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JP6650432B2 - 腎臓関連抗原１に対する抗体およびその抗原結合性フラグメント - Google Patents

腎臓関連抗原１に対する抗体およびその抗原結合性フラグメント Download PDF

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Description

本発明は、腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）に特異的に結合する特異的抗体または抗原結合性フラグメント、ならびにこれらを癌の治療、検出および診断の目的に使用することに関する。これらの抗体または抗原結合性フラグメントに関しては特に、細胞への治療剤の送達が考慮される。
婦人科悪性疾患のなかでも卵巣癌は、米国では女性における腫瘍関連の死亡率の首位を占めており（Ｊｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）、米国では女性における癌関連死の４番目の原因となっている（Ｍｅｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。アメリカがん協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、２００５年に新たに合計２２，２２０例を推定し、１６，２１０人をこの疾患に起因するものと見なした（Ｂｏｎｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。過去３０年間にわたって、統計値はほとんど変化がないままであり、卵巣癌を発症した女性の大多数はこの疾患で死亡している（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ，２００６）。この疾患は１：７０の生涯リスクを伴い、その死亡率は６０％を超える（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ，２００６）。その死亡率が高いことは、悪性腫瘍が既に卵巣を越えて蔓延している場合に、卵巣癌の早期発見が困難なことに起因する。実際、８０％を超える患者は、疾患が進行期（第ＩＩＩ期または第ＩＶ期）にあると診断されている（Ｂｏｎｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これらの患者は予後が不良であり、これは、当初は８０％〜９０％が化学療法に反応するにもかかわらず５年生存率が４５％未満であることに反映されている（Ｂｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。このように、数年前に５年生存率が２０％であったのと比較して成功率が上昇したことは、少なくとも一部には、腫瘍組織が卵巣だけに限定されているときに最適に摘出できるようになったことに起因しており、このことは卵巣癌にとって有意な予後因子となっている（Ｂｒｉｓｔｏｗ Ｒ．Ｅ．，２０００；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。疾患の初期（第Ｉ期）にあると診断された患者において、５年生存率は９０を超える範囲に及んでいる（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ，２００６）。
卵巣癌は、卵巣の表面上皮または表面介在物（ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）に由来する異質腫瘍群を含む。これらの腫瘍群は、漿液性粘液性、類子宮内膜、明細胞およびブレンナー（遷移）型に分類されており、それぞれの型は女性生殖器の器官における様々な種類の上皮に対応している（Ｓｈｉｈ ａｎｄ Ｋｕｒｍａｎ，２００５）。これらの腫瘍群のうち漿液性腫瘍は、卵巣癌と診断された患者の約６０％を占める。各組織学的サブカテゴリは更に、良性、中程度（境界性腫瘍または低悪性度腫瘍（ＬＭＰ））、および悪性の３つの群に分類され、３つの群はそれぞれの臨床的挙動を反映している（Ｓｅｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＬＭＰは、漿液性と診断された腫瘍の１０％〜１５％に相当し、変則的な核構造および転移挙動を示すという点で難問であるが、その侵攻性は高悪性度の漿液性腫瘍よりもかなり低い。ＬＭＰ腫瘍患者の５年生存率が９５％であったのとは対照的に、同期間に進行した高悪性度疾患に関しては生存率が４５％に満たない（Ｂｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
現在、卵巣癌の診断は、１つには、患者の病歴の日常的分析を通して、更には理学的な超音波およびＸ線検査、ならびに血液学的スクリーニングを実施することにより実施されている。血清バイオマーカーの早期血液学的検出に関しては、２つの代替的方策が報告されてきた。１つは、質量分光測定を介した血清試料の分析によって、同一性が不明なタンパク質またはタンパク質フラグメントを見つけ、それにより癌の有無を検出するというアプローチである（Ｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋｏｚａｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ただし、この方策はコストが高くつくうえ、広く利用可能となっていない。別法として、血清中の既知のタンパク質／ペプチドの有無は、抗体マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、またはその他の類似のアプローチを使用して検出されている。ＣＡ−１２５（癌抗原１２５）と呼ばれる卵巣癌の標識としてのタンパク質バイオマーカーに対して、血清試験が広範に実施されるようになって久しい。一方、これらのタンパク質分子は卵巣癌細胞において過剰に産生し得るが、ほかにも、卵管癌または子宮体癌（子宮の内壁の癌）を含めたいくつかの癌が存在しており、膵癌患者の６０％、他の悪性腫瘍患者の２０％〜２５％はＣＡ−１２５が高い値であった。ＣＡ−１２５試験において、第Ｉ期の卵巣癌患者から真陽性の結果が返ってくる確率は約５０％に限られるのに対し、第ＩＩ期、第ＩＩＩ期、および第ＩＶ期の卵巣癌患者から真陽性の結果が返ってくる確率は８０％である。他の２０％の卵巣癌患者はＣＡ−１２５濃度の上昇を全く呈さない。加えて、ＣＡ−１２５試験で高値が得られた場合は、月経、妊娠、または子宮内膜症などの癌とは関連性のない他の良性活性を示している場合がある。結果として、この試験では、当該の初期疾患が呈する陽性予測値（ＰＰＶ）が１０％未満であり依然として治療が可能な場合に、初期疾患の検出に関して臨床用途がかなり限定されていた。ＣＡ−１２５に超音波スクリーニングを加えたとしてもＰＰＶの改善率は最大約２０％にすぎず（Ｋｏｚａｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ゆえに、この試験はスクリーニング試験として有効ではない。
疾患の病因知識の向上、積極的な腫瘍縮小手術、および近代的な併用化学療法にもかかわらず、死亡率はほとんど変化がなかった。転帰が不良となった原因は、（１）この病期において病徴の発現がごく僅かしかなく、かつ早期疾患検出のための適切なスクリーニング試験も欠如したがゆえに、やっと診断が頻繁に行われるようになったのは以後の病期に進行してしまってからであり、その時点での腹膜播種のため効果的な治療が限定されたことと、（２）標準の化学的治療法に対する抵抗力がしばしば高まったせいで患者の５年生存率の改善が制限されたことにある。卵巣癌に対する初期の化学療法レジメンには、カルボプラチン（パラプラチン）とパクリタキセル（タキソール）との併用が包含される。何年にも及ぶ臨床試験によって、この併用が最も効果を発揮するのは、有効な手術後においてである（即ち、新たに卵巣癌と診断された女性の約８０％において腫瘍体積が減り、４０％〜５０％においては完全に退縮する）ことが立証されてきた。それでもなお、患者の応答を改善する方法を模索して研究が続けられている。最近では、到達困難な標的細胞に対する化学療法剤の腹部注入と静脈送達とが併用されるようになり、効果が増してきた。一方、重篤な副作用が治療コースの不備につながることもしばしばである。その他のいくつかの化学療法剤としては、ドキソルビシン、シスプラチンシクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、ビンブラスチン、塩酸トポテカン、イホスファミド、５−フルオロウラシルおよびメルファランが挙げられる。より最近の臨床試験によって、シスプラチンを腹膜内投与すると静脈注射による全身化学療法と比較して生存率の上昇に役立つことが実証されてきた（Ｃａｎｎｉｓｔｒａ ａｎｄ ＭｃＧｕｉｒｅ，２００７）。疾患初期段階で化学療法を受けた女性において生存率が卓越していることは、卵巣癌の検出率改善方法の策定に向けた研究活動に対する正当性が確固たるものとなっている。更にまた、新規な卵巣癌関連バイオマーカーの発見は、今後の卵巣癌治療において、副作用が最小限に抑えられかつ有効性が改善された治療法の展開にもつながるであろう。
このように最近になって卵巣癌がよく理解されるようになり、その治療が進歩したにもかかわらず、化学療法の使用は重篤な副作用を伴うことが回避できず、その用途が限定されてしまっている。結果として、要求された方策が、抗原組織特異性とモノクローナル抗体の選択性とを組み合わせるといったより具体的なものであれば、非特異性関連の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）副作用を有意に低減できるはずである。卵巣癌の治療にモノクローナル抗体が使用されるようになり、継続されている臨床試験の数は増加の一途をたどっている（Ｏｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ ａｎｄ ｂｅｒｅｋ，２００５）。これらの試みのほとんどにおいては、イットリウム９０などの放射性同位元素に結合したモノクローナル抗体、または他の癌種で既に同定されている腫瘍抗原を標的とする抗体の使用が調査されてきた。この一例は、血管内皮成長因子を標的とするベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）の使用である（Ｂｕｒｇｅｒ，２００７）。モノクローナル抗体の治療標的として現在調査されている卵巣癌特異抗原は、ごく少数しかない。いくつかの例としては、Ｂ７−Ｈ４と称されるタンパク質（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、およびより最近では葉酸受容体−α（Ｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）の使用が挙げられ、そのうちの後者は最近になってＩＩ期の臨床試験に入った。
腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）は元々、細胞障害性Ｔリンパ細胞に提示される抗原性ペプチドとして、組織適合性白血球抗原−Ｂ７腎臓癌細胞系由来のｃＤＮＡライブラリからクローンされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ９ＵＢＰ８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：２８；２９）。ＫＡＡＧ１を含む座位は、逆ＤＮＡストランド上に転写された２つの遺伝子をコードすることが発見された。センスストランドは、ＤＣＤＣ２と称されるタンパク質をコードする転写産物をコードすることが明らかにされた。これらの著者らによる発現の研究から、ＫＡＡＧ１アンチセンス転写産物が腫瘍特異的であり、正常組織においては発現をほとんど呈さなかったのに対し、ＤＣＤＣ２センス転写産物は偏在的に発現したことが見出された（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。癌（特に、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌および黒色腫）におけるＫＡＡＧ１転写産物の発現は、その全体が参照により本願明細書に援用されている公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号明細書において開示されている。また、腎臓癌腫、結腸直腸癌腫、黒色腫、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌腫、食道癌腫、膀胱腫瘍、肺癌腫および頭頸部腫瘍におけるＲＮＡの発現も、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅらによって観測された。近年では、連鎖不平衡研究から得られた有力な遺伝学的証拠により、ＶＭＰ／ＤＣＤＣ２／ＫＡＡＧ１座位が失読症（ｄｙｓｌｅｘｉａ）を伴うことが明らかにされた（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これらの報告のうちの１つは、患者の失読症を引き起こした原因がＤＣＤＣ２マーカーにあることを指摘していた。皮質ニューロン移動においてこのタンパク質の機能は、異常なニューロン移動および成熟をしばしば示すこれらの患者の病徴と一致していたためである（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号明細書
本発明は、特異的抗ＫＡＡＧ１抗体および抗原結合性フラグメント、ならびにＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する腫瘍細胞を含む癌の治療、検出および診断のためのこれら特異的抗ＫＡＡＧ１抗体および抗原結合性フラグメントの使用に関する。そのような癌の例示的実施形態としては、例えば、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌および頭頸部癌が挙げられる。
抗体または抗原結合性フラグメントは、腫瘍細胞の表面で発現したＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１の変異体を標的とするのに特に有効であり得る。
実際、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、例えば、ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６に開示されている３Ｄ３抗体および３Ｇ１０抗体と比べると、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞に結合する能力に優れると思われる。これらの抗体および抗原結合性フラグメントはまた内在化されるため、治療剤を腫瘍細胞に送達するうえで有用であり得る。本発明者らの結果に基づき、例えば結合および内在化に優れるなどの所望の特徴を有する抗体および抗原結合性フラグメントは通常、アミノ酸６１〜８４で区切られたＫＡＡＧ１のＣ末端領域と結合することがわかった。ただし、３Ａ４抗体および３Ｇ１０抗体は両方とも同じ領域に結合するにしても、腫瘍細胞の表面への結合は３Ｇ１０抗体よりも３Ａ４抗体の方が効率的であるように思われる。特に、フローサイトメトリー（細胞表面に対する抗体の直接的な結合を測定するアプローチ）での実験において、ＫＡＡＧ１抗原を発現する癌細胞は、３Ａ４の所要量が３Ｇ１０との比較で約１／１０である。加えて、表面プラスモン共鳴を使用した結合実験において、ＫＡＡＧ１に対する３Ａ４の親和性定数（ＫＤ）が１０ピコモル未満であるのに対し、抗体３Ｄ３および３Ｇ１０が呈する親和性定数（ＫＤ）は２００ピコモル超（１／２０未満の親和性）であることが発見された。よって、３Ａ４のこうした結合能の増加は、治療活性の向上に転換されると予想される。
本発明はその一態様において、ＫＡＡＧ１（配列番号２９）のアミノ酸６１〜８４の間に位置する少なくとも１０個（例えば、１０〜２０個またはそれを上回る）の連続したアミノ酸と同一な配列に特異的に結合する能力を有し得る単離されたもしくは実質的に精製された抗体、または抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明はまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと競合し得る単離抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
更なる態様において本発明は、本明細書に記載されているアミノ酸配列を有する特異的抗体または抗原結合性フラグメントに関する。そのような抗体または抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体（単離された）の形態はもとより、本明細書に記載されている特性を有する抗原結合性フラグメントの形態であってもよい。モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の転置を包含する抗体または抗原結合性フラグメントもまた、これと共に包含される。
ゆえに、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト定常領域のアミノ酸および／またはヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含んでいてもよい。
用語「抗体」は、無傷抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。用語「抗体」はまた、二重特異的抗体などの多重特異的抗体を包含する。ヒト抗体は通常２つの軽鎖と２つの重鎖とを含み、それぞれ可変領域および定常領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＬ１またはＬ１、ＣＤＲＬ２またはＬ２、およびＣＤＲＬ３またはＬ３として同定されている３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＨ１またはＨ１、ＣＤＲＨ２またはＨ２、およびＣＤＲＨ３またはＨ３として同定される３つのＣＤＲを含む。本発明のヒト化抗体のＣＤＲ（例えば、配列番号５６に示すＣＤＲＨ２）は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａの定義を使用して同定されてきた。一方、他の発明者（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，２００８）は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｉａに大まかに基づき、修正されたアプローチを使用し、その結果、より短いＣＤＲ（例えば、配列番号６に示すＣＤＲＨ２）をデリニエートした。
本明細書において用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する能力を保持している１つ以上の抗体フラグメント（例えば、ＫＡＡＧ１、ＫＡＡＧ１の分泌形態、またはその変異体）を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントによって実行され得ることが明らかにされてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、即ちＶＬドメインとＶＨドメインとＣＬドメインとＣＨ１ドメインとからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、即ちヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一群（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬドメインとＶＨドメインとからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ ＣＤＲ３が挙げられる。更にまた、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を使用して合成リンカーを介して結合することも可能である。それにより、これらＶＬおよびＶＨドメインを単一ポリペプチド鎖とすることができ、この単一ポリペプチド鎖内でＶＬ領域とＶＨ領域とが対になることによって１価分子（単鎖として公知のＦｖ（ｓｃＦｖ）が形成される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含されるように意図されたものである。更にまた、抗原結合性フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド（例えば、リンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に融合される重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域）と、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域と、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域と、を含んでなる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１つ以上のシステイン残基をセリン残基で置換することによって、二量体化が防止されるように修飾できる。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は更に、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号明細書に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して採取され、このフラグメントは、無傷抗体と同じ方法で利用されるようにスクリーニングされる。
用語「ヒト化抗体」は、完全にヒト化された抗体（即ち、フレームワークが１００％ヒト化されている）と、部分的にヒト化された抗体（例えば、ヒト抗体由来の１種以上のアミノ酸が少なくとも１つの可変ドメインに含まれている一方、他のアミノ酸が非ヒト親抗体のアミノ酸である）と、を包含する。「ヒト化抗体」は典型的に、非ヒト親抗体のＣＤＲ（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類など）と、天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスのフレームワークと同一のフレームワークと、を含む。そういった場合、「ヒト化抗体」は、完全にヒト化されていることで特徴づけられる。「ヒト化抗体」はまた、ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスのアミノ酸置換に全く対応していない１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。そのような置換には、例えば、抗体の特徴（例えば親和性、特異性など）を保持し得る復帰突然変異（例えば非ヒトアミノ酸の再導入）が包含される。そのような置換は通常、フレームワーク領域におけるものである。「ヒト化抗体」はまた任意選択的に定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にその定常領域部分はヒト抗体の定常領域である。「ヒト化抗体」の定常領域は典型的に、ヒト抗体の定常領域と同一である。
用語「天然ヒト抗体」は、ヒト抗体レパートリー、即ち、生殖細胞系配列を介してコードされる（コード可能な）抗体を指す。
用語「キメラ抗体」は、非ヒト可変領域とヒト定常領域とを有する抗体を指す。
用語「ハイブリッド抗体」は、その重鎖可変領域または軽鎖可変領域（その重鎖または軽鎖）の１つが或る種類の（例えば、ヒト化）抗体に由来するものであり、他の重鎖可変領域または軽鎖可変領域（重鎖または軽鎖）が別の種類の（例えば、ネズミ、キメラ）抗体に由来するものである抗体を指す。
一部の実施形態において、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域は、ヒト化されていることが求められる非ヒト抗体に由来する１〜３０のアミノ酸から構成されていてもよく、残りの部分は天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスに由来するものであり得る。場合によってはヒト化抗体は１〜６つの非ヒトＣＤＲを含んでいてもよく、多くの場合に６つのＣＤＲは非ヒトである。
非ヒト親抗体をヒト化する目的に選択された天然ヒト抗体は、非ヒト親抗体の（モデリングされた）可変領域（に重ね合わせ可能な）構造に似た３次元構造を有する可変領域を含み得る。よって、ヒト化抗体は、非ヒト親抗体の３次元構造に似た３次元構造を有する可能性が高くなる。
ヒト化の目的に選択された天然ヒト抗体の軽鎖可変領域は、非ヒト親抗体の軽鎖可変領域に対して、例えば、全体的に（軽鎖可変領域全体にわたって）少なくとも７０％、７５％、８０％等の同一性を有し得る。別法として、ヒト化の目的に選択された天然ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域は、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％等の配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、ヒト化の目的に選択された天然ヒト抗体は、その軽鎖相補性決定領域内に、非ヒト親抗体の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸と同数または実質的に同数のアミノ酸を有し得る。
ヒト化の目的に選択された天然ヒト抗体の重鎖可変領域は、非ヒト親抗体の重鎖可変領域に対して、例えば、全体的に（重鎖可変領域全体にわたって）少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％等の同一性を有し得る。また、本発明によれば、ヒト化抗体の重鎖ヒトフレームワーク領域のアミノ酸残基は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％、７５％、８９％等の同一性を有する天然ヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来するものであり得る。一部の実施形態において、ヒト化の目的に選択された天然ヒト抗体は、その重鎖相補性決定領域内に、非ヒト親抗体の重鎖相補性決定領域のアミノ酸と同数または実質的に同数のアミノ酸を有し得る。
非ヒト親抗体をヒト化する目的に選択された天然ヒト抗体は、非ヒト親抗体の（モデリングされた）可変領域（に重ね合わせ可能な）構造に似た３次元構造を有する可変領域を含み得る。よって、ヒト化抗体またはハイブリッド抗体は、非ヒト親抗体のものに似た３次元構造を有する可能性が高くなる。
例えば、ヒト化の目的に選択され得る天然ヒト抗体重鎖可変領域は、次の特徴：ａ）非ヒト抗体の重鎖の３次元構造に対して類似もしくは同一の（重ね合わせ可能な）３次元構造、および／またはｂ）非ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を有し得る。任意選択的に、重鎖ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３つとも全て）における（いくつかの）アミノ酸残基は、非ヒト重鎖ＣＤＲアミノ酸残基のものと同じかまたは実質的に同じである。
別法として、ヒト化の目的に選択され得る天然ヒト抗体軽鎖可変領域は、次の特徴：ａ）非ヒト抗体の軽鎖の３次元構造に対して類似もしくは同一の（重ね合わせ可能な）３次元構造、および／またはｂ）非ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を有し得る。任意選択的に、軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３つとも全て）における（いくつかの）アミノ酸残基は、非ヒト軽鎖ＣＤＲアミノ酸残基のものと同じかまたは実質的に同じである。
