JP7455746B2

JP7455746B2 - アルファ－シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用

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Publication number: JP7455746B2
Application number: JP2020538630A
Authority: JP
Inventors: リチャード・イー・オルソン; アンジェラ・エム・カケース; ジェリィ・イー・メレディス・ジュニア; ニノ・デヴィゼ; ジェイムズ・ケイ・ロイ; カール・ジェイ・バルディック; アンナプルナ・ペンドリ; アイバー・エム・マクドナルド; ピーター・ヘーイドーン; マリアンネ・レアベック・イェンセン
Original assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: US12180478B2; US20200354720A1; EA202091695A1; US11359197B2; JP2021510512A; US11447775B2; SG11202006526YA; US20230193260A1; PE20201501A1; JP2024037914A; KR20200140793A; MX2020007433A; SA520412423B1; AU2019208006A1; AU2019208006B2; CA3088112A1; US20210180065A1; IL275902A; CN111836624A; BR112020013994A2

Description

本出願において電子的に提供した配列表の引用
本出願において電子的に提供した配列表(名称：3338_107PC01_SequenceListing_ST25.txt、サイズ：１０,４５８バイト；および作成日：２０１９年１月１０日)の内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。

発明の分野
本発明は、アルファ－シヌクレイン(ＳＮＣＡ)タンパク質発現減少にいたる、細胞におけるアルファ－シヌクレイン(ＳＮＣＡ)転写物のイントロン１とエクソン２の接合部を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物(ＡＳＯ)に関する。ＳＮＣＡタンパク質発現減少は、多系統萎縮症、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)およびレビー小体型認知症などの一定範囲の医学的障害に有益であり得る。

発明の背景
シヌクレインタンパク質ファミリーのメンバーであるアルファ－シヌクレイン(ＳＮＣＡ)は、主に神経組織内で発現される小可溶性タンパク質である。Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)参照。多くの細胞型で発現されるが、神経細胞のシナプス前終末内に優勢に局在化する。厳密な機能はまだ完全には解明されていないが、ＳＮＣＡは、シナプス伝達の制御に重要な役割を有することが示唆されている。例えば、ＳＮＣＡは、ＳＮＡＲＥ複合体形成における分子シャペロンとして機能し、これは神経細胞のシナプス小胞とシナプス前膜のドッキングに介在する。ＳＮＣＡは微小管関連タンパク質タウなどの他のタンパク質とも相互作用でき、これは、微小管安定化を助け、小胞輸送を制御する。

シナプス伝達制御におけるＳＮＣＡの役割のため、ＳＮＣＡ発現および／または機能の改変は重要な生物学的過程を妨害し得る。このような妨害は、脳内のＳＮＣＡタンパク質凝集体の異常蓄積により特徴づけられる神経変性疾患である、α－シヌクレイン病に寄与すると考えられている。従って、誤って折り畳まれた、凝集し、かつリン酸化したＳＮＣＡタンパク質の不溶性封入体は、パーキンソン病(ＰＤ)、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症(ＤＬＢ)および多系統萎縮症(ＭＳＡ)などの疾患の病理学的特徴である。Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001); and Valera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016)参照。

パーキンソン病などのα－シヌクレイン病は、特に高齢者で非常に多くみられる進行性神経変性脳障害である。Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004)参照。世界中で約７００万～１０００万人がこのような障害をもって生活し、米国単独で毎年約６０,０００の新規症例があると推定される。一個人に対する医療費は年間＄２,５００を優に超え、治療的手術は患者あたり最大＄１００,０００の費用となり得る。それ故に、より強固かつ費用効率のよい処置選択肢の必要性が大きい。

発明の概要
本発明は、AtTcctttacaccACAC(配列番号４)の連続的ヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)に関し、ここで、大文字はベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡであり、小文字はＤＮＡである。他の実施態様において、ＡＳＯは、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。

ある実施態様において、ＡＳＯは、OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMCを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴおよびＯｘｙＭＣはそれぞれアデニンベータＤ－オキシ－ＬＮＡ、チミンベータＤ－オキシ－ＬＮＡおよびメチルシトシンベータＤ－オキシ－ＬＮＡであり、ＤＮＡｔ、ＤＮＡｃおよびＤＮＡａはそれぞれチミンＤＮＡ、シトシンＤＮＡおよびアデニンＤＮＡである。ある実施態様において、本発明のＡＳＯは、Ｃ_１７１Ｈ_２１４Ｎ_５６Ｏ_９０Ｐ_１６Ｓ_１６の分子式および図１Ｂに示す構造を有し、ここで、Ｍ^＋はカウンターイオンである。ある実施態様において、カウンターイオンは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、カウンターイオンはＮａ^＋である。

本発明はまたここに開示するＡＳＯを含むコンジュゲートであって、ここで、ＡＳＯは少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合しているものを提供する。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。

またここに提供されるのは、ここに開示するＡＳＯまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ある実施態様において、組成物は、さらに治療剤を含む。ある実施態様において、治療剤はアルファ－シヌクレインアンタゴニストである。ある実施態様において、アルファ－シヌクレインアンタゴニストは抗アルファ－シヌクレイン抗体またはそのフラグメントである。

本発明は、さらに、ここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物を含むキットを提供する。また提供されるのは、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物を含む診断キットである。

本発明はまた細胞におけるＳＮＣＡタンパク質発現を阻止または減少する方法に関し、方法はここに開示するＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物をＳＮＣＡタンパク質発現細胞に投与することを含み、ここで、細胞のＳＮＣＡタンパク質発現が投与後阻止または減少される。ある実施態様において、ＡＳＯは、投与後細胞のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現を阻止または減少する。ある実施態様において、ＳＮＣＡｍＲＮＡの発現は、投与後、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少される。他の実施態様において、ＡＳＯは、投与後、ＡＳＯに曝されていない細胞と比較して、細胞のＳＮＣＡタンパク質少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％減少させる。ある実施態様において、細胞は神経細胞である。

ここに提供されるのは、有効量の本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病を処置する方法である。ある実施態様において、シヌクレイン病は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される。

またここに提供されるのは、医薬の製造のための本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物の使用である。本発明はまた処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置用医薬の製造のための、ＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物の使用を提供する。ある実施態様において、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物は、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置に使用するためである。他の実施態様において、本発明のＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物は治療に使用するためである。

ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、ＡＳＯ、コンジュゲートまたは組成物は、経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与される。

図１Ａは、ＡＳＯ－００５４５９の連続的ヌクレオチド配列を示す。ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴおよびＯｘｙＭＣはそれぞれアデニンベータＤ－オキシ－ＬＮＡ、チミンベータＤ－オキシ－ＬＮＡおよびメチルシトシンベータＤ－オキシ－ＬＮＡである；ＤＮＡｔ、ＤＮＡｃおよびＤＮＡａはそれぞれチミンＤＮＡ、シトシンＤＮＡおよびアデニンＤＮＡである；そしてｓはホスホロチオエート結合である。

図１Ｂは、ここに開示するＡＳＯ－００５４５９の分子構造を示す。提供される構造はＣ_１７１Ｈ_２１４Ｎ_５６Ｏ_９０Ｐ_１６Ｓ_１６の分子式を有し、Ｍ^＋の各々はＨ^＋、Ｎａ^＋またはＮＨ_４ ^＋などの薬学的に許容されるカウンターイオンである。

図２Ａおよび２Ｂは、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣトランスジェニックマウスから単離した初代神経細胞のＳＮＣＡおよびチューブリン(Ｔｕｂ)タンパク質発現に対するＡＳＯ－００５４５９の効果を示す。神経細胞をＡＳＯ－００５４５９の１０点滴定で処理し、ＳＮＣＡおよびチューブリンタンパク質の量を測定した。α－Ｓｙｎ／Ｔｕｂ比(図２Ａ)およびＴｕｂレベル(図２Ｂ)のパーセント阻害が示される。各データ点は、個々の反復を表す。

図３は、ヒト神経細胞のＳＮＣＡ(丸)、タンパク質Ｓ(アルファ)(ＰＲＯＳ１(四角))およびチューブリン(ＴＵＢＢ３(三角))ｍＲＮＡは発現レベルに対するＡＳＯ－００５４５９の効果を示す。神経細胞を種々の濃度のＡＳＯ－００５４５９で６日間処理し、次いで、ｍＲＮＡレベルをQUANTIGENE^{(登録商標)}アッセイで測定した。ｍＲＮＡ発現レベルを対照のパーセントとして示す。データを、２回測定の平均±ＳＤとして示す。

図４は、１００μgのＡＳＯ－００５４５９(白四角)または対照媒体(黒丸)ＩＣＶ投与３日後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの海馬でのＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡで正規化し、次いで媒体群の平均発現レベルに対して表した。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。データを、２回測定の平均±ＳＤとして示す。示す統計は、１元配置ＡＮＯＶＡとダネットの事後検定に基づく。^＊＊＊ｐ＜０.００１。

図５Ａおよび５Ｂは、ＡＳＯ－００５４５９で処置したマウスの平均体重の比較を示す。図５Ａで、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスに３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μgのＡＳＯ－００５４５９を投与し、体重を処置後０週目、１週目および２週目に測定した。図５Ｂで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００μgのＡＳＯ－００５４５９を投与し、動物の体重を２８日間の経過中に週１回測定した。両図５Ａおよび５Ｂで、媒体対照を受けた動物を対照として使用した。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。示す統計は、２元配置ＡＮＯＶＡに基づく。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、海馬(図６Ａ)、脳幹(図６Ｂ)および線条体(図６Ｃ)投与１４日後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの海馬(図６Ａ)、脳幹(図６Ｂ)および線条体(図６Ｃ)でのＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＳＮＣＡｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲで測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡで正規化し、次いで媒体群平均に対して表した。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。各丸は個々の動物を表す。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。示す統計は、１元配置ＡＮＯＶＡとダネットの事後検定に基づく。^＊＊＊ｐ＜０.００１。

図７は、ＡＳＯ－００５４５９処置１４日後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの海馬(黒色)、脳幹(薄灰色)および線条体(濃灰色)で検出されたＡＳＯ－００５４５９レベルを示す。マウスは、ＩＣＶ投与で３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μgのＡＳＯ－００５４５９を受けた。データは、複数動物からの平均±ＳＤを表す(ｎ＝５)。

図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８ＤＡＳＯ－００５４５９処置１４日後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの海馬(図８Ａ)、脳幹(図８Ｂ)および線条体(図８Ｃ)におけるＡＳＯ－００５４５９暴露レベルとＳＮＣＡｍＲＮＡ発現の相関を示す。図８Ｄは、海馬(丸)、脳幹(四角)および線条体(三角)からのデータを組み合わせて示す。各データ点は、個々の動物を表す。４パラメータ、非線形フィットを海馬(図８Ａ)および脳幹(図８Ｂ)について示す。

図９Ａおよび９Ｂは、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスのＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＳＯ－００５４５９の効果の用量応答曲線を示す。動物は１２.５μg(丸)、２５μg(四角)または５０μg(三角)のＡＳＯ－００５４５９を(ＩＣＶ注射で)受け、投与後２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週に屠殺した。脳幹(図９Ａ)および線条体(図９Ｂ)の両方のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで評価し、次いで媒体対照に対して正規化した。平均データを示す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。

図１０Ａおよび１０Ｂは、ＡＳＯ－００５４５９投与４週後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスのＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＳＯ－００５４５９の効果を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ－００５４５９(１２.５μg、２５μgまたは５０μg)を受けた。相対的ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベル(媒体対照に対して正規化した)を脳幹(図１０Ａ)および線条体(図１０Ｂ)両者について示す。各データ点は、個々の動物を表す。複数動物からの平均±ＳＤも示す。示す統計は１元配置ＡＮＯＶＡを使用する媒体群との比較と、複数比較のためのダネットの補正に基づく。水平線は１の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。^＊ｐ＜０.０５、^＊＊ｐ＜０.０１、^＊＊＊ｐ＜０.００１、^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１。

図１１Ａおよび１１Ｂは、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの脳組織のＳＮＣＡタンパク質発現レベルに対するＡＳＯ－００５４５９の効果の用量応答曲線を示す。動物は１２.５μg(丸)、２５μg(四角)または５０μg(三角)のＡＳＯ－００５４５９を(ＩＣＶ注射で)受け、投与後２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週に屠殺した。ＳＮＣＡタンパク質レベルを脳幹(図１１Ａ)および線条体(図１１Ｂ)両者でＥＬＩＳＡにより測定し、次いで媒体対照に対して正規化した。平均データを示す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。

