TW202018080A - Rna奈米結構，其製備方法和用途 - Google Patents

Abstract

本文公開的是高Tm RNA奈米結構，其可以由用以構建分層或不分層的RNA奈米結構的一個或多個模塊或基序組成。所述RNA奈米結構可具有核心結構域和三個或更多個雙鏈臂及其製劑以綴合大量的治療劑、pH響應或酶可裂解的藥物貨物。本文還公開用於生成可自組裝成高度熱穩定的RNA結構的合成RNA寡核苷酸的設計策略。本文還公開本文所述的RNA奈米結構的用途。

Description

RNA奈米結構，其製備方法和用途

相關申請的交叉引用

本申請主張於2018年2月9日提交的，名稱為“具有70℃至100 ℃ Tm的RNA奈米結構用於溶解和攜帶高拷貝數的紫杉醇或衍生物用於遞送至腫瘤”的美國臨時申請第62/628, 591號的權益，其整體通過引用併入本文。

本申請主張於2018年11月5日提交的，名稱為“RNA奈米結構，其製備方法和用途”的美國臨時申請第62/755, 696號的權益，其整體容通過引用併入本文。

關於聯邦資助的研究或開發的聲明

本申請是在由美國國立衛生研究院授予的CA207946、CA186100、CA151648、CA168505、CA209045和EB019036基金號的政府支持，以及由美國國防部授予的W81XWH-15-1-0052基金號的政府支持下完成的。政府在本申請中具有某些權利。

序列表

本申請包含以電子形式提交的序列表，其為2018年11月9日創建的名稱為“321501-2160_ST25”的ASCII.txt文件。序列表的內容整體併入本文。

本發明係有關於一種RNA，尤指一種RNA奈米結構，其製備方法和用途。

化療在癌症治療中仍起關鍵作用。然而，最頻繁使用的抗癌藥物，包括用於多種癌症治療的活性最強化療劑之一的紫杉醇，都是疏水性的小分子。這些小分子差的水溶性經常導致嚴重的副作用、非特異性毒性和低藥效。需要一種高效且受控的藥物遞送和釋放平台。

在一些方面，本文描述的是可由至少三段合成RNA寡核苷酸組成的RNA基序，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以彼此偶聯，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以形成中心核結構域，和圍繞所述核結構域排布並且遠離所述中心核結構域延伸的至少三個雙鏈臂，其中所述RNA基序的解鏈溫度可以大於65攝氏度。該模塊化RNA基序可以包括3至9條合成RNA寡核苷酸鏈。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段可以包括一個或多個修飾的核苷酸。一個或多個修飾的核苷酸可以是末端核苷酸或非末端核苷酸。所述修飾可以是與一個或多個修飾的核苷酸連接的炔。所述修飾可以是與一個或多個修飾的核苷酸連接的接頭。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與所述至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相連的貨物化合物分子。至少3至100個貨物化合物分子可與所述合成RNA寡核苷酸相連。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相連的官能團。所述官能團可以與末端核苷酸相連。所述官能團可以與非末端核苷酸相連。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與官能團相連的貨物化合物。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段都可以包括具有與SEQ ID NOs：1-54中的任一者為大約80 - 100 %同一性的序列的寡核苷酸序列。所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以被配置為自組裝以形成所述模塊化RNA基序。所述模塊化RNA基序的Tm可以大於約70攝氏度。所述模塊化RNA基序的Tm可以在約70攝氏度至約100攝氏度的範圍。所述模塊化RNA基序的Tm可以在約65攝氏度至約100攝氏度的範圍。

在一些方面，本文中還描述的是可以由至少四段合成RNA寡核苷酸組成的模塊化RNA基序，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以彼此偶聯，其中所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以形成中心核結構域，並且至少三個雙鏈臂可以圍繞所述核結構域排布並可以遠離所述中心核結構域延伸。所述模塊化RNA基序可以包括4至9條合成RNA寡核苷酸鏈。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段可以包括一個或多個修飾的核苷酸。一個或多個修飾的核苷酸可以是末端核苷酸或非末端核苷酸。所述修飾可以是與一個或多個修飾的核苷酸連接的炔。所述修飾可以是與一個或多個修飾的核苷酸連接的接頭。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與所述至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相連的貨物化合物分子。在有些方面，至少3至100個貨物化合物分子可與所述合成RNA寡核苷酸相連。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相連的官能團。所述官能團可以與末端核苷酸相連。所述官能團與非末端核苷酸相連。所述模塊化RNA基序可以進一步包括與官能團相連的貨物化合物。所述至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段可以由具有與SEQ ID NOs：1-54中的任一者為大約70 - 100 %同一性的序列的寡核苷酸序列組成。所述至少三段合成RNA寡核苷酸可以被配置自組裝以形成所述模塊化RNA基序。

在一些方面，本文還描述了RNA奈米結構，其可以包括至少兩個如本文所述的模塊化RNA基序，其中所述至少兩個模塊化RNA基序可以彼此相連。所述RNA奈米結構可以包括中心核，其中所述中心核可以包括第一模塊化RNA基序；第一層，其中所述第一層可以包括至少三個模塊化RNA基序，其中所述第一層的所述至少三個模塊化RNA基序中的每個模塊化RNA基序可以與所述第一模塊化RNA基序相連；和第二層，其中所述第二層包含至少三個模塊化RNA基序，其中所述第二層的所述至少三個模塊化RNA基序中的每一個可以與所述第一層的所述至少三個模塊化基序中的模塊化RNA基序相連。在一些方面，所述奈米結構中的所有所述模塊化RNA基序都可以具有相同數目的雙鏈臂。在一些方面，所述第一層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目可以不同於所述第一模塊化RNA基序上的、所述第二層的模塊化RNA基序上的、或所述第一模塊化RNA基序和所述第二層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。在一些方面，所述第二層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目可以不同於所述第一模塊化RNA基序上的、所述第一層的模塊化RNA基序上的、或者所述第一模塊化RNA基序和所述第一層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。所述第一模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目可以不同於所述第一層的模塊化RNA基序上的、所述第二層的模塊化RNA基序上的、或者所述第一層和所述第二層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。所述RNA奈米結構的解鏈溫度（Tm）可以大於70攝氏度。所述RNA奈米結構的Tm可以在70攝氏度至約100攝氏度範圍。所述第一模塊化RNA基序可以具有比所述第一層的模塊化RNA基序和所述第二層的模塊化RNA基序更大的Tm。所述第一層的模塊化RNA基序可以具有比所述第二層的模塊化RNA基序更大的Tm。所述RNA基序中的一個或多個可以與一個或多個貨物化合物偶聯。所述RNA基序中的一個或多個可以與一個或多個官能團偶聯。所述貨物化合物可以是抗癌化合物、螯合劑、放射性同位素、熒光團、miRNA、抗miRNA、siRNA、pH響應前藥（prodrug）、酶可裂解前藥或其任意組合。所述RNA基序中的一個或多個與兩個或更多個貨物化合物偶聯，其中所述兩個或更多個貨物化合物中的至少兩個是不同類型的貨物化合物。

在一些方面，本文還描述了可以包括向受試者施用如本文所述的模塊化RNA基序或本文所述的RNA奈米結構的步驟的方法。所述受試者可以患有或懷疑患有癌症。

在一些方面，本文還描述在受試者中治療癌症或疾病的方法，所述方法可包括向所述受試者施用如本文所述的模塊化RNA基序或如本文所述的RNA奈米結構的步驟。

在一些方面，本文還描述瞭如本文所述的RNA奈米結構，其用於製備用於治療疾病或癌症的藥劑。

在一些方面中，本文還描述了可以包括計算設備，以及在所述計算設備上可執行的應用的系統，其中，當被執行時，所述應用被可以使得所述計算設備至少：產生理論雙鏈臂（DA）序列，其可以至少部分地基於所述理論DA序列的GC含量，所述理論DA序列的解鏈溫度（Tm）和自發二聚化的能力；選擇對於一組寡聚物的一個或多個DA，其可以至少部分地基於所保存的一組DA的計算的交叉互補性，其中具有最低總體互補性的DA被選擇；可以計算寡聚物序列，其可以包括計算DA序列的反向互補序列、計算延伸寡聚物序列和計算終止寡聚物序列；並且可以至少部分地基於寡聚物自發二聚化或形成二聚體的能力來選擇寡聚物，其中不自發二聚化並且不形成二聚體的那些寡聚物被選擇。

在一些方面，本文還描述了至少包括如下步驟的方法：生成理論雙鏈臂（DA）序列，其至少部分地基於所述理論DA序列的GC含量，所述理論DA序列的解鏈溫度（Tm），和自發二聚化的能力；至少部分地基於所保存的一組DA的計算的交叉互補性，選擇對於一組寡聚物的一個或多個DA，其中具有最低總體互補性的DA被選擇；計算寡聚物序列，其可包括計算DA序列的反向互補序列、計算延伸寡聚物序列和計算終止寡聚物序列；和至少部分地基於寡聚物自發二聚化或形成二聚體的能力選擇寡聚物，其中不自發二聚化並且不形成二聚體的那些寡聚物被選擇。

在一些方面，本文還描述了本文所述的核苷酸、RNA或RNA結構的用途，其用於使疏水性或低可溶性藥物變得可溶，從而減少藥物劑量，用於降低藥物毒性或副作用，或者避免在癌症化療中使用油或有機溶劑溶解藥物。

在一些方面，本文還描述了疏水性材料用於產生RNA微團結構以攜帶抗癌化合物、治療劑、miRNA、抗miRNA、siRNA、螯合劑、放射性同位素、熒光團、pH響應前藥或酶可裂解前藥的用途。

本申請的一個或多個方面的細節在以下的附圖和說明中闡述。根據說明書和附圖以及申請專利範圍，本申請的其它特徵、目的和優點將是顯而易見的。

在更詳細地描述本申請之前，應當理解，本公開不限於所描述的特定方面，並且因此理所應當可以改變。還應當理解的是，本文中使用的術語僅出於描述特定方面的目的，且不意在限制。

除非另有限定，本文使用的所有技術和科學術語都具有如本公開所屬領域普通技術人員通常理解的相同的意義。儘管類似或等同於本文描述的任何方法和材料也可以用於實踐或測試本公開，但在目前只描述了優選的方法和材料。

在本說明書中引用的所有出版物和專利都被引用，以公開和描述所引用的出版物與之相關的方法和/或材料。所有這樣的出版物和專利通過引用併入本文，相當於具體和單獨地指定每個單獨的出版物或專利通過引用被併入。這種通過引用的併入明確限於在所引用的出版物和專利中描述的方法和/或材料，並且不延伸至來源於所引用的出版物和專利的任何詞典定義。沒有在本申請中明確地重複的所引用出版物和專利中的任何詞典定義不應被視為如此，並且不應被理解為定義在所附申請專利範圍中出現的任何術語。對於任何出版物的引用均針對其在申請日之前的公開內容，並且不應當被解釋為承認本申請由於在先公開而無權先於這些出版物。此外，所提供的公開日期可能不同於也許需要獨立確認的實際公開日期。

在閱讀本申請之後，對於本領域技術人員將顯而易見的是，本文所描述和闡明的各個方面中的每一方面具有獨立的元件和特徵，這些元件和特徵可以在不脫離本公開的範圍或精神的情況下，容易地與任何其他若干方面的特徵分離或組合。任何所述的方法可以所述的事件的次序或以邏輯上可行的任何其它次序執行。

應當注意，比率、濃度、量和其它數值數據在本文中可以範圍的形式表達。還應當理解，每個範圍的端點既與另一個端點顯著相關，又與另一個端點顯著獨立。還應當理解，本文公開了許多值，並且每個值在本文中還被描述為除了所述值本身以外的“大約”該特定值。例如，如果公開了值“10”，那麼“約10”也被公開。在本文中，範圍可以表示為從“約”一個特定值，和/或到“約​​”另一個特定值。類似地，當通過使用先行詞“約”將值表示為近似值時，將理解，所示特定值形成進一步的方面。例如，如果公開了值“約10”，則“10”也被公開。

在表述範圍的情況下，進一步的方面包括從一個特定值和/或到另一個特定值。提供了值的範圍的情況下，應當理解，在該範圍的上限和下限之間以下限單位的十分之一為基準的每個中間值（除非上下文另有明確說明）和在該陳述範圍中的任何其他陳述的值或中間值均包括在本申請內。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包括在較小範圍內，並且也包括在本申請內，受限於所述範圍中任何特別排除的界限。當陳述範圍包括一個或兩個所述界限時，排除任一個或兩個那些所包括的界限的範圍也包括在本公開內。例如，當陳述範圍包括一個或兩個界限時，排除那些所包括界限的任一個或兩個界限的範圍也包括在本申請內，例如短語“x至y”包括從“x”至“y”的範圍，以及大於“x”和小於“y”的範圍。該範圍還可以被表達為上限，例如，“約x、y、z或更小”，並且應當被解釋為包括“約x”、“約y”和“約z”的特定範圍，以及“小於x”、 “小於y”和“小於z”的範圍。同樣地，短語“約x、y、z或更大”應當被解釋為包括“約x”、“約y”和“約z”的特定範圍，以及“大於x”、 “大於y”和“大於z”的範圍。此外，短語“約‘x’至‘y’”，其中‘x’和‘y’為數值，包括“約‘x’至約‘y’”。

應當理解，使用這樣的範圍形式是為了方便和簡潔，因此，應當以靈活的方式被解釋為不僅包括明確地記載為該範圍的界限的數值，而且也包括包含在該範圍內的所有個別數值或子範圍，如同每個數值和子範圍被明確記載。為了說明，“約0.1 %至5 %”的數值範圍應當被解釋為不僅包括明確記載約0.1 %至約5 %的值，而且還包括在所指示範圍內的單獨的值（例如，約1 % 、約2 %、約3 %和約4 %）和子範圍（例如，約0.5%至約1.1%；約5%至約2.4%；約0.5%至約3.2%，和約0.5%至約4.4%，以及其他可能的子範圍）。

除非上下文另有明確指示，否則在說明書和所附申請專利範圍中使用的單數形式“一（a/an）”和“所述”包括複數指示物。

如本文所使用的“約”、“大約”、“基本上”等諸如此類，當與數值變量結合使用時，通常可以指所述變量的值和在實驗誤差內的所述變量的所有值（例如，在針對平均值的95%置信區間內）或在所指示值的±10%內，以較大者為準。如本文所使用的術語“約”、“大約”、“為或約”以及“基本上”可以表示所討論的量或值可以是精確值，或者是提供如申請專利範圍中所述的或本文教導的等同結果或等同效果的數值。也就是說，應當理解，量、大小、配方、參數和其它數量和特性不是並且不必是精確的，而是可以根據需要近似的和/或更大或更小的，反映容差、換算因子、舍入、測量誤差等，以及本領域技術人員已知的其他因素，從而獲得等同的結果或效果。在一些情況下，提供等同的結果或效果的值不能被合理地確定。通常，無論是否被明確地陳述為此，量、大小、配方、參數或其它數量或特性是“約”、“大約”、或“為或約”。應當理解，在定量值之前使用“約”、“大約”、或“為或約”的情況下，除非另外特別聲明，否則該參數也包括特定的定量值本身。

除非另外指明，否則本公開的方面將採用分子生物學、微生物學、有機化學、生物化學、生理學、細胞生物學、癌症生物學、物理學等諸如此類的技術，其在本領域的技能範圍內。文獻中對這些技術進行了充分的解釋。

在詳細描述本公開的各方面之前，應當理解，除非另有說明，否則本公開不限於特定的材料、試劑、反應材料、製造方法等，因為這些可以變化。還應理解，本文中所使用的術語僅出於描述特定方面的目的，且並不意在限制。除非上下文另有明確指示，在邏輯上是可能的情況下，在本申請中還有可能步驟以不同的順序執行。

定義

如本文所用，“活性劑”或“活性成分”是指組合物的全部或部分效應歸因於的組合物的組分。活性劑可以是藥物活性化合物、分子（包括但不限於化學分子和生物分子）或其他物質，當其與RNA奈米結構接觸和/或當其與RNA奈米結構不接觸時，能在施用其的受試者中引發效應（例如藥物效應和/或生物效應）。

如本文所使用的，術語“施用”是指向受試者提供組合物的任何一種方法。這樣的方法是本領域技術人員熟知的，並且包括但不限於心內給藥、口服給藥、經皮給藥、吸入給藥、經鼻給藥，局部給藥、陰道內給藥、眼部給藥、耳內給藥、腦內給藥、直腸給藥、舌下給藥、口腔給藥和腸胃外給藥，包括注射給藥例如靜脈內給藥、動脈內給藥給藥、肌內給藥和皮下給藥。施用可以是連續的或間歇的。在各個方面，可以治療性地施用製品；也就是說，施用以治療現有疾病或病症。在進一步的各個方面中，可以預防性地施用製品；也就是說，施用用於預防疾病或病症而施用。

如本文所用，“抗感染劑”可包括但不限於抗生素、抗細菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑和抗原生動物劑。

如本文所用，“適體”可以指單鏈DNA或RNA分子，其可以以高親和力和特異性結合預選的包括蛋白質的靶標。它們的特異性和特性不是直接由它們的一級序列，而是由它們的三級結構決定的。

如本文所使用的，“連接的”、“連接”等諸如此類可以指在兩個或更多個分子之間形成共價或非共價結合（例如鍵），或兩個或更多個分子的綴合。如本文中所使用的，“連接的”、“連接”等諸如此類可以指兩個或更多個分子直接結合在一起，在連接在一起的那些分子之間沒有中間分子，或者是指經一個或多個接頭介導的兩個或更多個分子間接連接在一起。在結合是非共價的情況下，這可以涵蓋電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客相互作用，疏水相互作用、TT堆疊相互作用、氫鍵結合相互作用、范德華相互作用、磁性相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用和/或它們的組合。在結合是共價的情況下，這可以涵蓋在所涉及的每個分子中在一個或多個原子之間共享一對電子的鍵。

如本文所用，術語“接觸”是指將所公開的組合物或肽或藥物製品與細胞、靶受體或其它生物實體以這樣的方式集合在一起，以使得所述化合物能直接（即通過與靶標本身相互作用），或者間接（即通過與靶標活性所依賴的另一個分子、輔因子、因子或蛋白質相互作用）影響靶標（例如，受體、轉錄因子、細胞等）的活性。

如本文中所使用的，“對照”是在實驗中用於比較目的而使用的替代受試者或樣本，並且其被包括以最小化或區分除了自變量之外的變量的影響。 “對照”可以是陽性對照或陰性對照。

如本文所使用的，“偶聯”或“偶聯至”是指更大結構或系統的兩個或更多個組份的直接或間接的連接或結合或其他接合。

如本文中所使用的，“綴合”具有與“連接”相同的含義。

如本文所用，“脫氧核糖核酸（DNA）”和“核糖核酸（RNA）”通常可以指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA，或者修飾的RNA或DNA。 RNA可以是非編碼RNA或編碼mRNA（信使RNA）的形式，非編碼RNA例如tRNA（轉移RNA）、snRNA（小核RNA）、rRNA（核醣體RNA）、反義RNA、RNAi（RNA干擾構建體） 、siRNA（短干擾RNA）、微RNA（miRNA）或核酶，適體，指導RNA（gRNA）。

如本文所用，“劑量”、“單位劑量”、或“用量”是指適用於受試者中的物理離散單元，每個單元含有預定量的奈米顆粒組合物或製劑，其經計算以產生與其施用相關的期望響應。

如本文所用，術語“有效量”是指足以實現期望的結果或對不期望的狀態有效果的量。例如，在一個方面，有效量的聚合奈米顆粒是殺死和/或抑制細胞生長而對周圍的非癌細胞不引起額外損害的量。例如，“治療有效量”是指足以實現期望的治療結果或對不期望的症狀有效果、但通常不足以引起不利副作用的量。針對任何特定患者的具體治療有效劑量水平將取決於多種因素，包括所治療的病症和病症的嚴重性；所使用的具體組合物；患者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；施用時間；施用途徑；所使用的具體化合物的排泄率；治療的持續時間；與使用的具體化合物和藥學領域中熟知的類似因素組合使用或同時使用的藥物。

如本文所使用的，“同一性”、“同一”等諸如此類可以指如通過比較序列所確定的兩個或更多個核苷酸或多肽序列之間的關係。在本領域中，“同一性”還指如通過這樣的序列串之間的匹配所確定的核苷酸或多肽之間的序列相關性程度。可以通過已知方法容易地計算“同一性”，所述已知方法包括但不限於在（計算分子生物學，Lesk，AM編輯，牛津大學出版社，紐約，1988；生物計算：信息學和基因組計劃，Smith，DW編輯，學術出版社，紐約，1993；序列數據的計算機分析，第I部分，Griffin，AM和Griffin，HG編輯，胡瑪納出版社，新澤西州，1994；分子生物學中的序列分析，Von Heinje，G.，學術出版社，1987；和序列分析入門，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，斯托克頓出版社，紐約，1991；以及Carillo，H.和Lipman， D.，SIAM J. 應用數學，1988，48：1073）中記載的那些。確定同一性的優選方法被設計為在所測試序列之間給出最大匹配。用於確定同一性的方法被編碼在公眾可獲得的計算機程序中。兩個序列之間的同一性百分比可以通過使用合併了Needelman和Wunsch（J. Mol. Biol.，1970，48：443-453）算法（例如，NBLAST和XBLAST）的分析軟件（例如美國威斯康星麥迪遜的遺傳學計算機小組的序列分析軟件包）來確定。除非另有說明，否則使用默認參數確定本公開的多肽的同一性。

如本文所使用的，“免疫調節劑”可以指能夠調控或調節一種或多種免疫功能或應答的試劑，諸如治療劑。

如本文所使用的，關於奈米顆粒階段的術語“基序”旨在指代雙鍊或單鏈核糖核酸或其類似物。通過彼此連接，各個基序接合在一起成為較大的顆粒。連接可以通過非共價結合而發生。

本文使用的術語“奈米顆粒”旨在指代直徑從1 nm至高達1,000 nm的顆粒。所述奈米顆粒可以為5 nm至30 nm、10 nm至50 nm，10 nm至40 nm，10 nm至30 nm，10 nm至20 nm，以及10 nm至15 nm。 RNA可以從任何來源獲得，例如噬菌體phi 29、HIV、果蠅、核醣體或可以是合成RNA。

如本文所使用的術語“奈米結構”旨在指代在任何方向沿著其最大尺寸測量時1 nm至高達1,000 nm的結構。如在任何方向沿著其最大尺寸測量，奈米結構可以為5 nm至30 nm、10 nm至50 nm，10 nm至40 nm，10 nm至30 nm，10 nm至20 nm，以及10 nm至15 nm。

如本文所使用的術語“核酸”和“多聚核苷酸”通常是指至少兩個鹼基-糖-磷酸組合的序列串，並且尤其指代單鍊和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區域混合的DNA、單鍊和雙鏈RNA、和單鍊和雙鏈區域混合的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，所述DNA和RNA可以是單鏈的，或更典型的是雙鏈的，或者是單鍊和雙鏈區域的混合。此外，如本文所使用的，多聚核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區域。在這樣的區域中的鏈可以來源於相同的分子或來源於不同的分子。該區域可以包括全部的一種或多種所述分子，但更典型的是僅涉及一些所述分子的區域。具有三螺旋區域的分子之一通常是寡核苷酸。 “多聚核苷酸”和“核酸”也包含這樣的化學修飾、酶促修飾或代謝修飾的多聚核苷酸形式，以及病毒和細胞特徵的DNA和RNA的化學形式，尤其包括簡單的細胞和復雜的細胞。例如，術語多聚核苷酸包括如上所述的包含一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA。因此，包括諸如肌苷的不常見鹼基，或者諸如三苯甲基化鹼基的修飾鹼基（僅舉兩個實例）的DNA或RNA就是如本文所使用的多聚核苷酸。 “多聚核苷酸核酸”和“核酸”還包括PNA（肽核酸）、硫代磷酸酯和天然核酸的磷酸酯骨架的其它變體。天然核酸具有磷酸酯骨架，人工核酸可含有其它類型的骨架，但含有相同的鹼基。因此，具有為穩定性或其它原因而經修飾的骨架的DNA或RNA是如本文中那個術語所意指的 “核酸”或“多聚核苷酸”。特別地，“多聚核苷酸”和“核酸”還包括天然核酸的核糖（糖）部分的2'氟代，2'O-甲基化，LNA（鎖核酸），以及2'修飾的其它變體。天然核酸（DNA和RNA分別）在2’核糖位置具有質子或羥基，人工核酸可能含有其它形式的2’修飾，以增加熱力學和酶穩定性。因此，具有為穩定性或其它原因而經修飾的2’核糖位置的DNA或RNA是如本文中那個術語所意指的 “核酸”或“多聚核苷酸”。如本文所使用的，“核酸序列”和“寡核苷酸”還涵蓋如上文所定義的核酸和多聚核苷酸。

術語“藥學上可接受的”描述不是生物學上或以其他方式不期望的材料，也就是說，不引起不可接受的水平的不期望的生物效應或不以有害方式相互影響。

如本文所使用的，“藥學上可接受的載體或賦形劑”是指可用於製備藥物製劑的載體或賦形劑，所述藥物製劑通常是安全的、無毒的，並且不是生物學上或以其他方式不希望的，且包括獸醫用途以及人類藥物用途可接受的載體或賦形劑。如說明書和申請專利範圍中使用的“藥學上可接受的載體或賦形劑”包括一種和多於一種這樣的載體或賦形劑。如本文所用，“藥學上可接受的載體”是指無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在即用前重構為無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。合適的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或載劑的實例包括水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等諸如此類）、羧甲基纖維素和其合適的混合物，植物油（諸如橄欖油）和可注射的有機酯諸如油酸乙酯。例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情況下通過維持所需要的粒度，以及通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。這些組合物還可以包含佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過包含各種抗細菌劑和抗真菌劑，諸如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等諸如此類，可以確保防止微生物的作用。還希望包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉和類似物。通過包含諸如單硬脂酸鋁和明膠的試劑（其延遲吸收）會引起可注射的藥物形式的延長吸收。通過在諸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚（原酸酯）和聚（酸酐）的生物可降解聚合物中形成藥物微囊基質，製備可注射的貯庫型。依賴藥物與聚合物的比例和所使用的特定聚合物的性質，可以控製藥物釋放的速率。還通過將藥物截留在與機體組織相容的脂質體或微乳劑中而製備可注射貯庫製劑。可注射製劑可例如通過細菌截留過濾器過濾或通過加入無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌，所述無菌固體組合物可在即用之前被溶解或分散於無菌水或其它可注射無菌介質中。合適的惰性載體可以包括諸如乳糖的糖。在一些方面，活性組分顆粒的至少95重量%具有在0.01至10微米範圍的有效粒度。

如本文所使用的，術語“預防”是指排除、避免、消除、預防、停止或阻礙某些事情（例如疾病或其症狀）發生，特別是通過提前作用。應當理解，除非另外特別指出，否則在本文中使用“減少” 、“抑制”或“防止”的情況下，另外兩個詞的應用也被明確公開。例如，在一個方面，“預防”可以指預防癌細胞的複製或預防癌細胞的轉移。術語“預防”包括維持或限制在亞臨床狀態下的疾病。