典型的な抗原結合部位は、軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを対にして生成された可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に整合性がとれていて、極めて類似の構造を呈する。これらの可変領域は典型的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのハイパー可変領域で離間された比較的相同的なフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合性フラグメントの全般的な結合活性は多くの場合、ＣＤＲの配列によって指図される。ＦＲはしばしば、３次元においてＣＤＲを適切に位置決めし、アライメントする役割を果たすことによって、抗原結合を至適化する。
本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントは、例えば、マウス、ネズミもしくは他の何らかの哺乳動物、または他の源（組み換えＤＮＡ技術によるものなど）に由来するものであり得る。
本発明の更なる範囲、適用性および利点は、下掲の非限定的な詳述から明らかになるであろう。この詳細説明は、添付の図面を参照しながら本発明の例示的実施形態を示しているが、単に例示の目的で与えられたものであることを理解すべきである。
ＥＬＩＳＡにおいて高濃度の組み換えヒトＫＡＡＧ１と共にインキュベートしたときの３Ａ４キメラ抗ＫＡＡＧ１抗体の結合を、対照抗体と比較した結果を示す。３Ａ４の結合曲線は、より明るい色の線分で示されている。 ＥＬＩＳＡ分析によって３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体のエピトープ特異性をマップした結果を記述した、ヒストグラムを示す。その結果から、３Ａ４がアミノ酸６１〜８４間のＫＡＡＧ１のカルボキシ末端に含まれるアミノ酸の配列と相互作用することが明らかにされた。３Ａ４の結合を、ＫＡＡＧ１の領域１〜３５、３６〜６０、および６１〜８４とそれぞれ相互作用することで知られる３Ｃ４、３Ｄ３、および３Ｇ１０抗ＫＡＡＧ１抗体と比較した。 ＳＫＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ卵巣癌細胞に対して行われたフローサイトメトリーの結果を示す。３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体（濃い線分）と対照ＩｇＧ（明るい線分）とが比較されている。 ２９３Ｅヒト腎臓細胞に対して行われたフローサイトメトリーの結果を示す。３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体（濃い線分）と対照ＩｇＧ（明るい線分）とが比較されている。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いたフローサイトメトリーによる、ＳＫＯＶ−３細胞の表面上のＫＡＡＧ１抗原の検出を表す。細胞を３７℃でインキュベートした場合、経時的に蛍光シグナルが減少する。これは、細胞を３Ａ４と共にインキュベートしたとき、インキュベーション中にＫＡＡＧ１／抗体複合体が内在化されたことを示唆している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体の内在化、および３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体とＬＡＭＰ１（エンドソーム膜およびリソソーム膜と会合するタンパク質）との共局在性を示す。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体の内在化、および３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体とＬＡＭＰ１（エンドソーム膜およびリソソーム膜と会合するタンパク質）との共局在性を示す。 種々の抗ＫＡＡＧ１抗体に露出された腫瘍細胞のＦＡＣ分析を表すグラフである。 種々の抗ＫＡＡＧ１抗体に露出された腫瘍細胞のＦＡＣ分析を表すグラフである。 細胞膜において起こり得るＫＡＡＧ１配向を２通りの表現で表した概略図である。 ネズミ３Ａ４可変ドメイン（リボンダイヤグラム）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ１Ｈｈ１（即ち、ヒト化軽鎖１およびヒト化重鎖１）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ１は変異体１のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ１は変異体１の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ１Ｈｈ２（即ち、ヒト化軽鎖１およびヒト化重鎖２）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ１は変異体１のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ２は変異体２の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ１Ｈｈ３（即ち、ヒト化軽鎖１およびヒト化重鎖３）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ１は変異体１のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ３は変異体３の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ１Ｈｈ４（即ち、ヒト化軽鎖１およびヒト化重鎖４）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ１は変異体１のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ４は変異体４の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ２Ｈｈ１（即ち、ヒト化軽鎖２およびヒト化重鎖１）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ２は変異体２のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ１は変異体１の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ２Ｈｈ２（即ち、ヒト化軽鎖２およびヒト化重鎖２）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ２は変異体２のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ２は変異体２の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ２Ｈｈ３（即ち、ヒト化軽鎖２およびヒト化重鎖３）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ２は変異体２のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ３は変異体３の重鎖として指定されている。 ３Ａ４可変ドメインのヒト化抗体Ｌｈ２Ｈｈ４（即ち、ヒト化軽鎖２およびヒト化重鎖４）の分子モデルである。ＣＤＲループは黒に彩色されており、軽鎖の場合はＬ１、Ｌ２およびＬ３と標識され、重鎖の場合はＨ１、Ｈ２およびＨ３と標識されている。フレームワーク領域は、グレーで示してある。ネズミフレームワークからヒトフレームワークに変異した残基の側鎖は、球棒表現で描かれている。Ｌｈ２は変異体２のヒト化軽鎖として指定され、Ｈｈ４は変異体４の重鎖として指定されている。 ネズミおよびヒト化軽鎖の３Ａ４可変ドメインのアミノ酸配列アライメントである。軽鎖は２つのヒト化変異体（Ｌｈ１およびＬｈ２）を有する。ＣＤＲはボールド体で表示され、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３で指示されている。ヒトフレームワーク領域における復帰突然変異、即ちネズミアミノ酸は、ヒト化配列において下線で示されている(図１０ａ)。ネズミおよびヒト化重鎖の３Ａ４可変ドメインのアミノ酸配列アライメントである。重鎖は４つのヒト化変異体（Ｈｈ１〜Ｈｈ４）を有する。ＣＤＲはボールド体で表示され、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３で指示されている。ヒトフレームワーク領域における復帰突然変異、即ちネズミアミノ酸は、ヒト化配列において下線で示されている(図１０ｂ)。 ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）を使用してネズミ３Ａ４軽鎖可変領域（配列番号４）を軽鎖可変領域変異体（配列番号３３）にアライメントした図である。ここで、「＊」（アスタリスク）は、完全に保存された単一の残基を有する位置を示す。ここで、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５を上回る著しく類似した特性を持つグループ間の保存を示す。ここで、「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５以下の類似性の低い特性を持つグループ間の保存を示す(図１１Ａ)。ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）を使用してネズミ３Ａ４重鎖可変領域（配列番号２）を軽鎖可変領域変異体（配列番号３８）にアライメントした図である。ここで、「＊」（アスタリスク）は、完全に保存された単一の残基を有する位置を示す。ここで、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５を上回る著しく類似した特性を持つグループ間の保存を示す。ここで、「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５以下の類似性の低い特性を持つグループ間の保存を示す(図１１Ｂ)。 ｐＫＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ−変異体１のプラスミドマップを表す。同様な方法で、ヒト化３Ａ４変異体の重鎖がｐＫ−ＣＲ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンされた。それゆえに、結果として得られたプラスミドは、重鎖免疫グロブリン可変ドメインの配列を除き、ｐＫＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ変異体１と同一である。 ｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１のプラスミドマップを表す。同様な方法で、３Ａ４抗体のヒト化変異体１および２の軽鎖がｐＭＰＧ−ＣＲ５のＢａｍＨＩ部位にクローンされた。それゆえに、結果として得られたプラスミドは、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインの配列を除き、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１と同一である。 ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクション後の抗体産生の分析を表す。ヒト化３Ａ４抗体の軽鎖および重鎖の様々な組み合わせを用いトランスフェクションしたＣＨＯｃＴＡ細胞の上澄み（トランスフェクション後１３日目）を、ウエスタンブロットで分析した。ウエスタンブロットのバンドを公知の標準液（ヒト精製ＩｇＧ抗体）の希釈物に対して走査した後、上澄み中に産生された抗体の量を分子量（Ｍｒ）マーカー（ｋＤａ）で測定した。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５にかけた組み換えＫＡＡＧ１試料のゲル濾過を示すグラフである。ＫＡＡＧ１をゲル濾過物に注入し、０．４ｍｌ／ｍｉｎで分離させた。最大ピークは画分１５〜画分１９の間である。 ３Ａ４抗体のネズミおよびヒト化変異体の速度および親和性定数を記載した表である。 ヒト化抗体の会合速度（Ｋａ）を図示したヒストグラムである。 ヒト化抗体の解離速度（Ｋｄ）を図示したヒストグラムである。 ヒト化抗体の親和性定数（ＫＤ）を図示したヒストグラムである。 ＥＬＩＳＡにおいてＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、３Ａ４ヒト化抗体変異体およびネズミ３Ａ４の結合を比較して示したものである。Ｌｈ１軽鎖変異体とアセンブルされたヒト化重鎖（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）の濃度依存的な結合プロファイルである。 ＥＬＩＳＡにおいてＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、３Ａ４ヒト化抗体変異体およびネズミ３Ａ４の結合を比較して示したものである。Ｌｈ２軽鎖変異体とアセンブルされたヒト化重鎖（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）の濃度依存的な結合プロファイルである。 癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、非透過ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞上のヒト化抗体およびネズミ３Ａ４抗体結合活性を比較して示したものである。
癌細胞におけるＫＡＡＧ１の発現および生物学的活性
本発明は、様々な癌種、特に卵巣癌に見つかる腫瘍を標的とする抗体の使用に関する。抗体を腫瘍に差し向けるためには、癌細胞の細胞表面に発現した腫瘍特異抗原の同定を行う必要がある。腫瘍特異抗原の同定に利用可能な技術はいくつか存在しており、卵巣腫瘍内のＫＡＡＧ１の同定に使用された方法、即ち、サブトラクティブトランスクリプションベースのｍＲＮＡの増幅（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ（ＳＴＡＲ））と呼ばれる革新的発見の基盤は、２００７年１２月２７日に国際公開第２００７／１４７２６５号パンフレットに基づいて発行された公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号明細書に記載されている。
卵巣癌ＳＴＡＲライブラリの分析によって、分泌されたタンパク質および細胞表面タンパク質をコードする多くの遺伝子が明らかにされた。これらのうちの１つでＡＢ−０４４７と呼ばれるものには、オープンリーディングフレームが含まれており、このオープンリーディングフレームによって、配列番号２９に対応する８４アミノ酸のポリペプチド（配列番号２８に示すヌクレオチド配列を有する８８５塩基対のｃＤＮＡによりコードされたもの）がコードされた。公的に利用可能なデータベースの検索によって、ＡＢ−０４４７ヌクレオチド配列がＫＡＡＧ１と呼ばれる遺伝子のものと同一であることが判明した。バイオインフォーマティック分析によって、その機能的ドメインを細胞外区画に対して提示する膜アンカー型タンパク質が予想された。ＫＡＡＧ１は最初に腎臓癌ライブラリから細胞表面抗原としてクローンされたものであり、これはその膜局在化を裏付ける結果となった。加えて、本発明者らの研究から、タンパク質がそのアミノ末端で処理されることが判明した。これはアミノ酸３０および３４におけるまたはその間の機能的シグナルペプチドの開裂と一貫性を持った結果であった。更にまた、完全長ｃＤＮＡの一過性発現の結果、培養培地中で開裂されたＫＡＡＧ１が検出された。この最後の発見から、この膜アンカー型タンパク質は、高レベルで発現した場合に細胞から除去され得ることが示唆された。対照的に、ＫＡＡＧ１のアミノ酸がトランケートされた突然変異体（ａｍｉｎｏ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ）が発現した結果、タンパク質の細胞内保持が起こった。その機能を解明した公開報告書は現時点では存在せず、本発明により開示されているような、卵巣癌におけるＫＡＡＧ１の過剰発現は、従来は文書化されてこなかった。
ゆえに、本発明者らはＫＡＡＧ１が抗体ベースの診断および治療法に使用できるかどうかの調査にあたった。
ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０等のいくつかの卵巣癌細胞に基づくモデルが確立されてきており、当業者によく知られている。これらの細胞は、卵巣腫瘍または腹水を有する患者由来のヒト卵巣癌細胞系の採取物の一部である。これらの細胞は、ヒト卵巣癌の優良細胞ベースモデルとなるマイクロアレイ上のグローバル遺伝子発現パターンを含めた、綿密な分析を受けた。これらの細胞系がｉｎ ｖｉｖｏでの卵巣腫瘍挙動のまさに典型例であることは、成長特性、遺伝子発現パターン、および化学療法薬に対する反応によって示唆された（Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらの卵巣癌細胞系から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、原発腫瘍由来の細胞系においてＫＡＡＧ１転写産物の発現が弱いことが立証された。対照的に、腹水由来の細胞系は高レベルのＫＡＡＧ１の発現を含んでいた。腹水由来の細胞においてＫＡＡＧ１の発現が増大したことは、細胞の環境がＫＡＡＧ１遺伝子の調節に影響することを示唆するものであった。腹水細胞は進行した疾患と関連しており、この発現パターンはＫＡＡＧ１レベルの増大が足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）と関連していることを意味する。この後者の示唆に従い、これらの細胞が３Ｄ培養でスフェロイドとして培養された場合、ＫＡＡＧ１の発現が原発腫瘍由来の細胞系を有意に増大させることが明らかにされた。これらのスフェロイドは詳細にわたって特徴づけられてきており、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍関連の多くの特性を示すことが明らかにされた（Ｃｏｄｙ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。ゆえに、特に卵巣癌発生時の腫瘍の進行を疑似したモデルにおいて、ＫＡＡＧ１の発現が有意に増大することが明らかにされた。
卵巣癌細胞においてＫＡＡＧ１の発現が調節されることを実証したうえで、卵巣癌細胞挙動におけるこの遺伝子の機能を細胞ベースのアッセイで調査した。その趣旨で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて卵巣癌細胞系における内因性ＫＡＡＧ１遺伝子の発現をノックダウンしてＫＡＡＧ１の発現を減少させた結果、創傷治癒（即ち、スクラッチ）アッセイにより示されたのと同様、標準細胞可動性アッセイで定量されたように、細胞遊走が有意に減少したことが明らかにされた。この種類のアッセイでは、コンフルエント単層内の露出領域が細胞で充填される速度を測定する。ＫＡＡＧ１の発現が減少した結果、コロニー生存率アッセイなどのクローン原性アッセイで測定される卵巣癌細胞系の生存率が減少した。当業者であれば他の方法を使用して、癌細胞、特に卵巣癌細胞の挙動におけるＫＡＡＧ１の要件を評価できよう。
卵巣腫瘍ではＫＡＡＧ１の発現率が高いこと、正常組織ではＫＡＡＧ１の発現が制限されていること、および発現レベルと悪性度の増大に対応関係があること、ならびに卵巣癌細胞系の挙動におけるＫＡＡＧ１の推定的な生物学的役割に基づき、卵巣癌の検出、予防用および治療用の抗体を開発する目的で治療標的としてＫＡＡＧ１を選択した。卵巣癌以外の癌においてＫＡＡＧ１が発現したという理由からもまた、本出願者は他の癌の病徴に関して治療用または診断用の抗体を評価するに至った。
ゆえに、本発明は、ＫＡＡＧ１を標的とする（例えば抗体−薬物複合体として使用できる）抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントを提供する。
そのような抗体および抗原結合性フラグメントとしては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、および抗原結合領域を有するポリペプチドが挙げられる。
ＫＡＡＧ１に結合する抗体および抗原結合性フラグメント
抗体を最初にＦａｂライブラリから単離し、目的とする抗原に対する抗体の特異性を確認した。
本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントの可変領域は、所望される種の定常領域と融合させることが可能であり、そうすることにより、所望される種のエフェクター細胞に抗体を認識させることができる。定常領域は、例えば、ＩｇＧ１亜型、ＩｇＧ２亜型、ＩｇＧ３亜型、またはＩｇＧ４亜型に由来し得る。可変領域を用い定常領域をフレーム内でクローニングまたは合成することは、優に当業者の技術範囲内にあり、例えば組み換えＤＮＡ技術を介して実施され得る。ゆえに、ヒト抗体の定常領域を含む抗体だけでなく、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含む抗体または抗原結合性フラグメントもまた、本発明に包含される。
ゆえに、例証的実施形態において本発明は、
ａ．配列番号８を含むかもしくは配列番号８に示すＣＤＲＬ１配列、
ｂ．配列番号９を含むかもしくは配列番号９に示すＣＤＲＬ２配列、または
ｃ．配列番号１０を含むかもしくは配列番号１０に示すＣＤＲＬ３配列
を有する軽鎖可変領域を含む、単離抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
単離抗体または抗原結合性フラグメントはまた、
ａ．配列番号５を含むかもしくは配列番号５に示すＣＤＲＨ１配列、
ｂ．配列番号６を含むかもしくは配列番号６に示すＣＤＲＨ２配列、または
ｃ．配列番号７を含むかもしくは配列番号７に示すＣＤＲＨ３配列
を有する重鎖可変領域を含んでいてもよい。
例証的実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、軽鎖可変領域の任意の独立したＣＤＲ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３の組み合わせを含んでいてもよい。ＣＤＲ３はより具体的に選択され得る。組み合わせとしては、例えば、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３と、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２と、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と、を挙げることができる。
別の例示的実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域の任意の独立したＣＤＲ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３の組み合わせを含んでいてもよい。ＣＤＲ３はより具体的に選択され得る。組み合わせとしては、例えば、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２と、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、を挙げることができる。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる少なくとも２つのＣＤＲを含んでいてもよい。
また、本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３と、を含んでいてもよい。
更に、本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、
ａ．ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる少なくとも２つのＣＤＲと、
ｂ．ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２、または１つのＣＤＲＨ３からなる少なくとも２つのＣＤＲと、
を含んでいてもよい。
抗体または抗原結合性フラグメントは、より好ましくは、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３と、を含んでいてもよい。
抗体または抗原結合性フラグメントはまた、より好ましくは１つのＣＤＲＨ１と、１つのＣＤＲＨ２と、１つのＣＤＲＨ３と、を含んでいてもよい。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２、または１つのＣＤＲＨ３を含んでいてもよい。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントはまた、１つのＣＤＲＨ１と、１つのＣＤＲＨ２と、１つのＣＤＲＨ３と、を含んでいてもよい。
軽鎖可変領域または重鎖可変領域のどちらか一方のみが利用可能な場合、当該技術分野において公知の方法を使用して、相補可変領域のライブラリをスクリーニングすることによって、抗体または抗原結合性フラグメントを再構成してもよい（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１５０：８８０−８８７，Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８）。
また、本明細書に記載されている（元のＣＤＲと比較して）少なくとも１つのＣＤＲ内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体も、本発明に包含される。
本発明はまた、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも２つのＣＤＲ内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体を包含する。
本発明はまた、（元のＣＤＲと比較して）３つのＣＤＲ内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体を包含する。
本発明はまた、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも１つのＣＤＲ内に少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体を包含する。
本発明はまた、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも２つのＣＤＲ内に少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体を包含する。
本発明はまた、（元のＣＤＲと比較して）３つのＣＤＲ内に少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチドまたは抗体を包含する。
別の態様において本発明は、（単一のポリペプチド鎖上にまたは別個のポリペプチド鎖上に）本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントのうちの１つの、軽鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域と、重鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域と、を含むポリペプチド、抗体、または抗原結合性フラグメントに関する。
本発明はその別の態様において、（単一のポリペプチド鎖上にまたは別個のポリペプチド鎖上に）本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を６つとも全て含み得る抗ＫＡＡＧ１抗体に関する。
変異体抗体および抗原結合性フラグメント
