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JP6105615B2 - リゾチーム活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

リゾチーム活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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JP6105615B2
JP6105615B2 JP2014542854A JP2014542854A JP6105615B2 JP 6105615 B2 JP6105615 B2 JP 6105615B2 JP 2014542854 A JP2014542854 A JP 2014542854A JP 2014542854 A JP2014542854 A JP 2014542854A JP 6105615 B2 JP6105615 B2 JP 6105615B2
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Description

配列リストの参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるコンピューター可読形式の配列リストを含有する。
原子座標の参照
本出願は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２リゾチームの三次元構造の原子座標を図６に示す。
本発明は、リゾチーム活性を有するポリペプチドと、触媒ドメインと、このポリペプチドおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドと、に関する。発明はまた、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、および宿主細胞と、さらにはこのポリペプチドおよび触媒ドメインを産生および使用する方法と、に関する。
リゾチームは、多くの生物により細菌に対する防御機構として産生されるＯ−グリコシルヒドロラーゼである。この酵素は、細菌中の重要な構造分子であるペプチドグリカンのグルコシド結合を切断することにより、細菌細胞壁の加水分解を引き起こす。その細胞壁がリゾチーム作用により弱体化された後、細菌細胞は、浸透圧に起因して溶解する。
リゾチームは、ウイルス、植物、昆虫、鳥、爬虫動物、哺乳動物などの多くの生物中に存在する。哺乳動物では、リゾチームは、鼻分泌物、唾液、涙、腸、尿、および乳から単離されてきた。この酵素は、Ｎ−アセチルムラミン酸の炭素番号１とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの炭素番号４との間のグルコシド結合を切断する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらの２つ炭水化物は、重合されて細胞壁ポリサッカリドを形成する。
抗微生物剤としてのリゾチーム酵素の可能性に関心が高まっている。たとえば、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの病原体に対して、リゾチーム活性が示されてきた。
リゾチームは、次の５つの異なるグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリーに分類されてきた（ＣＡＺｙ、ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）。すなわち、ニワトリ卵白リゾチーム（ＧＨ２２）、ガチョウ卵白リゾチーム（ＧＨ２３）、バクテリオファージＴ４リゾチーム（ＧＨ２４）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）鞭毛タンパク質（ＧＨ７３）、およびカラロプシス属（Ｃｈａｌａｒｏｐｓｉｓ）リゾチーム（ＧＨ２５）。ファミリーＧＨ２３およびＧＨ２４のリゾチームは、主に、バクテリオファージに由来することが知られており、菌類では同定されていない。リゾチームファミリーＧＨ２５は、他のリゾチームファミリーに構造的に関連しないことが明らかにされてきた。
リゾチームの使用は、動物用飼料（たとえば、国際公開第００／２１３８１号パンフレットおよび国際公開第０４／０２６３３４号パンフレットを参照されたい）、チーズ製造（たとえば、国際公開第０５／０８０５５９号パンフレットを参照されたい）、食品保存（Ｈｕｇｈｅｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８７）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５３：２１６５）、洗剤（たとえば、米国特許第５，０４１，２３６号明細書および欧州特許第０４２５０１６号明細書を参照されたい）、口腔ケア（たとえば、米国特許第４，３５５，０２２号明細書、国際公開第０４／０１７９８８号パンフレット、および国際公開第０８／１２４７６４号パンフレットを参照されたい）、美容学および皮膚科学、避妊、泌尿器学、および婦人科学（たとえば、国際公開第０８／１２４７６４号パンフレットを参照されたい）で提案されてきた。
ＧＨ２５リゾチームは、カラロプシス属（Ｃｈａｌａｒｏｐｓｉｓ）に由来することが報告されてきた（Ｆｅｌｓｃｈ ＪＷ，Ｉｎｇａｇａｍｉ Ｔ，ａｎｄ Ｈａｓｈ ＪＨ．（１９７５），“Ｔｈｅ Ｎ，Ｏ−Ｄｉａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ｏｆ Ｃｈａｌａｒｏｐｓｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｖ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０（１０）：３７１３−３７２０）。
商業市場で入手可能な主要製品であるニワトリ卵白リゾチームは、たとえばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞壁中のＮ，６−Ｏ−ジアセチルムラミダーゼを切断しないので、とくに、この重要なヒト病原体を溶解することができない（Ｍａｓｓｃｈａｌｃｋ Ｂ，Ｄｅｃｋｅｒｓ Ｄ，Ｍｉｃｈｉｅｌｓ ＣＷ（２００２），“Ｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｕｎｄｅｒ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ”，Ｊ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．６５（１２）：１９１６−２３）。
異なるリゾチームは、異なる微生物に対して異なる特異性を有することが観測されてきた。したがって、それぞれの特定の用途に好適な酵素を選択できるように、入手可能ないくつかのリゾチームを有することが望ましい。したがって、リゾチーム活性を有する新しいポリペプチドが望まれる。
本発明は、ＧＨ２５ファミリーに属するかつリゾチーム活性を有する単離された菌類ポリペプチドに関する。
本発明はさらに、
（ａ）配列番号４の成熟ポリペプチドまたは配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列または配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列またはそれらの全長相補配列に中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｄ）１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号４または配列番号８の成熟ポリペプチドの変異体、および
（ｅ）リゾチーム活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリペプチドの断片、
からなる群から選択される、リゾチーム活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、組換え発現ベクター、組換え宿主細胞と、このポリペプチドの産生方法と、に関する。
さらに、本発明は、本発明に係るポリペプチドを含む組成物、たとえば、洗剤組成物、動物用飼料組成物、および細菌ゲノムＤＮＡ抽出組成物に関する。
本発明はまた、抗微生物活性を有する本発明に係るポリペプチドと、バイオフィルム形成阻害剤としての、洗剤における、歯科ケアにおける、動物用飼料における、および細菌細胞壁破壊のための、本発明に係るポリペプチドの使用方法と、に関する。
本発明はまた、タンパク質をコードする遺伝子に機能可能に連結された、配列番号４のアミノ酸１〜１９または配列番号８のアミノ酸−２３〜−１を含むまたはそれらからなるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、発現ベクター、および組換え宿主細胞と、タンパク質の産生方法と、に関する。
配列リストの概要
配列番号１は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２から単離されたＰ２４４Ａ７ ＧＨ２４遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号２は、配列番号１から推定されたアミノ酸配列である。
配列番号３は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２から単離されたＰ２４２Ｍ９ ＧＨ２５遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号４は、配列番号３から推定されたアミノ酸配列である。
配列番号５は、フォワードプライマーＦ−Ｐ２４２Ｍ９である。
配列番号６は、リバースプライマーＲ−Ｐ２４２Ｍ９である。
配列番号７は、合成的に最適化されたＧＨ２５遺伝子のＤＮＡ配列である。
配列番号８は、配列番号７から推定されたアミノ酸配列である。
配列番号９は、フォワードプライマーＢａｍＨＩである。
配列番号１０は、リバースプライマーＥｃｏＲＩである。
図１は、Ｓ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２４リゾチーム（ＥＸＰ０３８９０、配列番号２）、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（ＥＸＰ０３８６４、配列番号４）、およびアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来の参照リゾチームＧＨ２５の放射状拡散アッセイを示している。 図２は、分光光度計により５４０ｎｍで測定される再懸濁ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＴＣ Ｎｏ．４６９８溶液の光学濃度低下により決定される６０、７６、７０、７５、８０、および８５℃での３０または６０秒後のアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチームＰ２４２Ｍ９（配列番号４）の温度安定性を示している。 図３は、５０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）、５０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．５）、および５０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ｐＨ６．５）中で示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて決定されるＧＨ２５リゾチームＰ２４２Ｍ９（配列番号４）の熱安定性を示している。 図４は、再懸濁クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＮＮ０１２６０溶液の光学濃度低下により決定されるＧＨ２５リゾチームＰ２４２Ｍ９（配列番号４）、合成ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８）、および配列番号８の１１種の変異体の４濃度のリゾチーム活性を示している。 図５は、再懸濁クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）臨床単離物溶液の光学濃度低下により決定されるＧＨ２５リゾチームＰ２４２Ｍ９（配列番号４）、合成ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８）、および配列番号８の１１種の変異体の４濃度のリゾチーム活性を示している。 図６は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２ ＧＨ２５リゾチームの三次元構造の原子座標を示している。これらの原子座標は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２ ＧＨ２５リゾチームの構造を示す三次元モデルおよび以上に挙げたリゾチームの変異体などの相同構造の三次元モデルを作成するのに役立ちうる。
定義
リゾチーム：「リゾチーム」活性という用語は、本明細書では、２つ以上の炭水化物間または炭水化物部分と非炭水化物部分との間のグリコシド結合の加水分解を触媒するＯ−グリコシルヒドロラーゼとして定義される。リゾチームは、細菌細胞壁のムコポリサッカリドおよびムコペプチドの特定の残基間のグリコシド結合、たとえば、ペプチドグリカンのＮ−アセチルムラミン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間およびキトデキストリンのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合を切断して、溶菌をもたらす。リゾチームは、酵素クラスＥＣ３．２．１．１７に属する。本発明の目的では、リゾチーム活性は、実施例４に記載の濁度アッセイに従って決定される。一態様では、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４または配列番号８の１つの成熟ポリペプチドのリゾチーム活性の少なくとも２０％、たとえば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異により天然に生じ、集団内に多型をもたらしうる。遺伝子突然変異は、サイレントでありうるか（コードポリペプチドの変化なし）、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
抗微生物活性：「抗微生物活性」という用語は、本明細書では、微生物、たとえば、藻類、古細菌、細菌、菌類、および／または原生動物の死滅または増殖阻害を行う活性として定義される。抗微生物活性は、たとえば、細菌の死滅を意味する殺細菌性または細菌増殖の防止を意味する静細菌性でありうる。抗微生物活性は、ペプチドグリカンのＮ−アセチルムラミン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間およびキトデキストリンのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合の加水分解を触媒することを含みうる。抗微生物活性はまた、リゾチームが微生物の表面に結合してその増殖を阻害することを含みうる。また、抗微生物効果は、細菌毒素の阻害または低減によりおよびオプソニン効果により免疫刺激剤として細菌オートリシンを活性化するための本発明に係るリゾチームの使用を含みうる。本発明の目的では、抗微生物活性は、実施例１０に記載の抗微生物アッセイに従って決定される。
改変／改質された性質：「改変／改質された性質」という用語は、本明細書では、親リゾチームまたは同定された参照配列と比較して改変または改質された変異体関連特性として定義される。改変または改質された性質は、とくに明記されていないかぎり、他の参照リゾチームまたは親リゾチームと対比して改良された変異体関連特性であってもよい。改変／改質または改良されうる性質の例は、以下に与えられる。
熱安定性：「熱安定性」という用語は、緩衝液中におけるまたは製品の貯蔵／輸送時に存在するような条件下もしくは変異体の工業的使用時に存在するような条件下における、親または同定された参照配列と対比される、高温での一定時間のインキュベーション後のリゾチーム活性を意味する。変異体は、親と対比して改変された熱活性プロファイルを呈することもあれば呈しないこともありうる。一態様では、リゾチーム活性を有する変異体の熱安定性は、選択された温度において、親または参照配列の少なくとも１．０倍、たとえば、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、および少なくとも２５倍の熱安定性である。好ましくは、活性は、「材料および方法」の節に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
温度プロファイル／温度安定性：「温度プロファイル／温度安定性」という用語は、親または同定された参照配列と比較して、変異体酵素が改変された温度プロファイルを示すことを意味する。ただし、温度プロファイルは、温度の関数としてのリゾチーム活性として決定される。各温度での活性は、好ましくは、最適温度での値に規格化された相対活性（％単位）として示される。最適温度とは、試験された温度（すなわち、５〜１０℃のジャンプを有する温度）の範囲内で活性が最も高い温度のことである。
ｐＨ安定性：「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が活性であるｐＨ範囲（ｐＨ活性範囲）の外にあるｐＨでの一定時間のインキュベーション後、親リゾチームまたは同定された参照配列と対比して、変異体酵素が構造安定性を呈することを意味する。そのような変異体は、親と対比して改変されたｐＨ活性プロファイルを呈することもあれば呈しないこともありうる。たとえば、変異体は、増大または低減されたｐＨで活性でないこともありうるが、ｐＨ活性範囲に戻した後、その三次元構造を維持して活性を取り戻すことが可能である。他の選択肢として、変異体は、増大または低減されたｐＨでのインキュベーション後、親と対比して改良されたリフォールディング能を有しうる。
一態様では、ｐＨ安定性プロファイルは、リゾチーム変異体が酸性ｐＨで改良された安定性を有するように改変される。本明細書で用いられる場合、酸性ｐＨとは、ｐＨ２〜５．５、好ましくは２．５〜５．２５、より好ましくは３〜５、さらにより好ましくは３．５〜４を意味する。好ましくは、変異体リゾチームは、１時間にわたり所与のｐＨでインキュベートした後、同一の時間にわたりｐＨ６．５に維持された変異体と比較したとき、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の残存活性を維持する。好ましくは、変異体リゾチームの残存活性は、同一の条件下で処理された親リゾチームまたは同定された参照配列の残存活性の少なくとも１．１倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも７倍、さらに最も好ましくは少なくとも１０倍である。好ましくは、活性は、「材料および方法」の節に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
ｐＨ活性：「ｐＨ活性」という用語は、本明細書では、親リゾチームまたは同定された参照配列のｐＨ活性プロファイルと比較したときにｐＨ依存性活性プロファイルの改変を呈する変異体リゾチームとして定義される。ｐＨ活性プロファイルは、温度や溶媒組成などの所与の条件で一定のｐＨ範囲にわたり微生物増殖を防止する、微生物細胞を排除する、および／または加水分解反応の触媒作用を行う酵素の効率の尺度を提供する。リゾチームは、ポリペプチドが安定であるかつその酵素活性を維持する特定のｐＨ範囲を有し、この範囲外では、リゾチームは、活性が低くなるとともに、安定性が低くなる可能性もある。このｐＨ範囲内には、一般に、リゾチームが最大活性を示すｐＨ最適値が存在する。