如本文所使用的，“自組裝”是指核酸（以及在一些情況下是預先形成的核酸奈米結構（例如，晶體））以序列-特異性的方式、以預測的方式，並且在沒有外部控制的情況下彼此退火的能力。在一些方面，核酸奈米結構自組裝方法包括在單個容器中組合核酸（例如單鏈核酸或寡核苷酸）並允許核酸基於序列互補性彼此退火。在一些方面，這一退火過程涉及將核酸置於高溫下，然後逐漸降低溫度以利於序列特異性結合。各種核酸奈米結構或自組裝方法是已知的並在本文中記載。

如本文所使用，術語“受試者”是指施用的靶標，例如，動物、人、細胞或細胞群。因此，本文公開的方法的受試者可以是脊椎動物，諸如哺乳動物、魚、鳥、爬行動物或兩棲動物。本文公開的方法的受試者可以是人、非人靈長類、馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、牛、貓、豚鼠或囓齒動物。該術語不指定特定年齡或性別。因此，意圖涵蓋成年的和新生的受試者，以及胚胎，且無論雄性或雌性。在一個方面，所示受試者是患者。患者是指患有疾病或病症（諸如例如癌症和/或異常細胞生長）的受試者。術語患者包括人類和獸醫受試者。在一個方面，受試者已經被診斷為需要治療癌症和/或異常細胞生長。

討論

RNA奈米技術為治療包括但不限於癌症的疾病提供了巨大的前景。RNA奈米顆粒可用作各種活性劑的載體。然而，當前的RNA奈米顆粒無法基於RNA奈米技術遞送。例如，當前的RNA奈米顆粒局限在它們僅能夠以RNA奈米顆粒的每條RNA鏈與一種活性劑綴合。由於RNA奈米顆粒與綴合的活性劑相比尺寸較大，由RNA奈米顆粒攜帶的活性劑的摩爾濃度低。換句話說，RNA奈米顆粒的負載效率低。這導致通過這些RNA顆粒遞送到受試者的活性劑是低量和無效量的，從而使得當前的RNA奈米顆粒不是用於遞送活性劑以治療和/或預防疾病的合適的載體。

雖然解決該問題的直接方法是將更多的活性劑分子綴合至每個RNA奈米顆粒，但是試圖以這種方式解決負載效率低的問題的嘗試失敗。這一失敗可至少部分地歸因於RNA的折疊能量和解鏈溫度（Tm）。通過共價結合使每個RNA奈米顆粒綴合多個活性劑分子導致RNA奈米顆粒的解離除了當前的RNA奈米顆粒負載效率低以外，當前的RNA奈米顆粒還會在全身注射後發生解離。這可能是由於當前的RNA奈米顆粒的物理阻礙、低Tm和/或低熱穩定性。

考慮到當前的RNA奈米顆粒的缺陷，本文描述的是可以由一個或多個模塊化RNA基序組成的RNA奈米結構。該RNA奈米結構可以負載一種或多種活性劑並且可以具有超高的熱穩定性、超高的解鏈溫度和有助於增加負載效率和/或容量的其它物理性質。本文中所描述的含有或不含有活性劑的RNA奈米結構可以施用給受試者。通過審閱下文的附圖、具體實施方式和實施例，本公開的其它組合物、化合物、方法、特徵和優點對於本領域普通技術人員而言將是顯而易見或變得顯而易見。所有這些額外的組合物、化合物、方法、特徵和優點旨在包括在本說明書內，並且在本公開的範圍內。

RNA奈米結構

本文描述的是可以由一個或多個模塊化RNA基序組成的RNA奈米結構。所述模塊化RNA基序可以各自由3-9條被設計（或配置）以自組裝為高度有序的模塊化RNA基序的單獨的合成RNA寡核苷酸組成。組裝時，所述模塊化RNA基序可以由可以排佈在核心結構域周圍的多條雙鏈臂（DA）組成。多個模塊化RNA基序可以彼此連接以形成RNA奈米結構。圖41A-45B顯示模塊化RNA基序和RNA奈米結構的各方面。在腦海中形成對於RNA奈米結構的總體理解後，現在更詳細地描述模塊化RNA基序和RNA奈米結構的各方面。

模塊化RNA基序

如上所述，RNA奈米結構可包括一個或多個模塊化RNA基序。圖41A-41G顯示模塊化RNA基序的各方面。如圖41A-41G所示，模塊化RNA基序可以由3、4、5、6、7、8或9條合成的單鏈RNA寡核苷酸組成，所述合成的單鏈RNA寡核苷酸能夠通過雜交自組裝為模塊化RNA基序。每條合成的單鏈RNA寡核苷酸的長度可以為約16至約120個鹼基。可以設計每個模塊化RNA基序中每條合成的單鏈RNA寡核苷酸的確切序列，以使得它們在與2個或更多個其它的合成單鏈RNA寡核苷酸組裝時獲得特異性的物理特性。 RNA基序可以由3、4、5、6、7、8或9個合成RNA寡核苷酸組成。可以設計合成RNA寡核苷酸，以使得它們在自組裝後形成高度有序的2-D和/或3-D結構。自組裝時，合成RNA寡核苷酸形成高度有序的結構，其在本文中稱為模塊化RNA基序。例如，如圖41A-41G所示，2-D結構可以至少部分地取決於合成RNA寡核苷酸的數目。 RNA奈米結構可具有來自核心結構域的3、4、5、6、7、8或9條雙鏈臂（DA）。 DA可以對稱或非對稱地排佈在核心結構域周圍。

核心結構域可以具有0-4個對稱或不對稱的突起核苷酸，將各DA分隔，這可以允許優化各環的熱力學穩定性、空間限制和/或結構排布。雙鏈序列（DA）和未配對核心核苷酸數量的變化都可以影響模塊化RNA基序和/或RNA奈米結構的熱力學穩定性。因此，可以通過改變形成模塊化RNA基序的合成RNA寡核苷酸的序列而優化物理性質和功能特性。例如，圖1B顯示模塊化RNA基序，其具有3條DA，和在H2和H3 DA之間的不對稱突起（5'UUU3'）和在H1和H2 DA之間的不對稱突起（5' U3'）。在另一個實例中，圖29C顯示含有三條DA的模塊化RNA基序，所述三條DA具有不同的不對稱突起但相同的DA（在它們的H1 | H2 | H3 DA之間分別是U | UUU | -、- | GG | -和- | C | CU），從而產生不同的退火Tm值（圖30A）。另外，圖38A至38G顯示具有3-9條DA的模塊化RNA基序，在各DA之間具有對稱的突起（5’UG3’）。

如41A至41G所示，RNA寡核苷酸自組裝，以使得模塊化RNA基序包含含有3、4、5、6、7、8或9條DA（圖41A至41B中顯示的黑色部分）的核心域（圖41A至41G中虛線框內部的淺灰色區域）。 DA可以排佈在核心區域周圍，以使得在任何兩個相鄰DA之間形成角度（θ）。例如，在圖41A中，模塊化RNA基序包含3段合成RNA寡核苷酸，其自組裝形成具有3條DA的模塊化RNA基序。在DA1和DA2之間形成的角度被記錄為θ2，在DA1和DA3之間形成的角度被記錄為θ3，以及在DA3和DA2之間形成的角度被記錄為θ1。圖41B至41G關於每幅圖中顯示的模塊化RNA基序具有類似的符號標記。 DA可以基本上對稱地定位在核心結構域周圍。在其它方面，DA不是對稱地定位在核心結構域周圍。表1顯示了圖41A至41G中引用的每個模塊化RNA基序的角度範圍。

表1.模組化RNA基序的角度。

模組化RNA基序的解鏈溫度（Tm）可為約65 ℃或更高。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可大於65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃。在有些方面，模組化RNA基序的Tm可以是65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃ 。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從65 ℃至66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從66至67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從67至68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從68至69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從69至70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從70至71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從71至72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從72至73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從73至74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從74至75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從75至76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從76至77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從77至78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從78至79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從79至80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從80至81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從81至82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從82至83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從83至84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從84至85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從85至86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從86至87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從87至88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從88至89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從89至90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從90至91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從91至92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從92至93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從93至94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從94至95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從95至96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從96至97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從97至98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從98至99或100 ℃的範圍。在有些方面，模組化RNA基序的解鏈溫度可以在從99至100 ℃的範圍。

合成RNA寡核苷酸

如前文所述，模塊化RNA基序可以由3-9段單獨的合成RNA寡核苷酸組成，所述合成RNA寡核苷酸可以自組裝以形成模塊化RNA基序。合成RNA寡核苷酸可以是單鏈。每段單獨的合成RNA寡核苷酸可以由16-120個核苷酸組成。核苷酸可以是天然核糖核苷酸或可以被修飾。在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以是2’修飾的。 2'修飾或其它修飾可以2'氟代-、2'O-甲基化-、LNA-或任何其它骨架、糖或鹼基修飾的核糖核苷酸，或者天然核糖核苷酸、骨架、糖和鹼基修飾的核糖核苷酸的任何組合。修飾在本文的其它部分進一步討論。每段合成RNA寡核苷酸可以由16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119或120個核苷酸或其中任何範圍的核苷酸組成。可以設計和配置每段合成RNA寡核苷酸，以使得它能夠與2、3、4、5、6、7或8個其它的合成RNA寡核苷酸一起自組裝成如本文其它部分所述的模塊化RNA基序。合成RNA寡核苷酸的合理設計在本文其它部分描述。

核苷酸可以是未修飾的核苷酸或修飾的核苷酸。所述修飾可以是5’-末端修飾和/或3’-末端修飾和/或2’-內部糖修飾和/或鹼基內部修飾。典型的5 '末端修飾包括氨基、羧基、磷酸酯、硫醇、馬來酰亞胺、炔、膽固醇、醛、碳間隔區、PEG-間隔區、二重區（doubler）、三重區（trebler） 、可光解氨基、可光解間隔區、熒光團（例如，花青素3、3.5、5、5.5、7，熒光素等）、生物素、脫硫生物素，地高辛、猝滅劑（ dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等）或本領域有經驗的使用者已知的其它5'修飾。典型的3'末端修飾包括氨基、羧基、磷酸酯、硫醇、炔、膽固醇、碳間隔區、PEG-間隔區、熒光團（例如，花青素3、3.5、5、5.5、7，熒光素等）、生物素、脫硫生物素、地高辛、猝滅劑（dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等）或本領域有經驗的使用者已知的其它3'修飾。典型的內部修飾包括氨基-dA、氨基-dC、氨基-dT、羧基-dT、2'O-炔丙基、2'-氨基、2'-氟代、2'-甲氧基、5 -乙炔基-dU、C8-炔-dC、C8-炔-dT、碳間隔區、PEG -間隔區、熒光團（例如花青素3、3.5、5、5.5、7，熒光素等）、生物素、脫硫生物素、地高辛、猝滅劑（dabcyl、dabsyl、BlackHole、BBQ650等）或本領域有經驗的使用者已知的其它5'修飾。修飾可以是與核苷酸連接的炔基。修飾可以是與核苷酸連接的官能團。合適的官能團在本文其它部分描述。存在於每段合成RNA寡核苷酸中的炔基或官能團能夠促進貨物化合物在包含炔基的位點經由例如點擊化學綴合。參見例如圖3A。在合成RNA寡核苷酸中，一個或多個末端（例如，5’末端和/或3’末端）核苷酸可以被修飾。合成RNA寡核苷酸的一個或兩個末端可以被修飾。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120個核苷酸可以被修飾。在有些方面，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、 100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120個核苷酸可以未被修飾。如果從5 '末端至3 '末端按順序地考慮合成RNA寡核苷酸中的每個核苷酸，修飾的核苷酸可以是核苷酸1、2、3、4、5、6、7 、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32 、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57 、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82 、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107 、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120或其任何組合。在存在多個修飾的核苷酸的情況下，修飾的核苷酸可以彼此相鄰，或者可以由一個或多個未修飾的核苷酸間隔開。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個未修飾的核苷酸可以介於兩個修飾的核苷酸之間。

在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以具有根據SEQ ID NOs：1-54中的任一個的序列。在有些方面，合成RNA寡核苷酸可以具有與SEQ ID NOs：1-54中的任一個百分之80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或約99一致的序列。

製備合成RNA寡核苷酸的方法

可以使用標準的分子生物和生物化學技術來合成所述合成RNA寡核苷酸、多聚核苷酸官能團和多聚核苷酸貨物化合物。換句話說，可形成RNA奈米顆粒的各種核酸可以根據需要從頭合成或由各種核酸表達載體產生或體外轉錄。這樣的合成技術對於本領域技術人員來說是已知的。

RNA奈米結構

在有些方面，單個模塊化RNA基序可以是RNA奈米結構。本文還描述了可包括兩個或更多個模塊化RNA基序的RNA奈米結構。例如，如圖42A至42G所示，RNA奈米結構可以是有序的。一級模塊化RNA基序（例如圖42A 至42G中的黑色模塊化RNA基序）可以連接或以其它方式偶聯到3-9個額外的模塊化RNA基序上以形成中間層（例如圖42A至42G中的深灰色模塊化RNA基序）。中間層中的每個模塊化RNA基序可以連接或以其它方式偶聯到3-9個額外的模塊化RNA基序上。在有些方面，連接或以其它方式偶聯到RNA奈米結構的中間層上的模塊化RNA基序可以形成RNA奈米結構的末端層或外層（例如圖42A至42G中淺灰色的模塊化RNA基序）。在其它實施方案中，連接或以其它方式偶聯到RNA奈米結構的中間層上的模塊化RNA基序可以形成另一個中間層。在有些方面，RNA奈米結構可具有模塊化RNA基序的1個中間層。將理解的是，可以連接或以其它方式偶聯到其上的模塊化RNA基序的總數僅受模塊化RNA基序中DA的數量的限制。連接或偶聯可以在構成模塊化RNA基序的合成的寡核苷酸的3’端和/或5’端發生。

在有些方面，RNA奈米結構可以是均質的（例如，包含在RNA奈米結構中的所有模塊化RNA基序可以是相同的）。在有些方面，RNA奈米結構可以是異質的（例如，包含在RNA奈米結構中至少兩個模塊化RNA基序在一個或多個以下特徵中彼此不同：DA的數目、寡核苷酸序列的長度和/或寡核苷酸序列）。 RNA奈米結構的層可以是均質的（例如，給定層中的每個模塊化RNA基序可以是相同的）。 RNA奈米結構的層可以是異質的（例如，包含在層中的至少兩個模塊化RNA基序在以下特徵中的至少一個中彼此不同：DA的數目、寡核苷酸序列的長度，和/或寡核苷酸序列）。在有些方面，RNA奈米結構的一個或多個層可以各自是均質的，但RNA奈米結構可以是異質的，因為RNA奈米結構中的兩個或更多個模塊化RNA基序關於以下特徵中的一個或多個彼此不同：DA的數目、寡核苷酸序列的長度，和/或寡核苷酸序列。圖42A至42G顯示包含均質的層的均質RNA奈米結構的方面。圖43顯示包含均質的層的異質RNA奈米結構的一個方面。如圖43中所示，在有些方面，每個層可以由具有不同數目的DA的模塊化RNA基序組成。在有些方面，異質RNA奈米結構可含有均質的層和至少一個異質的層。在有些方面，如果RNA奈米結構在基序中、層中或跨過一個或多個層加載一種或多種不同的貨物化合物，則所述RNA奈米結構可以被認為是異質的。

本文所述的RNA奈米結構可具有高熱穩定性或超高熱穩定性，如在本文中經由在qPCR中的顆粒退火或在熱梯度凝膠分析（TGGE）中的顆粒解離進行Tm測量而定義。本文所述的RNA奈米結構可具有高解鏈溫度或超高解鏈溫度（Tm）。 RNA寡核苷酸通常表現長度依賴的的解鏈溫度，其對於長的雜交雙鏈在70-75 ℃達到穩定。所述雙鏈的修飾和疏水分子綴合降低RNA雙鏈的穩定性並因此導致較低的解鏈溫度和解離形成單獨的鏈，從而導致體內酶解消化。適於攜帶高密度官能團的RNA奈米結構具有約70 ℃或更高的Tm。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可高於65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃ 。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以是65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83 、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃ 。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從65 ℃至66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82 、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從66至67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從67至68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從68至69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從69至70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從70至71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從71至72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從72至73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從73至74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從74至75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從75至76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從76至77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從77至78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從78至79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從79至80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從80至81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從81至82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從82至83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從83至84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從84至85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從85至86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從86至87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從87至88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從88至89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從89至90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從90至91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從91至92、93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從92至93、94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從93至94、95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從94至95、96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從95至96、97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從96至97、98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從97至98、99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從98至99或100 ℃的範圍。在有些方面，RNA奈米結構的解鏈溫度可以在從99至100 ℃的範圍。

在有些方面，核心模塊化RNA基序的Tm可以大於形成中間層的模塊化RNA基序的Tm，其可以大於形成末端層或最外層的模塊化RNA基序的Tm 。應當理解，在存在多個中間層的情況下，形成最內層中間層的模塊化RNA基序的Tm可以大於形成最外層中間層的模塊化RNA基序的Tm。位於最內層中間層和最外層中間層之間的任何中間層可具有Tm低於形成最內層中間層的模塊化RNA基序的Tm、高於形成最外層中間層的模塊化RNA基序的Tm、並且可以隨著距最內部層中間層的距離而降低的模塊化RNA基序。這一特徵可導致可在高於模塊化RNA基序的測量的Tm值的溫度下發生的熱力學驅動的奈米結構組裝（圖33A）。這進一步通過以與各模塊化RNA基序的Tm成比例的速率使每個層脫落而可以允許有效負載釋放的熱力學機制（圖33D）。

當沿著其最長或最大尺寸測量時，RNA奈米結構可具有高達微米的大小。當沿著其最長或最大尺寸測量時，RNA奈米結構的大小可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41 、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67 、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92 、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或約900 nm。在有些方面，當沿著其最長或最大尺寸測量時，RNA奈米結構的大小可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 nm或其中的值的任何範圍。在有些方面，當沿著其最長或最大尺寸測量時，RNA奈米結構的大小可為約1-30、1-40、1-50、10-50、10-40、10-30、30- 50、30-40或40-50 nm。在有些方面，RNA奈米結構可以大體上是球形的。在其它方面，RNA奈米結構可以是三角形平面、三角錐體、T形、四面體、方形平面、交互的、三角雙錐體、四方錐體、五角平面、八面體、三角棱柱，五角椎體、五角雙錐體、四角反棱柱、三帽三角棱柱、單蓋四角反棱柱、箭頭形、箭尾形、X形，或任何這些形狀的變形形式。

負載的和/或功能化的RNA奈米結構

構成本文中所描述的RNA奈米結構的模塊化RNA基序可提供各種位點，貨物化合物和/或官能團可在這些位點處連接到或以其它方式偶聯到模塊化RNA基序。通過將貨物化合物和/或官能團連接到或以其它方式偶聯到模塊化RNA基序，RNA奈米結構可以負載一種或多種貨物化合物和/或用一種或多種官能團官能化。貨物化合物和/或官能團可以在RNA奈米結構被組裝之前或之後被連接到或以其它方式被偶聯到模塊化RNA基序。

貨物化合物和/或官能團可以被連接到或以其它方式被偶聯到RNA奈米結構中的模塊化RNA基序的一個或多個DA的5 '末端和/或3 '末端（參見例如圖1C）。如前文所討論的，構成模塊化RNA基序的合成RNA寡核苷酸的一個或多個核苷酸可以被修飾，以使得官能團或貨物化合物的連接或偶聯可以發生在該核苷酸上。在有些方面，修飾的核苷酸在RNA寡核苷酸中可以存在於這樣的位置，以使得當組裝成模塊化RNA基序時，修飾的核苷酸存在於DA中（參見例如圖16A- 16B和圖18）。因此，模塊化RNA基序可以在模塊化RNA基序的DA中的一個或多個核苷酸處負載貨物化合物和/或官能團。存在於RNA奈米結構中的模塊化RNA基序可以在每個DA的5'末端和/或3'末端和/或每個DA中的一個或多個內部核苷酸（例如，修飾的核苷酸）處被負載。

在有些方面，RNA奈米結構中的模塊化RNA基序的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、130、140、150、160、170、180、190、 200、250、300、350、400、450、500、550、至600或更多個末端可用於連接或偶聯至貨物化合物或官能團。在有些方面，RNA奈米結構中的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 、21、22、23、24、25、26、27 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950至1000或更多個核苷酸可用於修飾和/或連接或偶聯至貨物化合物或官能團。因此，只要RNA奈米結構在被負載時是穩定的並且負載不違反化學或物理限制（例如，位阻），則可以連接到或以其它方式偶聯到RNA奈米結構的貨物化合物和/或官能團的數目可以與那些可用於負載的位點的數目相同。

RNA奈米結構可以負載單一類型的貨物化合物。 RNA奈米結構可以負載單一類型的官能團。 RNA奈米結構可以負載2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多類型的貨物化合物。 RNA奈米結構可以負載2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多類型的官能團。

在包含多層的RNA奈米結構中，所有層可以負載相同的貨物化合物和/或官能團類型。在有些方面中，在包含多層的RNA奈米結構中，兩層或更多層可以負載不同的貨物化合物和/或官能團類型。在一個非限制性實例中，三層RNA奈米結構可以在核心層中負載一種或多種類型的貨物化合物（例如一種或多種類型的貨物化合物的20至100個分子），由可負載內體逃逸和/或放射-MRI-熒光成像形態的第二層（或中間層）屏蔽，並且最終由末端層或最外層進行保護，其在末端層暴露於溶劑的端部負載靶標和/或增強生物分佈的官能團（圖46B）。如圖32D所示，兩層通過將內層的合成寡核苷酸與外層的合成寡核苷酸之一偶聯而連接。因此，層的結合由組成顆粒的層的Tm控制，然後其可以用於確定特定官能團層的釋放曲線。或者，層可通過pH、光或酶敏感的化學基團偶聯，以在一旦滿足期望的環境條件，諸如細胞攝入低pH的內體或溶酶體時，誘導釋放。

圖44A至44B顯示負載單一類型的貨物化合物或官能團的RNA奈米結構的方面。黑色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊化RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的二級或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的末端或最外層水平的模塊化RNA基序。

圖45A至45B顯示負載多種類型的貨物化合物和/或官能團（包括但不限於活性劑）的RNA奈米結構的方面。黑色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊化RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的二級或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序指示包含在RNA奈米結構中的末端或最外層水平的模塊化RNA基序。

圖46A至46B顯示負載多種類型的貨物化合物和/或官能團（包括但不限於紫杉醇）的RNA奈米結構的方面。圖46A. 具有模塊化RNA基序的奈米結構，所述模塊化RNA基序包含具有內部修飾的延長的核心，所述內部修飾允許活性劑特異性連接至奈米結構的核心。圖46B. 具有不同官能團的奈米結構，所述官能團連接至每一層中的寡核苷酸的5’末端或3’末端。

貨物化合物和官能團

如前文所述，RNA奈米結構可以包含一種或多種貨物化合物和/或一個或多個官能團。在有些方面，可以被連接或以其它方式被偶聯至RNA奈米結構的單個化合物或分子可以是貨物化合物和官能團。如本文上下文中所使用的，術語“貨物化合物”是指可以如本文所述被負載到RNA奈米結構上並且可以被遞送至受試者（例如，通過從RNA奈米結構釋放，或甚至當被連接或以其它方式偶聯至RNA奈米結構時在與受試者接觸時在受試者中引發生理反應）的任何分子、化合物或組合物。如本文上下文中使用的術語“官能團”是指將功能性加入到RNA奈米結構中的化合物。貨物化合物或官能團可以是任何生物分子、化學分子、合成分子或任何其它分子，其可以如本文所述由本文所述的RNA奈米結構封裝，連接至和/或結合至如本文所述的RNA奈米結構。貨物化合物和/或官能團可以是活性劑。在有些方面，貨物化合物可以由RNA奈米結構或其組分封裝，連接至和/或結合至RNA奈米結構或其組分。

在有些方面，貨物化合物和/或官能團可以是DNA、RNA、修飾的核糖核苷酸、氨基酸、肽、多肽、抗體、適體、適體酶、核糖開關、核糖酶、抑制必需腫瘤蛋白質和基因的翻譯或轉錄的核糖酶的引導序列、激素、免疫調節劑、退熱劑、鎮靜劑，抗精神病藥、鎮痛劑、解痙劑、抗炎藥、抗組胺劑、抗感染劑和化學治療劑（抗癌藥）。其它合適的貨物化合物包括可使細胞或受試者對治療或預防和成像或其它診斷劑更響應（或敏感）的敏化劑（例如，輻射敏化劑）。 RNA奈米結構可以被用作單藥治療或與其它活性劑組合用於治療或預防疾病或病症。

合適的激素包括但不限於氨基酸衍生的激素（例如，褪黑激素和甲狀腺素）、小肽激素和蛋白質激素（例如促甲狀腺素釋放激素、抗利尿激素、胰島素、生長激素、促黃體激素、促卵泡激素，和促甲狀腺激素）、類花生酸（例如花生四烯酸、脂氧素和前列腺素），和類固醇激素（例如雌二醇、睾酮、四氫睾酮皮質醇）。

合適的免疫調節劑包括但不限於強的松、咪唑硫嘌呤、6-MP、環孢黴素、他克莫司、氨甲蝶呤、白介素（例如IL-2、IL-7和IL-12）、細胞因數（例如干擾素（例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、和IFN-γ）、粒細胞集落刺激因數，和咪喹莫特）、趨化因數（例如，CCL3、CCL26和CXCL7）、胞嘧啶磷酸鳥苷、寡去氧核苷酸、葡聚糖、抗體，和適體）。

合適的退熱劑包括但不限於非類固醇抗炎藥（例如布洛芬、萘普生、酮洛芬，和尼美舒利）、阿司匹林和相關的的水楊酸鹽（例如水楊酸膽鹼、水楊酸鎂，和水楊酸鈉）、對乙酰氨基酚/醋氨酚、安乃近、納布美通、安替比林，和奎寧。

合適的鎮靜劑包括，但不限於，苯二氮卓類（例如，阿普唑侖、溴西泮、氯氮卓、氯硝西泮、氯拉酸、地西泮、氟西泮、勞拉西泮、奧沙西泮、替馬西泮，三唑侖，和托非索泮）、血清素能（serotenergic）的抗抑鬱藥（例如，選擇性血清素再攝取抑製劑，三環抗抑鬱藥和單胺氧化酶抑製劑），mebicar、afobazole、selank、溴曼特（bromantane）、美昔得樂（emoxypine）、阿扎哌隆、巴比妥酸鹽、羥嗪、普瑞巴林、伐力多和β-受體阻滯劑。