本発明はまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントの変異体を包含する。包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列において変異を有するものである。例えば、包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの変異体ＣＤＲ（２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変異体ＣＤＲ、または更には１２個の変異体ＣＤＲ）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖および／または変異体重鎖を有するものである。本発明に包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、元の抗体または抗原結合性フラグメントと比較して結合親和性が類似しているかまたは改善されているものである。
本明細書において用語「変異体」は、本明細書に記載されているいずれの配列にも適用され、例えば、変異体ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３のいずれか）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖、変異体重鎖、変異体抗体、変異体抗原結合性フラグメント、ならびにＫＡＡＧ１変異体を包含する。
本発明に包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、挿入、欠失、またはアミノ酸置換（保存的または非保存的）を含み得るものである。これらの変異体は、そのアミノ酸配列中の少なくとも１種のアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されていてもよい。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、上述した軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでいてもよく、例えば、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸などの定常領域のアミノ酸を更に含んでいてもよい。
例証的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでいてもよい。
本発明の別の例証的実施形態によれば、抗原結合性フラグメントは、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２を含んでいてもよい。
置換型突然変異に重要な部位としては、高度可変領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、フレームワーク領域内または更には定常領域内での修飾改変も考慮される。保存的置換は、下掲の群（１群〜６群）のいずれか１つからの（ＣＤＲ、可変鎖、抗体などの）アミノ酸を同じ群の別のアミノ酸と交換することによって為され得る。
保存的置換の他の例示的実施形態を、表１Ａの「好適な置換（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」という見出しの下に示す。そのような置換の結果、所望されない特性が得られた場合は、表１Ａで「例示的置換」と呼ぶより実質的な変更、またはアミノ酸のクラスに関して更に詳しく後述するような変更を導入して、生成物をスクリーニングすることもできる。
変異体が置換変異によって生成され、かつ本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持し得ることは、当該技術分野において公知である。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されている。例えば、置換型突然変異に重要な部位の１つとして、異なる種から採取される特定の残基どうしが同一である部位を挙げることができる。「保存的置換」と同定される置換の例を表１Ａに示す。そのような置換の結果、望ましくない変更が生じた場合、表１Ａ中で「例示的な置換」と呼ばれる、または、更に本明細書においてアミノ酸クラスを参照して詳述されているような他のタイプの置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
機能または免疫学的同一性における実質的な修正は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド主鎖の（例えば、シート立体配座またはヘリックス立体配座としての）構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果に有意な違いのある置換を選択することによって達成される。天然残基は、一般の側鎖特性に基づいて次の群に分類される。
（１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）
（３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖配向に影響する残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、および
（６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
非保存的置換は、これらの部類のメンバーの相互交換を伴う。
元の抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列と比べて、変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、そのアミノ酸配列において実質的な配列類似性および／または配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の度合いは、同一性（同一のアミノ酸）および保存的置換のパーセンテージに基づく。
本明細書において可変鎖間の類似性および同一性の度合いは一般的に、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、既定の設定を使用して、即ち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（開始ギャップ１１およびギャップ伸張のペナルティ１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）および活性化フィルタを使用して、定量されてきた。
ゆえに、同一性パーセントは、元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ同じまたは類似する位置を占有し得るアミノ酸を示す。
類似性パーセントは、同じ位置または類似の位置にある元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ保存的なアミノ酸置換で置換されるアミノ酸を示す。
ゆえに、本発明の変異体は、元の配列または元の配列の一部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
変異体の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８１％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８２％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
簡潔にするために、本出願者は本発明に包含される個々の変異体の例示的実施形態を示した表１Ｂを提供している。この表１Ｂには、特定の配列同一性（％）および配列類似性（％）が含まれている。各「Ｘ」は所定の変異体を定義するものと解釈すべきである。
本発明は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖、抗体および／または抗原結合性フラグメントを包含する。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含むものである。
これらの軽鎖可変領域は、配列番号８に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列と、配列番号９に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列と、配列番号１０に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列と、を含み得る。
本発明の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号８に対して少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含んでいてもよい。
本発明の別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号８と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含んでいてもよい。
本発明の別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号９に対して少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ２配列を含んでいてもよい。
本発明の更に別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含んでいてもよい。
本発明の別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号１０に対して少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含んでいてもよい。
本発明の付加的な例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号１０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含んでいてもよい。
例証的実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列を含む重鎖可変領域を含んでいてもよい。
これらの重鎖可変領域は、配列番号５に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列と、配列番号６に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列と、配列番号７に対して少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列と、を含んでいてもよい。
本発明の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号５に対して少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含んでいてもよい。
本発明の別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号５と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含んでいてもよい。
本発明の更に別の例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号６に対して少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含んでいてもよい。
本発明の更なる例示的実施形態は、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号６と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含んでいてもよい。
本発明の他の更なる例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号７に対して少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含んでいてもよい。
本発明の付加的な例証的実施形態において、本明細書に記載されている抗体はいずれも、配列番号７と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含んでいてもよい。
場合によっては、変異体抗体の重鎖可変領域は、（アミノ酸置換と組み合わせた、またはアミノ酸置換を含まない）アミノ酸欠失または付加を含んでいてもよい。多くの場合、１、２、３、４または５個のアミノ酸欠失または付加が許容され得る。
本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態には、配列番号３０に示す軽鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号３０
ＤＸＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＶＸＸＧＸＸＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＧＴＸＬＥＸＫ（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。アミノ酸置換は、例えば、天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスの対応する位置に見出されるアミノ酸であってもよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態には、配列番号３１に示す軽鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号３１
ＤＸａ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸａ２ＶＸａ３Ｘａ４ＧＸａ５Ｘａ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸａ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸａ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸａ９ＧＴＸａ１０ＬＥＸａ１１Ｋ
（配列中、
Ｘａ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ２はＡもしくはＰであってよく、
Ｘａ３は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ４はＬもしくはＰであってよく、
Ｘａ５は酸性アミノ酸であってよく、
Ｘａ６はＱもしくはＰであってよく、
Ｘａ７は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘａ８は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ９はＡもしくはＱであってよく、
Ｘａ１０は塩基性アミノ酸であってよく、または
Ｘａ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの付加的な例示的実施形態には、配列番号３２に示す軽鎖可変領域を有するものが包含される：
配列番号３２
ＤＸＡ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＡ２ＶＸＡ３ＸＡ４ＧＸＡ５ＸＡ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＡ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＡ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＡ９ＧＴＸＡ１０ＬＥＸＡ１１Ｋ
（配列中、
ＸＡ１はＶもしくはＩであってよく、
ＸＡ２はＡもしくはＰであってよく、
ＸＡ３はＳもしくはＴであってよく、
ＸＡ４はＬもしくはＰであってよく、
ＸＡ５はＤもしくはＥであってよく、
ＸＡ６はＱもしくはＰであってよく、
ＸＡ７はＫもしくはＱであってよく、
ＸＡ８はＬもしくはＶであってよく、
ＸＡ９はＡもしくはＱであってよく、
ＸＡ１０はＲもしくはＫであってよく、または
ＸＡ１１はＬもしくはＩであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
実施形態によれば、軽鎖可変ドメイン変異体は、配列番号３３または３４に示す配列を有していてもよい。
配列番号３３
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
配列番号３４
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態には、配列番号３５に示す重鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号３５
ＱＸＱＬＶＱＳＧＸＥＸＸＫＰＧＡＳＶＫＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＱＸＸＧＸＸＬＥＷＸＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＸＸＸＴＸＤＸＳＸＳＴＡＹＭＸＬＸＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。アミノ酸置換は、例えば、天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスの対応する位置に見出されるアミノ酸であってもよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態は、配列番号３６に示す重鎖可変領域を有するものを含む。
配列番号３６
ＱＸｂ１ＱＬＶＱＳＧＸｂ２ＥＸｂ３Ｘｂ４ＫＰＧＡＳＶＫＸｂ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸｂ６ＱＸｂ７Ｘｂ８ＧＸｂ９Ｘｂ１０ＬＥＷＸｂ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸｂ１２Ｘｂ１３Ｘｂ１４Ｘｂ１５ＴＸｂ１６ＤＸｂ１７ＳＸｂ１８ＳＴＡＹＭＸｂ１９ＬＸｂ２０ＳＬＸｂ２１ＳＥＤＸｂ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸｂ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘｂ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ２はＰもしくはＡであってよく、
Ｘｂ３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ４はＶもしくはＫであってよく、
Ｘｂ５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ６は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ７はＳもしくはＡであってよく、
Ｘｂ８はＨもしくはＰであってよく、
Ｘｂ９は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１０はＳもしくはＧであってよく、
Ｘｂ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１２は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１４はＩもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１６は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１７はＫもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１８は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１９はＱもしくはＥであってよく、
Ｘｂ２０はＮもしくはＳであってよく、
Ｘｂ２１はＴもしくはＲであってよく、
Ｘｂ２２は中性親水性アミノ酸であってよく、または
Ｘｂ２３はＳもしくはＬであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの付加的な例示的実施形態は、配列番号３７に示す重鎖可変領域を有するものを含む。
配列番号３７
ＱＸＢ１ＱＬＶＱＳＧＸＢ２ＥＸＢ３ＸＢ４ＫＰＧＡＳＶＫＸＢ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＢ６ＱＸＢ７ＸＢ８ＧＸＢ９ＸＢ１０ＬＥＷＸＢ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＢ１２ＸＢ１３ＸＢ１４ＸＢ１５ＴＸＢ１６ＤＸＢ１７ＳＸＢ１８ＳＴＡＹＭＸＢ１９ＬＸＢ２０ＳＬＸＢ２１ＳＥＤＸＢ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＢ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
ＸＢ１はＩもしくはＶであってよく、
ＸＢ２はＰもしくはＡであってよく、
ＸＢ３はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ４はＶもしくはＫであってよく、
ＸＢ５はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ６はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ７はＳもしくはＡであってよく、
ＸＢ８はＨもしくはＰであってよく、
ＸＢ９はＫもしくはＱであってよく、
ＸＢ１０はＳもしくはＧであってよく、
ＸＢ１１はＩもしくはＭであってよく、
ＸＢ１２はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ１３はＡもしくはＶであってよく、
ＸＢ１４はＩもしくはＴであってよく、
ＸＢ１５はＬもしくはＩであってよく、
ＸＢ１６はＶもしくはＡであってよく、
ＸＢ１７はＫもしくはＴであってよく、
ＸＢ１８はＳもしくはＴであってよく、
ＸＢ１９はＱもしくはＥであってよく、
ＸＢ２０はＮもしくはＳであってよく、
ＸＢ２１はＴもしくはＲであってよく、
ＸＢ２２はＳもしくはＴであってよく、または
ＸＢ２３はＳもしくはＬであり、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
実施形態によれば、重鎖可変ドメイン変異体は、配列番号３８〜４１のいずれか１つに示す配列を有し得る。
配列番号３８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号３９
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号４０
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号４１
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
細胞における抗体の産生
本明細書において開示されている抗ＫＡＡＧ１抗体は、ハイブリドーマ技術または組み換えＤＮＡ法などの、当業者によく知られている様々な方法で製造することができる。
本発明の例示的実施形態において抗ＫＡＡＧ１抗体（例えば、これと共に開示される抗体と競合し得る抗体）は、従来のハイブリドーマ技術によって生成することが可能であり、このハイブリドーマ技術においては、マウスを抗原で免疫化し、脾臓細胞を単離し、ＨＧＰＲＴ発現が欠失した骨髄腫細胞、ならびにヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミン（ＨＡＴ）含有培地によって選択されるハイブリッド細胞と融合する。
本発明の付加的な例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、組み換えＤＮＡ方法によって生成され得る。
抗ＫＡＡＧ１抗体を発現させるために、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つまたはその他をコードできるヌクレオチド配列を、発現ベクター（即ち、特定の宿主に挿入されたコーディング配列の転写用および翻訳制御用のエレメントを含むベクター）に挿入してもよい。これらのエレメントは、エンハンサー、構成プロモータ、誘導性プロモータ、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域などの調節配列を含んでいてもよい。当業者に周知の方法を使用すれば、この種の発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。
本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列由来のポリペプチドまたはＲＮＡを発現させる目的に利用可能な発現ベクター／宿主細胞系としては、当業者に公知の様々なものがあり得る。これらには、組み換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バクロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクターもしくは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるが、これらに限定されない。哺乳類系における組み換えタンパク質の長期産生のために、細胞系における安定な発現を実施できる。例えば、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列は、同じかまたは別のベクター上にウイルス性複製起点および／または内因性発現エレメント、ならびに選択可能遺伝子または可視マーカー遺伝子を含み得る発現ベクターを使用して細胞系中に形質転換され得る。本発明は、使用されるベクターまたは宿主細胞に制限されない。本発明の或る実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を、それぞれ別の発現ベクター中にリゲートさせて、各鎖を別々に発現させ得る。別の実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできる軽鎖および重鎖の両方を、１つの発現ベクター中にリゲートさせて、同時に発現させ得る。
別法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系またはカップリングしたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系をそれぞれ使用して、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含むベクターから、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドを発現させてもよい。
一般的に、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含有する宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を介してコードされるポリペプチドを発現する宿主細胞もしくはその一部は、当業者に公知の様々な手順で同定され得る。これらの手順としては、ＤＮＡ／ＤＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、ならびに核酸もしくはアミノ酸配列の検出、および／または定量を目的とする膜ベース、溶液ベースもしくはチップベースの技術を包含するタンパク質バイオアッセイ、または免疫測定技術が挙げられるが、これらに限定されない。特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用してポリペプチドの発現を検出し測定するための免疫学的方法は、当該技術分野において公知である。そのような技術の例としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。当業者であれば、これらの方法論を本発明に容易に適合させることができるであろう。
