JP6464144B2 - ステアリドン酸の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、ステアリドン酸の精製の分野に関連する。

魚油や藻類等に多く含まれるω３系の脂肪酸であるα−リノレン酸（ＡＬＡ）やステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエンサン（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、高脂血症や動脈硬化の改善能を有し、さらに免疫や炎症反応などについても生理活性が報告されていることから、様々な用途に活用できる素材である（非特許文献１、特許文献１）。

しかしＥＰＡやＤＨＡを利用する際には酸化安定性の低さが問題となり、食品などへの応用が困難な場合がある。ＡＬＡは、ＥＰＡやＤＨＡと比較すると酸化安定性が高く、生体内においてＥＰＡのプレカーサーとなるが、生理活性の高さについてはＥＰＡやＤＨＡより低く、またＥＰＡへの変換効率が低いことが問題となっている（非特許文献２）。

一方で、ＡＬＡからＥＰＡに代謝される際の中間生成物であるＳＤＡは、ＥＰＡやＤＨＡより酸化安定性が高く、さらにＡＬＡよりＥＰＡへの変換効率が高いことから体内摂取後、ＥＰＡのプレカーサーとして利用できる可能性がある。

ＳＤＡの天然の供給源としては、麻やクロスグリ、エキウムの種子があり（特許文献２）、近年では遺伝子組み換えによってＳＤＡ含有大豆も開発されている（特許文献３）。アンチョビもまた、ＳＤＡの供給源であり、その漁獲量は年間約１０００万トンあることからＳＤＡの原料として期待されているものの、ＳＤＡ含有量が約３ｗｔ％程度と低く、精製が困難である。

脂肪酸の精製方法としては、分子蒸留法、クロマトグラフィー法、硝酸銀処理法、尿素付加法が公知（特許文献４、特許文献５）となっており、工業的規模においても利用可能であるものの、アンチョビ油などの原料からＳＤＡを効率よく精製する方法は存在しない。

特表２０１２−５３１９１１号公報 特表２００４−５３６８０１号公報 特表２０１２−５３１９１１号公報 特開平１１−２０９７８６号公報 特開平７−２４２８９５号公報

万倉三正および鹿山 光、「ＡＡ，ＥＰＡ，ＤＨＡの生理機能と利用」、ＡＡ，ＥＰＡ，ＤＨＡ−高度不飽和脂肪酸、鹿山光編、恒星社厚生閣（東京）、１９９５年、ｐｐ．２０７−２２４ Ｗａｌｋｅｒ ＣＧ ｅｔ ａｌ．、「Ｓｔｅａｒｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ω−３ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．」、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１３，２９，ｐｐ．３６３−３６９．

そのため、アンチョビ油などの原材料からＳＤＡを高純度および/または高収率で生産
・精製する方法が求められている。

ＳＤＡを含む原材料（例えば、アンチョビ油）からＳＤＡを分離精製するにあたり、エチルエステル化（例えば、（ａ）脂質分解酵素（例えば、リパーゼ）処理によるエチルエステル化、または、（ｂ）アルカリ処理によるエチルエステル化）と硝酸銀処理法を組み合わせることにより高品質且つ高純度なＳＤＡを高回収率で生産できることを見い出し、本発明を完成した。本発明においては、さらに、（１）薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によってＳＤＡエチルエステルを精製することによって、ＳＤＡ含有率８０ｗｔ％以上の精製品を得ることができる。また、本発明の生産方法においては、吸着剤を用いて、脂質の過酸化物、着色成分、原料由来の異物などの不純物を除去してもよい。

ＳＤＡエチルエステルのような脂肪酸エチルエステルの高度精製に際しては、従来、一般に長時間の蒸留などの高温処理を伴うため、臭い、色などの官能評価上の問題点を有していた。本発明の精製法は蒸留工程を含むものの、エチルエステル化反応（例えば、酵素反応もしくはアルカリ処理）および/または硝酸銀処理などを低温にて行うことにより、臭いや色などの官能評価上の問題を生じることなく、ＳＤＡエチルエステル含有率８０ｗｔ％以上の高品質のエチルエステルを取得することを可能とする。