合適的抗精神病藥包括，但不限於，苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆(pipaperone)、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齊特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美馬嗪、地西拉嗪（dizyrazine）、氟非那嗪、左美丙嗪、美索達嗪、丙拉嗪、哌氰嗪、羥哌氯丙嗪、哌普嗪、普魯氯嗪、普馬嗪、異丙嗪、氮丙嗪、硫丙拉嗪、硫醚嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻噸、氯哌噻噸、氟哌噻噸、替沃噻噸、珠氯噻醇、氯噻平、克噻平、氮丙嗪、卡匹帕明、氯卡帕明、嗎啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、維拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、魯拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奧氮平，帕潘立酮、哌羅匹隆、喹硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、三甲丙咪嗪、齊拉西酮、佐替平、alstonie、聯苯蘆、生物蝶呤、依匹哌唑、大麻二酚、卡利拉嗪、匹莫範色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、諾美林，和齊洛那平（zicronapine）。

合適的鎮痛劑包括但不限於對乙酰氨基酚/醋氨酚、非類固​​醇抗炎藥（例如，布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利）、COX-2抑製劑（例如，羅非昔布、塞來昔布，和依托昔布）、阿片樣物質（例如，嗎啡、可待因、氧可酮、氫可酮、二氫嗎啡、哌替啶、丁丙諾啡）、曲馬朵、去甲腎上腺素、氟西汀、奈福泮、奧芬那君、普瑞巴林、加巴噴丁、環苯扎林、東莨菪鹼、美沙酮、凱托米酮、哌腈米特，和阿司匹林和相關的水楊酸鹽（例如，水楊酸膽鹼，水楊酸鎂，和水楊酸鈉）。

合適的解痙劑包括，但不限於，美貝維林（mebeverine）、罌粟鹼（paverine）、環苯扎林、卡立普多、奧芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林。

合適的抗炎藥包括但不限於強的松、非膽固醇抗炎藥（例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利）、COX-2抑製劑（例如，羅非昔布、塞來昔布和依托昔布），和免疫選擇性抗炎性衍生物（例如，頜下肽- T及其衍生物）。

合適的抗組胺劑包括，但不限於，H1-受體拮抗劑（例如，阿伐斯汀、氮卓斯汀，比拉斯汀、溴苯那敏、布克利嗪、溴馬嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、賽克利嗪、氯苯那敏、氯馬斯汀、賽庚啶、地氯雷他定、右旋溴苯那敏、右旋氯苯那敏、茶苯海明（dimenhydrinate）、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羥嗪、左西替利嗪（levocetirzine ）、氯雷他定、美克洛嗪、米氮平、奧洛他定、奧芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、異丙嗪、嘧啶胺、喹硫平，盧帕他定、曲吡那敏和曲普利啶）、H2-受體拮抗劑（例如，西咪替丁、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁（ rafitidine）和羅沙替丁）、曲托喹啉、兒茶素、色甘酸鹽（Cromoglicate）、奈多羅米、和β2 -腎上腺素能激動劑。

合適的抗感染劑包括，但不限於，抗阿米巴藥（例如，硝唑尼特、巴龍黴素、甲硝唑、磺甲硝咪唑(tnidazole)、氯喹，和雙碘喹啉）、氨基糖苷類（例如，巴龍黴素，妥布黴素、慶大霉素、阿米卡星、卡那黴素，和新黴素）、驅腸蟲藥（例如，噻嘧啶、甲苯咪唑、伊維菌素、吡喹酮、阿苯達唑、米替福辛、噻苯達唑、奧氨尼喹）、抗真菌劑（例如，氮雜茂抗真菌劑（例如，伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克黴唑、咪康唑，和伏立康唑）、棘白菌素（例如，卡泊芬淨、阿尼芬淨，和米卡芬淨），灰黃黴素、特比萘芬、氟胞嘧啶，和多烯類（例如，制黴菌素和兩性黴素b）、抗瘧藥（例如，乙胺嘧啶/磺胺多辛、青蒿素甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍，奎寧、羥基氯喹、甲氟喹、氯喹、強力黴素、乙胺嘧啶，和鹵泛曲林）、抗結核劑（例如，基水楊酸鹽（例如，氨基水楊酸）、異煙肼/利福平、異煙肼/吡嗪酰胺/利福平、貝達喹啉、異煙肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福噴汀、捲曲黴素，和環絲氨酸）、抗病毒劑（例如，金剛烷胺、金剛烷乙胺、阿巴卡韋/拉米夫定、恩曲他濱/替諾福韋、可比司他/elvitegravir/恩曲他濱/替諾福韋、依法韋侖/恩曲他濱/替諾福韋、阿巴卡韋/拉米夫定/齊多夫定、拉米夫定/齊多夫定、恩曲他濱/替諾福韋、恩曲他濱/洛匹那韋/利托那韋/替諾福韋，干擾素α-2v/利巴韋林、PEG干擾素α-2b、馬拉韋羅、雷替格韋、度魯特韋、恩夫韋地、膦甲酸、福米韋生、奧司他韋、扎那米韋、奈韋拉平、依法韋侖、依曲韋林、利匹韋林、地拉韋定、奈韋拉平、恩替卡韋、拉米夫定、阿德福韋、索非布韋、地達諾新、替諾福韋、阿巴卡韋（avacivr）、齊多夫定、司他夫定、恩曲他、扎西他濱（xalcitabin）、替比夫定、西咪匹韋、波普瑞韋、特拉匹韋、洛匹那韋/利托那韋、福沙那韋、地瑞那韋、利托那韋、替拉那韋、阿扎那韋、奈非那韋、安普那韋、茚地那韋、沙奎那韋（sawuinavir）、利巴韋林、伐昔洛韋（valcyclovir）、阿昔洛韋、泛昔洛韋、更昔洛韋，和纈更昔洛韋）、碳青黴烯類（例如，多利培南、美羅培南、厄他培南，和西司他丁/亞胺培南）、頭孢菌素（例如，頭孢羥氨芐、頭孢拉啶、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢吡肟、頭孢洛林（ceflaroline）、氯碳頭孢、頭孢替坦、頭孢呋辛、頭孢羅齊、氯碳頭孢、頭孢西丁，頭孢克洛、頭孢布烯、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢托崙、頭孢去甲噻肟（cefizoxime），和頭孢他啶）、糖肽抗生素（例如，萬古黴素、達巴萬星、奧利萬星，和特拉萬星（telvanci n）），甘氨環素類（例如，替加環素）、抗麻風藥（例如，氯法齊明和沙利度胺）、林可黴素及其衍生物（例如，克林黴素和林可黴素）、大環內酯類及其衍生物（例如，泰利黴素、非達黴素、紅黴素、阿奇黴素、克拉黴素、地紅黴素，和醋竹桃黴素）、利奈唑胺、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、利福昔明、氯黴素、磷黴素，甲硝唑、氨曲南、桿菌肽、β -內酰胺抗生素（芐星青黴素（苯乍生和芐基青黴素）、苯氧甲基青黴素、氯灑西林、氟氯西林（flucoxacillin）、甲氧西林、替莫西林、美西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、阿莫西林、氨芐西林、巴氨西林、羧芐西林、哌拉西林、替卡西林，阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、拉維酸/替卡西林、青黴素、普魯卡因青黴素、苯唑西林、雙氯西林、奈夫西林、頭孢唑啉、頭孢氨芐頭孢菌素C、先鋒黴素、頭孢克洛，頭孢羥唑、頭孢呋辛、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢克肟（cefiximine）、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢洛林、比阿培南、多利培南、厄他培南、法羅培南、亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、沙納黴素、氨曲南（azrewonam）、替吉莫南、諾卡黴素A、taboxinine，和β -內酰胺）、喹諾酮（例如，洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西諾沙星、萘啶酸、依諾沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星，和司帕沙星）、磺胺類（例如，磺胺甲噁唑/甲氧芐啶，柳氮磺吡啶，和磺胺異噁唑）、四環素類（例如，強力黴素、地美環素、米諾環素、強力黴素/水楊酸、強力黴素/ω-3多不飽和脂肪酸，和四環素） ，和泌尿系統抗感染劑（例如，呋喃妥因、烏洛托品、磷黴素、西諾沙星、萘啶酸、甲氧芐啶，和亞甲基藍）。

合適的化學治療劑包括，但不限於，紫杉醇、喜樹鹼、本托昔單抗(brentuximab vedotin)、多柔比星、5-FU（氟尿嘧啶）、依維莫司、培美曲塞、美法崙、帕米膦酸鹽、阿那曲唑、依西美坦、奈拉濱，奧法木單抗、貝伐單抗、貝利司他、托西莫單抗、卡莫司汀、博來黴素、博舒替尼、白消安、阿崙單抗、伊立替康、凡德他尼、比卡魯胺、洛莫司汀、道諾黴素、氯法拉濱、卡博替尼、放線菌素D，雷莫蘆單抗、阿糖胞苷、環磷酰胺、環磷酰氮芥、地西他濱、地塞米松、多西他賽、羥基脲、氮烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奧沙利鉑、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔單抗、維莫德吉、菊歐文氏菌天冬酰胺酶、氨磷汀、依托泊苷、氟他米特、托瑞米芬、氟維司群、來曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、氨甲蝶呤、氟尿苷、阿托珠單抗、吉西他濱，阿法替尼、甲磺酸伊馬替尼、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠單抗、六甲蜜胺、拓撲替康、帕納替尼、伊達比星、異環磷酰胺、依魯替尼、阿西替尼、干擾素α-2a、吉非替尼、羅米地辛、伊沙匹隆、魯索替尼、卡巴他賽、ado -曲妥珠單抗美坦新偶聯物、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈濱、米托坦、長春新鹼、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司鈉、氯化鍶- 89 、二氯甲基二乙胺、絲裂黴素、白消安、吉妥珠單抗奧佐米星、長春瑞濱、非格司亭、PEG非格司亭、索拉非尼、尼魯米特、噴司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培門冬酶、地尼白介素（deneukin diftitox）、阿利維A酸、卡鉑、帕妥珠單抗、順鉑、泊馬度胺、強的松、阿地白介素、巰嘌呤、唑來膦酸、來那度胺、利妥昔單抗、奧曲肽、達沙替尼、瑞戈非尼、組胺瑞林、舒尼替尼、司妥昔單抗、高三尖杉酯鹼、鳥嘌呤（硫鳥嘌呤（tioguanine））、達拉非尼、厄洛替尼、貝沙羅丁、替莫唑胺、噻替派、沙利度胺、BCG、替西羅莫司、苯達莫司汀鹽酸鹽、曲普瑞林、三氧化二砷（aresnic trioxide）、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼單抗、長春花鹼、硼替佐米、維甲酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亞葉酸、克里唑蒂尼、卡培他濱、恩雜魯胺、易普利姆瑪、戈舍瑞林、伏立諾他、艾代拉里斯、色瑞替尼、阿比特龍、埃博黴素、他氟泊苷（tafluposide）、咪唑硫嘌呤、去氧氟尿苷、長春地辛、全反式維甲酸，和本文其它處列出的其它抗癌劑。

合適的敏化劑可包括但不限於放射敏化劑、胰島素敏化劑（例如，二甲雙胍、噻唑烷二酮、）和用於光動力療法的光敏劑（例如，氨基乙酰丙酸（ ALA）、矽酞菁Pc4、m-四羥基苯基二氫卟酚（mTHPC），和單-L-天冬氨酰二氫卟吩e6（NPe6）。

合適的顯像劑包括但不限於熒光分子（例如，Cy3、Cy5、ICG，和其它可商購的熒光團）、順磁性離子、可含有順磁性離子的奈米顆粒、超順磁性的氧化鐵分子及其奈米顆粒，18F-氟脫氧葡萄糖和其它PET顯像劑、含有钆的造影劑、放射性核素和其組合物。

在有些方面，官能團可以是靶向部分。如在這一語境中所使用的，短語“靶向部分”是指在遞送至受試者後可導致RNA奈米結構被特異性地定向至受試者中的位置、細胞類型、器官，或結構的化合物、分子或任何其它組合物。靶向部分可以包括化合物和分子，諸如抗體、適體和受體配體。

合適的靶向部分包括但不限於與下列結合的適體和配體：表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺特異性膜抗原受體（PSMA）、上皮細胞粘附分子（EpCam） 、血管內皮生長因子（VEGF）、半乳糖受體、葉酸受體、G蛋白偶聯受體（GPCR）、CD受體、整聯蛋白、轉鐵蛋白受體、成纖維細胞生長因子（FGFR） 、σ受體（SR），和/或表皮生長因子受體（EGFR），或化學配體諸如葉酸、半乳糖和GalNAc。

在有些方面，官能團/貨物化合物可以是螯合劑。合適的螯合劑包括但不限於NOTA、DOTA、EDTA、恩瑞格（Exjade）、二巰基丁二酸、甲磺酸去鐵胺、去鐵酮、Jadenu，和鹽酸曲恩汀（Syprine）。

在有些方面，官能團/貨物化合物可以是疏水的。在有些方面，官能團和/或貨物化合物可以是親水的。在有些方面，官能團和/或貨物化合物可以帶正電荷。在有些方面，官能團和/或貨物化合物可以帶負電荷。在有些方面，官能團和/或貨物化合物可以是電中性的。在有些方面，官能團和/或貨物化合物可以是不帶電荷。

在有些方面，靶向部分特異性靶向癌細胞。在有些方面，靶向部分是EGFR、HER2，和/或EP-CAM適體或PSM抗原，或葉酸。在有些方面，靶向部分是EGFR的配體。在其它方面，靶向部分靶向血液、肺、腎、腦組織、神經元、肌肉、心臟、腱、韌帶、肝、胰腺，或其它特定的組織。

在有些方面，官能團可以促進貨物分子的連接。如本文其它部分所述，構成合成RNA寡核苷酸的核苷酸可以被修飾。除了炔之外，合成RNA寡核苷酸可以被諸如接頭的官能團修飾。使用用於定時的觸發式釋放的熱力學、酸不穩定、光敏，或酶不穩定的化學基團，個別的官能團可以被連接或以其它方式偶聯至合成RNA寡核苷酸和/或貨物化合物或額外的官能團。在有些方面，官能團可以是刺激響應接頭，諸如可光解接頭、pH響應接頭，或酶可切割的接頭。可光解接頭是含有可由特定波長的光裂解的光不穩定基團的分子。所述可光解接頭可以可裂解地將貨物分子或其它功能部分（例如，靶向部分）連接至RNA奈米顆粒。這是其中貨物分子從RNA奈米顆粒釋放可以被調節和控制的另一種機制。所述可光解接頭可通過電磁輻射源（包括但不限於可見光、紅外輻射、紫外輻射）被激活（例如，裂解）。使用可光解接頭可允許對貨物分子從RNA奈米顆粒的釋放進行時間控制和空間控制。示例性的可光解接頭可包括但不限於亞磷酰胺（參見例如，Olejnik et al., Nucleic Acids Res. (1998); 26:3572-3576; Olejnik et al. Nucleic Acid Res. (1999), 27:4626-4631; 和Tang et al., Nucleic Acid Res (2002), 38:3848-3855, Gene Link目錄號26-6888)、可光解的生物素（參見例如，Olejnik et al., Nucleic Acids Res. (1998); 26:3572-3576; Olejnik et al. Nucleic Acid Res. (1999), 27:4626-4631; 和Tang et al., Nucleic Acid Res (2002), 38:3848-3855, Gene Link目錄號26-6691）、可光解的氨基C6（參見例如，Olejnik et al., Nucleic Acids Res. (1998); 26:3572-3576; Olejnik et al. Nucleic Acid Res. (1999), 27:4626-4631; 和Tang et al., Nucleic Acid Res (2002), 38:3848-3855, Gene Link目錄號26-6890)、可光解的間隔區（參見例如，參見例如，Olejnik et al ., Nucleic Acids Res. (1998); 26:3572-3576; Olejnik et al. Nucleic Acid Res. (1999), 27:4626-4631;和Tang et al., Nucleic Acid Res (2002), 38:3848 -3855, Gene Link目錄號26-6889）；2 -基芐基接頭（參見例如，Bai et al., (2003) PNAS, 100: 409-413）。本領域普通技術人員將理解其它合適的可光解接頭。

在有些方面，所述接頭可以是pH響應接頭。 pH響應接頭可以是能在一定的定pH降解（例如水解）的任何化合物。因此，pH響應接頭可以是酸響應的或鹼性響應的。所述pH響應接頭可以是聚合物。合適的pH響應接頭在本領域中通常是已知的，並且包括但不限於在以下中所描述的那些：Choy et al. (Bioconjugate. Chem. (2016) 27:824-830; Schmaljohann (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. (2006) 58:1655-1670, Balamuralidhara et al. (2011) Am. J. Drug Disc. Devel. 1:24-48; Biomedical Nanomaterials, ed. Zhao and Shen (2016),第6章; Masson et al. (2004) J. Control Release. 99:423-434; Karimi et al., Nanomed. and Nanobiotech. (2016) 8:696-716; 國際專利申請公開WO2016/028700; 和Patil et al., 2012. Int. J. Mol. Sci. 13:11681-11693。

在有些方面，所述接頭可以是酶可切割接頭。酶可切割接頭是含有酶的切割位點的接頭。在有些方面，所述接頭可以是含有針對核酸內切酶的序列的核酸。本領域普通技術人員將理解核酸內切酶切割位點和如何產生含有它們的核酸分子。可以包含的其它切割位點可以是RNA酶或DNA酶切割位點。在有些方面，酶可切割位點可以是針對對靶細胞特異的酶的切割位點。因此，以這種方式，釋放可以被控制，以使得其通過與靶細胞特異性酶的相互作用而僅在靶細胞處發生。在有些方面，所述接頭可以是化學基團，其可以由諸如酯酶的酶裂解或水解。本領域技術人員將立即理解可加入所述酶可切割接頭中的其它切割位點。

模塊化RNA基序和RNA奈米結構的合理設計

設計自組裝核酸奈米結構的原理是編碼核酸鏈中的序列互補性，以使得所述核酸鏈在適當的物理條件下通過配對互補片段而自組織為預定的奈米結構。根據這一基本原理（參見例如，Seeman NCJ Theor. Biol. 99: 237, 1982，通過引用併入本文），研究人員已經創造了各種各樣的合成核酸奈米結構（參見例如，Seeman NC Nature 421 : 427, 2003; Shih WM et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 20: 276, 2010，其每一篇通過引用併入本文）。根據本公開可使用的核酸（例如，DNA）奈米結構和產生這樣的結構的方法的實例是已知的並且包括，但不限於，網格（參見例如，Winfree E. et al. Nature 394: 539 , 1998; Yan H. et al. Science 301: 1882, 2003; Yan H. et al. Proc. Natl. Acad. ofSci. USA 100; 8103, 2003; Liu D. et al. J. Am. Chem. Soc . 126: 2324, 2004; Rothemund PWK et al. PLoS Biology 2: 2041, 2004，其每一篇通過引用併入本文），帶狀（參見例如，Park SH et al. Nano Lett. 5: 729, 2005 ; Yin P. et al. Science 321: 824, 2008,其每一篇通過引用併入本文）、管狀（參見例如，Yan H. Science, 2003; P. Yin, 2008其每一篇通過引用併入本文）、具有限定形狀的有限二維和三維物體（參見例如，Chen J. et al. Nature 350: 631, 1991; Rothemund PWK, Nature, 2006; He Y. et al. Nature 452: 198, 2008; Ke Y. et al. Nano. Lett. 9: 2445, 2009; Douglas SM et al. Nature 459: 414, 2009; Dietz H. et al. Science 325: 725, 2009; An dersen ES et al. Nature 459: 73, 2009; Liedl T. et al. Nature Nanotech. 5: 520, 2010; Han D. et al. Science 332: 342, 2011，其每一篇通過引用併入本文） ，和宏觀晶體（參見例如，Meng JP et al. Nature 461: 74, 2009，通過引用併入本文）。合成RNA寡核苷酸可以是單鏈核酸、雙鏈核酸或單鍊和雙鏈核酸的組合。

RNA奈米結構組分（合成RNA寡核苷酸和模塊化RNA基序可以使用本文所述的計算機輔助設計方法來設計。儘管使用特定的RNA奈米結構演示了計算機設計，但是應當理解，本領域技術人員能夠將其中教導的原理外推至任何希望的RNA奈米結構。

每個合成RNA寡核苷酸可以被設計成使得當其與2個或更多個額外的合成RNA寡核苷酸組合時，發生鹼基配對以產生具有圍繞核心結構域的3個或更多個DA的高度有序的2-D和3-D結構，所述核心結構域可以包含或不包含鏈之間的鹼基配對，並且可以包括在DA之間形成對稱或不對稱突起的0-4個核苷酸。每個合成RNA寡核苷酸可以被設計成包括16-120個核苷酸。每個合成RNA寡核苷酸可以被設計成包括1個或更多個修飾的核苷酸。核苷酸修飾在本文其他地方描述。設計成包括多於一個修飾的合成RNA寡核苷酸可以被設計成使得修飾的核苷酸被一個或多個未修飾的核苷酸分隔。在有些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30或更多個未修飾的核苷酸可以分隔兩個修飾的核苷酸。

本文所述的合成RNA寡核苷酸和/或RNA奈米結構的合理設計可以在計算環境中進行。所述計算環境可以包括一個或多個計算設備，所述計算設備可以包括至少一個處理器電路，例如，其可以具有處理器和存儲器。根據本公開的各方面，各種應用和/或其他功能可以在所述計算環境中被執行。而且，各種數據可以被存儲在可由計算環境訪問的一個或多個數據存儲中。

在計算環境中被執行的組件例如可以包括合理的RNA設計系統和本文未詳細討論的其他應用、服務、過程、系統、引擎，或功能。所述合理的RNA設計系統可以被執行以促進如本文所述的合成RNA寡核苷酸和/或RNA奈米結構的設計。合理的RNA設計系統也可執行可與RNA寡核苷酸的設計（諸如本文所述的那些合成RNA寡核苷酸和/或RNA奈米結構）相關的各種後端功能。

如圖48中所示，合理的RNA設計系統可以被執行以動態地創造可以被用於產生如本文所述的RNA奈米結構的合成RNA寡核苷酸序列。所述合理的RNA設計系統可產生、鑑定和/或選擇可與一種或多種其它合成RNA寡核苷酸序列（其也可通過合理的RNA設計系統產生）相容並自組裝以形成如本文所述的RNA奈米結構的合成RNA寡核苷酸序列。所述合理的RNA設計系統還能夠鑑定不能與一種或多種其它的合成RNA寡核苷酸序列相容以形成如本文所述的RNA奈米結構的合成RNA寡核苷酸序列。

所述合理的RNA設計系統可以應用一種或多種優化算法以確定可相容並形成如本文所述的RNA奈米結構的合適或最佳的合成RNA寡核苷酸序列，所述算法至少部分基於RNA寡核苷酸和/或RNA奈米結構的GC含量、兩段或更多段RNA寡核苷酸和/或RNA奈米結構的Tm、RNA寡核苷酸自發二聚化的概率和/或能力、合成RNA寡核苷酸的交叉互補性、RNA和包含修飾的核酸的寡核苷酸之間的轉化，和/或合成RNA寡核苷酸的其它數據或屬性。

如圖48中所示，合理的RNA設計系統可產生如本文其它地方所述的各種理論雙鏈臂（DA）（在圖48中產生DA序列）。所述合理的RNA設計系統在被執行時可以接著確定所形成的理論DA的GC含量是否在希望的GC範圍內。可以由用戶設置希望的GC範圍。在有些方面中，所述GC範圍可從約50 %至51、52、53、54、55、56、57、58、59，或約60 % 。在有些方面，所述GC範圍可為約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59，或約60 % 。如果所形成的理論DA不在希望的GC範圍內，希望的Tm範圍內和/或可以自發二聚化，則所述理論DA被捨棄。如果理論DA在期望的GC範圍內，在期望的Tm內，並且不自發二聚化，則理論DA可以被保存 。然後，被接受的DA可以被所述合理的RNA設計系統用於選擇可以形成被接受的DA的一組寡聚物。

如圖48中所示，所述合理的RNA設計系統可以選擇用於一組寡聚物的DA。所述合理的RNA設計系統可以計算被保存的一組（兩個或更多個）DA的交叉互補性。具有最高的交叉互補性的DA可以被丟棄，且具有最低的總體交叉互補性的DA可以被保存。

如圖48中所示，所述合理的RNA設計系統可以使用具有最低的總體交叉互補性的DA來計算寡聚物序列。所述合理的RNA設計系統可計算DA序列的反向補序列，計算延伸RNA寡聚物序列，和可以計算終止寡聚物序列。通過確定所計算的RNA寡聚物序列是否自發二聚化和/或可形成二聚體，所述合理的RNA設計系統可以從各種所計算的RNA寡聚物序列中確定合適的寡聚物序列。所述合理的RNA設計系統可以保存不自發二聚化並且不形成二聚體的那些計算的RNA寡聚物序列，並且可以丟棄確實自發二聚化或形成二聚體的那些計算的RNA寡聚物序列。如果被保存的計算的RNA寡聚物序列是使用DNA序列（例如cDNA）產生的，則所述合理的RNA設計系統可轉換為RNA序列。被轉換的序列可以被保存。

接下來，提供對計算環境的技術設備的討論。存儲在存儲器中的是數據和可由處理器執行的若干組件。存儲在存儲器中的也可以是數據存儲和其他數據。許多軟件組件被存儲在存儲器中並且可由處理器執行。在這方面，術語“可執行的”意指以最終可由處理器運行的形式存在的程序文件。可執行程序的實例可以是，例如，可以被翻譯為機器代碼（其為可以被加載到一個或多個存儲器設備的隨機存取部分並由處理器運行的格式）的編譯程序、可以以諸如目標代碼（其能夠被加載到一個或多個存儲器設備的隨機存取部分並由處理器運行）的格式被表達的代碼，或者可以被另一個可執行程序解讀以在存儲器設備的隨機存取部分產生待由處理器執行的指令的代碼。可執行程序可以被存儲在存儲器設備的任何部分或組件中，所述存儲器設備包括例如隨機存取存儲器（RAM）、只讀存儲器（ROM）、硬盤驅動器、固態驅動器、USB閃存驅動器、存儲卡、諸如高密度光盤（CD）或數字多功能光盤（DVD）的光盤、軟盤、磁帶，或其他存儲器組件。

存儲器可以包括易失性和非易失性存儲器和數據存儲組件兩種。此外，處理器可以表示多個處理器和/或多個處理器核，並且一個或多個存儲器設備可以表示在並行處理電路中分別操作的多個存儲器。存儲器設備也可以表示各種類型存儲設備的組合，諸如RAM、大容量存儲設備、閃存，或硬盤存儲器。在這種情況下，局部接口可以是有助於在多個處理器中的任意兩個之間或者在任何處理器和任何存儲器設備之間進行通信的適當網絡。局部接口可以包括附加系統，其被設計以協調這一通信，包括，例如，執行負載平衡。處理器可以具有電構造或一些其他可用的構造。

