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JP6346265B2 - Ｄｎａインターカレーティング剤の細胞送達 - Google Patents

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ランケノー インスティテュート フォー メディカル リサーチ
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Description

本発明は、活性剤が担体のＤＮＡにインターカレートしているＤＮＡ担体を用いた、該活性剤の細胞への送達に関する。該ＤＮＡ担体は、該ＤＮＡ担体を特定の細胞型に結合させる標的化剤をさらに含むことができ、それによりインターカレートされた活性剤の細胞への送達を促進することができる。
活性剤とＤＮＡの間の非共有結合性相互作用は、一般に、グルーブバインディングまたはインターカレーションのいずれかにより起こる。特に抗癌治療の分野から、インターカレーションというＤＮＡ塩基対の間に平面の薬物分子を挿入することを含む工程により、ＤＮＡと相互作用する複数の化学療法薬が製造された。これにより、ＤＮＡのらせん反転および伸長の減少が得られる。インターカレーションの会合定数は、好適な疎水性結合、イオン結合、水素結合およびファンデルワースル力により１０５〜１０−１１Ｍ−１になり得る。インターカレーションは、一般に、縮合環構造に関連づけられるが、非縮合環系も公知である。インターカレーションは、特に塩基性、陽イオン性または電子吸引性官能基が存在する場合にはほとんどが遺伝毒性であるため、抗腫瘍剤、抗悪性腫瘍剤、抗マラリア剤、抗生物質剤および抗真菌剤としてのこれらの化合物の有効な使用に大きく貢献するものと認識されている。
ＤＮＡデンドリマーは、相互に連絡した天然または合成モノマーオリゴヌクレオチドサブユニットから組み立てられる複雑で高度に分岐した分子である。ＤＮＡデンドリマーは、それぞれが２つのＤＮＡ鎖から生成されたＤＮＡモノマーから構築されており、ＤＮＡ鎖は各鎖の中心部分（「ウエスト」としても公知）に位置する配列相補性の領域を共有しているが、他のモノマーの「アーム」へのハイブリダイゼーションのために４つの非相補性の一本鎖「アーム」を有する。モノマーは、単一モノマーから開始して、相補性アームを介してさらなるモノマーにハイブリダイズして、デンドリマーに構築される。同様の手法で、それまでの層の中のモノマーアームにモノマーがハイブリダイズすることにより、さらなる層が付加される。層の数の変動、およびどのアームがさらなるモノマーにハイブリダイズするかにより、異なるサイズおよび形状のＤＮＡデンドリマーが生成される。ＤＮＡデンドリマーが経時的に崩壊するのを防ぐために、ソラレン架橋剤のインターカレーションおよび活性化を介し、ＵＶ光を利用して、化学的「点溶接部」を成長している構築物に付加することができる。デンドリマーは、典型的には超遠心分離後のショ糖勾配を変性させる際に、デンドリマーのサイズおよび分子に応じて精製させる。
ＤＮＡデンドリマーは、一般には外層上に存在するハイブリダイズされていないアームへの連結を介して、非常に多様な異なるタイプの分子および粒子に共有結合または非共有結合することもできる。これらの分子および粒子は、特異的分子ターゲットへのＤＮＡデンドリマーの標的化およびシグナリング分子の検出を介したターゲットへのデンドリマーの結合の検出を可能にする、ＤＮＡデンドリマー上のシグナリングおよびターゲティングデバイスであってもよい。シグナる発生部分としては、多数の蛍光色素、ハプテン、酵素および他の分子材料、ならびに金ナノ粒子および量子ドットなどの粒子が挙げられる。ターゲティングデバイスとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、アプタマー、ペプチドなどが挙げられる。モノマーの外層は、多くのハイブリダイズされていないアームを含むため、ＤＮＡデンドリマー構築物は、一般には特異的核酸およびタンパク質の検出のために、非常に多様なインビトロ適用においてシグナル増強剤として作用するが、電子デバイス内の検出デバイスとしても作用する。適用例としては、ＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＯＳＡ、ルミネックスビーズアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションなどでのシグナル増強剤が挙げられる。標識および標的化されたＤＮＡデンドリマーの使用は、調査研究において広範に発表されており、これらの材料は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ ＬＬＣ（ペンシルバニア州ハットフィールド所在）により販売または製造される市販の検査用製品として入手できる。
ＤＮＡデンドリマーは、インビトロおよびインビボの両方の適用において送達およびトランスフェクションデバイスとしての潜在的用途を有することも示されている。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００５／００８９８９０号、ＷＯ２００８／１４７５２６号およびＷＯ２０１０／０１７５４４号を参照されたい。特にＤＮＡデンドリマーは、運搬物（例えば、薬物）の送達を受けるように標的化された細胞上の表面形状に結合する標的化デバイス（例えば、細胞内エンドサイトーシス性内在化イベントを誘発し得る細胞表面形状に特異的な抗体）と結合する。標的化されたＤＮＡデンドリマーと受動的に会合する運搬物は、単にデンドリマーとの空間的会合により細胞に侵入するが、運搬物は、外側のアームへの連結など、複数の付着方策を介してデンドリマーに結合することもできる。
本発明は、ＤＮＡ担体を用いた、活性剤の細胞への改善された送達方法に関する。