したがって、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）を転写させるための条件下で、および／または細胞培養物からポリペプチドを発現させるための条件下で培養できる。細胞が産生したポリペプチドは、配列および／または使用されたベクターに応じて分泌されることもあれば、細胞内に保持されることもあり得る。例示的実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜経由でのポリペプチド分泌を指図するシグナル配列を含むように設計できる。
遺伝コードに固有の縮重のため、同じであるか実質的に同じあるかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を産生でき、そのＤＮＡ配列を使用して、例えば、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を介してコードされるポリペプチドを発現させることができる。本発明のヌクレオチド配列を、当該技術分野において一般的に公知の方法を使用してエンジニアリングすることによって、限定はされないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現の修飾を含む様々な目的に対応するようにヌクレオチド配列を改変できる。ヌクレオチド配列をエンジニアリングする場合、遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドをランダムにフラグメント化しＰＣＲで再アセンブリすることによる、ＤＮＡシャフリングを利用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性の部位特異的突然変異誘発を使用して、制限部位の新規作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先度の変更、スプライス変異体の産生などの突然変異を導入できる。
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現したポリペプチドを処理する能力に関して、所望の様式で選択できる。そのようなポリペプチドの修飾としては、限定はされないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。例証的実施形態においては、特定のグリコシル化構造またはパターンを含む抗ＫＡＡＧ１抗体が所望され得る。また、ポリペプチドの「プレプロ」形態を開裂する翻訳後プロセッシングを使用して、タンパク質のターゲティング、フォールディング、および／または活性を規定することもできる。特異的な細胞機構、および翻訳後活性に特有の機構を有する様々な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷ１３８）が市販されており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。また、これらの宿主細胞を選択することによって、発現したポリペプチドの適正な修飾およびプロセッシングが保証され得る。
天然、修飾、または組み換え核酸配列を異種配列とリゲートさせると、結果として、上記の宿主系のいずれにおいても、異種ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドが翻訳される。このことは、当業者であれば容易に理解するであろう。市販の親和性マトリックスを使用すれば、そのような異種ポリペプチド部分を介して融合ポリペプチドの精製を促し得る。そのような部分としては、限定はされないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、およびモノクローナル抗体エピトープなどの抗体エピトープが挙げられる。
他の更なる態様において本発明は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、完全軽鎖、完全重鎖、可変領域、ＣＤＲなど）に融合された融合パートナー（例えば、ＨＡ、Ｆｃなど）を含んでいてもよい。
また、当該技術分野において周知の化学的または酵素的方法を用いて、全体としてまたは部分的に、核酸およびポリペプチド配列を合成できることも、当業者であれば容易に理解するであろう。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術を利用して実施でき、ＡＢＩ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの機械を使用して合成を自動化できる。所望により、アミノ酸配列を合成中に改変し、かつ／または他のタンパク質由来の配列と組み合わせて、変異体タンパク質を産生できる。
抗体複合体
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能部分（即ち、検出もしくは診断目的に対応）または治療部分（治療目的に対応）と結合させ得る。
「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、および／または他の物理的手段を介して検出できる部分である。検出可能部分は、直接的および／または間接的のいずれかで（例えば、限定はされないが、ＤＯＴＡ結合またはＮＨＳ結合などの結合を介し）、当該技術分野において周知の方法を使用して、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントとカップリングされ得る。使用され得る検出可能部分は多岐にわたっており、その選択肢は、要求される感度、結合容易性、安定性要件、および利用可能な計装に依存する。好適な検出可能部分としては、限定はされないが、蛍光標識、放射性標識（例えば、限定はされないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１、ＰＥＴスキャナー用の陽電子放出アイソトープなどを含む）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（例えば、限定はされないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、量子ドットおよび／またはナノ粒子が挙げられる。検出可能部分は、検出可能なシグナルを誘発しかつ／または生成でき、それにより検出可能部分からのシグナルが検出可能になる。
本発明の別の例示的実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、治療部分（例えば、薬剤、細胞傷害性部分、抗癌剤）とカップリング（修飾）され得る。
例証的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体および抗原結合性フラグメントは、化学療法剤、細胞傷害性剤または抗癌剤（例えば、小分子）を含んでもよい。そのような化学療法剤または細胞傷害性剤としては、限定はされないが、イットリウム９０、スカンジウム４７、レニウム１８６、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、および当業者に認知されているその他多くのもの、例えば、ルテチウム（例えば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（例えば、Ｂｉ２１３）、銅（例えば、Ｃｕ６７）が挙げられる。他の例においては、化学療法剤、細胞傷害性剤または抗癌剤は、当業者に公知のもののなかでも、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、タキサン、シュードモナスエンドトキシン、リシン、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ）、マイタンシノイド（例えば、メルタンシン）および他の毒素から構成され得る。
別法として、本発明の方法および当該技術分野において公知の方法を実施するために、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（結合または非結合）を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントに特異的に結合でき、かつ所望される検出可能部分、診断部分または治療部分を有し得る第２の分子（例えば、二次抗体など）と組み合わせて使用できる。
抗体の医薬組成物およびその使用
抗ＫＡＡＧ１抗体または抗原結合性フラグメント（結合または非結合）の医薬組成物もまた、本発明に包含される。医薬組成物は抗ＫＡＡＧ１抗体または抗原結合性フラグメントを含んでもよく、また薬学的に許容可能な担体も含んでいてよい。
本発明の他の態様は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと、担体と、を含み得る組成物に関する。
本発明はまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと薬学的に許容可能な担体とを含み得る、医薬組成物に関する。
活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、生理食塩水、ゼラチン、油、アルコール類、ならびに活性化合物を薬学的に使用してもよい調製物に加工し易くする他の賦形剤および助剤を含んでなる薬学的に許容可能な担体を含み得る。他の例においては、この種の調製物を滅菌してもよい。
本明細書において「医薬組成物」は、薬学的に許容可能な希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と合わせた治療有効量の薬剤を意味する。本明細書において「治療有効量」とは、所与の状態および投与レジメンに関して治療効果が得られる量を指す。そのような組成物は、液体であるか、または凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥された配合物であり、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸着防止のためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質または等張性改良剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中へのもしくはその粒子状調製物上への、或いはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層ベシクル、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への物質の移入。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響する。制御放出組成物または持続放出組成物には、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の配合物が包含される。また、ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も、本発明に包含されている。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害物質、または非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路を含めた様々な投与経路に対応した透過促進剤を取り入れている。一実施形態において、医薬組成物は、非経口、癌近傍、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内および腫瘍内投与される。
更に、本明細書において「薬学的に許容可能な担体」または「医薬担体」は当該技術分野において公知であり、０．０１〜０．１Ｍもしくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％生理食塩水を包含するが、これらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容可能な担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンガーデキストロース系、およびこれらに類するものが挙げられる。保存料および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、照合剤、不活性ガス、およびこれらに類するものもまた、存在し得る。
どのような化合物についても治療有効量は、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌもしくはブタなどの動物モデルのどちらかで推定できる。動物モデルはまた、濃度範囲および投与経路を決める場合に使用され得る。それゆえ、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決める場合にも使用され得る。これらの技術は当業者に周知であり、治療有効量とは、病徴または症状を改善する活性成分の量を指す。治療効果および毒性は、細胞培養においてまたは実験動物を用い、標準の薬剤的手順で、例えばＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算して比較対照することによって定量できる。上述した治療組成物はいずれも、この種の治療を必要とするあらゆる被検対象（限定はされないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルおよびヒトなどの哺乳動物を含む）に適用できる。
本発明において使用される医薬組成物は、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸手段を含めた任意の数の経路によって投与できる。
本開示の目的ための用語「治療」は、治療的処置と予防または防止的処置の両方を指し、ここで、目的は標的化された病的状態または障害を予防もしくは減速（軽減）させることにある。治療を必要としている人としては、既に障害を有する人、障害を有しがちな人、または障害を予防すべき人が挙げられる。特に、必要としている被験対象としては、より高いレベルの１種以上の癌マーカーを有する被験対象が挙げられる。
抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントは、卵巣癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、黒色腫などの様々な癌種の治療において、治療上の効能を有し得る。より具体的な実施形態において、被験対象は、例えば、再発性卵巣癌を有し得る。更に別の実施形態において、被験対象は、例えば、転移性癌を有し得る。
場合によっては、抗ＫＡＡＧ１抗体およびフラグメントは、ＫＡＡＧ１とそのタンパク質パートナーとの相互作用をブロックし得る。本発明の抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１を発現する細胞に治療部分を送達する目的に、特に使用され得る。
抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントは、様々な種類の卵巣癌の治療において、治療上の効能を有し得る。数種の細胞腫は、それぞれ異なる卵巣癌組織型を生じ得る。最も一般的な形態の卵巣癌は、卵巣または卵管の上皮細胞層に由来する腫瘍を含む。そのような上皮卵巣癌としては、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性腫瘍、明細胞腫瘍、および境界性腫瘍が挙げられる。他の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントは、生殖系および性索卵巣癌などの他の種類の卵巣癌の治療において効能を有する。
場合によっては、抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントを、同じ状態に対して施される他の治療と組み合わせて同時に投与し得る。よって、抗体を、抗有糸分裂剤（例えば、タキサン）、白金系薬剤（例えば、シスプラチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ドキソルビシン）および当業者に公知の他の抗癌治療薬と共に投与し得る。他の例においては、抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントを、他の治療抗体と共に投与し得る。これらの抗体には、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０およびＨｅｒ２を標的とする抗体が包含されるが、これらに限定されない。
本発明は、その更なる態様において、ＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法に関し、この方法は、本明細書に記載されている有効量の抗体または抗原結合性フラグメントに細胞を接触させる工程を含み得る。
本発明はまた、哺乳動物における癌の治療方法、またはＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法も包含し、この方法は、例えば本明細書に記載されている治療部分に結合している抗体または抗原結合性フラグメントを、必要とする被検対象に投与する工程を含み得る。
更なる態様において本発明は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを使用した治療方法、診断方法および検出方法を提供すると共に、そのような目的に対応した医薬組成物もしくは薬物の製造における、これらの抗体または抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
ゆえに、本発明は、癌の治療（に対応した医薬組成物の製造）における、本明細書に記載されている単離抗体または抗原結合性フラグメントの使用に関する。
抗体または抗原結合性フラグメントは、より具体的には、例えば、転移能力を有する悪性腫瘍、および／または足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）で特徴づけられる腫瘍細胞を含めた悪性腫瘍に適用可能であり得る。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントはまた、癌の診断にも使用し得る。癌の診断癌の診断は、癌を有するかもしくは癌を有する疑いのある哺乳動物に対して本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで実施できる。診断はまた、哺乳動物から採取された試料を抗体または抗原結合性フラグメントに接触させ、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞（腫瘍細胞）の有無を判別することによって、ｅｘ ｖｉｖｏで実施され得る。
ゆえに、本発明はまた、哺乳動物における癌を検出する方法またはＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントを必要とする被検対象に投与する工程を含み得る。
本発明は、その別の態様において、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を検出する方法に関し、この方法は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントに細胞を接触させる工程と、抗体およびＫＡＡＧ１発現細胞またはＫＡＡＧ１変異体発現細胞によって形成される複合体を検出する工程と、を含み得る。検出方法に使用される抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合され得るものである。
検出方法に使用される抗体または抗原結合性フラグメントの他の例示的実施形態は、腫瘍細胞の表面に発現されるＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体に結合するものである。
本明細書に記載されている治療方法、検出方法または診断方法を必要としていてその方法から恩恵を受ける被検対象は、卵巣癌（例えば、漿液性、類内膜、明細胞もしくは粘液性）、皮膚癌（例えば、黒色腫、扁平上皮細胞癌腫）、腎臓癌（例えば、乳頭細胞癌腫、明細胞癌腫）、結腸直腸癌（例えば、結腸直腸癌腫）、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌（例えば、乳房癌腫）、前立腺癌（例えば、前立腺癌腫）、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍（例えば、肺癌腫）または頭頸部腫瘍を有するかもしくは有する疑いのある被検対象であり、特に癌が悪性であることで特徴づけられる場合、および／またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞が足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）で特徴づけられる場合である。
癌を有する被験対象は、画像診断、組織生検、遺伝子試験で同定され得る。別法として、癌を有する被験対象は、標準アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、およびこれに類するもの）を使用して体液中に癌が存在するかどうかを基準に同定され得る。
本発明に特に包含されるのは、卵巣癌（例えば、漿液性、類内膜、明細胞もしくは粘液性）、皮膚癌（例えば、黒色腫、扁平上皮細胞癌腫）、または腎臓癌（例えば、乳頭細胞癌腫）を有するかもしくは有する疑いのある患者であり、とりわけ癌が悪性であることで特徴づけられる場合、および／またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞が足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）で特徴づけられる場合である。
本発明の別の態様は、配列番号２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１（配列番号２９）、ＫＡＡＧ１変異体、またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体の分泌形態もしくは循環形態を検出する方法に関し、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞、またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を含むかまたは含むことが疑われる試料（生検、血清、血漿、尿など）を、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと接触させる工程と、結合を測定する工程と、を含んでもよい。試料は、癌（例えば、卵巣癌、転移性癌）を有するかまたは癌（例えば、卵巣癌、転移性癌）を有することが疑われる、哺乳動物（例えば、ヒト）由来であり得る。試料は、哺乳動物から採取される組織試料、または細胞培養物の上澄みであり得る。
本発明によれば、試料は、哺乳動物から採取される血清試料、血漿試料、血液試料、精液または腹水であり得る。本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１の分泌形態または循環（血中で循環する）形態を有利に検出できる。
この方法は、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体に結合する抗体または抗原結合性フラグメントによって形成される複合体を定量する工程を含み得る。
抗体が抗原に結合すると、抗原の予想分子量が増大する。ゆえに、抗体または抗原結合性フラグメントが抗原と特異的に結合すると、物理的変化が起こる。
そのような変化は、例えば、電気泳動の後に、ウエスタンブロット、およびゲルまたはブロットの着色、質量分析法、コンピュータとＨＰＬＣとの接続、ＦＡＣＳなどを利用することにより検出できる。分子量におけるシフトを計算できる他の装置は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）が挙げられる。
抗体が、例えば検出可能な標識を含む場合、抗原−抗体複合体は、標識によって放出される蛍光、標識の放射線放出、その基質を用いて得られる標識の酵素活性などにより検出できる。
抗体または抗原結合性フラグメントと抗原との間の結合の検出および／または測定は、当該技術分野において公知の様々な方法によって実施できる。抗体または抗原結合性フラグメントと抗原との間の結合は、検出可能な標識（放射線放出、蛍光、変色など）を介し、放出されたシグナルを検出できる装置を使用すれば、モニタリングできる。そのような装置は、発生時点の結合を示すデータを提供し、抗原に結合した抗体の量に関する指標も提供し得る。（通常、コンピュータに接続した）装置によって、バックグラウンドシグナル（例えば、抗原−抗体結合の不在下で得られるシグナル）またはバックグラウンドノイズと、特異的抗体−抗原結合によって得られるシグナルと、の差を計算することもできる。ゆえに、そのような装置は、抗原が検出されたかどうかに関する指標および結論をユーザーに提供し得る。
本発明の更なる態様は、本明細書に記載されている１種以上の抗体または抗原結合性フラグメントを含む１種以上の容器を具備し得るキットに関する。
核酸、ベクターおよび細胞
通常は抗体が細胞内で生成され、軽鎖および重鎖をコードする核酸配列を含むベクターから発現される軽鎖および重鎖の発現を可能にする。
ゆえに、本明細書に記載されているＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖のいずれかをコードできる核酸は、本発明に包含される。
ゆえに、更なる態様において本発明は、ＫＡＡＧ１に特異的に結合できる抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードする核酸に関する。
本発明の核酸の例示的実施形態は、
ａ．配列番号８に示されているもしくは配列番号８を含むＣＤＲＬ１、
ｂ．配列番号９に示されているもしくは配列番号９を含むＣＤＲＬ２、または
ｃ．配列番号１０に示されているもしくは配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列
を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を含む。
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る軽鎖可変領域をコードし得る。
また、本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域をコードし得る。
本発明はまた、
ａ．配列番号５に示されているもしくは配列番号５を含むＣＤＲＨ１配列、
ｂ．配列番号６に示されているもしくは配列番号６を含むＣＤＲＨ２配列、または
ｃ．配列番号７に示されているもしくは配列番号７を含むＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコードする核酸に関する。
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２またはＣＤＲＨ３からなる少なくとも２つのＣＤＲを含み得る重鎖可変領域をコードし得る。
本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＨ１と、１つのＣＤＲＨ２と、１つのＣＤＲＨ３と、を含み得る重鎖可変領域をコードし得る。
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体をコードする核酸もまた、本発明に包含される。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が少なくとも２つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が３つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が少なくとも１つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が少なくとも２つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が３つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明の他の態様は、配列番号４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸に関する。