雖然本文所述的合理的RNA設計系統和其它各種系統可以體現在由如上文所討論的通用硬件所執行的軟件或代碼中。

流程圖顯示了本文中所描述的組件的部分的實施的功能性和操作的實例。如果被體現在軟件中，則每個框可以表示代碼的模塊、片段或部分，所述代碼可以包括實施規定的邏輯功能的程序指令。所述程序指令可以體現為源代碼的形式，所述源代碼可以包括以編程語言編寫的人可讀語句或者機器代碼，所述機器代碼可以包括諸如計算機系統或其他系統中的處理器的適當執行系統可識別的數字指令。所述機器代碼可以從源代碼轉換。如果被體現在硬件中，則每個框可以代表電路或多個互連電路以實施規定的邏輯功能。

儘管流程圖展示了特定的執行順序，但應理解，執行順序可不同於所描述的順序。例如，兩個或更多個框的執行順序相對於所顯示的順序可以被打亂。此外，連續顯示的兩個或更多個框可以同時執行或者部分同時執行。進一步，在一些實例中，附圖中顯示的一個或多個框可以被跳過或省略。

此外，本文中所描述的包括軟件或代碼的任何邏輯或應用可呈現在任何非暫時性的計算機可讀介質中以供指令執行系統（諸如，例如，計算機統或其他系統中的處理器）使用或與其結合使用。在這個意義上，所述邏輯可以包括，例如，包括可以從計算機可讀介質獲取並由指令執行系統執行的程序代碼、指令和聲明的語句。在本申請的上下文中，“計算機可讀介質”可以是可以包含、存儲或維護本文中所描述的邏輯或應用的任何介質，其由指令執行系統使用或與指令執行系統結合使用。

RNA奈米結構製劑

本文還提供藥物製劑，其可以包括一定量本文所述的RNA奈米結構和適於向需要其的個體施用的藥物載體。所述需要其的個體可以患有或可以被懷疑患有癌症，遺傳疾病或病症，病毒、細菌、真菌和/或寄生蟲感染，或需要治療或預防的其它疾病或病症。在有些方面，需要其的受試者需要診斷程序，例如成像程序。所述藥物配方可以包括一定量本文所述的RNA奈米結構，其可有效治療或預防癌症，遺傳疾病或病症，病毒、細菌、真菌和/或寄生蟲感染，或其它疾病或病症，或對受試者或其部分的成像是有效的。

製劑可以通過任何合適的施用途徑施用。例如，製劑（和/或組合物）可以口服、靜脈內、眼部、眼內、肌內、陰道內、腹膜內、直腸、腸胃外、局部、鼻內或皮下施用至需要其的受試者。本文描述了其他合適的途徑。在有些方面，所述RNA奈米結構包含有效量的貨物分子。

腸胃外製劑

RNA奈米結構可以被配製為用於腸胃外遞送，例如注射或輸注，以溶液或懸浮液形式。所述製劑可通過任何途徑施用，例如血流或直接至待治療的器官或組織。

腸胃外製劑可使用本領域已知的技術被製備為水性組合物。通常，這樣的組合物可以被製備為可注射製劑，例如，溶液或懸浮液；固體形式，適合用於在註射前在添加重構介質時製備溶液或懸浮液；乳劑，諸如油包水（w /o）乳劑、水包油（o/w）乳劑，及其微乳劑、脂質體或乳脂體。

所述載體可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、一種或多種多元醇（例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇）、諸如植物油（例如，花生油、玉米油、芝麻油等）的油，及其組合。可以維持適當的流動性，例如，通過使用包衣（諸如卵磷脂），在分散劑的情況下通過維持所需粒徑和/或通過使用表面活性劑。在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。

如本文所描述的RNA奈米結構的溶液和分散劑可在與一種或多種藥學上可接受的賦形劑適當混合的水或另一種溶劑或分散介質中被製備，所述賦形劑包括，但不限於，表面活性劑、分散劑、乳化劑、pH調節劑及其組合。

合適的表面活性劑可以是陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑或非離子表面活性劑。合適的陰離子表面活性劑包括但不限於含有羧酸根、磺酸根和硫酸根離子的那些。合適的陰離子表面活性劑包括長鏈烷基磺酸鹽和烷基芳基磺酸鹽的鈉、鉀、銨鹽，諸如十二烷基苯磺酸鈉；磺基琥珀酸二烷基鈉，諸如雙-（2-乙基硫氧基）-磺基琥珀酸鈉；和烷基硫酸鹽，諸如月桂基硫酸鈉。合適的陽離子表面活性劑包括但不限於季銨化合物，諸如氯化苯甲烴銨、芐索氯銨、西曲溴銨、硬脂酰二甲基芐基氯化銨，聚氧乙烯和椰油胺。合適的非離子表面活性劑包括單硬脂酸乙二醇酯、肉荳蔻酸丙二醇酯、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、酰化山梨醇酯、酰化蔗糖、PEG-150月桂酸酯，PEG-400單月桂酸酯、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙烯乙二醇丁醚、Poloxamer® 401、硬脂酰單異丙醇胺，和聚氧乙烯氫化牛脂酰胺。兩性表面活性劑的實例包括N-十二烷基-β-丙氨酸鈉、N-月桂基-β-亞氨基二丙酸鈉、肉荳蔻酰兩性乙酸鹽、月桂基甜菜鹼和月桂基磺基甜菜鹼。

所述製劑可含有防腐劑以防止微生物生長。合適的防腐劑包括但不限於對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，和硫柳汞。所述製劑也可以包含抗氧化劑以防止RNA奈米結構的降解。

所述製劑可以被緩衝至pH 3-8，在重構後用於腸胃外施用。合適的緩沖劑包括但不限於磷酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑，和檸檬酸鹽緩沖劑。

水溶性聚合物可用於腸胃外施用的製劑中。合適的水溶性聚合物包括但不限於聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羧甲基纖維素，和聚氧乙烯。無菌可注射溶液可通過根據需要將所需量的RNA奈米結構加入具有一種或多種上文所列的賦形劑的合適的溶劑或分散介質中，接著過濾殺菌來製備。分散液可以通過將各種滅菌的RNA奈米結構加入無菌載體中而製備，所述無菌載體含有基本分散介質和所需的來自上文列出的那些的其他成分。用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末可通過真空乾燥和冷凍乾燥技術製備，其產生RNA奈米結構加上來自先前滅菌過濾的溶液的任何額外的所希望成分的粉末。所述粉末可以這樣的方式製備，以使得顆粒本質上是多孔的，這可以增加顆粒的溶解。製備多孔顆粒的方法是本領域公知的。

用於腸胃外施用的藥物製劑可以是由一種或多種RNA奈米結構形成的無菌水溶液或顆粒懸浮液的形式。可接受的溶劑包括例如水、林格氏溶液、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS），和等滲氯化鈉溶液。所述製劑也可以是無菌溶液、懸浮液或乳液，在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑（例如1,3 -丁二醇）中。

在有些情況下，所述製劑可以以液體形式分散或包裝。在其它方面，用於腸胃外施用的製劑可包裝為固體，例如，通過冷凍乾燥合適的液體製劑而獲得。所述固體可在施用之前用合適的載體或稀釋劑重構。

用於腸胃外施用的溶液、懸浮液或乳液可以用維持適於眼部施用的pH所必需的有效量的緩沖劑緩衝。合適的緩沖劑包括但不限於乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽，和磷酸鹽緩沖劑。

用於腸胃外施用的溶液、懸浮液或乳液也可以含有一種或多種張力劑，以調節所述製劑的等滲範圍。合適的張力劑包括但不限於甘油、甘露醇、山梨醇、氯化鈉，和其它電解質。

用於腸胃外施用的溶液、懸浮液或乳液也可以含有一種或多種防腐劑以防止眼科製品的細菌污染。合適的防腐劑包括，但不限於，聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（PHMB）、氯化苯甲烴銨（BAK）、穩定的氯氧複合物（也被稱為Purite®）、醋酸苯汞，氯丁醇、山梨酸、氯己定、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯、硫柳汞，及其混合物。

用於奈米技術的溶液、懸浮液，或乳液（包括用於腸胃外施用的奈米製劑）也可以含有一種或多種賦形劑，諸如分散劑、潤濕劑，和懸浮劑。

局部製劑

如本文所述的RNA奈米結構可以配製為用於局部施用。用於局部施用的合適劑型包括霜劑、軟膏劑、藥膏、噴霧劑、凝膠、洗劑、乳劑、液體，和透皮貼劑。所述製劑可配製用於透粘膜、經上皮、經內皮，或經皮施用。所述局部製劑可包含一種或多種化學滲透增強劑、膜通透劑、膜輸送劑、潤膚劑、表面活性劑、穩定劑，和其組合。

在有些方面，所述RNA奈米結構可以以液體製劑（諸如溶液或懸浮液）、半固體製劑（諸如洗劑或軟膏劑），或固體製劑施用。在有些方面，所述RNA奈米結構可配製為液體，包括溶液和懸浮液，諸如滴眼劑，或為半固體製劑，諸如用於局部施用至皮膚、至粘膜（諸如眼）、至陰道，或至直腸的軟膏劑或洗劑。

所述製劑可以包含一種或多種賦形劑，例如軟化劑、表面活性劑、乳化劑、滲透增強劑，諸如此類。

合適的軟化劑包括且不限於，杏仁油、蓖麻油、長角豆提取物、鯨蠟硬脂醇、鯨蠟醇、鯨蠟酯蠟、膽固醇、棉籽油、環甲矽油、乙二醇棕櫚硬脂酸酯、甘油、單硬脂酸甘油酯、單油酸甘油酯、肉荳蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、羊毛脂、卵磷脂、輕質礦物油、中鏈甘油三酯，礦物油和羊毛脂醇、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、大豆油、澱粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇及其組合。在有些方面，所述軟化劑可以是乙基己基硬脂酸酯和棕櫚酸乙基己酯。

合適的表面活性劑包括但不限於乳化蠟、甘油基單油酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脫水山梨糖醇酯、苯甲醇，苯甲酸芐酯、環糊精、單硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚維酮及其組合。在有些方面，所述表面活性劑可以是硬脂醇。

合適的乳化劑包括但不限於阿拉伯膠、金屬皂、某些動物和植物油，和各種極性化合物、陰離子乳化蠟、硬脂酸鈣、卡波姆、鯨蠟硬脂醇，鯨蠟醇、膽固醇、二乙醇胺、棕櫚酸硬脂酸乙二醇酯、單硬脂酸甘油酯、甘油基單油酸酯、羥丙基纖維素、羥丙甲纖維素、羊毛脂、水合的，羊毛脂醇、卵磷脂、中鏈甘油三酯、甲基纖維素、礦物油和羊毛脂醇、磷酸二氫鈉，單乙醇胺、非離子乳化蠟、油酸、泊洛沙姆、多種泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、藻酸丙二醇酯、自乳化的單硬脂酸甘油酯、檸檬酸鈉脫水合物、月桂基硫酸鈉、脫水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花油、黃芪膠、三乙醇胺、黃原膠及其組合。在有些方面，所述乳化劑可以是硬脂酸甘油酯。

合適類別的滲透增強劑包括但不限於脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸、脂肪醇醚、氨基酸、磷脂、卵磷脂、膽酸鹽、酶、胺和酰胺、絡合劑（脂質體、環糊精、修飾的纖維素，和二酰亞胺）、大環化合物（諸如大環內酯、酮，和酸酐以及環狀脲）、表面活性劑、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、DMSO和相關化合物、離子化合物、氮酮和相關化合物，以及溶劑（諸如醇、酮、酰胺、多元醇（例如，二醇）。

合適的乳液包括但不限於水包油乳液和油包水乳液。乳液的任一個或兩個相可以包括表面活性劑、乳化劑，和/或液體非揮發性非水性材料。在有些方面，所述表面活性劑可以是非離子表面活性劑。在其它方面，所述乳化劑是乳化蠟。在進一步的方面，所述液體非揮發性非水性材料是二醇。在有些方面，所述二醇是丙二醇。所述油相可以含有其它合適的油性的藥學上可接受的賦形劑。合適的油性的藥學上可接受的賦形劑包括但不限於羥基化蓖麻油或芝麻油，可以作為表面活性劑或乳化劑用於油相中。

也提供了包含如本文所述的RNA奈米結構的洗劑。在有些方面，所述洗劑為具有100厘沲至1000厘沲的粘度的乳液形式。洗劑的流動性可以允許在寬泛的表面積上快速且均勻的應用。洗劑可配製為在皮膚上乾燥，在皮膚表面上留下其藥用組分的薄塗層。

也提供了含有如本文所述的RNA奈米結構的霜劑。所述霜劑可含有乳化劑和/或其它穩定劑。在有些方面，所述霜劑是具有大於1000厘沲的粘度（通常在20,000-50,000厘沲的範圍）的霜的形式。與軟膏劑相比，霜劑更易於鋪展和更易於除去。

霜劑和洗劑之間的一個區別是粘度，其取決於各種油的量/使用和用於製備製劑的水的百分比。霜劑可比洗劑粘稠，可具有各種用途，並且可具有更多不同的油/黃油，這取決於在皮膚上所需的效果。在霜劑製劑的有些方面，水基百分比可以是總量的約60 %至約75 % ，並且油基可以是總量的約20 %至約30 % ，其中其它百分比為乳化劑、防腐劑和添加劑，達到總量為100 %。

也提供了含有如本文所述的RNA奈米結構和合適的軟膏基質的軟膏劑。合適的軟膏基質包括烴基質（例如，凡士林、白凡士林、黃色軟膏劑，和礦物油）；吸收基質（親水性凡士林、無水羊毛脂、羊毛脂，和冷霜）；水可移除性基質（例如，親水性軟膏劑）和水溶性基質（例如，聚乙二醇軟膏劑）。糊劑通常不同於軟膏劑，因為它們含有較大百分比的固體。糊劑通常比用相同組分製備的軟膏劑更具有吸收性且更不油膩。

本文也描述了包含如本文所述的RNA奈米結構的凝膠、膠凝劑和液體載體。合適的膠凝劑包括但不限於修飾的纖維素，諸如羥丙基纖維素和羥乙基纖維素；卡波姆均聚物和共聚物；熱可逆凝膠和其組合。液體載體中合適的溶劑包括但不限於：二甘醇單乙醚；亞烷基二醇，諸如丙二醇；異山梨醇二甲基；醇，諸如異丙醇和乙醇。所述溶劑可以根據它們溶解藥物的能力被選擇。可改善製劑的皮膚觸感和/或軟化作用（emolliency）的其它添加劑也可以被加入。此類添加劑包括但不限於肉荳蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、C12-C15烷基苯甲酸酯、礦物油、角鯊烷、環甲矽油、癸酸/辛酸甘油三酯，及其組合。

本文也描述了可包括如本文所述的RNA奈米結構的泡沫。泡沫可以是與氣體推進劑組合的乳液。所述氣體推進劑可包括氫氟烷烴（HFA）。合適的推進劑包括HFA，諸如1,1,1,2-四氟乙烷（HFA 134a）和1,1,1,2,3,3,3 -七氟丙烷（HFA 227），但是當前被批准或可被批准用於醫療用途的這些和其它HFA的混合物和添加物是合適的。所述推進劑可以缺乏烴推進劑氣體，其在噴霧過程中可以產生易燃或爆炸性蒸氣。此外，所述泡沫可以不包含揮發性醇，其在使用期間可產生易燃或爆炸性蒸氣。

緩沖劑可被用於控制組合物的pH。所述緩沖劑可將組合物如下緩衝：從pH約4至pH約7.5、從pH約4至pH約7、或從pH約5至pH約7。在有些方面，所述緩沖劑可以是三乙醇胺。

可以包括防腐劑以防止真菌和微生物的生長。合適的防腐劑包括但不限於苯甲酸、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉、丙酸鈉、苯扎氯銨、芐索氯銨，苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙基醇，和硫柳汞。

在某些方面，可以通過向有需要的患者連續遞送一種或多種製劑來提供所述製劑。對於局部應用，可以進行重複應用，或者可以使用貼片以在延長的時間段內提供諾司卡品類似物的連續施用。

腸內製劑

本文所述的RNA奈米結構可以被製備於腸內製劑中，諸如用於口服施用。合適的口服劑型包括片劑、膠囊劑、溶液、混懸劑、糖漿劑和錠劑。片劑可以使用本領域公知的壓製或模製技術製備。明膠或非明膠膠囊可以被製備為硬膠囊殼或軟膠囊殼，使用本領域公知的技術，其可以包封液體、固體和半固體填充材料。

含有如本文所述的RNA奈米結構的製劑可以使用藥學上可接受的載體製備。如本文中通常使用的“載體”包括但不限於稀釋劑、防腐劑、粘結劑、潤滑劑、崩解劑、溶脹劑、填料、穩定劑，及其組合。用於劑型中的聚合物包括，但不限於，合適的疏水性或親水性聚合物和合適的pH依賴性或非依賴性聚合物。合適的疏水性和親水性聚合物包括但不限於羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羧基甲基纖維素、聚乙二醇、乙基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯，和離子交換樹脂。 “載體”也包括包衣組合物的所有組分，其可包括增塑劑、顏料、著色劑、穩定劑，和助流劑。

含有如本文所述的RNA奈米結構的製劑可以使用一種或多種藥學上可接受的賦形劑被製備，包括稀釋劑、防腐劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、溶脹劑、填料、穩定劑，及其組合。

含有如本文所述的RNA奈米結構的延遲釋放劑量製劑可如標準參考文獻中所述被製備，諸如“Pharmaceutical dosage form tablets”, eds. Liberman et. al. (New York, Marcel Dekker, Inc., 1989), “Remington – The science and practice of pharmacy”, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, 和“Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems”, 6th Edition, Ansel et al. , (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995).這些參考文獻提供關於用於製備片劑和膠囊以及片劑、膠囊和顆粒的延遲釋放劑型的賦形劑、材料、設備和方法的信息。這些參考文獻提供關於用於製備片劑和膠囊以及片劑、膠囊和顆粒的延遲釋放劑型的載體、材料、設備和方法的信息。

包含如本文所述的RNA奈米結構的製劑可被塗覆合適的包衣材料，例如，以在顆粒一旦穿過胃的酸性環境時延遲釋放。合適的包衣材料包括但不限於纖維素聚合物諸如鄰苯二甲酸乙酸纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和乙酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯；聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及可以商品名EUDRAGIT® (羅斯製藥公司（Roth Pharma）, 魏特爾斯塔特（Westerstadt）, 德國)商購的甲基丙烯酸樹脂、玉米膠蛋白、蟲膠，和多醣。

包衣可以不同比例的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依賴性聚合物形成，可以具有或不具有水不溶性/水溶性非聚合物賦形劑，以產生所希望的釋放曲線。所述包衣可以在（骨架或簡單）劑型上進行，所述劑型包括，但不限於，片劑（用或不用包衣丸被壓制）、膠囊（用或不用包衣丸）、丸，顆粒組合物，“成分原樣”被配製為，但不限於，懸浮液形式或為噴劑劑型。

此外，包衣材料可以包含常規的載體，諸如增塑劑、顏料、著色劑、助流劑、穩定劑、成孔劑和表面活性劑。任選的藥學上可接受的賦形劑包括，但不限於，稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、穩定劑，和表面活性劑。

稀釋劑，也被稱為“填料”，可以用於增加固體劑型的體積，以提供用於壓製片劑或形成丸和顆粒的實用性尺寸。合適的稀釋劑包括，但不限於，二水合磷酸二鈣、硫酸鈣、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、氯化鈉、干淀粉，水解澱粉、預膠化澱粉、二氧化矽膠、氧化鈦、矽酸鎂鋁和糖粉。常見的稀釋劑包括惰性粉狀物質（諸如澱粉）、粉狀纖維素（特別是結晶和微晶纖維素）、糖（諸如果糖、甘露醇和蔗糖）、穀物粉和類似的可食用粉末。典型的稀釋劑包括，例如，各種類型的澱粉、乳糖、甘露醇、高嶺土、磷酸鈣或硫酸鹽、無機鹽諸如氯化鈉和糖粉。粉狀纖維素衍生物也是有用的。

粘合劑可賦予固體劑型以凝聚性質，並因此可以確保片劑或丸或顆粒在形成劑型後保持完整。合適的粘合劑材料包括，但不限於，澱粉、預膠化澱粉、明膠、糖（包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇）、聚乙二醇、蠟、天然和合成樹膠諸如阿拉伯膠、黃芪膠、藻酸鈉、纖維素，包括羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素，和矽酸鎂鋁(veegum)，以及合成聚合物諸如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物，甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共​​聚物、甲基丙烯酸氨烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。典型的片劑粘合劑包括諸如澱粉、明膠和糖（諸如乳糖、果糖和葡萄糖）的物質。天然樹膠和合成樹膠，包括阿拉伯膠、藻酸鹽、甲基纖維素，和聚乙烯吡咯烷酮也可以被使用。聚乙二醇、親水性聚合物、乙基纖維素和蠟也可作為粘合劑。

可以包括潤滑劑以促進片劑製造。合適的潤滑劑包括，但不限於，硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石，和礦物油。在片劑製劑中可以包括潤滑劑以防止片劑和沖頭在沖模中被粘住。所述潤滑劑可以選自例如滑石、硬脂酸鎂和硬脂酸鈣、硬脂酸和氫化植物油的光滑固體。

崩解劑可以被用於促進劑型在施用之後崩解或“解體”，並且通常包括，但不限於，澱粉、羥乙酸澱粉鈉、羧甲基澱粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、預膠化澱粉、粘土、纖維素、藻酸鹽（alginine）、樹膠或交聯聚合物，諸如交聯的PVP（來自GAF化學品公司的Polyplasdone® XL）。

穩定劑可以被用於抑製或延遲藥物分解反應，舉例而言，所述分解反應包括氧化反應。合適的穩定劑包括，但不限於，抗氧化劑、丁羥甲苯（BHT）；抗壞血酸、其鹽和酯；維生素E、生育酚及其鹽；亞硫酸鹽諸如偏亞硫酸鈉；半胱氨酸及其衍生物；檸檬酸；沒食子酸丙酯，和丁羥茴香醚（BHA）。

額外的活性劑

在有些方面，一定量的一種或多種額外的活性劑被包括在含有RNA奈米結構的藥物製劑中。合適的額外的活性劑包括，但不限於，DNA、RNA、修飾的核糖核苷酸、氨基酸、肽、多肽、抗體、適體、核糖酶、抑制必需腫瘤蛋白質和基因的翻譯或轉錄的核糖酶的引導序列、激素、免疫調節劑、退熱劑、鎮靜劑，抗精神病藥、鎮痛劑、解痙劑、抗炎藥、抗組胺劑、抗感染劑和化學治療劑（抗癌藥）。其它合適的額外的活性劑包括，敏化劑（諸如輻射敏化劑）。 RNA奈米結構可以被用作單藥治療或與其它活性劑組合用於治療或預防疾病或病症。

合適的激素包括但不限於氨基酸衍生的激素（例如，褪黑激素和甲狀腺素）、小肽激素和蛋白質激素（例如促甲狀腺素釋放激素、抗利尿激素、胰島素、生長激素、促黃體激素、促卵泡激素，和促甲狀腺激素）、類花生酸（例如花生四烯酸、脂氧素和前列腺素），和類固醇激素（例如雌二醇、睾酮、四氫睾酮皮質醇）。

合適的免疫調節劑包括但不限於強的松、咪唑硫嘌呤、6-MP、環孢黴素、他克莫司、氨甲蝶呤、白介素（例如IL-2、IL-7和IL-12）、細胞因子（例如乾擾素（例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、和IFN-γ）、粒細胞集落刺激因子，和咪喹莫特）、趨化因子（例如，CCL3、CCL26和CXCL7）、胞嘧啶磷酸鳥苷、寡脫氧核苷酸、葡聚醣、抗體，和適體）。

合適的退熱劑包括但不限於非類固醇抗炎藥（例如布洛芬、萘普生、酮洛芬，和尼美舒利）、阿司匹林和相關的的水楊酸鹽（例如水楊酸膽鹼、水楊酸鎂，和水楊酸鈉）、對乙酰氨基酚/醋氨酚、安乃近、納布美通、安替比林，和奎寧。

合適的鎮靜劑包括，但不限於，苯二氮卓類（例如，阿普唑侖、溴西泮、氯氮卓、氯硝西泮、氯拉酸、地西泮、氟西泮、勞拉西泮、奧沙西泮、替馬西泮，三唑侖，和托非索泮）、血清素能的抗抑鬱藥（例如，選擇性血清素再攝取抑製劑，三環抗抑鬱藥和單胺氧化酶抑製劑），mebicar、afobazole、selank、溴曼特（bromantane）、美昔得樂（emoxypine）、阿扎哌隆、巴比妥酸鹽、羥嗪、普瑞巴林、伐力多和β-受體阻滯劑。

合適的抗精神病藥包括，但不限於，苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、氟哌啶醇、莫哌隆、匹泮哌隆(pipaperone)、替米哌隆、氟司必林、五氟利多、匹莫齊特、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美馬嗪、地西拉嗪（dizyrazine）、氟非那嗪、左美丙嗪、美索達嗪、丙拉嗪、哌氰嗪、羥哌氯丙嗪、哌普嗪、普魯氯嗪、普馬嗪、異丙嗪、氮丙嗪、硫丙拉嗪、硫醚嗪、三氟拉嗪、三氟丙嗪、氯普噻噸、氯哌噻噸、氟哌噻噸、替沃噻噸、珠氯噻醇、氯噻平、克噻平、氮丙嗪、卡匹帕明、氯卡帕明、嗎啉吲酮、莫沙帕明、舒必利、維拉必利、氨磺必利、阿莫沙平、阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、布南色林、伊潘立酮、魯拉西酮、美哌隆、奈莫必利、奧氮平，帕潘立酮、哌羅匹隆、喹硫平、瑞莫必利、利培酮、舍吲哚、三甲丙咪嗪、齊拉西酮、佐替平、alstonie、聯苯蘆、生物蝶呤、依匹哌唑、大麻二酚、卡利拉嗪、匹莫範色林、pomaglumetad methionil、戊卡色林、諾美林，和齊洛那平（zicronapine）。

合適的鎮痛劑包括但不限於對乙酰氨基酚/醋氨酚、非類固​​醇抗炎藥（例如，布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利）、COX-2抑製劑（例如，羅非昔布、塞來昔布，和依托昔布）、阿片樣物質（例如，嗎啡、可待因、氧可酮、氫可酮、二氫嗎啡、哌替啶、丁丙諾啡）、曲馬朵、去甲腎上腺素、氟西汀、奈福泮、奧芬那君、普瑞巴林、加巴噴丁、環苯扎林、東莨菪鹼、美沙酮、凱托米酮、哌腈米特，和阿司匹林和相關的水楊酸鹽（例如，水楊酸膽鹼，水楊酸鎂，和水楊酸鈉）。

合適的解痙劑包括，但不限於，美貝維林（mebeverine）、罌粟鹼（paverine）、環苯扎林、卡立普多、奧芬那君、替扎尼定、美他沙酮、美索巴莫、氯唑沙宗、巴氯芬、丹曲林、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林。

合適的抗炎藥包括但不限於強的松、非膽固醇抗炎藥（例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利）、COX-2抑製劑（例如，羅非昔布、塞來昔布和依托昔布），和免疫選擇性抗炎性衍生物（例如，頜下肽- T及其衍生物）。

