DE69836482T2

DE69836482T2 - Menschliches recq4 gen, das für eine helikase kodiert

Info

Publication number: DE69836482T2
Application number: DE69836482T
Authority: DE
Inventors: Akira Kamakura-shi SHIMAMOTO; Saori Kamakura-shi KITAO; Yasuhiro Kamakura-shi FURUICHI
Original assignee: Agene Research Institute Co Ltd Kamakura; Agene Research Institute Co Ltd
Current assignee: GENCECARE RESEARCH INSTITUTE CO.,LTD., KAMAKUR, JP
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2018-07-11
Also published as: EP0999273B1; EP0999273A4; US6472513B1; EP0999273A1; JP4113920B2; DE69836482D1; WO1999005284A1; US6335435B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das ein Protein codiert, das eine Helicase-Aktivität besitzt, ein Protein, das durch das Gen codiert wird, ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, und die Verwendung des Gens und des Proteins.
FACHLICHER HINTERGRUND
DNA-Helicasen sind wichtige Enzyme, die auf verschiedene biologische Reaktionen, an denen DNA beteiligt ist, in lebenden Körpern oder mikrobiellen Zellen einwirken, und es gibt eine Anzahl verschiedener Arten von DNA-Helicasen.
Das Auftreten einer großen Vielzahl von DNA-Helicasen wird deutlich durch die Tatsache demonstriert, dass die Reaktionen, an denen DNA beteiligt ist, eine Vielzahl von Reaktionen einschließen, wie etwa Replikation und Proliferation von Zellen, Entwicklung und Wachstum eines Individuums und den Erhalt des Lebens. Von den anerkannten biochemischen Reaktionen, die auf zellulärer Ebene ablaufen, wird angenommen, dass es mindestens fünf Reaktionen gibt, einschließlich Replikation, Reparatur, Transkription, Auftrennung und Rekombination von DNA. Es ist allgemein bekannt, dass DNA-Helicasen bewirken, dass eine Duplex-DNA in Einzelstränge entflochten wird, und es wird angenommen, dass die Energie, die für die Durchführung solch einer Aktion erforderlich ist, durch die Hydrolyse von ATP bereitgestellt wird.
Unter den vielen Arten von DNA-Helicasen wurden kürzlich die RecQ-Typ-DNA-Helicasen gefunden, die jeweils eine Helicase-Domäne mit mindestens etwa 40 % Homologie zur Helicase-Domäne des Escherichia coli (E. coli)-recQ-Gens auf Aminosäure-Ebene aufweisen. Der Blick richtete sich auf die RecQ-Typ-Helicasen aufgrund ihrer Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und der Alterung bei Menschen. Beispielsweise ist das Bloom-Syndrom eine Krankheit, die häufig verschiedene Krebsarten in jungen Jahren auslöst, und das Werner-Syndrom ist eine genetische Krank heit, die vorzeitiges Altern und abnormalen Krebs auslöst. Es wurde kürzlich herausgefunden, dass diese Syndrome durch Mutation unterschiedlicher Gene verursacht werden, die verschiedene menschliche RecQ-Typ-DNA-Helicasen codieren (Cell, 83, S. 655–666, 1995 und Science, 272, S. 258–262, 1996).
Eine RecQ-Typ-Helicase wurde ursprünglich in E. coli durch Nakayama et al. gefunden (Mol. Gen. Genet., 195, S. 474–480, 1984). Zwei Arten von Genen codieren Proteine, die eine hohe Homologie zu der Helicase besitzen, die in Hefe und einer menschlichen Krebszelle gefunden worden sind und diese wurden als sgs1 (Gangloo et al., Mol. Cell. Biol. 14, S. 8391–8398, 1994) bzw. RecQ1 (Seki et al., Nuc. Acids Res., 22, S. 4566–4573, 1994) bezeichnet.
Als bekannte Helicasen, die zu dieser Familie gehören, gibt es in einzelligen Organismen wie etwa E. coli und Hefe nur die oben genannten E. coli RecQ-Helicase und sgs1; und in multizellulären Organismen (d.h. Menschen) Bloom-DNA-Helicase (Ellis et al., Cell, 83, S. 655–666, 1995) und Werner-DNA-Helicase (Yu et al., Science, 272, S. 258–262, 1996), die beide für die oben erwähnten Krankheiten verantwortlich sind, sowie RecQ1-Helicase, von der bisher nicht bekannt ist, dass sie bei Krankheiten eine Rolle spielt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines menschlichen RecQ4-DNA-Helicase-Gens, eines Proteins, das durch das Gen codiert wird, ein Verfahren zur Herstellung des Proteins und die Verwendung des Proteins und des Gens.
Die Erfinder des Vorliegenden nahmen an, dass es viele Mitglieder der RecQ-Familie von DNA-Helicasen neben den obigen drei Arten im Menschen gibt. Die Erfinder nahmen ebenfalls an, dass, wenn Gene solcher Helicasen einer Mutation unterworfen werden, die Gene verschiedene Krankheiten auslösen könnten, wie sie im Bloom-Syndrom und im Werner-Syndrom beobachtet werden und sogar die ursächlichen Gene für nicht-behandelbare Krankheiten sein könnten, deren Äthiologien bisher unbestimmt sind. Die Erfinder führten intensive und umfangreiche Studien durch, um die oben erwähnten Aufgaben zu lösen. Im Ergebnis gelang es den Erfindern, ein neues menschliches RecQ4-DNA-Helicase-Gen mittels der so genannten RACE-Methode zu klonieren. Dieser Erfolg führte zur Realisierung der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen bereit, das ein Protein mit Helicase-Aktivität codiert, wobei:

(a) das Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 umfasst; oder
(b) das Gen eine DNA umfasst, die die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID 1 umfasst.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Vektor bereit, der das Gen enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine nicht-humane Transformante bereit, die den rekombinanten Vektor enthält.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines Oligonukleotids zum Nachweis eines Gens der Erfindung vor, wobei das Oligonukleotid mindestens einen Teil eines Gens umfasst, welches eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfasst, wobei das Oligonukleotid in der Lage ist, an ein Gen zu hybridisieren, das die DNA-Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das Helicase-Aktivität besitzt, bereit, das das Kultivierung der Transformante und die anschließende Gewinnung des Proteins aus der resultierenden Kultur umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein rekombinantes Protein bereit, das

(a) die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2; oder
(b) ein Protein mit einer Deletion des ersten Methionins (met) in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 umfasst.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das eine Helicase-Aktivität besitzt, bereit, das das Kultivieren der Transformante und die anschließende Gewinnung des Proteins aus der resultierenden Kultur umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Antikörper bereit, der spezifisch mit dem Protein reagiert und der ausgewählt ist aus einem monoklonalen und einem polyklonalen Antikörper. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper sein.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Hybridom bereit, das den monoklonalen Antikörper produziert, und das durch Zellfusion einer Antikörper produzierenden Zelle, die mit dem Protein immunisiert wurde, mit einer Myelomzelle hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Kit zum Diagnostizieren einer Krankheit bereit, die durch die genetische Abnormalität eines Gens verursacht wird, das ein Protein mit einer Helicase-Aktivität codiert, wobei das Kit das Protein und den monoklonalen Antikörper und/oder den polyklonalen Antikörper umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein nicht-humanes, transgenes Tier bereit, in das das Gen in der modifizierten Form eingebracht wurde, wobei die Modifikation so erfolgte, dass das Expressionsniveau des Gens erhöht oder verringert ist.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das Gen gemäß der vorliegenden Erfindung codiert eine neue humane RecQ4-DNA-Helicase und codiert ein Protein, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung enthält sieben Helicase-Motive der bekannten RecQ-Typ-DNA-Helicase, die zwischen E. coli, Hefe und dem Menschen auf Aminosäure-Ebene gut konserviert sind, wie in 2 dargestellt ist. Wie durch die Ergebnisse des Radiation Hybrid Mappings, die in 3 dargestellt sind, deutlich demonstriert wird, wird bestätigt, dass das humane RecQ-Typ-DNA-Helicase-Gen der vorliegenden Erfindung sich auf dem langen Arm des humanen Chromosoms 8, 8q24.3, befindet, wie in 4 dargestellt ist. Gene, die von anderen Arten stammen und die dem vom Menschen stammenden Gen der vorliegenden Erfindung entsprechen, können ebenfalls mittels bekannter Techniken kloniert werden.