本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
ステアリドン酸エチルエステルの生産方法であって、以下の工程：
（ａ）ステアリドン酸を含む出発原料を無水条件下において脂質分解酵素処理してステアリドン酸エチルエステルを生成し、ステアリドン酸エチルエステルを含む画分を調製する工程；
（ｂ）ステアリドン酸エチルエステルを含む画分に銀塩を含む水性媒体溶液を混合して、ステアリドン酸エチルエステルと銀の錯体を形成する工程；および
（ｃ）ステアリドン酸エチルエステルと銀との錯体を含む水性媒体相を分離し、該分離した水性媒体相に疎水性溶媒を添加して、該錯体から解離したステアリドン酸エチルエステルを含む疎水性媒体相を得る工程；
を包含する、方法。
（項目２）
さらに、
（ｄ）前記工程（ｃ）において得られた疎水性媒体相を、薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によって精製する工程、
を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
さらに、
（ｅ）前記工程（ｄ）によって得られた精製物を吸着剤処理して不純物を除去する工程、を包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記脂質分解酵素が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、および、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属からなる群から選択される属の細菌に由来するリパーゼである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記脂質分解酵素の反応条件が、以下：
反応温度が３０〜６０℃；
反応時間が６〜７２時間；および、
脂質分解酵素添加量が出発原料１ｇあたり５０〜１０００Ｕ
である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記、錯体を形成する条件が、以下：
反応温度が１０〜３０℃；および、
錯体を形成させる時間が５〜６０分；
であり、そして、錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる条件が、以下：
反応温度が３０〜８０℃；および、
錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる時間が５〜９０分；
である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記工程（ｄ）が薄膜式真空精密蒸留法であり、そして、蒸留装置塔頂の真空度が０．２ｍｍＨｇ以下であり、蒸留温度が１５０〜２００℃である、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、ゼオライト、カオリン、バーライト、および、アルミナからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、脱ガスし、窒素置換した活性白土であって、該活性白土の量が、前記工程（ｄ）によって得られた生成物重量の１〜２０ｗｔ％である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
項目３、８、または、９に記載の方法によって得られるステアリドン酸エチルエステルを含む組成物であって、
ステアリドン酸エチルエステルの含有率が８０ｗｔ％以上；
酸価が０．１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ以下；
過酸化物価が２ｍｅｑ／ｋｇ以下；
ガードナー法による色が４以下；
官能的に無臭；
である、組成物。
（項目１１）
ステアリドン酸エチルエステルの生産方法であって、以下の工程：
（ａ）ステアリドン酸を含む出発原料をエチルエステル化してステアリドン酸エチルエステルを生成し、ステアリドン酸エチルエステルを含む画分を調製する工程；
（ｂ）ステアリドン酸エチルエステルを含む画分に銀塩を含む水性媒体溶液を混合して、ステアリドン酸エチルエステルと銀の錯体を形成する工程；および
（ｃ）ステアリドン酸エチルエステルと銀との錯体を含む水性媒体相を分離し、該分離した水性媒体相に疎水性溶媒を添加して、該錯体から解離したステアリドン酸エチルエステルを含む疎水性媒体相を得る工程；
を包含する、方法。
（項目１２）
前記エチルエステル化が、アルカリ処理によって行われる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
さらに、
（ｄ）前記工程（ｃ）において得られた疎水性媒体相を、薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によって精製する工程、
を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
さらに、
（ｅ）前記工程（ｄ）によって得られた精製物を吸着剤処理して不純物を除去する工程、を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記、錯体を形成する条件が、以下：
反応温度が１０〜３０℃；および、
錯体を形成させる時間が５〜６０分；
であり、そして、錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる条件が、以下：
反応温度が３０〜８０℃；および、
錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる時間が５〜９０分；
である、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記工程（ｄ）が薄膜式真空精密蒸留法であり、そして、蒸留装置塔頂の真空度が０．２ｍｍＨｇ以下であり、蒸留温度が１５０〜２００℃である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、ゼオライト、カオリン、バーライト、および、アルミナからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、脱ガスし、窒素置換した活性白土であって、該活性白土の量が、前記工程（ｄ）によって得られた生成物重量の１〜２０ｗｔ％である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１４、１７、または、１８に記載の方法によって得られるステアリドン酸エチルエステルを含む組成物であって、
ステアリドン酸エチルエステルの含有率が８０ｗｔ％以上；
酸価が０．１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ以下；
過酸化物価が２ｍｅｑ／ｋｇ以下；
ガードナー法による色が４以下；
官能的に無臭；
である、組成物。

本発明によって、高品質且つ高純度なステアリドン酸（ＳＤＡ）エチルエステルを高回収率で生産できる。本発明は、色や臭い、味などの官能面においてもまた安全面においても優れたＳＤＡエチルエステルの製造方法を提供する。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。また、本明細書において「ｗｔ％」は、「質量パーセント濃度」と互換可能に使用される。

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において使用される用語「出発原料」とは、ステアリドン酸（ＳＤＡ）を含む原料をいう。好ましくは、出発原料のステアリドン酸（ＳＤＡ）含有率は、３ｗｔ％以上である。出発原料は、脱酸処理されていても、されていなくてもよい。出発原料は、天然物そのものであっても、天然物の粗精製物であってもよい。好ましくは、本発明の出発原料は、魚類由来の油脂類であり、より好ましくは、本発明の出発原料は、アンチョビ油である。

