JP6214397B2 - 新規ホスファチジルイノシトール３キナーゼ阻害剤及び医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、新規のホスファチジルイノシトール３キナーゼ阻害剤及びこれを含有する医薬組成物に関する。

がんの薬物療法は、分子標的薬の登場により目覚ましい進歩を遂げているが、未だ克服できない難治性がんは数多く存在する。そのため、より治療効果の高い、新しいがん分子標的薬の開発が望まれている。

ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（Phosphatidyl inositol 3-kinase；以下「ＰＩ３Ｋ」という）は、細胞膜上に存在するリン脂質ホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート（ＰＩＰ２）のイノシトール環の３位リン酸基をリン酸化してホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）を生成する酵素であり（非特許文献１：Fruman et al., Annual Rev Biochem 67, 481-507, doi:10.1146/annurev. biochem. 67.1.481 (1998)）、様々な増殖因子受容体チロシンキナーゼにより活性化され、下流のＡＫＴの活性化を介して、細胞の生存及び増殖を促進するように作用する（非特許文献２：Cantley, L. C. Science 296, 1655-1657, doi:10.1126/science. 296.5573.1655 (2002)）。ＰＩ３Ｋは、がんに関連していることがわかっている。

ＰＩ３Ｋは、触媒サブユニット（catalytic subunit）と調節サブユニット（regulatory subunit）とからなるヘテロダイマーを形成している。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットであるｐ１１０αをコードする。このＰＩＫ３ＣＡ遺伝子については、乳がんや大腸がん等の様々ながん種において、高頻度の遺伝子増幅や機能獲得型の点突然変異が報告されている（非特許文献３：Samuels et al. Science 304, 554 (2004)；非特許文献４：Ikenoue et al. Cancer Res 65, 4562 (2005)；非特許文献５：Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 802 (2005)）。
また、ＰＩ３Ｋとは逆反応を触媒する脱リン酸化酵素であるＰＴＥＮ（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）は、シグナルメッセンジャーであるＰＩＰ３を減少させることによって細胞の増殖を抑制する（非特許文献６：Maehama et al., J. Biol. Chem. 273, 13375-13378 (1998)）。ＰＴＥＮ遺伝子については、子宮内膜がんや悪性黒色腫など多くのがん種で欠失や点突然変異が見られ（非特許文献７：Salmena et al., Cell 133, 403-414 (2008)）、その点突然変異のほとんどで脱リン酸化酵素活性が低下していることが報告されている（非特許文献８：Han et al. Cancer Res 60, 3147 (2000)）。
これらの変異の結果、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の異常な恒常的活性化が生じ、がん細胞の生存シグナルが伝達されると考えられている。

そのため、ＰＩ３Ｋは、がん治療における有力な標的分子として注目されており、近年、ＰＩ３Ｋ阻害剤の開発が盛んに行われている。いくつかの低分子ＰＩ３Ｋ阻害剤は臨床試験の段階に入っているが、未だ医薬品化されるに至ったものはない（非特許文献９：Kong & Yamori, Current Medicinal Chemistry 16, 2839-2854 (2009)）。

一方、がんの発生にはエピジェネティックスの異常が深く関わっていることが明らかにされている。ヒストンアセチル化はエピジェネティックス制御の重要なメカニズムの一つであり（非特許文献１０：Carew et al., Giles, Cancer Let 269, 7-17 (2008)）、そのアセチル化を解除するヒストンデアセチラーゼ（以下「ＨＤＡＣ」という）の阻害により、遺伝子発現変化が生じ、それに伴って細胞分化やアポトーシスが引き起こされることがわかっている。このため、ＨＤＡＣ阻害剤は、新しいがん分子標的薬として注目を集めている。

デプシペプチド類化合物（特許文献１〜４）は、１つ以上のアミド結合（−ＣＯＮＨＲ−）がエステル結合（−ＣＯＯＲ）に置換されたペプチドの総称である。デプシペプチド類化合物の中でも、ＦＫ２２８（ＦＲ９０１２２８、ロミデプシンとも呼ばれている）は、クロモバクテリウム・ビオラセウムから発酵産物として単離された化合物であり（非特許文献１１：Ueda et al. J. Antibiotics 47, 301 (1994)）、クラスＩ ＨＤＡＣを選択的に阻害する強力なＨＤＡＣ阻害剤である（非特許文献１２：Furumai et al. Cancer Res 62, 4916 (2002)）。ＦＫ２２８は、このＨＤＡＣ阻害活性に基づいて抗がん剤として臨床試験が進められ、同じくＨＤＡＣ阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）とともに、皮膚Ｔ細胞リンパ腫に対する治療薬として米国ＦＤＡの認可を受けている。
なお、用語「デプシペプチド」は、狭義ではＦＫ２２８を指すが、本明細書においては上記の意義を有する用語として使用する。

ヒトがん細胞株において、ＰＩ３Ｋ阻害剤とＨＤＡＣ阻害剤の併用は、殺細胞効果の増強や相乗作用をもたらすことが報告されている(非特許文献１３：Wozniak et al. Haematologica 95, 613 (2010))。
ＨＤＡＣ阻害剤がそれ自体でＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に影響するか否かに関しては議論がある（非特許文献１４：Hanker et al., J Molecular Signaling 4, 5 (2009);非特許文献１５：Graham et al. Clinical Cancer Res 12, 223 (2006)）。古典的なＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（trichostatin A；ＴＳＡ）は、プロテインホスファターゼ１（protein phosphatase 1）を介してリン酸化ＡＫＴを抑えることが報告されている（非特許文献１６：Chen et al., J Biol Chem 280, 38879 (2005)）。

ＦＫ２２８に関しても、細胞選択的にリン酸化ＡＫＴの発現を抑制するとした報告がある（非特許文献１７：Kodani et al., Oncology Reports 13, 477-483 (2005)）。しかし、その機序については明らかにされておらず、ＦＫ２２８のキナーゼ阻害活性を検討した文献もない。さらに、デプシペプチド類化合物がＰＩ３Ｋ阻害活性を有することについては報告されていない。