本発明の更に他の態様は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％配列同一性を有する重鎖可変領域をコードする核酸に関する。
更に別の態様において本発明は、本明細書に記載されている核酸を含むベクターに関する。
本発明によれば、ベクターは発現ベクターであり得る。
特定の宿主に挿入されたコーディング配列の転写用および翻訳制御用のエレメントを含むベクターは、当該技術分野において公知である。これらのエレメントは、エンハンサー、構成プロモータ、誘導性プロモータ、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域などの調節配列を含んでいてもよい。この種の発現ベクターを構築する目的に使用できる方法は、当業者に周知である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。
別の態様において本発明は、本明細書に記載されている核酸、抗体または抗原結合性フラグメントを含み得る単離された細胞に関する。
単離された細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸および重鎖可変領域をコードする核酸を、別個のベクター上または同じベクター上のいずれかに含んでいてもよい。単離された細胞はまた、軽鎖をコードする核酸および重鎖をコードする核酸を、別個のベクター上または同じベクター上のいずれかに含んでいてもよい。
本発明によれば、細胞は抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現、アセンブル、および／または分泌できる。
別の態様において本発明は、本明細書に記載されている抗体を含有し得るかつ／または発現し得る細胞を提供する。
本発明によれば、細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸と重鎖可変領域をコードする核酸とを含み得る。
細胞は抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現させる、アセンブルする、および／または分泌する能力を有し得る。
以下の実施例は、本発明の詳細を更に概説するために提示してある。
実施例１
この実施例では、ＫＡＡＧ１に対する抗体３Ａ４の結合について説明する。
ＫＡＡＧ１に結合する抗体を、Ａｌｅｒｅファージ提示技術を用いて生成した。この技術、およびこれらの抗体の生成方法の詳細説明は、米国特許第６，０５７，０９８号明細書に見出され得る。加えて、ＫＡＡＧ１に対する抗体の生成の詳細説明は、ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６号明細書に見出され得る。概括して言えば、この技術は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）を提示するファージライブラリのストリンジェントなパニングを利用する。数回のパニング後、Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌと称するライブラリが得られた。このＯｍｎｉｃｌｏｎａｌは、極めて高い親和性および特異性でＫＡＡＧ１に結合する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む組み換えＦａｂに富んでいた。このライブラリ（より正確にはＯｍｎｉｃｌｏｎａｌ ＡＬ０００３ Ａ２ＺＢと称する）から、９６の個々の組み換えモノクローナルＦａｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製し、ＫＡＡＧ１結合について試験した。この９６ウェルプレートのモノクローナル抗体から、組み換えＫＡＡＧ１に対するその高い結合活性、および卵巣癌細胞表面上のＫＡＡＧ１に対する親和性に基づいて、３Ａ４と称するモノクローナルを誘導した。
重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖の可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１および３に示し、重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖の可変領域のポリペプチド配列をそれぞれ配列番号２および４に示す。３Ａ４重鎖免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ配列番号５、６および７に示し、３Ａ４軽鎖免疫グロブリンのＣＤＲをそれぞれ配列番号８、９および１０に示す。
ＦａｂモノクローナルとＫＡＡＧ１タンパク質との間の相互作用の研究が実施される可能性はさておき、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究の有意義な実施に関して、Ｆａｂの用途は、抗原の生物学的機能の検証に限定される。ゆえに、３Ａ４のＦａｂに含まれる軽鎖可変領域および重鎖可変領域を完全抗体スカフォールドに転移させて、マウス−ヒトキメラＩｇＧ１を生成させる必要があった。軽および重免疫グロブリン鎖の両方の発現ベクターを、ｉ）Ｆａｂ発現ベクターの上流の元の細菌シグナルペプチド配列が哺乳類シグナルペプチドおよびｉｉ）マウス抗体中の軽定常領域および重鎖定常領域がヒト定常領域で置換されるように構築した。この転移を実施するための方法には、当業者に周知の標準的分子生物学技術が使用された。以下、その方法論について簡単に概説する。
軽鎖発現ベクター − ２９３Ｅ一過性トランスフェクション系において使用されるように設計された、ｐＴＴＶＨ８Ｇ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）と呼ばれる既存の哺乳類発現プラスミドを、マウス軽鎖可変領域に適合するように修飾した。結果として得られたマウス−ヒトキメラ軽鎖は、マウス可変領域とそれに続くヒトカッパ定常ドメインとを含んでいた。ヒトカッパ定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、プライマーＯＧＳ１７７３およびＯＧＳ１７７４（それぞれ配列番号１１および１２）を使用してＰＣＲにより増幅した。ヒトカッパ定常領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および１４に示す。結果として得られる３２１塩基対ＰＣＲ産物を、ヒトＶＥＧＦ Ａ（ＮＭ＿００３３７６）のシグナルペプチド配列のすぐ下流のｐＴＴＶＨ８Ｇ中にリゲートさせた。このクローニング工程ではまた、マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの正確な位置決定を可能にする独自の制限エンドヌクレアーゼ部位の位置決定も行った。ｐＴＴＶＫ１と呼ばれる最終発現プラスミドの配列を配列番号１５に示す。配列番号３に示す３Ａ４軽鎖可変配列に基づいて、その５’末端で、ＶＥＧＦ Ａシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同一の配列を組み入れた、軽鎖可変領域に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。このプライマーの配列を配列番号１６に示す。逆方向プライマー（配列番号１７）は、その３’末端で、ヒトカッパ定常ドメインの最初の２０塩基対と同一の配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメントおよび消化されたｐＴＴＶＫ１の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理した結果、相補的末端が得られ、これらの相補的末端どうしをアニーリングによって結合した。アニーリング反応をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に変換し、マウス軽鎖可変領域がｐＴＴＶＫ１発現ベクター中に適切に挿入されることを保証するため、シーケンシングによって発現プラスミドを検証した。
重鎖発現ベクター − ３Ａ４の重鎖免疫グロブリンを産生した発現ベクターを、軽鎖免疫グロブリンの産生について前述したｐＴＴＶＫ１と同様の方法で設計した。ヒトＩｇＧＫシグナルペプチド配列だけでなくＩｇＧ１のヒトＦｃドメインのＣＨ２領域およびＣＨ３領域も含むプラスミドｐＹＤ１１（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）を、ヒト定常ＣＨ１領域をコードするｃＤＮＡ配列をリゲートさせることによって修飾した。独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計されたＰＣＲプライマーＯＧＳ１７６９およびＯＧＳ１７７０（配列番号１８および１９）を使用して、配列番号２０および２１に示すヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域を増幅した。ＩｇＧＫシグナルペプチド配列のすぐ下流のヒトＣＨ１の３０９塩基対フラグメントをリゲートした後、修飾されたプラスミド（配列番号２２）をｐＹＤ１５と指定した。選択された重鎖可変領域をこのベクター中にリゲートした場合、結果として得られたプラスミドは、ヒト定常領域を有する完全ＩｇＧ１重鎖免疫グロブリンをコードする。その５’末端でＩｇＧＫシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同一の配列を組み入れた、抗体３Ａ４（配列番号１）の重鎖可変領域に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。このプライマーの配列を配列番号２３に示す。逆プライマー（配列番号２４）は、その３’末端で、ヒトＣＨ１定常ドメインの最初の２０塩基対と同一の配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメントおよび消化されたｐＹＤ１５の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理した結果、相補性末端が得られ、これらの相補性末端どうしをアニーリングによって結合した。アニーリング反応をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に変換し、マウス重鎖可変領域がｐＹＤ１５発現ベクター中に適切に挿入されることを保証するため、シーケンシングによって発現プラスミドを検証した。
２９３Ｅ細胞におけるヒト３Ａ４キメラＩｇＧ１の発現 − 軽鎖および重鎖免疫グロブリンをコードした、上記の調製された発現ベクターを、一過性トランスフェクション系を用いて２９３Ｅ細胞において発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。組織培養培地中で抗体の最高収率を達成するための軽鎖：重鎖の比を最適化し、９：１（Ｌ：Ｈ）であることが判明した。
キメラ３Ａ４のＫＡＡＧ１への結合 − ３Ａ４モノクローナル抗体の相対的結合を測定するために、大規模な一過性トランスフェクション技術を用いて２９３Ｅ細胞において組み換えヒトＫＡＡＧ１を産生した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，２００４）。Ｆｃ融合タンパク質としてのヒト組み換えＫＡＡＧ１の発現および精製は、ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６号明細書に記載されている。抗体調製物に対するＦｃ−ＫＡＡＧ１の結合を実施するために、Ｆｃ−ＫＡＡＧ１をＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でビオチニル化し、１０ｎｇ／ウェルをストレプトアビジン９６ウェルプレート中で室温にて１時間コーティングした。精製されたキメラ３Ａ４を高濃度で添加し、室温にて３０分間インキュベートした。ＨＲＰ結合ヒト抗カッパ軽鎖抗体を用いてＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）の存在下で結合した抗体を検出し、マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取りを行った。図１に示すように、３Ａ４は固定化されたＫＡＡＧ１タンパク質と用量依存的に相互作用した。対照の非関連ＩｇＧを組み換えＫＡＡＧ１と共にインキュベートしたときに、極めて高い濃度においてさえも、結合活性が全く観測されなかった。この結果から、３Ａ４がヒトＫＡＡＧ１に結合することが実証された。３Ａ４の結合を、別のエピトープ特異性を有するキメラ３Ｄ３（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｆｉｌｉｏｎ（２００９）に記載）の結合と比較した（実施例２を参照）。この種のアッセイにおいて、３Ａ４の結合活性は３Ｄ３に極めて類似している（図１を参照）。
実施例２
この実施例は、ＫＡＡＧ１のどの領域に３Ａ４抗体が結合するかを判別するための、エピトープマッピング研究について説明する。
３Ａ４抗体によって結合するＫＡＡＧ１の領域を更にデリニエートするために、ＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を発現させ、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。完全長ＫＡＡＧ１に関して、トランケートされたバージョンをＰＣＲで増幅し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＹＤ５中にリゲートさせた。使用したプライマーを順方向オリゴヌクレオチドを、配列番号２６および２７のプライマーを用いて配列番号２５に示す配列と組み合わせて、それぞれＫＡＡＧ１のアミノ酸番号６０および３５を末端とするＦｃ融合フラグメントを産生した。これらの組み換え突然変異体の発現は、完全長Ｆｃ−ＫＡＡＧ１について前述のように実施し、タンパク質−Ａアガロースで精製した。
Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｆｉｌｉｏｎ（２００９）の教示に基づいて、他の抗体が組み換えＫＡＡＧ１の特異的領域と相互作用したことが判明した。ゆえに、抗ＫＡＡＧ１抗体３Ｃ４、３Ｄ３、および３Ｇ１０はそれぞれＫＡＡＧ１の領域１〜３５、３６〜６０、および６１〜８４と相互作用した。これらの結合結果を再現し、図２に示す。３Ａ４抗体を介して結合されているＫＡＡＧ１内の領域を判別するために、実施例１に記載されているのと類似のプロトコールに従い、ＫＡＡＧ１のトランケートされたＦｃ融合物を使用してＥＬＩＳＡを実施した。修正した点は、別のビオチニル化Ｆｃ−ＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を使用したことだけである。結果から明らかなように、３Ａ４の結合特異性は３Ｇ１０と類似していた。アミノ酸６０を超えるアミノ酸配列を有さないＫＡＡＧ１突然変異体においては、ＫＡＡＧ１への３Ａ４の結合は起こらない。これは、３Ａ４が、ヒトＫＡＡＧ１のアミノ酸６１〜８４によってデリニエートされる領域と相互作用することを示す。ＥＬＩＳＡ（実施例１）で測定されたように、３Ａ４および３Ｄ３は、結合活性が実質的に同一である反面、エピトープ特異性が極めて多様である。この観測は、３Ａ４の結合特性が３Ｄ３とは全く異なることを示唆している。
実施例３
この実施例では、３Ａ４がＫＡＡＧ１癌細胞系の表面上に結合する能力について説明する。
フローサイトメトリーを使用して、細胞系の表面上のＫＡＡＧ１を検出した。ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡ特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ発現分析に基づいて、選択された癌細胞系が、ＫＡＡＧ１タンパク質を発現させることを予期した。これを検証すべく、卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ）および対照細胞系が呈したＫＡＡＧ１の発現（２９３Ｅ）量は極めて少なかった。５ｍＭのＥＤＴＡを使用して細胞を回収し、ヘモサイトメーターで計数して、ＦＣＭバッファー（０．５％ＢＳＡ、ヤギ血清１０μｇ／ｍｌ含有の１×ＰＢＳ）中に２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度にて再懸濁した。キメラ３Ａ４または対照ＩｇＧを終濃度５μｇ／ｍｌで１００μｌの細胞に添加し、氷上で２時間インキュベートした。細胞を冷却ＰＢＳ中で洗浄し非結合抗体を除去してから、二次抗体としての（１：２００で希釈した）ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧを含有するＦＣＭバッファー１００μｌ中に再懸濁して、氷上で４５分間インキュベートした。冷却ＰＢＳ中での別途の洗浄工程に続いて、細胞を２５０μｌのＦＣＭバッファー中に懸濁し、フローサイトメーターで分析した。この実験の結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。細胞系を対照抗体と共にインキュベートし、その結果、細胞から抗体が除外されたときに一般的に得られるシグナルに対応したヒストグラムが作成された。これにより、これらのＦＣＭ値のバックグラウンド信号が確立された（図３Ａおよび図３Ｂ）。対照的に、ＳＫＯＶ−３、ＴＯＶ−２１Ｇを３Ａ４キメラ抗体と共にインキュベートした結果、強い蛍光信号が得られた（図３Ａ）。このことは、これらの癌細胞表面上のＫＡＡＧ１が抗体によって効率的に検出されること示す。２９３Ｅ細胞（ヒト腎臓細胞系）は、ＫＡＡＧ１の発現をごく僅かしか示さないことが予期されており、実際にもＦＣＭヒストグラムは対照抗体と比べてほとんどシフトを示さなかった（図３Ｂを参照）。ゆえに、３Ａ４によって、癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１が特異的に検出された。３Ａ４の活性を３Ｄ３（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｆｉｌｉｏｎ（２００９）の教示に記載されている抗ＫＡＡＧ１抗体）と比較した。この特許出願に基づき、３Ｄ３は癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１をＦＣＭで測定して検出できることが判明した。このことは、３Ｄ３をＳＫＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ細胞の存在下でインキュベートしたときに確証された（図３Ａを参照）。蛍光信号が３Ａ４に比べると高くなかったことは、３Ａ４は卵巣癌細胞表面上のＫＡＡＧ１を検出する能力が多様化しかつ向上したことを示す。発明者らの研究室で得られた他の結果は、３Ａ４が、このアッセイにおいて３Ｄ３が活性を呈さない条件下で、癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１を検出できたことを示す（結果は図示せず）。これらの観測、および３Ａ４のエピトープ特異性が３Ｄ３と比べて異なることを考え合わせると、これらの抗体の抗ＫＡＡＧ１特性がそれぞれ異なることがわかる。
実施例４
３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を抗体複合体として使用する方法
上記に実証したように、フローサイトメトリーを使用して癌細胞の表面上の３Ａ４によって、ＫＡＡＧ１抗原が検出された。抗体が細胞表面上の標的に結合した時点で発生し得る分子イベントは数とおり存在しており、これらの分子イベントには、ｉ）別の細胞表面抗原／レセプタまたは配位子へのアクセシビリティがブロックされること、ｉｉ）比較的安定な抗体−抗原複合体の形成によって、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して細胞の標的化が可能になること、ｉｉｉ）アゴニスト抗体によって例証されるように、シグナリングイベントが発生し得ること、ｉｖ）複合体が内在化され得ること、またはｖ）複合体が細胞表面から除去され得ることが包含される。本論点に対処するため、発明者らは細胞表面の３Ａ４抗体ーＫＡＡＧ１複合体の挙動を調査することを望んだ。実施例３に記載されているように、ＳＫＯＶ−３細胞を平板培養し、洗浄し、５μｇ／ｍｌのキメラ３Ａ４抗体と共にインキュベートした。洗浄後に、完全なＯＳＥ培地を添加し、細胞を３７℃で最大９０分間置いておく。指示された時間に細胞を除去し（図４を参照）、急冷して、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧを用いてサイトメトリー用に調製した。その結果は、存続分の平均蛍光強度のパーセンテージ（平均蛍光強度、％）として表された。図４に例示するように、蛍光シグナルは３０〜４５分間で急速に減少する。この結果は３Ａ４／ＫＡＡＧ１複合体が細胞から消失したことを示し、これにより、複合体の内在化が発生する可能性が高いことが示唆された。こうした細胞表面蛍光の減少を司る機序を解明するための予備研究により、複合体が内在化したらしいことが認められた。
これらの調査結果は、この内在化が顕微鏡によって観察し得るかどうか知るために、生細胞に対して免疫蛍光検査を実行することによって更に確証された。完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸および抗生物質を含有するＯＳＥ培地（Ｗｉｓｅｎｔ））中のカバーグラス上に、ＳＫＯＶ−３細胞を播種した。いったん細胞が正しく付着した後、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体を含む新鮮な培地を１０ｕｇ／ｍｌにて添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中で）２０分間固定した。細胞を洗浄した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ中で５分間透過化処理した。１．５％粉ミルク含有ＰＢＳを用い、１時間ブロッキングを行った。抗ＬＡＭＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１８８２１，ｄｉｌｕｔｅｄ １：１００）と共に１．５％ミルク含有ＰＢＳ中で２時間インキュベートして、リソソーム関連の膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）を検出した。ＰＢＳ中で洗浄した後、二次抗体を１．５％ミルク中に共に添加し、１時間インキュベートした。抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体に対する二次抗体は、１：３００に希釈したＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった。抗ＬＡＭＰ１抗体に対する二次抗体は、１：３００に希釈したＤｙＬｉｇｈｔ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった。両方の二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製であった。カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬の上にかぶせた。図５Ａに示すように、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞の存在下にて３７℃で４時間インキュベートした後、主に核周囲領域付近の複合体中に３Ａ４抗体を検出できた（矢印で指した、図５Ａの左パネルの赤い染色を参照）。これは、エンドソーム−リソソームベースの内在化経路に典型的なものであった。この観測は、リソソームマーカー（即ち、ＬＡＭＰ１）を視覚化して、これらの領域内においても発現していることが見出されたときに、更に確証された（矢印で指した、図５Ａの中央パネルの緑色の染色を参照）。重要なことに、２つの画像をマージすると、その結果、黄橙色の構造の外観から、３Ａ４抗体および抗ＬＡＭＰ１抗体が同一構造内に存在していることが判明した（矢印で指した、図５Ａの右パネルの黄色の染色を参照）。癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１に結合する３Ａ４と、ＬＡＭＰ１（即ち、後期エンドソーム／リソソームのマーカー）との共局在性は、抗体／抗原複合体が内在化されたことを示すほか、この複合体がペイロードの放出に敏感に反応する経路を追従し、３Ａ４抗体に結合されるであろうことも示す。別の癌細胞系であるＴＯＶ−２１Ｇにおいても、同一の結果が観測された（図５Ｂを参照）。
これらの研究を考え合わせることによって、ＫＡＡＧ１に特異的な抗体（例えば、３Ａ４）が抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）としての用途を有し得ることが実証された。ゆえに、ＫＡＡＧ１の高レベルの卵巣癌特異性と、この標的が細胞内で内在化される能力との組み合わせによって、ＡＤＣとして用途の展開が支持される。
実施例５
癌細胞表面上のＫＡＡＧ１の好適な検出
ＫＡＡＧ１タンパク質の種々のエピトープと相互作用する抗体をいくつか作成したが、ＫＡＡＧ１が無傷の癌細胞表面上に発現した場合の、これらのエピトープのアクセシビリティについては部分的にしか解明されなかった。ＫＡＡＧ１の主要アミノ酸構造の生物情報科学分析では、（ヒトタンパク質内のアミノ酸総数は８４であり）、膜貫通ドメインに対応し得る明白な配列は何も認められなかった。ゆえに、ＫＡＡＧ１がどのように細胞膜に固定されたかは、完全には分からなかった。
ＫＡＡＧ１に対して生成された抗体は、ＫＡＡＧ１タンパク質内の３つの異なる領域に結合されていることが明らかにされた（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６号明細書を参照）。ほとんどの抗体はＫＡＡＧ１タンパク質内のアミノ酸３５〜６０と相互作用する。これは本出願における抗体３Ｄ３および３Ｇ１２によって例証されている。アミノ酸６１〜８４間のＫＡＡＧ１のカルボキシ末端と相互作用する抗体は、抗体３Ａ４によって例証されている。最後に、タンパク質のアミノ末端領域と相互作用する抗体は、３Ｃ４によって例証されるように、ＫＡＡＧ１を発現する細胞と極めて僅かしか結合しないことを示した。
ＫＡＡＧ１が細胞内に発現している場合は、カルボキシ末端領域（アミノ酸６１〜８４）が細胞外空間に露出していることと、この領域を標的化する抗体がＫＡＡＧ１陽性細胞を最も効率的に検出し、かつこのＫＡＡＧ１陽性細胞を場合によっては処置し得ることが、本出願によって示されている。ＫＡＡＧ１（アミノ酸３５〜６０）の中央領域に結合する抗体はまた、細胞表面上のＫＡＡＧ１を検出するが、その検出の程度はカルボキシ末端と相互作用する抗体よりも低い。
ＳＫＯＶ−３などの卵巣癌細胞系は、ＫＡＡＧ１の発現に対して陽性である。これらの細胞を使用して、フローサイトメトリーでＫＡＡＧ１の発現を検出した。このフローサイトメトリーは、細胞表面タンパク質の検出を可能にする方法であり、当業者に周知である。概括して言えば、試料ごとに１００，０００細胞を１μｇ／ｍｌの濃度にて氷上で一次抗体（抗ＫＡＡＧ１または対照抗体のいずれか一方）と共に１時間インキュベートした。氷冷したＰＢＳで数回洗浄した後、細胞に結合する一次抗体を検出する蛍光色素（ＦＩＴＣ）に結合した二次抗体と共に、染色された細胞をインキュベートした。更に数回洗浄した後、細胞をフローサイトメーターで分析した。図６に表された結果は、カウント（細胞）の数値を表すＹ軸、および蛍光（蛍光シグナル）の量を表すＸ軸を示す。ＳＫＯＶ−３細胞を３Ａ４抗体と共にインキュベートしたときに、蛍光における大きな変動が観測された。このことは、細胞表面上に多量のＫＡＡＧ１タンパク質が存在しており（図６Ａ）、それがこの抗体によって効率的に認識されたことを示唆している。同一の条件下で、ＫＡＡＧ１の中央領域と相互作用する抗体、即ち、３Ｇ１２および３Ｄ３（図６Ａ）は、ＫＡＡＧ１を検出する効果が有意に低かった。細胞を高濃度の３Ｇ１２または３Ｄ３と共にインキュベートしたときに、細胞表面上にＫＡＡＧ１を検出できた（不図示）。細胞を対照ＩｇＧ（図６Ａ）、または３Ｃ４、即ちＫＡＡＧ１のアミノ末端に対する抗体（図６Ａ）のいずれか一方と共にインキュベートしたときに、シグナルは全く観測されなかった。これらの結果から、ＫＡＡＧ１の他の領域に対して差し向けられた抗体よりもＫＡＡＧ１のカルボキシ末端と相互作用する抗体の方が、癌細胞表面上の抗原を効率的に検出できることがわかった。これは、ＫＡＡＧ１のカルボキシ末端が細胞外（外部）細胞スペースに露出していることを示唆している。ＫＡＡＧ１を発現する他の癌細胞系に関して、類似の結果が得られた。