本明細書において使用される用語「アンチョビ」とは、カタクチイワシ科の魚をいう。本発明のアンチョビとしては、例えば、アンチョベータ（英名：ａｎｃｈｏｖｅｔａ 学名：Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｒｉｎｇｅｎｓ）、カタクチイワシ（英名：Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｎｃｈｏｖｙ 学名：Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ヨーロッパカタクチイワシ（英名：Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｃｈｏｖｙ 学名：Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｅｎｃｒａｓｉｃｏｌｕｓ）、ミナミアフリカカタクチイワシ（英名：ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ａｆｒｉｃａｎ ａｎｃｈｏｖｙ 学名：Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ ｃａｐｅｎｓｉｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明において好ましいアンチョビは、アンチョベータである。アンチョベータは世界年間漁獲量が約１０００万トンあり、その油脂にはステアリドン酸が含まれる。

本明細書において使用される用語「グリセリド」とは脂肪酸のトリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリドからなる群から選択される成分を含む。本発明において、そうでないと規定しない限り、「グリセリド」は、リン脂質や糖脂質を含まない。

本明細書において使用される用語「エチルエステル化」とは、出発原料に含まれる脂肪酸（例えば、ステアリドン酸（ＳＤＡ））の少なくとも一部または全部をステアリドン酸エチルエステルにする反応をいう。本発明で用いるエチルエステル化としては、例えば、脂質分解酵素処理およびアルカリ処理が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される用語「脂質分解酵素」とは、脂質を分解する酵素であり、代表的には、リパーゼまたはコレステロールエステラーゼである。好ましくは、本発明の「脂質分解酵素」は、リパーゼである。本発明において使用される「脂質分解酵素」は、天然の酵素であっても、組換え酵素であってもよい。また、本発明において使用される「脂質分解酵素」は、溶液の形態であっても、固定化された形態であってもよい。例えば、出発原料に含まれる脂肪酸（例えば、ＳＤＡ）を脂質分解酵素によってエチルアルコール存在下でエチルエステル化する。

本発明において使用するリパーゼは、特に限定されることはないが、代表的には、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、および、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属からなる群から選択される属の細菌に由来するリパーゼである。あるいは、ブタなど哺乳動物の膵臓由来のリパーゼを用いてもよい。本発明のリパーゼとしては、以下に列挙する市販のリパーゼが利用可能である：（１）名糖産業：リパーゼＱＬＭ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属）、リパーゼＰＬ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属）、リパーゼＰＬＣ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属）、リパーゼＱＬＣ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属）、リパーゼＯＦ（Ｃａｎｄｉｄａ属）；（２）天野エンザイム：リパーゼＡＹ（Ｃａｎｄｉｄａ属）、リパーゼＧ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）、リパーゼＲ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）。好ましいリパーゼは、リパーゼＱＬＭ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属）である。使用する酵素量としては、５０Ｕ〜１０００Ｕ、好ましくは１００Ｕ〜９００Ｕ、より好ましくは２００Ｕ〜８００Ｕ、最も好ましくは４００Ｕ〜６００Ｕである。

本明細書において使用される、ステアリドン酸の「アルカリ処理」とは、出発原料に存在する脂肪酸のグリセリド又は他のエステルを塩基触媒存在下でエチルアルコールと反応させるアルコリシスによってエチルエステル化することをいう。塩基性触媒にはナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウムが好ましく、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属との水酸化物が該当するがこれらに限定されない。触媒の使用量は、出発原料に対して０．１％〜５％で、好ましくは０．２％〜２％であるがこれらに限定されない。反応温度は２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは４０〜７０℃であるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される用語「吸着剤」とは、精製中に発生した脂質の過酸化物、着色成分、原料由来の異物などの不純物を吸着する物質をいう。本発明において使用する吸着剤としては、例えば、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、ゼオライト、カオリン、バーライト、および、アルミナが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される用語「精製」とは、精製の目的となる物質の濃度を高める任意の操作をいう。

本明細書において使用される用語「ＳＭＢクロマトグラフィー」とは、液体クロマトグラフィーの原理を利用する分離法であって、原料中の特定の成分と、別の特定の成分に対して異なる選択的吸着能力を有する吸着剤が充填された複数の単位充填層を直列に連結するとともに、最下流部の単位充填層と最上流部の単位充填層とを連結し、無端状の循環系を形成した移動層を用いるクロマトグラフィーをいう。本願明細書において、「ＳＭＢクロマトグラフィー」は、「擬似移動層クロマトグラフィー」と互換可能に使用される。