ＤＮＡ担体は、少なくとも一部が二本鎖形態であるＤＮＡと、二本鎖ＤＮＡ内にインターカレートする活性剤と、を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ担体は、活性剤が送達される分子、細胞、または組織に結合する標的化剤も含む。特別な実施形態において、ＤＮＡ担体は、ＤＮＡデンドリマーであり、ＤＮＡデンドリマーの二本鎖部分にインターカレートされる活性剤を有する。標的化される分子、細胞または組織へのＤＮＡ担体の結合の際に、デンドリマーは、細胞によりエンドソームに内在化され、エンドソームの酸性ｐＨがＤＮＡからの活性剤放出を促進して、細胞毒性作用または他の生物学的作用を生成する。
ＬＹＳＯＳＥＮＳＯＲ色素による生存細胞の標識を示す。 内在化されたデンドリマーを含む細胞を示す。 図１Ａおよび１Ｂの結合画像であり、デンドリマーが細胞の酸性コンパートメントに内在化されていることを示している。 図２〜図Ｄは、実施例２の結果を示している：非処置細胞（図２Ａ）、非標的化Ｄｏｘデンドリマー（図２Ｂ）、Ｇ８ ｍＡｂがコンジュゲートされたＤｏｘデンドリマー（図２Ｃおよび２Ｄ）。
詳細な説明
本発明の複数の模範的実施形態を記載する前に、本発明が以下の説明に示された構築物または工程ステップの詳細に限定されないことが理解されなければならない。本発明は、他の実施形態で可能であり、様々な方法で実践または実行することが可能である。
本明細書全体を通して参照される「一実施形態」、「特定の実施形態」、「１つ以上の実施形態」または「実施形態」は、その実施形態と併せて記載された特別な特色、構造、材料または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。つまり、本明細書全体の様々な箇所にある「１つ以上の実施形態において」、「特定の実施形態において」、「一実施形態において」または「実施形態において」は、必ずしも本発明の同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特別な特色、構造、材料または特性が１つ以上の実施形態において任意の適切な手法で組み合わせられていてもよい。
第一の態様において、本発明は、インターカレートしている活性剤の細胞または組織への送達のための合成ＤＮＡ担体であって、該ＤＮＡが、全体的または部分的に二本鎖であり、該ＤＮＡが、該ＤＮＡの二本鎖部分にインターカレートされた活性剤を含む、合成ＤＮＡに関する。該合成ＤＮＡ担体のオリゴヌクレオチド成分は、直鎖状または分枝状オリゴヌクレオチドであってもよい。ＤＮＡ担体の各二本鎖ＤＮＡ部分は、５ｂｐ長以上、例えば約２０〜３５ｂｐ、約３５〜５０ｂｐ、約５０〜１００ｂｐ、または約１００〜２００ｂｐである。合成ＤＮＡ担体は、インビトロで構築され、好ましくは活性剤の負荷量を増加させるために複数の二本鎖部分を含む。複数の二本鎖部分を含む合成ＤＮＡ担体の例としては、ＤＮＡデンドリマーが挙げられる。合成ＤＮＡ担体が、直鎖状オリゴヌクレオチドを含む場合、該オリゴヌクレオチドは、１つの二本鎖部分または複数の二本鎖部分を含んでいてもよい。ＤＮＡ担体内のそのような直鎖状オリゴヌクレオチドの全長は、典型的には少なくとも１０ｎｔ、例えば１０〜２０ｎｔ長、１０〜５０ｎｔ長、１０〜８０ｎｔ長、１０〜１５０ｎｔ長、または１０〜２００ｎｔ長である。
一実施形態において、合成ＤＮＡ担体は、ＤＮＡ担体を選択された細胞または組織タイプに結合させるために該選択された細胞または組織タイプに結合する標的化剤をさらに含んでいてもよく、それにより選択された細胞または組織への活性剤の送達が促進される。選択された細胞または組織タイプへの標的化剤の結合は、細胞表面タンパク質または細胞表面受容体への標的化剤の結合を介していてもよい。適切な標的化剤としては、細胞表面タンパク質または細胞表面受容体に結合する抗体、リガンドまたはペプチドが挙げられる。標的化剤は、典型的には共有結合または非共有結合のいずれかでＤＮＡデンドリマーに連結する（例えば、標的化剤を、デンドリマーアームに相補性のオリゴヌクレオチドに連結させて、デンドリマーアームにハイブリダイズする）。
標的化剤により標的化され得る細胞表面受容体およびタンパク質の例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）、抗マラリア剤マーカ、および葉酸受容体が挙げられる。好ましくは細胞表面受容体またはタンパク質は、感染、損傷もしくは疾患を受けた細胞上で特異的に発現されるか、または感染、損傷もしくは疾患を受けた細胞上で過剰発現される。標的化剤の具体的例としては、抗トランスフェリン抗体またはＴｆＲ標的化ペプチド、例えばトランスフェリン受容体に結合し、様々な癌で過剰発現されるＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号：ｌ）が挙げられる。例として、標的化剤は、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞の表面で見出されるおよそ１７０ｋＤａの部分に結合するＧ８モノクローナル抗体、およびその誘導体であってもよい。Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞は、骨格筋特異性転写因子ＭｙｏＤ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤ノギン、および細胞表面Ｇ８エピトープのためにｍＲＮＡの発現により同定される。有用な標的化部分の他の例としては、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦＲファミリー受容体、ＩＣＡＭ、ＣＤ受容体、ＭＭＰ−９、インターロイキン受容体、葉酸受容体、および当該技術分野で公知の他のものに結合するものが挙げられる。