合適的抗組胺劑包括，但不限於，H1-受體拮抗劑（例如，阿伐斯汀、氮卓斯汀，比拉斯汀、溴苯那敏、布克利嗪、溴馬嗪、卡比沙明、西替利嗪、氯丙嗪、賽克利嗪、氯苯那敏、氯馬斯汀、賽庚啶、地氯雷他定、右旋溴苯那敏、右旋氯苯那敏、茶苯海明（dimenhydrinate）、二甲茚定、苯海拉明、多西拉敏、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羥嗪、左西替利嗪（levocetirzine ）、氯雷他定、美克洛嗪、米氮平、奧洛他定、奧芬那君、苯茚胺、非尼拉敏、苯托沙敏、異丙嗪、嘧啶胺、喹硫平，盧帕他定、曲吡那敏和曲普利啶）、H2-受體拮抗劑（例如，西咪替丁、法莫替丁、拉呋替丁、尼扎替丁、雷尼替丁（ rafitidine）和羅沙替丁）、曲托喹啉、兒茶素、色甘酸鹽（Cromoglicate）、奈多羅米、和β2 -腎上腺素能激動劑。

合適的抗感染劑包括，但不限於，抗阿米巴藥（例如，硝唑尼特、巴龍黴素、甲硝唑、磺甲硝咪唑(tnidazole)、氯喹，和雙碘喹啉）、氨基糖苷類（例如，巴龍黴素，妥布黴素、慶大霉素、阿米卡星、卡那黴素，和新黴素）、驅腸蟲藥（例如，噻嘧啶、甲苯咪唑、伊維菌素、吡喹酮、阿苯達唑、米替福辛、噻苯達唑、奧氨尼喹）、抗真菌劑（例如，氮雜茂抗真菌劑（例如，伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑、酮康唑、克黴唑、咪康唑，和伏立康唑）、棘白菌素（例如，卡泊芬淨、阿尼芬淨，和米卡芬淨），灰黃黴素、特比萘芬、氟胞嘧啶，和多烯類（例如，制黴菌素和兩性黴素b）、抗瘧藥（例如，乙胺嘧啶/磺胺多辛、青蒿素甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍，奎寧、羥基氯喹、甲氟喹、氯喹、強力黴素、乙胺嘧啶，和鹵泛曲林）、抗結核劑（例如，基水楊酸鹽（例如，氨基水楊酸）、異煙肼/利福平、異煙肼/吡嗪酰胺/利福平、貝達喹啉、異煙肼、乙胺丁醇、利福平、利福布汀、利福噴汀、捲曲黴素，和環絲氨酸）、抗病毒劑（例如，金剛烷胺、金剛烷乙胺、阿巴卡韋/拉米夫定、恩曲他濱/替諾福韋、可比司他/elvitegravir/恩曲他濱/替諾福韋、依法韋侖/恩曲他濱/替諾福韋、阿巴卡韋/拉米夫定/齊多夫定、拉米夫定/齊多夫定、恩曲他濱/替諾福韋、恩曲他濱/洛匹那韋/利托那韋/替諾福韋，干擾素α-2v/利巴韋林、PEG干擾素α-2b、馬拉韋羅、雷替格韋、度魯特韋、恩夫韋地、膦甲酸、福米韋生、奧司他韋、扎那米韋、奈韋拉平、依法韋侖、依曲韋林、利匹韋林、地拉夫定、奈韋拉平、恩替卡韋、拉米夫定、阿德福韋、索非布韋、地達諾新、替諾福韋、阿巴卡韋（avacivr）、齊多夫定、司他夫定、恩曲他、扎西他濱（xalcitabin）、替比夫定、西咪匹韋、波普瑞韋、特拉匹韋、洛匹那韋/利托那韋、福沙那韋、地瑞那韋、利托那韋、替拉那韋、阿扎那韋、奈非那韋、安普那韋、茚地那韋、沙奎那韋（sawuinavir）、利巴韋林、伐昔洛韋（valcyclovir）、阿昔洛韋、泛昔洛韋、更昔洛韋，和纈更昔洛韋）、碳青黴烯類（例如，多利培南、美羅培南、厄他培南，和西司他丁/亞胺培南）、頭孢菌素（例如，頭孢羥氨芐、頭孢拉啶、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢吡肟、頭孢洛林（ceflaroline）、氯碳頭孢、頭孢替坦、頭孢呋辛、頭孢羅齊、氯碳頭孢、頭孢西丁，頭孢克洛、頭孢布烯、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢托崙、頭孢去甲噻肟（cefizoxime），和頭孢他啶）、糖肽抗生素（例如，萬古黴素、達巴萬星、奧利萬星，和特拉萬星（telvanci n）），甘氨環素類（例如，替加環素）、抗麻風藥（例如，氯法齊明和沙利度胺）、林可黴素及其衍生物（例如，克林黴素和林可黴素）、大環內酯類及其衍生物（例如，泰利黴素、非達黴素、紅黴素、阿奇黴素、克拉黴素、地紅黴素，和醋竹桃黴素）、利奈唑胺、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、利福昔明、氯黴素、磷黴素，甲硝唑、氨曲南、桿菌肽、β -內酰胺抗生素（芐星青黴素（苯乍生和芐基青黴素）、苯氧甲基青黴素、氯灑西林、氟氯西林（flucoxacillin）、甲氧西林、替莫西林、美西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、阿莫西林、氨芐西林、巴氨西林、羧芐西林、哌拉西林、替卡西林，阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、拉維酸/替卡西林、青黴素、普魯卡因青黴素、苯唑西林、雙氯西林、奈夫西林、頭孢唑啉、頭孢氨芐頭孢菌素C、先鋒黴素、頭孢克洛，頭孢羥唑、頭孢呋辛、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢克肟（cefiximine）、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢洛林、比阿培南、多利培南、厄他培南、法羅培南、亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、沙納黴素、氨曲南（azrewonam）、替吉莫南、諾卡黴素A、taboxinine，和β -內酰胺）、喹諾酮（例如，洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、qatifloxacin、莫西沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、吉米沙星、莫西沙星、西諾沙星、萘啶酸、依諾沙星、格雷沙星、加替沙星、曲伐沙星，和司帕沙星）、磺胺類（例如，磺胺甲噁唑/甲氧芐啶，柳氮磺吡啶，和磺胺異噁唑）、四環素類（例如，強力黴素、地美環素、米諾環素、強力黴素/水楊酸、強力黴素/ω-3多不飽和脂肪酸，和四環素） ，和泌尿系統抗感染劑（例如，呋喃妥因、烏洛托品、磷黴素、西諾沙星、萘啶酸、甲氧芐啶，和亞甲基藍）。

合適的化學治療劑包括，但不限於，紫杉醇、本托昔單抗（brentuximab vedotin）、多柔比星、5-FU（氟尿嘧啶）、依維莫司、培美曲塞、美法崙、帕米膦酸鹽、阿那曲唑、依西美坦、奈拉濱，奧法木單抗、貝伐單抗、貝利司他、托西莫單抗、卡莫司汀、博來黴素、博舒替尼、白消安、阿崙單抗、伊立替康、凡德他尼、比卡魯胺、洛莫司汀、道諾黴素、氯法拉濱、卡博替尼、放線菌素D，雷莫蘆單抗、阿糖胞苷、環磷酰胺、環磷酰氮芥、地西他濱、地塞米松、多西他賽、羥基脲、氮烯咪胺、亮丙瑞林、表柔比星、奧沙利鉑、天冬酰胺酶、雌莫司汀、西妥昔單抗、維莫德吉、菊歐文氏菌天冬酰胺酶、氨磷汀、依托泊苷、氟他米特、托瑞米芬、氟維司群、來曲唑、地加瑞克、普拉曲沙、氨甲蝶呤、氟尿苷、阿托珠單抗、吉西他濱，阿法替尼、甲磺酸伊替尼、卡莫司汀、艾瑞布林、曲妥珠單抗、六甲蜜胺、拓撲替康、帕納替尼、伊達比星、異環磷酰胺、依魯替尼、阿西替尼、干擾素α-2a、吉非替尼、羅米地辛、伊沙匹隆、魯索替尼、卡巴他賽、ado -曲妥珠單抗美坦新偶聯物、卡非佐米、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈濱、米托坦、長春新鹼、丙卡巴肼、甲地孕酮、曲美替尼、美司鈉、氯化鍶- 89、二氯甲基二乙胺、絲裂黴素、白消安、吉妥珠單抗奧佐米星、長春瑞濱、非格司亭、PEG非格司亭、索拉非尼、尼魯米特、噴司他丁、它莫西芬、米托蒽醌、培門冬酶、地尼白介素（deneukin diftitox）、阿利維A酸、卡鉑、帕妥珠單抗、順鉑、泊馬度胺、強的松、阿地白介素、巰嘌呤、唑來膦酸、來那度胺、利妥昔單抗、奧曲肽、達沙替尼、瑞戈非尼、組胺瑞林、舒尼替尼、司妥昔單抗、高三尖杉酯鹼、硫鳥嘌（硫鳥嘌呤（tioguanine））、達拉非尼、厄洛替尼、貝沙羅丁、替莫唑胺、噻替派、沙利度胺、BCG、替西羅莫司、苯達莫司汀鹽酸鹽、曲普瑞林、三氧化二砷（aresnic trioxide）、拉帕替尼、戊柔比星、帕尼單抗、長春花鹼、硼替佐米、維甲酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、亞葉酸、克里唑蒂尼、卡培他濱、恩雜魯胺、易普利姆瑪、戈舍瑞林、伏立諾他、艾代拉里斯、色瑞替尼、阿比特龍、埃博黴素、他氟泊苷(tafluposide)、咪唑硫嘌呤、去氧氟尿苷、長春地辛、全反式維甲酸，和本文其它處列出的其它抗癌劑。

使用RNA奈米結構及其製劑的方法

RNA奈米結構及其製劑可以被用於向需要其的受試者或細胞遞送一種或多種貨物化合物。在有些方面，所述RNA奈米結構可以用於遞送RNA或DNA分子以用於置換基因/轉錄本治療，向受試者遞送RNAi或類似的RNA（例如微RNA）以特異性地抑制RNA轉錄本以減少特定基因或多個基因的基因表達，遞送顯像劑，遞送小分子藥物，和/或遞送可包封在本文提供的RNA奈米結構中的任何其它貨物化合物。因此，所述RNA奈米結構可被用於向需要其的受試者遞送治療、預防和/或診斷化合物。

在有些方面，本文所述的RNA奈米結構可與細胞或其群體接觸。在有些方面，所述細胞或其群體針對由所述RNA奈米結構遞送的治療或預防被敏化。在有些方面，所述RNA奈米結構正在遞送敏化劑。在有些方面，被遞送的貨物化合物不是敏化劑。在一個方面，在施用RNA奈米結構之後，受試者可以針對治療被敏化。在一個方面，可以根據本領域已知的用於特定治療的一種或多種方法來測量針對治療諸如治療劑治療（諸如由被所述RNA奈米結構遞送的貨物化合物所提供）的增加的敏感性或降低的敏感性。在一個方面，測量針對治療的敏感性的方法包括，但不限於，細胞增殖測定和細胞死亡測定。在一個方面，細胞或受試者對治療的敏感性可以通過將施用所公開的治療劑組合物之後的細胞或受試者的敏感性與尚未被施用所公開治療劑組合物的細胞或受試者的敏感性進行比較而被測量或確定。

例如，在一個方面，在施用敏化劑和/或所述RNA奈米結構（諸如攜帶敏化劑的RNA奈米結構）之後，細胞對治療的敏感性比未施用敏化劑的細胞可以更敏感2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍， 14-倍、15-倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍或更多。在一個方面，在施用所公開治療劑組合物之後，細胞對治療的抗性比未施用敏化劑（諸如由本文所述的RNA奈米結構遞送的敏化劑）的細胞可以更低2​​-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、11-倍、12-倍、13-倍，14-倍、15 -倍、16-倍、17-倍、18-倍、19-倍、20-倍或更多。確定細胞或受試者的敏感性或抗性在本領域中可以是常規的並且在普通臨床醫生和/或研究者的技能範圍內。

在一個方面中，確定細胞或受試者對治療的敏感性或抗性可以被監測。例如，在一個方面，關於敏感性和抗性的數據可以周期性地被獲取，諸如針對受試者（例如，人類受試者或患有癌症和/或異常細胞生長的患者）的壽命每週、每隔一周、每月、每隔一個月、每3個月、6個月、9個月，或每年、每隔一年，每5年，每10年。在一個方面，關於敏感性和抗性的數據可以在不同時間而不是在周期性的時間被獲取。在一個方面，可以基於關於細胞或受試者對治療的敏感性或抗性的數據來改變受試者的治療。例如，在一方面中，可通過改變所公開組合物的劑量、所公開組合物的施用途徑、所公開組合物的施用頻率等來改變治療。

在有些方面，在所述RNA奈米結構包括連接靶向部分和/或貨物化合物的可光解接頭的情況下，所述RNA奈米結構可以被施用於受試者或細胞群體。在施用後，可將光應用至需要其的受試者中需要治療或預防的細胞區域和/或群體，以引起所述RNA奈米結構和/或貨物分子的釋放。

如本文提供的RNA奈米結構可以被施用至需要其的受試者、細胞或其群體。所述需要其的受試者可以患有癌症、遺傳疾病或病症、病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌感染，或將受益於被遞送的有效試劑（諸如本文所述的貨物化合物）的任何其它疾病或病症。所遞送的量可以是本文提供的RNA奈米結構的有效量。需要其的受試者可以是有症狀的或無症狀的。在有些方面，本文提供的RNA奈米結構可以與另一種活性劑共同施用。將理解，共同施用可以指包含在製劑中或提供在與RNA奈米結構或其製劑分開的劑型中的額外的化合物。 RNA奈米結構或其製劑（諸如本文所公開的那些）的有效量可以在約0.1 mg/kg至約500 mg/kg範圍。在有些方面，所述有效量在約0.1 mg/kg至10 mg/kg範圍。在另外的方面，所述有效量在約0.1 mg/kg至100 mg/kg範圍。如果進一步的方面，所述有效量在約0.1 mg至約1000 mg範圍。在有些方面，所述有效量可以是約500 mg至約1000 mg。

所述RNA奈米結構和其製劑的施用可以是全身的或局部的。本文所述的化合物和製劑可以每日一次或多次向需要其的受試者施用。在一個方面，所述化合物和/或其製劑可以每天施用一次。在有些方面，所述化合物和/或其製劑可以每天施用給定的一次。在另一個方面，所述化合物和/或其製劑可以每天施用兩次。在有些方面，當施用時，有效量的所述化合物和/或製劑被施用給需要其的受試者。所述化合物和/或其製劑可以每週施用一次或多次。在有些方面，所述化合物和/或其製劑可以每週施用1天。在其它方面，所述化合物和/或其製劑可以每週施用2至7天。

在有些方面，所述RNA奈米結構和/或其製劑可以以劑型施用。所述化合物和/或其製劑的量或有效量可劃分為多種劑型。例如，有效量可以被分為兩種劑型，並且第一劑型可，例如，在早晨被施用，並且第二劑型可以在晚上被施用。雖然有效量在一天中是通過兩份劑量給予，但是受試者接受了有效量。在有些方面，所述有效量為約0.1至約1000 mg每天。劑型中的有效量可以在約0.1 mg/kg至約1000 mg/kg的範圍。所述劑型可被配製成用於口服、陰道、靜脈內、經皮、皮下、腹膜內，或肌肉內施用。用於各種施用途徑的劑型的製備描述於本文其它地方。

本文所述的模塊化RNA基序和本文所述的RNA奈米結構可用於製備治療疾病或癌症的藥物。

已經描述了本申請的許多方面。然而，將理解的是，在不脫離本申請的精神和範圍的情況下，可以進行各種修改。因此，其它方面在所附申請專利範圍的範圍內。

實施例

實施例1：基於RNA的微團：用於化療藥物負載和遞送的平台。

RNA可以用作用於自下而上製造用於生物技術和生物醫學應用的奈米結構的強大建築模塊。除了當前利用鹼基配對、基序堆積和三級相互作用的自組裝策略之外，我們首次報導構建基於RNA的微團奈米結構，其具有綴合至分支的pRNA 3-向接合（3WJ）基序的一個螺旋末端上的膽固醇分子。所獲得的兩親性RNA微團由親水性RNA頭部和共價連接的疏水性脂質尾部組成，所述尾部可通過疏水相互作用在水溶液中自發地組裝。利用pRNA 3WJ分支結構的特徵，組裝的RNA微團能夠護送多種功能性模塊。作為治療劑遞送的概念證明，紫杉醇被負載到具有顯著提高的水溶性的所述RNA微團上。負載藥物的RNA微團的成功構建通過瓊脂糖凝膠電泳、原子力顯微鏡（AFM）、動態光散射（DLS）和尼羅紅熒光包封測定來確認和表徵。臨界微團形成濃度低至約100 nM。加載紫杉醇的RNA微團可以內化至癌細胞中並抑制它們的增殖。進一步的研究顯示，負載紫杉醇的RNA微團以Caspase-3依賴性的方式誘導癌細胞凋亡，但單獨的RNA微團表現出低細胞毒性。最後，負載紫杉醇的RNA微團在體內靶向腫瘤，而不在健康組織和器官中積聚。也沒有或有非常低的促炎性反應誘導。因此，多價、癌細胞滲透性，結合可控的組裝、低毒性或無毒性，以及腫瘤靶向，全部是使得我們的pRNA微團成為用於潛在藥物遞送的合適平台的有前景的特徵。

簡介

通過分子自組裝製備的功能性奈米顆粒在生物技術和生物醫學方面的具有重大應用前景[1-4]。在這些當中，RNA已被用作獨特的生物材料以通過自組裝構建多種多樣的奈米顆粒[Li, H. et al. Adv.Mater. 28 (2016) 7501-7507; Guo, P. Nature Nanotechnology 5 (2010) 833-842; Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667; Shu, Y. et al. Methods 54 (2011) 204-214; Haque, F. et al. Nano Today 7 (2012) 245-257; Afonin, KA et al. Nano.Lett. 12 (2012) 5192-5195; Shu, Y. et al. Nat.Protoc. 8 (2013) 1635-1659; Khisamutdinov, E. et al. Nucleic Acids Res. 42 (2014) 9996-10004; Jasinski, D. et al. ACS Nano 8 (2014) 7620-7629; Khisamutdinov, EF et al. Advanced Materials 28 (2016) 100079-100087; Afonin, KA et al. Nano Lett. 14 (2014) 5662-5671; Dibrov, SM et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108 (2011) 6405-6408; Afonin, KA et al. Nat.Nanotechnol. 5 (2010 ) 676-682]。已證明這些RNA奈米顆粒進一步功能化用於生物醫學應用[Lee, JB et al. Nat.Mater. 11 (2012) 316-322; Lee, TJ et al. Oncotarget 6 (2015) 14766-14776; Cui, D. et al. Scientific reports 5 (2015) 10726; Shu, D. et al. ACS Nano 9 (2015) 9731-9740; Rychahou, P. et al. ACS Nano 9 (2015) 1108-1116; Binzel, D . et al. Molecular Therapy 24 (2016) 1267-1277; Afonin, KA et al. Nat.Protoc. 6 (2011) 2022-2034]。先前報導了RNA奈米顆粒自組裝的策略。利用RNA鹼基配對和三級相互作用，為多功能的RNA組裝體在奈米級上提供了針對他們的組成、結構和功能的精確控制[Shu, Y. et al. Nat.Protoc. 8 (2013 ) 1635-1659; Khisamutdinov, EF et al. Methods Mol Biol 1316 (2015) 181-193]。在本研究中，檢查了通過分子間疏水性相互作用製造具有微團性質的RNA自組裝體的策略。

本文描述的是穩定的phi29 pRNA 3-向接合（3WJ）基序的設計和製造，所述3-向接合基序可被用作用以構建具有高化學和熱力學穩定性的多價RNA奈米顆粒的骨架[Guo, P. Nature Nanotechnology 5 (2010) 833-842; Haque, F. et al. Nano Today 7 (2012) 245-257]。所獲得的分支的的RNA奈米顆粒的尺寸和形狀是均勻的。它們可以發揮不同的功能，同時在體外和體內都保持它們的三級折疊和獨立的功能[Haque, F. et al. Nano Today 7 (2012) 245-257; Jasinski, D. et al. ACS Nano 8 (2014) 7620-7629; Shu, D. et al. ACS Nano 9 (2015) 9731-9740; Binzel, D. et al. Molecular Therapy 24 (2016) 1267-1277; Shu, Y. et al. RNA 19 (2013) 766-777; Khisamutdinov, EF et al. ACS Nano. 8 (2014) 4771-4781; Li, H. et al. Nucleic Acid Ther. (2015) 25(4):188-97; Lee, TJ et al. Mol Ther. (2017) 25(7):1544-1555; Shu, D. et al. Nucleic Acids Res. (2014) 42(2):e10]。也顯示了熒光染料分子[Shu, D. et al. EMBO J. 26 (2007) 527-537]和具體的細胞靶向配體[Shu, D. et al. ACS Nano 9 (2015) 9731-9740 ; Rychahou, P. et al. ACS Nano 9 (2015) 1108-1116; Binzel, D. et al. Molecular Therapy 24 (2016) 1267-1277; Lee, TJ et al. Mol Ther. (2017) 25(7 ):1544-1555; Pi, F. et al. Nat Nanotechnol. (2018) 13(1):82-89]可以通過RNA固相合成或通過轉錄後化學綴合而共價連接到RNA鏈上[ Shu, Y. et al. Methods 54 (2011) 204-214; Shu, Y. et al. Nat.Protoc. 8 (2013) 1635-1659; Raouane, M. et al. Bioconjug.Chem 23 (2012) 1091 -1104]。由不同的化學和功能部分修飾的RNA分子的可行性證明RNA奈米顆粒作為多功能藥物遞送平台的潛力。

已經描述了DNA微團構建體[Gosse, C. et al. J Phys Chem B 108 (2004) 6485-6497; Wu, Y. et al. Proc Natl Acad Sci US A 107 (2010) 5- 10; Liu, H. et al. Chemistry 16 (2010) 3791-3797; Chen, T. et al. Angew.Chem Int.Ed Engl. 52 (2013) 2012-2016; Jeong, JH et al. Bioconjug.Chem 12 (2001) 917-923; Dentinger, PM et al. Langmuir 22 (2006) 2935-2937; Alemdaroglu, FE et al. Angew.Chem Int.Ed Engl. 45 (2006) 4206-4210; Trinh, T. et al. Chem Commun.(Camb.) 52 (2016) 10914-10917; Li, Z. et al. Nano Letters 4 (2004) 1055-1058; Alemdaroglu, FE et al. Adv.Mater. 20 (2008) 899- 902]。通過將親脂性部分熔合到pRNA-3WJ分支的螺旋末端之一上，可以將親水性RNA分子轉化為兩親性構建體。這一兩親性構建體表現類似於磷脂，同時其自發地自組裝成單分散的三維微團奈米結構，所述三維的微團奈米結構具有脂質內核和分支的RNA外冠，作為水溶液中分子間疏水相互作用的結果。與當前的DNA微團系統（其應用受限於它們單一的功能性）[Wu, Y. et al. Proc Natl Acad Sci US A 107 (2010) 5-10; Jeong, JH et al. Bioconjug.Chem 12 (2001) 917-923]不同，pRNA微團能夠將不同類型的功能部分共價連接至單個顆粒，包括用於癌症治療的化學藥物、用於奈米顆粒跟踪的成像部分和用於組合治療的共同遞送的RNAi組分。

分離自短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮的紫杉醇（PTX）[Wani, MC et al. J Am.Chem Soc 93 (1971) 2325-2327]是用於多種癌症類型的最有效的化療藥物之一[Spencer, CM et al. Drugs 48 (1994) 794-847; Rowinsky, EK et al. N.Engl.J Med. 332 (1995) 1004-1014; Jordan, MA et al. Nat Rev.Cancer 4 (2004) 253-265]。紫杉醇用於癌症治療的機制是促進和穩定微管並且進一步抑制細胞週期的G2或M期，然後細胞死亡[Horwitz, S.B. et al. Trends Pharmacol.Sci 13 (1992) 134-136]。然而，根據生物製藥分類系統（BCS），紫杉醇已經被分類為IV型化學藥物，因為它具有低水溶性（~ 0.4 μg/mL）和低滲透性。被使用的第一個紫杉醇的配方在Cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)和脫水乙醇的1∶1（v: v）混合物中，由0.9 %氯化鈉或5 %右旋糖溶液稀釋5 ~ 20倍用於靜脈注射施用[Singla, AK et al. Int.J Pharm 235 (2002) 179-192]。然而，已經觀察到含有Cremophor油的配方導致嚴重的副作用[Gelderblom, H. et al. Eur.J Cancer 37 (2001) 1590-1598]以及不可預期的非線性血漿藥動學[Sparreboom, A.. et al. Cancer Res 56 (1996) 2112-2115]。因此，已經廣泛地探究了替代的紫杉醇配方，特別是用基於奈米顆粒的遞送系統[Kim, S.C. et al. J Control Release 72 (2001) 191-202]。利用奈米級的尺寸、腫瘤靶向遞送和生物相容性，在奈米遞送系統中包封紫杉醇可增加藥物循環半衰期、降低其全身毒性、減少副作用、改善藥代動力學和藥效學特性，並展示更好的患者配合度。紫杉醇白蛋白結合的奈米顆粒（Abraxane®）在2005年已由FDA批准。紫杉醇脂質體（Lipusu®）、聚合物微團（Genexol PM®）和具有多聚谷氨酸鹽的聚合綴合物（Xyotax®）是目前可商購的紫杉醇配方。此外，還有各種類型的紫杉醇奈米顆粒配方或者正在開發或者正在臨床試驗，諸如基於聚合物的奈米顆粒[Hamaguchi, T. et al. Br.J Cancer 97 (2007) 170-176; Dong, Y . et al. Biomaterials 25 (2004) 2843-2849; Kim, K. et al. J Control Release 146 (2010) 219-227]、基於脂質的奈米顆粒[Yoshizawa, Y. et al. Int.J Pharm 412 (2011) 132-141; Yuan, H. et al. Int.J Pharm 348 (2008) 137-145]、聚合物-藥物綴合物[Khandare, JJ et al. Bioconjug.Chem 17 (2006) 1464 -1472; Bedikian, AY et al. Melanoma Res 14 (2004) 63-66]、無機奈米顆粒[Hwu, JR et al. J Am.Chem Soc 131 (2009) 66-68]、碳奈米管[Lay, CL et al. nanotechnology 21 (2010) 065101]、奈米晶體[Deng, J. et al. Int.J Pharm 390 (2010) 242-249]等。然而，還從未報導過將紫杉醇配製到基於RNA的奈米遞送平台。