本明細書において使用される用語「銀塩」とは、水溶性の銀化合物で、高度不飽和脂肪酸のπ電子と錯体形成能を有する塩類をいう。本発明において使用する銀塩としては、例えば、硝酸銀、過塩素酸銀、四フッ化ホウ素酸銀、および、酢酸銀が挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用する銀塩は、好ましくは、硝酸銀である。

本明細書で用いる脂肪酸組成分析法、ならびに、酸価、過酸化物価(以下、「ＰＯＶ」
という)およびアニシジン価の測定法は、周知であり、例えば、２００３年版基準油脂分
析試験法（（社）日本油化学会編纂）に記載されるとおりである。

（本発明の生産方法）
本発明のステアリドン酸エチルエステルの生産方法は、
（ａ）ステアリドン酸を含む出発原料をエチルエステル化（例えば、無水条件下において脂質分解酵素処理によるか、もしくは、アルカリ処理による）してステアリドン酸エチルエステルを生成し、ステアリドン酸エチルエステルを含む画分を調製する工程；
（ｂ）ステアリドン酸エチルエステルを含む画分に銀塩を含む水性媒体溶液を混合して、ステアリドン酸エチルエステルと銀の錯体を形成する工程；および
（ｃ）ステアリドン酸エチルエステルと銀との錯体を含む水性媒体相を分離し、該分離した水性媒体相に疎水性溶媒を添加して、該錯体から解離したステアリドン酸エチルエステルを含む疎水性媒体相を得る工程；
を包含する。

（工程ａ）
脂質分解酵素処理における「無水条件下」としては、水分含量を出発原料の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または、１０％以下とする条件である。無水条件下は、代表的には、無水エタノール溶媒存在下である。脂質分解酵素（例えば、リパーゼ）によるエチルエステル化反応の反応温度は、３０〜６０℃、好ましくは４０℃である。エチルエステル化反応の反応時間は、６〜７２時間、好ましくは２４時間である。

アルカリ処理によるエチルエステル化の反応条件としては、出発原料に対して０．１〜５％、好ましくは０．５％〜３％、より好ましくは２％の塩基性触媒（例えば水酸化ナトリウム）を添加する条件下であるがこれらに限定されない。反応温度は２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは４０〜７０℃であるがこれらに限定されない。撹拌速度は５０〜５００ｒｐｍが好ましいが、反応物が均一にされればこの限りではない。反応時間は１５分〜１２０分が好ましいが、より好ましくは６０分であるがこれらに限定されない。

必要であれば、脂質分解酵素またはアルカリ処理によるエチルエステル化反応の後、疎水性溶媒（例えば、ノルマルヘキサン）を添加し、疎水性溶媒層とエタノール層の２層になるまで静置し、ＳＤＡエチルエステルを含む疎水性溶媒層を回収し、必要に応じてエタノールおよび水で洗浄する。さらに必要であれば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってグリセリド画分を除去する。

（工程ｂ）
本発明において使用する銀塩としては、例えば、硝酸銀、過塩素酸銀、四フッ化ホウ素酸銀、および、酢酸銀が挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用する銀塩は、好ましくは、硝酸銀である。銀塩を含む水性媒体溶液の遊離脂肪酸含量は、特に限定されることはないが、好ましくは銀１ｇあたり０．２ｍｅｑ以下である。銀塩水溶液（例えば、硝酸銀水溶液）の濃度は、反応溶液あたり２０〜７０ｗｔ％が好ましく、５０ｗｔ％が最も好ましい。ＳＤＡエチルエステルと銀塩の錯体形成温度は、１０〜３０℃であり、好ましくは２０℃である。錯体形成時間は、５〜６０分であり、好ましくは、２０分である。

（工程ｃ）
本発明において、錯体からＳＤＡエチルエステルを解離させる温度は、３０〜８０℃であり、好ましくは、６０℃である。錯体からエチルエステルを解離させる時間は、５〜９０分であり、好ましくは、３０分である。錯体からエチルエステルを解離させる溶媒としては任意の疎水性溶媒が利用可能であるが、好ましくは、シクロヘキサン、ノルマルヘキサン、クロロホルム、アセトン、トルエン、または、キシレンである。好ましくは、ノルマルヘキサンおよび/またはシクロヘキサンである。