別の実施形態において、該ＤＮＡ担体の二本鎖部分にインターカレートされる活性剤は、化学療法薬、抗感染剤、抗マラリア剤、および抗ウイルス剤または抗真菌剤である。そのような薬剤の具体的例としては、ベルベリン系薬剤（抗真菌剤、抗悪性腫瘍剤）、アクリジン系薬剤（例えば、プロフラビンまたはキナクリン、消毒薬）、癌化学療法薬（例えば、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ボレロキシン）、クリプトレピン（抗マラリア性細胞毒性剤）、およびサリドマイド（多発性骨髄腫の処理）が挙げられる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、該ＤＮＡ担体は、二層、四層、六層または八層ＤＮＡデンドリマーをはじめとするＤＮＡデンドリマーを含んでいてもよい。該ＤＮＡデンドリマーのサイズは、必要に応じて、細胞および組織への活性剤の送達（例えば、循環系または局所注射を介して）を促進するため、および細胞によるＤＮＡ担体の取り込みを最大にするために選択される。一般に該ＤＮＡ担体は、約３〜２１６のオリゴヌクレオチド一本鎖を含む。
第二の態様において、本発明は、前述の実施形態のいずれかにおけるＤＮＡ担体と、少なくとも１種の医薬的に許容し得る賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。該医薬的に許容し得る賦形剤は、患者、細胞または組織への投与のためにＤＮＡ担体を配合して、治療的または他の生物学的結果を実現するために用いられ得る任意の適切なビヒクルである。該賦形剤は、二本鎖ＤＮＡと適合性があり（即ち、それらは、選択された細胞または組織への送達前にＤＮＡ担体を変性させない）、加えて活性剤と、そして存在するならば標的化剤と適合性があるそれらの賦形剤から選択される。そのような医薬的賦形剤としては、生理学的緩衝剤、糖類およびオリゴ糖、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、ワックス、キレート化剤、界面活性剤、希釈剤、抗酸化剤、結合剤、防腐剤、着色剤、乳化剤、脂質ミセル、または医薬配合剤の他の従来の構成成分が挙げられる。特定の実施形態において、該医薬組成物は、例えば注射または輸液により、患者に非経口送達されるように配合されている。この場合、該ＤＮＡ担体が循環から所望の細胞または組織タイプに向かうように、該ＤＮＡ担体が標的化剤を含むことが望ましい。他の実施形態において、該医薬組成物は、活性剤の送達が望ましい細胞または組織への経口投与または局所投与に適合されていてもよい（例えば、局所配合剤）。
さらなる態様において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載されたＤＮＡ担体を作製する方法に関する。一実施形態において、該ＤＮＡ担体は、一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズして全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させること、および活性剤を該二本鎖部分にインターカレートさせる条件下で、全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを活性剤と混和すること、により構築される。余分な活性剤は、例えばクロマトグラフィーにより、除去されて、ＤＮＡ担体を生成する。具体的な実施形態において、余分な活性剤を除去するクロマトグラフィーは、スピンカラムを用いて実施される。
別の実施形態において、該活性剤は、一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションの間にＤＮＡ担体に組み込まれて、全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを構築した後、先に記載された通り余分な活性剤を除去することができる。
さらなる実施形態において、ＤＮＡ担体を作製する方法は、ＤＮＡデンドリマーの構築、活性剤を該ＤＮＡデンドリマーの二本鎖部分にインターカレートさせる条件下で、ＤＮＡデンドリマーを活性剤と混和すること、および余分な活性剤を、例えばクロマトグラフィー（例えば、スピンカラム）により、除去すること、を含む。
ＤＮＡ担体が標的化剤と連結された具体的な実施形態において、該ＤＮＡ担体は、一本鎖ＤＮＡから構築されて全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成し、標的化剤は、構築されたＤＮＡに連結される。ＤＮＡへの標的化剤の連結は、当該技術分野で公知の通り共有結合での付着により遂行されていてもよく、またはそれはハイブリダイゼーションなどの非共有結合的連結であってもよい。そのような方法としては、例えばジスルフィド結合を介した連結、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル依存性縮合反応、二官能基性架橋、電荷−電荷相互作用を介して標的化剤をＤＮＡ担体に架橋するためのポリカチオン性化合物の使用、またはＷＯ２０１０／０１７５４４号に記載される通りＤＮＡ担体への直接的もしくは間接的ハイブリダイゼーションが挙げられる。例えば一本鎖のキャプチャーオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡデンドリマーのアームに付加され、該キャプチャー配列に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドが、標的化剤に連結される。標的化剤の相補配列が、ＤＮＡデンドリマーのキャプチャー配列にハイブリダイズされて、標的化剤をＤＮＡデンドリマーに連結させる。ハイブリダイズされたキャプチャーおよび相補配列は、場合により架橋されてもよい。該活性剤は、全体的もしくは部分的に二本鎖のＤＮＡの構築の際、またはＤＮＡ担体への標的化剤の連結の後に、ＤＮＡ担体に組み込まれてもよい。標的化剤が、先に記載された通りキャプチャー配列を介してＤＮＡ担体にハイブリダイズされると、連結により形成された二本鎖ＤＮＡも、活性剤をインターカレートすることができる。
標的化剤に連結されたＤＮＡ担体を作製する別の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドが、最初のステップにおいて標的化剤に付着され、その後、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズされて、ＤＮＡ担体の全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させる。