図１２Ａおよび１２Ｂは、ＡＳＯ－００５４５９投与８週後のＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスのＳＮＣＡタンパク質発現レベルに対するＡＳＯ－００５４５９の効果を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ－００５４５９(１２.５μg、２５μgまたは５０μg)を受けた。相対的ＳＮＣＡタンパク質発現レベル(媒体対照に対して正規化した)を脳幹(図１２Ａ)および線条体(図１２Ｂ)両者について示す。各データ点は、個々の動物を表す。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。複数動物からの平均±ＳＤも示す。示す統計は１元配置ＡＮＯＶＡを使用する媒体群との比較と、複数比較のためのダネットの補正に基づく。

図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＳＯ－００５４５９投与後のカニクイザルにおけるＳＮＣＡｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現レベルの反応速度論を示す。動物の各々は媒体対照またはＡＳＯ－００５４５９(８mg)を受け、次いで、投与後２４時間、３日、２週、４週、８週、１３週または２０週に屠殺した。各時点で、ＳＮＣＡｍＲＮＡ(図１３Ａ)およびＳＮＣＡタンパク質(図１３Ｂ)の発現レベルを次の組織で評価した：髄質(上左パネル)、尾状核被殻(上中パネル)、橋(上右パネル)、小脳(下左パネル)、腰部脊髄(下中パネル)および前頭前皮質(下右パネル)。発現レベルは媒体対照のパーセンテージとして示す。個々の動物および平均のデータ両者が示される。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。

図１４Ａおよび１４Ｂは、ＡＳＯ－００５４５９投与２週間後のカニクイザルのＳＮＣＡｍＲＮＡ(図１４Ａ)およびＳＮＣＡタンパク質(図１４Ｂ)両者の相対的発現レベル(媒体対照のパーセンテージとして)を示す。動物は媒体対照または種々の濃度のＡＳＯ－００５４５９(２、４または８mg)を受けた。発現レベルを次の組織で評価した：髄質(上左パネル)、尾状核被殻(上中パネル)、橋(上右パネル)、小脳(下左パネル)、腰部脊髄(下中パネル)および前頭前皮質(下右パネル)。発現レベルは媒体対照のパーセンテージとして示す。個々の動物および平均のデータ両者が示される。水平線は１００％の参照値を印す(すなわち、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現が媒体対照群で観察される発現レベルと等しいであろう値)。

本発明の詳細な記載
Ｉ. 定義
物の単数表現はその物の１またはそれ以上をいうことは注意すべきである；例えば「ヌクレオチド配列」は１以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、「１以上」および「少なくとも１」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。

さらに、「および／または」は、ここで使用されるとき、他方を伴うまたは伴わない、２つの特定の性質または要素の各々と解釈すべきである。故に、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの表現で使用する用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの言い回しで使用する用語「および／または」は、次の態様を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。

ある態様が用語「含む」を使用して記載されているとき、用語「からなる」および／または「から本質的になる」で記載される類似する態様も提供されると理解される。

特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本発明に使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。

単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)により認められた形態で示す。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に５'から３'配向で記載する。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。ここに提供する表題は、本明細書を全体として参酌して得られる本発明の種々の態様を限定するものではない。従って、直ぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参酌してより完全に定義される。

用語「約」は、ここでは、おおよそ、大まかに、近辺またはその辺りを意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、その範囲が示す数値の上および下に境界を広げるように修飾される。一般に、用語「約」は、数値を、記載した値の例えば、１０パーセント上または下の(高いまたは低い)偏差まで、上および下に修飾し得る。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯ投与後、細胞のＳＮＣＡタンパク質を少なくとも約６０％減少させる」なる記載があるならば、ＳＮＣＡレベルは５０％～７０％の範囲で減少されることが含意される。

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ＡＳＯ)は、ヌクレオチド間結合により互いに共有結合された、天然に存在するヌクレオシドまたはその修飾形態などのヌクレオシドのオリゴマーまたはポリマーをいう。本発明に有用なＡＳＯは、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシドを含む。ＡＳＯは、ＡＳＯが標的核酸配列とハイブリダイズするように、標的核酸と相補性である。ここで使用する用語「アンチセンスＡＳＯ」、「ＡＳＯ」および「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と相互交換可能である。

用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することが意図される。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、インビボまたはインビトロの標的配列、例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡをいう。本用語が標的配列の核酸またはヌクレオチドをいうとき、該核酸またはヌクレオチドは細胞に天然に存在する配列であり得る。他の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のＡＳＯの配列をいう。本用語がＡＳＯの配列をいうとき、該核酸またはヌクレオチドは天然に存在しない、すなわち、化学合成された、酵素的に産生された、組み換えにより産生されたまたはこれらの何れかの組み合わせであり得る。ある実施態様において、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは合成または組み換えにより産生され、天然に存在する配列またはそのフラグメントではない。他の実施態様において、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含むため、天然に存在しない。用語「核酸」または「ヌクレオシド」は、ポリヌクレオチドに存在する単一核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログをいう。「核酸」または「ヌクレオシド」は天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列をいうとき、言及されるのは、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵおよびそれらのアナログなどの塩基配列であることは認識される。

ここで使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基などの共有結合基(結合基)を含むグリコシドをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドおよび修飾糖および／または塩基を含む天然に存在しないヌクレオチドの両者を包含する。ここで、単一ヌクレオチド(単位)はモノマーまたは核酸単位とも称され得る。

ここで使用する用語「ヌクレオシド」は、ＡＳＯのヌクレオシド間をヌクレオチド間結合により共有結合され得る、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいう。バイオテクノロジー分野において、用語「ヌクレオシド」はしばしば核酸モノマーまたは単位をいうために使用される。ＡＳＯに関連して、用語「ヌクレオシド」は、糖主鎖およびヌクレオチド間結合の存在が含意される、シトシン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、グアニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、アデニン(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、チミン(ＤＮＡ)およびウラシル(ＲＮＡ)を含む、塩基単独、すなわち、核酸塩基配列をいい得る。同様に、特にヌクレオチド間結合基の１以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は「ヌクレオシド」といい得る。例えば用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質が特定されていても、使用できる。

当業者には認識されるとおり、オリゴヌクレオチドの５'末端ヌクレオチドは、５'末端基を含み得るが、５'ヌクレオチド間結合基を含まない。

用語「下流」は、ヌクレオチド配列についていうとき、核酸またはヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド配列の３'に位置することを意味する。ある実施態様において、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。

特に断らない限り、ここに提供する配列は、５'末端(左)から３'末端(右)に記載される

用語「上流」は、対照ヌクレオチド配列の５'に位置するヌクレオチド配列をいう。

ここで使用する用語「転写物」は、ＤＮＡの転写により合成され、処理後メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)になる一次転写物すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ(ｐｒｅ－ｍＲＮＡ)および処理されたｍＲＮＡそれ自体をいうことができる。用語「転写物」は、「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」および「ｍＲＮＡ」と相互交換可能に使用され得る。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびその他などの成熟、機能的形態に変換されるようにいくつかの方法で修飾される。故に、用語「転写物」は、エキソン、イントロン、５' ＵＴＲおよび３' ＵＴＲを含み得る。

ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程をいう。ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)への転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は「遺伝子産物」を産生する。ここで使用する遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生された核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡまたは転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。ここに記載する遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングされた核酸または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク質分解的開裂されたポリペプチドをさらに含む。

ＳＮＣＡポリペプチドの「天然に存在するバリアント」なる用語は、規定分類群、例えば、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳動物に天然に存在するＳＮＣＡポリペプチド配列またはＳＮＣＡ核酸配列(例えば、転写物)のバリアントをいう。一般に、ＳＮＣＡポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」をいうとき、本用語はまた染色体転座または複製により染色体位置１７ｑ２１におよびそれ由来のｍＲＮＡなどのＲＮＡに見られる、ＳＮＣＡコードゲノムＤＮＡのあらゆるアレルバリアントも包含し得る。「天然に存在するバリアント」は、ＳＮＣＡｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来するバリアントも含み得る。特定のポリペプチド配列をいうとき、例えば、本用語はまた天然に存在するタンパク質も包含し、それは、従って、例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解的開裂、グリコシル化などにより共翻訳または翻訳後修飾により処理され得る。

ここで使用する用語「相補物」は、対照配列と相補的である配列を示す。相補性は、互いに逆平行で整列されたとき、鏡を見るのにおよび物の逆側を見るのによく似て、配列の各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるように、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列間で共有される性質であるＤＮＡ複製および転写の塩基原則であることは周知である。それ故に、例えば、５'「ＡＴＧＣ」３'配列の相補物は、３'「ＴＡＣＧ」５'または５'「ＧＣＡＴ」３'として記載し得る。ここで使用する用語「逆相補物」、「逆相補的」および「逆相補性」は、ここでは用語「相補物」、「相補的」および「相補性」と相互交換可能に使用する。それ故に、配列5' attcctttacaccacac 3'(配列番号４)は、5' gtgtggtgtaaaggaat 3'と相補的であり得る。

ここで使用する配列番号(すなわち、配列番号４)への言及は特定の核酸塩基配列を含むが、デザインまたは完全化学構造の何れかを含まない。本明細書で特定のＡＳＯ番号(すなわち、ＡＳＯ－００５４５９)に言及するとき、対象は配列、特定のＡＳＯ設計および化学構造を含む。

「有効性」は、通常、特に断らない限り、μM、nMまたはpMのＩＣ_５０またはＥＣ_５０値として表される。有効性はパーセント阻害の観点でも表し得る。ＩＣ_５０は治療分子の中央阻害濃度である。ＥＣ_５０は、媒体または対照(例えば、食塩水)に対する治療分子の中央有効濃度である。機能的アッセイにおいて、ＩＣ_５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現を、該治療分子により達成される生物学的応答の５０％減ずる治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、ＥＣ_５０は、生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現の５０％を生じる治療分子の濃度である。ＩＣ_５０またはＥＣ_５０は、当分野で知られる何れかの手段により計算され得る。

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、それに対する診断、予後診断または治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含むヒト、家庭用動物、農業用動物、競技用動物および動物園の動物を含む。

用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性を有効とし、該組成物が投与される対象に許容されない毒性であるさらなる成分を含まないような形態の調製物をいう。このような組成物は無菌であり得る。

ここに開示するＡＳＯの「有効量」は、具体的に述べる目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記載する目的に関連して、経験的におよび日常的方法で決定され得る。

「処置」または「処置する」または「処置するためまたは「軽減する」または「軽減するため」などの用語は、(１)診断された病的状態または障害を治癒、減速または症状軽減するおよび／または進行停止させる治療手段および(２)標的病的状態または障害の発症を阻止および／または遅延させる予防的または防止的手段の両者をいう。それ故に、処置を含むものは、既に障害を有するもの；障害を有する素因があるもの；および障害を阻止すべきものを含む。ある実施態様において、対象は、患者が、疾患または障害と関連する症状の、例えば、完全な部分的なまたは一過性の軽減または消失を示すならば、ここに提供される方法により、本明細書の他の箇所に記載される疾患または状態が十分に「処置される」。

II. ＡＳＯ－００５４５９
本発明のＡＳＯ(すなわち、ＡＳＯ－００５４５９)は１７ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み、これは、ＳＮＣＡ転写物の領域(すなわち、イントロン１とエクソン２の間の接合部)の相補物、すなわち、配列番号１のヌクレオチド７,６０４～７,６２０に対応する。本発明のＡＳＯは、LDLDDDDDDDDDDLLLL(すなわち、AtTcctttacaccACAC)のＡＳＯ設計で配列番号４に示すヌクレオチド配列(すなわち、attcctttacaccacac)を有し、ここで、Ｌはロックド核酸ヌクレオシド(すなわち、ＬＮＡ、例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ)を示し、Ｄはデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)を示す。従って、ＡＳＯ－００５４５９の５'末端から１番目、３番目および１４～１７番目のヌクレオチドはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡであり、他のヌクレオチドの各々はＤＮＡである。ここに開示するＡＳＯはまた次の化学構造も有する：OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC(ここで、「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す)。ＡＳＯ－００５４５９の構造式は図１Ｂに示し、ここで、Ｍ^＋は薬学的に許容されるカウンターイオンである。ここで使用する用語「薬学的に許容されるカウンターイオン」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではなく、それにより、薬学的に許容される塩形態の産生を可能とする、電気的中性の維持のためのイオン種を伴うイオンをいう。従って、ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはＨ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋または１^＋の荷電を有する任意の他のカチオンであり得る。ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはＨ^＋、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびこれらの組み合わせである。

ここで使用する用語「薬学的に許容される塩」は、ＡＳＯ－００５４５９がその塩の形成により修飾(例えば、ここに開示するカチオンの付加)されている、ＡＳＯ－００５４５９の誘導体をいう。このような塩は、望ましくない毒物学的効果を付与することなく、ＡＳＯの所望の生物学的活性を保持する。本発明のＡＳＯは任意の塩形態であり得る。ある実施態様において、本発明のＡＳＯはナトリウム塩の形態である。他の実施態様において、ＡＳＯはカリウム塩の形態である。