Aus den Ergebnissen der Multi-Gewebe-Northern Blot-Analyse zur Bestimmung des Expressionsniveaus des Gens der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Organen (siehe 5) erkennt man, dass die Expression des Gens in allen untersuchten Geweben beobachtet wird, und eine bemerkenswert intensive Expression insbesondere in Thymus und Testis beobachtet wird.
Diese Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass das Gen der vorliegenden Erfindung eines der Gene ist, die für die Aufrechterhaltung der fundamentalen Homöostase lebender Körper verantwortlich sind. Dementsprechend ist das Gen zum Studium der Entwicklung und der Alterung von Individuen nützlich. Die Aufklärung der Expressionsregulation des Gens ist ebenfalls nützlich bei der Aufklärung des Mechanismus zur Aufrechterhaltung der fundamentalen Homöostase lebender Körper wie auch bei der Entwicklung neuer Pharmazeutika zur Aufrechterhaltung der fundamentalen Homöostase des Lebens.
Das Gen der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch die folgenden Methoden identifiziert und erhalten werden.
1. Klonierung von menschlichem RecQ-Typ-DNA-Helicase-Gen
Das Gen der vorliegenden Erfindung (im Folgenden auch als "humanes RecQ4-Gen" oder "humanes RecQ-Typ-DNA-Helicase-Gen" bezeichnet) kann mittels Durchführung der RACE-Methode (Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman, M.A. et al., Methods Enzymol., Bd. 218, S. 340–358, 1993) hergestellt werden, basierend auf der Kombination der Grundsätze der Long Distance (LD)-PCR-Methode und der Supressions-PCR-Methode.
Das heißt, dass ein DNA-Fragment, das eine Teilsequenz des bekannten humanen RecQ-Typ-DNA-Helicase-Gens umfasst, und DNA-Fragmente unbekannter Sequenzen, die jeweils die 5'- und 3'-Enden aufweisen, getrennt voneinander amplifiziert und anschließend miteinander verbunden werden, wodurch sich das humane RecQ-Typ-DNA-Helicase-Gen der vorliegenden Erfindung in Form einer cDNA der gesamten Länge ergibt. In der vorliegenden Erfindung kann die cDNA der gesamten Länge beispielsweise unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits, wie etwa dem Marathon^TM cDNA-Amplifizierungskit, hergestellt von CLONTECH, kloniert werden.
Zunächst wird ein DNA-Fragment amplifiziert, das die vom Menschen stammende bekannte Sequenz umfasst. Die bekannte Sequenz kann aus poly(A)+RNA hergestellt werden, die aus einem menschlichen Gewebe oder Organ stammt, wie etwa poly(A)+RNA, die aus menschlichem Testis oder Milz stammt. Die RNA wird mit reverser Transkriptase behandelt, um cDNA zu synthetisieren, welche anschließend einer RT-PCR unterzogen wird, um ein cDNA-Teilfragment herzustellen [1(1)]. Das cDNA-Teilfragment wird sequenziert. Basierend auf der ermittelten Sequenz werden vier Arten Gen-spezifischer Primer (GSPs) konstruiert, die jeweils als "5'GSP1" und "5'GSP2" bzw. "3'GSP1" und "3'GSP2" bezeichnet werden. Diese GSPs sind für die Amplifikation von DNA-Fragmenten unbekannter Sequenzen erforderlich, die sich upstream von der 5'-Region bzw. downstream von der 3'-Region der cDNA-Teilsequenz befinden. Die GSPs besitzen Nukleotidsequenzen, die in geeigneter Weise aus der Sequenz der Teil-cDNA ausgewählt sind, und können chemisch syntheti siert werden. In der vorliegenden Erfindung sind "5'GSP1" und "5'GSP2" diejenigen GSPs, die für die Amplifikation des Fragments unbekannter Sequenz verwendet werden, das sich upstream von der 5'-Region der Teil-cDNA befindet, und " 3'GPS1" und " 3'GSP2" diejenigen, die für die Amplifikation des Fragments unbekannter Sequenz verwendet werden, das sich downstream von der 3'-Region der Teil-cDNA befindet, wie in einem Kasten der 1(1) dargestellt ist.
Als nächstes werden die DNA-Fragmente, die sich upstream von der 5'-Region und downstream von der 3'-Region der Teil-cDNA befinden, getrennt amplifiziert [1(2)]. Als Matrizen für die Amplifikation können im Handel erhältliche cDNAs verwendet werden, die aus menschlichem Testis, Milz oder ähnlichen stammen, wie etwa cDNA Ready^TM, hergestellt von CLONTECH. Obwohl die Sequenzen der Matrizen-DNA-Fragmente unbekannt sind, besitzt jede von ihnen eine Adaptersequenz, die am Ende angebracht ist. Die Amplifizierungsreaktion (LD-PCR) der cDNA-Fragmente unbekannter Sequenzen, die angefügte Adaptersequenzen besitzen, wurde zwei Runden lang getrennt durchgeführt unter Verwendung von Primern, die an die Adaptersequenzen hybridisieren (im Folgenden einfach als "Adapter-Primer" (APs) bezeichnet), und den GSPs als Primern (1(2)). Zum Beispiel kann die unbekannte 5'-Sequenz durch Durchführung der ersten PCR unter Verwendung von AP1 und 5'GSP1, und anschließender Durchführung der zweiten PCR unter Verwendung des in der ersten PCR hergestellten Fragments als der Matrize und Primern (AP2 und 5'GSP2), die jeweils an innere Regionen relativ zu den Regionen für AP1 und 5'GSP1 hybridisieren (d.h. nested PCR), amplifiziert werden. Die unbekannte 3'-Sequenz kann ebenfalls auf dieselbe Weise wie die unbekannte 5'-Sequenz unter Verwendung von 3'GSP1 und 3'GSP2 amplifiziert werden.
In der vorliegenden Erfindung wird das DNA-Fragment, das sich upstream von dem bekannten Fragment befindet, als "5'-RACE-Produkt" bezeichnet, und das DNA-Fragment, das sich downstream von dem bekannten Fragment befindet, wird als " 3'-RACE-Produkt" bezeichnet. Da jeder AP die gleiche Sequenz besitzt wie die überhängende Sequenz des entsprechenden Adapters, kann er nicht an den Adapter annea len und die Verlängerungsreaktion bei der ersten Amplifikation beginnt erst beim Gen-spezifischen Primer (GSP) (dies wird "Suppressions-PCR" genannt).
Die Nukleotidsequenz der resultierenden cDNA kann durch ein PCR-basierendes Verfahren ermittelt werden, wie es von Hattori et al. (Electrophoresis 13, S. 560–565, 1992) beschrieben ist. Das heißt, dass die Reaktion unter Verwendung eines PRISM-Sequenzierungskits durchgeführt wird, das einen Fluoreszenzfarbstoff-Deoxyterminator enthält, hergestellt von Perkin Elmer, die Nukleotidsequenz unter Verwendung eines Autosequenzierers, hergestellt von Applied Biosystem (Modell ABI 373), ausgelesen wird und die Daten am Computer (z.B. Macintosh Computer) analysiert werden, der an den Autosequenzierer angeschlossen ist.