アルカリ性ｐＨ（たとえば、ｐＨ７．５〜１２、好ましくは８〜１１、より好ましくは８．５〜１０、さらにより好ましくは９〜９．５）で改良された活性を有するリゾチーム変異体は、洗剤などのよりアルカリ性の環境で機能しうるであろう。
酸性ｐＨ（たとえば、ｐＨ２〜６．５、好ましくは２．５〜６、より好ましくは３〜５．５、さらにより好ましくは３．５〜５）で改良された活性を有する変異体は、特定の食品中の保存剤などのより酸性の条件下で機能しうるであろう。
中性〜弱酸性ｐＨ（たとえば、ｐＨ４〜７．０、好ましくは４．５〜６．５、より好ましくは５〜６．５）で改良された活性を有する変異体は、飼料中で健康生活学的分子を使用したり、動物の健常微生物叢を安定化したり、または動物のＧＩ管内のウイルス、寄生虫、もしくは細菌の病原体の増殖／腸内定着を抑制したりする場合などの弱酸性または中性の条件下で機能しうるであろう。
一態様では、ｐＨ活性プロファイルは、リゾチーム変異体がよりアルカリ性のｐＨで改良された活性を有するように改変される。好ましくは、少なくとも０．５単位高い、好ましくは少なくとも１．０ｐＨ単位高い、より好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位高い、さらにより好ましくは少なくとも２．０ｐＨ単位高いｐＨでのリゾチーム変異体の活性は、親酵素または同定された参照配列の少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍である。好ましくは、それと同時に、リゾチーム変異体は、親リゾチームまたは同定された参照配列がそのｐＨ最適値で呈する活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％、または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも１００％を維持する。好ましくは、活性は、「材料および方法」の節に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
他の態様では、ｐＨ活性プロファイルは、リゾチーム変異体がより酸性のｐＨで改良された活性を有するように改変される。好ましくは、少なくとも０．５単位低い、好ましくは少なくとも１．０ｐＨ単位低い、より好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位低い、さらにより好ましくは少なくとも２．０ｐＨ単位低いｐＨでのリゾチーム変異体の活性は、親酵素または同定された参照配列の少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍である。好ましくは、それと同時に、リゾチーム変異体は、親リゾチームまたは同定された参照配列がそのｐＨ最適値で呈する活性の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％、または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも１００％を維持する。好ましくは、活性は、「材料および方法」の節に記載のリゾチーム濁度活性アッセイを用いて試験される。
基質特異性：「基質特異性」という用語は、死滅／阻害しうる細菌のタイプに関するおよび／またはモデルリゾチーム基質（たとえば、ｐ−ＮＰ−（ＮＡＧ−ＮＡＭ）ｎもしくはｐ−ＮＰ−（ＮＡＧ）ｍオリゴマー）に対するリゾチームの特異性を意味する。リゾチームの基質特異性を改変することにより、リゾチームが死滅および／または阻害しうる細菌のタイプを変化させることが可能である。一態様では、リゾチームの基質特異性を拡張することにより、野生型リゾチームが死滅および／または阻害しうる細菌以外の他のタイプの細菌を死滅および／または阻害することが可能である。
グリケーション感受性：非酵素的グリケーションは、還元糖がタンパク質の主にリシン（Ｋ）残基の遊離アミノ基に共有結合する自発的翻訳後プロセスである。グリケーションは、リゾチームの活性に影響を及ぼしうる。本発明によれば、非酵素的グリケーションに対するリゾチームの感受性は、指定されたアミノ酸変化により低減されうる。
また、改良された性質は、ペレット化安定性、水蒸気安定性、より広範な温度活性プロファイルなどの熱的性質を含みうる。さらなる改良された性質は、プロテアーゼ感受性および／またはグリコシル化パターンを含みうる。改良は、好ましくは、所望の適用条件との関連で評価される。
触媒ドメイン：「触媒ドメイン」という用語は、酵素の触媒機構を含有する酵素の領域を意味する。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子から逆転写により調製可能なＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在しうるイントロン配列が欠如している。初期一次ＲＮＡ転写物は、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングをはじめとする一連の工程によりプロセシングされるｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般的には、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧなどの開始コドンで始まるかつＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡなどの停止コドンで終わるオープンリーディングフレームにより決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの組合せでありうる。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明に係る成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して同一起源（すなわち同一遺伝子由来）であっても外来起源（すなわち異なる遺伝子由来）であってもよく、または互いに同一起源であっても外来起源であってもよい。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されるものではない。最低限でも、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーと共に提供されうる。
発現：「発現」という用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含む。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつその発現を提供する制御配列に機能可能に結合された、線状または環状のＤＮＡ分子を意味する。
断片：「断片」という用語は、成熟ポリペプチドまたは成熟ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（たとえば複数）のアミノ酸を除いたポリペプチドまたは触媒ドメインを意味する。ただし、この断片は、リゾチーム活性を有する。一態様では、断片は、少なくとも１８４アミノ酸残基（たとえば、配列番号４のアミノ酸２５〜２０８）または少なくとも１９５アミノ酸残基（たとえば、配列番号４のアミノ酸２２〜２１６）を含有する。さらなる態様では、断片は、少なくとも１８４アミノ酸残基（たとえば、配列番号８のアミノ酸１０〜１９３）または少なくとも１９５アミノ酸残基（たとえば、配列番号８のアミノ酸５〜１９９）を含有する。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによるトランスフォーメーション、トランスフェクション、トランスダクションなどを受けやすい任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異に起因して親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。
単離された：「単離された」という用語は、天然に存在しない形態のまたは環境中の物質を意味する。単離された物質の例としては、限定されるものではないが、（１）天然に存在しない任意の物質、（２）天然で会合している天然に存在する成分の１つ以上またはすべてから少なくとも部分的に分離された任意の物質、限定されるものではないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、補因子など、（３）天然に見いだされる物質に対して人間の手により修飾された任意の物質、または（４）天然で会合している他の成分に対する物質の量の増加（たとえば、物質をコードする遺伝子の多重コピー、物質をコードする遺伝子と天然で会合しているプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）により修飾された任意の物質が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在していてもよい。
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳および任意の翻訳後修飾、たとえば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端トランケーション、グリコシル化、リン酸化などを行った後の最終形態のポリペプチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜１９および配列番号８のアミノ酸−４０〜−１８がシグナルペプチドであると予測するＳｉｇｎａｌＰプログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）に基づいて、配列番号４のアミノ酸２０〜２２７または配列番号８のアミノ酸１〜２０８である。宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドにより発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を産生しうることは、当技術分野で公知である。
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、リゾチーム活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号３のヌクレオチド１〜５７および配列番号７のヌクレオチド１〜６９がシグナルペプチドをコードすると予測するＳｉｇｎａｌＰプログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ｓｕｐｒａ）に基づいて、配列番号３のヌクレオチド５８〜１４７とヌクレオチド３０２〜８３５との連結配列および配列番号７のヌクレオチド１２１〜７４４である。
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離された、または他の点では天然に存在しないと思われる形で核酸のセグメントを含有するように修飾された、または１つ以上の制御配列を含む合成された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。
機能可能に連結された：「機能可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を誘導するように制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターにより記述される。
本発明の目的では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラム中に実装されているものを用いて、決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ６２）置換行列である。「最長同一性」と記されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一残基数×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中の全ギャップ数）
本発明の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラム中に実装されているニードルマン・ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，ｓｕｐｒａ）を用いて、決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換行列である。「最長同一性」と記されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド数×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中の全ギャップ数）
ストリンジェンシー条件：異なるストリンジェンシー条件は、以下のように定義される。
「非常に低いストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。最後に、４５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
「低ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および２５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最後に、３回にわたり５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間洗浄される。
「中ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最後に、３回にわたり５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間洗浄される。
「中〜高ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および３５％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最後に、３回にわたり６０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間洗浄される。
「高ストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最後に、３回にわたり６５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間洗浄される。
「非常に高いストリンジェンシー条件」という用語は、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続いて、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％ホルムアミド中、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は、最後に、３回にわたり７０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間洗浄される。
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟ポリペプチドコード配列の５’末端および／または３’末端から１つ以上（たとえば複数）のヌクレオチドを除いたポリヌクレオチドを意味する。ただし、このサブ配列は、リゾチーム活性を有する断片をコードする。一態様では、サブ配列は、少なくとも５５２ヌクレオチド（たとえば、配列番号３のヌクレオチド７３〜１４７とヌクレオチド３０２〜７７８との連結配列）または少なくとも５８５ヌクレオチド（たとえば、配列番号３のヌクレオチド６４〜１４７とヌクレオチド３０２〜８０２との連結配列）を含有する。さらなる態様では、サブ配列は、少なくとも５５２ヌクレオチド（たとえば、配列番号７のヌクレオチド１４８〜６９９の配列）または少なくとも５８５ヌクレオチド（たとえば、配列番号７のヌクレオチド１３３〜７１７の配列）を含有する。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来のまたは望ましくないヌクレオチドを含まないかつ遺伝子工学操作ポリペプチド産生系内で使用するのに好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然にまたは組換えにより会合された他のポリヌクレオチド材料を多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６％、多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、多くとも２％、多くとも１％、および多くとも０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する５’および３’非翻訳領域、たとえば、プロモーターおよびターミネーターを含みうる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、重量基準で少なくとも９０％の純度、たとえば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度、および少なくとも９９．５％の純度である。本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態である。
実質的に純粋なポリペプチド：「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、天然にまたは組換えにより会合された他のポリペプチド材料を多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６％、多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、多くとも２％、多くとも１％、および多くとも０．５重量％含有する調製物を意味する。好ましくは、ポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド材料の重量を基準にして少なくとも９２％の純度、たとえば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度、および１００％の純度である。本発明に係るポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態である。これは、たとえば、周知の組換え方法または古典的な精製方法でポリペプチドを調製することにより達成可能である。
変異体：「変異体」という用語は、１つ以上（たとえば複数）の位置に１つ以上（たとえば複数）のアミノ酸残基の改変、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を含む、リゾチーム活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、位置を占有するアミノ酸を異なるアミノ酸と交換することを意味し、欠失とは、位置を占有するアミノ酸を除去することを意味し、そして挿入とは、位置を占有するアミノ酸に近接しておよびその直後に１、２、または３アミノ酸を追加することを意味する。本発明に係る変異体は、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５個、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５個の改変を含みうる。
本発明に係る変異体は、位置が配列番号８の成熟配列中の位置に対応する位置番号６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０からなる群から選択される少なくとも１個の改変／修飾を有する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、天然に見いだされないものである。