ＡＳＯ－００５４５９はＳＮＣＡｍＲＮＡのイントロン１／エクソン２接合部に結合し、ＳＮＣＡｍＲＮＡの翻訳を阻止し得る。ある実施態様において、糖修飾のため、本発明のＡＳＯは、対照(例えば、このような糖修飾がないＡＳＯ)と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％増強された標的ＲＮＡ配列への結合親和性を有する。

ここに記載するＡＳＯのモノマーは、結合基を介して一緒に結合される。好適には、各モノマーは結合基により３'隣接モノマーに結合される。

本発明の状況で、ＡＳＯの末端の５'モノマーは、５'末端基を含んでも含まなくてもよいが、５'結合基を含まないことは当業者には理解される。

用語「結合基」および「ヌクレオチド間結合」は、２つのヌクレオチドを一緒に共有結合できる基を意味することを意図する。例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。

ヌクレオチド間結合の例はホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせを含む。引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ２００７／０３１０９１も参照。

本発明のＡＳＯのある態様において、ヌクレオチドはホスホロチオエート基の手段により互いに結合させる。

ホスホジエステル結合、例えば１個または２個の結合の、そうではないホスホロチオエートＡＳＯへの、特にヌクレオチド間または隣への挿入は、ＡＳＯのバイオアベイラビリティおよび／または生体内分布を修飾できることが認識されている－引用により本明細書に包含させるＷＯ２００８／１１３８３２参照。

上記の実施態様などの、適切であり、具体的に示されていないある実施態様において、全ての残りの結合基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートまたはそれらの混合物である。

ある実施態様において、ヌクレオチド間結合基全てホスホロチオエートである。

「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２'およびＣ４'に架橋結合を含む２'修飾ヌクレオシドであり(「２'－４'架橋」とも称する)、これはリボース環の配座を制限またはロックする。これらヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸(ＢＮＡ)とも呼ばれる。リボースの配座のロッキングは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子についてオリゴヌクレオチドに導入されたとき、ハイブリダイゼーションの親和性増強(二本鎖安定化)に関連する。オリゴヌクレオチド／相補物二本鎖の融点の測定により日常的に決定され得る。

非限定的、例示的ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, and Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238およびWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に開示される。

さらなる非限定的、例示的ＬＮＡヌクレオシドはスキーム１に開示される。

特定の実施態様において、本発明において有用なＬＮＡはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。

II.Ａ. コンジュゲート
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分に共有結合したＡＳＯ－００５４５９をいう。

ＡＳＯ－００５４５９の１以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、活性、細胞分布、細胞取り込みまたはＡＳＯ安定性に影響することにより、ＡＳＯの薬理学を改善し得る。ある実施態様において、コンジュゲート部分は、ＡＳＯの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込み改善により、ＡＳＯの薬物動態性質を修飾または増強する。特にコンジュゲートは、ＡＳＯを特定の臓器、組織または細胞型に標的化させ、それにより、その臓器、組織または細胞型でのＡＳＯの有効性を増強させ得る。同時に、コンジュゲートは、ＡＳＯの非標的細胞型、組織または臓器での活性、例えば、オフターゲット活性または非標的細胞型、組織または臓器での活性の減少に作用し得る。ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は適当なコンジュゲート部分を提供する。さらに適当なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰｒ)に結合できるものである。特に三価Ｎ－アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適する、例えばＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２およびＷＯ２０１４／１７９６２０参照。

ＡＳＯコンジュゲートおよびおよびその合成は、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 and Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的レビューにも報告されている。

ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えば、カプシド)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。

II.Ｂ. 活性化ＡＳＯ
ここで使用する用語「活性化ＡＳＯ」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ＡＳＯの１以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にする少なくとも１つの官能化部分に共有結合(すなわち、官能化)されている本発明のＡＳＯをいう。一般に、官能化部分は、ＡＳＯを、例えば、アデニン塩基の３'－ヒドロキシル基または環外ＮＨ_２基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を結合できる末端基を介してＡＳＯに共有結合できる化学基を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、ＮＨ_２基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のような任意の適当な保護基で保護される。

ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は、ＡＳＯの５'末端のコンジュゲート部分への共有結合を可能とするため、５'末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のＡＳＯは３'末端で官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは主鎖に沿ってまたはヘテロ環式塩基部分を官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のＡＳＯは、５'末端、３'末端、主鎖および塩基から独立して選択される１超える位置で官能化され得る。

ある実施態様において、本開示の活性化ＡＳＯは、官能化部分に共有結合した１以上のモノマーの合成中に取り込まれることにより合成される。他の実施態様において、本開示の活性化ＡＳＯは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、ＡＳＯは合成完了後官能化される。

III. 医薬組成物および投与経路
ＡＳＯ－００５４５９は医薬製剤および組成物で使用され得る。好適には、このような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。

ＡＳＯ－００５４５９は、処置患者に重篤な副作用を引き起こすことなく、患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤などのような単位製剤に包含され得る。しかしながら、ある形態の治療においては、重篤な副作用は、治療処置の前向きな結果を確実にするという場合には許容され得る。

製剤された薬物は薬学的に許容される結合剤およびアジュバントを含み得る。カプセル、錠剤または丸剤は、例えば、次の化合物を含み得る：結合剤として微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン；賦形剤としてデンプンまたはラクトース；滑沢剤としてステアレート；種々の甘味または風味剤。カプセル剤について、投与量単位は脂肪油などの液体担体を含み得る。同様に、糖コーティングまたは腸溶性コーティングも投与量単位の一部であり得る。オリゴヌクレオチド製剤はまたミセルエマルジョンを形成する活性医薬成分と脂質のエマルジョンでもあり得る。

本発明の医薬組成物は、局所または全身処置いずれが望まれるかおよび処置する領域により、多くの方法で投与され得る。投与は、(ａ)経口、(ｂ)例えば、ネブライザーを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送法による、肺、気管内、鼻腔内；(ｃ)上皮、経皮、眼および膣および直腸送達を含む粘膜への局所；または(ｄ)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；または頭蓋内、例えば、髄腔内、脳室内または心室内投与を含む非経腸であり得る。ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は、ＩＶ、ＩＰ、経口、局所的でまたはボーラス注射として投与されまたは標的臓器に直接投与される。ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は髄腔内または脳室内にボーラス注射として投与される。

局所投与用医薬組成物および製剤は経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、スプレー剤、坐薬剤、液剤および散剤を含み得る。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるか望ましいことがある。局所製剤の例は、ＡＳＯ－００５４５９が脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含む。経口投与用組成物および製剤は、散剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水または非水性媒体の懸濁液剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含むが、これらに限定されない。非経腸、髄腔内、脳室内または心室内投与用組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤および、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または添加物などであるが、これらに限定されない他の適当な添加物も含み得る、無菌水溶液を含み得る。

本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない多様な成分から製造され得る。薬物の標的組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含むが、これらに限定されない担体介在送達により増強され得る(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27)。

本発明の医薬製剤は、簡便には単位投与量形態で提示され得て、製薬業界で周知の慣用の技術により製造され得る。このような技術は、活性成分と医薬担体または添加物を結合させる工程を含む。一般に、製剤は均一にかつ緊密に活性成分と液体担体または微粉砕固体担体または両者を混合し、次いで、必要であれば、製品を成形することにより製造される。

非経腸、皮下、皮内または局所投与のために、製剤は無菌希釈剤、緩衝液、張性制御剤および抗細菌剤を含み得る。活性ＡＳＯは、制御された放出特性を備えたインプラントまたはマイクロカプセルを含む、崩壊または体からの即時の排泄から保護する担体を用いて製造され得る。静脈内投与のために、担体は生理学的食塩水またはリン酸緩衝化食塩水であり得る。２００７年３月２２日公開の国際公開ＷＯ２００７／０３１０９１(Ａ２)は適当な薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供する－これは引用により本明細書に包含させる。

IV. 診断
本開示は、さらに、ＳＮＣＡ関連疾患、例えば、シヌクレイン病の診断に有用な診断方法を提供する。シヌクレイン病の非限定的例は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。

ＡＳＯ－００５４５９を、個体からの組織または体液のＳＮＣＡ転写物発現測定に使用し、正常組織または体液の標準ＳＮＣＡ転写物発現レベルと測定発現レベルを比較でき、ここで、標準と比較した発現レベル増加は、ＡＳＯ－００５４５９で処置可能な障害の指標である。

ＡＳＯ－００５４５９を使用して、当業者に知られる何れかの方法を使用して、生物学的サンプルのＳＮＣＡ転写物レベルをアッセイし得る。(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。

「生物学的サンプル」は、個体、細胞株、組織培養またはＳＮＣＡ転写物を発現する可能性のある他の細胞源から得たあらゆる生物学的サンプルを意図する。哺乳動物から組織および体液を得る方法は、当分野で周知である。

Ｖ. ＡＳＯを含むキット
本開示は、さらに、ここに記載するＡＳＯ－００５４５９を含み、ここに記載する方法の実施に使用できる、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、１以上の容器に少なくともＡＳＯ－００５４５９を含む。ある実施態様において、キットは、全て対照物、アッセイ実施の指示および結果の解析および提示に必要な何れかの必要なソフトウエアを含む、検出アッセイに必要なおよび／または実施に十分な全ての要素を含む。当業者は、ＡＳＯ－００５４５９が当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込み得ることを認識する。

VI. 使用方法
ＡＳＯ－００５４５９は治療および予防に利用され得る。ＳＮＣＡは、シナプス伝達制御に役割を有すると考えられる場所であるシナプス前末端で、神経細胞に優勢に発現される１４０アミノ酸タンパク質である。天然に折り畳まれていないモノマーおよび安定なα－ヘリックスの四量体の両者で天然に存在することが推定されており、幾つかの翻訳後修飾を受けていることが示されている。広く研究されている修飾の一つは、ＳＮＣＡのアミノ酸セリン１２９(Ｓ１２９)のリン酸化である。通常、ＳＮＣＡはＳ１２９で小さいパーセンテージでしか構成的にリン酸化(ｐＳ１２９)されないが、病的細胞内封入で見られる大多数がｐＳ１２９ＳＮＣＡである。これら病的封入体は、誤って折り畳まれたＳＮＣＡタンパク質の凝集された、不溶性蓄積物からなり、集合的にシヌクレイン病(またはα－シヌクレイン病)として知られる神経変性疾患群の特徴である。

シヌクレイン病で、ＳＮＣＡは神経細胞にレビー小体として知られる病的凝集体を形成し、これは、パーキンソン病(ＰＤ)、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)およびレビー小体型認知症(ＤＬＢ)両者の特徴である。ＡＳＯ－００５４５９は、それ故に、ＳＮＣＡ病的凝集体の数を減らすまたはＳＮＣＡ病的凝集体の形成を阻止することができる。さらに、グリア細胞質内封入体(ＧＣＩ)と称される異常ＳＮＣＡ富病巣がオリゴデンドロサイトに見られ、多系統萎縮症(ＭＳＡ)として知られる、急速に進行する、致死的シヌクレイン病の特徴を表す。ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９はＧＣＩ数を減らすまたはＧＣＩ形成を阻止するオリゴデンドロサイトでの検出不可能なまたは低レベルのＳＮＣＡｍＲＮＡ発現の報告は、ＳＮＣＡのある病的形態が、高度に発現される神経細胞から、オリゴデンドロサイトに伝播されることを示唆する。ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は、ＳＮＣＡ、例えば、病的形態のＳＮＣＡの神経細胞からの伝播を減少または阻止する。

ＡＳＯ－００５４５９を使用して、細胞および実験動物での、例えば、ＳＮＣＡタンパク質の合成を特異的に阻害(一般にｍＲＮＡの分解または阻害、それによるタンパク質形成阻止による)についての研究ができ、それにより、標的の機能的分析またはその治療介入の標的としての有用性の評価が促進される。さらに提供されるのは、インビトロまたはインビボで、細胞または組織と、有効量の本開示のＡＳＯ－００５４５９、コンジュゲートまたは組成物を接触させることを含む、細胞または組織におけるＳＮＣＡｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質の発現を下方制御する方法である。

治療として、ＳＮＣＡ転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質発現調節により処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、ここに開示によりＡＳＯ－００５４５９の投与により処置するさらに提供されるのは、治療的または予防有効量の本発明のＡＳＯ－００５４５９または組成物を投与することによる、ＳＮＣＡ転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の発現と関連する疾患または状態を有することが疑われるまたはその素因のある動物を処置するなどの哺乳動物を処置する方法である。本発明によるＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。ある実施態様において、本発明のＡＳＯまたはコンジュゲートは治療に使用される。

本発明は、さらに、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患などの、ここに記載する疾患の１以上の処置に使用するための、ＡＳＯ－００５４５９を提供する。