（工程ｄ）
本発明の生産方法においては、必要に応じて、上記工程（ｃ）において得られた疎水性媒体相を、薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によって精製してもよい。
（ｄ１：薄膜式真空精密蒸留法）
薄膜式真空精密蒸留法とは、各成分の沸点差を利用して分離する方法である。ＳＤＡエチルエステルの場合、ＳＤＡエチルエステルを含む炭素鎖数が１８の成分は炭素鎖数２０以上の成分と比較すると魚油脂肪酸の中で比較的低い沸点に位置している。ＳＤＡエチルエステルの精製のためには、代表的には、蒸留装置内の真空度を０．２ｍｍＨｇ以下とし、１５０〜２００℃で複数回処理を行うが、この条件に限定されることはない。蒸留温度は、好ましくは、１７４℃である。
（ｄ２：擬似移動床式クロマトグラフィー法）
擬似移動床式クロマトグラフィー法（ＳＭＢクロマトグラフィー法）では、無端状の循環系に対して原料と溶離液とを供給し、カラム内（単位充填層）を高速で移動するＸ成分（すなわち、弱親和性成分）と、カラム内を低速で移動するＹ成分（すなわち、親和性成分）とをそれぞれ異なる位置から抜き出す。そして、ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料供給位置、溶離液供給位置、Ｘ成分抜き出し位置、およびＹ成分抜き出し位置を、一定の位置関係に保ちながら流体循環方向下流側に順次移動させることで、原料供給を連続的に行う処理操作を擬似的に実現する。その結果、層内での各成分の分布状態はほぼ一定の幅で移動し、各成分の抜出位置も、純度・濃度ともに高い部分を取り続けることが可能な操作方式である。
（ｄ３：尿素付加法）
尿素付加法とは、溶解した尿素が結晶化する際に直鎖の分子を取り込みながら六角柱状の付加物結晶を形成する性質を利用する精製法である。例えば、原料と尿素メタノール溶液を混合し冷却し、飽和脂肪酸やモノ不飽和脂肪酸を取り込んだ尿素付加物を形成させ、これをろ別することにより精製を行う。代表的には、尿素付加物からｎ−ヘキサン抽出し、シリカゲル処理の後、ｎ−ヘキサンを留去して目的の不飽和脂肪酸を得る。
（ｄ４：分子蒸留法）
分子蒸留法は、例えば、遠心式分子蒸留法、又は、流下薄膜式分子蒸留法によって行うことが出来る。例えば、流下薄膜式分子蒸留の場合、特開２０００−３４２２９１号公報に記載されるように、真空度０．００５ｍｍＨｇ、蒸発面温度２００℃、流速３０ｇ／Ｌの条件で処理を行い、留分として遊離脂肪酸画分、残分としてグリセリド画分を取得できる。流下薄膜式分子蒸留の場合、分子蒸留操作における真空度、蒸発面温度、および／または、フィード量は、装置の型式、原料油の違いにより当業者が適宜変更することができる。

（工程ｅ）
本発明の生産方法においては、必要に応じて、上記工程（ｄ）によって得られた精製物を吸着剤処理して不純物を除去してもより。本発明において使用する吸着剤としては、例えば、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、および、アルミナが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、吸着剤は、活性白土またはシリカゲルである。活性白土は、好ましくは、脱ガスし、窒素置換した活性白土であって、活性白土の添加量は、工程（ｄ）によって得られた生成物重量の１〜２０ｗｔ％である。

本発明によって得られたＳＤＡエチルエステルを含む画分（組成物）は、代表的には：ステアリドン酸エチルエステルの含有率が８０ｗｔ％以上；酸価が０．１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ以下；過酸化物価が２ｍｅｑ／ｋｇ以下；ガードナー法による色が４以下；官能的に殆ど無臭、である。

（ガードナー法）
精製標品の色の評価としては、例えば、ガードナー法を用いることができる。ガードナー法は、試料をガードナー・ホルト試料管に入れた後、標準色ガラスセットの標準色と比較してガードナー標準色番号を表示する方法である。

以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
アンチョビ油１０００ｇに対してリパーゼＱＬＭ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属由来、名糖産業）を５００，０００Ｕおよび水分含量０．０２ｗｔ％以下の無水エタノールを１０００ｍＬ加えて４０℃で２４時間撹拌後、ノルマルヘキサン２０００ｍＬを加えて分液ロートで２層になるまで静置した。エチルエステル画分を含むヘキサン層を回収した後、エタノール及び水で水洗し、ノルマルヘキサン：ジエチルエーテル＝９５：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってグリセリド画分を除去しエチルエステル３００．１ｇを得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製は、石塚稲男、「カラムクロマトグラフィー」生化学データブック（Ｉ）日本生化学会編，東京化学同人，東京，１９７９，ｐｐ．８６９に従った。

このアンチョビ油エチルエステル３００．１ｇに対して５０ｗｔ％硝酸銀水溶液（ｗ／ｗ）２５００ｇを加えて２０℃で撹拌することによって錯体を形成し、分液ロートで４０分間静置した後、下層の錯体画分を回収し、その画分にヘキサン２５００ｇを加えて６０℃で撹拌することにより錯体を解離させてヘキサンにエチルエステルを溶解させ、そのエチルエステルを含むヘキサンをロータリーエバポレーターによって濃縮することにより、ＳＤＡ含有率２１．３ｗｔ％のエチルエステル１２６．７ｇを得た。