特開平２−８５２９６号公報 特開平４−７９８９２号公報 特表２００８−５４２３４７号公報 特表２００９−５１９２２４号公報

Fruman, D. A., Meyers, R. E. & Cantley, L. C. Annual Review of Biochemistry 67, 481-507, doi:10.1146/annurev.biochem.67.1.481 (1998) Cantley, L. C. Science 296, 1655-1657, doi:10.1126/science.296.5573.1655 (2002) Samuels, Y. et al. Science 304, 554 (2004) Ikenoue, T. et al. Cancer Research 65, 4562 (2005) Kang, S., Bader, A. G. & Vogt, P. K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 802 (2005) Maehama, T. & Dixon, J. E. The Journal of Biological Chemistry 273, 13375-13378 (1998) Salmena, L., Carracedo, A. & Pandolfi, P. P. Cell 133, 403-414 (2008) Han, S. Y. et al. Cancer Research 60, 3147 (2000) Kong, D. & Yamori, T. Current Medicinal Chemistry 16, 2839-2854 (2009) Carew, J. S., Giles, F. J. & Nawrocki, S. T. Cancer Letters 269, 7-17 (2008) Ueda, H. et al. The Journal of Antibiotics 47, 301 (1994) Furumai, R. et al. Cancer Research 62, 4916 (2002) Wozniak, M. B. et al. Haematologica 95, 613 (2010) Hanker, A. B., Healy, K. D., Nichols, J. & Der, C. J.. Journal of Molecular Signaling 4, 5 (2009) Graham, C. et al. Clinical Cancer Research 12, 223 (2006). Chen, C. S., Weng, S. C., Tseng, P. H. & Lin, H. P. Journal of Biological Chemistry 280, 38879 (2005) Kodani, M. et al. Oncology reports 13, 477-483 (2005) Tugendreich, S. et al. Genome Research 11, 1899 (2001) Rodriguez-Escudero, I. et al. Biochemical Journal 390, 613 (2005) Cid, V. et al. Oncogene 27, 5431-5442 (2008) 日本がん分子標的学会 第１５回学術集会 抄録 ２０１１年５月３１発行 演題番号Ｐ１０−５「出芽酵母をスクリーニングツールとした新規ＰＩ３Ｋ阻害剤の探索」 Narita, K. et al. Chemistry-A European Journal 15, 11174-11186 (2009) Takizawa et al. Chemical Communication, 1677-1679 (2008) Takizawa et al. Heterocycles 76, 275-290 (2008) Rogers, B. et al. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 3, 207-214 (2001) Alani, E., Cao, L. & Kleckner, N. Genetics 116, 541 (1987) Walker, E. H. et al. Molecular Cell 6, 909-919 (2000) Grunwald, V. et al. Cancer Research 62, 6141 (2002) Ropero, S. et al. Nature 200, 6 Hanigan, C. L. et al. Gastroenterology 135, 1654-1664. e1652 (2008) Ree, A. H., Folkvord, S. & Flatmark, K. Nature Genetics 40, 812-813 (2008) Xu, W., Parmigiani, R. & Marks, P. Oncogene 26, 5541-5552 (2007) Richon, V. M., Sandhoff, T. W., Rifkind, R. A. & Marks, P. A. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 10014 (2000) Nakajima, H., Kim, Y. B., Terano, H., Yoshida, M. & Horinouchi, S. Experimental Cell Research 241, 126-133 (1998) Kumagai, T. et al. International Journal of Cancer 121, 656-665 (2007)

本発明は、新規のＰＩ３Ｋ阻害剤を提供することを目的とする。さらに、ＰＩ３ＫとＨＤＡＣとをともに阻害する薬剤の開発は、難治性がんの克服に多大な貢献をするものと考えられる。したがって、本発明は、ＰＩ３Ｋ阻害作用とＨＤＡＣ阻害作用とを併せ持つ物質を提供することを目的とする。最終的に、本発明は、これらの物質を含有する新規抗がん用医薬組成物、特に難治性がんに対しても有効な抗がん用医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、上記の課題を解決するために、まず、新規のＰＩ３Ｋ阻害剤を見出すべく、スクリーニングを行った。具体的には、出芽酵母にヒトのｐ１１０αを発現させると細胞増殖障害を生じるが、ＰＩ３Ｋ阻害剤を作用させると細胞増殖障害が回避される事象（非特許文献１８：Tugendreich et al., Genome Research 11, 1899 (2001)；非特許文献１９：Rodriguez-Escudero et al. Biochemical Journal 390, 613 (2005)；非特許文献２０：Cid et al. Oncogene 27, 5431-5442 (2008)）を利用したスクリーニング系（非特許文献１９；非特許文献２１：日本がん分子標的学会 第１５回学術集会 抄録 ２０１１年５月３１発行 演題番号Ｐ１０−５「出芽酵母をスクリーニングツールとした新規ＰＩ３Ｋ阻害剤の探索」）を用いて、化合物ライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、ＨＤＡＣ阻害剤であるデプシペプチド類化合物、すなわちＦＫ２２８及びその類縁体を候補物質として選択した。

本発明者らは、インビトロでＰＩ３Ｋ阻害活性の評価を行い、これらの化合物がμＭオーダーの濃度でＰＩ３Ｋの直接阻害活性をもつことを確認した。また、ヒト培養細胞を用いたウェスタンブロット解析において、これらの化合物がリン酸化ＡＫＴとＡＫＴ経路の下流分子を抑制することを見出した。さらに、ＭＴＴアッセイの結果から、これらの化合物が特定の濃度範囲でＨＤＡＣ阻害剤に抵抗性の細胞に対しても強い殺細胞効果を発揮することを見出した。そして、その細胞死がアポトーシスであること、さらに、そのアポトーシスが、デプシペプチド類化合物のＨＤＡＣ／ＰＩ３Ｋ二重阻害活性により誘導されることを確認し、本発明を完成した。

したがって、本発明によれば、
〔１〕 以下の式１で示されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩からなるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤
式１

（式中、Ａは、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＨ（ＯＨ）−を表し、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基、置換もしくは無置換のアリール基又は置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。）；
〔２〕 式１において、Ｒ³が水素原子である、前記〔１〕記載のＰＩ３Ｋ阻害剤；
〔３〕 式１において、Ｒ¹が置換もしくは無置換のアラルキル基である、前記〔１〕又は〔２〕記載のＰＩ３Ｋ阻害剤；
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のＰＩ３Ｋ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、難治性がんの治療用医薬組成物；
〔５〕 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が体重１kgあたり約１mg/日〜１０，０００mg/日の投与用量で投与されることを特徴とする、前記〔４〕記載の難治性がんの治療用医薬組成物；
〔６〕 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、以下の式２〜２０のいずれかで示されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩である、前記〔４〕又は〔５〕記載の難治性がんの治療用医薬組成物
式２

式３

式４

式５

式６

式７

式８

式９

式１０

式１１

式１２

式１３

式１４

式１５

式１６

式１７

式１８

式１９

式２０

〔７〕 以下の式１で示されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩
式１

（式中、Ａは、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＨ（ＯＨ）−を表し、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基、置換もしくは無置換のアリール基又は置換もしくは無置換のアラルキル基を表す；但し、Ａ、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³の組合せが、Ａ＝−ＣＯＮＨ−かつＲ¹＝エチリデン基かつＲ²＝Ｒ³＝イソプロピル基、Ａ＝−ＣＨ（ＯＨ）− かつＲ¹＝イソプロピル基かつＲ²＝メチル基かつＲ³＝水素原子、Ａ＝−ＣＨ（ＯＨ）− かつＲ¹＝sec-ブチル基かつＲ²＝メチル基かつＲ³＝水素原子、Ａ＝−ＣＨ（ＯＨ）− かつＲ¹＝Ｒ²＝イソプロピル基かつＲ³＝水素原子、Ａ＝−ＣＯＮＨ− かつＲ¹＝エチリデン基かつＲ²＝イソプロピル基かつＲ³＝水素原子、Ａ＝−ＣＯＮＨ− かつＲ¹＝Ｒ³＝水素原子かつＲ²＝イソプロピル基、Ａ＝−ＣＯＮＨ− かつＲ¹＝メチル基かつＲ²＝イソプロピル基かつＲ³＝水素原子、及び、Ａ＝−ＣＯＮＨ− かつＲ¹＝ベンジル基かつＲ²＝イソプロピル基かつＲ³＝水素原子、のいずれかである化合物を除く）；
が提供される。

本発明によれば、新規なＰＩ３Ｋ阻害剤が提供される。この新規なＰＩ３Ｋ阻害剤は、従来公知のＰＩ３Ｋ阻害剤とは全く異なる構造を有する化合物である。本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＨＤＡＣ阻害活性をも有し、ＨＤＡＣ阻害剤としても作用しうるが、特定の濃度で用いた場合には、ＨＤＡＣ阻害剤抵抗性のがん細胞に対しても、アポトーシスを誘導することにより殺細胞活性を発揮する。したがって、本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＨＤＡＣ阻害剤を含む従来の抗がん剤には耐性のがん細胞に対して有効な医薬組成物を提供することができる。
本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＨＤＡＣ阻害活性のほか、他のキナーゼをも阻害する可能性を有していることが見出され、がん細胞を制御する上で有利に働くことが推測される多分子標的の薬剤である可能性がある。
また、本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、がん特異的に作用する分子標的薬として使用されるものであるから、がん細胞以外の細胞や組織に与える影響は比較的少ないと考えられ、実際、ＦＫ２２８については、長期投与によっても何ら副作用を生じない例や、何らかの副作用を生じた場合であっても比較的軽く、これを抑える薬剤との併用によって抑えることが可能であることがわかっている。ＦＫ２２８の類縁体については、後述するようにＦＫ２２８よりも副作用が低いと考えられ、したがって、本発明の医薬組成物は、生体に対して高用量で使用しても重篤な副作用が起こる可能性が低い。