本発明は、さらに、有効量のＡＳＯ、コンジュゲートまたはその医薬組成物をそれを必要とする動物(例えば処置が必要な患者)に投与することを含む、α－シヌクレイン病を処置する方法を提供する。

ある実施態様において、疾患、障害または状態は、ＳＮＣＡ遺伝子転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の過発現と関連する。

本発明はまた細胞または組織におけるＳＮＣＡ遺伝子転写物および／またはＳＮＣＡタンパク質の発現を阻害(例えば、減少)する方法も提供し、方法は、インビトロまたはインビボで、細胞または組織とここに開示の有効量のＡＳＯ、そのコンジュゲートまたは医薬組成物を接触させて、ＳＮＣＡ遺伝子転写物の発現の低下に影響を与え、それによりＳＮＣＡタンパク質を減少させることを含む。

ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９を、脳の１以上の区画、例えば、海馬、脳幹、線条体または何れかのこれらの組み合わせにおけるＳＮＣＡｍＲＮＡの発現の減少に使用する。他の実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は、３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目、１５日目、２０日目、２１日目または２５日目に、媒体(無ＡＳＯ)の投与または暴露後のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現と比較して、例えば、脳幹および／または線条体におけるＳＮＣＡｍＲＮＡの発現を７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満に減少させる。ある実施態様において、ＳＮＣＡｍＲＮＡの発現は、２８日目、３０日目、３２日目、３５日目、４０日目、４２日目、４５日目、４９日目、５０日目、５６日目、６０日目、６３日目、７０日目または７５日目まで、媒体(無ＡＳＯ)の投与または暴露後のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現と比較して、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下に維持される。

他の実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９は、髄質、尾状核被殻、橋、小脳、腰部脊髄、前頭前皮質および／または何れかのこれらの組み合わせのＳＮＣＡｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質発現を減少させる。

本発明はまた、医薬の製造のための、記載する本発明のＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートも提供する。本発明はまた、ここに記載する障害の処置に使用するためのまたはここに記載する障害の処置の方法のための、ＡＳＯ－００５４５９またはそのコンジュゲートを含む組成物も提供する。本発明はまた治療に使用するためのＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートを提供する。本発明は、さらに、シヌクレイン病の処置に使用するための、ＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートを提供する。

本発明は、さらに、細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の阻害を及ぼすように、細胞に本発明のＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートを投与することを含む、ＳＮＣＡ発現細胞におけるＳＮＣＡタンパク質を阻害する方法を提供する。

本発明は、本発明によるＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートを投与することを含む、処置を必要とする対象における神経過興奮を減少、軽減、予防または処置する方法を含む。

本発明はまた、処置を必要とする患者に、ここに記載する本発明のＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートおよび／または本発明の医薬組成物を投与することを含む、ここに記載する障害を処置する方法も提供する。

本発明のＡＳＯ－００５４５９および他の組成物を、ＳＮＣＡタンパク質の過発現または変異バージョンの発現と関連する状態の処理に使用し得る。

本発明は、α－シヌクレイン病の処置などのための医薬として使用するための、本発明のＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートも提供する。ある実施態様において、α－シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患である。

本発明は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、ＡＳＯ－００５４５９の使用をさらに提供する。ある実施態様において、ＡＳＯ－００５４５９またはそのコンジュゲートを、α－シヌクレイン病、発作性疾患またはこれらの組み合わせの処置用医薬の製造に使用する。

一般的に述べて、本発明の一態様は、哺乳動物に治療有効量のここに記載するＡＳＯを投与することを含む、ＳＮＣＡの異常レベルと関連する状態(すなわち、α－シヌクレイン病)を有するかまたは疑われる哺乳動物を処置する方法に関する。

ここで述べる疾患または障害は、ある実施態様において、ＳＮＣＡ遺伝子またはタンパク質産物がＳＮＣＡタンパク質と関連するまたは相互作用する遺伝子の変異と関連し得る。それ故に、ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、ＳＮＣＡ配列の変異形態である。

本発明の興味深い態様は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、ここに定義するＡＳＯ－００５４５９またはここに定義するコンジュゲートの使用に関する。

本発明の方法は、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質が原因の疾患の処置または予防に用いられ得る。ある実施態様において、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質が原因の疾患はα－シヌクレイン病である。ある実施態様において、α－シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含む。

換言すると、ある実施態様において、本発明は、さらに、本発明のＡＳＯ－００５４５９またはコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質を処置する方法に関する。

本発明は、医薬として使用するためのここに定義するＡＳＯ－００５４５９、組成物またはコンジュゲートにも関する。

本発明は、異常レベルのＳＮＣＡタンパク質またはＳＮＣＡタンパク質の変異体形態(例えば、ここに記載する疾患の一つと関連するもののようなアレルバリアント)の発現の処置用医薬の製造のための、ここに定義する化合物、組成物またはコンジュゲートの使用にさらに関する。

処置を必要とする患者は、該疾患または障害を有するか有する可能性が高い患者である。

本発明の実施には、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の技術が用いられる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2^nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)参照。

上に引用する全ての参考文献ならびに本明細書に引用する全ての引用文献は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。

次の実施例は、説明のために提供し、限定のためではない。

実施例１：ＡＳＯ－００５４５９の構築
ここに記載するＡＳＯ(すなわち、ＡＳＯ－００５４５９)を、ＳＮＣＡｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン１とエクソン２の間の接合部(すなわち、配列番号１のヌクレオチド７,６０４～７,６２０)を標的とするよう設計した。ＡＳＯ－００５４５９をギャップマー(例えば、交互ギャップマー)として設計し、５'末端および３'末端にロックド核酸－ＬＮＡ(大文字)、ベータ－デオキシＬＮＡをおよびホスホロチオエート主鎖を含む。しかし、主鎖は他のタイプの主鎖でよい(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの組み合わせ)。

本発明のＡＳＯを、当分野で周知の方法を使用して合成した。このようなＡＳＯの製造法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10 - " Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載され、その内容全体を引用により明示的に本明細書に包含させる。

実施例２. 初代神経細胞におけるＳＮＣＡタンパク質の減少を測定する高含量アッセイ
ＡＳＯ－００５４５９を、初代マウス神経細胞のＳＮＣＡタンパク質発現を減少させるその能力について試験した。初代神経細胞培養を、Ａ５３Ｔ変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体をマウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドで担持するＰＡＣ－Ｔｇ(ＳＮＣＡ^Ａ５３Ｔ)^＋／＋；ＳＮＣＡ^－／－(「ＰＡＣ－Ａ５３Ｔ」)マウスの前脳から確立した。Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)参照。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。初代神経細胞を、製造業者のプロトコールに従うパパイン消化により産生した(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。単離神経細胞を洗浄し、Ｂ２７(Gibco)、１.２５μM Glutamax(Gibco)、１００単位／ml ペニシリン、１００μg／ml ストレプトマイシンおよび２５μg／ml アムホテリシンＢ添加神経基底培地(ＮＢＭ、Invitrogen)に再懸濁した。

細胞を、多ウェルポリＤ－リシン被覆プレートに５,４００細胞／cm^２で播種した(例えば３８４ウェルプレートで２５μl ＮＢＭ中６,０００細胞／ウェル)。ＡＳＯを水で希釈し、細胞にＤＩＶ０１(すなわち、播種１日後)に加えた。ＡＳＯを培地中最終濃度の２倍で添加し、次いで、細胞に手動で送達した。あるいは、ＡＳＯ水溶液をLabcyte ECHOアコースティックディスペンサーを使用して分配した。ＥＣＨＯ分配のために、２５０nlのＡＳＯ水溶液を培地中の細胞に加え、続いて新鮮ＮＢＭの等体積アリコートを加えた。一次スクリーニングのため、ＡＳＯを５μM、３.３μM、１μM、２００nMまたは４０nMの最終濃度で加えた。有効性決定のために、ＡＳＯの８～１０点滴定を０.７５mM現役から調製し、次いで２.７～４０００nMまたは４.５～１０,０００nM範囲の最終濃度で培養細胞に送達した。ＡＳＯ－００００１０(TCTgtcttggctTTG、配列番号５)およびＡＳＯ－０００８３８(AGAaataagtggtAGT、配列番号６)(５μM)を、それぞれチューブリンおよびＳＮＣＡの参照対照阻害剤としてプレートに包含させた。細胞をＡＳＯと１４日間インキュベートし、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。

１４日間インキュベーション後、細胞を、ウェル中４％ホルムアルデヒド(J.T. Baker)および４％スクロース(Sigma)の最終濃度に固定剤を加えることにより固定した。細胞を１５分間固定し、固定剤をウェルから吸引した。次いで、細胞を、０.３％Triton-X 100および３％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)または３％正常ヤギ血清含有リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液で２０分間透過性処理した。その後、透過処理緩衝液をウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、一次抗体を０.１％Triton X-100および３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した。１：１０００のウサギ抗ＳＮＣＡ(Abcam)および１：５００のニワトリ抗チューブリン(Abcam)の希釈を使用した。細胞を、一次抗体と２時間～一夜インキュベートした。インキュベーション後、一次抗体染色溶液を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。３％ＢＳＡと共に０.１％Triton X-100を含むＰＢＳ中の１：５００希釈のヤギ－抗ニワトリAlexa 567抗体、ヤギ抗ウサギ－Alexa 488抗体およびHoechst(１０μg／ml)を含む二次染色溶液をウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。その後、二次染色溶液をウェルから吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞洗浄後、６０μlのＰＢＳを各ウェルに加えた。次いで、プレートをＰＢＳユニットイメージングまで保存した。

造影のために、プレートを核(Hoechst染色、チャネル１)、チューブリン伸長(Alexa 567、チャネル２)およびＳＮＣＡ(Alexa 488、チャネル３)を定量するためのSpot Detector bio-application(Cellomics)を使用するThermo-Fisher(Cellomics)CX5イメージャー上で走査した。対象カウント(核)をモニターしたが、データベースに公開しなかった。チューブリンにより被覆された総面積を特性SpotTotalAreaCh2として定量し、ＳＮＣＡの染色の総強度をSpotTotalIntenCh3として定量した。チューブリン測定は毒性のモニターのために含めた。ＳＮＣＡタンパク質減少を決定するために、ＳＮＣＡ強度対チューブリン染色面積比を計算し、結果を、合計として媒体処理ウェルおよびチューブリンまたはＳＮＣＡそれぞれの最大阻害ウェルとしてＡＳＯ－００００１０またはＡＳＯ－０００８３８ウェルを使用して％阻害中央として正規化した。

実施例３：ヒト神経細胞でｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE^{(登録商標)}分析(９６ウェルアッセイ)
ＡＳＯ－００５４５９がヒトＳＮＣＡｍＲＮＡを減少させる能力および／または可能性のあるヒトオフターゲットｍＲＮＡ種を、インビトロでQUANTIGENE^{(登録商標)}分析により測定した。ヒト神経細胞(Cellular Dynamics Inc., "iNeurons")を、製造業者の明細にしたがい解凍し、播種し、培養した。これらのiNeuronsはCellular Dynamic所有の分化および精製プロトコールを使用して多能性幹(ｉＰＳ)細胞から誘導したヒト神経細胞の高度に純粋な集団である。

溶解：細胞を、ウェルあたり５０,０００～１００,０００細胞(試験するオフターゲットの発現による)でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamaxおよびペニシリン－ストレプトマイシン添加神経基底培地に維持した。ＡＳＯを水で希釈し、ＤＩＶ０１(すなわち、播種１日後)に細胞に加えた。一点測定のために、０.５μMの最終ＡＳＯ濃度を一般に使用した。ＩＣ_５０決定のために、神経細胞を５μMの最高濃度で１：４の７点濃度応答希釈で処理し、ＩＣ_５０を規定した。次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で６日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した

インキュベーション後、培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーＲＮＡ測定を、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットを利用する分岐ＤＮＡ－シグナル増幅法を使用してＲＮＡを定量するQUANTIGENE^{(登録商標)}2.0 Reagent System(AFFYMETRIX^{(登録商標)})を使用して実施した。作業細胞溶解緩衝溶液を、５０μl プロテイナーゼＫを５mlの予め温めた(３７℃)混合物に添加し、ｄＨ_２Ｏで１：４最終希釈に希釈することにより製造した。作業溶解緩衝液プレートに加え(試験するオフターゲットの発現により、１００～１５０μl／ウェル)、１０回摩砕し、密封し、３０分間、５５℃でインキュベートした。溶解後、ウェルをさらに１０回摩砕し、プレートを－８０℃で保存するか直ぐにアッセイした。

