JPS58158187A - テルペン様物質を生産する放線菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物、さらに詳しくはテルペン様物質生産能
を有するストレプトミセス属に属する微生物に関する。

本発明の微生物は、岡山系備前市内の土壌から分離され
た放線菌であって、ストレプトミセス・ニス−ビー　Ｙ
　−Ｇ　４６６　Ｇ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５
ｐＹ−Ｇ４６６Ｇ）の名称で工業技術院微生物工業技術
研究所に微生物受託番号微工研菌寄第６り３２号として
寄託されており１次のような菌学的性状を有している。

ストレプトミセス−ニス・ピーＹ−Ｇ４６６Ｇ株の菌学
的性状： １、形態 Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株の気菌糸はオートミール寒天。

イースト麦芽寒天及びチロシン寒天等で良く着生する。

顕微鏡下で、気菌糸の先端には螺旋形成力を認められる
が輪生板および菌核形成は認められた（・。電子顕微鏡
下で胞子表面は不整でしわ状を呈する。胞子の個々の区
切りは観察困難である力′−１０個以上の胞子が連鎖し
ていると推定される。

２　各種培地上の性状 各種培地上の性状は以下に示すとうりである。

３生理学的性質 （１）生育温度範囲　　１５〜４０Ｃ 至適培養条件　　２８〜３３ｔＺ’ （２１セラｆ　７１７）　Ｍ化　単純ゼラチン（２０−
ｃ培１１　）　。

グルコース・ペプト／ ゼラチン（２８Ｃ培養）共に液 化は認められない ＋３１　　脱脂牛乳の凝固　陽性 （４）　　脱脂牛乳のペプトン化　陽　性（５）　　ス
ターチの加水分解　陽　性（６）　　メラニン様色素の
生成 チロジノ寒天培地　陰性 ペプト／・イースト・鉄寒天培地　　陰　性（力硝酸塩
の還元陰性 （８）硫化水素の生成　陰性 ４　炭素源の資化性 １）利用する Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、　Ｄ　−フラクト
ース、Ｄ−マ／ニトール、Ｄ−キシロース。

２）利用しない又は利用性が疑わしい シークロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフィ
ノース 以上のことよりＹ−０４６６Ｇ株の性状を要約すると、
気菌糸は螺旋を形成し、胞子の表面は不整でしわ状を呈
する。各種培地での発育は無色〜うす黄色を呈する。気
菌糸は粉状で茶白色へ茶灰色を呈し、イースト麦芽寒天
、チロジノ寒天などで胞子形成部位に湿った黒色斑点を
生じ１時には一面に広がることもある。又可溶性色素の
生成は認められなし・。このような特徴を有する既知菌
種を「イノターナショナル・ジャーナル・オプ・システ
マティノク・バクテリオロジー」第１８巻、１９巻。

２２巻、及ヒ、ニス−ニー・ワックスマフ著ｒｆ−アク
チノミセテス」第２巻（１９６１年）などにより。

検索すると、Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株は、ストレプトミセス・
パイグロスコピカス解放線菌に属させるのが妥当と考え
られる。

トレスナーら（アプライドΦマイクロバイオロジー第１
５巻、６３７〜６３９頁、　　１９６７年）およびディ
ーラら（アプライド・マイクロバイオロジー第１６巻。

９３５〜９４１頁１９６８年）の分類によれば、パイグ
ロスコピカス解放線菌は、胞子の形態よりＳ・バイグロ
スコピカスタイブとＳ・プラテンシスタイプに分けられ
る。前記の胞子形態よりＹ−Ｇ４６６Ｇ株は、Ｓ−バイ
グロスコピカスタイブに属している。そこでこのグルー
プの代表菌株であるストレプトミセス・バイグロスコピ
カスの記載（「ザ・アクチノミセス」第２巻、　２３０
頁。

１９６１年）とＹ−Ｇ４６６Ｇ株の性状を比較すると、
シュクロース硝酸塩寒天培地及びグルコース・アスパラ
ギン寒天培地における可溶性色素の生成、脱脂牛乳の凝
固性に於て相違が認められるがその他の性状は良（一致
している。このように本菌株はストレプトミセス・バイ
グロスコピカスに近縁の菌であるが必ずしも一致しない
点もある為にストレプトミセス・ニス・ピーＹ−Ｇ４６
６Ｇ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、Ｙ　　Ｇ　
４６６　Ｇ　）と命名した。放線菌は人工的ＩＣ、また
自然に変異をおこしやすいが本発明のいうストレプトミ
セス・ニス・ピーＹ−Ｇ４６６Ｇ株は天然から分離され
た放線菌、ある（・はこれを紫外線。

Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれ
らの自然変異株につ（・でも本発明の微生物に包含され
るものである。

菌株の土壌からの分離は通常の分離操作、たとえば採取
した土壌を滅菌生理食塩水で希釈し、適当な寒天培地上
で分離培養することによって行うことができる。

本菌株は、テルペノ様物質を代謝する府で特異である。

テルペン様物質またはそのアグリコンであるサボゲニノ
については９代謝作用、抗潰瘍作用、抗炎症作用、抗ア
レルギー作用等の種々の生理活性が知られている（特開
昭５６−１３９４１６．同５６−７３０２５　）。した
がって２本発明の微生物は、有用な生理活性物質を産生
ずる菌として有用である。

本発明の微生物から、上記代謝産物を得るＫは。

菌株を一般的培養方法に準じて培養すればよ（。

特に液体培地中での振とう培養あるいは深部通気かく拌
培養によることが好ましく・。培地成分としては通常ス
トレプトミセス属の菌の培養に利用されて℃・る各種の
培地源が使用できる。例えば、炭素源としては、ブドウ
糖、乳糖、麦芽糖、デンプン、グリセリン、大豆油、水
あめ、糖みっなどを使用し得る。また窒素源としては、
大豆粉、ツー／ステイープリカー、小麦胚芽、綿実粕、
ベラトン、肉エキス、酵母エキス、落花生粉、無機硝酸
塩、硫酸アンモニウム塩などを使用し得る。その他必要
に応じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウム。

塩化カリ、リン酸塩等の無機塩を添加するほか菌の生育
を助げＹ−Ｇ４６６Ｇ物質の生産を促進することが可能
な有機及び無機物を添加することができる。

培養に際しては培地のｐＨは中性付近で、培養温度は２
５〜３３Ｕであるが２７〜３０Ｃが特に好ましくＯ 培養物より目的のテルペノ様物質な単離採取するには、
培養物より目的のテルペン様物質を単離採取するには通
常の微生物の培養物より抗生物質を単離する方法が適用
される。Ｙ−Ｇ４６６Ｇテルベ／様物質は培養液中に含
有されるので、遠心分離またはｒ過により菌体を除去し
た後ｒ過液から抽出される。すなわち適当な溶剤に対す
る溶解性および溶解度の差、溶液からの析出性および析
出速度の差９種々の吸着剤に対する吸着親和性の差。

２種の液相間における分配の差などを利用する一般の抗
生物質の製造に用いられる手段によって分離、採取、精
製される。この方法は必要に応じて単独に用いられ、あ
るいは任意の順序に組合せ。

また反覆して適用できる。こうして得られたテルペノ様
物質は２次のような理化学的性状を有する。

Ｙ　−Ｇ４６６Ｇ株の生産するテルペン様物質の理化学
的性状 １）紫外線吸収スペクトル：　端吸収 ２）赤外線吸収スペクトル：　第１図参照３）溶解性 ■　ピリジン、ジメチルフォルムアミド可溶■水、メタ
ノールに僅溶 ■　アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ヘキサ
／、ベンゼンに不溶 ４）呈色反応 ■　ニンヒドリン、クロリン・トリジン反応は陰性■　
リーヘルマ／、燐モリフチ／酸アンモノ、過ヨウ素酸塩
反応は陽性 ５）酸性物質 ６）物質の色　　白色粉末 ７）薄層クロマドグ、ラフイー ■　担体ニジリカゲル６０Ｆ２５４　（商品名、メルク
社製）溶　　媒　　系　　　　　　　　　　Ｒｆ値ジク
ロロホルムメタノール−水　（６：４：１）　　　０．
５６エタノールー酢酸−水（４：１：２）　　０．８６
■　担体：アビセルＳＦ　（商品名、７ナコ７薬品社製
）溶　　　媒　　　系　　　　　　　　　　　Ｒｆ値ブ
タノール−酢酸−水　（４：１：２）　　　　　　０．
５７８０％アセトニトリル水　　　　　　　　　　　　
　　０．６８つぎに、実施例を挙げて上記テルペン様物
質の製造法を説明する。