Die Nukleotidsequenzen der bekannten DNA-Teilsequenz, des 5'-RACE-Produkts und des 3'-RACE-Produkts werden miteinander assembliert, wodurch sich eine Nukleotidsequenz einer cDNA voller Länge ergibt. Das heißt, die überlappenden Bereiche zwischen den Sequenzen werden miteinander verbunden, um eine Nukleotidsequenz zu ergeben, die die 5'- und 3'-Endregionen aufweist (1).
Die Nukleotidsequenz des Gens der vorliegenden Erfindung und die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das Gen codiert wird, sind jeweils in SEQ ID Nr.1 bzw. 2 dargestellt. Ein Protein mit einer Deletion des ersten Methionins (Met) in der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 ist ebenfalls in den Proteinen der vorliegenden Erfindung umfasst. Zusätzlich zu den Nukleotidsequenzen, die die Aminosäuren codieren, die in dem Protein der vorliegenden Erfindung enthalten sind, umfasst das Gen der vorliegenden Erfindung auch eine degenerierte Variante des Gens, das das gleiche Protein codiert, welches sich nur in einem degenerierten genetischen Codon unterscheidet.
Sobald die Nukleotidsequenz bestimmt ist, kann das gewünschte Gen durch PCR unter Verwendung von Primern (z.B. solchen, wie sie in SEQ ID Nr. 35 und 36 dargestellt sind), die chemisch synthetisiert sind oder auf der ermittelten Nukleotidse quenz basieren, oder durch Hybridisierung unter Verwendung eines DNA-Fragments, das die ermittelte Nukleotidsequenz besitzt, als Sonde hergestellt werden.
2. Herstellung von rekombinantem Vektor und Transformante
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann durch Einbau des Gens in einen geeigneten Vektor hergestellt werden. Die Transformante der vorliegenden Erfindung kann durch Einschleusen der rekombinanten Vektor-DNA in einen Wirt hergestellt werden, welcher für einen Vektor kompatibel ist, der für die Herstellung des rekombinanten Vektors verwendet wurde.
Das Gen wird in gereinigter Form in eine Restriktionsschnittstelle oder eine Multiklonierungsstelle eines geeigneten Vektors eingefügt, um einen rekombinanten Vektor zu ergeben, wobei dieser rekombinante Vektor anschließend verwendet wird, um eine Wirtszelle zu transformieren.
Die Vektor-DNA, in welche das DNA-Fragment eingefügt wird, ist nicht speziell eingeschränkt, und jeder kann verwendet werden, vorausgesetzt, sie kann in der Wirtszelle repliziert werden, wie etwa Plasmid-DNA, Phagen-DNA oder ähnliche. Beispiele für Plasmid-DNA umfassen Plasmid pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pBluescript SK+ (Stratagene) und pGEM-T (Promega). Beispiele für Phagen-DNA umfassen M13mp18 und M13mp19.
Der Wirt ist nicht speziell eingeschränkt, vorausgesetzt, dass er das fragliche Gen exprimieren kann, und er kann entweder eine eukaryotische oder eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele für den Wirt umfassen Bakterien (z.B. E. coli Bacillus subtilis), Hefe (z.B. Saccharomyces cerevisiae) und tierische Zellen (z.B. COS-Zellen, CHO-Zellen).
Wenn ein Bakterium wie etwa E. coli als Wirt verwendet wird, wird bevorzugt, dass der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, sich autonom zu replizieren und gleichzeitig einen Aufbau hat, umfassend einen Promotor, die DNA der vorliegenden Erfindung und eine Transkriptions-Terminationssequenz. E. coli kann beispielsweise XLi-Blue (Stratagene) oder JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) sein, und der Expressionsvektor kann pBTrp2 sein. Der Promotor kann jeglicher Art sein, vorausgesetzt, dass er in einem Wirt (z.B. E. coli) exprimiert werden kann. Beispiele für solch einen Promotor umfassen den trp-Promotor, lac-Promotor, PL-Promotor und PR-Promotor, die aus E. coli und Phagen stammen.
In der vorliegenden Erfindung kann die Transformation beispielsweise nach dem Verfahren nach Hanahan (Techniques for Transformation of E. coli in DNA Cloning, Bd. 1, Glover, D.M., Hrsg., S. 109–136, IRL Press, 1985) durchgeführt werden.
Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, kann der Expressionsvektor YEp13 oder YCp50 sein, und der Promotor kann gal1-Promotor oder gal10-Promotor sein. Das Einschleusen des rekombinanten Vektors in die Hefe kann mittels Elektroporations-Verfahren (Methods. Enzymol., 194, S. 182–187, 1990), Spheroplasten-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, S. 1929–1933, 1978), Lithiumacetat-Verfahren (J. Bacteriol., 153, 163–168, 1983) oder ähnliche durchgeführt werden.
Wenn eine tierische Zelle als Wirt verwendet wird, kann der Expressionsvektor pcDNAI und pcDNAI/Amp (Invitrogen) sein. Das Einschleusen des rekombinanten Vektors in die tierische Zelle kann mittels Elektroporations-Verfahren, Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren oder ähnliche durchgeführt werden.
Wenn beispielsweise eine Plasmid-DNA als eine Vektor-DNA verwendet wird und ein EcoRI-DNA-Fragment in diese eingefügt wird, kann die Plasmid-DNA zuvor mit einem Restriktionsenzym EcoRI (NEB) verdaut werden. Die verdaute Vektor-DNA kann mit dem fraglichen DNA-Fragment gemischt werden, und anschließend kann beispielsweise T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit dem Gemisch zur Reaktion gebracht werden, wodurch ein rekombinanter Vektor erhalten wird.
Die Selektion des transformierten Stamms kann mittels Koloniehybridisierung unter Verwendung eines DNA-Fragments, das einen Abschnitt des fraglichen Gens als Sonde enthält, oder mittels eines PCR-Verfahrens unter Verwendung eines 5'-Primers (FP; Forward Primer), der basierend auf der Nukleotidsequenz des fraglichen Gens synthetisiert wird, und eines 3'-Primers (RP; Reverse Primer), der basierend auf der Nukleotidsequenz von DNA, die komplementär zum fraglichen Gen ist, synthetisiert wird, und der Auswahl von Kolonien, die das fragliche Gen enthalten, durchgeführt werden.
3. Herstellung von Protein (Polypeptid), das durch humanes RecQ4-Gen codiert wird
Die Transformante, die den rekombinanten Vektor enthält, der wie oben erwähnt erzeugt wurde, wird kultiviert, um das Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen. Das Kultivierungsverfahren kann ein herkömmliches Festkultur-Verfahren sein. Für diesen Zweck wird jedoch vorzugsweise ein Flüssigkultur-Verfahren angewendet.
Das Kulturmedium, das zum Kultivieren der Transformante verwendet wird, kann beispielsweise eines sein, das mindestens eine Stickstoffquelle (z.B. Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt) umfasst und das mit mindestens einem anorganischen Salz (z.B. Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-Chlorid) und wahlweise einem anderen Zusatzstoff(en) (z.B. einer Kohlenhydratquelle, einem Antibiotikum, einem Vitamin) in geeigneter Weise ergänzt wurde. Falls nötig kann IPTG oder ähnliches dem Kulturmedium zugegeben werden, um die Expression des Gens zu induzieren. Das Kulturmedium wird anfangs auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 eingestellt, und die Kultivierung erfolgt üblicherweise 14–20 Stunden lang bei 36–38 °C, vorzugsweise bei etwa 37 °C, durch ein belüftetes Rührkultur-Verfahren, Schüttelkultur-Verfahren oder ähnliche.
Nachdem die Kultivierung beendet ist, kann das Protein der vorliegenden Erfindung aus der Kultur mittels eines herkömmlichen Proteinreinigungsverfahrens wie folgt gewonnen werden.