野生型リゾチーム：「野生型」リゾチームという用語は、天然に存在する微生物、たとえば、天然に見いだされる細菌、酵母、または糸状菌により発現されるリゾチームを意味する。
変異体の呼称に関する規則
本発明の目的では、配列番号８に開示される成熟ポリペプチドは、他のリゾチーム中の対応するアミノ酸残基を決定するために使用される。他のリゾチームのアミノ酸配列を配列番号８に開示される成熟ポリペプチドにアライメントし、このアライメントに基づいて、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラム中に実装されたニードルマン・ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、配列番号８に開示される成熟ポリペプチド中のいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を決定する。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー１０、ギャップ伸長ペナルティー０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ６２）置換行列である。「最長同一性」と記されるＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。（同一残基数×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中の全ギャップ数）。ニードルマン・ブンシュアルゴリズムは、配列の比較および配列同一性の計算に使用される。
他のリゾチーム中の対応するアミノ酸残基の同定は、限定されるものではないが、ＭＵＳＣＬＥ（対数期待値による多重配列比較、バージョン３．５以降、Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降、Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６、Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８、Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４、Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４、Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、およびＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３以降、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を利用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡをはじめとするいくつかのコンピュータープログラムを用いて、それらのそれぞれのデフォルトパラメーターを用いて、複数のポリペプチド配列のアライメントにより、決定可能である。
他の酵素が配列番号８の成熟ポリペプチドから逸脱して、伝統的配列ベース比較によるそれらの関係の検出に失敗した場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを使用することが可能である。ポリペプチドファミリーの確率的表現（プロファイル）を利用してデータベースを検索する検索プログラムを用いて、配列ベース探索のより高い感度を達成することが可能である。たとえば、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴプログラムは、反復的データベース検索プロセスを介してプロファイルを発生し、遠縁の相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドのファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベース中に１つ以上の表現を有しいれば、さらに高い感度を達成することが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５、ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、クエリー配列の構造フォールドを予測するニューラルネットワークへの入力としてさまざまな情報源からの情報（ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アライメントプロファイル、および溶媒和ポテンシャル）を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９の方法を用いて、未知構造の配列をＳＣＯＰデータベース中に存在するスーパーファミリーモデルにアライメントすることが可能である。次に、これらのアライメントを用いて、ポリペプチドに対する相同性モデルを発生し、その目的のために開発されたさまざまなツールを用いて、モデルの正確度を評価することが可能である。
既知構造のタンパク質では、検索および構造アライメントの発生のために、いくつかのツールおよび資源を利用することが可能である。たとえば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは、構造的にアライメントされてきており、それらのアライメントは、アクセス可能かつダウンロード可能である。距離アライメント行列（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）やコンビナトリアル伸長（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などのさまざまなアルゴリズムを用いて、２つ以上のタンパク質構造をアライメントすることが可能であり、可能な構造相同体を発見するために、これらのアルゴリズムの実装を追加的に利用して、対象の構造で構造データベースを検索することが可能である（たとえば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明に係る変異体の記述では、参照を容易にするために、以下に記載の命名法に準じる。許容されたＩＵＰＡＣ一文字または三文字アミノ酸略号を利用する。
置換：アミノ酸置換では、次の命名法を使用する。すなわち、元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸。したがって、アラニンによる位置２２６のトレオニンの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」として表される。複数の突然変異は、追加マーク（「＋」）により分離され、たとえば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、それぞれ、アルギニン（Ｒ）によるグリシン（Ｇ）のおよびフェニルアラニン（Ｆ）によるセリン（Ｓ）の位置２０５および４１１での置換を表す。
欠失：アミノ酸欠失では、次の命名法を使用する。すなわち、元のアミノ酸、位置、＊。したがって、位置１９５のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」として表される。複数の欠失は、追加マーク（「＋」）により分離され、たとえば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」である。
挿入：アミノ酸挿入では、次の命名法を使用する。すなわち、元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸。したがって、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と表される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸＃１、挿入アミノ酸＃２など］と表される。たとえば、位置１９５のグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」として示される。
そのような場合、挿入アミノ酸残基は、挿入アミノ酸残基に先行するアミノ酸残基の位置番号に小文字を追加することにより、番号付けされる。したがって、以上の例では、配列は、以下のようになるであろう。
複数の改変：複数の改変を含む変異体は、追加マーク（「＋」）により分離され、たとえば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、チロシンおよびグルタミン酸による位置１７０および１９５でのアルギニンおよびグリシンの置換を表す。
異なる改変：ある位置に異なる改変を導入可能である場合、異なる改変は、コンマにより分離され、たとえば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、チロシンまたはグルタミン酸による位置１７０でのアルギニンの置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、次の変異体、すなわち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」を表す。
リゾチーム活性を有するポリペプチド
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９１％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９２％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９３％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９４％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９６％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９７％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一態様では、ポリペプチドは、４５アミノ酸以下だけ、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４アミノ酸だけ、配列番号４の成熟ポリペプチドと異なる。
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子変異体を含むかもしくはそれらからなり、またはリゾチーム活性を有するそれらの断片である。他の態様では、ポリペプチドは、配列番号４の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなる。他の態様では、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２０〜２２７を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９１％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９２％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９３％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９４％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９６％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９７％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、リゾチーム活性を有する配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドに関する。
一態様では、ポリペプチドは、４５アミノ酸以下だけ、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４アミノ酸だけ、配列番号８の成熟ポリペプチドと異なる。
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列もしくはその対立遺伝子変異体を含むかもしくはそれらからなり、またはリゾチーム活性を有するそれらの断片である。他の態様では、ポリペプチドは、配列番号８の成熟ポリペプチドを含むかまたはそれからなる。他の態様では、ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸２０〜２２７を含むかまたはそれからなる。
他の実施形態では、本発明は、中ストリンジェンシー条件下、中〜高ストリンジェンシー条件下、高ストリンジェンシー条件下、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号３もしくは配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）それらのｃＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の全長相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、リゾチーム活性を有する単離されたポリペプチドに関する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
配列番号３または配列番号７のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、さらには配列番号４または配列番号８のポリペプチドまたはその断片は、当技術分野で周知の方法に従って、異なる属または種の株からリゾチーム活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローニングするための核酸プローブを設計すべく使用しうる。特定的には、そのようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的サザンブロッティング手順に続いて、対象の細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに使用可能である。そのようなプローブは、全配列よりもかなり短くすることが可能であるが、少なくとも１５ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチド長にすべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも６００ヌクレオチド長、少なくとも７００ヌクレオチド長、少なくとも８００ヌクレオチド長、または少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブは両方とも、使用可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識される（たとえば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、またはアビジンを用いて）。そのようなプローブは、本発明に包含される。
そのような他の株から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、以上に記載のプローブにハイブリダイズする、かつリゾチーム活性を有するポリペプチドをコードする、ＤＮＡに関して、スクリーニングしうる。そのような他の株からのゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動または他の分離技術により分離しうる。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の好適な担体材料上に移動および固定しうる。配列番号３または配列番号７またはそのサブ配列と相同的なクローンまたはＤＮＡをハイブリダイズするために、担体材料は、サザンブロットで使用される。
本発明の目的では、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、中〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号３または配列番号７、（ｉｉ）配列番号３または配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉｉ）それらのｃＤＮＡ配列、（ｉｖ）それらの全長相補配列、または（ｖ）それらのサブ配列、に対応する標識核酸プローブにハイブリダイズすることの指標となる。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、たとえば、Ｘ線フィルムまたは当技術分野で公知の任意の他の検出手段を用いて検出可能である。
一態様では、核酸プローブは、配列番号３のヌクレオチド５８〜１４７もしくはヌクレオチド３０２〜８３５または配列番号７のヌクレオチド１２１〜７４４である。他の態様では、核酸プローブは、配列番号４または配列番号８のポリペプチド、その成熟ポリペプチド、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドである。他の態様では、核酸プローブは、配列番号３または配列番号７またはそのｃＤＮＡ配列である。
他の実施形態では、本発明は、配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列またはそのｃＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、リゾチーム活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列またはそのｃＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、リゾチーム活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号４の成熟ポリペプチドの変異体に関する。一実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチド中に導入されるアミノ酸置換、欠失、および／または挿入の数は、４５以下、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５である。
好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号８の成熟ポリペプチドの変異体に関する。一実施形態では、配列番号８の成熟ポリペプチド中に導入されるアミノ酸置換、欠失、および／または挿入の数は、４５以下、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５である。
アミノ酸変化は、副次的性質、すなわち、タンパク質のフォールディングおよび／もしくは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換もしくは挿入、小さい欠失、典型的には１〜３０個のアミノ酸の欠失、小さいアミノもしくはカルボキシル末端伸長、たとえば、アミノ末端メチオニン残基、２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド、または正味電荷もしくは他の機能、たとえば、ポリヒスチジントラクト、抗原エピトープ、もしくは結合ドメインを変化させることにより精製を促進する小さい伸長であり得る。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ならびに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン）の群に含まれる。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は、当技術分野で公知であり、たとえば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。通常の置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