実験はまた、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化処理されたＳＫＯＶ−３細胞において実施された。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は典型的に、細胞膜の透過化処理、および膜タンパク質の放出に使用される。透過化処理された細胞を３Ａ４と共にインキュベートしてフローサイトメーターで測定したときに（図６Ｂを参照）、シグナルは無傷細胞において得られるシグナルと類似していた。顕著にも、透過化処理された細胞を、ＫＡＡＧ１の中央領域に結合する３Ｇ１２抗体と共にインキュベートしたときに（図６Ｂ）、シグナルは３Ａ４と同程度の強度であった。これらの結果は、ＫＡＡＧ１の中央領域が細胞膜にまたは細胞内部に存在する可能性の高いことを示している。３Ｄ３抗体（別の中央領域バインダー）に関しても類似の結果が得られた（図６Ｂ）。ただし、３Ｄ３に関して得られたシグナルは、それほど強くなかった。前と同様、このアッセイにおいてＩｇＧ対照は、検出可能なシグナルを全く示さなかった（図６Ｂ）。興味深いことに、ＫＡＡＧ１のアミノ領域に結合する３Ｃ４抗体と共に細胞をインキュベートしても、結果として、検出可能なシグナルが全く得られなかった（図６Ｂ）。この最後の結果は、タンパクから細胞膜への転移中にＫＡＡＧ１のアミノ領域が開裂する可能性の高いことを示唆している。
全般的に、これらの実験は、ＫＡＡＧ１抗原が癌細胞表面上に発現する場合に、ＫＡＡＧ１抗原の構造および配向に関して多くの洞察を提供する。これらのデータに基づき、細胞表面におけるＫＡＡＧ１の構造を示す２つのモデルを提示する（図７）。データが示唆するところによれば、第１のモデル（図７のモデルＡ）において、中央部分は実際、細胞外スペースに部分的にしか露出されていないＫＡＡＧ１の膜貫通領域である。このため、ＫＡＡＧ１のカルボキシ末端の検出が容易である反面、中央領域の結合が困難になっている。第２のモデル（図７のモデルＢ）においてＫＡＡＧ１は、それ自体が細胞膜に埋め込まれている他のタンパク質を介して膜に固定されている。また、カルボキシ末端は３Ａ４などの抗体を介して容易にアクセスできるが、ＫＡＡＧ１とタンパク質パートナーとの間の相互作用があると、中央領域へのアクセスが困難になるであろう。結果から、透過化処理された細胞の存在下で試験された（３Ａ４によって例証される）カルボキシ末端バインダーおよび（３Ｇ１２および３Ｄ３によって例証される）中央領域バインダーの両方からなる抗体が、両方のモデルと一致していることがわかった。３Ｃ４抗体が無傷または透過化処理された細胞内のＫＡＡＧ１に結合できないことは、ＫＡＡＧ１の成熟した処理済み膜形態のアミノ末端内に含有されるアミノ酸が欠乏していることに起因する可能性が高く、両方のモデルがこれと一致している。
これらの結果は、癌細胞内（特に、アミノ酸６１〜８４にまたがる領域内）のＫＡＡＧ１のカルボキシ末端を標的とする抗体が、ＫＡＡＧ１を発現する癌腫の治療用の治療薬として使用される抗体の作製に最も適していることを暗示している。加えて、カルボキシ末端領域に結合するＫＡＡＧ１抗体の用途としては、ほかにも、ＫＡＡＧ１を発現する癌腫の検出用の診断試薬が挙げられる。
３Ａ４抗体に類似した結合特異性を有する抗体または抗原結合性フラグメントは、ハイブリドーマ技術をはじめとする当該技術分野において公知の方法に従い、動物をＫＡＡＧ１のＣ末端部分で免疫化することにより、生成または単離され得る。この方法は、抗体または抗原結合性フラグメントのライブラリをＫＡＡＧ１のＣ末端部分でスクリーニングする工程、および／または本明細書に記載されている３Ａ４抗体を使用して単離抗体または抗原結合性フラグメントの競合アッセイを実施する工程を含む。
実施例６
３Ａ４マウスモノクローナル抗体の設計によるヒト化
マウス３Ａ４モノクローナル抗体の可変領域の３Ｄモデリング
このタスクを相同性モデリングによって達成した。ＢＬＡＳＴ検索にて、軽鎖および重鎖（配列番号４および２）のネズミ３Ａ４可変領域配列に最も類似する鋳型構造を、ＰＤＢと突き合わせて同定した。マウス３Ａ４可変領域の初期モデルを構築するため、次の鋳型構造（ＰＤＢコード）：軽鎖に対しては２ＩＰＵ（鎖Ｌ）、および重鎖に対しては１Ｆ１１（鎖Ｂ）を使用した。他の好適な鋳型は、軽鎖用ＰＤＢエントリ２ＤＤＱ、ならびに重鎖用ＰＤＢエントリ３ＩＹ３、１ＫＴＲ、２ＶＸＴ、１Ａ６Ｔおよび１ＩＧＩにおいて見出され得る。これらの鋳型構造に対して、ネズミ３Ａ４配列（２ＩＰＵ軽鎖における７つの突然変異、ならびに１Ｆ１１重鎖における１７の突然変異および３つの残基欠失）に従って必要な突然変異を作用させた。ネズミ３Ａ４可変領域の重鎖および軽鎖に対応する突然変異構造を、それぞれの鋳型構造の重鎖および軽鎖に重ね合わせることによって、２本鎖抗体構造にアセンブルした。ＡＭＢＥＲ力場でエネルギーを最小化し、初めて弛緩されたＣＤＲループから最後のステージでのみ完全に弛緩したフレームワーク領域の主鎖重原子までの範囲に及ぶ制約を段階的に解放することによって、３Ａ４可変領域をアセンブルした結果として得られた構造をまずリファイニングした。次いで、モンテカルロ最小化（ＭＣＭ）立体配座サンプリングによって各抗体可変領域構造におけるＣＤＲ−Ｈ３ループをリファイニングし、ここでＣＤＲ−Ｈ３領域内の二面角を各ＭＣＭサイクルでサンプリングしてから、ＣＤＲ−Ｈ３ループの初期立体配座の周辺で１０Åにて延在する所定の領域のエネルギーを最小化した。マウス３Ａ４抗体においてモデリングされた可変領域の表現を図８に示す。また、各３Ａ４可変配列に最も類似するヒトまたはヒト化可変配列の構造をＰＤＢから同定し、次いでネズミ３Ａ４可変領域のモデリング済み構造の上に重ね合わせた。これらの構造には、軽鎖用ＰＤＢエントリ３ＱＣＴ、３ＡＡＺ、１ＷＴ５および３Ｍ８Ｏ、および重鎖用ＰＤＢエントリ１Ｉ９Ｒ、３ＮＦＰ、１Ｔ０４、１ＺＡ６、３ＨＣ４、２Ｄ７Ｔおよび１ＷＴ５が含まれる。これらの構造を使用して、フレームワーク領域における突然変異のモデリングに役立て、それにより、モデリングされたネズミ３Ｄ構造から開始されるヒト化３Ｄ構造を構築した。
マウス３Ａ４アミノ酸配列およびモデリングされた構造の特性評価
この工程を実施して、ヒューマネス指数、抗原接触傾向指数、抗原接触傾向指数を推定し、ＣＤＲ、カノニカル残基、鎖間パッキング（ＶＨ／ＶＬ界面の残基）、可変領域／定常領域パッキング（ＶＨ／ＣＨおよびＶＬ／ＣＬ界面の残基）、異常なフレームワーク残基、潜在的ＮおよびＯグリコシル化部位、埋設された残基、バーニアゾーン残基、およびＣＤＲへの近位度をデリニエートした。これらの特性を評価するため、インターネットで利用可能なリソースおよびローカルソフトウェアを使用した。
マウスＣＤＲ用の最良のヒト軽鎖および重鎖フレームワークの選択
この選択は、標準配列相同性をヒト生殖細胞系データベース（ＶＢＡＳＥ）のローカルコピー、他の配列ライブラリ（ＧｅｎｂａｎｋおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）のほか、一連のヒトフレームワークコンセンサス配列にも突き合わせて比較することによって行われた。ＢＬＡＳＴ検索を実行し、フレームワーク領域内に限定して（ゆえに、ＣＤＲを除外して）最高の相同性と一致すると同時にＣＤＲループの長さとも一致する配列を取得した。ｋ２およびｈ１クラスに対応している３Ａ４抗体の軽鎖および重鎖に対してそれぞれ、ヒトフレームワークを同定した。いくつかのヒト生殖細胞系フレームワーク配列のなかで３Ａ４フレームワーク配列に最も類似しているものを、これらのクラスのヒトコンセンサス配列に加えて保持した。
復帰突然変異に対するフレームワーク残基の同定、および複数のヒト化変異体の設計
この工程は、対応するヒト配列に突然変異すべきアミノ酸残基に特に慎重に標識付けするうえで重要である。これらの残基は、親和性の損失の場合、マウス配列への復帰突然変異の一次候補を表す。この工程は、特に抗体−抗原複合体の実験的構造の不在下では、設計上最も困難で予測不可能なヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ）工程であり、次のカテゴリ（カノニカル、ＣＤＲ−Ｈ３、バーニアゾーン、異常、ＣＤＲに近位（５Å以内）、鎖間パッキング、およびグリコシル化部位残基）のうちの１つ以上における残基の同定に依存する。そのような残基は、抗原結合部位および親和性に直接または間接的に影響する可能性がある。抗原接触傾向指数だけでなく、ヒト生殖細胞系データベースにおける各位置でのアミノ酸発生もまた、或る残基がマウス配列からヒト配列に問題なく突然変異できるかどうかを判定するうえで、極めて重要となる。３Ａ４抗体軽鎖可変領域のヒト化は、１００％フレームワークにおけるヒト化に向けて提案されたヒト化フレームワークに対する１１突然変異を含み、３Ａ４抗体重鎖可変領域のヒト化は、１００％フレームワークにおけるヒト化に向けて提案されたヒト化フレームワークに対する２３突然変異を含む。これらの１００％ヒト化可変領域配列はそれぞれ、Ｌｖｈ１およびＨｖｈ１（配列番号３３および３８）と標識されている。慎重な構造的および比較的な配列分析に基づいて、３Ａ４マウス配列由来のいくつかの残基が保持されている付加的なヒト化配列もまた設計した。この配列分析は、これらの位置に突然変異が導入された場合に抗原結合親和性が改変される可能性の高いことを示唆している。これら可変領域の配列は、Ｌｖｈ２、Ｈｖｈ２、Ｈｖｈ３およびＨｖｈ４（配列番号３４、３９、４０および４１）と標識されている。
２つのヒト化軽鎖変異体（定常領域を含む）は、本明細書においてＬｈ１（配列番号４３）およびＬｈ２（配列番号４４）として同定されている。４つのヒト化重鎖変異体（定常領域を含む）は、本明細書においてＨｈ１（配列番号４６）、Ｈｈ２（配列番号４７）、Ｈｈ３（配列番号４８）およびＨｈ４（配列番号４９）として同定されている。２つのヒト化軽鎖および４つのヒト化重鎖は、８つのヒト化抗体（Ｌｈ１Ｈｈ１、Ｌｈ１Ｈｈ２、Ｌｈ１Ｈｈ３、Ｌｈ１Ｈｈ４、Ｌｈ２Ｈｈ１、Ｌｈ２Ｈｈ２、Ｌｈ２Ｈｈ３、およびＬｈ２Ｈｈ４）にアセンブルできる。これら全ての組み合わせに対応した分子モデルを、ネズミ３Ａ４可変領域の３Ｄモデルから開始される相同性モデリングで構築した。これらの分子モデルは、図９ａ〜９ｈに図示されている。
３Ａ４軽鎖ヒト化配列Ｌｖｈ２（配列番号３４）の場合、マウス配列由来のフレームワーク残基Ｖａｌ−Ｌ２およびＬｙｓ−Ｌ４５を保持した。これらを保持した理由は、残基Ｌ２が半埋設されていて、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３の両方に接触し、かつ抗原に接触する傾向を有する一方、残基Ｌ４５が重鎖に接近しているためである。発明者らは、これらのネズミ残基が両方ともヒトフレームワークにおいて発生し得ることに言及している。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ２（配列番号３９）の場合、マウス配列からのフレームワーク残基Ｉｌｅ−Ｈ２およびＬｙｓ−Ｌ７３が保持された。これらが保持された理由は、残基Ｈ２が半埋設されていて、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ３の両方に接触し、かつ抗原に接触する傾向を有する一方、残基Ｈ７３がＣＤＲ−Ｈ２を支持しているバーニアゾーンに属しているためであり、またこれらのネズミ残基が両方ともヒトフレームワークにおいて発生し得るためでもあった。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ３（配列番号４０）の場合、これらマウス配列由来のフレームワーク残基Ｉｌｅ−Ｈ４８、Ａｌａ−Ｈ６７、Ｌｅｕ−Ｈ６９およびＶａｌ−Ｈ７１に加えて、Ｉｌｅ−Ｈ２およびＬｙｓ−Ｌ７３復帰突然変異が保持された。これらを保持した理由は、これら全ての付加的なネズミ残基が、埋設された残基であり、ＣＤＲ−Ｈ２を支持しているバーニアゾーンに属するためであり、またネズミ残基Ｈ７１がヒトフレームワークにおいて発生し得るためでもある。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ４（配列番号４１）の場合、Ｈｖｈ３ヒト化変異体の復帰突然変異が６つとも全て組み入れられたのに加えて、付加的な２つのマウスフレームワーク残基Ｌｙｓ−Ｈ３８およびＬｙｓ−Ｈ６６も組み入れられた。これらは、ＣＤＲ−Ｈ２に近接している半埋設残基を表しているためである。結果として得られた、ネズミ鎖およびヒト化鎖のアミノ酸配列の一覧を、表１に示す。ネズミおよびヒト化軽鎖可変領域のアライメントを図１０ａに示し、ネズミおよびヒト化重鎖可変領域のアライメントを図１０ｂに示す。
図１１ａおよび図１１ｂはそれぞれ、ネズミ軽鎖可変領域を１００％ヒト化軽鎖可変領域にアライメントしたもの、およびネズミ重鎖可変領域を１００％ヒト化重鎖可変領域にアライメントしたものである。この図は、保持されているアミノ酸、および置換用に選択されたアミノ酸を図示したものである。
実施例７
３Ａ４ヒト化変異体抗体のアセンブリおよび発現
これらの調査の目的は、抗クラステリン抗体の動態パラメータを決定することにある。特に、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体のヒト化によって、そのモノクローナル抗体がヒトＫＡＡＧ１に結合している動態パラメータに影響が及ぶかどうか突き止めることを目的としている。この目的を果たすために、ＢｉｏＲａｄ社製のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６計器を使用して動態分析方法を策定した。ヒトＫＡＡＧ１をセンサーチップ上に固定した。全長抗体またはＦａｂフラグメントを注入し、固定されたＫＡＡＧ１と相互作用させた。
３Ａ４のキメラ（ネズミ）重鎖および軽鎖をコードするプラスミドの構築
元のネズミ免疫グロブリン鎖からのキメラ抗体重鎖および軽鎖をＰＣＲで増幅した。その際に使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、次のとおりである：重鎖、配列番号５０でコードされた５’オリゴ、および配列番号５１；軽鎖でコードされた３’オリゴ、配列番号５２でコードされた５’オリゴ、および配列番号５３でコードされた３’オリゴ。結果として得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで先に消化しておいたｐＫ−ＣＲ５（配列番号２１）にクローンした。
ヒト化重鎖３Ａ４変異体１、２、３および４をコードするプラスミドの構築
抗体３Ａ４（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）のヒト化重鎖領域をコードするフラグメントは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）から注文されたものである。Ｋｏｚａｋ配列および終止コドン配列を含んだＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、仔ウシの腸ホスファターゼ（ＮＥＢ）で先に脱リン酸化しておいたプラスミドｐＫ−ＣＲ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンして、再環状化を防いだ。図１２ａに、プラスミドｐＫ−ＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ−変異体１のマップを示す。ヒト化３Ａ４の全ての重鎖変異体を同様な方法で構築した。
ヒト化軽鎖３Ａ４変異体１および２をコードするプラスミドの構築
抗体３Ａ４（Ｌｈ１およびＬｈ２）ヒト軽鎖領域をコードするフラグメントは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文されたものである。Ｋｏｚａｋ配列および終止コドン配列を含んだＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、仔ウシの腸ホスファターゼ（ＮＥＢ）で先に脱リン酸化しておいたプラスミドｐＭＰＧ−ＣＲ５（配列番号５５）のＢａｍＨＩ部位にクローンして、再環状化を防いだ。図１２ｂに、プラスミドｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１のマップを示す。ヒト化３Ａ４の全ての軽鎖変異体を同様の方法で構築した。
一過性トランスフェクションの研究
メーカーの推奨事項に従い、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の小培養物から単離した。概括して言えば、リゲーションおよびトランスフォーメーションの後に、単一コロニーを選択して、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有のＬＢ培地２ｍｌを接種した。培養物を激しく（２５０ＲＰＭで）振盪して３７℃にて一晩インキュベートした。その後、キットに付属しているプロトコール、バッファーおよびカラムを使用して、１．５ｍｌの培養物からプラスミドを単離した。滅菌水５０μＬを使用してＤＮＡを溶出させた。メーカーの推奨事項に従い、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の大培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培養物２００ｍＬを新鮮な単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーと共に播種し、激しく（２５０ＲＰＭで）振盪して３７℃にて一晩インキュベートした。細菌（重鎖については１３０ｍＬの培養物、および軽鎖については１８０ｍＬの培養物）を６０００×ｇで遠心分離して４℃で１５分間ペレット化し、キットに付属しているプロトコール、バッファーおよびカラムを使用して、プラスミドを単離した。滅菌した５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中に精製済みプラスミドを再懸濁して、光学密度２６０ｎｍにて定量した。トランスフェクションに先立ち、精製済みプラスミドをフェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿により滅菌した。そのプラスミドを滅菌した５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中に再懸濁して、光学密度２６０ｎｍにて定量した。
トランスフェクションに先立ち、細胞（ＣＨＯ−ｃＴＡ）をＰＢＳで洗浄し、デキストラン硫酸を含まない成長培地（ＣＤ−ＣＨＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に４．０×１０６細胞／ｍｌの濃度で３時間懸濁培養液の形で再懸濁させた。プラスミドの組み合わせごとに、ＣＤＣＨＯ培地５ｍｌに各プラスミド１０μｇ／ｍｌおよびポリエチレンイミン５０μｇ／ｍｌ（ＰＥＩ Ｍａｘ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補給したものを徐々に添加して、細胞４５ｍｌをトランスフェクションした。終濃度は各プラスミドが１μｇ／ｍｌで、ＰＥＩが５μｇ／ｍ１であった。２時間後、細胞を３０℃でトランスフェクションした。翌日、デキストラン硫酸５０μｇ／ｍＬおよび各補助剤３．７５ｍｌ（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加し、３０℃で１３日間インキュベートした。４日目、６日目、８日目および１１日目にＦｅｅｄ Ａ２．５ｍｌとＦｅｅｄ Ｂ２．５ｍｌとを添加した。１３日目に、上澄みを遠心分離で澄ませて、０．２２μＭフィルタで濾過した。
ＣＲ５プロモータで調節された３Ａ４抗体のヒト化重鎖および軽鎖の種々の変異体をコードするプラスミドを用いて、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯｃＴＡ）をトランスフェクションした。軽鎖および重鎖の様々な組み合わせを用い、トランスフェクションを行った。対照としての細胞も、キメラ／ネズミ抗体をコードするプラスミドを用いて、同様にトランスフェクションした。
抗体の精製
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔａｃｅｌｌ−５０ｋ）カセットを使用して、ＣＨＯ細胞トランスフェクションからの上澄み１５ｍｌを遠心分離で１５００ｒｐｍにて濃縮した。メーカーの推奨事項に従い、Ｎａｂ ｓｐｉｎ ｋｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、濃縮された抗体（５５０μｌ）を精製した。その後、精製された抗体を、ＰＢＳを使用して脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）カセットを使用して、２５００ｒｐｍにて濃縮して最終体積２５０μｌにした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、精製された抗体をＯＤ２８０値の読み取りにより定量し、−２０℃で凍結させた状態に維持した。精製された抗体のアリコートを当量のＬａｅｍｍｌｉ ２Ｘ中に再懸濁し、９５℃で５分間加熱してから、氷冷した。標準曲線は、既知量のヒト骨髄腫血漿由来の精製ヒトＩｇＧ１カッパ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して作成された。試料をポリアクリルアミドＮｏｖｅｘ１０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）上で分離させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅｅ，ＱＣ）上に２７５ｍＡで１時間転移させた。膜を０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間ブロックし、Ｃｙ５と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃａｔ＃ １０９−１７６−０９９）と共に１時間インキュベートした。Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ＋スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）でスキャンすることによって、シグナルを露出して定量した。図１３に示すように、ＣＨＯ細胞内において３Ａ４ヒト化抗体変異体の全ての組み合わせが発現した。
実施例８
ネズミおよびヒト化３Ａ４抗体の動力学解析
補用品
ＧＬＭセンサーチップ、Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ、およびエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭナトリウム酢酸塩バッファーはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入された。ＨＥＰＥＳバッファー、ＥＤＴＡ、およびＮａＣｌはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入された。１０％のＴｗｅｅｎ２０溶液はＴｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入された。ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入された。ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された。
ゲル濾過
濃度３．１１４ｍｇ／ｍｌのＫＡＡＧ１タンパク質（容量２２０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５カラムに注入した。Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＨＢＳＴ泳動用バッファー（下記参照）中で０．４ｍｌ／ｍｉｎにて分離を行った。収集された画分の容量は５００μＬであった。拡張係数を５５００とし、ＭＷを８９６９として、各画分におけるＫＡＡＧ１の濃度をＯＤ２８０で定量した。図１４は、ＫＡＡＧ１のゲル濾過のプロファイルを表す。潜在的集合体（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の小ピークは、１１ｍｌ付近で溶出している。ＳＰＲアッセイ用の検体として使用されたタンパク質は、１３ｍｌで溶出したタンパク質（画分１５〜１９）であった。
ＳＰＲバイオセンサーアッセイ
全ての表面プラスモン共鳴アッセイは、ＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を使用し、ＨＢＳＴ泳動用バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４））で２５℃の温度にて実施された。標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：５希釈物を検体（水平）方向へ３０μＬ／ｍｉｎにて３００秒間注入することで活性化されたＧＬＭセンサーチップを使用して、抗マウスＦｃ捕捉表面を生成した。活性化の直後に、抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的抗体の溶液１３μｇ／ｍＬを１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）に溶かしたものを、約８０００共鳴単位（ＲＵ）が不動化されるまで、検体方向へ２５μＬ／ｍｉｎの流速にて注入した。１Ｍエタノールアミンを検体方向へ３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間注入することによって残りの活性基を急冷した。これにより、ブランク参照（ｂｌａｎｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）用のモック活性化インタースポットが確実に作成される。ＫＡＡＧ１に結合する３Ａ４変異体のスクリーニングは、２つの工程で発生した。３Ａ４変異体を細胞上澄みから抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面上にリガンド方向（垂直）へ間接的に捕捉し、続いて検体方向へＫＡＡＧ１を注入した。最初に、検体方向へバッファーを１００ｕＬ／ｍｉｎで３０秒間１回注入することによって、ベースラインを安定させた。３Ａ４の捕捉時に毎回、未精製３Ａ４変異体を含む細胞培養培地をＨＢＳＴで４％に希釈するか、または約１．２５μｇ／ｍＬの精製３Ａ４含有ＨＢＳＴを使用した。野生型３Ａ４と一緒に４〜５個の３Ａ４変異体を同時に、個々のリガンドチャネルに２５μＬ／ｍｉｎの流速で２４０秒間注入した。この結果、抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面に約４００〜７００ＲＵの飽和３Ａ４が捕捉された。第１のリガンドチャネルは、必要に応じてブランク対照として使用できるよう、ブランクのままにした。この３Ａ４捕捉工程の直後に、２種類のバッファーを検体方向へ注入してベースラインを安定させ、その後、ゲル濾過精製されたＫＡＡＧ１を注入した。典型的なスクリーニングで、５とおりのＫＡＡＧ１濃度（８、２．６６、０．８９、０．２９、および０．０９８ｎＭ）およびバッファー対照を同時に個々の検体チャネル内に５０μＬ／ｍｉｎにて１２０秒間注入し、６００秒の解離フェーズをおいて、結果として、捕捉された３Ａ４変異体ごとに、バッファー参照（ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によって一連の結合センサーグラムが得られた。抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的３Ａ４複合体を０．８５％リン酸の１８秒間隔のパルスで１００μＬ／ｍｉｎにて１８秒間再生成し、次の注入サイクル用に抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面を調製した。バッファーのブランク注入およびインタースポットを使用して、センサーグラムをアラインし二重参照してから、結果として得られたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．０を使用して分析した。ローカルＲｍａｘを使用し、参照されたセンサーグラムを１：１のラングミュア結合モデルに適合させることによって、動態値および親和性値を定量してから、結果として得られた速度定数（ｋｄ ｓ−１／ｋａ Ｍ−１ｓ−１）から親和性定数（ＫＤ Ｍ）を導き出した。