Die Zellen werden durch lytische Behandlung mit einem Enzym (z.B. Lysozym), Aufbrechen durch Ultraschallbehandlung, Aufbrechen durch mechanische Behandlung oder ähnliches aufgebrochen, wodurch das Protein, das durch das Gen der vorliegenden Erfindung codiert ist, aus den Zellen freigesetzt wird. Anschließend wird die unlösliche Materie aus der Lösung mittels Filtration, Zentrifugation oder ähnlichem entfernt, um eine Rohproteinlösung zu ergeben.
Das Protein kann aus der Rohproteinlösung mittels eines herkömmlichen Proteinreinigungsverfahrens gereinigt werden. Als solch ein Verfahren können beispielsweise das Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionentausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Elektrophorese oder ähnliche allein oder in Kombination eingesetzt werden.
4. Herstellung von monoklonalem Antikörper
Der monoklonale Antikörper, der spezifisch für das Protein ist, das durch humanes RecQ4-Gen der vorliegenden Erfindung codiert wird, kann wie folgt hergestellt werden.
(1) Herstellung von Antigen
Das Protein, das wie in Abschnitt 3 oben beschrieben hergestellt wurde, wird in einer Pufferlösung gelöst, und anschließend wird ein Adjuvans zugegeben. Als solch ein Adjuvans kann im Handel erhältliches komplettes oder inkomplettes Freund's Adjuvans oder ähnliches allein oder in gemischter Form verwendet werden.
(2) Immunisierung und Isolierung von Antikörper produzierenden Zellen
Das wie oben beschrieben hergestellte Immunogen wird einem Säugetier (z.B. Ratte, Maus) verabreicht. Eine einzelne Dosis des Antigens, die zur Immunisierung verwendet wird, kann aus 10–500 μg pro Tier bestehen. Das Tier kann durch intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion des Antigens immunisiert werden. Das Immunisierungsintervall ist nicht speziell eingeschränkt und die Immunisierung kann in Intervallen von mehreren Tagen bis mehreren Wochen, vorzugsweise 1–3 Wochen, 2–5 Mal, vorzugsweise 3–4 Mal, durchgeführt werden. Zwei bis sieben Tage, vorzugsweise vier oder fünf Tage nach der letzten Immunisierung werden die Antikörper produzierenden Zellen isoliert. Solche Antikörper produzierenden Zellen können Milzzellen, Lymphknotenzellen, periphere Blutzellen, und vorzugsweise Milzzellen oder lokalisierte Lymphknotenzellen sein.
(3) Zellfusion
Die Myelomzellen, die zur Zellfusion mit den Antikörper produzierenden Zellen verwendet werden, können von einer üblicherweise allgemein erhältlichen etablierten Zelllinie eines Tiers (z.B. Maus) stammen. Die verwendete Zelllinie ist vorzugsweise eine, die eine Arzneimittelselektivität aufweist, und nicht in der Lage ist, in einem selektiven Medium (HAT-Medium; das Hypoxantin, Aminopterin und Thymidin umfasst) in ihrer nicht-fusionierten Form zu überleben, jedoch in der Lage ist, in solch einem selektiven Medium nur in ihrer mit einer Antikörper produzierenden Zelle fusionierten Form zu überleben. Spezifische Beispiele für die Myelomzelle umfassen eine Maus-Myelomzelllinie wie etwa P3U-1 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) und P3x63Ag8.653. Die Myelomzellen werden anschließend mit den Antikörper produzierenden Zellen fusioniert. Die Zellfusion kann durchgeführt werden, indem die Antikörper produzierenden Zellen mit den Myelomzellen in einem Verhältnis von 100–500 Zellen der Antikörper produzierenden Zellen pro 1 Myelomzelle, zum Beispiel durch Mischen gleicher Volumina eines Kulturmediums, das 10⁸ Zellen/ml der Antikörper produzierenden Zellen enthält, und eines Kulturmediums, das 2 × 10⁵ Zellen/ml der Myelomzellen enthält, gemischt werden, und das Gemisch anschließend einer Fusionsreaktion in Gegenwart eines die Fusion unterstützenden Mittels unterzogen wird. Zur Unterstützung der Zellfusion kann Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1500 Dalton oder ähnliches verwendet werden. Alternativ kann eine im Handel erhältliche Zellfusionsvorrichtung eingesetzt werden, die eine elektrische Stimulierung (z.B. Elektroporation) verwendet, um die Zellfusion der Antikörper produzierenden Zellen mit den Myelomzellen zu bewirken.
(4) Testen und Klonierung der Hybridome
Aus den Zellen nach der Zellfusionsbehandlung werden die gewünschten Hybridome getestet. Das Testen kann durch entsprechendes Verdünnen der Zellsuspension mit RPMI-1640-Medium, das fötales Kälberserum enthält, oder ähnlichem, Inokulieren der erhaltenen Verdünnungslösung in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte in einer Menge von etwa 5–10 Zellen/Vertiefung, Zugabe eines selektiven Mediums in jede Vertiefung, und anschließendem Inkubieren der Platte während das selektive Medium in den Vertiefungen in geeigneter Weise mit frischem Medium ersetzt wird, durchgeführt werden. Die gewünschten Hybridome können in Form der Zellen erhalten werden, die etwa 14 Tage nachdem die Kultivierung begonnen wurde gewachsen sind. Der Kulturüberstand der gewachsenen Hybridome wird anschließend auf die Anwesenheit der fraglichen Antikörper getestet. Das Testen kann nach einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, und das Verfahren ist nicht speziell eingeschränkt. Beispielsweise kann ein Teil des Hybridom enthaltenden Kulturüberstands aus den einzelnen Vertiefungen entnommen werden und einem Test mittels Enzymimmunassay (EIA), Radioimmunassay (RIA) oder ähnlichen unterzogen werden.
Das Klonieren der fusionierten Zellen erfolgt anschließend durch ein Verfahren der definierten seriellen Verdünnung oder ähnliche, um letztendlich Hybridome zu etablieren, die monoklonale Antikörper produzieren.
(5) Gewinnung monoklonaler Antikörper
Als Verfahren zum Gewinnen monoklonaler Antikörper aus den oben etablierten Hybridomen kann ein herkömmliches Zellkulturverfahren oder Ascites-Flüssigkeit-Produktionsverfahren eingesetzt werden. Im Fall eines Zellkulturverfahrens werden die Hybridome in einem Kulturmedium für tierische Zellen kultiviert, wie etwa RPMI-1640-Medium, das 10 % fötales Kälberserum enthält, MEM-Medium oder ein Serumfreies Medium unter herkömmlichen Kultivierungsbedingungen (z.B. 37 °C, 5 % CO₂) für 10–14 Tage, und die Antikörper können aus dem Kulturüberstand erhalten werden. Im Fall eines Ascites-Flüssigkeit-Produktionsverfahrens werden die Hybridome (etwa 5 × 10⁶ Zellen) intraperitoneal einem Tier der gleichen Art verabreicht, wie der Säuger aus dem die Myelomzellen stammen, wodurch die Hybridome dazu gebracht werden, in großem Maßstab zu wachsen. Ein bis zwei Wochen später wird die Ascites-Flüssigkeit oder das Serum aus dem Tier gewonnen. Bei diesem Antikörper-Gewinnungsverfahren kann, wenn es erforderlich ist, dass die Antikörper gereinigt werden, ein bekanntes Verfahren wie etwa das Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionentausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder Gel-Chromatographie, einzeln oder in Kombination eingesetzt werden.
5. Herstellung polyklonaler Antikörper
(1) Herstellung von Antigen
Das wie in Abschnitt 3 oben beschrieben hergestellte Protein wird in einer Pufferlösung gelöst und anschließend wird ein Adjuvans hinzugegeben. Solch ein Adjuvans kann im Handel erhältliches komplettes oder nicht-komplettes Freund's Adjuvans sein.