他の選択肢として、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が変化するような性質である。たとえば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性の向上、基質特異性の改変、ｐＨ最適値の変化などでありうる。
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位指向突然変異誘発やアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野で公知の手順に従って同定可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入し、得られた突然変異分子をリゾチーム活性に関して試験して分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた、参照されたい。また、酵素または他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、光親和性標識などの技術により決定されるように、構造の物理的解析により決定可能である。たとえば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。また、必須アミノ酸が何であるかは、関連ポリペプチドとのアライメントから推測可能である。
単一または複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７、Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６、国際公開第９５／１７４１３号パンフレット、または国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されるように、関連スクリーニング手順に続いて、突然変異誘発、組換え、および／またはシャフリングの公知の方法を用いて、試験可能である。使用可能な他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（たとえば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および領域指向突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャフリング方法は、宿主細胞により発現されたクローン化突然変異ポリペプチドの活性を検出するために、ハイスループット自動スクリーニング方法と組み合わせることが可能であるＮｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収して、当技術分野の標準的方法を用いて迅速に配列決定することが可能である。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
ポリペプチドは、一方のポリペプチドの領域が他方のポリペプチドの領域のＮ末端またはＣ末端で融合されたハイブリッドポリペプチドであってもよい。
ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明に係るポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合された融合ポリペプチドまたは切断可能融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明に係るポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、当技術分野で公知であり、インフレームであるようにかつ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲートすることを含む。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテイン技術を用いて構築することも可能である（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含むことが可能である。融合タンパク質が分泌されると、この部位は、切断されて２つのポリペプチドを放出する。切断部位の例としては、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６、Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３、およびＣｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１、Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２、Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８、およびＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示される部位が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２リゾチームの結晶構造は、１．３Åの分解能で解析された。この構造の原子座標は、図６に示される。この原子座標を用いて、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２リゾチームまたは相同構造（たとえば、本発明に係る変異体）の構造を示す三次元モデルを発生することが可能である。
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２リゾチームは、Ｅ．Ｃ：番号３．２．１．１７に帰属されるＧＨ２５ヒドロラーゼファミリーに属する。触媒機構は、アノマー炭素の周りのコンフォメーションの正味保持配置を伴う古典的コシュランド保持機構であると考えられる。これは、多くの場合、共有結合グリコシル−酵素中間体が関与する二工程二重置換機構により達成される。反応は、２つのアミノ酸側鎖により提供される酸／塩基および求核的支援を用いて行われる。第１の工程（グリコシル化工程と呼ばれることが多い）では、１つのアミノ酸残基（Ｄ９５）は、アノマー中心を攻撃する求核剤の役割を果たしてアグリコンを置き換え、グリコシル酵素中間体を形成する。それと同時に、結合が切断される際、第２のアミノ酸残基（Ｅ９７）は、酸触媒として機能してグリコシド酸素をプロトン化する。第２の工程（脱グリコシル化工程と呼ばれることが多い）では、グリコシル酵素中間体は、水により加水分解され、この時点では、第２のアミノ酸残基（Ｅ９７）は、進入水分子を脱プロトン化する塩基触媒として作用する。酸基／塩基基のｐＫa値は、触媒作用の各工程でその役割を最適化するように触媒作用中に高値と低値との間で循環すると考えられる。
Ｘ線構造を用いて、アミノ酸残基Ｄ９５およびＥ９７（配列番号８を番号付けに用いる）は、触媒残基として同定されてきた。本発明の実施形態では（本明細書に挙げられた１つ以上の改変のほかに）、本発明に係るリゾチーム変異体のＥ９７およびＤ９５（配列番号８を番号付けに用いる）に対応するアミノ酸に改変を行わない。触媒機構のこの第１の工程では水（おそらくＯＨ−の形態で）が求核剤として機能しうるので、いくつかのリゾチーム分子からの求核剤の突然変異は、いくらかの触媒活性を維持すると推測される酵素をもたらしうることが知られている（Ｍａｌｃｏｌｍ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ，（１９８９），“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ａｓｐ−５２ ａｎｄ Ｇｌｕ−３５ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６（１），１３３−１３７）。
リゾチーム活性を有する変異体
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドの位置６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０に対応する１つ以上（たとえば複数）の位置での改変を含むかまたはそれからなる。ただし、各改変は、独立して、置換、挿入、または欠失であり、変異体は、抗微生物活性および／またはリゾチーム活性を有する。
一実施形態では、改変は置換である。他の実施形態では、改変は挿入である。さらなる実施形態では、改変は欠失である。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号４の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
本発明に係るリゾチーム変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むかまたはそれからなる。
一態様では、本発明に係る変異体中の改変の数は、１〜４５、たとえば、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、および１〜５であり、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５個の改変である。
他の態様では、変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドの位置６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８、１６１、１６２、１７８、１８３、および１９０に対応する１つ以上（たとえば複数）の位置に置換、挿入、欠失などの改変を含む。他の態様では、変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドの位置６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８、１６１、１６２、１７８、１８３、および１９０のいずれかに対応する２つの位置での改変を含む。他の態様では、変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドの位置６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８、１６１、１６２、１７８、１８３、および１９０のいずれかに対応する３つの位置での改変を含む。他の態様では、変異体は、配列番号８の成熟ポリペプチドの位置６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８、１６１、１６２、１７８、１８３、および１９０に対応する各位置での改変を含む。
本発明の一実施形態は、リゾチーム活性および／または抗微生物活性を維持しつつリゾチームのｐＨ活性プロファイルを改変することである。本発明の好ましい実施形態は、リゾチームがよりアルカリ性のｐＨで改良された活性を有することである。すなわち、ピークの抗微生物活性またはリゾチーム活性のｐＨは、増加する／よりアルカリ性になる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１０（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームのｐＨ活性プロファイルを改変する位置１０（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、改変は、ピーク抗微生物活性のｐＨを増大させる置換Ｗ１０Ｈを含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置３９（配列番号８を番号付けに用いる）の改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームのｐＨ活性プロファイルを改変する位置３９（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、改変は、ピーク抗微生物活性のｐＨを増大させる置換Ｓ３９Ｄを含むかまたはそれからなる。
他の実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、次の位置、すなわち、６、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う位置１０（配列番号８を番号付けに用いる）での改変からなる。好ましい実施形態は、次の位置、すなわち、６、１１、２８、３０、３３、３７、３９、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う置換Ｗ１０Ｈである。
他の実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、次の位置、すなわち、６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う位置３９（配列番号８を番号付けに用いる）での改変からなる。好ましい実施形態は、次の位置、すなわち、６、１０、１１、２８、３０、３３、３７、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う置換Ｓ３９Ｄである。
さらなる実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１０および３９（配列番号８を番号付けに用いる）での改変からなる。好ましい実施形態は、置換Ｗ１０ＨおよびＳ３９Ｄからなる。
さらなる実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、次の位置、すなわち、６、１１、２８、３０、３３、３７、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う位置１０および３９（配列番号８を番号付けに用いる）での改変からなる。好ましい実施形態は、次の位置、すなわち、６、１１、２８、３０、３３、３７、５９、６０、６１、６２、６３、９２、９３、９４、９６、９８、９９、１００、１０１、１０６、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４２、１４３、１５８の、１６１、１６２、１７８、１８３、および／または１９０の１つ以上での改変を伴う置換Ｗ１０ＨおよびＳ３９Ｄである。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置６（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置６（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１１（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１１（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置３０（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置３０（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置３３（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置３３（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置３７（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置３７（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１０１（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１０１（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１３９（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１３９（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１６１（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１６１（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１６２（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１６２（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１８３（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１８３（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、本発明に係る単離された変異体は、位置１９０（配列番号８を番号付けに用いる）での改変を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、改変は、リゾチームの基質特異性を改変する位置１９０（配列番号８を番号付けに用いる）でのアミノ酸の置換を含むかまたはそれからなる。
リゾチーム活性を有するポリペプチドの供給源
本発明に係るリゾチーム活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から取得しうる。本発明の目的では、所与の供給源との関連で本明細書で用いられる「から取得される」という用語は、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、供給源によりまたは供給源からのポリヌクレオチドが挿入された株により生成されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から取得されるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
ポリペプチドは、菌類ポリペプチドでありうる。たとえば、ポリペプチドは、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のポリペプチドなどの糸状菌ポリペプチドでありうる。
他の態様では、ポリペプチドは、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギウス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・スブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のポリペプチドである。
他の態様では、ポリペプチドは、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ポリペプチド、たとえば、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ １１４．９２から得られるポリペプチドである。
以上に挙げた種に対して、本発明が、知られている種名にかかわらず、完全世代および不完全世代の両方ならびに他の分類学的等価世代、たとえば、アナモルフを包含することは、理解されよう。当業者であれば、適切な等価世代が何であるかは、容易にわかるであろう。