続いて薄膜式真空精密蒸留により精製するため、硝酸銀処理によって得られたエチルエステル１２６．７ｇを蒸留器に入れた後、塔頂における真空度０．１８ｍｍＨｇ、蒸留温度１７３〜１７５℃の操作条件で蒸留処理を行い、目的とする主留画分２１．３ｇを得た。この留分は、ＳＤＡ含有率が８３．２ｗｔ％であった。その他の主な類縁物質であるＥＰＡ含有率は６．２ｗｔ％、ＤＨＡ含有率は４．０ｗｔ％であった。薄膜式真空精密蒸留によって得られたエチルエステルに活性白土を５ｗｔ％添加して３５℃で３０分間撹拌後、ろ過を行い、酸価０．０３ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価０．９ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価２．８、官能評価的に殆ど無臭で色が３（ガードナー）であるＳＤＡ含有率８３．２ｗｔ％のエチルエステル２０．６ｇを得た。出発原料に対するＳＤＡの回収率は５５．３％であった。

出発原料であるアンチョビ油及び各処理後のＳＤＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡの含有率は以下の通りである。

（実施例２）
アンチョビ油１０００ｇを実施例１同様にリパーゼ処理および硝酸銀処理を行って、ステアリドン酸含有率２１．３ｗｔ％のエチルエステルを得た後、該エチルエステルを２００ｇ／Ｌになるようにメタノールに溶解した。この試料をＯＤＳカラム（φ１０ｍｍ×Ｈ５００ｍｍ）６本を用いた２成分分離の擬似移動床式クロマトグラフィー法によって精製するため、１時間・充填剤１Ｌ当たりの原料供給量を１７．５ｍｌ（１７．５ｍＬ／ｌ−Ｒ／ｈ）、メタノールを溶離液として１時間・充填剤１Ｌ当たりの流量３５０ｍＬ（０．３５Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）の条件に設定して精製することで、ステアリドン酸含有率８１．５ｗｔ％のエチルエステルを得た。その他の主な類縁物質であるエイコサペンタエン酸の含有率は８．４ｗｔ％、ドコサヘキサエン酸は５．２ｗｔ％であった。得られたエチルエステルに活性白土を５ｗｔ％添加して３５℃で３０分間撹拌後、ろ過を行い、酸価０．０６ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価１．８ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価は３．５、官能評価的に殆ど無臭で色が３（ガードナー）であるＳＤＡ含有率８１．５ｗｔ％のエチルエステル１９．６ｇを得た。出発原料に対するＳＤＡの回収率は５１．５ｗｔ％であった。

（実施例３）
アンチョビ油１０００ｇを実施例１と同様にリパーゼ処理および硝酸銀処理を行って、ステアリドン酸含有率２１．３ｗｔ％のエチルエステルを得た後、該エチルエステルを尿素４００ｇとエタノール１３５０ｍＬの混合溶液に加えて７５℃で６０分間撹拌して溶解させた後、常温まで冷却して沈殿物（尿素付加品）と上清を濾別し、その上清を回収してエタノールを除去した。エタノール除去後の残渣に水２００ｍＬを加えて溶解し、６Ｎ塩酸によってｐＨを３〜４に調整することより上層に分離浮上した油分を回収し、この油分をｐＨが中性になるまで複数回水洗することによって尿素の除去を行い、尿素付加精製品を得た。この精製品のステアリドン酸含有率は８０．４ｗｔ％で、その他の主な類縁物質であるエイコサペンタエン酸の含有率は８．７ｗｔ％、ドコサヘキサエン酸は４．９ｗｔ％であった。得られたエチルエステルに活性白土を５ｗｔ％添加して３５℃で３０分間撹拌後、ろ過を行い、酸価０．１０ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価１．９ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価３．１、官能評価的に殆ど無臭で色が３（ガードナー）であるＳＤＡ含有率８０．４ｗｔ％のエチルエステルのエチルエステル１７．３ｇを得た。出発原料に対するＳＤＡの回収率は４４．９ｗｔ％であった。

（実施例４）
アンチョビ油１０００ｇに２ｗｔ％の水酸化ナトリウムエタノール溶液５００ｇを加え、４０℃、２００ｒｐｍで６０分間撹拌した後、該反応物を回収してｐＨが中性になるまで複数回水洗することによって該反応物中から水酸化ナトリウムの除去を行い、アンチョビ油エチルエステル８０７．３ｇを得た。得られたアンチョビ油エチルエステルについて実施例１と同様に硝酸銀処理を実施し、ＳＤＡ含有率７．０ｗｔ％のエチルエステル３３７．５ｇを得た後、薄膜式真空精密蒸留を行い、目的とする主留画分２２．０ｇを得た。この留分はＳＤＡ含有率が８０．８％であった。得られたエチルエステルを実施例１と同様に活性白土を添加して撹拌、ろ過を行い、酸価０．０２ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価１．１ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価３．６、官能評価的に殆ど無臭で色が３（ガードナー）であるＳＤＡ含有率８０．２ｗｔ％のエチルエステル１９．７ｇを得た。出発原料に対するＳＤＡの回収率は５０．１％であった。