(2) Immunisierung
Das für die Immunisierung verwendete Tier kann ein Hase, Meerschweinchen, Ziege, Schaf oder ähnliches sein. Im Fall eines Hasen wird das Protein beispielsweise subkutan in die Hinterpfote, üblicherweise in einer Dosis von 100–500 μg zusammen mit komplettem Freund's Adjuvans injiziert. Nach zwei Wochen wird die gleiche Dosis des Antigens gemischt mit nicht-komplettem Freund's Adjuvans intramuskulär injiziert. Weitere zwei Wochen später wird die intramuskuläre Injektion wiederholt. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wird ein Teil des Bluts aus dem Ohr entnommen, und mittels EIA-Verfahren oder ähnlichem der Antikörpertiter bestimmt. Wenn der Antikörpertiter den erwünschten Wert erreicht, wird das gesamte Blut gewonnen. Falls jedoch der Antikörpertiter gering ist, wird die Immunisierung wiederholt bis der Antikörpertiter den erwünschten Wert erreicht. Die Antikörper werden dann aus dem Serum durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung gereinigt, wie in dem oben beschriebenen relevanten Abschnitt über die Reinigung der monoklonalen Antikörper erwähnt.
6. Reagens zum Nachweis von humanem RecQ4-Gen und dem Protein, das das Gen codiert
Humanes RecQ4-Gen besitzt einen hohen Grad an Homologie mit den für das Bloom-Syndrom und das Werner-Syndrom ursächlichen Genen, welche eine chromosomale Instabilität zur Folge haben und häufig Carcinogenese und Progerie auslösen (2), und die hohe Expression des Gens wird in verschiedenen humanen Geweben beobachtet (5). Daher kann man darauf schließen, dass das Gen eines der Gene ist, die DNA-Helicasen codieren, die für die Aufrechterhaltung der fundamentalen Homöostase eines lebenden Körpers verantwortlich sind. Dementsprechend kann die Aufklärung der Regulierung der Expression des Gens zur Aufklärung des Mechanismus der Aufrechterhaltung der Homöostase eines lebenden Körpers nützlich sein, zur Entwicklung neuer Arzneimittel für die Aufrechterhaltung der fundamentalen Homöostase eines lebenden Körpers nützlich sein, und beim Studium der Aufklärung der Beziehung zum Altern nützlich sein. Das Reagens der vorliegenden Erfindung ist nützlich zum Nachweis und zur Diagnose von Krankheiten, die durch die Abnormalität in den Genen verursacht wird, welche Proteine codieren, die Helicase-Aktivität aufweisen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Bloom-Syndrom und Werner-Syndrom.
Wenn das Gen der vorliegenden Erfindung als ein Reagens verwendet wird, kann die Hybridisierung unter Verwendung eines Oligonukleotids durchgeführt werden, das als Sonde mindestens einen Abschnitt des klonierten humanen RecQ4-Gens enthält, und der Nachweis kann durch Southern oder Northern Blot-Verfahren erfolgen. Als solch eine Oligonukleotid-Sonde kann eine DNA-Sonde, eine RNA-Sonde oder ähnliches verwendet werden.
Wenn der polyklonale oder monoklonale Antikörper für das Protein, das durch das Gen der vorliegenden Erfindung codiert wird, als ein Nachweisreagens verwendet wird, kann der Nachweis durch EIA, RIA oder Western Blot-Analyse erfolgen.
7. Nicht menschliche transgene Tiere, in die das Gen in modifizierter Form eingeschleust wurde, so dass das Expressionsniveau des Gens ansteigt oder abnimmt.
In der vorliegenden Erfindung kann das Gen künstlich modifiziert werden, um sein Expressionsniveau verglichen mit dem normalen Niveau zu erhöhen oder zu senken, durch Hervorrufen einer Mutagenese (z.B. Deletion, Substitution, Addition, Insertion) in einem Abschnitt der diversen Stellen, die zur Regulierung der Expression des Gens von Bedeutung sind (z.B. Enhancer, Promotor, Intron).
Die Mutagenese kann durch jedes bekannte Verfahren erfolgen. Zum Beispiel kann ein im Handel erhältliches Punktmutagenese-Kit (z.B. TAKARA LA-PCR in vitro-Mutagenese-Kit, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet werden. Das transgene Tier umfasst beispielsweise eine transgene Maus oder eine transgene Ratte. Der das mutierte Gen enthaltende Vektor kann ein Vektor sein, der in der Lage ist, RecQ4-Gene verschiedener Tierarten zu überexprimieren oder ein Vektor, der in der Lage ist, die Expression solcher RecQ4-Gene zu unterdrücken. In jedem dieser Fälle, ist ein Antibiotika-Resistenz-Gen (z.B. ein Neomycin-Resistenz-Gen) zur positiven Selektion an das Gen ligiert.
Das Einschleusen des Gens kann durch direkte Injektion der DNA in befruchtete Eier erfolgen. Es wird jedoch bevorzugt, embryonale Stammzellen (ES)-Zellen einzusetzen, um ein effizientes Einschleusen des Gens zu erreichen, da ES-Zellen den Vorteil haben, dass sie kultiviert werden können und sich aus ihnen Mäuse oder ähnliches entwickeln können. Die ES-Zellen können TT2-Zellen (Shin-ichi AIZAWA, "Gene Targeting", 1995, Yodosha) sein. Beispielsweise wird die Vektor-DNA, die Mäuse-RecQ4-Gen enthält, durch Elektroporation in ES-Zellen eingeschleust und positive Klone werden mit Neomycin selektiert, wodurch die fraglichen mutierten ES-Zellen erhalten werden. Die mutierten ES-Zellen werden anschließend in Blastocysten oder 8-zellige Embryos durch eine Kapillare oder ähnliches injiziert. Die Blastocysten oder 8-zelligen Embryos können direkt in den Eileiter einer Tragemutter implantiert werden. Alternativ können sie zum Blastocysten-Stadium entwickelt werden und anschließend in den Uterus einer Tragemutter implantiert werden. Aus der Nachkommenschaften, die aus der Tragemutter gezüchtet werden, werden Chimären ausgewählt. Die Tiere mit einem hohen Beitrag zu den Chimären sind mit hoher Wahrscheinlichkeit Tiere der Keimzelllinie der Chimären. Ob ein Tier eine Chimäre der Keimzelllinie dieser Chimäre ist, kann durch Paarung des Tiers mit einem normalen (d.h. Wildtyp) bestimmt werden. Das Paaren der Keimzelllinie der Chimäre mit einem normalen resultiert in der Erzeugung von Heterozygoten, und das Paaren zwischen Heterozygoten resultiert in der Erzeugung von Homozygoten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Prozesse zum Klonieren des Gens gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
2 stellt den Vergleich der Aminosäuresequenz-Homologie zwischen dem Protein, das durch humanes RecQ4-Gen codiert wird, und Proteinen, die von anderen Genen stammen, dar.
3 stellt die Radiation Mapping-Analyse dar, die darauf hinweist, dass das humane RecQ4-Gen auf dem menschlichen Chromosom 8 liegt.
4 stellt menschliches Chromosom 8 dar.
5 ist ein Foto, das die Ergebnisse der Northern Blot-Analyse von humanem RecQ4-Gen zeigt.
6 stellt den Vergleich der Aminosäuresequenz-Homologie zwischen dem Protein, das durch EST-DNA ACC. H16879 codiert wird, und einem Protein, das von E. coli stammt, dar.
7 stellt die Assemblierung des Gens gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter dargestellt. Die nachfolgenden Beispiele sollen jedoch nur dazu dienen, den technischen Umfang der Erfindung darzustellen, gestatten aber nicht, dass dieser eingeschränkt wird.