図１は、本発明の化合物の合成経路を表す図である。「Ｂｏｃ」＝tert−ブトキシカルボニル（tert-butoxycarbonyl）、「ＴＢＳ」＝tert−ブチルジメチルシリル（tert-butyldimethylsilyl）、「Ｔｒ」＝トリチル（trityl）、「ＰＭＢ」＝ｐ−メトキシベンジル（p-methoxybenzyl）をそれぞれ表す。 図２Ａは、ＦＫ２２８及びその類縁体のＰＩ３Ｋ阻害活性の測定を表す図である。２０μMでのＦＫ２２８及びその類縁体（ＳＰ−１、ＳＰ−２、ＳＰ−３、ＳＰ−５、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ１、ＦＫ−Ａ２、ＦＫ−Ａ３、ＦＫ−Ａ４、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ−Ａ６）のＰＩ３Ｋ阻害活性を、ＰＩ３Ｋ活性の阻害率として示す。 図２Ｂは、同様に測定したＬＹ２９４００２のＰＩ３Ｋ阻害曲線を示す。縦軸は、ＰＩ３Ｋ活性に対する阻害率を示す。 図２Ｃは、同様に測定したＦＫ２２８のＰＩ３Ｋ阻害曲線を示す。縦軸は、ＰＩ３Ｋ活性に対する阻害率を示す。 図２Ｄは、同様に測定したＦＫ−Ａ５のＰＩ３Ｋ阻害曲線を示す。縦軸は、ＰＩ３Ｋ活性に対する阻害率を示す。 図２Ｅは、異なるＡＴＰ濃度条件下で同様に測定したＦＫ２２８のＰＩ３Ｋ阻害曲線を示す。縦軸は、ＰＩ３Ｋ活性に対する阻害率を示す。実線はＡＴＰ濃度５０μM、点線はＡＴＰ濃度５００μMでの結果を示す。 図３は、ウェスタンブロッティングによるＡＫＴ経路の抑制の評価を表す図である。 パネルＡは、化合物処理の時間経過によるリン酸化ＡＫＴの変化を表す。ＰＣ３細胞にそれぞれ１０μMのＬＹ２９４００２、ＦＫ２２８又はＦＫ−Ａ５を、５分、３０分又は１８０分作用させ、細胞を回収してウェスタンブロッティングによりリン酸化（ｐ−）ＡＫＴ及びＡＫＴを検出した結果を表す。 パネルＢは、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５の濃度変化によるＡＫＴ経路の抑制を表す。ＰＣ３細胞を、図に示した濃度（μM）のＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５で１８０分処理し、回収したサンプルを用いて、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３、Ｔｈｒ−３０８）及びＡＫＴ、リン酸化ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ−９）、リン酸化ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ−２４４８）、リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ−３８９）、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ−３７／４６）、リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ−２１７／２２１）、リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ−２０２／Ｔｙｒ−２０４）の発現レベルを検出したウェスタンブロット解析の結果である。 図４Ａは、ＨＣＴ１１６細胞、ＲＫＯ細胞、ＣＯ１１５細胞におけるＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ１の発現をウェスタンブロットにて確認した結果を表す図である。 図４Ｂは、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の殺細胞効果の評価を表す図である。ＬＹ２９４００２（５０μM）、ＳＡＨＡ（２．５μM）、同濃度のＬＹ２９４００２（５０μM）及びＳＡＨＡ（２．５μM）の併用（ＳＡＨＡ＋ＬＹ）、及び図に示した濃度のＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ２２８又はＦＫ−Ａ５とＬＹ２９４００２との併用の存在下で２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイを行い、生細胞数を測定することにより殺細胞効果を検討した結果である。グラフの縦軸はＤＭＳＯ添加時の吸光度に対する比を示す。 図４Ｃは、図４Ｂと同様に測定した、ＲＫＯ細胞におけるＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の殺細胞効果の評価を表す図である。 図４Ｄは、図４Ａと同様に測定した、ＣＯ１１５細胞におけるＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の殺細胞効果の評価を表す図である。 図５Ａは、図に示した濃度のＦＫ２２８又ＦＫ２２８及びＬＹ２９４００２（５０μM）の存在下で２４時間培養したＨＣＴ１１６細胞についてのＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。上段は、比較のための５０μM ＬＹ２９４００２、２．５μM ＳＡＨＡ、同濃度のＬＹ２９４００２（５０μM）及びＳＡＨＡ（２．５μM）で同様に処理した結果である。 図５Ｂは、ＦＫ２２８の代わりにＦＫ−Ａ５を用いて図５Ａと同様に行った解析の結果を示す図である。 図５Ｃは、ＦＫ−Ａ５についての図５Ｂの結果を解析し、Ｇ２／Ｍ、Ｓ、Ｇ１／Ｇ０、ｓｕｂＧ１分画のパーセンテージを算出した結果を示す図である。 図５Ｄは、ＨＣＴ１１６細胞を図に示した濃度のＳＡＨＡ、ＦＫ−２２８で２４時間処理し、ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ、アセチル化ヒストンＨ３、アセチル化ヒストンＨ４の発現についてウェスタンブロット解析を行った結果を表す図である。 図６は、図３パネルＢに示した実験と同様にして行ったウェスタンブロッティングによるＡＫＴ経路の抑制の評価を表す図である。 左から、ＦＫ−Ａ１１、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ２２８の濃度変化によるＡＫＴ経路の抑制を表す。ＰＣ３細胞を、図に示した濃度（μM）の各化合物で１８０分処理し、回収したサンプルを用いて、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３、Ｔｈｒ−３０８）及びＡＫＴの発現レベルを検出したウェスタンブロット解析の結果である。 図７Ａは、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。ＬＹ２９４００２（「ＬＹ」；５０μM）、ＳＡＨＡ（２．５μM）、同濃度のＬＹ２９４００２（５０μM）及びＳＡＨＡ（２．５μM）の併用（ＳＡＨＡ＋ＬＹ）、及び図に示した濃度のＦＫ−Ａ１１の存在下で２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイを行い、生細胞数を測定することにより殺細胞効果を検討した結果である。グラフの縦軸はＤＭＳＯ添加時の吸光度に対する比を示す。 図７Ｂは、図７Ａと同様に測定した、ＲＫＯ細胞におけるＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。 図７Ｃは、図７Ａと同様に測定した、ＣＯ１１５細胞におけるＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。 図７Ｄは、図７Ａと同様に測定した、正常細胞ＫＭＳＴ６細胞（非腫瘍性、線維芽細胞）におけるＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。 図８Ａは、図７Ａと同様に測定した、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＫ２２８、ＦＫ−５、ＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の比較を表す図である。横線を付したバーはコントロール（ＤＭＳＯ、ＳＡＨＡ、ＬＹ、又はＳＡＨＡ+ＬＹ）、斜線を付したバーはＦＫ２２８、黒塗りのバーはＦＫ−５、白塗りのバーはＦＫ−Ａ１１をそれぞれ示す。 図８Ｂは、図７Ａと同様に測定した、ＲＫＯ細胞におけるＦＫ２２８、ＦＫ−５、ＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。横線を付したバーはコントロール（ＤＭＳＯ、ＳＡＨＡ、ＬＹ、又はＳＡＨＡ+ＬＹ）、斜線を付したバーはＦＫ２２８、黒塗りのバーはＦＫ−５、白塗りのバーはＦＫ−Ａ１１をそれぞれ示す。 図８Ｃは、図７Ａと同様に測定した、ＣＯ１１５細胞におけるＦＫ２２８、ＦＫ−５、ＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価を表す図である。横線を付したバーはコントロール（ＤＭＳＯ、ＳＡＨＡ、ＬＹ、又はＳＡＨＡ+ＬＹ）、斜線を付したバーはＦＫ２２８、黒塗りのバーはＦＫ−５、白塗りのバーはＦＫ−Ａ１１をそれぞれ示す。