速度および親和性定数の定量
図１５は、ＫＡＡＧ１と精製ネズミ３Ａ４との相互作用、キメラとして一過性に発現したネズミ３Ａ４および一過性に発現したヒト化変異体に関する、会合（ｋａ、１／Ｍｓ）および解離（ｋｄ、１／ｓ）速度定数のほか、親和性（ＫＤ、Ｍ）定数の要約である。これらの定数を図１６にグラフで表す。純粋な親、キメラおよびヒト化３Ａ４変異体については、会合速度定数が極めて類似している（図１６ａ）。一過性に発現するキメラ３Ａ４は、純粋な親３Ａ４と比べて解離速度定数が類似しており、このことは、ＫＡＡＧ１と抗体との間の相互作用のパラメータが変更されなかったことを示唆している（図１６ｂ）。一方、全てのヒト化変異体は、オフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）が僅かに変わった（即ち、解離速度が迅速化した）と考えられ（図１６ｂ）、これは親和性定数に反映されている（図１６ｃ）。要約すると、ヒト化変異体の結合親和性（ｌｏｇＫＤ）と親抗体（ＬｃＨｃ）において生じた復帰突然変異の数との間には線形の相関が存在しており、突然変異の数が増加するにつれて結合親和性が減少する。しかしながら、マウス残基が全く保持されない最悪の変異体（Ｈ１Ｌ１、０．４７ｎＭ）と１０個のマウス残基が保持される最良の変異体（Ｈ４Ｌ２、０．１ｎＭ）とでは、結合親和性にたった４倍の差しかない。最後に、ＫＡＡＧ１に対する全ての変異体の結合親和性がサブナノモルであることが見出され、最良の変異体（Ｈ４Ｌ２、０．１ｎＭ）が示した親和性はネズミ（ＬｃＨｃ、０．０５７ｎＭ）の約６倍弱かった。全般的に、これらの結果は、全ての変異体がＫＡＡＧ１に対して極めて高い親和性を示すことを示唆しており、よって、ヒト化が成功したことがわかった。
実施例９
ＥＬＩＳＡにおけるＫＡＡＧ１に対する３Ａ４ヒト化変異体の結合
ＥＬＩＳＡ方法はまた、ヒト化３Ａ４変異体の結合活性をネズミ３Ａ４抗体と比較する目的にも使用された。組み換えヒトＫＡＡＧ１を９６ウェルプレート中で一晩コーティングし、洗浄して、室温で１時間インキュベートした結果、ネズミまたはヒト化３Ａ４変異体の量が増加した。別途の洗浄工程に続いて、ＨＲＰに結合した抗ヒト抗体をウェルに添加し、結合された３Ａ４抗体をＡｂｓ４５０にて熱量測定によって測定した。図１７Ａに示すように、ヒト化変異体（Ｌｈ１Ｈｈ１、Ｌｈ１Ｈｈ２、Ｌｈ１Ｈｈ３およびＬｈ１Ｈｈ４）は、ネズミ３Ａ４（ＬｃＨｃ）と比較して、ＫＡＡＧ１との結合が極めて類似していることを示した。この結果から、ヒト化重鎖変異体が４つとも全て、ヒト化軽鎖のＬ１変異体とアセンブルしたときに、元のｈ３Ａ４重鎖と同等であったことがわかった。図１７Ｂは、重鎖変異体を３Ａ４ヒト化軽鎖のＬｈ２変異体とアセンブルしたときの結果を示す。この例では、変異体の結合に差異があった。例えば、Ｌｈ２ｈｈ４は、ネズミ３Ａ４と比較して最も近いプロファイルを持つ変異体であった。これはＳＰＲデータと一致しており（実施例３を参照）、重鎖の変異体４がＫＡＡＧ１に対して最も高い親和性を有することを示した。これらの結合の結果を考え合わせると、このアッセイにおいては全てのヒト化変異体がヒトＫＡＡＧ１と相互作用することが明らかである。多少は微妙な差異があるが、ＥＬＩＳＡにおける結合はＳＰＲ結果と一致していた。
実施例１０
癌細胞の表面上での３Ａ４ヒト化変異体の結合
癌細胞の表面上に発現したＫＡＡＧ１に対してヒト化３Ａ４変異体が相互作用する能力を、フローサイトメトリーを使用して評価した。このために、先に述べたようにフローサイトメトリーで３Ａ４と効率的に結合したＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、８個のヒト化変異体および元のネズミ抗体と共にインキュベートした。手短に言うと、ＳＫＯＶ−３細胞をＥＤＴＡでプレートから分離させ、氷上で３．０ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌまたは０．３ｍｇ／ｍｌの抗体と共に１時間インキュベートした。３回の洗浄工程の後、細胞を二次抗体（ＦＩＴＣと結合した抗ヒトＩｇＧ）と共に氷上で１時間インキュベートした。フローサイトメーターで細胞表面の蛍光を測定した。その値を、図１８のヒストグラムに示す。図示するように、透過化処理された表面上のＫＡＡＧ１が全ての変異体によって検出できた。最も強い信号は３Ａ４抗体の最高濃度で（３ｍｇ／ｍｌ）で得られ、抗体の濃度が減少するにつれて減衰した。種々の変異体のなかでもネズミ復帰突然変異が最多のもの（図１８のＬｈ１Ｈｈ４およびＬｈ２Ｈｈ４を参照）は、細胞表面上のＫＡＡＧ１と相互作用し、最も高い活性を呈している。実際、Ｌｈ１Ｈｈ４およびＬｈ２ｈｈ４は、ネズミ３Ａ４抗体（ＬｃＨｃ）と比較して、ＫＡＡＧ１に対する細胞表面の結合の改善は僅かであったと考えられた。
文献（その内容は、本明細書において参照により援用されている）
− Ｊｅｍａｌ Ａ， Ｍｕｒｒａｙ Ｔ， Ｗａｒｄ Ｅ， Ｓａｍｕｅｌｓ Ａ， Ｔｉｗａｒｉ ＲＣ， Ｇｈａｆｏｏｒ Ａ， Ｆｅｕｅｒ ＥＪ ａｎｄ Ｔｈｕｎ ＭＪ． Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２００５． ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２００５； ５５： １０−３０．
− Ｍｅｎｏｎ Ｕ， Ｓｋａｔｅｓ ＳＪ， Ｌｅｗｉｓ Ｓ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ＡＮ， Ｒｕｆｆｏｒｄ Ｂ， Ｓｉｂｌｅｙ Ｋ， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｎ， Ｄａｗｎａｙ Ａ， Ｊｅｙａｒａｊａｈ Ａ， Ｂａｓｔ ＲＣ Ｊｒ， Ｏｒａｍ Ｄ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓ ＩＪ． Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００５； ２３（３１）：７９１９−２６．
− Ｂｏｎｏｍｅ Ｔ， Ｌｅｅ ＪＹ， Ｐａｒｋ ＤＣ， Ｒａｄｏｎｏｖｉｃｈ Ｍ， Ｐｉｓｅ−Ｍａｓｉｓｏｎ Ｃ， Ｂｒａｄｙ Ｊ， Ｇａｒｄｎｅｒ ＧＪ， Ｈａｏ Ｋ， Ｗｏｎｇ ＷＨ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＪＣ， Ｌｕ ＫＨ， Ｓｏｏｄ ＡＫ， Ｇｅｒｓｈｅｎｓｏｎ ＤＭ， Ｍｏｋ ＳＣ ａｎｄ Ｂｉｒｒｅｒ ＭＪ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｅｒｏｕｓ ｌｏｗ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， ｌｏｗ ｇｒａｄｅ， ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５； ６５： １０６０２−１０６１２．
− Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ａ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ， Ｂ． Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６； １２（２）： ３２３−３２７．
− Ｂｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ５ｔｈ ｅｄ． Ｌｏｎｄｏｎ： Ｂ．Ｃ． Ｄｅｃｋｅｒ， Ｉｎｃ．； ２０００． ｐｐ． １６８７−１７２０．
− Ｂｒｉｓｔｏｗ Ｒ．Ｅ． Ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０００； １２： ４７４−４８０．
− Ｂｒｏｗｎ Ｅ， Ｓｔｅｗａｒｔ Ｍ， Ｒｙｅ Ｔ， Ａｌ−Ｎａｆｕｓｓｉ Ａ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＲ， Ｂｒａｄｂｕｒｎ Ｍ， Ｓｍｙｔｈ Ｊ ａｎｄ Ｇａｂｒａ Ｈ． Ｃａｒｃｉｎｏｓａｒｃｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ： １９ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｎｔｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ２００４； １００： ２１４８−２１５３．
− Ｓｈｉｈ Ｌ−Ｍ ａｎｄ Ｋｕｒｍａｎ ＲＪ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ Ｔｕｍｏｒｓ： Ｎｅｗ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ Ｏｌｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５； １１（２０）： ７２７３−７２７９．
− Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＤ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ， Ｋｕｒｍａｎ ＲＪ． Ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ． Ｉｎ： Ｋｕｒｍａｎ ＲＪ， ｅｄｉｔｏｒ． Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ’ｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ． ５ｔｈ ｅｄ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； ２００２． ｐｐ． ７９１−９０４．
− Ｃａｎｎｉｓｔｒａ ＳＡ ａｎｄ ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＰ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００７； ２５（２０）： ２８６５−２８６６．
− Ｏｅｉ ＡＬ， Ｓｗｅｅｐ ＦＣ， Ｔｈｏｍａｓ ＣＭ， Ｂｏｅｒｍａｎ ＯＣ， Ｍａｓｓｕｇｅｒ ＬＦ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２００８； ３２（６）： １１４５−１１５７．
− Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ ＣＦ ａｎｄ Ｂｅｒｅｋ ＪＳ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２００５； ５（１）： ８７−９６．
− Ｂｕｒｇｅｒ ＲＡ． Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００７； ２５（２０）： ２９０２−２９０８．
− Ｓｉｍｏｎ Ｉ， Ｚｈｕｏ Ｓ， Ｃｏｒｒａｌ Ｌ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ， Ｓａｒｎｏ ＭＪ， Ｗｏｌｆｅｒｔ ＲＬ， Ｋｉｍ ＮＷ． Ｂ７−Ｈ４ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｍｅｒｋｅｒ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６； ６６（３）： １５７０−１５７５．
− Ｅｂｅｌ Ｗ， Ｒｏｕｔｈｉｅｒ ＥＬ， Ｆｏｌｅｙ Ｂ， Ｊａｃｏｂ Ｓ， ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ＪＭ， Ｐａｔｅｌ ＲＫ， Ｔｕｒｃｈｉｎ ＨＡ， Ｃｈａｏ Ｑ， Ｋｌｉｎｅ ＪＢ， Ｏｌｄ ＬＪ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＭＤ， Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ， Ｓａｓｓ ＰＭ， Ｇｒａｓｓｏ Ｌ． Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＯＲａｂ−００３， ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ． ２００７； ７： ６−１３．
− Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ＢＪ， Ｇａｕｇｌｅｒ Ｂ， Ｐｒｏｂｓｔ−Ｋｅｐｐｅｒ Ｍ， Ｍｉｃｈａｕｘ Ｌ， Ｄｅｖｕｙｓｔ Ｏ， Ｌｏｒｇｅ Ｆ， Ｗｅｙｎａｎｔｓ Ｐ， Ｂｏｏｎ Ｔ． Ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ａ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９９； １９０（１２）： １７９３−１７９９．
− Ｓｏｏｋｎａｎａｎ Ｒ， Ｔｒｅｍｂｌａｙ ＧＢ， Ｆｉｌｉｏｎ Ｍ． Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． ２００７； ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｕｎｄｅｒ Ｎｏ． ＷＯ／２００７／１４７２６５ ｏｎ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２７， ２００７．
− Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｊ， Ａｎｔｈｏｎｉ Ｈ， Ｄａｈｄｏｕｈ Ｆ， Ｋｏｎｉｇ ＩＲ， Ｈｉｌｌｍｅｒ ＡＭ， Ｋｌｕｃｋ Ｎ， Ｍａｎｔｈｅｙ Ｍ， Ｐｌｕｍｅ Ｅ， Ｗａｒｎｋｅ Ａ， Ｒｅｍｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ， Ｈｕｌｓｍａｎｎ Ｊ， Ｃｉｃｈｏｎ Ｓ， Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ＣＭ， Ｐｒｏｐｐｉｎｇ Ｐ， Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ Ｍ， Ｚｉｅｇｌｅｒ Ａ， Ｐｅｙｒａｒｄ−Ｊａｎｖｉｄ Ｍ， Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｋｏｅｒｎｅ Ｇ， Ｎｏｅｔｈｅｎ ＭＭ， Ｋｅｒｅ Ｊ． Ｓｔｒｏｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＤＣＤＣ２ ａｓ ａ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｄｙｓｌｅｘｉａ． Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ２００６； ７８： ５２−６２．
− Ｃｏｐｅ Ｎ， Ｈａｒｏｌｄ Ｄ， Ｈｉｌｌ Ｇ， Ｍｏｓｋｖｉｎａ Ｖ， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｊ， Ｈｏｌｍａｎｓ Ｐ， Ｏｗｅｎ ＭＪ， Ｏ’‘Ｄｏｎｏｖａｎ ＭＣ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ． Ｓｔｒｏｎｇ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ＫＩＡＡ０３１９ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６ｐ ｉｓ ａ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｓｌｅｘｉａ． Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ２００５； ７６： ５８１−５９１．
− Ｍｏｒ Ｇ， Ｖｉｓｉｎｔｉｎ Ｉ， Ｌａｉ Ｙ， Ｚｈａｏ Ｈ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｐ， Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｔ， Ｙｕｅ Ｌ， Ｂｒａｙ−Ｗａｒｄ Ｐ ａｎｄ Ｗａｒｄ ＤＣ Ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． ＰＮＡＳ ２００５； １０２： ７６７７−７６８２．
− Ｋｏｚａｋ ＫＲ， Ａｍｎｅｕｓ ＭＷ， Ｐｕｓｅｙ ＳＭ， Ｓｕ Ｆ， Ｌｕｏｎｇ ＭＮ， Ｌｕｏｎｇ ＳＡ， Ｒｅｄｄｙ ＳＴ ａｎｄ Ｆａｒｉａｓ−Ｅｉｓｎｅｒ Ｒ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． ＰＮＡＳ ２００３； １００： １２３４３−１２３４８．
− Ｂｅｎｏｉｔ ＭＨ， Ｈｕｄｓｏｎ ＴＪ， Ｍａｉｒｅ Ｇ， Ｓｑｕｉｒｅ ＪＡ， Ａｒｃａｎｄ ＳＬ， Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ Ｄ， Ｍｅｓ−Ｍａｓｓｏｎ ＡＭ， Ｔｏｎｉｎ ＰＮ． Ｇｌｏｂａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｘ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ２００７； ３０（１）： ５−１７．
− Ｃｏｄｙ ＮＡ， Ｚｉｅｔａｒｓｋａ Ｍ， Ｆｉｌａｌｉ−Ｍｏｕｈｉｍ Ａ， Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ ＤＭ， Ｍｅｓ−Ｍａｓｓｏｎ ＡＭ， Ｔｏｎｉｎ ＰＮ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ， ｓｐｈｅｒｏｉｄ， ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ３ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． ＢＭＣ Ｍｅｄ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００８； １（１） ：３４．
− Ｂｕｅｃｈｌｅｒ Ｊ， Ｖａｌｋｉｒｓ Ｇ， Ｇｒａｙ Ｊ． Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．２０００； Ｕ．Ｓ． ６，０５７，０９８．
− Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ， Ｋａｍｅｎ Ａ， Ｐｅｒｒｅｔ Ｓ， Ｐｈａｍ ＰＬ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． ２００２； Ｃａｎａｄｉａｎ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡ ２４４６１８５．
− Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅｍ．２００４； Ｕ．Ｓ． ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／６６２，３９２．
− Ｔｒｅｍｂｌａｙ ＧＢ， Ｆｉｌｉｏｎ Ｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｌｏｃｋ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ． ２００９； ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６．
− Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ， Ｋａｍｅｎ Ａ， Ｐｅｒｒｅｔ Ｓ， Ｐｈａｍ ＰＬ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． ２００２； Ｃａｎａｄｉａｎ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡ ２４４６１８５．
− Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅｍ．２００４； Ｕ．Ｓ． ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／６６２，３９２．
− Ｃｈａｎｇ ＭＨ， Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｓ ＬＥ， Ｍｅｉｋｌｅ ＰＪ． ＣＤ１０７ａ （ＬＡＭＰ−１） ａｎｄ ＣＤ１０７ｂ （ＬＡＭＰ−２）． ２００２； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ． １６：１４７−５１．
− Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ， ＫＲ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， ＡＣＲ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ． ２００８； Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４５， ３８３２−３８３９．
本明細書において参照される配列
配列番号１−３Ａ４重鎖可変領域ヌクレオチド配列
ＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＧＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２−３Ａ４重鎖可変領域ポリペプチド配列
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＭＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号３−３Ａ４軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＴＡＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ
配列番号４−３Ａ４軽鎖可変領域ポリペプチド配列
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＡＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＬＫ
配列番号５−３Ａ４重鎖ＣＤＲ１ポリペプチド配列
ＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳ
配列番号６−３Ａ４重鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮ
配列番号７−３Ａ４重鎖ＣＤＲ３ポリペプチド配列
ＤＰＧＡＭＤＹ
配列番号８−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ１ポリペプチド配列
ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
配列番号９−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＴＶＳＮＲＦＳ
配列番号１０−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ３ポリペプチド配列
ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ
配列番号１１−ＯＧＳ１７７３
ＧＴＡＡＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ
配列番号１２−ＯＧＳ１７７４
ＧＴＡＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ
配列番号１３−ヒトカッパ定常ヌクレオチド配列
ＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ
配列番号１４−ヒトカッパ定常ポリペプチド配列
ＡＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１５
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配列番号１６−ＯＧＳ１８５００
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配列番号１７−ＯＧＳ２０８４
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配列番号１８−ＯＧＳ１７６９
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配列番号１９−ＯＧＳ１７７０
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配列番号２０−ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域ヌクレオチド配列
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配列番号２１−ヒト免疫グロブリンＣＨ１領域ポリペプチド配列
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配列番号２２
ＣＴＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＡＡＧＡＴＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＣＧＡＡＣＴＡＡＡＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＡＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＴＴＣＡＡＴＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＡＧＣＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＣＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＡＴＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＴＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＴＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＣＣＣ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ＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＧＣＡＡＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＧＧＴ
配列番号２３−ＯＧＳ１８７９
ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧ
配列番号２４−ＯＧＳ１８１０
ＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＣ
配列番号２５
ＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣ
配列番号２６
ＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣ
配列番号２７
ＧＴＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣ
配列番号２８
ＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＣＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＡＡＴＴＧＣＣＣＣＣＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＣＣＧＴＴＧＣＧＧＴＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＧＡＴＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＣＴＡＧＧＣＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＡＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣＧＣＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＣＧＣＣＴＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＴＡ
配列番号２９
ＭＤＤＤＡＡＰＲＶＥＧＶＰＶＡＶＨＫＨＡＬＨＤＧＬＲＱＶＡＧＰＧＡＡＡＡＨＬＰＲＷＰＰＰＱＬＡＡＳＲＲＥＡＰＰＬＳＱＲＰＨＲＴＱＧＡＧＳＰＰＥＴＮＥＫＬＴＮＰＱＶＫＥＫ
配列番号３０（変異体軽鎖可変領域）
ＤＸＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＶＸＸＧＸＸＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＧＴＸＬＥＸＫ
（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換（保存的または非保存的）である。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る）。
配列番号３１（変異体軽鎖可変領域）
ＤＸａ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸａ２ＶＸａ３Ｘａ４ＧＸａ５Ｘａ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸａ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸａ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸａ９ＧＴＸａ１０ＬＥＸａ１１Ｋ
（配列中、
Ｘａ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ２はＡもしくはＰであってよく、
Ｘａ３は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ４はＬもしくはＰであってよく、
Ｘａ５は酸性アミノ酸であってよく、
Ｘａ６はＱもしくはＰであってよく、
Ｘａ７は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘａ８は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ９はＡもしくはＱであってよく、
Ｘａ１０は塩基性アミノ酸であってよく、または
Ｘａ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号３２（変異体軽鎖可変領域）
ＤＸＡ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＡ２ＶＸＡ３ＸＡ４ＧＸＡ５ＸＡ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＡ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＡ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＡ９ＧＴＸＡ１０ＬＥＸＡ１１Ｋ
（配列中、
ＸＡ１はＶもしくはＩであってよく、
ＸＡ２はＡもしくはＰであってよく、
ＸＡ３はＳもしくはＴであってよく、
ＸＡ４はＬもしくはＰであってよく、
ＸＡ５はＤもしくはＥであってよく、
ＸＡ６はＱもしくはＰであってよく、
ＸＡ７はＫもしくはＱであってよく、
ＸＡ８はＬもしくはＶであってよく、
ＸＡ９はＡもしくはＱであってよく、
ＸＡ１０はＲもしくはＫであってよく、または
ＸＡ１１はＬもしくはＩであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号３３（変異体１軽鎖可変領域：Ｌｖｈ１）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３４（変異体２軽鎖可変領域：Ｌｖｈ２）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３５（変異体重鎖可変領域）
ＱＸＱＬＶＱＳＧＸＥＸＸＫＰＧＡＳＶＫＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＱＸＸＧＸＸＬＥＷＸＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＸＸＸＴＸＤＸＳＸＳＴＡＹＭＸＬＸＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＶＴＶＳＳ
（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る）。
配列番号３６（変異体重鎖可変領域）
ＱＸｂ１ＱＬＶＱＳＧＸｂ２ＥＸｂ３Ｘｂ４ＫＰＧＡＳＶＫＸｂ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸｂ６ＱＸｂ７Ｘｂ８ＧＸｂ９Ｘｂ１０ＬＥＷＸｂ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸｂ１２Ｘｂ１３Ｘｂ１４Ｘｂ１５ＴＸｂ１６ＤＸｂ１７ＳＸｂ１８ＳＴＡＹＭＸｂ１９ＬＸｂ２０ＳＬＸｂ２１ＳＥＤＸｂ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸｂ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘｂ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ２はＰもしくはＡであってよく、
Ｘｂ３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ４はＶもしくはＫであってよく、
Ｘｂ５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ６は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ７はＳもしくはＡであってよく、
Ｘｂ８はＨもしくはＰであってよく、
Ｘｂ９は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１０はＳもしくはＧであってよく、
Ｘｂ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１２は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１４はＩもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１６は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１７はＫもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１８は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１９はＱもしくはＥであってよく、
Ｘｂ２０はＮもしくはＳであってよく、
Ｘｂ２１はＴもしくはＲであってよく、
Ｘｂ２２は中性親水性アミノ酸であってよく、または
Ｘｂ２３はＳもしくはＬであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号３７（変異体重鎖可変領域）
ＱＸＢ１ＱＬＶＱＳＧＸＢ２ＥＸＢ３ＸＢ４ＫＰＧＡＳＶＫＸＢ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＢ６ＱＸＢ７ＸＢ８ＧＸＢ９ＸＢ１０ＬＥＷＸＢ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＢ１２ＸＢ１３ＸＢ１４ＸＢ１５ＴＸＢ１６ＤＸＢ１７ＳＸＢ１８ＳＴＡＹＭＸＢ１９ＬＸＢ２０ＳＬＸＢ２１ＳＥＤＸＢ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＢ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
ＸＢ１はＩもしくはＶであってよく、
ＸＢ２はＰもしくはＡであってよく、
ＸＢ３はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ４はＶもしくはＫであってよく、
ＸＢ５はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ６はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ７はＳもしくはＡであってよく、
ＸＢ８はＨもしくはＰであってよく、
ＸＢ９はＫもしくはＱであってよく、
ＸＢ１０はＳもしくはＧであってよく、
ＸＢ１１はＩもしくはＭであってよく、
ＸＢ１２はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ１３はＡもしくはＶであってよく、
ＸＢ１４はＩもしくはＴであってよく、
ＸＢ１５はＬもしくはＩであってよく、
ＸＢ１６はＶもしくはＡであってよく、
ＸＢ１７はＫもしくはＴであってよく、
ＸＢ１８はＳもしくはＴであってよく、
ＸＢ１９はＱもしくはＥであってよく、
ＸＢ２０はＮもしくはＳであってよく、
ＸＢ２１はＴもしくはＲであってよく、
ＸＢ２２はＳもしくはＴであってよく、または
ＸＢ２３はＳもしくはＬであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号３８（変異体１重鎖可変領域：Ｈｖｈ１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３９（変異体２重鎖可変領域：Ｈｖｈ２）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４０（変異体３重鎖可変領域：Ｈｖｈ３）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４１（変異体４重鎖可変領域：Ｈｖｈ４）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４２ ３Ａ４ネズミ軽（カッパ）鎖
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＡＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４３ ３Ａ４ヒト化軽（カッパ）鎖変異体１；Ｌｈ１
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４４ ３Ａ４ヒト化軽（カッパ）鎖変異体２；Ｌｈ２
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４５ ３Ａ４ネズミ重（Ｉｇｇ１）鎖
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＭＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４６ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体１；Ｈｈ１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４７ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体２；Ｈｈ２
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４８ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体３；Ｈｈ３
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４９ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体４：Ｈｈ４
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号５０
ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣ
配列番号５１
ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ
配列番号５２
ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧ
配列番号５３
ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ
配列番号５４ ｐＫ−ＣＲ５
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配列番号５５ ｐＭＰＧ−ＣＲ５
ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＣＡＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＴＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧＴＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧＧＴＴＧＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＧＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＧＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＣＧＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣＧＧＧＣＧＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＣＧＴＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＡＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＧＧＣＧＴＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＡＴＣＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＣＣＣＧＡＣＡＧＴＣＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＧＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＡＴＡＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＣＧＣＴＣＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧＴＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＡＴＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＣＡＴＡＡＣＧＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＡＴＡＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＴＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡＣＴＴＴＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＧＡＣＡＧＡＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＣＴＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＧＧＧＡＴＧＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧＣＴＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧ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ＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＣＡＴＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴＡＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＧＧＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＧＴＧＡＣＣＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＴＡＧＧＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＴＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＴＧＣ
配列番号５６−３Ａ４ヒト化重鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧ

Claims (42)

  1. 配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５６に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２および配列番号７に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を有する腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）に特異的に結合する能力がある、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  2. 前記重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号２に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  3. 前記軽鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号４に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  4. 配列番号２、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４、配列番号３３または配列番号３４に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  5. ヒトフレームワーク領域と、重鎖可変領域の２位でＩｌｅ及び／または７３位でＬｙｓを含み、前記位置はＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  6. 更に、重鎖可変領域の４８位でＩｌｅ、６７位でＡｌａ、６９位でＬｅｕ及び／または７１位でＶａｌを含み、前記位置はＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  7. 更に、重鎖可変領域の３８位でＬｙｓ及び６６位でＬｙｓを含み、前記位置はＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  8. 軽鎖可変領域が、２位でＶａｌ及び／又は４５位でＬｙｓを含み、前記位置はＫａｂａｔナンバリングに従う、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  9. 前記抗体がヒトＩｇＧ１抗体の定常領域を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  10. 前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、ヒト化抗体、またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  11. 治療部分または検出可能部分に結合している、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  12. 細胞傷害性剤に結合している、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  13. 前記細胞傷害性剤がアウリスタチンを含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  14. 前記アウリスタチンがモノメチルアウリスタチンＥまたはモノメチルアウリスタチンＦを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
  15. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸または核酸の組み合わせ。
  16. 請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
  17. 発現ベクターである、請求項１６に記載のベクター。
  18. 請求項１５に記載の核酸、請求項１６若しくは１７に記載のベクターまたは請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、単離された細胞。
  19. 軽鎖可変領域をコードする核酸と重鎖可変領域をコードする核酸とを含む、請求項１８に記載の単離された細胞。
  20. 抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現させる、アセンブルする、および／または分泌する能力のある、請求項１９に記載の単離された細胞。
  21. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントと薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  22. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、担体とを含む、組成物。
  23. ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する単離された細胞、またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を含むか含む疑いのある試料を、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントに接触させる工程と、結合を測定する工程と、を含む、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を検出するための方法。
  24. 前記試料が、癌または転移性癌を有するか有する疑いのある被験対象に由来する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記試料が哺乳動物から採取された血清試料、血漿試料、血液試料または組織試料であるか、細胞培養物または上澄みである、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記ＫＡＡＧ１または前記ＫＡＡＧ１変異体に結合された抗体の量を定量する工程を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  27. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント、請求項１５に記載の核酸または請求項１６若しくは１７に記載のベクターを含むキット。
  28. ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を含む癌の検出、診断、または治療のための医薬の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、請求項２１に記載の医薬組成物または請求項２２に記載の組成物の使用。
  29. ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を含む癌の治療のための、請求項２１に記載の医薬組成物または請求項２２に記載の組成物。
  30. ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を含む腫瘍の検出または癌の診断に使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物または請求項２２に記載の組成物。
  31. 前記癌が卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の医薬組成物または組成物。
  32. 前記癌が卵巣癌である、請求項３１に記載の医薬組成物または組成物。
  33. 前記卵巣癌が再発性卵巣癌である、請求項３２に記載の医薬組成物または組成物。
  34. 前記癌が転移性である、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の医薬組成物または組成物。
  35. 請求項２１に記載の医薬組成物または請求項２２に記載の組成物を必要としている被検対象に投与する工程を含む、癌の治療方法において使用するための、請求項２４に記載の医薬組成物または請求項２５に記載の組成物。
  36. 前記必要としている被検対象が卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌および頭頸部癌からなる群から選択される癌を有するか有する疑いのある、請求項３５に記載の医薬組成物または組成物。
  37. 前記癌が卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳癌、甲状腺癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２８に記載の使用。
  38. 前記癌が卵巣癌である、請求項３７に記載の使用。
  39. 前記卵巣癌が再発性卵巣癌である、請求項３８に記載の使用。
  40. 前記癌が転移性である、請求項２８および３７から３９のいずれか一項に記載の使用。
  41. 請求項１８から２０のいずれか一項に記載の単離された細胞を培養し、抗体またはその抗原結合性フラグメントを生産する工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを作成する方法。
  42. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントを、治療部分または検出部分と結合させる工程を含む、請求項４１に記載の方法。
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