ＤＮＡ担体を作製する前述の方法のいずれかにおいて、ＤＮＡデンドリマーは、例えばＴ． Ｗ． Ｎｉｌｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） １８７， ２７３−２８４に記載される通り、当該技術分野で公知の方法のいずれかにより構築されてもよい。
さらなる態様において、本発明は、活性剤を細胞または組織に送達する方法であって、該細胞または組織を、前述の実施形態のいずれかによるＤＮＡ担体と接触させて、ＤＮＡ担体を細胞に取り込ませ、該活性剤を細胞内部で放出させて細胞への細胞毒性または他の生物学的作用を生成することを含む、方法に関する。該細胞または組織をビンビボまたはインビトロでＤＮＡ担体と接触させてもよい。細胞をインビトロでＤＮＡ担体と接触させる場合、細胞は、典型的には細胞培養されており、ＤＮＡ担体は、その培地に添加され、細胞表面への結合を可能にする期間、細胞と共にインキュベートされて、余分なＤＮＡ担体が除去される。活性剤のエンドサイトーシスおよび放出に十分な期間の後、細胞に対する活性剤の細胞毒性または生物学的活性を、顕微鏡で視覚化することができる。細胞をインビボでＤＮＡ担体と接触させる場合、所望の作用部位への注射、輸液、局所投与を介して、または他の適切な方法により、細胞表面への結合およびエンドサイトーシスを可能にする期間、ＤＮＡ担体を患者または動物へ投与する。細胞内に放出される活性剤の細胞毒性または生物学的活性は、生理学的応答をモニタリングすることにより、または罹患した組織の試料の顕微鏡検査により決定することができる。
さらなる態様において、本発明は、細胞または組織への活性剤の前述のインビボ送達方法を利用して、ＤＮＡ担体を、必要とする患者に送達することにより、疾患または状態を処置する方法に関する。処置の特異性に関して、標的化剤は、一般に、細胞毒性または他の生物学的活性が望ましい細胞型にとって特異的であるように選択される。活性剤は、処置される疾患または状態に対して治療活性であるように選択され、ＤＮＡ担体は、疾患または状態の症状を処置、治癒または改善するのに十分な量および期間、患者に投与される。ＤＮＡ担体の投与により処置可能な疾患および状態としては、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする活性剤が利用可能な任意の疾患または状態が挙げられる。非限定的例としては、癌、マラリア、真菌性疾患、ウイルス性疾患、線維性疾患などが挙げられる。
処置を実行するために、合成ＤＮＡ担体を、例えば組織または細胞への外用または注射により、処置される組織または細胞に局所投与してもよい。あるいは合成ＤＮＡ担体を、例えば静脈注射もしくは輸液により、または経口投与により、全身投与してもよい。いずれかの実施形態において、存在するならばＤＮＡ担体に連結された標的化剤が、処置される細胞型へのＤＮＡ担体の結合、およびその細胞型への活性剤の送達を促進する。
具体的な実施形態において、Ｇ８エピトープを標的化するモノクローナル抗体に連結されたＤＮＡデンドリマーと、ＤＮＡをインターカレートするサイトトキシンと、を含むＤＮＡ担体の投与により、後嚢混濁（ＰＣＯ）が予防されるか、またはその発症率が低下する。ＰＣＯは、白内障手術後の特定の成人および小児に起こり、水晶体上皮細胞および筋線維芽細胞が分化することにより発症して、水晶体を取り囲む嚢の透明性に影響を及ぼす。現在、ＰＣＯを予防するための有効な処置はない。ヒト水晶体組織内の筋線維芽細胞が、骨格筋特異性転写因子ＭｙｏＤ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤ノギン、およびＧ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識される細胞表面分子、を発現するＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞を起源とすることが発見された。白内障手術を受けた患者から得たヒト水晶体組織の組織片培養におけるＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞のディプリーションが、標的化剤としてのＧ８ ｍＡｂおよびインターカレートされたドキソルビシンを用いて、それらの細胞を本発明によるＤＮＡ担体（ＤＮＡデンドリマー）で溶解することにより完遂された。Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞は、以下の実施例に示す通り、特異的に排除された。このデータから、経時的な筋線維芽細胞の蓄積が予防されるであろうことも、推定することができる。
実施例
実施例１：横紋筋肉腫細胞におけるＧ８ ｍＡｂコンジュゲートデンドリマーの内在化
細胞
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：ＤＮＡデンドリマーは、過去に開示された通り製造した（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、特許明細書第５，１７５，２７０号、同第５，４８４，９０４号、同第５，４８７，９７３、同第６，１１０，６８７号および同第６，２７４，７２３号参照）。簡潔に述べると、各ＤＮＡ鎖の中心部分に相補的に配置された配列の一領域を共有する２つのＤＮＡ鎖から生成されたＤＮＡモノマーから、ＤＮＡデンドリマーを構築した。２つの鎖をアニーリングしてモノマーを形成するが、得られた構造は、４つの一本鎖「アーム」に隣接する中央の二本鎖「ウエスト」を有すると説明することができる。このウエスト＋アーム構造は、塩基性の３ＤＮＡ（登録商標）モノマーを含む。５つのモノマータイプそれぞれの端部にある一本鎖アームは、精密で特殊な方法により互いに相互作用するように設計されている。相補性モノマーのアームの間の塩基対合が、モノマー層の連続付加を通してデンドリマーの定方向の構築を可能にする。デンドリマーの各層の構築は、ＤＮＡ鎖が互いに共有結合する架橋工程を含み、それにより別の方法ではデンドリマー構造の変形を引き起こす変性条件に耐える完全に共有結合の分子を形成する。加えて、相補性キャプチャーオリゴとして働く３８塩基のオリゴヌクレオチドが、以下に示す通り、簡単なＴ４ ＤＮＡリガーゼ依存性ライゲーション反応により、利用可能なデンドリマーアームの５’末端にライゲートされる。