実施例　１ グルコース１％、ポテトスターチ１％、８ｇ　ミート０
．７５％、グルテンミール０．７５％、酵母エキス０．
５％、　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５％、　Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０，０５％＋　ＮａＣ１Ｏ１２％＊　ｐＨ７，３組
成の培地を５００　ｍｌ三角フラスコに５０　ｍｌ宛２
本分注し、常法どおり滅菌を行った後。

Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株を接種し３０Ｃで４８時間培養する。

別にスターチ４．５％、グリセリン０．７５％、コーン
スチープリカー０１％、グルテンミール０１％、Ｓ■ミ
ート２，５％、カザミノ酸０３％、　ＦｅＳＯ４＠　７
Ｈ２００，０２％、　ｐ）（７，２の組成の培地を５０
０　ｒｎｌ三角フラスコに６０　ｍｌ宛５０本分注し、
消泡剤としてアデカノール（旭電化社製）を２滴宛加え
、滅菌を行った後。

上記の培養液を１％の割合で植菌し３０γで９６時間培
養を行う。

培養終了后の培養液はｐＨ７，８を示し、ＩＮ塩酸水で
ｐＨ７，０に修正した後、ラヂオライト６００（昭和化
学工業瓶製）６％を添加してｆ遇する。次いで得うｈり
ｆ液３．Ｏｔ　ヲ７７ハー　ラ（トＩＲＣ−５０（ＮＨ
４＋型）（米国ローム・アンド・）・−ス社Ｉ！り３０
０　ｍｌを充填したカラムに通し１次いで水２００　ｒ
ａｔで洗滌する。ＩＲＣ−５０（ＮＨ４＋型）カラムに
吸着した成分は続いてＩＮアンモニア水によって溶出す
ると、ニンヒドリ／反応陽性でＢ、ｓｕｂ、に活性を示
す画分２５０　ｍｌが得られる。薄層クロマトグラフィ
〔担体シリカゲル６０Ｆ　２５４　（メルク社製）〕〕
溶媒系ｎ−ブタノールーエタノールークロロホルムーア
／モニア４：５：２：８）によれば３乃至４ケの塩基性
成分が存在する。この塩基性成分は単離して分解実験お
よびマススペクトルの検討などからＤｅｓｔｏｍｙｃｉ
ｎグループであった。

次に上記の塩基性水溶性成分を除（・た後のＩＲＣ−５
０（ＮＨ４＋型）通過液３，２１をダイヤイオンＨＰ　
−２Ｏ（三菱化成μ社製）　３５０　ｍｌを充填したカ
ラムに通し、有効成分を吸着させる。１．ＯＬの水で洗
浄後。

５０％アセトン水で溶離するとリーベルマン反応陽性で
。

Ｐｒ−に対して活性を有する画分３００　ｃａｌが得ら
れる。これを減圧下に約２００ｍ１まで濃縮し９次いで
塩基性物質を完全に除去する目的でダウエックス５０　
Ｗ　（Ｈ型）（米国、ダウケミカル社製）　５０　ｒｎ
ｌを充填したカラムを通過させ、少量の水で水洗して通
過液と洗液を合せる。

この時ｐＨ２，５を示した為　ＩＮ’ＮａＯＨでｐｍ（
７，０に修正した後ＤＥｊ１ｋｇ−セファデックスＡ−
２５（Ｃ１−型）（スウェーデン、ファルマシア社製）
　３０　ｒｎｌを充填したカラムに通し２％ＮａＣ１水
で分画溶出すると８０　ｍｌの活性物質を含む溶液が得
られる。次に溶出液をｐＨ４，０とし、ダイヤイオンＨ
Ｐ　−２０２０ｍｌを充填したカラムに通し、有効物質
を吸着させ、５０ｍ１の水で洗浄後、５０％アセトン水
で溶離すると活性物質を含む溶液５０ｍ１が得られる。