本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、以下の式１で表されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩からなることを特徴とする。

式１

（式中、Ａは、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＨ（ＯＨ）−を表し、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基、置換もしくは無置換のアリール基又は置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。）

好ましくは、Ｒ¹は水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基又は置換もしくは無置換のアラルキル基であり、Ｒ²は低級アルキル基であり、Ｒ³は水素原子又は低級アルキル基である。本発明において、「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｉ‐プロピル、シクロプロピル、ｎ‐ブチル、ｓ‐ブチル、ｔ‐ブチル、シクロブチル、ｎ‐ペンチル、ｉ‐ペンチル、２‐メチルブチル、シクロペンチル、ｎ‐ヘキシル、シクロヘキシル等の直鎖もしくは分枝した炭素数１〜６のアルキル基が挙げられる。「低級アルキリデン基」としては、メチレン、エチリデン、プロピリデン、シクロプロピリデン、ブチリデン、ペンチリデン、ヘキシリデン等の直鎖もしくは分枝した炭素数１〜Ｃ６のアルキリデン基が挙げられる。「アリール基」としては、フェニル、ナフチル、ピリジニル、フラニル等が挙げられ、その置換基としては水酸基、保護基で保護された水酸基、アミノ基及び保護基で保護されたアミノ基等が挙げられる。「アラルキル基」としては、ベンジル、１‐フェニルエチル、ナフチルメチル、ピリジニルメチル等が挙げられ、その置換基としては水酸基、保護基で保護された水酸基、アミノ基及び保護基で保護されたアミノ基等が挙げられる。

特に好ましい化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
ＦＫ２２８

ＳＰ−１

ＳＰ−２

ＳＰ−３

ＳＰ−５

ＦＫ−Ａ１

ＦＫ−Ａ２

ＦＫ−Ａ３

ＦＫ−Ａ４

ＦＫ−Ａ５

ＦＫ−Ａ６

ＦＫ−Ａ７

ＦＫ−Ａ８

ＦＫ−Ａ９

ＦＫ−Ａ１０

ＦＫ−Ａ１１

ＦＫ−Ａ１２

ＦＫ−Ａ１３

ＦＫ−Ａ１７

Ｒ³が水素原子のもの、及び／又はＲ¹が置換もしくは無置換のアラルキル基のものがさらに好ましい。

また、本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤において、生理学的に許容可能な塩としては、具体的には、例えば、無機塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩；カルシウム塩、マグネシウム塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩；アンモニウム塩等）をはじめとして、各種の有機塩、ハロゲン化水素酸塩、無機酸塩、有機酸塩及びアミノ酸塩等が挙げられる。

本発明においては、これらのデプシペプチド類化合物又は塩の１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。

本発明に係るデプシペプチド類化合物、すなわちＦＫ２２８及び類縁体の製造方法は、公知である。ＦＫ２２８は、微生物によって産生された天然物を単離精製して得てもよく、従来公知の方法で半合成又は全合成により製造してもよい。具体的には、本発明の化合物の合成については、例えば、Narita et al. Chemistry-A European Journal 15, 11174-11186 (2009)（非特許文献２２）；Takizawa et al. Chemical Communication, 1677-1679 (2008) （非特許文献２３）; Takizawa et al. Heterocycles 76, 275-290 (2008) （非特許文献２４）に記載された方法にしたがって行うことができる。

本発明の医薬組成物が治療する対象のがんは、ＦＫ２２８について有効性が知られている各種のがんであり、中でも特に難治性のがんである。具体的には、皮膚がん、中皮腫、肺がん、胃がん、肝がん、大腸がん、乳がん、食道がん、膵臓がん、子宮がん（頚がん、内膜がん）、卵巣がん、皮膚がん、泌尿器がん、頭頚部がん、原発不明がん、造血器腫瘍(白血病、リンパ腫）、骨軟部肉腫等のがんであって、他の治療による効果が認められない又は低いものが挙げられる。さらに、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に高頻度で変異が報告されている、乳がん、子宮内膜がん、泌尿器がん、大腸がん、卵巣がん、頭頚部がん、肺がん等（非特許文献３）には、特に本薬剤の有効性が期待される。

本発明の医薬組成物は、本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤と製薬業界で公知の種々の添加剤等とを用いて、当該技術分野で公知の方法により適宜製造することができる。

本発明の医薬組成物の投与経路は、公知の経路、例えば経口、経鼻、舌下、点眼、経皮、注射、経腸、直腸内等から任意の経路を選択することができる。好ましくは経口又は注射である。

したがって、本発明の医薬組成物は、経口剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤等）、注射剤のほか、座剤、貼付剤、点滴剤、含嗽剤、点眼剤、トローチ等の剤型で使用に供することができる。このような各種製剤の製造方法は、当業者には充分公知である。

所望の剤型に応じて、添加剤として、製薬業界において使用されている各種の賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、香料等を、適宜本発明の医薬組成物の製造において用いることができる。

さらに、本発明の医薬組成物には、公知の他の薬学的有効成分をも含有させることができる。例えば、制吐剤、消化剤、及び他の抗がん剤等が挙げられる。

さらに、本発明の医薬組成物は、公知のドラッグデリバリーシステムと組み合わせることができる。例えば、リポソーム、無機ナノ粒子、無機−有機ハイブリッドナノ粒子、インプラント等が挙げられる。

これらの他の有効成分をさらに含有させることによって、あるいは本発明の医薬組成物を他の薬剤と組み合わせて使用することによって、一層の治療効果を期待できる。

本発明の医薬組成物の投与量及び投与剤型は、個別に、治療対象のがん、投与方法、投与される患者の年齢、体重、病態等に応じて定めることができる。
一般的には、有効成分として体重１kgあたり約１mg/日〜１０，０００mg/日、より好ましくは約１０mg/日〜約５，０００mg/日、さらに好ましくは約２０mg/日〜約５，０００mg/日、最も好ましくは約５０mg/日〜約５，０００mg/日を１日１回あるいは１日２〜３回に分割して、本発明の医薬組成物による治療が必要とされている患者に投与することができる。

１．出芽酵母によるＰＩ３Ｋ阻害剤スクリーニング
本発明において用いたスクリーニング系は、出芽酵母にヒトのｐ１１０αを発現させることにより生じる細胞増殖障害に基づいており、基本的に、Rodriguez-Escuderoらの方法（非特許文献１９：Biochemical Journal 390, 613 (2005)）に記載された方法にしたがってスクリーニングを行った。ただし、このスクリーニングにおいては、出芽酵母として、一般的に使用されている野生型株ＹＰＨ４９９の代わりに、７つのＡＢＣトランスポーター遺伝子及びＡＢＣトランスポーターの活性化に関与する２つの転写因子の遺伝子をノックアウトした薬剤感受性株ＡＤ１−９（MAT alpha, yor1, snq2, pdr5, pdr10, pdr11, ycf1, pdr3, pdr15, pdr1, his1, ura3）を用いた（非特許文献２５：Rogers et al. J. of Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 207-214 (2001)）。ＡＤ１−９株は、Nader Nourizad（Stanford Genome Technology Center Stanford University, CA, USA）より入手可能である。