ＤＮＡデンドリマーへのキャプチャー配列の付着：Ｇ８モノクローナル抗体（Ｇ８ ｍＡｂ）をＤＮＡデンドリマーに付着させるために、キャプチャー配列を、最初、デンドリマーアームの１０〜１５％にライゲートさせた。このキャプチャー配列への相補性オリゴヌクレオチドを、市販の化学薬品（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ， ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）を用いてＧ８モノクローナル抗体にコンジュゲートして、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせた。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のＧ８ ｍＡｂを付着させた。
デンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチドの隣接部分を重複させる架橋オリゴヌクレオチドを使用した簡単な核酸ライゲーション反応により、低分子（１５〜１００ヌクレオチド）ＤＮＡまたはＲＮＡキャプチャーオリゴヌクレオチド（または他の生化学的類似体）をデンドリマーアームの末端に共有結合させて、それによりキャプチャーオリゴヌクレオチドをデンドリマーアームの末端に架橋させた。架橋したオリゴヌクレオチドは、核酸リガーゼ酵素（好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼ酵素）のライゲーション活性を促進するために、隣接するデンドリマーアームおよびキャプチャーオリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基を重複させたが、各配列の少なくとも７塩基の重複が好ましい。架橋したオリゴヌクレオチドは、デンドリマーが非デンドリマー核酸または他の分子の特異的標的化に用いられる場合には、その相補配列の核酸ブロッカーとして作用することもできる。
以下の成分をマイクロ遠沈管に添加した：
１．１×ＴＥ緩衝液 ５．４μＬ（２６８０ｎｇ）中の二層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）
２．ａ（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ） ２．７μＬ（１３４ｎｇ）
３．１０× リガーゼ緩衝液 １０．２μＬ
４．ヌクレアーゼ不含水 ８１．７μＬ
５．Ｃａｐ０３キャプチャーオリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／μＬ） ４．０μＬ（２００ｎｇ）
６．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ） １０．０μＬ（１０単位）
最初の４つの反応体を一緒に添加し、６５℃に加熱後、室温に冷却した。その後、５番目と６番目の反応体を添加し、４５分間インキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液２．８μＬを添加して、ライゲーション反応を停止させた。１００ｋカットオフ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）の使用により、ライゲートされていないオリゴヌクレオチドを除去し、精製洗浄の間に、緩衝液を１×滅菌ＰＢＳ，ｐＨ７．４に交換した。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、デンドリマーの最初の一本鎖表面アームに連結する。
ＤＮＡデンドリマーの抗体付着および蛍光標識：細胞表面を標的化して内在化を開始するために、Ｇ８モノクローナル抗体をＤＮＡデンドリマーに連結させた。Ｇ８モノクローナル抗体は、予めデンドリマーにライゲートされたキャプチャー配列に相補性のオリゴヌクレオチドに共有結合により付着させた。手短に述べると、キャプチャー配列相補体（ｃｐｌＣａｐ０３） ５’−ＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴ ＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２）を、市販の化学薬品を用いて、３’末端によりＧ８モノクローナル抗体（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）に共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して余分な試薬を除去した。これらのコンジュゲートを、その後、試薬の最終的な構築の間にデンドリマーキャプチャー配列にハイブリダイズさせた（以下の３ＤＮＡ調製の節を参照）。加えて、ＤＮＡデンドリマーの外表面のアームに相補性の合成オリゴヌクレオチド（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３’および５’末端にそれぞれ１つずつとし、２つの蛍光標識（Ｃｙ３）を有するように調製した。このオリゴヌクレオチドを、その後、先に調製されたＧ８ ｍＡｂ標的デンドリマーの外側のアームに、オリゴヌクレオチド１８モル対ＤＮＡデンドリマー１モルの量でハイブリダイズした。Ｇ８ ｍＡｂ標的化Ｃｙ３で標識したＤＮＡデンドリマーを、横紋筋肉腫細胞による標的化および内在化試験に用いた。
横紋筋肉腫細胞におけるＣｙ３標識デンドリマーをコンジュゲートされたＧ８モノクローナル抗体の内在化
