菌活性を現す部分たけ集めて、減圧乾
燥し蒸留水に溶解させた後、凍結乾燥して羽毛模様の物
質を得た。

セファテックスＬＨ−２０クロマトグラフィーセファテ
ックスＬ　Ｉ−Ｉ　−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製品、
３０ｇ）をメタノール中において減圧して空気を除き、
充分に膨らせた後、内径２ｃｍ、長さ６０ｃｍカラムに
満たした。試料をメタノールに溶かしセファテックスＬ
Ｈ−２０カラムに掛け、溶出溶媒を利用して分画した。

得られた各分画等の抗真菌活性を確認した後、減圧乾燥
して蒸留水に溶解した後、凍結乾燥して微黄色羽毛模様
の物質を得た。

高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）セファデック
スＬＨ−２０カラムクロマトグラフイーにおいて得られ
た活性試料を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
で精製した。この時用いたカラムはＲｓ　ｉ　Ｉ　　Ｃ
＋８（Ａｌｔｅｃｈ社、ｌＯｕｍ、１．ＯＸ２５０ｍｍ
）であり、試料はできるだけ少量のメタノールに溶かし
てカラムに注入した。試料の溶出は８０％のメタノール
を利用して、Ｑ、　　５ｍｌ／分の流速で行い、２２０
ｎｍにおける紫外線吸収でモニタリングした。ＨＰＬＣ
後の活性分画は２２０ｎｍの吸収ピークと生物学的検定
の結果で判ることかできた。

ＫＲＦ−００１の醗酵条件を要約すれば、温度３０℃ｐ
Ｈ７，０、溶存酸素濃度ｌＯ乃至５０％、生産菌株は醗
酵開始後２０乃至３５時間内に最高値のＫＲＦ−００１
生産収率を現した（野性菌株の場合、０．２ｇ／ｌの生
産収率）。醗酵培地に燐酸塩が余り多ければ生産収率か
急激に低下し、複合炭素および窒素源の供給は細胞生育
に効果かあったけれとも、ＫＲＦ−００１生産には大い
なる役には立だなかった。

簡単な分離方法としては、前記のように等電沈澱法と吸
着クロマトグラフィー法とがあったか後者において、Ｘ
ＡＤ−７クロマトグラフイーを通過させることか更に効
果的であり、その以後にはシリカゲルクロマトグラフィ
ー、セファテックスＬＭ−２０クロマトグラフィーおよ
びＨＰＬＣ等を用いて分離精製をすることかできた。

以下実施例により本発明を更に、詳細な説明をしようと
する。

〔実施例〕

実施例　１ バシラス・サブチリス亜種フリッチエンシスの培養およ
び醗酵 一８０°Ｃに保たれる冷凍機中に保存されているバシラ
ス・サブチリス亜種フリッチエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　５ｕｂｓｐ、Ｋｒ１ｃｔｉ
ｅｎｓｉｓ。

ＡＴＣＣ５５０７９）バイアル１個（１ｍｌ）を溶かし
て１００ｍ１のグルコスＬＢ培地中に接種した後３０°
Ｃ１ｐＨ７，０で振盪培養を行った。グルコスＬＢ培地
はグルコス１０ｇ、パックドトリップトン１０ｇ、パッ
クド−酵母抽出物５ｇ、塩１０ｇおよび蒸留水１０００
１＋１１で製造しｐＨは７．０に調整した。

上記種菌の生長がＡｓ５ｏ　”０．　４　０．　５ニ至
った時全体培養液を８リツトルの生産用培地が入ってい
る１４リツトルの醗酵槽に無菌的に移した。

醗酵槽中における温度と空気疎通速度および攪拌速度は
各々３０°ＣＳ０．　５ＶＶＭおよび４００ｒｐｒｎを
保って醗酵させ、２日後に醗酵液を遠心分離して微生物
細胞を取除いた後上澄液をＸＡＤ−７カラムに通過させ
た後吸着したＫＲＦ−００１をメタノールで溶出した時
黄褐色の粗ＫＲＦ−００１（純度２５％）１２ｇが得ら
れた。生産用培地はシュクロス３０ｇソイトン１０ｇ、
酵母抽出物５　ｇ、　Ｋ２　ＨＰ　０４０．５　ｇ、　
ＭｇＳＯ４”７Ｈ２００，５ｇ、ＭｎＣｌｘ　４ｍｇ、
ＣａＣＬ５■、Ｆｅ５ＣＬ　　・７Ｈ２０２５＋ｎｇを
蒸留水１０１００Ｏに入れて溶解させ、ｐＨを７に調整
した後゛１２１″Ｃで４０分間滅菌のうえ準備した。