アッセイ：使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、ＳＮＣＡ、ＰＲＯＳ１またはチューブリン)によって、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積８０μl／ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE^{(登録商標)}2.0 AFFYMETRIX^{(登録商標)})の指示に従い、無ヌクレアーゼ水(１２.１μl)、溶解混合物(６.６μl)、遮断剤(１μl)および特定２.０プローブセット(０.３μl)(ヒトＳＮＣＡ catalogue #SA-50528、ヒトＰＲＯＳ１ catalogue #SA-10542またはヒトベータ３チューブリンcatalogue #SA-15628)を合わせることにより産生した。次に、２０μl 作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで８０μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために８０μl溶解混合物)に加えた。プレートを２４０ｇで２０秒間遠心分離し、次いで１６～２０時間、５５℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的ＲＮＡ捕捉)。

標的ＲＮＡのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で３回(３００μl／ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。次いで、2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５５℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５０℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び２４０ｇで２０秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(１００μl／ウェル)をプレートに加えた。プレートを５分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーでルミノメーターモードで１５分以内に造影した。

データ決定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナルを各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンＲＮＡのバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、対照処理サンプルライセートに対して計算した。ＡＳＯで処理した細胞のQUANTIGENE^{(登録商標)}アッセイの結果を、例えば、図３に示す。

実施例４：Ｒａｍｏｓ細胞におけるｍＲＮＡ減少を測定するためのQUANTIGENE^{(登録商標)}分析(９６ウェルアッセイ)
ヒトオフターゲットＩＫＺＦ３(ＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー３)ｍＲＮＡ減少の可能性を測定するために、Ｒａｍｏｓ細胞(ヒトリンパ球性細胞株)を使用した。Ｒａｍｏｓ細胞はＳＮＣＡを発現しないため、Ｒａｍｏｓ細胞で発現されるＲＢ１(ＲＢ転写コリプレッサー１)を、ＡＳＯ介在ノックダウンＩＫＺＦ３ｍＲＮＡ発現評価のための陽性対照として使用した。ヒトＲＢ１ｍＲＮＡ発現への結合およびノックダウンのために２つのＡＳＯを合成した。ベータ－２ミクログロブリン(β２Ｍ)をハウスキーピング遺伝子対照として使用した。Ｒａｍｏｓ細胞を、ＦＢＳ、グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ添加ＲＰＭＩ培地の懸濁液で増殖させた。

溶解：細胞を、ウェル当たり２０,０００細胞でポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン被覆９６ウェルプレートに播種し、Ｂ２７、glutamaxおよびペニシリン－ストレプトマイシン含有神経基底培地に維持した。ＡＳＯを水で希釈し、播種１日後(ＤＩＶ０１)、１μMの最終濃度で細胞に加えた。ＡＳＯ処理後、細胞を３７℃で４日間インキュベートして、ｍＲＮＡの定常状態減少を達成した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーＲＮＡ測定を、特別に設計されたＲＮＡ捕捉プローブセットを利用する分岐ＤＮＡ－シグナル増幅法を使用してＲＮＡを定量するQUANTIGENE^{(登録商標)}2.0 Reagent System(AFFYMETRIX^{(登録商標)})を使用して実施した。溶解混合物(QUANTIGENE^{(登録商標)}2.0 AFFYMETRIX^{(登録商標)})を３７℃で３０分間インキュベーターで予め温めた。懸濁液に細胞を溶解するために、１００μlの３Ｘ溶解緩衝液(１０μl／ml プロテイナーゼＫ含有)を、２００μlの懸濁液中の細胞に加えた。次いで、細胞を１０回摩砕して溶解させ、プレートを密封し、３０分間、５５℃でインキュベートした。その後、ライセートを－８０℃で保存するか直ぐにアッセイした。

アッセイ：使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、ＩＫＺＦ３、ＲＢ１およびβ２Ｍ)により、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積８０μl／ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された９６ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE^{(登録商標)}2.0 AFFYMETRIX^{(登録商標)})の指示に従い、無ヌクレアーゼ水１２.１μl、溶解混合物６.６μl、遮断剤１μl、特定２.０プローブセット０.３μl(ヒトＩＫＺＦ３ catalogue #SA-17027、ヒトＲＢ１ catalogue #SA-10550またはヒトベータ－２ミクログロブリンcatalogue #SA-10012)を合わせることにより産生した。次いで２０μl 作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで８０μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために８０μl溶解混合物)に加えた。次いでプレートを１６～２０時間、５５℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的ＲＮＡ捕捉)。標的ＲＮＡのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で３回(３００μl／ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、５５℃で１時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、３回吸引した。2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を記載のとおり加え、１時間、５５℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(１００μl／ウェル)を加え、１時間、５０℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び２４０ｇで２０秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(１００μl／ウェル)をプレートに加えた。プレートを５分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーでルミノメーターモードで１５分以内に造影した。

データ決定：目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナル(すなわち、無ライセート、１Ｘ溶解緩衝液のみ)を各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングｍＲＮＡ(Ｒａｍｏｓ細胞ではベータ－２－ミクログロブリンであった)のバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、未処理サンプルライセートの平均に対して計算した。ＡＳＯ－００５４５９で処理した細胞のQUANTIGENE^{(登録商標)}アッセイの結果を、表４に示す。

実施例５：ＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)細胞でのＳＮＣＡｍＲＮＡの減少を測定するためのｑＰＣＲアッセイ
ＳＮＣＡを標的とするＡＳＯ－００５４５９を、ＡＴＣＣから得たヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)神経芽腫細胞(ＣＲＬ－２２７１)におけるＳＮＣＡｍＲＮＡ発現を減少させる能力について試験した。

ＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)細胞を、細胞培養培地(１０％ウシ胎児血清[Sigma, cat.no F7524]、１×Glutamax^TM[Sigma, cat.no 3050-038]、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液[Sigma, cat.no M7145]および０.０２５mg／ml ゲンタマイシン[Sigma, cat.no G1397]添加ＭＥＭ[Sigma, cat.no M2279])で増殖させた。細胞を、５日毎にリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)[Sigma cat.no 14190-094]で洗浄し、続いて０.２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液(Sigma、Ｔ３９２４)を加え、３７℃で２～３分間インキュベートし、摩砕してトリプシン処理し、その後細胞播種した。細胞を、最大１５継代培養に維持した。

実験での使用のため、１２,５００細胞／ウェルを１００μL増殖培地中９６ウェルプレート(Nunc cat.no 167008)に播種した。オリゴヌクレオチドを７５０μM原液から調製した。ＰＢＳに溶解したＡＳＯを、細胞を最終濃度２５μMの一点試験のために播種した約２４時間後に加えた。細胞を、培地を一切交換することなく、４日間インキュベートした。有効性決定のために、８濃度のＡＳＯを１６～５０,０００nMの最終濃度範囲で調整した。ＡＳＯ－００４３１６(CcAAAtcttataataACtAC、配列番号７)およびＡＳＯ－００２８１６(TTCctttacaccACAC、配列番号８)を対照として含めた。

インキュベーション後、細胞を培地を除去し、続いて１２５μL PURELINK^{(登録商標)}Pro 96溶解緩衝液(Invitrogen 12173.001A)および１２５μL ７０％エタノールを加えることにより回収した。ＲＮＡを製造業者の指示に従い精製し、５０μL水の最終体積で溶出し、１０～２０ng／μlのＲＮＡ濃度を得た。ＲＮＡを、一工程ｑＰＣＲ反応前に水で１０倍希釈した。一工程ｑＰＣＲ反応のために、qPCR-mix(QauntaBioのqScript TMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX^{(登録商標)}Low ROX, cat.no 95134-500)を２つのTaqmanプローブと１０：１：１比(qPCR mix：プローブ１：プローブ２)で混合し、マスターミックスを作製した。TaqmanプローブはLifeTechnologiesから得た：ＳＮＣＡ：Hs01103383_m1；PROS1：Hs00165590_m1：ＴＢＰ：4325803；GAPDH4325792。次いで、マスターミックス(６μL)およびＲＮＡ(４μL、１～２ng／μL)をｑＰＣＲプレート(MICROAMP^{(登録商標)}光学３８４ウェル、4309849)で混合した。密封後、プレートを１０００ｇで１分間、ＲＴのクイックスピンに付し、Viia^TM 7システム(Applied Biosystems, Thermo)に移し、次のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分；９５℃で３分；４０サイクルの９５℃で５秒、続いて１.６℃／秒での温度低下、続いて６０℃で４５秒。データをQuantStudio^TM Real_time PCR Softwareで分析した。

実施例６：ヒトＳＮＣＡｍＲＮＡ減少に対するＡＳＯ－００５４５９のインビトロ分析
マウス神経細胞におけるＡＳＯ－００５４５９の有効性
実施例２に記載する方法を使用して、ＳＮＣＡｍＲＮＡ減少の下流結果としてＳＮＣＡタンパク質発現を減少させる能力について、ＡＳＯ－００５４５９を試験した。簡潔には、ＰＡＣ－Ａ５３Ｔマウス由来初代神経細胞をＡＳＯ－００５４５９または対照ＡＳＯで１４日間処理した。細胞を固定し、ＳＮＣＡタンパク質およびチューブリンタンパク質レベルを高含量イメージングで測定した。チューブリンレベルを毒性モニターおよびＳＮＣＡタンパク質減少を正規化のために測定した。

下表１に示すとおり、細胞と４nMのＡＳＯ－００５４５９のインキュベーションは、ＳＮＣＡタンパク質発現を２１％減少させた。４０nMおよび５μMのＡＳＯ－００５４５９で、ＳＮＣＡタンパク質発現はそれぞれ８４％および８６％減少した。対照的に、ＡＳＯ－００５４５９はチューブリンタンパク質発現レベルへの効果が最小限であるか全くなかった。

ＳＤ＝標準偏差
Ｎ＝試験数

有効性をさらに評価するため、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣ神経細胞を実施例２Ａに記載のとおりＡＳＯ－００５４５９の１０点滴定で処理し、ＳＮＣＡおよびチューブリンタンパク質に対する効果のＩＣ_５０を決定した。図２Ａおよび２Ｂおよび表２(下記)に示すとおり、α－Ｓｙｎ／チューブリン比の濃度依存性減少が観察され、平均ＩＣ_５０は７.４nMであった。この観察は、表１(上記)の一点活性データと一致した。さらに、ＡＳＯ－００５４５９のＴｕｂレベルに対する効果は無視できるであった。まとめて、これらの結果はＡＳＯ－００５４５９が全体的細胞生存能への効果は最小で、ＳＮＣＡタンパク質レベルを強力に減少させることを示す。

ＳＤ＝標準偏差
Ｎ＝試験数

ＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)細胞におけるＡＳＯ－００５４５９の効果
実施例５に記載の方法を使用して、ＡＳＯ－００５４５９を、４日間処理後のＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)におけるＳＮＣＡｍＲＮＡを減少する能力について、試験した

細胞と２５μM ＡＳＯ－００５４５９のインキュベーションは、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ(２)細胞でＳＮＣＡｍＲＮＡを９２％減少させた。

ヒト神経細胞におけるＡＳＯ－００５４５９の有効性
ＳＮＣＡに対するＡＳＯ－００５４５９有効性を、実施例３に記載のとおり、一次ヒト神経細胞を使用して確認した。簡潔には、ヒト神経細胞を、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞から導いた。細胞を６日間ＡＳＯ－００５４５９または対照ＡＳＯで処理し、次いで、ｍＲＮＡレベルをQUANTIGENE^{(登録商標)}アッセイで測定した。ヒト神経細胞がＡＳＯ－００５４５９のオフターゲットの可能性があるＰＲＯＳ１も発現するため、ＰＲＯＳ１ｍＲＮＡレベルも、オフターゲット遺伝子に対するＡＳＯ－００５４５９の効果を評価するために測定した。さらに、チューブリン(ＴＵＢＢ)ｍＲＮＡを毒性モニターのために測定した。

図３および表３(下記)に示すとおり、ＡＳＯ－００５４５９は、ヒト神経細胞で発現されるＳＮＣＡの濃度依存性減少を誘発し、平均ＩＣ_５０は１００nMであった。このＩＣ_５０は、ＰＡＣ－Ａ５３Ｔ神経細胞におけるＳＮＣＡタンパク質減少のＩＣ_５０(表２、上記)より約１３倍弱かった。この有効性シフトの理由は明らかではないが、ＡＳＯ取り込み、代謝またはＳＮＣノックダウンの反応速度論の差異による可能性がある。ＡＳＯ－００５４５９はヒト神経細胞でＰＲＯＳ１ｍＲＮＡの濃度依存性減少も示したが、ＩＣ_５０はＳＮＣＡに対するＩＣ_５０より３０～５０倍弱かった。これらの結果は、ヒト神経細胞におけるＳＮＣＡに対するＡＳＯ－００５４５９活性を確認し、ＡＳＯ－００５４５９がＰＲＯＳ１と比較してＳＮＣＡに３０～５０倍選択的であることを示す。