このものをアセトンを除去する為減圧濃縮し約２０ｍ１
とし、凍結乾燥を行うと淡褐色粉末４３０１Ｑｇが得ら
れる。

上記で得られた淡褐色粉末４３０ｍｇのうち２００■を
７０％アセトニトリルに溶解し、アビセル（旭化成社製
）を７０％アセトニトリル中に懸濁し、減圧脱気したの
ち１．２　ｘ　９０αのカラムに充填し、７０％アセト
ニトリル１００　ｍｌで洗浄後のカラムにのせ。

同じ溶媒系でカラムクロマトグラフィを行い３ｍｌずつ
分画する。リーベルマン反応陽性＊　Ｐｒｏｓｓに活性
な画分Ａｌｌ〜１６を集め減圧で約５耐迄濃縮し。

これに４倍量のアセトンを加；えると白色の沈澱が析出
する。この沈澱なｒ取し、４０Ｃで５時間減圧乾燥する
と９５．６ｔＱｇの活性物質が得られる。

分解実験（トリテルペン母核） 上記実施例で得られた白色粉末２ｏ１１１ｇＩＣＩＮ塩
酸２　ｍｌを加え１１０Ｃで３時間封管中で加熱する。

終了後酸性のままクロロホルム２ｍＺで３回抽出し。

クロロホルム層を水で洗った後、芒硝で乾燥して減圧濃
縮すると１１■の白色粉末が得られる。マススペクトル
の検討を行（・、　Ｍ　、　４５８　　分子式：Ｃ３３
Ｈｓｏ　Ｏｓが得られた。またＭ　、　４５８は３ケＴ
ｒｉｍｅ−ｔｈｙｌ　５ｉｌｙｌ化され、ベースビーク
は２３４を示し。

呈色反応はリーベルマン反応陽性を示した。

核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ　）　（ＣＤＣＩ
ｇ　）　（内部標準ＴＭＳ　）　： 上記のマススペクトル、核磁気共鳴スペクトルの結果か
ら９分解実験によってクロロ、ホルム層へ抽出される画
分は０１ｅａｎ　−１２−ｅｎｅ　−Ｔｒｉｏｌと考え
られる。

次匠クロロホルム抽出を行った残りの水層につ〜・て減
圧濃縮すると白色結晶性粉末９．５　ｆ！＠が得られ過
ヨウ素酸塩試薬に陽性で糖アルコール又は非還元糖の存
在を示している。アビセルをブタノール−酢酸−水・（
４：１：１）中に懸濁し、減圧脱気した後１．Ｑｘ１５
ｃｍのカラムに充填し、上記の粉末９．５１Ｔ１ｇを同
じ溶媒に溶かしてカラムにのせ展開すると／１６４〜７
に過ヨウ素酸塩反応陽性画分が流出する。この両分を減
圧乾固してマススペクトルの検討を行い、ＧＣ−マスス
ペクトルよりＭ”１６４゜１８０のピラノサイド２ケ及
び酸性糖１ケが存在すると考えられる。分子量１６４．
１８０の既知ピラノサイドとＧＣ−マススペクトルのり
テンションタイムおよび分解パターンの比較を行った結
果、Ｍ”：１６４はＬ−ラムノ、−スにＭ”：１８０は
Ｄ−ガラクトースに一致したが酸性糖についてはまだ明
らかでないが。

Ｄ−グルクロノピラノシールと推定される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株が産生ずるテルベ／、様物
質の赤外線吸収スペクトルを示 す。 第２図は、Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株が産生するテルペン様物質
の核磁気共鳴スペクトルを示 す。 特許出願人　山之内製薬株式会社 代理人　佐々木　晃　− 手続補正書（自発） ２　発明の名称 テルペン様物質を生産する放線菌 ３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所　　東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名称　
　（６６７）山之内製薬株式会社代表者　森　岡　茂　
夫 ４代理人 （１）明細書第１４頁中段の化学構造式を次の通り訂正
する。 ［ 」 （２）同　第１６頁初行の「物質」の次に１（母核）」
を加入する。 ■

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＣＩ＋　　テルペン様物質生産能を有する新菌種ストレ
   プトミセス・ニス・ピーに属する微生物（２）　　スト
   レプトミセス・ニスＯビー　Ｙ−Ｇ４６６Ｇ株である特
   許請求の範囲第（１）項に記載の微生物