実施例　２ バシラス・サブチリス亜種フリッチエンシス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　５ｕｂｓｐ、Ｋｒ１ｃｔ
ｉｅｎｓｉｓ　）突然変異誘導体Ｍ１８−９１を無菌グ
ルコスＬＢ培地に接種した後３０℃、ｐＨ７，０で１９
乃至２２時間振盪培養を行った。前記種菌の生長はＡ３
５０＝１．５乃至２．　０であった。種菌培養液約２０
００ｍ１を無菌操作で７０リツトルの生産用培地か入っ
ている１００リツトル醗酵槽に移した。醗酵は温度３０
℃、空気疎通速度ｌ乃至２ＶＶＭ、攪拌速度２００乃至
２５　Ｏｒｐｍ条件の下に行いｐＨは調節せず、泡が立
つ場合消泡剤を添加した。生産用培地はシュクロース３
０ｇ、ソイトン或いはソイビーンミル１０ｇ、酵母抽出
物５ｇ１に２　ＨＰ　Ｏａ　Ｏ、５ｇＳＭｇ　Ｓ　０４
　　・７Ｈ１００，５ｇ、ＭｎＣＬ　４ｍｇ、ＣａＣＩ
ｚ５ｍｇ、Ｆｅ５０．　・７Ｈ２０２５ｍｇ、蒸留水１
０１００Ｏの比率で調剤した。更に、上記生産用培地の
ソイトンやソイビーンミルをパマミディア２０ｇ／ｌに
取替えた実験も行った。

１００リツトル醗酵槽て用いた生産菌株Ｍ１Ｂ−９１は
突然変異誘導体中の一つとして、ＫＲＦ−ｏｏｉを短時
間内に生産する特徴かあった。実施例１において用いら
れた生産菌株より遥かに早い醗酵進行度を現したため約
１７時間培養後ＫＲＦ−００１（純度２５％）６０ｇ位
得られた。

窒素源としてパマミディアをソイトンの代わりに用いた
ときＫＲＦ−００１の生産量は、更に増加して約１７時
間培養後粗ＫＲＦ−００１（純度２５％）１５０ｇを得
た。

実施例　３ ＫＲＦ−００１の精製 実施例１において得た醗酵液１６リツトルを利用してＫ
ＲＦ−００１の精製を試みた。はじめに約４リツトルの
酵素液を４リツトルのアンバライ１−　（Ａｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ　）　ＸＡＤ　−７カラム（米国Ｒｏｈｍ　＆Ｈ
ａｓｓ社製品、９Ｘ９０ｃｍ）吸着させた後毎分４０ｍ
１の流速でベツド体積の２倍分の蒸留水（８リツトル）
で不純物を洗った後、ベツドの２倍分のメタノール（８
リツトル）てＫＲＦ−００１を溶出した。溶出して出た
分画等に対してビリキュラリア・オライゼ（Ｐｙｒｉｃ
ｕｌａｒｉａ　　ｏｒｙｚａｅ）を被検菌として用いて
活性物質を確認した後、減圧濃縮して凍結乾燥のうえ黄
褐色の活性物質を得た。

上記の方法を４回繰返して１６リツトルの醗酵液から約
１５ｇの黄褐色の粗ＫＲＦ−００１を得た。次の段階の
精製はシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ）クロマトグ
ラフィーによって行った。