バッチ＝使用したＡＳＯ－００５４５９の特定のロット番号

Ｒａｍｏｓ細胞におけるＡＳＯ－００５４５９の有効性
ＩＫＺＦ３はＡＳＯ－００５４５９について別の潜在的オフターゲットであるが、ＰＲＯＳ１と異なり、ヒト神経細胞で発現されない。その代わり、ＩＫＺＦ３はヒトリンパ球性細胞株であるＲａｍｏｓ細胞で強く発現される。Ｒａｍｏｓ細胞を１μM ＡＳＯ－００５４５９で処理し、ＩＫＺＦ３ｍＲＮＡ発現に対する効果を測定した。毒性モニターのために、ベータ－２ミクログロブリンｍＲＮＡも測定した。Ｒａｍｏｓ細胞がＳＮＣＡを発現しないため、別の遺伝子、ＲＢ１(ＲＢ転写コリプレッサー１)をＡＳＯ介在ノックダウンの陽性対照として使用した。ＡＳＯ－００６７５４(GGTgaggtttggtaGA、配列番号９)およびＡＳＯ－００６７５５(GGTgaggtttggtagaAG、配列番号１０)はＲＢ１を標的とし、本試験に含めた。表４(下記)に示すとおり、１μM濃度で、ＡＳＯ－００５４５９はＩＫＺＦ３ｍＲＮＡ発現に影響を与えず、ＡＳＯ－００５４５９のＳＮＣＡへの特異性が示された。ＡＳＯ－００５４５９はまたＲＢ１およびβ２ＭｍＲＮＡ発現にも影響を与えず、ＡＳＯ－００５４５９はＲａｍｏｓ細胞に毒性でないことが示される。対照的に、ＡＳＯ－００６７５４およびＡＳＯ－００６７５５(対照ＡＳＯ)は、ＲＢ１レベルをそれぞれ８７％および８３％減少させ、Ｒａｍｏｓ細胞におけるＡＳＯ活性を確認した。

バッチ＝使用したＡＳＯの特定のロット番号

まとめて、ここに示す結果はＡＳＯ－００５４５９がＳＮＣＡｍＲＮＡ減少に協力且つ高度に選択的であり、これはその後ＳＮＣＡタンパク質レベルの減少に介在することを示す。結果はまたＡＳＯ－００５４５９がマウスおよびヒト神経細胞両者で十分に忍容性であることを示す。これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのＡＳＯ－００５４５９の開発継続を支持する。

実施例７：インビボ忍容性およびインビボＳＮＣＡｍＲＮＡ減少
本発明のＡＳＯのインビボ忍容性を試験して、種々の動物モデル(すなわち、マウスおよびカニクイザル)に注射したとき、どのようにＡＳＯが許容されたかを確認した。

マウス
対象Ａ５３Ｔ変異を有するヒトＳＮＣＡ遺伝子全体をマウスＳＮＣＡノックアウトバックグラウンドで担持する雄および雌(２～３か月齢)ＰＡＣ－Ｔｇ(ＳＮＣＡ^Ａ５３Ｔ)^＋／＋；ＳＮＣＡ^－／－(「ＰＡＣ－Ａ５３Ｔ」)マウスを、急性、長期およびＰＫ／ＰＤインビボ効果試験に使用した。一部例では、野生型(ＷＴ)Ｃ５７Ｂ／６マウスを使用して、長期(すなわち、４週間)健康評価をした。マウスを、４匹または５匹のグループで、温度制御飼育室で、餌および水は自由に摂取させて飼育した。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。

ＡＳＯ投与溶液調製：０.２μm Whatmanフィルターおよび無ヌクレアーゼ遠心管を装着した無菌食塩水(１mL)シリンジを使用して、投与溶液を調製した。記載する量の水または食塩水をＡＳＯ粉末に加え、ボルテックス処理(約１分間)して、ＡＳＯ粉末を溶解させた。次いで、溶液を１０分間静置し、再び約１分間ボルテックス処理した。チューブを短く遠心して全ての液体をチューブの底に戻し、次いで、溶液を０.２μm 無菌フィルターをとおして、第二の無ＲＮａｓｅチューブに入れた。一次原液の少量をNanodropを使用する濃度分析のために１mg／mlに希釈した。分析サンプルを、手で倒置させながら３回ボルテックス処理して、徹底的に混合した。次いで、サンプルのＵＶ吸光度を、Nanodropで２６０nmで２回測定した(サンプルを入れる前に台を３回濯ぎ、拭いた)。試験サンプルは、分析が完了したら廃棄した。サンプルは、ＵＶ吸光度がサンプルの９０～１１０％であるならば、投与の準備ができたとみなした。ＵＶ吸光度がサンプルの１１０％を超えているならば、二次希釈を調製した；吸光度が＜９０％であるならば、高い初期濃度で、上記と同様の工程に従い調製した。サンプルを使用するまで４℃で保存した。

フリーハンド脳室内(ＩＣＶ)注射：HaleyおよびMcCormickの方法に従い、ＩＣＶ注射を２７または３０ゲージ針を備えたハミルトンマイクロシリンジを使用して実施した。針は、その脳内への浸透を制限するために、先端から２.５～３mmにポリエチレンガードを備えた。マウスをイソフルラン麻酔(１～４％)を使用して麻酔した。十分に麻酔されたら、一方の手の親指と人差し指で、首背部のたるんだ皮膚の部位でマウスを持った。次いで、優しく、しかし確かに圧をかけながら、動物の頭部を堅い平らな表面に押し付けて固定した。２７ 2/1ｇ針を備えた１０μL ハミルトンシリンジを使用して投与を行った。次いで針先端を頭皮および頭蓋骨をとおして前項の約１mm側面および１mm後端に挿入した(すなわち、中線の右、眼線から測定して約３mm後ろ)。針が設置できたら、ＡＳＯを食塩水媒体中５μlの体積で与え、約３０秒間かけて注入した。針を、出す前５～１０秒間その場に置いた。マウスを飼育ケージに戻し、約２～４分間回復させた。マウスを薬物および／または投与の有害行動変化について、投与直後３０分間連続して観察した。この間、離れて３回を超えて痙攣したマウスは全て直ぐに屠殺し、２０の自動スコアを付した。薬物忍容性を投与後１時間±１５分間採点した。非忍容性を投与された動物(忍容性スコア＞４)は、１時間評価後直ぐに屠殺した。

ＡＳＯ忍容性評価：ＡＳＯ投与動物を、投与直後評価し、あらゆる有害作用について２時間モニターした。急性忍容性(ＡＴ)試験について、マウスを投与時およびテイクダウン時、すなわちＡＳＯ注射３日後に再び評価した。長期健康評価について、マウスを、実験完了まで毎週秤量し、あらゆる健康および行動問題についてモニターした。最初の体重から１５％を超えて体重が減少したまたは忍容性問題を示したマウスを試験から除き、屠殺した。健康および忍容性評価を、次のチャートに従い実施した。

^ａ正常を「０」と採点する。動物を、投与後連続した時点で、個々に採点する。観察は、１時間±１５分、次いで２４時間±２時間、その後７日目(適切であれば)に採点する。痙攣は、前の観察ウインドで生じても１時間時点としてカウントする。総忍容性スコアを、個々のカテゴリースコアの合計に基づき計算し、可能な最高スコアは２０である。

組織回収：最終行動および健康評価後、マウスを断頭台で断頭し、脳を直ぐに摘出した。各脳を２つの半球に分け、ａ)海馬を３日急性忍容性試験におけるｍＲＮＡ測定のために切断した；ｂ)半球の一方からの海馬、脳幹および線条体をｍＲＮＡ測定のために切断し、同時に他方の半球の同じ領域を用量応答時間経過ＰＫ／ＰＤ試験におけるタンパク質／ＰＫ測定のために切断した。

試験のいくつかで、血液および脳脊髄液(ＣＳＦ)も、ＰＫ(血液)およびＰＫ／タンパク質(ＣＳＦ)測定のために採取した。血液およびＣＳＦを採取するために、マウスをイソフルラン(４％)で麻酔した。血液を２３Ｇ針を使用する心臓穿刺により採取した。採ったら、血液を２ml BD Microtainer(K2EDTA BD #365974)チューブに移し、処理するまで氷上に置いた。血液を処理するために、チューブを４５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで、血漿を取り、０.５mlエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで－８０℃で保存した。ＣＳＦを採取するために、胸腔を開けて心臓を露出させ、できるだけ多くの血液を、ＣＳＦの汚染を避けるために吸引した。ＣＳＦサンプルをマイクロピペットを使用して大槽から採取し、lo-bindタンパク質エッペンドルフチューブに入れた。次いで、チューブを４５００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。ＣＳＦを注意深く清潔なlo-bind ０.５mlエッペンドルフチューブに入れ、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

カニクイザルデータ
対象：試験開始時３.５～１０.０kgの雄カニクイザルを使用した。それぞれＬ３またはＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(ＣＳＦ)カテーテルをインプラントした。ポリレタンカテーテルの遠位先端はほぼＬ１椎骨まで髄腔内空間内を伸びた。近位末端を動物の背下部に位置する皮下アクセスポートに接続した。動物を試験開始前少なくとも２週間治癒させた。実験動物ケアは、Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory AnimalsおよびGuide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011)(National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health)に従った。プロトコールはBristol-Myers Squibb CompanyのWallingford Animal Care and Use Committeeに承認された。

ＣＳＦおよび血液サンプリング：ＣＳＦポートを、無菌法を使用して皮下でアクセスし、ＣＳＦを霊長類拘束椅子に正立で座っている起きた動物からサンプリングした。約０.１mlのＣＳＦをカテーテルのデッドスペースおよびポートを浄化するために採取開始時に廃棄した。ＣＳＦを、最大０.５ml ＣＳＦ／サンプルで自然流下により集めた。ＣＳＦを２,０００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。上清をドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで－９０℃に維持した。

血液を利用可能な静脈、一般に伏在静脈からサンプリングした。血液サンプルを問題の特定の測定により、多数の方法で調製した。血漿について、血液をＥＤＴＡ処理チューブに集めた。血清について、血液を血清セパレーターチューブに集め、少なくとも３０分間凝血させ、その後遠心分離した。凝固および凝固因子測定のため、血液をクエン酸処理チューブに集め、ＲＮＡ分析のため、血液をRNAlater含有チューブに集めた。処理後、サンプルをドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで凍結させたままにした。

髄腔内投与：動物を、覚醒時、市販の拘束椅子を改変して使用して投与できるように訓練し、動物を伏臥位に維持した。ＳＮＣＡ標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)を食塩水に溶解し、濾過滅菌し、０.３３ml／分で１.０ml体積で投与し、続いて０.５ml 無菌水をフラッシュした。総注入時間は４.５分であった。動物は注入後３０分間、伏臥位に維持した。

剖検：カニクイザルに、適切な体積の市販屠殺溶液を、ケタミンおよび／またはイソフルランで麻酔しながら投与した。剖検組織をその直後に得て、脳を切開のために湿った氷に載せた。目的領域を４～６mmスライスを使用して、ASI Cyno Brain Matrixならびにフリーハンド技術を使用して切断した。サンプルを、RNAlater^{(登録商標)}に生のまま入れるかまたは後の分析のためドライアイスで凍結させた。ＣＮＳ組織をカニクイザルから迅速に切断し、いずれの軸も４mmを超えない長さの切片を集め、５mLのRNAlaterに入れた。サンプルを４℃で一夜保存し、次いで分析するまで保存するため－２０℃に移した。

分析した脳領域は、髄質、橋、中脳、小脳、尾状核被殻(左右)、海馬(左右)、前頭前皮質(左右)、側頭皮質(左右)、頭頂皮質(左右)、後頭皮質(左右)および皮質下白質を含んだ。さらに、脊髄を頸部、胸部および腰部領域からサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓および心臓からも採取した。数例で、三叉神経核、脛骨神経および大動脈のサンプルを集め、これら領域でのオフターゲット薬理学を試験した。

マウスまたはサル組織、血漿およびＣＳＦにおけるＡＳＯ濃度のＥＬＩＳＡ定量：
組織を１：１比の血漿および水で均質化した。血漿(血漿およびＣＳＦ用)および血漿：水(組織サンプル用)で５０００～４.９nMの２倍連続希釈により標準曲線を作成し、次いで５×ＳＳＣＴ(７５０mM ＮａＣｌおよび７５mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、０.０５％(ｖ／ｖ) Tween-20含有)単独および３５nM捕捉および３５nM検出試薬含有５×ＳＳＣＴでさらに計５０００倍まで希釈して、１～１０００pMの標準範囲を得た。使用した希釈計数は予測されるサンプル濃度範囲により変わる。捕捉プローブはAAAGGAAと３'ビオチン(Exiqon)および検出プローブは５' ＤｉｇＮ－イソプロピル１８リンカー－－ＧＴＧＴＧＧＴ(Exiqon)であった。