[Beispiel 1] Klonierung humaner RecQ4-cDNA voller Länge
(1) Identifizieren eines cDNA-Fragments, das Homologie zur E. coli RecQ4-DNA-Hemicase besitzt
Vor der Klonierung der DNA der vorliegenden Erfindung wurde in der dbest-Datenbank nach einer cDNA-Sequenz gesucht, die Homologie mit E. coli RecQ-Helicase besitzt. Als Ergebnis wurden mehr als zehn Arten von EST (Expressed Sequence Tag)-DNAs gefunden, einschließlich EST-DNA ACC. H16879 (d.h. DNA, die die Aminosäuresequenz von H16879 codiert, die in 6 dargestellt ist). Unter Berücksichtigung der Nukleotidsequenz-Homologie dieser ESTs mit den EST-DNAs, die von anderen Organismen als dem Menschen (z.B. E. coli Hefe, Fadenwürmern) stammen, oder mit den Genen der bekannten menschlichen Bloom-Krankheit-Helicase, Werner-Krankheit-Helicase und RecQ1-Helicase, wurden jene, die eine hohe Nukleotidsequenz-Homologie zu diesen Genen aufweisen, aus den oben gefundenen ESTs weggelassen.
(2) Identifizierung von EST-DNA ACC. H16879 als das in menschlichen Geweben exprimierte Gen
Als nächstes wurde eine Reihe vorläufiger Experimente durchgeführt, um die Sequenz von EST-DNA ACC. H16879 als das Gen zu identifizieren, das tatsächlich in menschlichen Geweben exprimiert wird. Das heißt, ein Sense-Primer (SEQ ID Nr. 3) und ein Antisense-Primer (SEQ ID Nr. 4) wurden für die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) bereitgestellt, basierend auf der Nukleotidsequenz, die in dem EST-DNA-Fragment enthalten ist. Andererseits wurde cDNA aus mRNA, die von humanem Testis stammt, mittels reverser Transkriptase-Reaktion gewonnen. Die PCR wurde unter Verwendung der oben hergestellten Primer durchgeführt, um das Vorliegen der EST-DNA in der aus menschlichem Testis stammenden cDNA zu untersuchen.
Die RT-PCR wurde wie in (3-i) unten beschrieben durchgeführt. Als Ergebnis konnte ein vorausgesagtes PCR-Produkt von etwa 320 bp aus der Sequenz von EST-DNA ACC. H16879 nachgewiesen werden.
Die Bestätigung der Anwesenheit oder Abwesenheit der EST-DNA durch PCR kann auch dadurch erfolgen, dass das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment in eine Plasmid-DNA von E. coli eingefügt wird, das DNA-Fragment kloniert wird, und anschließend die Nukleotidsequenz der resultierenden Klon-Plasmid-DNA analysiert wird. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass EST-DNA ACC. H16879 ein Abschnitt des neuen Helicase-Gens war. [Bezüglich der Methoden siehe (3-ii) und (3-iii) unten.]
(3) Klonierung eines cDNA-Teilfragments von humanem RecQ4-Gen durch RT-PCR
(3-i) Herstellung von cDNA durch reverse Transkription und Amplifizierung
Eine Reaktionslösung, die aus menschlichem Testis stammende poly(A)+RNA (CLONTECH) (etwa 1 μg), Dithiothreit, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), einen Puffer für eine reverse Transkriptase, und eine reverse Transkriptase Super Script II umfasst, ließ man 30 Minuten lang bei 42 °C reagieren, und anschließend wird eine RNase-Behandlung durchgeführt, wodurch cDNA hergestellt wird. Die cDNA wurde als Matrize für die nachfolgende PCR verwendet.
Bei der PCR wurden TAKARA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) und ein damit verbundener Puffer verwendet. Falls nichts anderes angegeben ist, bezeichnen "Taq DNA-Polymerase" und "PCR-Puffer", wie sie im Folgenden verwendet werden, TAKARA Taq bzw. den damit verbundenen Puffer. Die PCR wurde in einer gemischten Reaktionslösung (25 μl) durchgeführt, die eine Lösung umfasst, die 1 × PCR-Puffer, 0,2 mM dNTPs, 0,4 μM RecQ4-Primer (SEQ ID Nr. 3 und 4) und 0,625 Einheiten Taq DNA-Polymerase mit einer angemessenen Menge der von menschlichem Testis stammenden cDNA enthält.
Die Reaktionslösung ließ man reagieren, beginnend bei 94 °C für 5 Minuten, und anschließend mit einem Programm von 94 °C für 30 Sekunden; 55 °C für 30 Sekunden; und 72 °C für 1 Minute für 35 Zyklen. Die resultierende Reaktionslösung ließ man zusätzlich für 5 Minuten bei 72 °C reagieren.
(3-ii) Subklonierung des PT-PCR-Produkts für die Sequenzierung
Eine Lösung, die das PT-PCR-Produkt, das in (3-i) oben erhalten wurde, T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.), Puffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) und pGEM-T-Vektor (Promega) enthält, ließ man 3 Stunden lang bei 15 °C reagieren, wodurch der Einbau des PT-PCR-Produktfragments in den pGEM-T-Vektor erfolgt. E. coli JM109 wurde mit dem Vektor transformiert, und die resultierende E. coli-Transformante wurde auf einer LB-Bactoagar-Platte, die X-gal, IPTG und Ampicillin (Endkonzentration: 50 μg/ml) enthielt, ausgestrichen und 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Weiße E. coli-Kolonien, die auf der Platte erschienen, wurden einer Kultivierung in Schüttelkultur in LB-Medium, das Ampicillin (Endkonzentration: 50 μg/ml) enthielt, bei 37 °C für 16 Stunden oder mehr unterzogen, und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Roboters (PI-100Σ, hergestellt von Kurabo) gewonnen.
Die resultierende Plasmid-DNA wurde in dH₂O (100 μl), das 10 μg/ml RNase enthält, gelöst zur Verwendung als Probe für die nachfolgende DNA-Sequenzierung.
(3-iii) Sequenzierung
Die PCR erfolgte unter Verwendung der Plasmid-DNA, die in (3-ii) oben gewonnen wurde, als Matrize in einem Reaktionssystem, das nicht markierte Primer, vier Arten fluoreszenzmarkierter Nukleotid-5'-triphosphat und Taq-Polymerase enthält. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist wie folgt.
Bei dieser PCR wurden die Primer, die in SEQ ID NR. 5–19 dargestellt sind, als Primer für die Sequenzierung verwendet.
Die PCR erfolgte mit einem Programm von 96 °C für 30 Sekunden (Denaturierung); 55 °C für 15 Sekunden (Annealing); und 60 °C für 4 Minuten (Verlängerung) für 25 Zyklen. Durch diese Reaktion wurden DNA-Fragmente synthetisiert, die alle einen zufällig eingebauten Fluoreszenzfarbstoff aufwiesen. Die Nukleotidsequenzen dieser DNA-Fragmente wurden einzeln unter Verwendung eines Sequenziergeräts analysiert. So konnte schließlich eine zusammenhängende Nukleotidsequenz bestimmt werden. Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenziergeräts, Modell ABI 373, hergestellt von Applied Biosystem. Die Nukleotidsequenz der humanen RecQ4-Teil-cDNA ist in SEQ ID Nr. 31 dargestellt.
(4) Klonierung der 5'- und 3'-Regionen des humanen RecQ4-Gens unter Verwendung des Marathon cDNA-Amplifizierungskits
Basierend auf der Nukleotidsequenz der humanen RecQ4-Teil-cDNA, die in (3) oben erhalten wurde, erfolgte das Klonieren der 5'- und 3'-Regionen des humanen RecQ4-Gens unter Verwendung des Marathon cDNA-Amplifizierungskits (CLONTECH). Um das 5'-RACE-Produkt zu amplifizieren, wurde zunächst die erste Runde PCR unter Verwendung von aus Testis stammender Marathon Ready-cDNA als Matrize und Primer AP1 (SEQ ID Nr. 20), spezifisch für die Adaptersequenz, und Primer 5'-GSP1 (SEQ ID Nr. 22), spezifisch für das RecQ4-cDNA-Teilfragment, durchgeführt. Die Zusammensetzung der für diese PCR verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die PCR erfolgte, beginnend mit dem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute mit einem Programm von 94 °C für 30 Sekunden (Denaturierung) und 72 °C für 4 Minuten (Annealing und Verlängerung) für 5 Zyklen; anschließend mit einem Programm von 94 °C für 30 Sekunden (Denaturierung) und 70 °C für 4 Minuten (Annealing und Verlängerung) für 5 Zyklen; und anschließend mit einem Programm von 94 °C für 30 Sekunden (Denaturierung) und 68 °C für 4 Minuten (Annealing und Verlängerung) für 25 Zyklen.