ヒト胎児型および胞巣型横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣの細胞株１３６および２０６１）を、培地８ｍｌが入った１００ｎｍ組織培養皿中のガラス製カバースリップ（１２カバースリップ／プレート）上で２４時間培養した。１３６細胞株は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭで培養した。２０６１細胞株は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで培養した。カバースリップを以下の培地１ｍｌを含有する３５ｍｍ組織培養皿に移した（２枚カバースリップ／皿）：
１．２μＭ希釈標準溶液に１：５００希釈されたＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ １８９原液（１ｍＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地
２．２μＭ ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ＋１：７５希釈されたＧ８：４ｎ デンドリマー−Ｃｙ３を含む培地
細胞を空気中の５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を３７℃のＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。細胞を落射蛍光顕微鏡測定により視覚化した。様々な希釈およびインキュベーション時間を、テストした。１時間インキュベートされた１：５００ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ＋１：７５ Ｇ８：デンドリマーが、最良の結果をもたらした。結果を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示すが、それらは横紋筋肉腫細胞において標識されたデンドリマーの内在化成功を示している。図１Ａは、酸性ｐＨで緑色蛍光を発するＬＹＳＯＳＥＮＳＯＲ色素で標識された細胞を示す（図１Ａでは細胞内の黒いスポットに集まっている）。図１Ｂは、細胞内のＣｙ３標識デンドリマーからの赤色蛍光を示す（図１Ｂでは細胞内の黒いスポットに集まっている）。図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂの結合画像であり、緑色シグナルと赤色シグナルの共局在化を示し黄色として視覚化されており、図１Ｃでは細胞内の矢印により示された黒いスポットとして示されている。これらの結果から、ＤＮＡデンドリマーに連結されたＧ８ ｍＡｂが細胞の酸性コンパートメント（即ち、リソゾーム）に内在化されることが確認される。
実施例２：Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞の標的化ディプリーション
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：二層ＤＮＡデンドリマーを、実施例１に記載された通り付着されたキャプチャー配列を用いて調製した。キャプチャー配列を、デンドリマーアームの１０〜１５％にライゲートさせた。
ＤＮＡデンドリマーへのＧ８ ｍＡｂの付着：Ｇ８モノクローナル抗体（Ｇ８ ｍＡｂ）を、同じく実施例１に記載された通りＤＮＡデンドリマーに付着させた。最初に、キャプチャー配列に相補性のオリゴヌクレオチド（ｃｐｌＣａｐ０３）の３’末端を、市販の化学薬品（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ， ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）を用いてＧ８モノクローナル抗体にコンジュゲートした。コンジュゲートをＨＰＬＣにより精製して、余分な試薬を除去した。キャプチャー配列およびそのキャプチャー配列の相補体を、その後、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせた。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のＧ８ ｍＡｂを付着させた。
ドキソルビシン二本鎖オリゴヌクレオチドＧ８抗体の調製：Ｇ８ ｍＡｂオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）１．２８２μｇを、相補性オリゴヌクレオチド配列（配列番号：２）１．２８２μｇおよび２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混和し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンを、蛍光分析法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシン二層デンドリマーの調製（標的化なし）：二層Ｃａｐ ０３デンドリマー（３μｇ）を、２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混合し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整して、３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであり、最終的なデンドリマー濃度は、１０ｎｇ／μｌであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンおよびデンドリマー濃度を、蛍光分析法およびＵＶ／Ｖｉｓ分光法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシン二層Ｇ８標的化デンドリマーの調製：二層Ｃａｐ ０３デンドリマー（３μｇ）を、Ｇ８ ｍＡｂオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）１．２８２μｌおよび２００μＭ Ｄｏｘ溶液 １５００μｌと混合し、以下の表に従って滅菌１×ＰＢＳを用いて、最終容量を３０００μｌに調整した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。３ｍＬ溶液中のＤｏｘの最終濃度は、１００μＭであり、最終的なデンドリマー濃度は、１０ｎｇ／μｌであった。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造業者のプロトコルに従って試薬を精製した。５Ｍ ＮａＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１６μｌを添加して、８６ｍＭ ＮａＣｌ濃度を得た。最終的なドキソルビシンおよびデンドリマー濃度を、蛍光分析法およびＵＶ／Ｖｉｓ分光法により決定した。