これらの種の株は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、独国微生物・細胞培養株保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）、菌類培養株中央局（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、農業研究局特許培養株保存機関北部研究センター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などのいくつかの培養株保存機関で一般に容易に利用可能である。
ポリペプチドは、以上に挙げたプローブを用いて、自然界（たとえば、土壌、コンポスト、水など）、または自然物質（たとえば、土壌、コンポスト、水など）から直接取得したＤＮＡサンプルから単離された微生物を含む他の供給源から同定および取得しうる。自然の生息地から直接微生物およびＤＮＡを単離する技術は、当技術分野で周知である。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の微生物のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーまたは混合ＤＮＡサンプルを同様にスクリーニングすることにより取得しうる。プローブを用いてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出した後、当業者に公知の技術を利用することにより、ポリヌクレオチドを単離またはクローニングすることが可能である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａを参照されたい）。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載したように、本発明に係るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
ポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用される技術は、当技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはそれらの組合せからの単離を含む。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、たとえば、発現ライブラリーの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて、共有される構造上の特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出することにより、行うことが可能である。たとえば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）、ポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅手順を使用することが可能である。ポリヌクレオチドは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もしくはアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）または関連生物の株からクローニングしうるので、ポリヌクレオチドのポリペプチドコード領域の対立遺伝子変異体または種変異体でありうる。
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、このポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを合成するために必要でありうる。このポリペプチドに「実質的に類似した」という用語は、このポリペプチドの天然に存在しない形態を意味する。これらのポリペプチドは、いくらか工学操作されているという点で、その天然源から単離されたポリペプチドと異なりうる。たとえば、比活性、熱安定性、ｐＨ最適値などが異なる変異体でありうる。変異体は、配列番号３、配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列もしくはそのｃＤＮＡ配列として提示されるポリヌクレオチドに基づいて（たとえば、それらのサブ配列）、および／またはポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらさないが、酵素の産生が意図された宿主生物のコドン使用頻度に対応する、ヌクレオチド置換を導入することにより、または異なるアミノ酸配列を生じうるヌクレオチド置換を導入することにより、構築しうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、たとえば、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７を参照されたい。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合可能な条件下で好適な宿主細胞内でコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供すべくさまざまな方法で操作可能である。ベクター中への挿入前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して、望ましいこともあれば必要なこともある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを改変する技術は、当技術分野で周知である。
制御配列は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するための宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドであるプロモーターでありうる。プロモーターは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異プロモーター、トランケートプロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含めて、宿主細胞内で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドでありうる。また、宿主細胞に対して同種または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得しうる。
細菌宿主細胞内で本発明に係る核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターの例は、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモーター（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、さらにはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から取得されるプロモーターである。さらなるプロモーターは、“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”ｉｎ Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａに記載されている。タンデムプロモーターの例は、国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
糸状菌宿主細胞内で本発明に係る核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｄａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼの遺伝子から取得されるプロモーター、さらにはＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（非翻訳リーダーが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子トリオースリン酸イソメラーゼからの非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属中性α−アミラーゼからの修飾プロモーター、例としては、非翻訳リーダーが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない）、ならびにそれらの突然変異プロモーター、トランケートプロモーター、およびハイブリッドプロモーターである。
酵母宿主では、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から取得される。酵母宿主細胞用の他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により記載されている。
制御配列はまた、転写を終了するように宿主細胞により認識される転写ターミネーターでありうる。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に機能可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のターミネーターを本発明に使用しうる。
細菌宿主細胞用の好ましいターミネーターは、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞用の好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から取得される。
酵母宿主細胞用の好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から取得される。酵母宿主細胞用の他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａにより記載されている。
制御配列はまた、遺伝子の発現を増大させる、プロモーターの下流かつ遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化剤領域でありうる。
好適なｍＲＮＡ安定化剤領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーでありうる。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に機能可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のリーダーを使用しうる。
糸状菌宿主細胞用の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から取得される。
酵母宿主細胞用の好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から取得される。
制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’末端に機能可能に連結された配列であるポリアデニル化配列でありうる。これは、転写時、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される。宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列を使用しうる。
糸状菌宿主細胞用の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞用の有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０により記載されている。
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードする、かつポリペプチドを細胞の分泌経路中に誘導する、シグナルペプチドコード領域でありうる。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、本質的に、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントに翻訳リーディングフレーム内で天然に連結されたシグナルペプチドコード配列を含有しうる。他の選択肢として、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来起源のシグナルペプチドコード配列を含有しうる。コード配列が天然にシグナルペプチドコード配列を含有しない場合、外来シグナルペプチドコード配列が必要とされうる。他の選択肢として、外来シグナルペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を単純に置き換えうる。しかしながら、宿主細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード配列が使用しうる。
細菌宿主細胞用の有効シグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７により記載されている。
糸状菌宿主細胞用の有効シグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、およびリゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から取得されるシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞用の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から取得される。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａにより記載されている。
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列でありうる。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合にはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは、一般的には不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒切断または自己触媒切断により活性ポリペプチドに変換可能である。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子の遺伝子から取得しうる。
シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端に隣接して位置する。
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を添加することが望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在をはじめとする化学的または物理的な刺激に対する反応で遺伝子の発現のオンオフの切換えを引き起こすものである。原核系の調節系は、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系を含む。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用可能である。糸状菌では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ α−アミラーゼプロモーター、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーターを使用可能である。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系では、この調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に機能可能に連結されるであろう。
発現ベクター
本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドと、プロモーターと、転写および翻訳停止シグナルと、を含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列を連結一体化することにより、１つ以上の便利な制限部位を含んでそのような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能にしうる組換え発現ベクターを生成しうる。他の選択肢として、ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現用の適切なベクター中に挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現しうる。発現ベクターの形成では、コード配列は、コード配列が発現用の適切な制御配列に機能可能に連結されるようにベクター中に位置する。
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に付すことが可能である、かつポリヌクレオチドの発現を引き起こすことが可能である、任意のベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス）でありうる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状または閉環状のプラスミドであってもよい。
ベクターは、自律的複製ベクター、すなわち、染色体外要素として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、たとえば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってよい。ベクターは、自己複製を保証するためのなんらかの手段を含有していてもよい。他の選択肢として、ベクターは、宿主細胞に導入された時、ゲノム中に組み込まれて、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡまたはトランスポゾンを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用してもよい。
ベクターは、好ましくは、トランスフォーム細胞、トランスフェクト細胞、トランスデュース細胞、または類似の細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、産物が、殺生物剤、またはウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを提供する、遺伝子である。
細菌性選択可能マーカーの例は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、スペクチノマイシン耐性、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞用の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３を含むが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で使用するための選択可能マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、さらにはそれらの等価体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、およびストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組込みまたはゲノムとは独立して細胞内でのベクターの自律複製を可能にする要素を含有する。