這一實施例尤其描述了用以通過與pRNA-3WJ-脂質綴合來包封紫杉醇的定義明確的RNA -微團體系的設計和構造。這也是首次報導具有顯著增強的紫杉醇水溶性和腫瘤滲透性的RNA -紫杉醇微團。所獲得的RNA微團顯示低臨界微團形成濃度（CMC）、優異的細胞結合和滲透性，以及通過體外誘導Caspase-3依賴性細胞凋亡而對癌細胞增殖的有效抑制。最後，證明了這些負載藥物的RNA微團可以以有利的腫瘤靶向全身遞送至腫瘤，從而使藥物在健康組織和關鍵器官中的滯留最小化。也沒有或有非常低的促炎性反應的誘導。所有這些發現表明RNA-微團體係作為用於癌症治療的合適的藥物遞送平台的強大潛力。這些RNA微團可以被用於腫瘤特異性靶向，降低藥物有效劑量和進一步減少化療的副作用。本文所述的RNA微團可以是堅固和安全的奈米遞送系統，以攜帶用於特異性腫瘤靶向和治療、具有最小的副作用的抗癌藥物，以對抗癌症並改善患者的生活質量。

材料和方法

通過“點擊化學”合成綴合紫杉醇的RNA鏈

為了合成PTX-疊氮化物，將1∶2∶2∶1當量的紫杉醇（阿法埃莎(Alfa Aesar)）、6-疊氮基己酸（疊氮基-HA）（Chem- IMPEX國際公司）、N,N '-二環己基碳二亞胺（DCC）（Acros Organics）和4 -（二甲基氨基）吡啶（DMAP）（西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)）稱重至雙頸圓底燒瓶中。反應混合物被溶解在約20mL乾燥的二氯甲烷（DCM）中並在室溫下反應，同時在氮氣氣氛下攪拌24小時。在旋轉式氣化器上將反應溶液過濾並濃縮。通過二氧化矽凝膠色譜法在用n-己烷：乙酸乙酯的 系列溶劑清洗下進一步純化濃縮的反應液。合併並乾燥含有純化產物的級份。純化的終產物PTX-疊氮化物由核磁共振（NMR）光譜表徵。

通過標準RNA固相化學合成法使用5’-己炔基亞磷酰胺（Glen Research公司）合成5’-炔-RNA。被標記的RNA鏈的理論產率為約68%（0.9819 = 0.68），具有98 %的平均偶聯效率。

向5 μL的2 mM RNA-炔水溶液添加2 μL的PTX-疊氮化物（50 mM，5當量，於3∶1（v/v）的DMSO（二甲基亞砜，極乾燥， Acros Organics）/tBuOH（叔丁醇，無水，西格瑪奧德里奇））、3 μL新鮮製備的“點擊溶液”，所述“點擊溶液”其在3∶1的DMSO/tBuOH中含有1：2摩爾比的0.1 M CuBr（溴化銅（I），西格瑪奧德里奇）和0.1 M TBTA（三[(1-芐基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺，西格瑪奧德里奇）。將反應混合物充分混合併在室溫下反應3小時。反應的成功通過20 % 的8 M尿素PAGE在TBE（89 mM Tris鹼-硼酸鹽，2mM EDTA）緩衝液中確定。隨後用100 μL 0.3 M NaOAc（乙酸鈉）和1 mL 100 %乙醇稀釋反應液，用於RNA沉澱。將沉澱物溶於水中，用於在Agilent PLRP-S 4.6x 250 mm 300 Å柱上使用離子對反相HPLC純化。在乙腈梯度（ramp）中使PTX標記的RNA與未反應的RNA -炔分離。 1.5 mL/min的流速在95 %溶劑A（0.1 M TEAA，HPLC級H2O）和5 %溶劑B（0.1 M TEAA，75 %乙腈，25 % HPLC級H2O）中平衡柱。將樣品通過0.2 μm的旋轉過濾器過濾，加載到柱上，然後在30分鐘的過程中由從5 %至100 %B的梯度洗脫。收集餾分，合併並交換緩衝液。最終的RNA-PTX綴合物通過質譜分析法表徵。

2’-F修飾的pRNA-3WJ-PTX微團的設計和構建

使用自下而向上的方法構建RNA微團[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667]。由三個片段，a3WJ、b3WJ和c3WJ組成的pRNA-3WJ-PTX微團被以下功能化：在a3WJ的5'-端上的紫杉醇（阿法埃莎）（a3WJ-5'PTX），作為治療模塊；在b3WJ的3'-端（b3WJ-3'chol）的膽固醇，作為親脂性模塊；和在c3WJ的3'-端的Alexa 647（Alexa Fluor® 647，英傑（Invitrogen））（c3WJ-3' Alexa647），作為近紅外（NIR）成像模塊。對照RNA奈米顆粒是沒有被稱為pRNA-3WJ微團的治療模塊、沒有被稱為pRNA-3WJ-PTX的親脂性模塊、並且沒有被稱為pRNA-3WJ的親脂性模塊和治療模塊二者的顆粒。

使用以下的pRNA-3WJ支架[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667]序列：a3WJ 5'-UUgCCaUgUgUaUgUggg-3' (SEQ ID NO:16); b3WJ 5'- CCCaCaUaCUUUgUUgaUCC-3' (SEQ ID NO:17); c3WJ 5'-ggaUCaaUCaUggCaa-3' (SEQ ID NO:18) (大寫字母指示2'氟代(2'-F) 修飾的核苷酸)。使用可商購的2'-TBDMS腺苷（n-bz）CED、2'-TBDMS鳥苷（n-ibu）CED、2'-氟胞苷（n-ac）CED和2'-氟尿苷CED的磷酰胺單體，通過標準的固相化學合成法[Lay, CL et al. nanotechnology 21 (2010) 065101]合成RNA片段，隨後根據製造商（Azco Biotech）提供的實驗方案脫保護。通過化學選擇性Cu（I）-催化的Huisgen 1,3-偶極環加成反應（“點擊化學”）將紫杉醇（PTX）綴合至a3WJ 5'-末端，並通過如上所述的反相HPLC純化。遵循製造商的說明，通過使用3’-膽甾醇基-TEG CPG載體（Glen Research公司）將膽固醇連接至b3WJ鏈的3’-末端。 b3WJ-3’chol的理論產率為~ 68 %（0.9819 = 0.68），具有98 %的平均偶聯效率。使用離子對反向相柱從終止的鏈中純化合成的RNA，這通常在固相合成期間產生膽固醇的完全標記。 Alexa647標記的RNA鏈購自Trilink生物技術有限公司（Trilink Bio Technologies，LLC）。

通過在TMS緩衝液（50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）或PBS緩衝液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4和2 mM KH2PO4, pH 7.4）中以等摩爾濃度混合3WJ鏈（a3WJ、b3WJ和c3WJ）來組裝pRNA-3WJ-PTX微團，隨後加熱至80℃持續5分鐘，並在40分鐘的過程中緩慢冷卻至37 ℃，隨後在37 ℃溫育1小時。

被組裝的pRNA-3WJ微團的表徵

官能化的3WJ奈米顆粒的組裝通過在TAE（40 mM Tris-乙酸鹽，1mM EDTA）緩衝液中進行1 %（w/v）瓊脂糖凝膠遷移測定來表徵。電泳之後，將凝膠用溴化乙錠染色，並由Typhoon FLA 7000（GE healthcare）可視化。

由Zetasizer nano-ZS（馬爾文儀器有限公司（Malvern Instrument，Ltd））在25 ℃下分別測量預組裝的pRNA-3WJ-PTX（20 μ M於PBS緩衝液中）和pRNA-3WJ- PTX微團（10 μ M於PBS緩衝液）的表觀流體動力學直徑。數據來自於三次獨立的測量值。還由Zetasizer nano-ZS（馬爾文儀器有限公司）在25 ℃下測量pRNA-3WJ-PTX微團（1 μM於PBS緩衝液中）的ζ電位。

RNA微團的大小和形狀也通過原子力顯微鏡（AFM）測定。對於AFM，將10 μM溶於TMS緩衝液中的pRNA-3WJ-PTX微團溶液沉積到新鮮切割的雲母上並過夜乾燥。在用HPLC級的水進行兩次連續沖洗步驟之後，將雲母安裝到布魯克（Bruker）Multimode IV AFM上並以輕敲模式成像。

RNA微團的成功形成也通過如先前報導的尼羅紅包封測定來確定[Edwardson, TGW et al. Nature Chemistry 5 (2013) 868-875; Zhang, A. et al. Soft Matter 9 (2013) 2224-2233]。丙酮中的5 mM尼羅紅儲液用於所有實驗。簡言之，將0 µM、1 µM、5 µM和10 µM被組裝的pRNA-3WJ微團分別與TMS緩衝液中的100 μM尼羅紅溫育。將混合物加熱至80 ℃，持續5分鐘，並在40分鐘內緩慢冷卻至37 ℃，隨後在37 ℃溫育1小時。在Fluorolog分光熒光計（Horiba Jobin Yvon）上以535 nm的激發波長和560 nm至760 nm的發射光譜測量與RNA微團濃度相對的尼羅紅熒光強度。 pRNA-3WJ被用作對照。

確定臨界微團形成濃度（CMC）

pRNA-3WJ微團的CMC通過如先前報導的熒光尼羅紅紅色包封測定[Zhang, A. et al. Soft Matter 9 (2013) 2224-2233]和瓊脂糖凝膠電泳來確定。簡言之，2倍系列稀釋的RNA微團樣品（在5 μM至0.005 μM的範圍內）與100 μM尼羅紅在50 μL終體積中一起溫育。將樣品加熱至80 ℃，持續5分鐘，並在40分鐘內緩慢冷卻至37 ℃，隨後在37 ℃溫育1小時。使用Fluorolog分光熒光計（Horiba Jobin Yvon）以535 nm的激發波長和560 nm至760 nm的發射光譜測量與RNA微團濃度相對的尼羅紅熒光強度。將2倍系列稀釋的RNA微團樣品（在2.5 nM至0.0390625 μM範圍內）直接加載到1% （w/v）瓊脂糖凝膠上以在120V下在TAE緩衝液中電泳。凝膠用溴化乙錠染色，並由Typhoon FLA 7000可視化。

配方穩定性測定

將pRNA-3WJ微團的2 μM溶液在酸性（pH=4）、中性（pH=7.4）和鹼性（pH=12）緩衝液中於37 ℃溫育1小時。最後的2 μM pRNA-3WJ微團也在不同溫度（4 ℃、37 ℃和65 ℃）下溫育1小時。將溫育後的所有樣品都加載到1%（w/v）瓊脂糖凝膠上以在120V下在TAE緩衝液中電泳。凝膠用溴化乙錠染色並由Typhoon FLA 7000可視化。

細胞培養

使人KB細胞（美國典型培養物保藏中心，ATCC）在含有10% FBS的RPMI-1640（賽默飛科技（Thermo Scientific））中在37 ℃培養箱中5% CO2和濕潤氣氛下生長和培養。小鼠巨噬細胞樣RAW 264.7細胞在補充10 %胎牛血清、100單位/mL青黴素和100 mg/mL鏈黴素的杜氏改良Eagle培養基（DMEM）中在37 ℃下在含有5% CO2的濕潤空氣中培養。

使用流式細胞術的體外結合測定

250 nM、500 nM和1μM Alexa647標記的pRNA-3WJ-PTX微團和不含有親脂性模塊的對照pRNA-3WJ-PTX奈米顆粒各自與2×105 KB細胞在37 ℃溫育1小時。用PBS洗滌兩次後，將細胞重懸於PBS中。流式細胞術由UK流式細胞術&細胞分選核心設備進行，以觀察Alexa647標記的pRNA-3WJ-PTX微團的細胞結合效力。數據通過FlowJo 7.6.1軟件進行分析。

使用共聚焦顯微鏡的體外結合和內化測定

使KB細胞在載玻片上生長過夜。 1μM Alexa647標記的pRNA-3WJ-PTX微團和不含有親脂性模塊的對照pRNA-3WJ-PTX奈米顆粒各自與細胞在37 ℃溫育1小時。用PBS洗滌後，用4%多聚甲醛（PFA）固定細胞並用PBS洗滌3次。用PBS中的0.1% Triton-X100處理被固定的細胞的細胞骨架5分鐘以提高細胞膜的滲透性，然後在室溫下用Alexa Fluor 488鬼筆環肽（Life Technologies）染色30分鐘，然後用PBS沖洗3×10分鐘。用含有DAPI（Life Technologies）的Prolong® Gold防淬滅試劑封裝細胞，且DAPI被用於細胞核染色。然後通過FluoView FV1000 濾波器共焦顯微鏡系統（奧林巴斯公司（Olympus Corp.））測定細胞的結合和細胞內化。

pRNA-3WJ-PTX的體外藥物釋放測定

將10 μM的pRNA-3WJ-PTX綴合物與50 % FBS在37 ℃溫育並在不同的時間點（1小時、4小時、8小時、12小時、15小時、22小時、28小時，和36小時）收集樣品並立即冷凍於-80 ℃。在通過整個時間過程完成樣品收集之後，所有樣品在15%非變性PAGE上在TBM緩衝液（89 mM Tris鹼-硼酸鹽，5 mM MgCl2）中電泳。由ImageJ量化凝膠條帶，並且以完整顆粒% = [（上部條帶的強度）/（上部條帶的強度+下部條帶的強度）] × 100 %計算完整顆粒的百分比。上部條帶錶示完整的RNA-藥物綴合物，而較低的條帶錶示藥物釋放後的RNA寡聚核苷酸。

MTT測定

為了測定來自pRNA-3WJ-PTX微團治療的細胞毒性作用，遵循製造商的說明，使用CellTiter 96非放射性細胞增殖測定（普洛麥格（Promega））來測定細胞活力變化。簡言之，在測定之前一天將1×104 KB細胞接種到96孔板中。在第二天，將1 μM、800 nM、600 nM、400 nM和200 nM的pRNA-3WJ-PTX微團添加到孔中，重複三次。單獨的紫杉醇、pRNA-3WJ微團、pRNA-3WJ-PTX和pRNA-3WJ以相同的測試濃度作為對照。將平板在37 ℃下在濕潤的5% CO2氣氛中溫育48小時。溫育之後，向每個孔中加入15 μl染液並將平板在濕潤的5% CO2氣氛中在37 ℃下溫育高達4小時。接著，向每個孔中加入100 μL增溶溶液/終止混合物並溫育1小時。最後，將孔中的內容物混合以得到均勻著色的溶液並在Synergy 4微孔板檢測儀（Bio - Tek）上記錄它們在570 nm的吸光度。

體外細胞模型中的細胞凋亡研究

如先前報導使用FITC膜聯蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒（BD Pharmingen）和Caspase-3測定試劑盒（BD Pharmingen）以研究由pRNA-3WJ-PTX微團治療誘導的細胞凋亡。對於FITC膜聯蛋白V染色測定，將KB細胞接種在12孔板中過夜。然後，用1 μM pRNA-3WJ-PTX微團處理細胞（~ 30 %融合）。對照包括紫杉醇、pRNA-3WJ微團和pRNA-3WJ。根據製造商的說明書，在與RNA微團溫育48小時之後，將KB細胞用胰蛋白酶消化為單細胞懸液。在兩次PBS洗滌後，將細胞重懸於100 μL 1×膜聯蛋白V-FITC結合緩衝液中。然後在每個樣品中加入5 μL膜聯蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI）並在室溫下溫育25分鐘。最後將樣品加入包含200 μ L 1×結合緩衝液的流管中，在1小時內用於FACS分析。

對於Caspase-3測定，將KB細胞接種在24孔板上過夜。然後用1 μM pRNA-3WJ-PTX微團處理細胞（約30 %融合）。對照包括紫杉醇、pRNA-3WJ微團和pRNA-3WJ。遵循製造商的說明，通過Caspase-3測定試劑盒（BD Pharmingen）測量並比較細胞的Caspase-3活性。簡言之，在誘導凋亡後的不同時間點（4小時、8小時、12小時和24小時）使用由試劑盒提供的冷的細胞裂解緩衝液製備細胞裂解液（1-10×106細胞/ mL），並在冰上溫育30分鐘。對於每個樣品，25 μL細胞裂解液中添加2 μL於80 μL 1×HEPES緩衝液中的重構的Ac-DEVD-AMC，並在37 ℃溫育1小時。在Fluorolog熒光光譜儀（Horiba Jobin Yvon）上以380 nm的激發波長在400-500 nm發射波長的範圍內測量從Ac-DEVD-AMC釋放的AMC的量。

動物模型

涉及動物的所有實驗方案都在肯塔基大學動物保護和利用委員會（IACUC）的監管下實施。為了產生異種移植模型，從Taconic購買4-8週齡的雌性無胸腺nu/nu小鼠。通過將重懸於無菌PBS中的KB細胞以2×106細胞/位點注射到裸鼠的左肩中以建立皮下腫瘤異種移植物。當注射後大約5天腫瘤結節達到50 mm3的體積時，將小鼠用於腫瘤靶向研究。

NIR熒光成像以檢測RNA微團在體內靶向癌症異種移植物

為了研究pRNA-3WJ-PTX微團在體內的遞送，在向負荷KB腫瘤的小鼠中分別尾靜脈注射100 μL 20 μM的Alexa 647標記的pRNA-3WJ-PTX微團和pRNA-3WJ -PTX（估計的血液中終濃度為約1μM）之後進行熒光成像研究。注射PBS的小鼠被用作陰性熒光對照。在30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時拍攝全身圖像。在註射後24小時通過吸入CO2及隨後的斷頸法處死小鼠，並將來自被處死小鼠的包括心臟、肺、肝、脾、腎的主要內臟器官與腫瘤一起收集起來，並使用IVIS光譜工作站（Caliper Life Science）以640 nm激發和680 nm發射進行熒光成像以評估生物分佈圖譜。

評估pRNA-3WJ微團的促炎症誘導

對於促炎性細胞因子誘導的體外評價，在24孔板中每孔接種2.5 ×105 RAW 264.7細胞並培養過夜。將pRNA-3WJ微團（1 μM或200 nM）以及脂多醣（LPS，3.6 μg/mL，與200 nM pRNA-3WJ微團等量）在DMEM（生命技術（Life Technologies））中稀釋並添加到細胞中溫育，重複三次。在溫育16小時之後，收集細胞培養上清液並立即儲存在-80℃用於進一步分析。遵循製造商的說明，分別使用小鼠ELISA MAX Deluxe套組（BioLegend，聖地亞哥，加利福尼亞州，USA）檢測所收集的上清液中的TNF-α和IL6，同時使用小鼠IFN α ELISA試劑盒（ PBL Assay Science，皮斯卡塔韋，新澤西州，USA）檢測IFN-α。

為了體內評估促炎性細胞因子和趨化因子誘導，將pRNA-3WJ微團（1 μM）、LPS（每隻小鼠10 μg）和DPBS對照經由尾靜脈注射到4至6週齡的雄性C57BL/6小鼠中。注射後3小時，通過心臟穿刺從小鼠中收集血液樣品，並以12,800×g離心10分鐘以​​收集血清。遵循製造商的說明，如上所述，通過ELISA檢測血清中TNF-α、IL6和IFN-α的濃度。遵循製造商的說明，使用小鼠趨化因子芯片試劑盒（R & D Systems，明尼阿波里斯市，明尼蘇達州，USA）測定趨化因子誘導。 LiCor用於定量印記點。

統計分析

對於所測試的每個樣本，

每個實驗重複3次。除非另有說明，否則結果以平均值± SD呈現。使用學生T-檢驗評估統計學差異，並且認為p > 0.05是差異顯著的。

結果和討論

pRNA-3WJ微團的構建和表徵

pRNA-3WJ-PTX微團利用由來自pRNA 3WJ基序的三段短RNA片段組成的模塊化設計[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667]（圖1A） 。通過考慮所述pRNA 3WJ基序的全局折疊結構，將親脂性模塊膽固醇與b3WJ的3’-末端綴合。 pRNA 3WJ基序的晶體結構顯示，跨越pRNA 3WJ的三個螺旋（H1、H2和H3）的角度為約60°（H1-H2）、約120°（H2-H3）和約180°（H1-H3 ）[Zhang, H. et al. RNA 19 (2013) 1226-1237]（圖1B）。為了避免由於分支的3WJ結構而由空間位阻干擾微團形成，膽固醇分子被放到距離其他兩個螺旋H1和H2最遠的H3上。我們目前的設計涉及使用治療模塊（紫杉醇）和成像模塊（Alexa 647染料）功能化H1，而不干擾微團形成（圖1C，圖1D）。如以下研究中所示，被綴合的化療藥物和檢測染料的功能也被充分保留。未被佔用的螺旋H2可以用RNAi模塊（諸如siRNA或微RNA）進一步活化，用於聯合治療以產生增強的或協同的治療效果。

在PBS或TMS緩衝液中將各鏈以等摩爾比混合後，所述複合物以高效率裝配，如在1 %瓊脂糖凝膠遷移測定中所示（圖1E）。 Alexa 647標記的RNA微團也顯示熒光條帶，其對應於指示微團形成成功的條帶（圖1E）。通過AFM進一步展示RNA微團的組裝，AFM顯示均勻的球形結構（圖2A）。 DLS測定顯示，與pRNA-3WJ核心骨架的7.466±1.215 nm相比，pRNA-3WJ-PTX微團的平均流體動力學直徑為118.7±14.50 nm（圖2B）。所構建的pRNA-3WJ-PTX微團還帶負電荷。如圖2C所示，ζ電位為-26.1 ± 10.4 mV。最後，通過尼羅紅包封測定分析RNA微團形成。尼羅紅是疏水性染料且在大量水溶液中幾乎不發光，但其包含在非極性微環境（諸如微團結構的脂質核心）中導致強烈的熒光增強[Greenspan, P. et al. J Cell Biol 100 (1985) 965-973]。因此，相關於不同濃度的RNA微團與固定量的尼羅紅染料的溫育的熒光強度的增加表明在緩衝溶液中形成RNA微團（圖2D）。與此相比，在沒有脂質核心的對照pRNA-3WJ中未觀察到熒光強度的顯著增加（圖2D）。

為了使pRNA-3WJ微團在體內化學穩定，在RNA鏈合成期間使用2'-F修飾的U和C核苷酸[Behlke, MA Oligonucleotides. 18 (2008) 305-319; Vestweber, H . et al. Synthetic Metals 68 (1995) 263-268]。所述2'-F修飾的RNA奈米顆粒被證明是化學穩定的並且與其未修飾的RNA對應物相比顯示更長的循環半衰期[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667 ; Behlke, MA Oligonucleotides. 18 (2008) 305-319]。 2'-F核苷酸的存在不僅使RNA奈米顆粒耐受RNA酶降解，而且還增強了pRNA-3WJ的解鏈溫度[Binzel, DW et al. Biochemistry 53 (2014) 2221-2231]，而不損害所述核心和併入的模塊的真實折疊和功能性[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667; Liu, J. et al. ACS Nano 5 (2011) 237-246] 。

進一步測定pRNA-3WJ配方相對於pH（酸性pH 4、中性pH 7.4，和鹼性pH 12）和溫度（4 ℃、37 ℃，和65 ℃）的穩定性。結果表明，pRNA -3WJ微團在寬範圍的溫度和酸性及中性條件下是穩定的。儘管如圖8所報告，pRNA-微團在鹼性條件下顯示解離，但pRNA-3WJ微團配方在生理條件下（pH 7.4，37 ℃）是明顯化學和熱力學穩定的。

通過“點擊化學”合成綴合紫杉醇的RNA鏈

為了給pRNA微團負載治療模塊，首先用-疊氮（-N3）官能化PTX，以便進一步與炔修飾的RNA反應。在N，N' -二環己基碳二亞胺（DCC）和4-（二甲基氨基）吡啶（DMAP）存在下，在無水二氯甲烷中，使用6 -疊氮基己酸接頭通過酯化作用將2 '-OH上的疊氮基引入PTX，以提供疊氮官能化的PTX（PTX-N3）作為主要產物（圖9A）。儘管在PTX的7'和2'位置上的兩個羥基都是化學反應性的，但是2'-OH通常顯示比7'- OH更高的反應性，因為7'- OH乙酰化在水性介質中非常不穩定，快速丟失C -7取代基[Skwarczynski, M. et al. J Med.Chem 49 (2006) 7253-7269]。純化後以73%的產率獲得在2’位置具有功能性的PTX-N3 。採用1H NMR質譜以確認CDCl3中的PTX-N3的化學結構。在PTX-N3的1H NMR質譜中，7'-CH在4.40 ppm處共振，並且在酯化作用之前和之後都沒有觀察到7-CH-OH信號（在4.4 ppm處）發生顯著的化學位移變化（圖9B），而2'-CH質子的共振從4.78 ppm（在酯化作用之前）位移至5.46 ppm（在酯化作用之後）（圖9C）。

如圖3A所示，通過銅I介導的點擊反應，PTX-N3以高於90 %的效率與-炔修飾的RNA（a3WJ）反應。通過20 %的8 M尿素PAGE（圖3B）和質譜法確認成功的綴合。通過質譜法測定的a3WJ-PTX的實驗質量為6939.2（m/z），其與基於化學結構（圖3C）計算的理論質量（6936.82（m/z））接近。紫杉醇和RNA之間形成的酯鍵可以在酯酶存在下或在水溶液中水解，這允許如通過體外藥物釋放測定所指示的那樣以可控方式緩慢釋放所負載的藥物（圖3A，3D）。這是用化療藥物紫杉醇“點擊”RNA分子的第一次報導。 PTX綴合不干擾pRNA-3WJ的逐步組裝（圖10A）。這也是第一次證明通過融合至RNA寡核苷酸而提高紫杉醇的水不溶性。與在DEPC H2O中使用等濃度的紫杉醇製備的混濁溶液相比，溶解在DEPC H2O中的1 mM RNA-紫杉醇綴合物顯示澄清的溶液（圖10B）。在綴合至RNA並組裝成微團奈米結構之後紫杉醇顯著改善的水溶性允許使用生理鹽水溶液用於體內施用而不是用Cremophor EL配方。除了點擊化學之外，使用其它化學偶聯反應性基團，諸如-NH2/-NHS -NH2/-COOH, 或者-SH/-馬來酰亞胺對RNA寡聚核苷酸和候選藥物進行官能化也是可行的RNA -藥物綴合方法，其能夠被應用於不適合點擊化學的藥物候選物。