本発明者らは、ＡＤ１−９に栄養要求性のマーカーを追加するため、ｈｉｓＧ−Ｕｒａ３−ｈｉｓＧカセットを使った手法（非特許文献２６：Alani et al., Genetics 116, 541 (1987)）で、ＬＥＵ２遺伝子破壊ＡＤ１−９株を作製して用いた。

形質転換したＡＤ１−９株は、ウラシル及びロイシン不含最少完全培地ＳＣ−Ｕ−Ｌ又は２％グルコースを２％ガラクトースで置き換えたＳＧａｌ−Ｕ−Ｌにて３０℃で培養した。

これらの酵母株について、公知のＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（Cayman Chemical Companyより購入）に対する感受性の違いを評価したところ、細胞増殖障害の回復が、ＹＰＨ４９９においてはＬＹ２９４００２濃度５０μMでみられるのに対して、スクリーニングに使用したＡＤ１−９では５μMでみられた。すなわち、スクリーニングに使用したＡＤ１−９は、ＹＰＨ４９９に比べ、ＬＹ２９４００２に対して約１０倍感受性が高いことが確認された。

上記の系を用いて、文部科学省がん特定領域研究・統合がん化学療法基盤情報支援班より供与を受けた化合物ライブラリーのスクリーニングを行った。各化合物を、濃度が０．５μM、５μMになるようにＳＧａｌ−Ｕ−Ｌ液体培地に添加し、ＡＤ１−９の形質転換体を２４時間振盪培養し、Ａ₆₀₀を測定した。コントロールとしてＤＭＳＯ、ＬＹ２９４００２を同様のスクリーニングに供した。独立した３回の繰り返し実験を行い、Ａ₆₀₀の平均値を算出し、その値の降順に羅列し、上位となった化合物を、ｐ１１０αによる細胞増殖障害を回復させる化合物として選択した。

０．５μMの化合物濃度では、ＤＭＳＯよりもＡ₆₀₀が高値になる化合物は認められなかった。５μMの濃度では、いくつかの化合物でＬＹ２９４００２と同程度の細胞増殖障害の回復が認められた。表１に、各化合物のライブラリー内でのＩＤ、化合物名、Ａ₆₀₀値を表す。

表１： 化合物ライブラリーのスクリーニング結果

ｐ１１０αを発現させた形質転換体においてＡ₆₀₀が高値となった上位の化合物は、いずれも、ＦＫ２２８及びその類縁体であった。

本スクリーニングにおいてＰＩ３Ｋ阻害活性をもつ可能性が示唆されたＦＫ２２８及びその類縁体の構造式、及び文部科学省がん特定領域研究・統合がん化学療法基盤情報支援班により評価されたＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ６に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を表２に示す。

表２： ＦＫ２２８及びその類縁体の構造式及びＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ６に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）

ＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ６に対するＩＣ₅₀の比は、心臓に対する影響を起こすリスクと関連があると考えられている。いずれの類縁体も、ＦＫ２２８と比較して、そのようなリスクが低いことが期待される。

２．デプシペプチド類化合物の合成
その後の実験に使用したＦＫ２２８及びＦＫ２２８類縁体は、全て、本発明者の東北薬科大学医薬合成教室の加藤正教授のグループによって公知の技術にしたがって合成されたものをＤＭＳＯに溶解して用いた。
各化合物の合成経路及び詳しい合成方法は、図１及びNarita et al. Chemistry-A European Journal 15, 11174-11186 (2009)（非特許文献２２）；Takizawa et al. Chemical Communication, 1677-1679 (2008) （非特許文献２３）; Takizawa et al. Heterocycles 76, 275-290 (2008) （非特許文献２４）に記載のとおりである。

図１を参照して説明すると、まず、段階（Ａ）において、側鎖Ｒ¹を有するアルデヒド誘導体に酢酸エチルを反応させて、付加体を得た。段階（Ｂ）において、その付加体の水酸基の保護、アミノ基の脱保護及びエステル交換を順次行い、アミノエステル誘導体を生じさせた。段階（Ｃ）において、そのアミノエステル誘導体とシステインから調製したカルボン酸誘導体を縮合させて、ペプチド誘導体（I）を得た。
段階（Ｄ）において、文献既知のカルボン酸誘導体と側鎖Ｒ²を有するアミノ酸エステル誘導体を縮合させて、ペプチド誘導体（II）を得た。
段階（Ｅ）において、上記で得られた２種類のペプチド誘導体（I）及び（II）を縮合させて、トリペプチド誘導体を得た。段階（Ｆ）において、分子内ラクトン化、ジスルフィド結合形成、水酸基の脱保護を順次行い、デプシペプチド類化合物の合成を行った。
一方、段階（Ｇ）において、従来の経路を用いて調製可能な側鎖Ｒ¹及びＲ³を有するトリペプチド誘導体とカルボン酸誘導体（II）を縮合させて、テトラペプチド誘導体を生じさせた。段階（Ｈ）において、分子内ラクトン化、ジスルフィド結合形成、水酸基の脱保護を順次行い、デプシペプチド類化合物の合成を完了した。

３．ＦＫ２２８及び類縁体のインビトロでのＰＩ３Ｋ阻害活性の評価
ＦＫ２２８、ＳＰ−１、ＳＰ−２、ＳＰ−３、ＦＫ−Ａ１、ＦＫ−Ａ２、ＦＫ−Ａ３、ＦＫ−Ａ４、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ−Ａ６及びＳＰ−５の計１１種類の化合物について、２０μMの濃度におけるＰＩ３Ｋ阻害活性の評価を行った。

ＰＩ３Ｋ（ｐ１１０α／ｐ８５α）阻害活性は、カルナバイオサイエンス社（神戸）に委託し、基質とリン酸化基質をキャピラリー中の移動度で分離・定量するモビリティ シフト アッセイ法で評価した（https://www.carnabio.com/japanese/product/search.cgi?mode=profiling）。各化合物を、２１nM ＰＩ３Ｋ、１０００nM ホスファチジルイノシトール、５０μM ＡＴＰ、５mM ＭｇＣｌ₂とともにアッセイバッファー（２０mM ＨＥＰＥＳ,２mM ＤＴＴ,２５μMコール酸ナトリウム（sodium cholate）、７５mM ＮａＣｌ、２０μM カンタリジン（cantharidine））に混和し、室温で５時間反応させた後、モビリティ シフト アッセイを行った。試験は２回繰り返して行った。
阻害率は、以下のようにして計算した：
コントロールとして、キナーゼ反応をＭＳＡ（モビリティ シフト アッセイ）で算出された産生物／基質＋産生物の値で評価し、それを０％阻害率とした。そこに薬剤が添加された場合の産生物／基質＋産生物の値を同様に算出し、コントロール値との差から阻害率を算出した。

その結果を図２Ａに表す。いずれの化合物についてもＰＩ３Ｋに対する直接阻害活性が認められた。その中で、ＳＰ−５、ＦＫ−Ａ１、ＦＫ−Ａ２、ＦＫ−Ａ３、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ−Ａ６については、ＦＫ２２８よりも高い阻害率が示され、最も強い阻害活性が認められたＦＫ−Ａ５では、６６．８％のＰＩ３Ｋ活性阻害率であった。

次に、最も阻害活性の強かったＦＫ−Ａ５及び元の化合物であるＦＫ２２８について、ＰＩ３Ｋに対する５０％阻害濃度(ＩＣ₅₀)を測定し、ＬＹ２９４００２と比較した。結果を図２Ｂ、Ｃ及びＤに示す。

ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５は、濃度依存性にＰＩ３Ｋ活性を阻害した。ＬＹ２９４００２、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５のＩＣ₅₀は、それぞれ０．７μM、５７．１μM、２６．２μMであった。ＦＫ２２８は５〜５００μM、ＦＫ−Ａ５は１〜３００μMの範囲で阻害活性が観察された。また、ＦＫ−Ａ５の方がＦＫ２２８よりも強くＰＩ３Ｋを阻害することがわかった。
なお、ＦＫ２２８のＰＩ３Ｋの阻害曲線において１０μMでの阻害率は６．５％であった（図２Ｃ）。

これらの結果から、類縁体の間でその阻害活性に差があるものの、ＦＫ２２８及びそのすべての類縁体について、ＰＩ３Ｋ阻害活性が示された。

上記のとおり、ＦＫ２２８及びその類縁体において、最もＰＩ３Ｋ阻害活性が強かったのがＦＫ−Ａ５、次がＦＫ−Ａ６であった（図２Ｂ）。ＦＫ−Ａ５とＦＫ−Ａ６とは立体異性体であり、７位にベンジル（フェニルメチル）基が付いている特徴的な構造をもつ（表２）。この特徴が、ＦＫ２２８と比べ、ＦＫ−Ａ５とＦＫ−Ａ６とが高い阻害活性をもたらすことに寄与している可能性がある。

４．ＰＩ３Ｋ−ＦＫ２２８ドッキングシュミレーション
従来のＰＩ３Ｋ阻害剤は、すべてｐ１１０触媒サブユニットのＡＴＰ結合部位に結合するとされている（非特許文献２７：Walker et al. Molecular Cell 6, 909-919 (2000)）。ＦＫ２２８も同じようにＡＴＰ結合部位に結合するかを検証した。

ドッキングシュミレーションは、シュミレーションソフトウェアとして商品名「ｅＨｉＴＳ」（Simulated Biomolecular Systems）を用い、鋳型となるＰＩ３Ｋの立体構造としてＰＩ３Ｋ（ｐ１１０αＨ１０４７Ｒ／ｐ８５α）−ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎの複合体の結晶構造データ（Protein Data Bank Identification Code: 3HHM）を利用して行われた。ＦＫ２２８は、細胞内に取り込まれた後、細胞内の還元作用によりジスルフィド結合が切断され、その結果生成したチオール基がＨＤＡＣの活性中心の亜鉛と配位してＨＤＡＣ阻害作用を発揮することが明らかにされている（非特許文献１２：Furumai et al. Cancer Res 62, 4916 (2002)）。したがって、細胞内でＰＩ３Ｋを阻害する場合においてもＦＫ２２８は還元型であると予測し、ＰＩ３Ｋとのドッキングモデルにおいても還元型のＦＫ２２８の構造を用いた。ドッキングモデルは候補モデルのうち、ソフトウエア上で構造の妥当性を評価するスコアが最も高いものを採用した。

その結果、還元型のＦＫ２２８は、ｐ１１０αのＡＴＰ結合部位に深く入りこみ、チオールやイソプロピルをポケットの奥に差し込む形で結合するものと予測された。
このことは、上記３．に記載した実験において、異なるＡＴＰ濃度条件下（５０μM及び５００μM）でＦＫ２２８のＰＩ３Ｋ阻害活性を測定することにより確認された。結果を図２Ｅに示す。ＦＫ２２８のＰＩ３Ｋ阻害活性は、高濃度のＡＴＰ存在下で低減した。標準的ＡＴＰ濃度（５０μM）及び高ＡＴＰ濃度（５００μM）でのＩＣ５０値は、それぞれ５７．２μM及び１２５．０μMであった。これらの結果は、ＦＫ２２８がＡＴＰ競合的なＰＩ３Ｋ阻害剤であること、すなわちＡＴＰ結合部位に結合することを示唆する。

５．ウェスタンブロッティングによるＡＫＴ経路の抑制の評価
ＰＴＥＮが欠失しており、ＰＩ３Ｋの下流のＡＫＴが恒常的に活性化しているＰＣ３（前立腺がん）細胞を用いて（非特許文献２８：Grunwald et al. Cancer Res 62, 6141 (2002)）、ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５によるＡＫＴのリン酸化の抑制を評価した。

ＰＣ３細胞は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手した。細胞は、非働化したウシ胎児血清を１０％の濃度で含んだＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で培養した。

ウェスタンブロッティングは、以下のようにして行った。各化合物で処理を行った各種の細胞を回収後、リシスバッファー（Lysis buffer： ５００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．５、１００mM ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ、１mM オルトバナジン酸ナトリウム（sodium orthovanadate）、１％ ＮＰ−４０、 １％プロテアーゼインヒビターカクテル（Protease Inhibitor cocktail、SIGMA-ALDRICH社製)で溶解し、遠心後上清を回収した。サンプルを１２．５％のポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-FL, millipore）に転写した。

一次抗体として以下のものを用いた。抗ＡＫＴ抗体（「ｔｏｔａｌ ＡＫＴ」又は「ＡＫＴ」）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３）抗体（「ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）」）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｔｈｒ−３０８）抗体（「ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）」）、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ−９）抗体（「ｐ−ＧＳＫ−３β」）、抗リン酸化ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ−２４４８）抗体（「ｐ−ｍＴＯＲ」）、抗リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ−３８９）抗体（「ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ」）、抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ−３７／４６）抗体（「ｐ−４ＥＢＰ１」）、抗リン酸化ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ−２１７／２２１）抗体（「ｐ−ＭＥＫ１／２」）、抗リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ−２０２／Ｔｙｒ−２０４）抗体（「ｐ−ＥＲＫ１／２」）（以上、すべてポリクローナル抗体、Cell Signaling Technology）、抗β−アクチンモノクローナル抗体（Sigma Aldrich）。
二次抗体としては、商品名「Alexa Fluor680IgG」（Invitrogen）を用いた。商品名「Odyssey Infrared Imaging system」（LI-COR）を用いて目的とするタンパク質の発現を検出した。

まず、化合物を作用させてからの時間経過によるリン酸化ＡＫＴの変化を検討した。結果を図３、パネルＡに示す。
ＬＹ２９４００２と同様に、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５ともに５分から１８０分という短時間で、全ＡＫＴの発現レベルは変化させずに、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３、Ｔｈｒ−３０８）の発現レベルを減少させた。

次に、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５の濃度の変化によるＡＫＴ及びＡＫＴ経路の下流分子のリン酸化の変化を検討した。化合物の作用時間は１８０分とした。結果を図３、パネルＢに示す。

ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５ともに、濃度依存的にリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３、Ｔｈｒ−３０８）、さらにそのシグナル伝達経路の下流の、リン酸化ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ−９）、リン酸化ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ−２４４８）、リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ−３８９）、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ−３７／４６）の発現レベルを抑制した。また、ＲＡＳ−ＭＡＰ経路のリン酸化ＭＥＫ１／２は抑制されなかったが、リン酸化ＥＲＫ１／２はやや抑制された。

また、この結果においては、１０μMの濃度で、リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３）、（Ｔ３０８）の発現レベルは、コントロールと比べてそれぞれ６６％又は８６％減少している。これは、図２Ａのデータが過小評価されている可能性があることを示すものである。すなわち、インビトロのＰＩ３Ｋ阻害活性の評価系においては、還元剤を含んでいたものの、細胞内での還元力には及ばず、活性をもつ還元型ＦＫ２２８の割合が少なかった可能性が考えられる。

以上から、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５がＰＩ３Ｋの阻害を介してＡＫＴ経路を抑制することが示された。また、リン酸化ＥＲＫ１／２を阻害することから、これらの化合物が、ＰＩ３Ｋ以外に、他のキナーゼに対する阻害活性をも有するか、又は他のタンパク質の作用を介してＥＲＫ１／２を阻害する可能性が示唆された。