（比較例１）
アンチョビ油１０００ｇを実施例１と同様にリパーゼ処理を行い、エチルエステル３００．１ｇを得た。該エチルエステルを尿素９００ｇとエタノール３０００ｍＬの混合溶液に加えて７５℃で６０分間撹拌して溶解させた後、常温まで冷却して沈殿物（尿素付加品）と上清を濾別し、その上清を回収してエタノールを除去した。エタノール除去後の残渣に水２００ｍＬを加えて溶解し、６Ｎ塩酸によってｐＨを３〜４に調整することより上層に分離浮上した油分を回収し、この油分をｐＨが中性になるまで複数回水洗することによって尿素の除去を行い、尿素付加精製品を得た。この精製品のステアリドン酸含有率は２４．７ｗｔ％で、その他の主な類縁物質であるエイコサペンタエン酸の含有率は７．１ｗｔ％、ドコサヘキサエン酸は３．６ｗｔ％であった。得られたエチルエステルに活性白土を５ｗｔ％添加して３５℃で３０分間撹拌後、ろ過を行い、酸価０．１７ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価２．８ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価４．４、官能評価的にわずかに臭いがあり、色が５（ガードナー）であるエチルエステルを得た。

（比較例２）
アンチョビ油１０００ｇに１ｗｔ％の水酸化ナトリウム−エタノール溶液５００ｇを加えて４０℃で２時間撹拌した後、上層の油層を回収した。該油層に水２５０ｇを添加して７０℃で３０分間撹拌し、下層の水層を廃棄した。同様操作を水層が中性になるまで複数回繰り返すことによって、油層の洗浄を行った。該油層に無水硫酸ナトリウムを５０ｇ添加した後、ろ過してアンチョビ油エチルエステルを９４７．２ｇ得た。続いて薄膜式真空精密蒸留により精製するため、該エチルエステルを蒸留器に入れた後、塔頂における真空度０．１８ｍｍＨｇ、蒸留温度１７３〜１７５℃の操作条件で蒸留処理を行い、目的とする主留画分８５．７ｇを得た。この留分は、ＳＤＡ含有率が２５．８ｗｔ％であった。その他の主な類縁物質であるＥＰＡ含有率は４１．２ｗｔ％、ＤＨＡ含有率は９．２ｗｔ％であった。得られたエチルエステルに活性白土を５ｗｔ％添加して３５℃で３０分間撹拌後、ろ過を行い、酸価０．０６ｍｇ ＫＯＨ／ｇ、過酸化物価１．２ｍｅｑ／ｋｇ、アニシジン価３．９、官能評価的に殆ど無臭で色が改善されたエチルエステルを得た。分析結果を表２に示す。

（実施例と比較例の対比）
実施例１〜３は、脂質分解酵素処理と銀塩処理とを組み合わせた実施例であり、実施例４は、アルカリ処理と銀塩処理とを組み合わせた実施例である。実施例１および４では、さらに、蒸留精製と活性白土処理とを行った。実施例２では、さらに、擬似移動床式クロマトグラフィー法による精製と活性白土処理とを行った。実施例３では、さらに、尿素処理と活性白土処理とを行った。実施例１〜４の結果から、エチルエステル化（例えば、（ａ）脂質分解酵素処理によるエチルエステル化、または、（ｂ）アルカリ処理によるエチルエステル化）と銀塩処理とを組み合わせることによって、高品質且つ高純度なステアリドン酸（ＳＤＡ）エチルエステルを高回収率で生産できることが実証された。

本発明の優れた効果は、例えば、実施例３と、比較例１（脂質分解酵素処理を行ったが、銀塩処理を行わなかった）ないし比較例２（脂質分解酵素処理も銀塩処理も行わなかった）とを比較すること（特に、ＳＤＡ含有率、臭い、および、色を比較すること）によって、一層明らかとなる。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明によって、高品質且つ高純度なステアリドン酸（ＳＤＡ）エチルエステルを高回収率で生産できる。本発明は、色や臭い、味などの官能面においてもまた安全面においても優れたＳＤＡエチルエステルの製造方法を提供する。本発明によって得られた高純度ＳＤＡエチルエステルはω３脂肪酸エチルエステルとして一般食品、健康食品、化粧品素材など広範囲の産業分野において利用可能であり、人間の健康維持、増進に有効である。