臨界微團形成濃度的確定

為了確定pRNA-3WJ-PTX微團的臨界微團形成濃度（CMC），使用如先前所報導的尼羅紅測定[Zhang, A. et al. Soft Matter 9 (2013) 2224-2233] 。尼羅紅是疏水性染料，其在水和其它極性溶劑中具有低熒光，但在非極性環境（例如微團的脂質核心）中發射強熒光。因此，尼羅紅熒光發射強度被用作微團形成的指標。為了測定CMC，尼羅紅的熒光強度被繪製成樣品濃度的函數。如圖11A所示，尼羅紅在低於0.078 μM的濃度下呈現低熒光強度，表明尼羅紅在水中並且存在很少的微團。隨著濃度的增加，熒光強度顯著增加，表明尼羅紅被包封在RNA微團的脂質核心中。 CMC可被估算為具有相對恆定值的強度比例的水平線的切線與具有快速增加的強度比例的對角線的交點（圖11B）。 CMC為約100 nM並且1 % TAE瓊脂糖凝膠由於靈敏度限制進一步確認CMC為約150 nM（圖11C）。在體外和體內實驗中使用的所有pRNA微團濃度均高於CMC以確保微團形成。

pRNA-3WJ-PTX微團結合併內化到KB細胞中

為了體外測定腫瘤細胞靶向，將pRNA-3WJ-PTX微團和不含有親脂性模塊的對照pRNA-3WJ-PTX與KB細胞溫育，胰蛋白酶化，洗滌，然後通過熒光激活的細胞分選（FACS）測定進行分析。與pRNA-3WJ-PTX骨架對照（0 %結合）相比，觀察到pRNA-3WJ-PTX微團具有強結合（幾乎100 %）（圖4A）。共聚焦顯微鏡成像進一步確認pRNA-3WJ-PTX微團有效結合併和內化至癌細胞中，如熒光RNA奈米顆粒（圖4B）和細胞質（圖4B）的極好重疊所證明。對於不含有親脂性模塊的對照pRNA-3WJ-PTX，觀察到非常低的信號。這些結果表明RNA微團對癌細胞結合具有高親和力。儘管目前的RNA微團設計不包括腫瘤特異性靶向模塊，但是高度帶電的RNA微團（因為RNA帶負電荷，在ζ電位研究中也顯示）能夠類似於如先前報導的DNA微團，在與細胞相互作用時自身崩解並插入細胞膜中[Liu, H. et al. Chemistry 16 (2010) 3791-3797]。不受理論的束縛，相信RNA微團的內化可能是通過插入細胞膜之後隨後的胞吞作用介導。

pRNA-3WJ-PTX微團在對癌細胞生長和凋亡的體外影響

為了測定RNA微團處理的細胞效應，實施MTT測定以分析處理後的細胞活力。與單獨RNA微團和不含有紫杉醇綴合物的3WJ對照相比，含有PTX的RNA微團可以在250 nM或以上成功地抑制腫瘤細胞生長（圖5A）。未評估低於125 nM的濃度以保持在CMC以上。由pRNA-3WJ-PTX微團引起的細胞生長抑製表明紫杉醇由於接頭酯在水溶液中水解而從RNA鏈釋放。由於所有的RNA-PTX綴合物都經歷HPLC純化，因此游離紫杉醇污染測試構建體的可能性非常小。此外，不含有紫杉醇負載的pRNA-3WJ微團對細胞活力和增殖沒有影響，這表明RNA微團骨架的低細胞毒性及其作為安全的藥物遞送平台的潛力。

如圖5B所示，FITC標記的膜聯蛋白V染色確認大部分癌細胞死亡是由於細胞凋亡。損失細胞質膜是凋亡細胞中最早的特徵之一。膜磷脂磷脂酰絲氨酸（PS）從質膜的內層外化至外層使得FITC標記的膜聯蛋白V結合PS以檢測正在經歷凋亡的細胞。 FITC膜聯蛋白V染色與PI配合使用以鑑定早期凋亡的細胞（Q3：PI陰性，FITC膜聯蛋白V陽性）和處於晚期凋亡或已經死亡的細胞（Q2 ：FITC膜聯蛋白V和PI陽性）。在我們的研究中，與不含有PTX的對照微團（4.52%）或不含有PTX的pRNA-3WJ（3.7%）相比，超過30%的細胞在用pRNA-3WJ-PTX微團處理48小時之後經歷凋亡，這表明癌症活力變化是由於細胞凋亡的誘導。

Caspase-3是早期細胞凋亡標記。 Caspase-3活性的增加與細胞凋亡密切相關。如通過增加的熒光強度所反映的Caspase-3活性的升高，在用pRNA-3WJ-PTX微團處理之後12小時出現（圖12A-12F）。發現，與對照奈米顆粒（pRNA-3WJ微團和pRNA-3WJ）相比，pRNA-3WJ-PTX微團處理的細胞裂解物顯示出與單獨的紫杉醇類似的最高熒光發射，其表明細胞凋亡的誘導是以Caspase -3依賴性方式進行（圖5C）。

通過使用NIR熒光pRNA-3WJ-PTX微團成像以特異性靶向異種移植動物模型中的腫瘤

通過在註射後的不同時間點收集裸鼠中的腫瘤異種移植物的原位熒光圖像來研究pRNA-3WJ-PTX微團的腫瘤靶向效率。腫瘤區域的圖像在註射後4小時變得容易確定（圖6A-6D和圖13）。從注射RNA微團的小鼠獲得的正常組織、器官和腫瘤的離體圖像顯示注射後24小時拍攝的腫瘤顯示最強的信號（圖6E-6G）。圖6H-6I顯示RNA微團在體外結合併內化至癌細胞。流式細胞術比較處理1小時後對KB細胞的結合親和力。共聚焦顯微鏡顯示內化分佈。藍色：細胞核；綠色：細胞骨架；紅色：RNA奈米顆粒。圖6J-6L顯示攜帶抗-miR21的RNA微團的體外研究。雙-螢光素酶測定證明抗miR21遞送到KB細胞。 qRT-PCR顯示miR21敲低對靶基因PTEN表達的影響。 Caspase-3測定顯示處理後誘導細胞凋亡。圖6M-6N顯示在具有異種移植物的小鼠中的體內生物分佈研究。全身成像。注射後8小時的離體器官成像。圖6O-6R顯示RNA微團在具有異種移植物的小鼠中的體內治療效果。 5次注射過程中的腫瘤消退曲線（紅色箭頭顯示注射日）。治療期間小鼠體重曲線。 qRT-PCR和Western印跡顯示在體內遞送抗miR21之後PTEN上調。在腫瘤積累動力學方面，RNA奈米顆粒在註射後4小時達到其最高積累，並且相比在健康的器官和組織在腫瘤中中保持更長，這表明構建的RNA微團的高的腫瘤靶向效率和腫瘤滯留能力。 RNA微團的這種獨特的腫瘤滯留行為表明該遞送系統鑑於其奈米級的大小和顆粒形狀而利用了EPR（增強的滲透性和滯留性）效應的優勢。此外，RNA微團構建體顯示可能由於其較大粒徑的延長的腫瘤滯留。通過在所述RNA微團的空螺旋分支上包括諸如葉酸[Shu, D. et al. Nature Nanotechnology 6 (2011) 658-667; Lee, TJ et al. Mol Ther. (2017) 25(7): 1544-1555; Zhang, H. et al. RNA 19 (2013) 1226-1237; Rychahou, P. et al. Methods Mol Biol 1297 (2015) 121-135; Guo, S. et al. Gene Ther 13 (2006 ) 814-820]和RNA適體[Shu, D. et al. ACS Nano 9 (2015) 9731-9740; Binzel, D. et al. Molecular Therapy 24 (2016) 1267-1277; Pi, F. et al . Nanomedicine 13 (2016) 1183-1193]的腫瘤靶向模塊，可以進一步保證RNA微團奈米顆粒的體內腫瘤靶向的特異性。

pRNA-3WJ微團未誘導或低誘導促炎性反應

促炎性反應可能潛在地由pRNA-3WJ微團配方中的RNA組分[Guo, S. et al. Mol Ther Nucleic Acids. 2017 9:399-408]和膽固醇組分[Tall, AR et al. Nat Rev.Immunol. 15 (2015) 104-116]二者誘導。為了解決這個顧慮，在體外和體內二者中評價pRNA-3WJ微團處理後促炎性細胞因子和趨化因子的產生。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是全身性炎症中涉及的細胞因子並且是造成急性期反應的細胞因子之一[Jaffer, U. et al. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc.Anesth. 2 (2010) 161-175]。白介素6（IL6）是作為促炎性細胞因子和抗炎性肌細胞因子（myokine）二者的白介素。 IL6在感染期間被分泌以刺激免疫應答[Scheller, J. et al. Biochim.Biophys Acta 1813 (2011) 878-888]。 IFN-α干擾素（其屬於I型乾擾素）也是參與響應病毒病原體的存在而釋放的促炎性反應的細胞因子。圖7A中的結果顯示，當與小鼠巨噬細胞樣細胞體外溫育時，與LPS陽性對照相比，高劑量（1 μM）和低劑量（200 nM）的pRNA-3WJ微團既不誘導IL6產生也不誘導IFN-α產生。 TNF-α的誘導在低劑量的pRNA-3WJ-微團處理下檢測不到，但在高劑量的RNA微團處理時略微增加。如圖7B所示，與LPS對照相比，將pRNA-3WJ-微團體內註射到免疫活性的C57BL/6小鼠中後，所有三種細胞因子都不被誘導。

趨化因子是主要的促炎性介質[Wang, Z.M. et al. J Biol Chem 275 (2000) 20260-20267; Turner, M.D. et al. Biochim.Biophys Acta 1843 (2014) 2563-2582]。在pRNA-微團體內處理後，檢測到25個趨化因子產量提高。如圖7C所示的可以證明，與PBS組相比，pRNA-3WJ微團並未誘導新的趨化因子。如圖14中通過紅色框突出顯示的，與PBS對照相比存在三種趨化因子（巨噬細胞炎性蛋白-1 γ（MIP-1γ）、趨化因子10（C10）和單核細胞趨化蛋白2（MCP2））顯示升高的誘導。總之，pRNA-3WJ微團配方未誘導或僅誘導非常低的促炎性應答。

總之，在這一實施例中尤其描述了基於良好定義的pRNA的微團的設計和構建，所述微團由疏水性脂質核心和親水性pRNA-3WJ外冠（corona）組成。化療藥物紫杉醇已被加載到RNA微團中，具有顯著提高的水溶性。也證明，加載紫杉醇的pRNA微團表現優異的腫瘤細胞結合和內化，以及在體外有效誘導對腫瘤的細胞毒性效果。在註射pRNA-微團後，也沒有或有非常低的促炎性響應誘導。通過將pRNA微團全身注射到異種移植小鼠模型中實現了腫瘤靶向而不累積到正常的器官和組織中。圖13顯示pRNA-3WJ-PTX微團體內腫瘤靶向的時間過程。 P：PBS；M-PTX：pRNA-3WJ-PTX微團。

分支的pRNA-3WJ外冠賦予無與倫比的多功能性，其可以以任何期望的組合被設計和構建。例如，可以通過在一個奈米顆粒中組合靶向、成像和治療模塊而構建多功能pRNA-3WJ微團。 pRNA-3WJ微團還可以針對多個基因或一個基因的不同位置同時遞送siRNA或微RNA以產生協同效應。此外，可以將不同類型的抗癌藥物加載到一個pRNA-3WJ微團上，以通過組合療法增強治療效果或克服抗藥性。因此，這一創新的基於RNA的微團奈米遞送平台對臨床應用具有巨大潛力。

實施例2：RNA奈米顆粒、三向接合、多分支或多臂RNA奈米結構攜帶多拷貝紫杉醇及其衍生物用於治療癌症和其它疾病。

圖15A至圖19顯示RNA奈米顆粒、三向接合、多分支或多臂RNA奈米結構以攜帶多拷貝紫杉醇及其衍生物用於治療癌症和其它疾病。

實施例3：RNA -藥物綴合

圖20A至圖24B顯示RNA-泰素序列設計和藥物綴合（圖20A至圖20C）、體外表徵（圖21A至21C）、熱穩定性（TGGE & qPCR，圖22A和22B）、體外毒性（圖23）和動物試驗中的治療研究的結果（圖24A和24B）。

【圖25A至圖28顯示RNA -CPT設計和藥物綴合（圖25A至圖25C）、體外表徵（組裝凝膠和TGGE，圖26A至圖26C），體外毒性（圖27），以及動物試驗中的治療研究的結果（圖28）。

實施例4：熱力學穩定的多層的分支的RNA奈米結構的計算機設計。

圖29A至圖31B顯示具有不同的核心和螺旋的分支3WJ的設計（圖29A和29B）、熱穩定性（qPCR&TGGE，圖30A至圖30C）和酶穩定性（血清穩定性測定，圖31A和31B）。

圖32A至36B顯示分支的3WJ的設計（圖32A至圖32C）、體外表徵（凝膠電泳和DLS，圖33A至圖33C）、熱穩定性（qPCR和TGGE，圖34A和圖34B ）、酶穩定性（血清穩定性測定，圖35A至35C），以及屏蔽性質（細胞結合測定，圖36A和圖36B）。

設計

天然RNA結構元件（諸如phi29 3WJ基序）已進化幾個世紀以服務於特定目的，其可以是用於生物功能的結構骨架或結構動態的元件。為了藥物遞送，期望這樣的奈米級顆粒，其具有可調節尺寸和形狀，具有高度的結構/熱力學穩定性，以及在機體中攜帶高密度貨物至特定靶標的能力，而不誘導免疫應答或毒性。

為了實現這一目的，設計了允許形成高度穩定的三維RNA奈米結構的平台，所述RNA奈米結構組裝自3-9段單獨的長度為16-120 nt的合成寡核苷酸。可以使用固相合成來合成所述寡聚物，其允許位點特異性修飾並且因此摻入被修飾的核苷酸以1）增加酶穩定性，2）提高熱力學穩定性，或者3）增加用於高密度貨物連接的位點。每個寡聚物根據其特定的功能要求合成，並使用自組裝以等摩爾濃度的所有組分鏈組裝到所希望的奈米結構中。

為了實現從大量單獨的鏈（3-9）高效自組裝，寡聚物序列設計需要考慮一些概念：i）互鎖域需要具有高度熱力學穩定性，ii）序列需要是特異的，iii ）寡聚物不應當具有強內部結構，和iv）貨物分子與核心且彼此之間應具有足夠的間隔。

互鎖域的穩定性決定了最終3D結構的穩定性。由於每條鏈可以包含顆粒的不同模塊（治療、靶向、成像），所以奈米結構有必要保持完整以遞送所有模塊。雖然這可以在線性雙鏈寡聚物上實現，但使用更有序的結構提供了益處，諸如控製粒度和形狀，其影響生物分佈和EPR效應；保護貨物在遞送期間不被暴露，其允許遞送疏水性分子；以及由於空間位阻而降低酶活性。為了實現更有序的結構，將寡聚物分成可以由或不由結構連接間隔開的至少兩個互鎖域。在我們的分支奈米結構中，通過實施例，每個寡聚物被分成三個結構域：5’DA、核心突起，和3’DA（圖47C）。構成奈米結構的鏈的數量等於結構中DA結構域的數量。此外，DA結構域的數目等於奈米結構中的獨立序列的數目。因此，任何3’DA的序列是一個特定的5’DA的反向互補序列，反之亦然。那麼，8分支的奈米結構由8個獨立的DA結構域限定，所述DA結構域通過合成的寡聚物的特定設計與它們的反向互補物互鎖。那麼寡聚物被設計為兩種類型：延伸寡聚物和終止寡聚物。通過定義DA編號（1、2、…、9）以及序列是正常的還是其反向互補物（rev），可以充分鑑定寡聚物。延伸寡聚物通常連接連續的DA域，例如12rev、23rev、34rev，而終止寡聚物通過用第一DA的反向互補物（如41rev）連接最後的DA而關閉循環，在這種情況下形成四面體排列的4-DA奈米結構（圖47A-B）。類似地，12rev、23rev、34rev、45rev、56rev加上61rev可以形成6-DA奈米結構，與具有相等間距的DA域可圍繞奈米顆粒核心組裝成八面體排列（圖47A）。

球形序列的計算導向的設計：

根據以上實施例，6-DA結構將使用與4-DA結構相同的某些序列（12rev、23rev、34rev）。因此，為了製造一系列3–9 DA的奈米結構，需要8段延伸鍊和7段終止鏈。在計算方面上，這需要鑑定對於預定義長度（核苷酸數目）的9 DA結構域的熱力學穩定序列，確定希望的核心突起連接核苷酸，以及優化序列以實現最小的自互補性和交叉互補性，以實現熱力學穩定的奈米結構的有效自組裝。

在圖48中概述了算法的流程。在第一步驟中，用戶定義以下輸入參數：1）DA域的數目，2）DA域的長度，3）連接域中核苷酸的同一性，4）DA域的解鏈溫度（Tm）的範圍，5）允許的GC含量的範圍，6）允許的自互補性的百分比，7）允許的交叉互補性的百分比。

然後，該算法使用隨機數生成來生成DA序列，並測試該序列是否落入期望的GC含量和TM範圍內。如果序列落入範圍內，則其被保存，並且重複該過程，直到已經確定25× #的DA序列。一旦已經鑑定了足夠#的序列，就測試它們的自互補性。然後基於它們與其它所保存的DA序列的交叉互補性程度，對顯示低自互補性的序列進行分類。然後用具有最低總體互補性的序列針對延伸寡核苷酸根據(seq1+UG連接+seq2反向互補)和針對終止寡核苷酸根據(seq2+UG連接+seq1反向互補)來計算奈米結構鏈的序列。重新測試全長寡聚物鏈的自互補性和交叉互補性，以確保反向互補不會不利地影響序列的整體特異性。如果奈米結構序列通過QC測試，則它們被轉化為RNA字母代碼並保存到文件中，否則重複程序直到找到合適的寡聚物組。

圖37A-​​37C顯示基於分支3WJ的模塊化RNA基序和具有不同臂數量的變體的設計和構建。圖37A 不同的高度有序接合（核心）被用作模塊化RNA基序的構建塊。圖37B 用於合成的模塊化RNA基序的核苷酸序列。圖37C 使用6WJ作為核心和4WJ作為臂（或分支）的模塊化RNA基序之一的3D結構。

圖38A至圖38G顯示3WJ（圖38A）、4WJ（圖38B）、5WJ（圖38C）、6WJ（圖38D）、7WJ（圖38E）、8WJ（圖38F）和9WJ（圖38G）模塊化RNA基序的2D結構，顯示了合成的RNA寡核苷酸序列的實例。

圖39A至圖39C顯示各種模塊化RNA基序的熱穩定性。圖39A qPCR顯示退火曲線。圖39B TGGE顯示解鏈曲線。圖39C 模塊化RNA基序退火和解鏈的Tm比較。

圖40A和圖40B顯示基於分支3WJ的模塊化RNA基序的體外表徵。圖40A. 大小比較凝膠：2 %瓊脂糖凝膠，顯示4-6WJ（從左到右：分子量標準、phi29-3WJ、單體、二聚體、三聚體、4WJ、5WJ、6WJ）的組裝。圖40B 通過動態光散射（DLS）測量的4-6WJ的大小分佈。

使用本實施例中描述的方法產生的示例性序列。

12REV

GACUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG (SEQ ID NO:1).

23REV

CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC (SEQ ID NO: 2).

31REV

GGGAACAGUACCACAACUAGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 3).

34REV

GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA (SEQ ID NO:4).

41REV

UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 5).

45REV

UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCUCCGCAUGAUGAAUACAGC (SEQ ID NO: 6).

51REV

GCUGUAUUCAUCAUGCGGAGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 7).

56REV

GCUGUAUUCAUCAUGCGGAGUGGGCAUUGGGAUCGUAUGAGC (SEQ ID NO: 8).

61REV

GCUCAUACGAUCCCAAUGCCUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 9).

67REV

GCUCAUACGAUCCCAAUGCCUGAACAAACAGAGCAAGCCUCC (SEQ ID NO: 10).

71REV

GGAGGCUUGCUCUGUUUGUUUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 11).

78REV

GGAGGCUUGCUCUGUUUGUUUGCGCGAUUUCCGCGUUACACA (SEQ ID NO:12).

81REV

UGUGUAACGCGGAAAUCGCGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 13).

89REV

UGUGUAACGCGGAAAUCGCGUGCCUGCUCGCGUACGUCUUAC (SEQ ID NO: 14).

91REV

GUAAGACGUACGCGACGAGGUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC (SEQ ID NO: 15).

a3WJ

UUGCCAUGUGUAUGUGGG (SEQ ID NO: 16).

b3WJ

CCCACAUACUUUGUUGAUCC (SEQ ID NO: 17).

c3WJ

GGAUCAAUCAUGGCAA (SEQ ID NO: 18).

aPhi29-Mod

AUUCGCUGUGUGGUAGUG (SEQ ID NO:19)

bPhi29-Mod

CACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 20).

cPhi29-Mod

CGUAGGACCAGCGAAU (SEQ ID NO: 21).

aPhi29-30

GCGUGCUGUGUGCUACCG (SEQ ID NO: 22).

bPhi29-30

CGGUAGCACUUUGCUGUGCG (SEQ ID NO: 23).

cPhi29-30

CGCACAGCCAGCACGC (SEQ ID NO: 24).

aSF5-30

GCGUGCUGGUGCUACCG (SEQ ID NO: 25).

bSF5-30

CGGUAGCACGGGCUGUGCG (SEQ ID NO: 26).

cSF5-30

CGCACAGCCAGCACGC (SEQ ID NO: 27)

aM2-30

GCGUGCUGGUGCUACCG (SEQ ID NO: 28).

bM2-30

CGGUAGCACCGCUGUGCG (SEQ ID NO: 29).

cM2-30

CGCACAGCCUCAGCACGC (SEQ ID NO: 30).

aPhi29-32

ACGCGACGUGUGCAUGCC (SEQ ID NO: 31).

bPhi29-32

GGCAUGCACUUUGCGUUGCG (SEQ ID NO: 32).

cPhi29-32

CGCAACGCCGUCGCGU (SEQ ID NO: 33).

aSF5-32

ACGCGACGGUGCAUGCC (SEQ ID NO: 34)

bSF5-32

GGCAUGCACGGGCGUUGCG (SEQ ID NO: 35)

cSF5-32

CGCAACGCCGUCGCGU (SEQ ID NO: 36).

aM2-32

ACGCGACGGUGCAUGCC (SEQ ID NO: 37)

bM2-32

GGCAUGCACCGCGUUGCG (SEQ ID NO: 38)

cM2-32

CGCAACGCCUCGUCGCGU (SEQ ID NO: 39)

Mod-a/WT-b

AUUCGCUGUGUGGUAGUGCCCACAUACUUUGUUGAUCC (SEQ ID NO: 40)

Mod-b/WT-b

CACUACCACUUUGUCCUACGCCCACAUACUUUGUUGAUCC (SEQ ID NO: 41)

Mod-c/WT-b

CGUAGGACCAGCGAAUCCCACAUACUUUGUUGAUCC (SEQ ID NO: 42)

30a/Mod-b

GCGUGCUGUGUGCUACCGCACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 43)

30b/Mod-b

CGGUAGCACUUUGCUGUGCGCACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 44)

30c/Mod-b

CGCACAGCCAGCACGCCACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 45)

Ext30-a/Mod-b

CCUAUUCAGGUGCGUGCUGUGUGCUACCGAUGUAAUUCAACACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 46)

Ext30-b/Mod-b

UUGAAUUACAUCGGUAGCACUUUGCUGUGCGAGGCUGAACAGCACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 47)

Ext30-c/Mod-b

CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGCACUACCACUUUGUCCUACG (SEQ ID NO: 48)

WT-b/Mod-a

CCCACAUACUUUGUUGAUCCAUUCGCUGUGUGGUAGUG (SEQ ID NO: 49)

WT-b/Mod-c

CCCACAUACUUUGUUGAUCCCGUAGGACCAGCGAAU (SEQ ID NO: 50)

SF5-4WJ-a

UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA (SEQ ID NO: 51)

SF5-4WJ-b

UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG (SEQ ID NO: 52)

SF5-4WJ-c

CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG (SEQ ID NO: 53)

SF5-4WJ-d

CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA (SEQ ID NO: 54)

實施例5 用於成像的奈米結構

圖49A-49C 熒光團綴合至核酸奈米結構（在本文中也被稱為奈米顆粒）用於體內癌症成像。圖49A PAGE分析證明RNA寡聚物和奈米顆粒可以攜帶多色熒光材料。圖49B 組裝凝膠顯示寡聚物可以在用熒光團修飾之後高效組裝。圖49C 與ICG熒光團偶聯的Phi29 3WJ奈米顆粒的生物分佈。

圖50A-50C DOTA螯合劑高密度綴合至RNA寡聚物和奈米顆粒。圖50A-50B 胺修飾的且DOTA綴合的寡聚物組裝到RNA奈米顆粒中。圖50B-50C具有和不具有螯合的Gd3+的、具有不同密度的DOTA綴合物的RNA奈米顆粒的比較。

圖51A-51C NOTA螯合劑高密度綴合至寡聚物和奈米顆粒。圖51A NOTA螯合Cu64至RNA奈米顆粒用於PET成像的示意圖。圖51B-51C NOTA綴合的RNA奈米顆粒的組裝凝膠和反相HPLC純化。

圖52A-52E顯示具有多個醛基團以綴合用於pH響應藥物釋放的藥物的pRNA鏈的設計和合成。圖52A 多種藥物在3WJ核心上綴合的示意圖。圖52B攜帶游離胺基基團用於亞胺鍵連接的藥物實例。圖52C 攜帶羥基基團用於縮醛連接的藥物實例。圖52D 使用肼鍵的pH敏感性接頭設計實例。圖52E. 將PI103前藥綴合至核酸寡聚物的酸不穩定接頭實例。

圖53A至圖53H顯示用於遞送用於癌症治療的厄洛替尼的基於RNA的熱穩定性微團的設計和製備。圖53A 用於形成RNA微團的具有可調節疏水修飾的兩親性RNA鏈。圖53B 與功能部分綴合的RNA-生育酚微團的圖示。圖53C-53H 具有可調節疏水修飾的5個兩親性RNA鏈的臨界微團濃度測定。

圖54A-54Q顯示用於抑制KB腫瘤異種移植物生長的CPT-RNA綴合物的設計和製備。圖54A-54C CPT-RNA綴合。

圖54B-54D 通過綴合至RNA的藥物增溶。圖54C-54H 攜帶CPT的RNA奈米顆粒的組裝、熱力學穩定性和大小分佈。圖54D-54I CPT從RNA奈米顆粒的釋放圖譜。圖54J-54K CPT-RNA奈米顆粒的細胞結合和內化。圖54L-54M CPT RNA奈米顆粒的細胞毒性和凋亡效應。圖54N-54P CPT RNA NP在KB腫瘤異種移植小鼠模型中的腫瘤抑制。

圖1A至1E顯示了pRNA-3WJ-PTX微團的結構基礎和組裝原理。圖1A.來源於噬菌體phi29包裝RNA的pRNA-3WJ基序。圖1B. pRNA-3WJ的成角分支結構。圖1C. 將pRNA-3WJ與親脂性模塊（膽固醇，藍色）、治療模塊（PTX，綠色）和報告模塊（Alexa染料，紅色）綴合。圖1D. 圖解在水溶液中通過綴合的親脂性模塊的疏水相互作用形成pRNA - 3WJ。圖1E. 通過1 % TAE瓊脂糖凝膠電泳分析pRNA-3WJ微團的組裝。上方凝膠：EtBr通道；下方凝膠：Alexa647通道（M: 1kb plus DNA分子量標準（DNA ladder））。