６．ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の殺細胞効果の評価
ＦＫ２２８は、ＨＤＡＣ１に対して１．６〜３．６nMのＩＣ₅₀をもつ強力なＨＤＡＣ阻害剤であり（非特許文献１２：Furumai et al. Cancer Res 62, 4916 (2002)；非特許文献２２：Narita et al. Chemistry-A European Journal 15, 11174-11186 (2009)）、多くのヒトがん細胞株に対してnMの範囲で５０％成長阻害を発揮することが示されている。ここまでの実験結果より、ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５がＰＩ３Ｋ阻害活性を示すのはμMの範囲であるため、ＨＤＡＣ阻害剤に抵抗性の細胞を用いてＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の殺細胞効果を検討した。

用いたヒト培養細胞は、大腸がん（ＨＣＴ１１６、ＣＯ１１５、ＲＫＯ）の細胞株であった。ＨＣＴ１１６及びＲＫＯは、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より、それぞれ入手した。ＣＯ１１５は、John M. Mariadason（Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australia）より入手した。細胞は、非働化したウシ胎児血清を１０％の濃度で含んだＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で培養した。

ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＣＯ１１５はいずれもマイクロサテライト不安定性（microsatellite instability；ＭＳＩ）陽性の細胞であり、ＨＣＴ１１６はＨＤＡＣ阻害剤感受性であるが、ＲＫＯ及びＣＯ１１５はＨＤＡＣ阻害剤に抵抗性である。ＲＫＯ及びＣＯ１１５については、ＨＤＡＣ２両対立遺伝子のエクソン１にあるＡ₉（アデニンの９回繰り返し）配列にフレームシフト変異が生じた結果、ＨＤＡＣ２タンパクが欠失しており、ＨＤＡＣ２の機能喪失によってアポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（apoptotic protease-activating factor 1；ＡＰＡＦ１）発現レベルの上昇がもたらされ、それによりアポトーシス制御異常が生じるため、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ、ＳＡＨＡに抵抗性になっていることが報告されている（非特許文献２９：Ropero et al. Nature 200, 6；非特許文献３０：Hanigan et al. Gastroenterology 135, 1654-1664. e1652 (2008)）。そこで、まず、ウェスタンブロットによってこれらの細胞におけるＨＤＡＣの発現レベルを確認した。

一次抗体として抗ＨＤＡＣ２モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology）（「ＨＤＡＣ２」）又は抗ＨＤＡＣ１ポリクローナル抗体（Santa Cruz）（「ＨＤＡＣ１」）を使用したこと以外は、基本的に上記と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。

その結果を図４Ａに示す。従来の報告と異なり、ＲＫＯ、ＣＯ１１５においてもＨＤＡＣ２の弱い発現が認められた。ＲＫＯについては、ＨＤＡＣ２の発現にバリエーションがあることが報告されている（非特許文献３１：Ree et al., Nature Genetics 40, 812-813 (2008)）。ＨＤＡＣ１はいずれの細胞においても発現が認められたが、ＣＯ１１５での発現レベルはやや低かった。

次に、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＣＯ１１５細胞を用いて、ＭＴＴアッセイにより殺細胞効果を検討した。

各種の細胞を８×１０³ cells/wellの密度で９６穴プレートに播き、２４時間の前培養の後、ＬＹ２９４００２（５０μM）、ＳＡＨＡ（Cayman Chemical Companyより購入；２．５μM）、ＬＹ２９４００２（５０μM）＋ＳＡＨＡ（２．５μM）の併用、ＦＫ２２８又はＦＫ−Ａ５（それぞれ５nM、５０nM、５００nM、５μM又は５０μM）、ＦＫ２２８又はＦＫ−Ａ５（それぞれ５nM、５０nM又は５００nM）＋ＬＹ２９４００２（５０μM）の併用を含んだ培地に置き換えてさらに培養した。

２４時間後に商品名「Cell counting kit-8」（同仁化学研究所）を用いて生細胞数を評価した。このキットは、水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色試薬として用いており、ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素によりホルマザンを生じる。ホルマザン色素量と生細胞数は比例関係にあり、ホルマザンの４５０nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（商品名「SpectraMax M2e」、Molecular devices）で測定し、生細胞数を計測した。

結果を図４Ｂ，Ｃ及びＤに示す。
ＨＤＡＣ阻害剤に感受性であるＨＣＴ１１６細胞では、ＳＡＨＡ、低濃度（５nM〜５００nM程度のレベル）のＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５により約５０％（４３〜７０％）の細胞死を生じた。これに対し、ＲＫＯ、ＣＯ１１５細胞においては、ＨＤＡＣ２の弱発現が認められたものの、ＳＡＨＡ、５０nM程度までのＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５に対して抵抗性（６〜１５％の細胞死）であった。ＬＹ２９４００２に対してはいずれの細胞も感受性（５０〜６０％の細胞死）であったが、ＳＡＨＡとＬＹ２９４００２との併用に対しては、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯでは殺細胞効果の増強（相加効果）が認められた一方、ＣＯ１１５の場合は増強が認められなかった。
ＰＩ３Ｋ阻害活性が発揮される高濃度（μMレベル）のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５は、いずれの細胞においても極めて強く細胞数を減少させた。

また、低濃度のＦＫ２２８又はＦＫ−Ａ５とＬＹ２９４００２との併用については、ＲＫＯ及びＣＯ１１５細胞では相乗効果が認められたが、高濃度（５μM）の単独のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５よりは低い殺細胞効果であった（図４Ｂ）。

これらの結果から、ＨＤＡＣ阻害剤に抵抗性の細胞に対しても、高濃度（μMレベル）のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５は極めて強い殺細胞効果を示し、高濃度において発揮されるＰＩ３Ｋ阻害活性が殺細胞効果を増強している可能性が示唆された。

７．ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５による細胞死の解析及びアポトーシス誘導に関する評価
ＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５の投与による細胞死の特徴を解析するため、まず、細胞周期解析としてＦＡＣＳ解析(fluorescence-activated cell sorting analysis)を行った。
ＨＣＴ１１６細胞を６穴プレートに２×１０⁵個ずつ播き、２４時間の前培養後、各薬剤存在下でさらに２４時間培養し、ＳＡＨＡ、ＬＹ２９４００２、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５を上記６．に記載した実験と同条件で作用させた。細胞を回収し、エタノールで固定後、ヨウ化プロピジウム／ＰＢＳ溶液で染色し、商品名「Cytomics FC500 Flow Cytometry System」（Beckman Coulter）を用いて解析した。細胞周期分画は商品名「Multicycle software」（Phenomix Flow Systems）を用いて算出した。

結果を図５Ａ、Ｂ及びＣに示す。ＨＤＡＣ阻害剤は、ｐ２１^WAF1の発現の上昇を介して細胞周期停止を誘導するが（非特許文献３２：Xu et al. Oncogene 26, 5541-5552 (2007)）、ＨＤＡＣ阻害剤の濃度や細胞の種類の違いによりＧ１／Ｓ期とＧ２／Ｍ期のどちらを優位に停止させるかについてはさまざまな報告がある（非特許文献３３：Richon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 10014 (2000)；非特許文献３４：Nakajima et al. Exp. Cell Res. 241, 126-133 (1998); 非特許文献３５:Kumagai et al. Int. J. of Cancer 121, 656-665 (2007)）。

本実験においては、ＳＡＨＡはＨＣＴ１１６細胞に対して著明なＧ２／Ｍ期の停止を誘導した。低濃度のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５も、ＳＡＨＡと同様にＧ２／Ｍ期優位の細胞周期の停止を誘導した（図５Ａ〜Ｃ）。