宿主細胞ゲノム中への組込みでは、ベクターは、相同的または非相同的組換えによるゲノム中への組込みのために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列またはベクターの任意の他のエレメントに依拠しうる。他の選択肢として、ベクターは、染色体中の正確な位置での宿主細胞のゲノム中への相同的組換えによる組込みを誘導すべく、追加のポリヌクレオチドを含有しうる。正確な位置での組込みの可能性を増加させるために、組込みエレメントは、相同的組換えの可能性を向上させるように対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する十分な数の核酸、たとえば、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、および８００〜１０，０００塩基対を含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列でありうる。さらに、組込みエレメントは、非コードまたはコードポリヌクレオチドでありうる。一方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる。
自律複製のために、ベクターは、対象の宿主細胞内でベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含みうる。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケーターでありうる。「複製起点」または「プラスミドレプリケーター」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏでプラスミドまたはベクターの複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、およびｐＡＣＹＣ１８４ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、およびｐＡＭβ１の複製起点である。
酵母宿主細胞で使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。
糸状菌細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５、国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびこの遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示される方法に従って達成可能である。
ポリペプチドの産生を増加させるために、本発明に係るポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞内に挿入しうる。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノム中に組み込むことにより、またはポリヌクレオチドと共に増幅可能選択可能マーカー遺伝子を組み込むことにより、取得可能であり、この場合、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーつまりポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能作用剤の存在下で細胞を培養することにより、選択可能である。
以上に記載のエレメントをライゲートして本発明に係る組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａを参照されたい）。
シグナルペプチド
本発明はまた、次のアミノ酸、すなわち、配列番号４のアミノ酸１〜１９または配列番号４のアミノ酸−４０〜−１８を含むまたはそれらからなるシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドに機能可能に連結されたタンパク質をコードする遺伝子をさらに含みうる。タンパク質は、好ましくは、シグナルペプチドに対して外来性である。一態様では、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド１〜５７または配列番号７のヌクレオチド１〜６９である。
本発明はまた、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸構築物、発現ベクター、および組換え宿主細胞に関する。
本発明はまた、（ａ）そのようなポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養することと、（ｂ）タンパク質を回収することと、含む、タンパク質の産生方法に関する。
タンパク質は、天然型でありうるかまたは宿主細胞に対して異種でありうる。「タンパク質」という用語は、本明細書では、特定の長さのコード産物を意味するものとみなされないので、ペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを包含する。「タンパク質」という用語はまた、コード産物を形成するように結合される２つ以上のポリペプチドを包含する。タンパク質はまた、ハイブリッドポリペプチドおよび融合ポリペプチドを含む。
好ましくは、タンパク質は、ホルモン、酵素、レセプターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはレポーターである。たとえば、タンパク質は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、たとえば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、またはβ−キシロシダーゼでありうる。
遺伝子は、任意の原核生物源、真核生物源、または他の供給源から取得されうる。
宿主細胞
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物またはベクターは、構築物またはベクターが染色体内組込み体としてまたは先に記載の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞内に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異に起因して親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、かなりの程度まで、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に依存するであろう。
宿主細胞は、本発明に係るポリペプチドの組換え産生に有用な任意の細胞、たとえば、原核細胞または真核細胞でありうる。
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌またはグラム陰性菌細菌でありうる。グラム陽性細菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オーシャノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞をはじめとする任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞でありうる。
細菌宿主細胞はまた、限定されるものではないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ． Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の細胞をはじめとする任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でありうる。
細菌宿主細胞はまた、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞をはじめとする任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞でありうる。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照されたい）により、コンピテント細胞トランスフォーメーション（たとえば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照されたい）、エレクトロポレーション（たとえば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照されたい）、またはコンジュゲーション（たとえば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照されたい）を用いて、行いうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照されたい）またはエレクトロポレーション（たとえば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照されたい）により、行いうる。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、プロトプラストトランスフォーメーション、エレクトロポレーション（たとえば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照されたい）、コンジュゲーション（たとえば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照されたい）、またはトランスダクション（たとえば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照されたい）により、行いうる。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（たとえば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照されたい）またはコンジュゲーション（たとえば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照されたい）により、行いうる。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞内へのＤＮＡの導入は、ナチュラルコンピテンス（たとえば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照されたい）、プロトプラストトランスフォーメーション（たとえば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７を参照されたい）、エレクトロポレーション（たとえば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照されたい）、またはコンジュゲーション（たとえば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照されたい）により、行いうる。しかしながら、宿主細胞内にＤＮＡを導入するための当技術分野で公知の任意の方法を使用可能である。
宿主細胞はまた、真核細胞、たとえば、哺乳動物、昆虫、植物、または菌類の細胞でありうる。
宿主細胞は、菌類細胞でありうる。本明細書で用いられる「菌類」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）ならびに菌界卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）および栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）を含む。
菌類宿主細胞は、酵母細胞でありうる。本明細書で用いられる「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、有担子胞子酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来変更される可能性があるので、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるように定義されるものとする。
酵母宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞、たとえば、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞でありうる。
菌類宿主細胞は、糸状菌細胞でありうる。「糸状菌」は、細分類の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および菌界卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ｓｕｐｒａにより定義される）のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、一般的には、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合ポリサッカリドで構成される菌糸体壁により特徴付けられる。栄養成長は、菌糸伸長により、炭素異化は、偏性好気性である。これとは対照的に、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養成長は、単細胞葉状体の発芽により、炭素異化は、発酵性でありうる。
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオラス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞でありうる。
たとえば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギウス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コプリナス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブキナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラディアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞でありうる。
菌類細胞は、それ自体公知のように、プロトプラストの形成、プロトプラストのトランスフォーメーション、および細胞壁の再生を含む過程により、トランスフォームされうる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の宿主細胞のトランスフォーメーションに好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種をトランスフォームするのに好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、およびＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０により記載された手順を用いてトランスフォームしうる。
産生方法
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を助長する条件下で、ポリペプチドをその野生型形態で産生する細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドの産生方法に関する。 好ましい態様では、細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の細胞である。より好ましい態様では、細胞は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）の細胞である。最も好ましい態様では、細胞は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２である。
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生を助長する条件下で本発明に係る組換え宿主細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドの産生方法に関する。
宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、ポリペプチドの産生に好適な栄養培地中で培養される。たとえば、細胞は、振盪フラスコ培養により、または好適な培地中でかつポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で行われる実験室用または工業用の発酵槽内での小スケールまたは大スケールの発酵（連続発酵、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、または固形発酵を含む）により、培養しうる。培養は、当技術分野で公知の手順を用いて、炭素源および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または発表された組成（たとえば、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにあるもの）に従って調製しうる。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは、培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から回収可能である。
ポリペプチドは、たとえば以下に記載するようなリゾチームスポットアッセイなど、ポリペプチドに特異的な当技術分野で公知の方法を用いて検出しうる。この検出方法は、特異的抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失を含むが、これらに限定されない。たとえば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を決定しうる。
ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて回収しうる。たとえば、ポリペプチドは、限定されるものではないが、回収、遠心分離、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発、または沈殿をはじめとする従来の手順により、栄養培地から回収しうる。
ポリペプチドは、限定されるものではないが、実質的に純粋なポリペプチドが得られるように、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（たとえば、分取等電点フォーカシング）、溶解度差（たとえば、硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）をはじめとする当技術分野で公知のさまざまな手順により、精製しうる。
代替態様では、ポリペプチドを回収せずに、ポリペプチドを発現する本発明に係る宿主細胞をポリペプチドの供給源として使用する。
植物
本発明はまた、回収可能量でポリペプチドまたはドメインを発現および産生するように本発明に係るポリヌクレオチドを含む単離された植物、たとえば、トランスジェニック植物、植物体各部、または植物細胞に関する。ポリペプチドまたはドメインは、植物または植物体各部から回収しうる。他の選択肢として、ポリペプチドまたはドメインを含有する植物または植物体各部は、食品または飼料の品質を向上させるために、たとえば、栄養価、嗜好性、およびレオロジー性を向上させるために、または抗栄養因子を破壊するために、そのまま使用してもよい。
トランスジェニック植物は、双子葉（双子葉植物）または単子葉（単子葉植物）でありうる。単子葉植物の例は、イネ科草本、たとえば、牧草（ブルーグラス、イチゴツナギ属（Ｐｏａ））、飼料草、たとえば、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、寒地型牧草、たとえば、ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ならびに穀草、たとえば、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、およびメイズ（トウモロコシ）である。