Unter Verwendung der resultierenden Reaktionslösung in verdünnter Form als Matrize erfolgte die zweite Runde der PCR unter Verwendung des weiter innen liegenden Primerpaars AP2 (SEQ ID Nr. 21) und 5'GSP2 (SEQ ID Nr. 23), wodurch ein 5'-RACE-Produkt von etwa 2 kpb erhalten wurde. Das gleiche Procedere wurde unter Verwendung des Primerpaars 3'GSP1 (SEQ ID Nr. 24) und 3'GSP2 (SEQ ID Nr. 25) wiederholt, wodurch ein 3'-RACE-Produkt von etwa 1,5 kbp erhalten wurde. Diese Produkte wurden getrennt in pGEM-T-Vektor subkloniert, und die Sequenzen der gesamten Länge der 5'- und 3'-RACE-Produkte wurden bestimmt [bezüglich des Verfahrens, siehe (3-ii) und (3-iii) oben].
Die Nukleotidsequenzen der erhaltenen 5'- und 3'-RACE-Produkte des humanen RecQ4-Gens sind in SEQ ID Nr. 32 bzw. 33 dargestellt.
(5) Bestimmung des Transkriptionsstartpunkts für das RecQ4-Gen
Als Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz des 5'-RACE-Produkts wurde das erste Methionin des vorhergesagten Proteins, das durch das RecQ4-Gen codiert wird, nicht in dem 5'-RACE-Produkt gefunden, und es wurde angenommen, dass das erste Methionin sich weiter upstream von dem 5'-RACE-Produkt befinden würde. Anschließend wurde der Transkriptionsstartpunkt des Gens wie folgt ermittelt.
Eine 5'-Region, die den Transkriptionsstartpunkt des RecQ4-Gens enthält, wurde mittels Oligo-Capping-Verfahren bestimmt. Aus humanem Testis stammende mRNA wurde mit aus Kälberdünndarm stammender alkalischer Phosphatase (CIAP) (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die mRNA zu dephosphorylieren. Die Zusammensetzung der verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 37 °C durchgeführt. Nachfolgend wurde die dephosphorylierte mRNA mit Nikotinsäure-Pyrophosphatase (TAP) (Nippon Gene) behandelt, um die 5'-CAP-Struktur von ihr zu entfernen. Die Zusammensetzung der verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37 °C durchgeführt. Nachfolgend wurde die mRNA (TAP-RNA) ohne CAP-Struktur mit einer Oligo-RNA (SEQ ID Nr. 26) von 30 bp als einem Adapter unter Verwendung von T4 RNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. Die Zusammensetzung der verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die Reaktion wurde 16 Stunden lang bei 18 °C durchgeführt. Das resultierende Reaktionsprodukt wurde mit Phenol behandelt, um Proteine daraus zu entfernen und anschließend einer Ethanol-Fällung unterzogen, wodurch eine Oligo-Capping-RNA erhalten wurde. Die Oligo-Capping-RNA wurde in dH₂O (50 μl) gelöst. Eine Einzelstrang-cDNA wurde unter Verwendung der Oligo-Capping-RNA als Matrize synthetisiert. Die Zusammensetzung der verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die Reaktionslösung wurde 10 Minuten lang bei 70 °C erhitzt und anschließend auf Eis gekühlt, und die folgenden Reagenzien wurden hinzugefügt.
Die Reaktionslösung wurde 2 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, anschließend wurde Superscript II (Gibco) (5 μl) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 37 °C zur Reaktion gebracht. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde die resultierende Lösung 10 Minuten lang bei 95 °C erhitzt, und anschließend dH₂O auf ein Gesamtvolumen von 500 μl hinzugegeben, was dann als Oligo-Capping-cDNA diente. Die PCR wurde unter Verwendung der Oligo-Capping-cDNA als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in zwei Runden durchgeführt. Unter Verwendung des PCR-Produkts der ersten Runde als Matrize wurde die zweite Runde der PCR anschließend durchgeführt (d.h. nested PCR). Die Zusammensetzung der für die erste Runde der PCR verwendeten Reaktionslösung ist wie folgt.
Die PCR erfolgte beginnend mit einem Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 Minuten und anschließend mit einem Programm von 94 °C für 30 Sekunden (Denaturierung); 60 °C für 30 Sekunden (Annealing); und 72 °C für 1 Minute (Verlängerung) für 35 Zyklen, und abschließend mit 72 °C für 5 Minuten. Unter Verwendung des PCR- Produkts als Matrize wurde die zweite Runde der PCR durchgeführt. Die für die zweite PCR verwendete Reaktionslösung war wie folgt.
Die zweite Runde der PCR wurde auf die gleiche Weise wie die erste Runde der PCR durchgeführt. Bei der 2 %igen Agarosegel-Elektrophorese wurde ein PCR-Produkt von etwa 400 bp beobachtet. Das PCR-Produkt wurde in pGEM-T-Vektor subkloniert und sequenziert [bezüglich der Verfahren siehe (3-ii) und (3-iii) oben]. Bei der Sequenzierung wurde ein Primerpaar von SEQ ID Nr. 5 und 6 verwendet.
Die Nukleotidsequenz der erhaltenen 5'-Transkriptionsstartpunktsregion des humanen RecQ4-Gens ist in SEQ ID Nr. 34 dargestellt.
(6) Konstruktion von RecQ4-cDNA voller Länge durch Nukleotidsequenz-Assemblierung
Die vier Nukleotidsequenzen von humaner RecQ4-cDNA, die in (3), (4) und (5) oben erhalten wurden, sind jeweils in SEQ ID Nr. 31–34 dargestellt. Diese Sequenzen überlappen miteinander teilweise und die relativen Positionen der Sequenzen sind in 7 dargestellt. Die Region des Transkriptionsstartpunkts, das 5'-RACE-Produkt, die Teil-cDNA und das 3'-RACE-Produkt in 7 sind in SEQ ID Nr. 34, 32, 31 bzw. 33 dargestellt.
Diese Regionen wurden mittels Computer unter Verwendung von DNASYS-Software analysiert. Die vier Nukleotidsequenzen wurden anschließend zusammenligiert, um eine RecQ4-cDNA-Sequenz voller Länge zu ergeben. Die erhaltene cDNA setzte sich in voller Länge aus 3850 Nukleotiden ohne die 3'-poly(A)-Sequenz zusammen (siehe SEQ ID Nr. 1). In der cDNA-Sequenz wurde gefunden, dass der offene Leserahmen (ORF) sich aus 3624 Nukleotiden zusammensetzte und ein Protein, das durch diese Sequenz codiert wird, bestand aus 1208 Aminosäureresten und hatte ein Molekulargewicht von 133070 Dalton. Die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das Gen codiert wird, ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
[Beispiel 2] Analyse von humanem RecQ4-Gen mittels Northern Blot
(1) Northern Blot-Analyse von humanem RecQ4-Gen
(1-i) Humaner Multi-Gewebe-Northern (MTN-I und -II) Blot
In diesem Beispiel wurde der MTN-Blot unter Verwendung eines im Handel erhältlichen vorgefertigten Filters (CLONTECH) erzeugt. Der vorgefertigte Filter wurde durch Elektrophorese von poly(A)+RNAs, die aus 16 Arten humaner Gewebe und Organe (jeweils 2 μg) extrahiert waren, auf einem Agarosegel und anschließendem Blotten des Gels auf eine Nylonmembran hergestellt.