一方、ＬＹ２９４００２については、Ｇ０／Ｇ１期の停止を引き起こし、アポトーシス誘導は弱いことが示されているが、本実験においてもＬＹ２９４００２はＨＣＴ１１６細胞に対してＧ０／Ｇ１期での停止を誘導した（図５Ａ〜Ｃ）。ＳＡＨＡ＋ＬＹ２９４００２の併用、低濃度のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５＋ＬＹ２９４００２の併用については、ｓｕｂＧ１分画が２０〜４０％と著明に増加し、強いアポトーシスが誘導された（図５Ａ〜Ｃ）。

これに対し、高濃度（５μM）のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５は、単独で強いアポトーシス（ｓｕｂＧ１分画３６〜３７％）を誘導し、ＤＮＡヒストグラムは、ＳＡＨＡ＋ＬＹ２９４００２の併用、低濃度のＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５＋ＬＹ２９４００２の併用の場合と類似の結果を示した（図５Ａ及びＢ）。細胞周期分画の解析においても、高濃度のＦＫ−Ａ５の場合は、ＳＡＨＡや低濃度のＦＫ−Ａ５＋ＬＹ２９４００２の併用の場合の分画と類似していた（図５Ｃ）。

以上から、高濃度（μMレベル）のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５が細胞周期に与える影響及び誘導されるアポトーシスは、ＨＤＡＣ阻害剤とＰＩ３Ｋ阻害剤とを併用した場合に類似することが示された。

また、ＦＫ２２８による細胞死がアポトーシス誘導によるものであることをさらに確認するために、ＳＡＨＡ（２．５μM）、図に示した濃度のＦＫ２２８で処理したサンプルを用い、一次抗体として抗ＰＡＲＰ−１／２ポリクローナル抗体（Santa Cruz）（「ＰＡＲＰ」）、抗リン酸化（ｐ）ＡＫＴ抗体（Ｓ４７３）（Cell signaling）（「ｐＡＫＴＳ４７３」）、抗ＡＫＴ抗体（「ｔｏｔａｌ ＡＫＴ」）、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体（Upstate）（「Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ Ｈ３」）、抗アセチル化ヒストンＨ４抗体（Upstate）（「Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ Ｈ４」）を使用したこと以外は、基本的に上記と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロットでは、ＨＣＴ１１６細胞を所定濃度のＳＡＨＡ、ＦＫ−２２８で２４時間処理し、ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ、アセチル化ヒストンＨ３、アセチル化ヒストンＨ４の発現について解析した。

結果を図５Ｄに示す。ＦＫ２２８によるアポトーシス誘導は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＣｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの増加によって裏付けられた。ＦＣＡＳ解析の結果と同様、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰは高濃度のＦＫ２２８（５μM）で最も増加し、強いアポトーシス誘導が示された。また、このとき同時に、高濃度のＦＫ２２８（５μM）はリン酸化ＡＫＴを抑制し、アセチル化ヒストンの発現を増加させていたことも判明した。

以上より、高濃度（μMレベル）のＦＫ２２８及びＦＫ−Ａ５は、強力にアポトーシスを誘導し、その際にはＨＤＡＣとＰＩ３Ｋの二重阻害剤としての活性を発揮していることが示された。

８．デプシペプチド類化合物の合成（２）
上記２．と同様にして、さらにデプシペプチド類化合物ＦＫ−Ａ７〜Ａ１３及びＦＫ−Ａ１７を合成し、特性を調べた。表３に、それらの化合物の構造式、及び上記３．と同様にして測定したＰＩ３Ｋ（ｐ１１０α／ｐ８５α）に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を、比較のためＦＫ２２８、ＳＡＨＡ、ＬＹ２９４００２とともに示す。表３中、ＦＫ２２８、ＳＡＨＡのＨＤＡＣ１に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、文部科学省がん特定領域研究・統合がん化学療法基盤情報支援班により評価された。

表３： ＦＫ−Ａ７〜Ａ１３、Ａ１７の構造式及びＰＩ３Ｋ、ＨＤＡＣ１に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）

９．ＦＫ−Ａ１１についての、ウェスタンブロッティングによるＡＫＴ経路の抑制の評価
上記５．と同様にして、ＦＫ−Ａ１１によるＡＫＴのリン酸化の抑制を評価し、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ２２８と比較した。ただし、作用時間は１８０分とし、一次抗体としては、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ−４７３）抗体（「ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）」）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｔｈｒ−３０８）抗体（「ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）」）、抗ＡＫＴ抗体（「ＡＫＴ」）、抗β−アクチンモノクローナル抗体（「Ｂ−ａｃｔｉｎ」）を使用した。

結果を、図６に示す。ＦＫ−Ａ１１については、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５よりも低濃度で、ＡＫＴのリン酸化を抑制することが示された。

１０．ＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果の評価
上記６．と同様にして、ＭＴＴアッセイによりＦＫ−Ａ１１の殺細胞効果を検討した。ただし、ヒト培養細胞としては、大腸がん（ＨＣＴ１１６、ＣＯ１１５、ＲＫＯ）の細胞株、及び正常細胞として非腫瘍性線維芽細胞株ＫＭＳＴ６を使用し、ＦＫ−Ａ１１は、５nM、５０nM、５００nM、５μM又は５０μMで使用した。

結果を図７Ａ〜Ｄに示す。
ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ細胞では、低濃度（５nM〜５００nM程度のレベル）のＦＫ−Ａ１１により顕著な細胞死を生じた。これに対し、ＨＤＡＣ阻害剤に対して抵抗性であるＣＯ１１５細胞においては、５０nM程度までのＦＫ−Ａ１１に対して抵抗性であったが、ＰＩ３Ｋ阻害活性が発揮されると推測される５００nMからは強い細胞死を生じた。一方、その濃度においては、非がん細胞であるＫＭＳＴ６は顕著な細胞死を生じなかった。

ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５、ＦＫ−Ａ１１の結果の比較を図８Ａ〜Ｃに示す。
これらの結果から、ｐ１１０αに対する阻害活性が非常に強いＦＫ−Ａ１１は、いずれのがん細胞株に対しても、ＦＫ２２８、ＦＫ−Ａ５よりも強力な細胞増殖抑制効果を示すことが明らかになった。

この出願は、平成２３年９月３０日出願の日本特許出願、特願２０１１−２１７３７８に基づくものであり、特願２０１１−２１７３７８の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims (7)

1. 以下の式１で示されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩。
   （式中、Ａは、−ＣＯＮＨ−を表し、Ｒ¹は置換もしくは無置換のナフチルメチル基又は置換もしくは無置換のフェニルメチルを示し、
   Ｒ²は、水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基、置換もしくは無置換のアリール基又は置換もしくは無置換のアラルキル基を表し、Ｒ^３は水素原子を示す）
2. 式１において、Ａ、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³の組合せがＡ＝−ＣＯＮＨ− かつＲ¹＝ベンジル基かつＲ²＝イソプロピル基かつＲ³＝水素原子である化合物を除く、請求項１記載のデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩。
3. 以下の式７〜２０のいずれかで示される化合物又は生理学的に許容可能なその塩。
   
4. 以下の式１で示されるデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩を含むホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤
   式１
   （式中、Ａは、−ＣＯＮＨ−を表し、Ｒ ¹ は置換もしくは無置換のアラルキル基を示し、
   Ｒ ² は、水素原子、低級アルキル基、低級アルキリデン基、置換もしくは無置換のアリール基又は置換もしくは無置換のアラルキル基を表し、Ｒ ^３ は水素原子を示す）。
5. 請求項１〜３のいずか１項に記載のデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩を含むホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤。
6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のデプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩を有効成分として含有することを特徴とする、がんの治療用医薬組成物。
7. 前記デプシペプチド類化合物又は生理学的に許容可能なその塩が体重１kgあたり１mg/日〜１０，０００mg/日の投与用量で投与されることを特徴とする、請求項６に記載のがんの治療用医薬組成物。