Claims (17)

1. ステアリドン酸エチルエステルの生産方法であって、以下の工程：
   （ａ）ステアリドン酸を含む出発原料を無水条件下において脂質分解酵素処理してステアリドン酸エチルエステルを生成し、ステアリドン酸エチルエステルを含む画分を調製する工程；
   （ｂ）ステアリドン酸エチルエステルを含む画分に銀塩を含む水性媒体溶液を混合して、ステアリドン酸エチルエステルと銀の錯体を形成する工程；および
   （ｃ）ステアリドン酸エチルエステルと銀との錯体を含む水性媒体相を分離し、該分離した水性媒体相に疎水性溶媒を添加して、該錯体から解離したステアリドン酸エチルエステルを含む疎水性媒体相を得る工程；
   を包含する、方法。
2. さらに、
   （ｄ）前記工程（ｃ）において得られた疎水性媒体相を、薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によって精製する工程、
   を包含する、請求項１に記載の方法。
3. さらに、
   （ｅ）前記工程（ｄ）によって得られた精製物を吸着剤処理して不純物を除去する工程、を包含する、請求項２に記載の方法。
4. 前記脂質分解酵素が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、および、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属からなる群から選択される属の細菌に由来するリパーゼである、請求項１に記載の方法。
5. 前記脂質分解酵素の反応条件が、以下：
   反応温度が３０〜６０℃；
   反応時間が６〜７２時間；および、
   脂質分解酵素添加量が出発原料１ｇあたり５０〜１０００Ｕ
   である、請求項１に記載の方法。
6. 前記、錯体を形成する条件が、以下：
   反応温度が１０〜３０℃；および、
   錯体を形成させる時間が５〜６０分；
   であり、そして、錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる条件が、以下：
   反応温度が３０〜８０℃；および、
   錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる時間が５〜９０分；
   である、請求項１に記載の方法。
7. 前記工程（ｄ）が薄膜式真空精密蒸留法であり、そして、蒸留装置塔頂の真空度が０．２ｍｍＨｇ以下であり、蒸留温度が１５０〜２００℃である、請求項２に記載の方法。
8. 前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、ゼオライト、カオリン、バーライト、および、アルミナからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
9. 前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、脱ガスし、窒素置換した活性白土であって、該活性白土の量が、前記工程（ｄ）によって得られた生成物重量の１〜２０ｗｔ％である、請求項８に記載の方法。
10. ステアリドン酸エチルエステルの生産方法であって、以下の工程：
    （ａ）ステアリドン酸を含む出発原料をエチルエステル化してステアリドン酸エチルエステルを生成し、ステアリドン酸エチルエステルを含む画分を調製する工程；
    （ｂ）ステアリドン酸エチルエステルを含む画分に銀塩を含む水性媒体溶液を混合して、ステアリドン酸エチルエステルと銀の錯体を形成する工程；および
    （ｃ）ステアリドン酸エチルエステルと銀との錯体を含む水性媒体相を分離し、該分離した水性媒体相に疎水性溶媒を添加して、該錯体から解離したステアリドン酸エチルエステルを含む疎水性媒体相を得る工程；
    を包含する、方法。
11. 前記エチルエステル化が、アルカリ処理によって行われる、請求項１０に記載の方法。
12. さらに、
    （ｄ）前記工程（ｃ）において得られた疎水性媒体相を、薄膜式真空精密蒸留法、擬似移動床式クロマトグラフィー法、尿素付加法、および、分子蒸留法からなる群から選択される精製法によって精製する工程、
    を包含する、請求項１０に記載の方法。
13. さらに、
    （ｅ）前記工程（ｄ）によって得られた精製物を吸着剤処理して不純物を除去する工程、を包含する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記、錯体を形成する条件が、以下：
    反応温度が１０〜３０℃；および、
    錯体を形成させる時間が５〜６０分；
    であり、そして、錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる条件が、以下：
    反応温度が３０〜８０℃；および、
    錯体からステアリドン酸エチルエステルを解離させる時間が５〜９０分；
    である、請求項１０に記載の方法。
15. 前記工程（ｄ）が薄膜式真空精密蒸留法であり、そして、蒸留装置塔頂の真空度が０．２ｍｍＨｇ以下であり、蒸留温度が１５０〜２００℃である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、ゼオライト、カオリン、バーライト、および、アルミナからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
17. 前記工程（ｅ）において使用する吸着剤が、脱ガスし、窒素置換した活性白土であって
    、該活性白土の量が、前記工程（ｄ）によって得られた生成物重量の１〜２０ｗｔ％である、請求項１６に記載の方法。