３００ｇのシリカゲル（米国ＭｅｒＣｋ社製品７７３４
）をカラム（４Ｘ５０ｃｍ）にクロロホルムを利用して
満たした後上記粗ＫＲＦ−００１を最小量のメタノール
−クロロホルム（３：　７）溶液で溶かして吸着させた
。ＫＲＦ−００１の溶出はメタノール−クロロホルム（
３：　７）７５０ｍｌおよび（１：　１）２１００ｍｌ
を流して行った。活性成分が入っている部分を凍結乾燥
して約７ｇの粗ＫＲＦ−００１を得た。

分離用ＴＬＣ板を利用して次の段階の精製を試みた。展
開溶媒としてはブタノール−エチルアセテート−水（６
：　１　：　１）を用いてＲｆｏ、３６の物質を回収し
た結果５ｇの活性物質か回収された。次の段階には上記
活性物質５ｇを２次に亘ってセファテックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）　Ｌ　Ｈ−２０カラム（０，８ｘ９０ａｎ）
に入れて精製した。試料を少量のメタノールに溶かして
カラムに吸着させ、メタノールを溶出溶媒を利用して毎
分０．２ｍｌの流速で流した。得られた分画中の活性物
質を凍結乾燥した結果１ｇの白色活性物質か得られた。

最終的な精製段階として、ＫＲＦ−００１の各成分等を
ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏ、モテ
ル）を用いて分離した。ＨＰＬＣカラムとしてはアルチ
ク（Ａｌｔｅｃｋ）社のＲ５１ｌ　　Ｃ（１０μｌＯＸ
１０Ｘ２５０を用いており１ｇの試料を３５％アセトニ
トリルに溶かしてｌＯ■／［１１１の濃度で注入した。

試料の溶出は最初の３０分間は３５％アセトニトリルで
、その後５０分まで５０％のアセトニトリルで行い、流
速は毎分４ｍｌてありＵＶ２２５ｎｍにおける吸収でモ
ニタリングをした。吸収ピーク等に対する生物活性検索
結果Ｒｔ２２．８’３３．８’、３８．７’、４５．５
’、４６．５’、および４９゜８′のピークか活性を現
しており、これらを各々ＫＲＦ−００１の成分Ａ、Ｂ、
ＣＳＤ、ＥおよびＦと命名した。最終的に得られた純粋
なるＫＲＦ−００１の各成分は成分Ａ２１０■成分８３
０ｍｇ、成分Ｃ９０ｍｇ、成分Ｄ　　３０■、成分Ｅ　
　３０■および成分Ｆ１０■であった。したかってＫＲ
Ｆ−００１は最小限６個以上の抗真菌性物質成分等の複
合体なることを知ることかできる。

〔発明の効果〕

前記のように、本発明の醗酵方法に基づいて抗真菌活性
を有する新規なＫＲＦ−００１複合体を大量生産するこ
とができるようになり、更に、生産されたＫＲＦ−００
１を効果的に精製することができるようになった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）液浸好気性醗酵条件の下に同化可能な炭素源と窒
   素源とを含有する培養培地中において、抗真菌物質ＫＲ
   Ｆ−００１複合体を生産する微生物バシラス・サブチリ
   ス亜種クリッチエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ
   ｌｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．Ｋｒｉｃｔｉｅｎｓｉｓ．ＡＴ
   ＣＣ５５０７９）またはバシラス・サブチリス亜種クリ
   ッチエンシスＭ１８−９１（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
   ｉｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．Ｋｒｉｃｔｉｅｎｓｉｓ　Ｍ１
   ８−９１、ＡＴＣＣ５５０７８）またはこれらの活性変
   異株を回収可能な量の上記抗生物質が収得されるまで醗
   酵培養させることを特徴とするＫＲＦ−００１複合体の
   製造方法。（２）第１項において、 培養の際培養液の酸度（ｐＨ）を調節せず培養させる方
   法。 （３）第１項において、 培養培地にＭｎＣｌ＿２を含有させる方法。 （４）第１項に基づくＫＲＦ−００１の醗酵液を直接Ｘ
   ＡＤ−７または活性炭カラムに通過させた後、有機溶媒
   で溶出させることを特徴とする、ＫＲＦ−００１複合体
   の精製方法。