(1-ii) Humane RecQ4-cDNA-Sonde
Der offene Leserahmen (ein Abschnitt der humanen RecQ4-cDNA; Reste 2097–2417 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1; 321 bp) wurde durch das nachstehend beschriebene Verfahren radioaktiv markiert und als Nachweissonde für humanes RecQ4-Gen verwendet.
(2) Hybridisierung
(2-i) Vorhybridisierung
Ein Filter wurde in einen Vorhybridisierungspuffer (100 ml) in einer Art Brotzeit-Plastikbehälter eingetaucht und 4 Stunden lang bei 42 °C inkubiert. Dieser Vorhybridisierungspuffer enthielt 50 % Formamid, 5 × SSPE, 10 × Denhardt-Lösung, 2 % SDS und 100 μg/ml eines denaturierten Lachssamen-DNA-Fragments.
(2-ii) Radioaktive Markierung der humanen RecQ4-cDNA-Sonde
Das radioaktive Markieren mit [α-³²P]-dCTP (NEN, Daiichi Pure Chemicals) erfolgte unter Verwendung des oben erwähnten humanen RecQ4-cDNA-Fragments (50 ng) als Matrize, Zufallshexamer (50 pmol) als Primer und einem Zufalls-Primer-DNA-Markierungskit Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.).
(2-iii) Hybridisierung
Der Vorhybridisierungspuffer wurde aus dem Behälter ausgeschüttet und ein frischer Vorhybridisierungspuffer wurde hinzugegeben. Der Behälter wurde behutsam geschüttelt, so dass sich unter dem Filter keine Luftblasen bildeten. Die mit [³²P]-dCTP radioaktiv markierte Sonde wurde zu der Vorhybridisierungslösung gegeben und auf eine spezifische Aktivität von etwa 1 × 10⁶ cpm/ml eingestellt, und die Hybridisierung erfolgte 16 Stunden lang bei 42 °C.
Nach der Hybridisierung wurde der Filter zweimal mit 2 × SSC/0,1 % SDS-Lösung (100 ml) bei Zimmertemperatur für jeweils 15 Minuten gewaschen, und zusätzlich zweimal mit 0,2 × SSC/0,1 % SDS-Lösung (100 ml) bei Zimmertemperatur für jeweils 15 Minuten gewaschen.
Der Filter wurde soweit getrocknet, dass er leicht feucht war und anschließend in eine Plastikfolie ("Saran-Wrap", hergestellt von Asahi Chemical Industries, Ltd.) gewickelt für die Verwendung in der nachfolgenden Analyse durch Autoradiografie unter Verwendung eines BAS 1500-Systems (Fujifilm).
(3) Analyse mittels Fuji BAS 1500-System
Die Probe wurde durch Auflegen auf einem zweidimensionalen Sensor der Art eines Strahlungsenergiespeicher (Imaging Plate; IP) unter Verwendung von photostimulierbarem Phosphor wie auf einem Röntgenstrahlungsfilm exponiert. Die IP wurde mit einem He-Ne-Laserstrahl angeregt. Die emittierte Lumineszenz, die von der Menge an exponiertem Licht abhängt, wurde in Form eines digitalen Betrags, der PSL (photostimulierte Lumineszenz) genannt wird, bestimmt. Die Bestimmung erfolgte unter Verwendung eines BAS 1500-Systems. Die von diesem System ermittelten Werte zeigten eine gute Linearität und daher fand man, dass dieses System sich für die Subtraktion des Hintergrunds, die Berechnung und den Vergleich von Strahlungsintensitäten in den festgelegten Regionen eignet.
(4) Ergebnisse der gewebespezifischen Expression von humaner RecQ4-mRNA
Der [³²P]-markierte ORF von humaner RecQ4-cDNA (ein Abschnitt der humanen RecQ4-cDNA; Nukleotide 2097–2417 in SEQ ID Nr. 1; 321 bp) wurde als Sonde auf einem MTN-Blot (CLONTECH) hybridisiert, der poly(A)+RNAs enthält, die aus verschiedenen humanen Geweben und Organen (jeweils 2 μg) stammen.
Die Expression von humaner RecQ4-mRNA wurde in verschiedenen Organen beobachtet, und deren Expressionsmuster ist in 5 dargestellt. Dies zeigte, dass humanes RecQ4-Gen in allen Geweben exprimiert wurde, und eine bemerkenswert starke Expression wurde insbesondere in Thymus und Testis beobachtet. Die Quellen, aus denen die poly(A)+RNAs in 5 stammten, sind folgende:
a, Herz; b, Hirn; c, Plazenta; d, Lunge; e, Leber; f, Skelettmuskel; g, Niere;
h, Bauchspeicheldrüse; i, Milz; j, Thymus; k, Prostata; l, Testis; m, Eierstöcke;
n, Dünndarm; o, Dickdarm; p, periphere Blutlymphozyten.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird humanes RecQ4-Gen bereitgestellt.
Das humane RecQ4-Gen der vorliegenden Erfindung ist nützlich zum Studium der Beziehung zu der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Zellalterung bei Menschen und zur Aufklärung der Ursachen von Krankheiten, die mit Wachstum und Alterung in Verbindung stehen, und ebenfalls nützlich bei der Herstellung von Medikamenten zur Verbesserung und Linderung der Auswirkungen solcher Erkrankungen, einer diagnostischen Sonde zum Nachweis und zur Vermeidung von Krankheiten, mit Bezug zu anderen Krankheiten, die mit der Alterung in Verbindung stehen, und eines Reagens für medizinische, zellbiologische, immunologische, biochemische und molekularbiologische Studien über die Entwicklung menschlicher Individuen.
Sequenzprotokoll

Claims

Gen, das ein Protein mit Helicase-Aktivität codiert, wobei: (a) das Protein eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr.: 2 umfasst; oder (b) das Gen eine DNA umfasst, die die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID 1 umfasst.
Rekombinanter Vektor, der das Gen von Anspruch 1 enthält.
Nicht-humane Transformante, welche den rekombinanten Vektor von Anspruch 2 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Helicase-Aktivität, umfassend das Kultivieren der Transformanten von Anspruch 3 und das anschließende Sammeln des Proteins aus der resultierenden Kultur.
Rekombinantes Protein, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr.: 2; oder (b) ein Protein mit einer Deletion des ersten Methionins (Met) in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr.: 2.
Antikörper, der spezifisch mit dem Protein von Anspruch 5 reagiert, welcher von einem monoklonalen und polyklonalen Antikörper gewählt ist.
Antikörper gemäß Anspruch 6, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper gemäß Anspruch 6, welcher ein polyklonaler Antikörper ist.
Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 7 produziert, welches hergestellt wird durch Zellfusion einer Antikörper produzierenden Zelle, welche mit dem Protein von Anspruch 5 immunisiert wurde, mit einer Myelomzelle.
Verwendung eines Oligonukleotids zum Nachweis eines Gens gemäß Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid mindestens einen Abschnitt eines Gens umfasst, umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr.: 1, wobei das Oligonukleotid in der Lage ist, an das nachzuweisende Gen zu hybridisieren.
Kit zum Diagnostizieren einer Krankheit, welche durch die genetische Abnormalität eines Gens verursacht wird, das ein Protein mit Helicase-Aktivität codiert, wobei das Kit das Protein von Anspruch 5 und einen Antikörper gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8 umfasst.
Transgenes, nicht-humanes Tier mit dem Gen von Anspruch 1, darin eingeführt in modifizierter Form, wobei die Modifikation so durchgeführt ist, dass das Expressionsniveau des Gens erhöht oder verringert ist.