圖2A至2D顯示了pRNA-3WJ微團的特徵。圖2A AFM圖像。比例尺：200 nm。圖2B 通過DLS的表觀流體動力學直徑測量。上圖：TMS緩衝液中的 3WJ；下圖：TMS緩衝液中的pRNA-3WJ- PTX微團。圖2C 通過DLS的ζ電位測量。圖2D 通過尼羅紅結合分析驗證pRNA-3WJ微團的組裝。

圖3A至3D顯示了RNA-PTX綴合物。圖3A RNA-PTX綴合物的設計原理。 PTX-N3可以通過點擊化學與末端炔標記的RNA反應，並且PTX隨後可以通過水解從RNA鏈被釋放。圖3B 在TBE緩衝液中通過20% 8M尿素PAGE分析成功的RNA - PTX綴合。圖3C 通過質譜對a3WJ-PTX綴合物的實驗質量預測。圖3D隨時間的體外PTX釋放曲線。

圖4A和4B顯示通過流式細胞術（圖4A）和共聚焦顯微鏡（圖4B）在體外腫瘤細胞結合和內化pRNA -3WJ-PTX微團的分析。顯示的是細胞核染色（藍色）；細胞骨架染色（綠色）；和pRNA-3WJ-PTX微團結合（紅色）。

圖5A至5D顯示了在體外負載PTX的pRNA-3WJ微團的細胞毒性和凋亡作用。圖5A通過MTT分析測定pRNA-3WJ-PTX微團的細胞毒性作用。圖5B 通過PI /膜聯蛋白V-FITC雙重染色和FACS分析測定pRNA-3WJ-PTX微團的凋亡作用。圖5C Caspase-3測定。圖5D顯示了pRNA-3WJ-PTX微團在小鼠異種移植物中的體內腫瘤靶向。左圖： 注射後4小時後獲得的全身圖像。右圖：注射後24小時後獲得的器官圖像。

圖6A-6R用於微RNA（micro RNA）遞送的RNA微團。圖6A-6D 3WJ基序，圖解3WJ RNA微團形成、3WJ/FA/抗-miR21微團的2D結構、由2%瓊脂糖凝膠分析的RNA微團的組裝。 （從左到右的泳道：3WJ、3WJ微團、3WJ /抗miR21、3WJ /抗miR21微團、3WJ/FA/抗miR21、3WJ/FA/抗miR21微團），3WJ/FA/抗-miR21微團的大小分佈和ζ電位。圖6E-6G 通過尼羅紅封裝分析測定的CMC，以及RNA微團在不同溫度、pH和RNA酶條件下的穩定性研究。圖6H-6I顯示RNA微團至癌細胞的體外結合和內化。處理1小時後，流式細胞術比較對KB細胞的結合親和力。共聚焦顯微鏡顯示內化分佈。藍色：細胞核；綠色：細胞骨架；紅色：RNA奈米顆粒。圖6J-6L顯示了攜帶抗-miR21的RNA微團的體外研究。雙螢光素酶測定展示向KB細胞遞送抗-miR21。 qRT-PCR顯示miR21敲除對靶基因PTEN表達的影響。 Caspase-3測定顯示處理後的細胞凋亡誘導。圖6M-6N顯示在具有異種移植物的小鼠中體內生物分佈研究。全身圖像。注射後8hr後的離體器官圖像。圖6O-6R顯示RNA微團在具有異種移植物的小鼠中的體內治療效果。在5次注射過程中的腫瘤消退曲線（紅色箭頭顯示注射日）。治療期間小鼠的體重曲線。 qRT-PCR和Western印跡顯示體內遞送抗-miR21後PTEN上調。

圖7A和7C顯示測定由pRNA-3WJ微團製劑對促炎性細胞因子和趨化因子的誘導。圖7A 在將pRNA-3WJ微團與小鼠巨噬細胞樣RAW 264.7細胞進行孵育之後，通過ELISA分析對TNF-α、IL6和IFN-α產生的體外評估。圖7B在將pRNA-3WJ微團注射到C57BL/6小鼠中之後，通過ELISA分析對TNF-α、IL6和IFN-α產生的體內評估。圖7C 對於pRNA-3WJ微團製劑的體內趨化因子誘導圖譜。

圖8顯示了相對於不同的pH和溫度的pRNA-3WJ微團製劑穩定性。

圖9A至9C顯示PTX-N3的合成（圖9A），PTX（圖9B）和PTX-N3（圖9C）的1H NMR（400 MHz）譜。

圖10A和10B顯示RNA-PTX綴合物。圖10A 用未修飾的a3WJ鏈、5’-炔修飾的a3WJ鍊和5’- PTX修飾的a3WJ鏈逐步組裝pRNA-3WJ。 (M:超低DNA分子量標準）。圖10B 1mM游離PTX和RNA-PTX在DEPC水中的溶解度。

圖11A-11C顯示了可證實微團形成的曲線圖和凝膠圖像。圖11A和11B顯示了根據尼羅紅結合分析的微團形成濃度。圖11C顯示1% TAE瓊脂糖凝膠電泳（分子量標準：1kb plus DNA分子量標準）。

圖12A至12F顯示Caspase-3依賴方式的pRNA-3WJ-紫杉醇微團誘導的凋亡的時間過程。

圖13顯示來自pRNA-3WJ-PTX微團體內腫瘤靶向的時間過程的結果。 P：PBS；M-PTX：pRNA-3WJ-PTX微團。

圖14顯示pRNA-3WJ微團處理的小鼠血清和對照PBS處理的小鼠血清的印跡圖像。

圖15A至15D顯示模塊化RNA基序的形狀、大小和對於高熔融溫度（Tm）的取向。圖15A具有不同的序列和熱穩定性的3WJS。圖15B 通過TGGE（熱梯度凝膠電泳）的Tm分析。圖15C 通過qPCR的Tm測定。圖15D 改變形狀和膽固醇標記策略的示例性RNA設計以優化膜錨定效率。

圖16A和16B顯示了由多個炔基團修飾的多分支或多臂模塊化RNA基序的二級結構。圖16A 由18個炔基團修飾的3WJ模塊化RNA基序。圖16B 由24個炔基團修飾的4WJ模塊化RNA基序。

圖17顯示用於多個紫杉醇有效綴合至RNA鏈的水/有機介質的最佳比率。

圖18顯示根據非變性PAGE的分別與18個紫杉醇和24個紫杉醇綴合的3WJ和4WJ RNA奈米結構的逐步自組裝（分子量標準：超低範圍DNA標記）。

圖19顯示根據TGGE的與18個紫杉醇綴合的3WJ奈米結構的Tm（M：單體）。

圖20A和20B顯示合成RNA寡核苷酸的序列設計和藥物綴合。圖20A 有紫杉醇（PTX）綴合的擴展3WJ和4WJ RNA載體的序列設計。將6-PTX綴合至一個4WJ合成RNA寡核苷酸。圖20B有和無6-PTX綴合的純化4WJ合成RNA寡核苷酸的HPLC色譜圖。

圖21A至21C顯示體外表徵。圖21A 具有18 PTX的3WJ和具有24 PTX的4WJ的逐步自組裝與（M、D、T分別表示單體、二聚體和三聚體）。圖21B 通過DLS測量的4WJ-24 PTX的大小分佈。圖21C 通過綴合至RNA而提高的PTX的溶解度。

圖22A和22B顯示熱穩定性。圖22A 4WJ空載體和4WJ-24 PTX的TGGE。圖22B 4WJ空載體和4WJ-24 PTX的qPCR。

圖23顯示具有多個泰素（Taxol）的4WJ的使用MTT測定的體外細胞毒性。在相同PTX濃度下，具有24 PTX的4WJ與單獨PTX相比顯示更高的細胞毒性。

圖24A和24B顯示用以檢測治療效果的動物試驗的結果。圖24A小鼠腫瘤體積和體重的每日記錄。圖24B處死前後腫瘤重量的比較。與陰性對照組相比，4WJ-FA-泰素組顯示更慢的腫瘤生長。在治療後未觀察到小鼠體重發生顯著降低，這可表明沒有顯著的毒性。

圖25A至25C顯示設計和藥物綴合。圖25A 修飾的寡核苷酸和喜樹鹼（CPT）前藥的點擊反應方案。圖25B 變性PAGE用以監測綴合（*表示2’-F 4炔；>表示2’-F 4 CPT）。圖25C 有和無4CPT綴合的純化3WJ鏈的HPLC色譜圖（黑色： 2’-Fb 4炔；紅色：2’-Fb 4CPT）。

圖26A至26C顯示負載有貨物化合物的3臂模塊化RNA基序的組裝和體外表徵。圖26A 圖解3WJ-FA-7CPT。圖26B FA-7CPT-3WJ和3WJ對照的逐步組裝的非變性PAGE（泳道1，2'-Fa 3CPT；泳道2，2'-Fa 3CPT+2'-Fc 葉酸；泳道3，FA-7CPT- 3WJ；泳道4，7CPT-3WJ；泳道5，FA-3CPT-3WJ；泳道6，FA-4CPT-3WJ；泳道7，FA-3WJ；泳道8，3WJ）。圖26C FA-7CPT- WJ的溫度梯度凝膠電泳。

圖27顯示具有一個CPT的RNA的KB細胞活力測試。在相同CPT濃度下，觀察到具有一個CPT的3WJ與單獨的CPT相比，具有稍微更大的細胞毒性。

圖28顯示3WJ-FA-7CPT和PBS之間腫瘤生長的比較。觀察到3WJ-FA-CPT與陰性對照組相比導致更緩慢的腫瘤生長。

圖29A至29C顯示具有三個不同核心（Phi29、SF5、M2）和四組螺旋（WT、Mod、30、32）的分支3WJ模塊化RNA基序的設計和序列。圖29A 顯示核心和螺旋的不同組合的設計示意圖。圖29B 七個3WJ模塊化RNA基序的序列設計（Phi29-Mod，Phi29-30，SF5-30，M2-30，Phi29-32，SF5-32，M2-32）。圖29C 具有同一組螺旋（DA）和在核心中將DA分開的不同突起的分支3WJ模塊化RNA基序的比較。

圖30A至30C顯示分支3WJ模塊化RNA基序在TES緩衝液中的熱穩定性。圖30A qPCR顯示退火曲線。圖30B TGGE顯示解鏈曲線。圖30C 針對分支3WJ模塊化RNA基序退火和解鏈所測量的Tm的比較。

圖31A和31B顯示分支3WJ模塊化RNA基序的酶解穩定性。圖31A血清降解曲線。圖31B. 3WJ在50%血清中的半衰期。

圖32A至32D顯示由分支3WJ模塊化RNA基序製成的分支3WJ RNA奈米結構的設計和構造。圖32A 具有不同熱穩定性的三種3WJ模塊化RNA基序，其用作分支3WJ RNA奈米結構的結構元件。圖32B 具有不同分層的分支3WJ RNA奈米結構的2D示意圖。圖32C 具有不同分層的分支3WJ RNA奈米結構的3D示意圖。圖32D 各分支3WJ模塊化RNA基序組成和偶聯以形成3層分支奈米結構。

圖33A至33D顯示分支3WJ RNA奈米結構的熱穩定性。圖33A. qPCR顯示退火曲線。圖33B. TGGE顯示解鏈曲線。圖33C 退火和解鏈Tm的比較。圖33D. TGGE顯示分支3WJ RNA模塊的熱力學堆疊層釋放曲線。

圖34A和34B顯示分支3WJ RNA奈米結構的體外表徵。圖34A 大小比較凝膠顯示2層和3層3WJ RNA奈米結構的組裝。圖34B 通過動態光散射（DLS）測量的2層和3層3WJ RNA奈米結構的大小分佈。

圖35A至35C顯示分支3WJ RNA奈米結構的酶解穩定性。圖35A血清穩定性凝膠。圖35B 血清降解曲線。圖35C. 3WJ RNA奈米結構在50 %血清中的半衰期。

圖36A和圖36B顯示通過流式細胞術（圖36A）和共聚焦顯微鏡（圖36B）的在體外3L-無FA、3L-核心 FA和3L-外部FA的細胞結合比較。

圖37A至37C顯示基於分支3WJ的模塊化RNA基序和具有不同臂數量的變體的設計和構造。圖37A 不同的高階接合（核心）用作模塊化RNA基序的結構元件。圖37B 合成的模塊化RNA基序的核苷酸序列。圖37C 使用6WJ作為核心且4WJ作為臂（或分支）的一個模塊化RNA基序的3D結構。

圖38A至38G顯示3WJ（圖38A）、4WJ（圖38B）、5WJ（圖38C）、6WJ（圖38D）、7WJ（圖38E）、8WJ（圖38F）和9WJ（圖38G）模塊化RNA基序的2D結構，顯示了示例的合成的RNA寡核苷酸序列。

圖39A至39C顯示各種模塊化RNA基序的熱穩定性。圖39A qPCR顯示退火曲線。圖39B TGGE顯示解鏈曲線。圖39C 針對模塊化RNA基序退火和解鏈的Tm比較。

圖40A和圖40B顯示基於分支3WJ的模塊化RNA基序的體外表徵。圖40A. 大小比較凝膠：2%瓊脂糖凝膠顯示4-6WJ的組裝（從左到右：分子量標準、phi29-3WJ、單體、二聚體、三聚體、4WJ、5WJ 、6WJ） 。圖40B 通過動態光散射（DLS）測量的4-6WJ的大小分佈。

圖41A至41G顯示模塊化RNA基序的方面。黑色區域識別雙鏈臂（DA），且灰色區域指示模塊化RNA基序的核心結構域。核心結構域也被指定為包含在虛線框內的模塊化RNA基序區域。

圖42A至42G顯示各包含單一類型的模塊化RNA基序的RNA奈米結構的方面。黑色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的二級水平或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的末端或最外側水平的模塊化RNA基序。

圖43顯示含有不同類型的模塊化RNA基序的RNA奈米結構的一個方面。黑色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊化RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的二級水平或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的末端或最外側水平的模塊化RNA基序。

圖44A至44B顯示負載單一類型的貨物化合物或官能團的RNA奈米結構的方面。黑色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊化RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的二級水平或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的末端或最外側水平的模塊化RNA基序。

圖45A至45B顯示負載多種類型的貨物化合物和/或官能團（包括但不限於活性劑）的RNA奈米結構的方面。黑色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的核心或一級模塊化RNA基序。深灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的二級水平或中間水平的模塊化RNA基序。淺灰色的模塊化RNA基序標示包含在RNA奈米結構中的末端或最外側水平的模塊化RNA基序。

圖46A至46B顯示負載多種類型的貨物化合物和/或官能團（包括但不限於紫杉醇）的RNA奈米結構的方面。圖46A 具有模塊化RNA基序的奈米結構，所述模塊化RNA基序包含具有內部修飾的延長的核心，所述內部修飾允許活性劑特異性連接至奈米結構的核心。圖46B 具有不同官能團的奈米結構，所述官能團連接至每一層中的寡核苷酸的5’端或3’端。

圖47A至47D顯示計算機衍生的RNA奈米結構的設計概念。圖47A. 顯示3-6分支的RNA奈米結構的2D和3D代表圖。圖47B顯示3-6分支RNA奈米結構的寡聚物序列和互鎖結構域的設計。圖47C顯示單獨RNA奈米結構低聚物的構成。

圖48顯示用於計算機設計RNA奈米結構低聚物序列的計算算法的流程圖。

圖49A至49C 將熒光團綴合至核酸奈米顆粒，用於體內癌症成像。圖49A PAGE分析，證明RNA寡聚物和奈米顆粒能攜帶多色熒光材料。圖49B 組裝凝膠，證明低聚物在經熒光團修飾後能高效組裝。圖49C 與ICG熒光團偶聯的Phi29 3WJ奈米顆粒的生物分佈。

圖50A至50C DOTA螯合劑高密度綴合至RNA寡聚物和奈米顆粒。圖50A至50B 將經胺修飾和與DOTA綴合的低聚物組裝至RNA奈米顆粒中。圖50B至50C 具有不同密度的DOTA綴合物的RNA奈米顆粒的比較，所述DOTA綴合物含有和不含有螯合的Gd3 +。

圖51A至51C NOTA螯合劑高密度綴合至低聚物和奈米顆粒。圖51A NOTA螯合Cu64至RNA奈米顆粒用於PET成像的示意圖。圖51B至 51C 綴合NOTA的RNA奈米顆粒的組裝凝膠和反相HPLC純化。

圖52A至52E顯示具有多個用以綴合藥物的醛基以用於pH響應性藥物釋放的pRNA鏈的設計和合成。圖52A 在3WJ核心上綴合多個藥物的示意圖。圖52B含有用於亞胺鍵結合的游離胺基的藥物實例。圖52C 含有用於縮醛鍵的羥基的藥物實例。圖52D 應用肼鍵的pH敏感性接頭設計的實例。圖52E 將PI103前藥偶聯至核酸低聚物的酸不穩定接頭的實例。

圖53A至53H顯示遞送用於癌症治療的厄洛替尼的基於RNA的熱穩定微團的設計和製備。圖53A 具有可調節的疏水修飾的兩親性RNA鏈，用於形成RNA微團。圖53B 圖解與功能性配基綴合的RNA-生育酚微團。圖53C至53H 具有可調節的疏水修飾的5個兩親性RNA鏈的臨界微團濃度測定。

圖54A至54P顯示用於抑制KB腫瘤異種移植物生長的CPT-RNA綴合物的設計和製備。圖54A至54C CPT-RNA綴合。圖54B-54D 通過綴合至RNA溶解藥物。圖54C至54H 攜帶RNA奈米顆粒的CPT的組裝、熱力學穩定性和大小分佈。圖54D至54I CPT自RNA奈米顆粒的釋放曲線。圖54J至54K CPT-RNA奈米顆粒的細胞結合和內化。圖54L至54M CPT RNA奈米顆粒的細胞毒性和凋亡作用。圖54N至54P CPT RNA NP在KB腫瘤異種移植小鼠模型中的腫瘤抑制。

Claims (53)

1. 一種模組化RNA基序，其包括： 至少三段合成RNA寡核苷酸，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸彼此偶聯，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸形成一中心核結構域，和圍繞該中心核結構域排列並且遠離該中心核結構域延伸的至少三個雙鏈臂,其中該RNA基序的解鏈溫度大於65攝氏度。
2. 如請求項1所述的模組化RNA基序，其中該模組化RNA基序包括3至9條合成RNA寡核苷酸鏈。
3. 如請求項1至2中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段包含一個或多個修飾的核苷酸。
4. 如請求項3所述的模塊化RNA基序，其中該一個或多個修飾的核苷酸是末端核苷酸或非末端核苷酸。
5. 如請求項3所述的模塊化RNA基序，其中該修飾是與該一個或多個修飾的核苷酸連接的炔。
6. 如請求項3所述的模塊化RNA基序，其中該修飾是與該一個或多個修飾的核苷酸連接的接頭。
7. 如請求項1至6中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與該至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相連的貨物化合物分子。
8. 如請求項7所述的模組化RNA基序，其中該至少3至100個貨物化合物分子連接至該合成RNA寡核苷酸。
9. 如請求項1至6中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與該至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相連的官能團。
10. 如請求項9所述的模塊化RNA基序，其中該官能團與末端核苷酸相連。
11. 如請求項9或10所述的模塊化RNA基序，其中該官能團與非末端核苷酸相連。
12. 如請求項9至11中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與官能團相連的貨物化合物。
13. 如請求項1至12中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段包括具有與SEQ ID NOs：1-54中的任一個大約80 -100%同一的序列的寡核苷酸序列。
14. 如請求項1至13中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸被配置為自組裝以形成該模塊化RNA基序。
15. 如請求項1至14中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該模塊化RNA基序的Tm大於約70攝氏度。
16. 如請求項1至15中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該模塊化RNA基序的Tm在約70攝氏度至約100攝氏度的範圍。
17. 如請求項1至16中任一項所述的模組化RNA基序，其中該模組化RNA基序的Tm在約65攝氏度至約100攝氏度的範圍。
18. 一種模塊化RNA基序，其包括： 至少四段合成RNA寡核苷酸，其中至少三段合成RNA寡核苷酸彼此偶聯，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸形成中心核結構域，並且至少三個雙鏈臂圍繞該核結構域排列並且遠離該中心核結構域延伸。
19. 如請求項18所述的模塊化RNA基序，其中該模塊化RNA基序包括4至9條合成RNA寡核苷酸鏈。
20. 如請求項18至19中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段包含一個或多個修飾的核苷酸。
21. 如請求項20所述的模塊化RNA基序，其中該一個或多個修飾的核苷酸是末端核苷酸或非末端核苷酸。
22. 如請求項20所述的模塊化RNA基序，其中該修飾是與該一個或多個修飾的核苷酸連接的炔。
23. 如請求項20所述的模塊化RNA基序，其中該修飾是與該一個或多個修飾的核苷酸連接的接頭。
24. 如請求項18至23中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與該至少三段合成RNA寡核苷酸的合成RNA寡核苷酸相連的貨物化合物分子。
25. 如請求項24所述的模塊化RNA基序，其中至少3至100個貨物化合物分子與該合成RNA寡核苷酸相連。
26. 如請求項18至23中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與該至少三段合成RNA寡核苷酸中的一段或多段的核苷酸相連的官能團。
27. 如請求項26所述的模塊化RNA基序，其中該官能團與末端核苷酸相連。
28. 如請求項26或27的模塊化RNA基序，其中該官能團與非末端核苷酸相連。
29. 如請求項26至28中任一項所述的模塊化RNA基序，其進一步包括與官能團相連的貨物化合物。
30. 如請求項18-29中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸中的每一段包括具有與SEQ ID NOs：1-54中的任一個大約70 -100%同一的序列的寡核苷酸序列。
31. 如請求項18至30中任一項所述的模塊化RNA基序，其中該至少三段合成RNA寡核苷酸被配置為自組裝以形成該模塊化RNA基序。
32. 一種RNA奈米結構，其包括： 至少兩個模塊化RNA基序，該模塊化RNA基序如請求項1至31中任一項所述，其中該至少兩個模塊化RNA基序彼此相連。
33. 如請求項32所述的RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構包括： 中心核，其中該中心核包括第一模塊化RNA基序； 一第一層，其中該第一層包括至少三個模塊化RNA基序，其中該第一層的該至少三個模塊化RNA基序中的每個模塊化RNA基序與該第一模塊化RNA基序相連；和 一第二層，其中該第二層包括至少三個模塊化RNA基序，其中該第二層的該至少三個模塊化RNA基序中的每一個與該第一層的該至少三個模塊化基序中的模塊化RNA基序相連。
34. 如請求項33所述的RNA奈米結構，其中該奈米結構中的所有模塊化RNA基序具有相同數目的雙鏈臂。
35. 如請求項33所述的RNA奈米結構，其中該第一層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目不同於該第一模塊化RNA基序上，該第二層的模塊化RNA基序上，或該第一模塊化RNA基序和該第二層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。
36. 如請求項33所述的RNA奈米結構，其中該第二層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目不同於該第一模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目，該第一層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目，或者該第一模塊化RNA基序和該第一層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。
37. 如請求項33所述的RNA奈米結構，其中該第一模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目不同於該第一層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目，該第二層的模塊化RNA基序上的雙鏈臂的數目，或者該第一層和該第二層的模塊化RNA基序兩者上的雙鏈臂的數目。
38. 如請求項32至37中任一項所述的RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構的解鏈溫度（Tm）大於70攝氏度。
39. 如請求項32-37中任一項所述的RNA奈米結構，其中該RNA奈米結構的Tm在70攝氏度至約100攝氏度範圍。
40. 如請求項33-39中任一項所述的RNA奈米結構，其中該第一模塊化RNA基序具有比該第一層的模塊化RNA基序和該第二層的模塊化RNA基序更大的Tm 。
41. 如請求項40所述的RNA奈米結構，其中該第一層的模塊化RNA基序具有比該第二層的模塊化RNA基序更大的Tm。
42. 如請求項33-41中任一項所述的RNA奈米結構，其中該RNA基序中的一個或多個與一個或多個貨物化合物偶聯。
43. 如請求項33-42中任一項所述的RNA奈米結構，其中該RNA基序中的一個或多個與一個或多個官能團偶聯。
44. 如請求項33-43中任一項所述的RNA奈米結構，其中該貨物化合物是抗癌化合物、螯合劑、放射性同位素、熒光團、miRNA、抗miRNA、siRNA、pH響應前藥、酶可裂解前藥，或其任意組合。
45. 如請求項33-41中任一項所述的RNA奈米結構，其中該RNA基序中的一個或多個與兩個或更多個貨物化合物偶聯，並且其中該兩個或更多個貨物化合物中的至少兩個是不同類型的貨物化合物。
46. 一種方法，其包括： 向受試者施用如請求項1至31中任一項所述的模塊化RNA基序或如請求項32至45中任一項該的RNA奈米結構。
47. 如請求項46所述的方法，其中該受試者患有或懷疑患有癌症。
48. 一種在受試者中治療癌症或疾病的方法，該方法包括： 向受試者施用如請求項1至31中任一項所述的模塊化RNA基序或如請求項32至45中任一項所述的RNA奈米結構。
49. 一種如請求項1至31中任一項所述的模塊化RNA基序或如請求項32至45中任一項所述的RNA奈米結構在製備用於治療疾病或癌症的藥物中的用途。
50. 一種系統，其包括： 一計算設備；和 在該計算設備上可執行的應用，其中，當被執行時，該應用使得該計算設備至少： 至少部分地基於理論DA序列的GC含量，理論DA序列的解鏈溫度（Tm）和自發二聚化的能力，產生理論雙鏈臂（DA）序列； 至少部分地基於所保存的一組DA的計算的交叉互補性，選擇對於一組寡聚物的一個或多個DA，其中具有最低總體互補性的DA被選擇； 計算寡聚物序列，其包括計算DA序列的反向互補物、計算延伸寡聚物序列和計算終止寡聚物序列；和 至少部分地基於寡聚物自發二聚化或形成二聚體的能力，選擇寡聚物，其中不自發二聚化並且不形成二聚體的那些寡聚物被選擇。
51. 一種方法，其包括： 至少部分地基於理論DA序列的GC含量，理論DA序列的解鏈溫度（Tm），和自發二聚化的能力，生成理論雙鏈臂（DA）序列； 至少部分地基於所保存的一組DA的計算的交叉互補性，選擇對於一組寡聚物的一個或多個DA，其中具有最低總體互補性的DA被選擇； 計算寡聚物序列，其包括計算DA序列的反向互補物、計算延伸寡聚物序列和計算終止寡聚物序列；和 至少部分地基於該寡聚物自發二聚化或形成二聚體的能力，選擇寡聚物，其中不自發二聚化並且不形成二聚體的那些寡聚物被選擇。
52. 如請求項1至52中任一項中列出的核苷酸、RNA或RNA結構的用途，其用於使疏水性或低可溶性藥物變得可溶，從而減少藥物劑量，以降低藥物毒性或副作用，或者避免在癌症化療中使用油或有機溶劑來溶解藥物。
53. 一種方法，其用於使用疏水性材料來產生RNA微團結構，以攜帶抗癌化合物、治療劑、miRNA、抗miRNA、siRNA、螯合劑、放射性同位素，熒光團、pH響應前藥或酶可裂解前藥。

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