Figure 0006346265
ドキソルビシンをインターカレートされたＤＮＡデンドリマーをコンジュゲートされたＧ８モノクローナル抗体によるヒト水晶体組織中のＭｙｏ／Ｎｏｇ細胞の標的化：白内障手術の際に嚢切開により除去されたヒト前部水晶体組織を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＤＦ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に採取した。水晶体組織を、以下のものを含むＤＦ ２４０μｌを含む８ウェルチャンバー組織培養スライドに移した：
１．添加なし
２． Ｇ８Ａｂ／Ｃａｐ０３オリゴ／ＣＰＬ −Ｄｏｘ ＤＦに１：８希釈された
３． 二層Ｇ８ Ａｂ／Ｃａｐ０３オリゴ／Ｃｐｌオリゴ − ＤＦで１：８に希釈
４． 二層Ｃａｐ０３ − ＤＦ中に１：８に高度に希釈
レンズがスライドの底に沈むまで、レンズをチャンバー内で浮遊させた。レンズを空気中の５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養した。組織をＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、その後、Ｇ８抗体およびＡｌｅｘａ４８８でコンジュゲートされた抗マウスＩｇＭと、ローダミンチャネルの下で蛍光を発するＲＯＣＨＥ ＴＵＮＥＬキットの試薬で二重標識した。
Ｇ８＋およびＴＵＮＥＬ＋細胞の割合、ＴＵＮＥＬを含むＧ８＋細胞の割合、ならびにＧ８を含むＴＵＮＥＬ＋細胞の割合を、落射蛍光顕微鏡測定により決定した。結果を、以下の表に示す：
Figure 0006346265
未処置培養物では、１％未満の細胞がＴＵＮＥＬ＋であった（図２Ａ）。加えて、Ｄｏｘのみを含むデンドリマー（ＤＮＡ：ＤＯＸ）は、赤色の染色がないことから示される通り、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞またはＧ８陰性水晶体細胞（図２Ｂ）においてアポトーシスを誘導しなかった。しかし、Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂにコンジュゲートされたデンドリマー（Ｇ８：ＤＮＡ：ＤＯＸ）は、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞にアポトーシスを特異的に誘導した（図２Ｃおよび図２Ｄは異なる数の陽性細胞を含む培地の２つの異なる区分を示す）。Ｇ８含有細胞は緑色に染色され、アポトーシスを受けた細胞（ＴＵＮＥＬ＋）は、赤色に染色される。図２ＣのＴＵＮＥＬ＋細胞（赤色）は、黒色のスポットにより示され、図２ＤのＴＵＮＥＬ＋細胞（赤色）は、濃灰色のスポットにより示される。小さな黒色の斑点は、緑色に染色されたＧ８含有細胞である。
Ｄｏｘにインターカレートされた二本鎖オリゴにコンジュゲートされたＧ８ ｍＡｂもまた、Ｍｙｏ／Ｎｏｇ細胞内にアポトーシスを特異的に誘導した（データを示さない）。
実施例３：膵臓腫瘍細胞の標的化ディプリーション
二層ＤＮＡデンドリマーの調製：二層ＤＮＡデンドリマーを、デンドリマーアームの１０〜１５％へのキャプチャー配列の付着をはじめとし、実施例１に記載された通り調製する。
Ｇ８ ｍＡｂの代わりに、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（ＴｆＲペプチド、配列番号：１）をデンドリマーに連結させる。キャプチャー配列に相補性のｃｐｌＣａｐ０３オリゴヌクレオチドを、市販の化学薬品（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）を用いてＴｆＲペプチドの３’末端により共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して余分の試薬を除去し、利用可能なキャプチャー配列の全てを占有するモル比でハイブリダイズさせる。以下に要約する通り、デンドリマー分子あたりおよそ２〜５個のペプチドが付着される。
ドキソルビシン二本鎖オリゴヌクレオチドＴｆＲペプチドの調製：Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂ二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製のために、実施例１に記載された通り、ＴｆＲペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート（先に調製された通り）をキャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、Ｄｏｘと混和する。
ドキソルビシン二層デンドリマーの調製（標的化なし）：ＴｆＲペプチドの標的化を含まないドキソルビシン二層デンドリマーも、既に記載された通り調製する。
ドキソルビシン二層ＴｆＲペプチドを標的化するデンドリマーの調製：Ｄｏｘを含むＧ８ ｍＡｂデンドリマーの調製のために、実施例１に記載された通り、先に調製された二層ＴｆＲペプチドを標的化するデンドリマーをＤｏｘと混和した。