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえば、ルピナス、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウ、インゲン、およびダイズ、ならびにアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、たとえば、カリフラワー、ナタネ、および近縁型生物アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。
植物体各部の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎、さらにはこれらの各部を構成する個々の組織、たとえば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、空胞、ペルオキシソーム、細胞質などの特定の植物細胞区画もまた、植物体各部であるとみなされる。さらに、組織の起源にかかわらず、いずれの植物細胞も、植物体各部であるとみなされる。同様に、本発明に係る利用を容易にすべく単離された特定の組織や細胞などの植物体各部、たとえば、胚、胚乳、アリューロン、および種皮も、植物体各部とみなされる。
このほかに本発明の範囲内に包含されるのは、そのような植物、植物体各部、および植物細胞の後代である。
ポリペプチドまたはドメインを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当技術分野で公知の方法に従って作製しうる。簡単に言えば、植物または植物細胞は、ポリペプチドまたはドメインをコードする１つ以上の発現構築物を植物宿主ゲノム中または葉緑体ゲノム中に組み込んで、得られた修飾植物または植物細胞を成長させてトランスジェニック植物または植物細胞にすることにより、作製される。
発現構築物は、便宜上、ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを、選択された植物または植物体各部におけるポリヌクレオチドの発現に必要とされる適切な調節配列に機能可能に連結して含む、核酸構築物である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた植物細胞の同定に有用な選択可能マーカーと、対象の植物中への構築物の導入に必要なＤＮＡ配列と、を含みうる（後者は、使用されるＤＮＡ導入方法に依存する）。
調節配列、たとえば、プロモーター配列およびターミネーター配列ならびに任意選択でシグナル配列またはトランジット配列の選択は、たとえば、ポリペプチドまたはドメインがいつ、どこで、どのように発現されることが望まれるかに基づいて、決定される。たとえば、ポリペプチドまたはドメインをコードする遺伝子の発現は、構成的もしくは誘導的でありうるか、または進行的、期特異的、もしくは組織特異的でありうる。また、遺伝子産物は、種子や葉などの特定の組織または植物体各部を標的としうる。調節配列は、たとえば、Ｔａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８６：５０６により記載されている。
構成的発現では、３５Ｓ−ＣａＭＶ、メイズユビキチン１、またはイネアクチン１プロモーターを使用しうる（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２１：２８５−２９４、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１５５−１１６５）。器官特異的プロモーターは、たとえば、種子、ジャガイモ塊茎、果実などの貯蔵シンク組織由来（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）もしくは分裂組織などの代謝シンク組織由来（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８６３−８７８）のプロモーター、イネ由来のグルテリン、プロラミン、グロブリン、アルブミンプロモーターなどの種子特異的プロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：８８５−８８９）、ビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）由来のレグミンＢ４および未知種子タンパク質遺伝子のビシア・ファバ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）プロモーター（Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：７０８−７１１）、種子油体タンパク質由来のプロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：９３５−９４１）、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来の貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター、またはたとえば国際公開第９１／１４７７２号パンフレットに記載の当技術分野で公知の任意の他の種子特異的プロモーターでありうる。さらに、プロモーターは、イネもしくはトマト由来のｒｂｃプロモーターなどの葉特異的プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：９９１−１０００）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｍｉｔｒａ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、イネ由来のａｌｄＰ遺伝子プロモーター（Ｋａｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８：６６８−６７４）、またはジャガイモｐｉｎ２プロモーターなどの創傷誘導性プロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８）でありうる。同様に、プロモーターは、温度、乾燥、塩分変化などの非生物的処理により誘導しうるか、またはプロモーターを活性化する外的適用物質、たとえば、エタノール、エストロゲン、植物ホルモン、たとえば、エチレン、アブシジン酸、およびジベレリン酸、ならびに重金属により誘導しうる。
また、プロモーターエンハンサーエレメントを用いて、植物でポリペプチドまたはドメインのより高い発現を達成しうる。たとえば、プロモーターエンハンサーエレメントは、プロモーターとポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドとの間に配置されたイントロンでありうる。たとえば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａには、発現を促進するためのイネアクチン１遺伝子の第１のイントロンの使用が開示されている。
発現構築物の選択可能マーカー遺伝子および任意の他の部分は、当技術分野で利用可能なものから選択しうる。
核酸構築物は、アグロバクテリウム媒介トランスフォーメーション、ウイルス媒介トランスフォーメーション、マイクロインジェクション、粒子照射、バイオリスティックトランスフォーメーション、およびエレクトロポレーションをはじめとする当技術分野で公知の従来技術により、植物ゲノム中に組み込まれる（Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５３５、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４）。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子移入は、トランスジェニック双子葉植物の形成に最適な方法であり（レビューについては、Ｈｏｏｙｋａｓ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５−３８を参照されたい）、単子葉植物をトランスフォームするためにも使用可能であるが、この植物に対しては、他のトランスフォーメーション法を使用することが多い。トランスジェニック単子葉植物の形成に最適な方法は、胚性カルスまたは発生胚の粒子照射（トランスフォーミングＤＮＡで被覆された微細な金またはタングステン粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：２７５−２８１、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１５８−１６２、Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７−６７４）。単子葉植物のトランスフォーメーションの代替方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１５−４２８により記載されたプロトプラストトランスフォーメーションに基づく。追加のトランスフォーメーション法としては、米国特許第６，３９５，９６６号明細書および同第７，１５１，２０４号明細書（両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
トランスフォーメーション後、当技術分野で周知の方法に従って、発現構築物が組み込まれた形質転換体を選択し、全植物体に再生する。多くの場合、トランスフォーメーション手順は、たとえば、２つの個別のＴ−ＤＮＡ構築物によるコトランスフォーメーションまたは特異的リコンビナーセによる選択遺伝子の部位特異的切除を用いて、再生中または後続の世代のいずれかで、選択遺伝子の選択的除去を行うように設計される。
本発明に係る構築物による特定の植物遺伝子型の直接的トランスフォーメーションに加えて、トランスジェニック植物は、構築物を有する植物を構築物が欠如している第２の植物に交配することにより作製しうる。たとえば、ポリペプチドまたはドメインをコードする構築物は、所与の品種の植物をなんら直接トランスフォームする必要なく、交配により特定の植物品種に導入することが可能である。したがって、本発明は、本発明に従ってトランスフォームされた細胞から直接再生された植物だけでなく、そのような植物の後代をも包含する。本明細書で用いられる場合、後代は、本発明に従って作製された親植物の任意の世代の子孫を意味しうる。そのような後代は、本発明に従って作製されたＤＮＡ構築物を含みうる。交配の結果として、出発系をドナー植物系で他花受粉することにより植物系にトランスジーンが導入される。そのような工程の例は、米国特許第７，１５１，２０４号明細書に記載されているが、これらに限定されるものではない。
植物は、戻し交配転換の過程により形成しうる。たとえば、植物は、戻し交配転換された遺伝子型、系統、純系、または雑種として参照される植物を含む。
遺伝子マーカーは、一方の遺伝的背景から他方の遺伝的背景への本発明に係る１つ以上のトランスジーンの遺伝子移入を支援すべく使用しうる。マーカー支援選択は、表現型変異に起因する誤差を回避すべく使用可能であるという点で、従来の育種と比べて利点を提供する。さらに、遺伝子マーカーは、特定の交配の個々の後代中のエリート生殖質の相対次数に関するデータを提供しうる。たとえば、所望の形質を有する以外に非作物学的に望ましい遺伝的背景を有する植物をエリート親に交配する場合、対象の形質を有するだけでなく所望の生殖質の割合が比較的大きい後代を選択すべく、遺伝子マーカーを使用しうる。このようにして、特定の遺伝的背景に１つ以上の形質を遺伝子移入するのに必要とされる世代数は、最小化される。
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドまたはドメインの産生を助長する条件下で、ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養することと、（ｂ）ポリペプチドまたはドメインを回収することと、を含む、本発明に係るポリペプチドまたはドメインの産生方法に関する。
使用
本発明に係るリゾチームまたはその組成物の好ましい使用例は、以下に与えられる。リゾチームの投与量およびリゾチームが使用される他の条件は、当技術分野で公知の方法に基づいて決定されうる。
本発明に係るポリペプチドは、典型的には、細菌、菌類、酵母、または藻類による汚染に晒される任意の場所に有用である。典型的には、場所は、微生物を死滅させたりまたは少なくともその増殖を抑制したりすることが望まれる、水性系、たとえば、冷却水系、洗濯濯ぎ水、油系、たとえば、切削油、潤滑剤、油田などである。しかしながら、本発明はまた、公知のリゾチーム組成物が有用であるすべての用途、たとえば、木材、ラテックス、接着剤、膠、紙、カードボード、テキスタイル、皮革、プラスチック、コーキング、および飼料の保護に使用されうる。
本発明に係るリゾチームまたはその組成物は、材料をリゾチームまたはその組成物で処理することによりペプチドグリカンまたはキトデキストリンを含む材料を分解すべく、いくつかの用途で使用されうる（たとえば、Ｐｒｏｃｔｏｒ ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，（１９８８）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２６：３５９−３９５、Ｃａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｌｉｍｅｎ．Ｎｕｔｒ．３：２９９−３２０、Ｈｕｇｈｅｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２１６５−２１７０、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｗｏｒｌｄ’ｓ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ４７：１４１−１６３を参照されたい）。
クリーニングおよび／または洗剤のための本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームは、好ましくは、以下に記載の洗剤組成物中に組み込まれ、かつ／またはそれと一緒に使用される。洗浄／洗濯が６０℃未満の温度で繰返し行われる場合、洗浄／洗濯機（衣類洗濯さらには食器洗浄）内でおよび機械で洗浄／洗濯されたテキスタイル上または物品上で悪臭を増大させるリスクが存在する。この悪臭は、洗浄／洗濯機内で増殖する微生物、たとえば、細菌、菌類、藻類、または他の単細胞生物により引き起こされる可能性が高い。
さらに、本発明は、洗剤組成物と本発明に係るリゾチームまたはリゾチーム組成物とを含有する洗濯溶液で布を処理することを含む、布の洗濯プロセスに関する。洗濯処理は、たとえば、機械洗濯プロセスまたは手動洗濯プロセスで行うことが可能である。洗濯溶液は、たとえば、洗剤組成物を含有する３〜１２のｐＨの水性洗濯溶液である。
本発明に係る方法に付される布は、従来の洗濯可能な洗濯物（たとえば、家庭の洗濯物）でありうる。好ましくは、洗濯物の大部分は、綿、綿混紡、あるいは天然もしくは人造のセルロース（たとえば、木材パルプ由来）またはそれらの混紡から作製された編布、織布、デニム、糸、およびタオル地を含む衣類および布である。混紡の例は、綿またはレーヨン／ビスコースと、１つ以上の併用材料、たとえば、羊毛、合成繊維（たとえば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）、およびセルロース含有繊維（たとえば、レーヨン／ビスコース、ラミー、アマ／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リヨセル）と、の混紡である。
本発明は、本発明に係るリゾチームまたはリゾチーム組成物で微生物汚染表面を処理することにより、テキスタイル衣類などの表面上、または洗浄／洗濯機内もしくは食器洗浄機内の金属製、プラスチック製、もしくはゴム製の部品、浴室タイル、床、テーブルトップ、排水管、流し台、洗面器などの硬質表面上の微生物汚染を低減する方法を提供する。そのような処理はまた、微生物汚染を含むテキスタイル上および硬質表面上の悪臭を低減すると予想される。
微生物汚染の低減は、いくつかの方法により評価することが可能であり、たとえば、臭気が低減されたかを審査員が評価することが可能であり、他の選択肢として、サンプルを表面から採取して培養し、リゾチームを用いない処理と比較して処理の結果として微生物数が低減されたかを評価することが可能である。
動物用飼料における本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームはまた、動物用飼料で使用されうる。一実施形態では、本発明は、本発明に係るリゾチームを１つ以上の動物用飼料成分に添加することを含む、動物用飼料組成物の調製方法を提供する。
本発明に係るリゾチームは、たとえば、ウイルス（たとえば、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢を引き起こすペルシウイルス属（Ｐｅｒｓｉｖｉｒｕｓ）など）、寄生性病原体（コクシジウム原虫、アイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）、アイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍｉｔｉｓ））、または細菌性病原体、たとえば、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、Ｃ．ヒオインテスティナリス（Ｃ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、およびＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）の亜種、トレポネマ・スイス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｕｉｓ）、ブラキスピラ・ヒオディセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、ならびにサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、たとえば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびサルモネラ・ムバンダカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｂａｎｄａｋａ）の増殖／腸内定着を抑制することにより、動物、特定的には、家畜、たとえば、限定されるものではないが、ヒツジ、ヤギ、ウシ（限定されるものではないが、肉牛、乳牛、および仔牛が含まれる）、シカ、ブタまたはイノシシ（限定されるものではないが、仔豚、育成豚、および雌豚が含まれる）、家禽（限定されるものではないが、ガチョウ、シチメンチョウ、アヒル、およびニワトリ、たとえば、ブロイラー、ヒヨコ、および産卵鶏が含まれる）、ウマ、ムース、およびウサギ、さらには魚介類（限定されるものではないが、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、およびコイ、ならびに甲殻類（限定されるものではないが、シュリンプおよびプローンが含まれる）が含まれる）の健常微生物叢を安定化するために使用されうる。好ましい実施形態では、リゾチームは、ニワトリに適用され、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に対する抗微生物活性を有する。さらなる実施形態では、本発明に係るリゾチームは、ニワトリ消化管の微生物バランスに好影響を及ぼし、このようにして動物生産性を改良する飼料添加物として使用される。
本発明に係るリゾチームはまた、国際公開第００／２１３８１号パンフレットおよび国際公開第０４／０２６３３４号パンフレットに従って、飼料消化率を改良してその利用効率を増大させる飼料強化酵素として、動物用飼料で使用されうる。