実験サンプルおよび標準を、１：１比でClarity溶解緩衝液(Phenomenex, cat#AL0-8579)に加え、その後捕捉および検出緩衝液で希釈し、次いでＥＬＩＳＡプレートに移した。ＣＳＦサンプルを血漿(２倍)で希釈し、その後溶解緩衝液を加えた。ストレプトアビジン被覆プレート(Thermo 15119)を５×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。１００μlサンプルを加え、６０分間、室温でインキュベートした。０.０５％Tween-20含有ＰＢＳで１：４０００希釈した検出プローブ、１００μl抗Ｄｉｇ－ＡＰＦａｂフラグメント(Roche Applied Science, Cat. No. 11 093 274 910)を加え、６０分間、室温でインキュベートした。プレートを２×ＳＳＣＴ緩衝液で洗浄後、１００μl Tropix CDP-star Sapphire II基質(Applied Biosystems)を３０分間、室温で加えた。ＡＳＯ濃度を発光により測定した(Enspire-PerkinElmer)。

アルファ－シヌクレインタンパク質測定：
脳組織サンプルを、ベッドホモジナイザーQiagen Tissuelyser IIを２５サイクル／秒で、５mmステンレス鋼ベッドで計２分使用して、ＲＩＰＡ緩衝液(５０mM ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム)中、１０ml／ｇ組織で均質化した。均質化サンプルを、氷上で３０分間インキュベートした。各サンプルの５０μLアリコートをＰＫ分析用に残した。残ったサンプルを２０,８００ｇで６０分間、４℃で遠心分離した。上清を保持し、分析に使用した。総タンパク質をPierce BCAタンパク質アッセイキット(23227)を使用して測定した。

脳組織抽出物：ＳＮＣＡタンパク質を、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２ＥＬＩＳＡを使用して測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を１００μlの抗ＳＮＣＡ抗体ＭＪＦＲ１(Abcam)で、ＢｕｐＨ炭酸－炭酸水素緩衝液、ｐＨ９.４(Thermo Scientific)に希釈した０.１μg／ml濃度で、一夜(Ｏ／Ｎ)、４℃で被覆した。翌日、プレートをDulbecco's PBS (Life Technologies)で４回洗浄し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、無プロテアーゼ、Fraction V, Roche Diagnostic)で２～３時間、室温(ＲＴ)または一夜、４℃で遮断した。標準および脳サンプル両者をRocheプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001、１ペレット／２５ml)およびホスファターゼ阻害剤２＆３(Sigma、１：１００)含有１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈した。ＳＮＣＡ野生型(rPeptide)を標準として使用した。サンプルをデュプリケート(５０μl／ウェル)で載せ、Ｏ／Ｎで４℃でインキュベートした。プレートをＲＴに平衡化した後、５０μlの検出抗体４Ｂ１２(Biolegend)(１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで１：４０００希釈)を各ウェルに加え、サンプルとＲＴで約２時間共インキュベートした。検出抗体は、アルカリホスファターゼ(Novus BiologicalsからのＡＰキット)とプレコンジュゲートさせた。次いでプレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄し、１００μlのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies)で３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートを、アッセイ中一定に振盪させた(Titer plate shaker, speed 3)。データを、GraphPad Prismで分析した。脳組織の総タンパク質を、製造業者の指示に従い、Micro protein assay kit(Thermofisher #23235)を使用して測定した。

脳脊髄液(ＣＳＦ)：ＳＮＣＡタンパク質を、製造業者の指示に従いU-PLEX Human SNCA Kit(cat# K151WKK-2, Meso Scale Discovery)で測定した。ＣＳＦサンプルを１０倍希釈した。Abcam mouse Hemoglobin ELISA kit(ab157715)を使用して、ＣＳＦサンプルでヘモグロビンを測定した。ＣＳＦサンプルをヘモグロビン測定のため４０倍希釈した。

ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ測定
脳領域を回収し、RNA-later、ＲＮＡ安定化溶液を予め充填したRNA-later Tissue Protect tubes(Qiagen cat#76514)に入れた。RNA-later溶液中の組織は、４℃で１か月または－２０℃もしくは－８０℃で無期限に保存できた。

ＲＮＡ単離：RNeasy Plus Mini Kit：マウス海馬および皮質からのＲＮＡをRNeasy Plus Mini Kit(Qiagen cat#74134)を使用して単離した。組織サンプルを１０μl／mlの２－メルカプトエタノールおよび０.５％Reagent Dx含有６００μLまたは１２００μL RLT Plus緩衝液体積で均質化した。６００μL溶解緩衝液を組織サンプルが＜２０mgであるならば使用し、１２００μl溶解緩衝液を組織サンプル＞２０mgで使用した。各均質化で、組織サンプルを６００μL RLT Plus緩衝液(と１０μl／mlの２－メルカプトエタノールおよび０.５％Reagent Dx)および５mmステンレス鋼ビーズ(Ｑiagen cat#69989)を含む２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移した。サンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。サンプルを２.０分間、２０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、２０Hzで処理した。次いでサンプルを２.０分間、３０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、３０Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび／または高頻度均質化を使用した。次いで６００μLの組織ライセートを２.０mL回収チューブのgDNA Eliminator spinカラムに移し、３０秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。全遠心分離工程をＲＴで実施した。フロースルーを集め、等体積の７０％エタノールを加え、混合した。６００μLを２.０mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに集め、サンプルを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った６００μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを７００μLの洗浄緩衝液ＲＷ１で洗浄し、１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムをキットプロトコールに記載のとおり、４体積のエタノールを含む５００μLの緩衝液ＲＰＥで２回洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために２.０分間、１０,０００ｇで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために１.０分間、１０,０００ｇで１回遠心分離した。次いで、カラムを新しい１.５mL回収チューブに移し、３０μLの無ＲＮａｓｅ水を膜中心に直接加えた。膜を１０分間、ＲＴでインキュベートした。次いで、カラムを１.０分間、１０,０００ｇで遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ含有溶出液を回収し、ＲＮＡ濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するＵＶ吸光度により決定されるまで氷上に置いた。ＲＮＡサンプルを－８０℃で保存した。

ＲＮＡ単離：RNEASY^{(登録商標)}Plus Universal Mini Kiｔ：全ての他のカニクイザル、マウスおよびラット組織サンプルからのＲＮＡを、RNEASY^{(登録商標)}Plus Universal Mini Kit(Qiagen cat#73404)を使用して単離した。均質化のために、５０μg以下の組織サンプルを、９００μL QIAZOL^{(登録商標)}溶解試薬および５mmステンレス鋼ビーズ(Qiagen cat#69989)を含む２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移したサンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。を２.０分間、２０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、２０Hzで処理した。次いでサンプルを２.０分間、３０Hzで処理し、サンプルを１８０°回転させ、さらに２.０分間、３０Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび／または高頻度均質化を使用した。均質化組織ライセートを新しい２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに入れ、ＲＴで５.０分間静置した。１００μLのgDNA Eliminator溶液を各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく撹拌した。１８０μLのクロロホルム(Sigma cat#496189)を各チューブに加え、チューブを３０秒間激しく撹拌した。チューブをＲＴで３分間静置した。チューブを１２,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上部水相を新しい２.０mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに約５００μL加えた。等体積の７０％エタノーを加え、混合した。以降の全遠心分離工程をＲＴで実施した。５００μLを２.０mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに移し、サンプルを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った５００μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄し、カラムを２体積のエタノールを含む７００μLの洗浄緩衝液ＲＷＴで洗浄した。カラムを１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムを、キットプロトコールに記載のとおり、４体積のエタノールを含む５００μLの緩衝液ＲＰＥで洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために１５秒間、１０,０００ｇで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために２.０分間、１０,０００ｇで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために１.０分間、１０,０００ｇで１回遠心分離した。次いで、カラムを新しい１.５mL回収チューブに移し、３０μLの無ＲＮａｓｅ水を膜中心に直接加えた。膜を１０分間、ＲＴでインキュベートした。カラムを１.０分間、１０,０００ｇで遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。ＲＮＡ含有溶出液を回収し、ＲＮＡ濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するＵＶ吸光度により決定されるまで氷上に置いた。ＲＮＡサンプルを－８０℃で保存した。

逆転写によるｃＤＮＡ合成：３００ngのＲＮＡを、ＰＣＲ－９６－ＡＢ－Ｃマイクロプレート(Axygen cat#321-65-051)中、無ヌクレアーゼ水(Invitrogen cat#10977-015)を使用して１０.８μLの最終体積に希釈した。６.０μLを、次の物を含む反応混合物１の各ウェルに加えた：２.０μLの５０μMランダムデカマー(Ambion cat#AM5722G)および４.０μLの１×ｄＮＴＰミックス(Invitrogen cat#10297-018)。プレートを光学シーリングテープ(Applied Biosystems cat# 4360954)で密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。次に、プレートを、９６ウェルThermal Cycler GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)を使用して、３.０分間、７０℃に加熱した。次いで、プレートを氷で完全に冷やした。次に、３.２５μLの反応混合物２(２μLの１０×標準緩衝液、１.０μLのＭＭＬＶ－ＲＴ２００Ｕ／μL 逆転写酵素酵素(Ambion cat#2044)および０.２５μLのＲＮａｓｅ阻害剤４０Ｕ／μL(Ambion cat#AM2682)含有)を各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。９６ウェルThermal Cyclerを使用して、プレートを９５℃で１０分間の後４２℃で６０分間加熱した。次いで、プレートを氷で冷却した。ｃＤＮＡプレートを、ＰＣＲ分析の準備ができるまで－２０℃に保存した。

ＳＮＣＡおよびＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現増幅および定量のためのｑＰＣＲ：ｃＤＮＡを、ＰＣＲ－９６－ＡＢ－Ｃマイクロプレートで無ヌクレアーゼ水で５倍希釈した。１０μLの２×Taqman Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems cat#4369016)、１.０μLの２０×Taqmanプライマー－プローブセット(Applied Biosystems)および５.０μLの無ヌクレアーゼ水からなる１６μLのMaster Mix溶液を、３８４ウェル光学ＰＣＲプレート(Applied Biosystems cat#4483315)の各ウェルに加えた。４.０μLの希釈ｃＤＮＡを３８４ウェル光学ＰＣＲプレートの各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、１.０分間、１,０００×ｇでＲＴで遠心分離した。ＰＣＲを、次のパラメーターを標準モードで使用するApplied Biosystems 700 HT Fast Real-Time PCRシステムで実施した：５０℃で２.０分間、９５℃で１０分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間および６０℃で１.０分間。

ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー－プローブセット：Applied Biosystems(Thermo Fisher)のプライマー－プローブセットは次のものを含んだ：
１) ヒトアルファシヌクレイン(cat#Hs01103383_m1)ＦＡＭ標識
２) ヒトＰＲＯＳ１(cat#HS00165590_m1)ＦＡＭ標識
３) カニクイザルアルファシヌクレイン(cat#Mf02793033_m1)ＦＡＭ標識
４) カニクイザルＧＡＰＤＨ(cat#Mf04392546_g1)ＦＡＭ標識
５) カニクイザルＧＡＰＤＨ(cat#Mf04392546_g1)ＶＩＣ標識プライマー限定
６) ラットアルファシヌクレイン(cat#Rn01425141_m1)ＦＡＭ標識
７) ラットＧＡＰＤＨ(cat#Rn01775763-g1)ＦＡＭ標識
８) ラットＧＡＰＤＨ(cat#4352338E)ＶＩＣ標識プライマー限定
９) マウスＧＡＰＤＨ(cat#Mm99999915-g1)ＦＡＭ標識
１０) マウスＧＡＰＤＨ(cat#4352339E)ＶＩＣ標識プライマー限定。

実施例８：マウスにおけるＡＳＯ－００５４５９のインビボ活性および忍容性分析
ＡＳＯ－００５４５９は、ヒトＳＮＣＡ特異的ＬＮＡ修飾ＡＳＯである。インビトロ結果(上記)は、ＡＳＯ－００５４５９が初代神経細胞のＳＮＣＡｍＲＮＡ減少に強力かつおよび選択的であることを示す。インビトロ結果は、ＡＳＯ－００５４５９が良好な忍容性であることも示唆する。

Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウス
これらの結果がインビボでも当てはまるかを評価するために、１００μgのＡＳＯ－００５４５９をＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスにＩＣＶ注射で投与し、忍容性および海馬におけるＳＮＣＡｍＲＮＡノックダウン(ＫＤ)両者を、実施例４(上記)のとおり注射３日後に評価した。