インビボマウス試験：マウスにおいて腫瘍形成を誘導するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ ２０ｍｌ中のＰＡＮ０２−Ｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを安定発現するネズミ膵臓癌細胞）２×１０５個を、Ｂ６マウスの膵臓に直接注射した。４週間後、マウスの眼窩後部に、１×ＰＢＳ（陰性対照）、ドキソルビシンを含むＴｆＲペプチド二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ドキソルビシンを含む非標的化ＤＮＡデンドリマー、またはドキソルビシンを含むＴｆＲ標的化ＤＮＡデンドリマーの１００μｌを注射する。注射は、１週間あたり２回を２週間とし、合計４回実施する。最後の投与後３日目にマウスを殺処分し、腫瘍、肝臓、脾臓を１０％ホルマリンで２時間固定し、パラフィン包埋切片を調製して、さらなる試験のためにスライド上に載せる。処置の結果である細胞死のレベルを決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。
インターカレートされたドキソルビシンを含むＴｆＲ標的化ＤＮＡデンドリマー、およびＴｆＲ標的化二本鎖オリゴヌクレオチドで処置されたマウスの腫瘍は、ＰＢＳ緩衝液対照またはＤｏｘを含む非標的化ＤＮＡデンドリマーのいずれかよりも有意に多くの細胞死を示した。
本明細書の発明は、特別な実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態が単に本発明の原理および適用例の例示であることは、理解されなければならない。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な改良および変更を本発明の方法および装置に施し得ることは、当業者に明白であろう。つまり本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれる改良および変更、ならびにその均等物を含むものとする。

Claims (16)

  1. 全体的または部分的に二本鎖の合成ＤＮＡ担体と、前記ＤＮＡ担体に連結された標的化剤と、前記ＤＮＡ担体の二本鎖部分にインターカレートされた活性剤とを含み、前記標的化剤が、Ｇ８抗原に結合する抗体またはペプチドである、
    細胞または組織への活性剤の送達のための組成物。
  2. 前記二本鎖ＤＮＡが、５塩基対を超える長さである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記活性剤が、水素結合を通して前記二本鎖ＤＮＡにインターカレートされている、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記合成ＤＮＡ担体がＤＮＡデンドリマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記ＤＮＡデンドリマーが、３〜２１６のハイブリダイズされたＤＮＡの一本鎖を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記活性剤が、化学療法薬、抗感染剤、抗マラリア剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記活性剤が、ベルベリン、アクリジン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、シスプラチン、カルボプラチンまたはサリドマイドである、請求項６に記載の組成物。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物と、医薬的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
  9. 細胞または組織に活性剤を送達するためのＤＮＡ担体を作製する方法であって、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築して全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを形成させること、標的化剤を前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡに連結させること、および前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを活性剤と接触させて、前記活性剤を前記ＤＮＡの二本鎖部分にインターカレートさせることを含み、前記標的化剤が、Ｇ８抗原に結合する抗体またはペプチドである、方法。
  10. 前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを前記活性剤と接触させると同時に、前記一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが構築される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡを、構築の後に前記活性剤と接触させる、請求項９に記載の方法。
  12. 前記活性剤と接触させる前に、前記標的化剤が前記全体的または部分的に二本鎖のＤＮＡに連結している、請求項１１に記載の方法。
  13. 細胞または組織を、請求項８に記載の医薬組成物と接触させることによって活性剤を前記細胞または組織に送達する方法において使用するための請求項８に記載の医薬組成物。
  14. 請求項８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することによって患者における疾患または状態を処置する方法において使用するための請求項８に記載の医薬組成物。
  15. 細胞または組織への活性剤の送達のための、請求項８に記載の医薬組成物。
  16. 患者における疾患または状態を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。
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