表６および７(下記)に示すとおり、ＡＳＯ－００５４５９は忍容性が良好であり、全体的平均忍容性スコア１であった。さらに、ＡＳＯ－００５４５９は、投与３日後、海馬のＳＮＣＡｍＲＮＡレベルを＞９０％に有意に低下させた(図４)。

インビボでの活性評価のために、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスに、ＡＳＯ－００５４５９を３.１３μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μg濃度でＩＣＶ注射で投与した。忍容性を、投与後７日目および１４日目の体重測定により評価した。ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現を、投与１４日後評価し、そのとき動物を屠殺し、組織を採取した。ＳＮＣＡｍＲＮＡノックダウンを海馬、脳幹および線条体の３脳領域で測定した。脳幹および線条体は、ＭＳＡおよびＰＤ患者脳で最も影響を受けている領域の二つである。別の試験で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００μgのＡＳＯ－００５４５９を投与し、忍容性を投与後７日目、１４日目、２１日目および２８日目の体重測定により評価した。１００μg ＡＳＯ－００５４５９を、ＩＣＶで野生型(ＷＴ)Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、体重および行動を４週間にわたりモニターした。ＡＳＯ－００５４５９がマウスＳＮＣＡを標的としないため、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現減少は、これら動物で測定しなかった。

図５Ａおよび５Ｂに示すとおり、ＡＳＯ－００５４５９(全濃度)処置マウス(Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス両者)および対照媒体処置マウスで、体重に有意差はなかった。動物(Ｃ５７ＢＬ／６)は実験の経過中、何ら異常行動は示さなかった。表８参照(下記)。このような結果は、ＡＳＯ－００５４５９が良好な忍容性であることを示した。また、ＡＳＯ－００５４５９処置マウスで、試験した全３脳領域でＳＮＣＡｍＲＮＡ発現の有意かつ依存性依存的減少があった。図６Ａ～６Ｃ参照。海馬で、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現は、３.１３μg、１２.５μg、２５μgおよび５０μg ＡＳＯ－００５４５９でそれぞれ５３％、７３％、８０％および９６％減少した。類似の用量依存的ノックダウンが脳幹でも観察された。線条体で、ＳＮＣＡｍＲＮＡノックダウンは、他の領域と比較して、より可変性であり、あまり強くなかった(図６Ａ～６Ｃ)：それぞれ７５％および４６％ノックダウンが５０μgおよび２５μgのＡＳＯ－００５４５９で観察された。しかしながら、１２.５μgおよび３.１３μgのＡＳＯ－００５４５９で、ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現の有意な減少はなかった。線条体での低活性について可能性のある説明は、ＳＮＣＡｍＲＮＡノックダウンのＡＳＯレベルまたは反応速度論の差異であろう。

ＡＳＯ－００５４５９レベルを、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスの全３つの脳領域で測定した。図７および表９(下記)に示すとおり、脳暴露はほぼ用量比例的であり、線条体を含む全３領域で類似した。種々の脳領域のＡＳＯ－００５４５９暴露－応答相関を図８Ａ～８Ｄに示す。類似の暴露－応答相関が海馬および脳幹で観察され、それぞれ推定ＩＣ_５０は１７９および２０６nMであった。比較として、線条体の暴露応答は比較的急であり、その領域でのＳＮＣＡｍＲＮＡ減少の遅い反応速度論を示唆する。図８Ｃ参照。

より広範な用量－応答／時間経過曲線を提供するために、ＡＳＯ－００５４５９を、再びＩＣＶフリーハンド注射によりＡ５３Ｔ－ＰＡＣマウスに脳室に直接投与した(０μg、１２.５μg、２５μgまたは５０μg)。動物を投与２４時間、３日、４週、８週、１２週、１６週および２０週後に屠殺し、脳幹および線条体のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現を評価した。

図９Ａおよび９Ｂに示すとおり(および上記データに一致して)、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスへのＡＳＯ－００５４５９は、脳幹および線条体両者でＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルの有意な減少(対媒体対照)をもたらした。減少は時間および用量両者に依存的であるように見え、ピーク減少(約９０％)が脳幹で５０μg ＡＳＯ－００５４５９で投与約４週間後に観察された(図９Ａ)。線条体で、ピーク減少(約５５％)は、５０μg ＡＳＯ－００５４５９で投与約３日後に観察された(図９Ｂ)。ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルは、媒体対照と比較して投与４週間でも有意に低いままであり(図１０Ａおよび１０Ｂ)、ベースライン対照に投与約１６週間後までに戻った(図９Ａおよび９Ｂ)。

図１１Ａおよび１１Ｂに示すとおり、動物へのＡＳＯ－００５４５９投与も、脳幹および線条体脳組織両者でＳＮＣＡタンパク質レベルの時間および用量依存的減少をもたらした。ピーク減少(約７５％)は、脳幹で５０μg用量で投与８週間後得られた(図１１Ａ)。線条体脳組織について、ピーク減少(約７５％)は、同様に５０μg用量であるが、投与４週間後得られた(図１１Ｂ)。個々のマウスの投与８週間後の発現レベルを図１２Ａ(脳幹)および１２Ｂ(線条体)に示す。ＳＮＣＡタンパク質レベルは投与約１２週間後に線条体でほぼベースラインに戻ったが、脳幹で、発現レベルは投与１６週間後でさえ、有意に減少していた(約２５％)。

実施例９：カニクイザルのＳＮＣＡ標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)のインビボ活性および忍容性の分析
ＡＳＯ活性および忍容性をインビボでさらに評価するため、髄腔内ポートのあるカニクイザルモデル(カニクイザルＩＴ)を開発した。このモデルは、ＳＮＣＡのＡＳＯ－００５４５９介在ノックダウンならびに潜在的１塩基対ミスマッチオフターゲットＰＲＯＳ１およびＩＫＺＦ３のノックダウンの評価を可能とする。ＳＮＣＡ、ＰＲＯＳ１およびＩＫＺＦ３のＡＳＯ－００５４５９標的部位は、ヒトとカニクイザルで完全に保存される。

実施例６に上記のとおり、各動物にＬ３またはＬ４椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(ＣＳＦ)カテーテルをインプラントした。ＡＳＯ－００５４５９を食塩水に溶解し、動物(８mg／動物)に投与し、ＩＴポートを使用して４.５分間にわたり注入した(２動物／投与群)。次いで、動物を投与２４時間および３日後に屠殺し、その時組織をＡＳＯ暴露および活性の分析のために採取した。分析した脳領域は髄質(Ｍｅｄ)、橋(Ｖ－橋)、中脳(Ｖ－ＭＢ)、小脳(ＣＢＬ)、尾状核被殻(左右)(ＣａｕＰ)、海馬(左右)(Ｈｉｐ)、前頭前皮質(左右)(ＦｒＣ)、側頭皮質(左右)(ＴｅＣ)、頭頂皮質(左右)(ＰａＣ)、後頭皮質(左右)(Ｏｃｃ)および皮質下白質(ＷＭ)を含んだ。さらに、脊髄を頸部(ＣＳＣ)、胸部(ＴＳＣ)および腰部(ＬＳＣ)領域でサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓、心臓、三叉神経核、脛骨神経および大動脈からも採取し、これらの領域でのオフターゲット薬理作用を試験した。

マウスで見られたのと同様、ＡＳＯ－００５４５９はカニクイザルで有害作用は観察されず、良好な忍容性であった(データは示していない)。そして下表１０に示すとおり、ＡＳＯ－００５４５９投与は、カニクイザル脳の種々の領域でＳＮＣＡｍＲＮＡの強固なノックダウンを示した。

上記ＳＮＣＡｍＲＮＡ減少をさらに特徴づけるため、カニクイザルにＡＳＯ－００５４５９(計８mg／動物)を投与し、投与２４時間、３日、２週、４週、８週、１３週または２０週後に屠殺して、種々の組織のＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルを評価した。図１３Ａに示すとおり、投与後２週間～１３週間でピーク減少が観察された。髄質、小脳、橋、尾状核被殻、前頭前皮質および腰部脊髄でそれぞれ７０％、６５％、７５％、３５％、９４％および９９％のピーク減少が観察された。ＳＮＣＡｍＲＮＡ発現レベルのこの現象はまたＳＮＣＡタンパク質発現レベルの時間依存的減少とも相関する(図１３Ｂ)。

次に、カニクイザルでの発現レベル減少が用量にも依存するかを評価するため、動物に２mg、４mgまたは８mgのＡＳＯ－００５４５９を投与し、次いで、投与２週間後屠殺した。図１４Ａおよび１４Ｂに示すとおり、ＳＮＣＡｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質発現レベル両者の減少は用量依存的でもあり、８mgのＡＳＯ－００５４５９で最大減少が観察された。

ここに提供する結果は、ＡＳＯ－００５４５９がＳＮＣＡｍＲＮＡ減少に強力かつ選択的であり、ＡＳＯ－００５４５９が神経細胞およびインビボ前臨床種で忍容性が良好であることを示す。さらに、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣ神経細胞からの結果は、ｍＲＮＡのＡＳＯ－００５４５９介在減少が、インビトロおよびインビボでＳＮＣＡタンパク質レベル減少をもたらすことを示す。さらに、Ａ５３Ｔ－ＰＡＣマウスおよびカニクイザルでの結果は、ＡＳＯ－００５４５９が、忍容性が良好な用量で脳でＳＮＣＡｍＲＮＡおよびＳＮＣＡタンパク質を減少させることを示す。まとめると、これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのＡＳＯ－００５４５９の開発継続を支持する。

このＰＣＴ出願は２０１８年１月１２日出願の、米国仮出願６２／６１６,９３７に基づく優先権を主張し、それは引用により本明細書に全体として包含させる。

Claims

AtTcctttacaccACACの連続的ヌクレオチド配列からなる、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）転写物を特異的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)であって、ここで、大文字はベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡであり、小文字はＤＮＡである、ＡＳＯ。
ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のＡＳＯ。
ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２に記載のＡＳＯ。
連続的ヌクレオチド配列がOxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMCであり、ここで、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴおよびＯｘｙＭＣがそれぞれアデニンベータＤ－オキシ－ＬＮＡ、チミンベータＤ－オキシ－ＬＮＡおよびメチルシトシンベータＤ－オキシ－ＬＮＡであり、ＤＮＡｔ、ＤＮＡｃおよびＤＮＡａがそれぞれチミンＤＮＡ、シトシンＤＮＡおよびアデニンＤＮＡであり、ｓが２ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合である、請求項１に記載のＡＳＯ。
Ｃ_１７１Ｈ_２１４Ｎ_５６Ｏ_９０Ｐ_１６Ｓ_１６の分子式および図１Ｂに示す構造を含み、ここで、Ｍ^＋がカウンターイオンである、請求項１～４の何れかに記載のＡＳＯ。
カウンターイオンがＨ^＋、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載のＡＳＯ。
カウンターイオンがＮａ^＋である、請求項６に記載のＡＳＯ。
請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯを含むコンジュゲートであって、ここで、ＡＳＯは少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、コンジュゲート。
非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたは任意のこれらの組み合わせを含む、請求項８に記載のコンジュゲート。
請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯまたは請求項８または９に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
さらに治療剤を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
治療剤がアルファ－シヌクレインアンタゴニストである、請求項１１に記載の医薬組成物。
請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯ、請求項８または９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０～１２の何れかに記載の医薬組成物および使用指示を含む、キット。
請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯ、請求項８または９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０～１２の何れかに記載の医薬組成物および使用指示を含む、診断キット。
細胞におけるＳＮＣＡｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質発現を阻止または減少するための、請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯ、請求項８または９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０～１２の何れかに記載の医薬組成物。
請求項１５に記載のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物であって、細胞がＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物と接触したときに、細胞におけるＳＮＣＡｍＲＮＡおよび／またはＳＮＣＡタンパク質の発現が阻止または減少されるものである、ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
ＳＮＣＡｍＲＮＡの発現が、細胞の接触後、ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物に接触していない対応する細胞と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％減少される、請求項１６に記載のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
ＳＮＣＡタンパク質の発現が、細胞の接触後、ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物に接触していない対応する細胞と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％減少される、請求項１６または１７に記載のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
細胞が神経細胞である、請求項１５～１８の何れかに記載のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
治療に使用するための、請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯ、請求項８または９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０～１２の何れかに記載の医薬組成物。
処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の治療に使用するための、請求項１～７の何れかに記載のＡＳＯ、請求項８または９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０～１２の何れかに記載の医薬組成物。
シヌクレイン病がパーキンソン病、パーキンソン病認知症(ＰＤＤ)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のためのＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
対象がヒトである、請求項２１または２２に記載の使用のためのＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。
ＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物が、経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与に適したものである、請求項１５～２３の何れかに記載のＡＳＯ、コンジュゲートまたは医薬組成物。