さらなる実施形態では、本発明に係るリゾチームは、動物消化管に好影響を及ぼし、このようにして、体重増加、飼料要求率（ＦＣＲ）、または改良された動物の健康、たとえば、低減された死亡率に基づいて、動物生産性を改良する飼料添加物として使用されうる。ＦＣＲは、ｇ単位体重増加／動物に対するｇ単位飼料摂取量／動物として計算される。
抗微生物剤としての本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームは、抗微生物剤として使用されうる。本発明の一態様は、微生物汚染表面を本発明に係るリゾチームで処理することを含む、微生物汚染の低減方法である。
本発明に係るリゾチームが抗微生物剤をとして作用することが可能であるかを評価するために、それを濁度アッセイ内に試験することが可能である。このアッセイでは、リゾチームが微生物細胞を分解可能であるかが試験される。たとえば、エキシグオバクテリウム・ウンデ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｎｄａｅ）細胞（悪臭のあるソックスから単離された）またはミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）細胞の乾燥基質を緩衝液または洗剤に溶解させることにより、緩衝液でのみ処理された微生物懸濁液と比較して、たとえば５４０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）が低減される。
消毒用または消毒剤としての本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームは、消毒剤として有用でありうるか、または消毒用として使用されうる。たとえば、眼内もしくは口内の感染の治療のために、またはコンタクトレンズのクリーニングおよび消毒のために、ならびに米国特許第６，７７７，２２３号明細書に記載の表面上のバイオフィルムを防止もしくは除去するために、使用されうる。
本発明に係るリゾチームはまた、口腔ケアに使用されうる。たとえば、リゾチームは、単独でまたは他の酵素さらには抗微生物ペプチドとの組合せで、練り歯磨きまたは他の口腔ケア製品で使用されうる。ポリペプチドは、口腔内に導入されうるか、または口腔に導入される物品に適用されうる。たとえば、国際公開第０８／１２４７６４号パンフレットを参照されたい。
一般的には、本発明に係るポリペプチドは、任意の表面上の微生物増殖のクリーニング、殺菌、または阻害に役立つと考えられる。本発明に係るポリペプチドと有利に接触させうる表面の例は、たとえば、酪農場、化学プロセスプラントまたは医薬プロセスプラント、下水処理システム、油処理プラント、紙パルプ処理プラント、水処理プラント、および冷却塔に使用されるプロセス装置の表面である。本発明に係るポリペプチドは、対象の表面上の微生物増殖のクリーニング、殺菌、または阻害に有効な量で使用すべきである。
本発明に係るポリペプチドは、そのほかに、食品加工プラントで、および食品が準備または給仕される任意の領域で、たとえば、病院、養護ホーム、およびレストランで、表面および調理具のクリーニングに使用されうる。
食品用途における本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームはまた、チーズ、特定的には、圧搾および加熱されたカードから作製されたもの、たとえば、スイスチーズ、パルメザンチーズ、エダムチーズ、ゴーダチーズ、チェダーチーズ、および多くの他のチーズの熟成中にクロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）の無制限増殖を選択的に阻害するために使用されうる。
本発明に係るリゾチームはまた、微生物汚染を抑制または阻害するためにワイン醸造に使用されうる。
治療剤としての本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームはまた、皮膚および軟組織の異栄養性および炎症性の病変の局所治療に使用されうる。たとえば、Ｐａｌｍｉｅｒｉ ａｎｄ Ｂｏｒａｌｄｉ（１９７７）Ａｒｃｈ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．（Ｔｏｒｉｎｏ）１３４：４８１−４８５を参照されたい。
本発明に係るリゾチームはまた、スキンケアに使用されうる。たとえば、ポリペプチドは、座瘡などの皮膚感染症に罹患している患者の皮膚に適用される。リゾチームはまた、たとえば、創傷の治癒を支援するために、創傷皮膚に適用される創傷ドレッシングに使用されうる。たとえば、米国特許出願第２００８０２５４０７９号明細書を参照されたい。
本発明に係るリゾチームはまた、リップスティック、リップバーム、リップジェル、またはリップグロスに使用されうる。たとえば、そのような製品は、局所口唇感染（たとえば、口唇ヘルペス）の治療に使用可能である。たとえば、米国特許出願第２００８０２５４０７９号明細書を参照されたい。
本発明に係るリゾチームはまた、気管支肺疾患の治療に使用されうる。
本発明に係るリゾチームはまた、消化酵素または消化助剤として使用されうる。本発明に係るリゾチームはまた、たとえば、望ましくない微生物汚染物質を抑制することにより、食品源としての死／生細菌の使用を改良するために使用されうる。
本発明に係るリゾチームはまた、たとえば、疾患に罹患しているヒト、たとえば、膵臓疾患または免疫無防備状態の患者の腸内の細菌過剰増殖を抑制または阻害するために、ヒトまたは他の動物において治療剤として使用されうる。
細菌ゲノムＤＮＡを抽出するための本発明に係るリゾチームの使用
本発明に係るリゾチームはまた、純粋培養サンプルおよび複数の細菌種を含有する環境サンプルの両方からの細菌ゲノムＤＮＡの抽出を支援するために使用されうる。細菌ＤＮＡを配列決定できるようにするために、細菌細胞壁を分解してその内側のＤＮＡを単離する必要がある。ニワトリ卵白リゾチームは、グラム陽性細菌からのＤＮＡ単離に使用される標準的酵素であり、細胞壁中に存在するペプチドグリカン鎖を加水分解して細胞壁の分解を支援することにより機能する。しかしながら、いくつかのグラム陽性細胞壁は、ニワトリ卵白リゾチームにより分解されない。たとえば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などの細胞は、Ｐｉｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９８９），Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（３）：７８２−７８７に記載されるように、リゾスタフィンを用いて溶解させることが推奨される。しかしながら、この方法は、すべてのタイプのグラム陽性細菌に対して奏効するわけではないので、市販のリゾチーム溶液を用いて単離できない新規なゲノムに対しては、新規なリゾチームが利用されることになろう。
本発明に係る１つ以上のリゾチームの添加は、任意選択でリゾスタフィンまたはニワトリ卵白リゾチームと併用して、現用の市販の溶液を用いてはできない細菌、好ましくはグラム陽性細菌の細胞壁の分解を可能にする。一実施形態では、リゾチームは、配列番号４、配列番号８を有するＧＨ２５リゾチームまたはそれらの変異体である。さらなる実施形態では、リゾチームは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゾベリア属（Ｚｏｂｅｌｌｉａ）、セルロファーガ属（Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌の細菌細胞壁を分解するのに有効である。追加の実施形態は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ゾベリア・ウリギノサ（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｕｌｉｇｉｎｏｓａ）、セルロファーガ・リティカ（Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ｌｙｔｉｃａ）、ストレプトマイセス・モバラエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）などの細菌である。他の実施形態では、リゾチームは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゾベリア属（Ｚｏｂｅｌｌｉａ）、セルロファーガ属（Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌、たとえば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ゾベリア・ウリギノサ（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｕｌｉｇｉｎｏｓａ）、セルロファーガ・リティカ（Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ｌｙｔｉｃａ）、およびストレプトマイセス・モバラエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）の細胞壁を分解する際、ニワトリ卵白リゾチームとの組合せが効果的である。特定の実施形態は、細菌ストレプトマイセス・モバラエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）の細胞壁を破壊する。
本発明に係るリゾチームは、任意選択でリゾスタフィンまたはニワトリ卵白リゾチームと併用して、細菌の細胞壁を破壊するために組成物またはキットに使用されうる。リゾチーム成分は、本発明に係るＧＨ２５リゾチーム、もしくは配列番号４、配列番号８を有するＧＨ２５リゾチームまたはそれらの変異体でありうる。
本発明に係るリゾチームの他の使用
本発明に係るリゾチームはまた、発酵プロセスで、たとえば、バイオマスからエタノールまたは他の製品を製造する際に、微生物増殖を抑制するために使用されうる。たとえば、国際公開第２００７／１０９７５０号パンフレットを参照されたい。したがって、リゾチームは、たとえば、（ａ）炭水化物材料を液化および／または糖化することと、（ｂ）発酵生物を用いて発酵することと、を含む発酵産物の製造プロセスに使用されうる。この場合、本発明に係るリゾチームは、発酵前、発酵中、および／または発酵後、細菌細胞の死滅および／または増殖阻害に十分な発酵濃度で発酵プロセスに適用される。
本発明に係るリゾチームはまた、養魚場またはエビ養殖場で微生物増殖を抑制するために使用されうる。
他の使用は、食品、飲料、化粧品、たとえば、ローション、クリーム、ジェル、軟膏、石鹸、シャンプー、コンディショナー、汗止め、デオドラント、酵素配合物、または食品成分の保存を含む。
組成物
またさらなる態様では、本発明は、抗微生物活性および／またはリゾチーム活性を有する本発明に係るポリペプチドを含む組成物に関する。
組成物は、主要酵素成分として本発明に係るポリペプチドを含みうる。たとえば、一成分組成物である。他の選択肢として、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼなどの複数の酵素活性を含みうる。
組成物は、当技術分野で公知の方法に従って調製されうる。また、液体組成物または乾燥組成物の形態でありうる。たとえば、ポリペプチド組成物は、顆粒またはマイクロ顆粒の形態でありうる。組成物に含まれるポリペプチドは、当技術分野で公知の方法に従って安定化されうる。
本発明に係るポリペプチド組成物の好ましい使用例は、以下に与えられる。本発明に係るポリペプチド組成物の投与量および組成物が使用される他の条件は、当技術分野で公知の方法に基づいて決定されうる。
細菌ゲノムＤＮＡ抽出組成物
本発明に係るリゾチームは、細菌からゲノムＤＮＡを抽出するための組成物に添加されうるので、その成分になりうる。リゾチームは、そのほかに、１種以上のさらなるリゾチーム、たとえば、限定されるものではないが、リゾスタフィン、ムタノリシン、またはニワトリ卵白リゾチームと組み合わせて、使用されうる。組成物は、細菌からゲノムＤＮＡを抽出するために一連の説明に従って混合一体化させうるキットの一部を形成しうる。キットは、緩衝液、１種以上の金属イオン結合剤たとえばＥＤＴＡ、プロテアーゼたとえばプロテイナーゼ（Ｋ）、洗剤たとえばＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ、および１種以上のリゾチーム、たとえば、本発明に係るＧＨ２５リゾチーム、リゾスタフィン、ムタノリシン、またはニワトリ卵白リゾチームを含有しうる。細菌ゲノムＤＮＡは、純粋培養サンプルおよび複数の細菌種を含有する環境サンプルの両方から抽出されうる。好ましい実施形態は、配列番号４、配列番号８を有するＧＨ２５リゾチームまたはそれらの変異体である。
動物用飼料組成物
本発明はまた、動物用飼料でリゾチーム活性を有する本発明に係るポリペプチドを使用する方法、さらには本発明に係るリゾチームを含む飼料組成物および飼料添加物に関する。
動物という用語は、ヒトをはじめとするすべての動物を含む。動物の例は、非反芻動物および反芻動物である。反芻動物としては、たとえば、ヒツジ、ヤギ、およびウシたとえば肉牛および乳牛などの動物が挙げられる。特定の実施形態では、動物は非反芻動物である。非反芻動物としては、単胃動物、たとえば、ブタまたはイノシシ（限定されるものではないが、仔豚、育成豚、および雌豚が含まれる）、家禽、たとえば、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、およびニワトリ（限定されるものではないが、ブロイラー、ヒヨコ、産卵鶏が含まれる）、ウマ（限定されるものではないが、熱血種、冷血種、および温血種が含まれる）、仔牛、ならびに魚介類（限定されるものではないが、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、およびコイ、ならびに甲殻類（限定されるものではないが、シュリンプおよびプローンが含まれる）が含まれる）が挙げられる。
飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に好適なまたはそれが目的の、任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を意味する。本発明に係る使用では、リゾチームは、食前、食後、または食事と同時に動物に供給可能である。後者が好ましい。そのようなリゾチーム組成物は、当然ながら、他の酵素と混合されうる。
リゾチームは、任意の形態で飼料に添加可能であり、比較的純粋なリゾチームとして添加してもよいし、または動物用飼料への添加が意図された他の成分と混合して、すなわち、動物用飼料添加物の形態で、たとえば、動物用飼料のためのいわゆる予備混合物の形態で添加してもよい。さらなる態様では、本発明は、動物用飼料に使用するための組成物、たとえば、動物用飼料および動物用飼料添加物たとえば予備混合物に関する。
本発明に係るリゾチームのほかに、本発明に係る動物用飼料添加物は、少なくとも１種の脂溶性ビタミン、および／または少なくとも種の水溶性ビタミン、および／または少なくとも種の微量ミネラル、および／または少なくとも種の多量ミネラルを含有する。
さらに、任意選択の飼料添加物成分は、着色剤、たとえば、カロテノイド、たとえば、β−カロテン、アスタキサンチン、およびルテイン、安定剤、成長改善添加剤および芳香化合物／風味剤、たとえば、クレオソール、アネトール、デカ、ウンデカ、および／またはドデカラクトン、イオノン、イロン、ギンゲロール、ピペリジン、プロピリデンフタリド、ブチリデンファタリド、カプサイシン、および／またはタンニン、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、反応性酸素発生種であり、また、たとえば、４０〜５０重量％の木質繊維、８〜１０重量％のステアリン、４〜５重量％のウコン粉末、４〜５８重量％のローズマリー粉末、２２〜２８重量％の石灰岩、１〜３重量％のガムたとえばアラビアガム、５〜５０重量％の糖および／またはデンプン、ならびに５〜１５重量％の水を含有しうる支持体が使用されうる。
本発明に係る飼料または飼料添加物はまた、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）、α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）、ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）、ホスホリパーゼＣ（３．１．４．３）、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）、アミラーゼ、たとえば、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）など、および／またはβ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４またはＥＣ３．２．１．６）から選択される少なくとも１種の他の酵素を含みうる。
多価不飽和脂肪酸の例は、Ｃ１８、Ｃ２０、およびＣ２２多価不飽和脂肪酸、たとえば、アラキドン酸、ドコソヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびガンマリノール酸である。
反応性酸素発生種の例は、化学品、たとえば、ペルボレート、ペルスルフェート、またはペルカーボネート、および酵素、たとえば、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、またはシンテターゼである。
通常、脂肪および水溶性ビタミンさらには微量ミネラルは、飼料への添加が意図されたいわゆる予備混合物の一部を形成し、一方、多量ミネラルは、通常、個別に飼料に添加される。これらの組成物タイプはいずれも、本発明に係るプロテアーゼで富化された場合、本発明に係る動物性飼料添加物である。
特定の実施形態では、本発明に係る動物用飼料添加物は、０．１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．５ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ、より好ましくは１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍのレベルで動物用食餌または動物用飼料に含まれることが意図される（または含まれなければならないとして処方される）。以上に挙げた投与レベルはまた、予備混合物に使用可能である。
本発明に係る動物用飼料組成物は、修飾タンパク質およびタンパク質誘導体を含めて、少なくとも１種の植物性タンパク質、たとえば、野菜から誘導されるものまたは野菜に由来するものを含有みうる。植物性タンパク質は、植物性タンパク質源、たとえば、マメおよびシリアル、たとえば、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物由来の材料、たとえば、大豆ミール、ルピナスミール、および菜種ミールから誘導されうる。他の選択肢として、植物性タンパク質源は、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、たとえば、ビート、サトウダイコン、ホウレンソウ、またはキノアの１つ以上の植物由来の材料である。植物性タンパク質源の他の例は、ナタネ、ヒマワリ種子、綿実、およびキャベツ、ならびに穀物、たとえば、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、メイズ（トウモロコシ）、コメ、ライコムギ、およびソルガムである。
本発明に係る動物用飼料組成物は、典型的には０〜２５％の量で、肉ならびに骨粉、羽毛粉、および／または魚粉などの動物性タンパク質をも含有しうる。本発明に係る動物用飼料組成物はまた、典型的には０〜３０％の量で、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）を含みうる。
またさらなる特定の実施形態では、本発明に係る動物用飼料組成物は、０〜８０％のメイズ、および／または０〜８０％のソルガム、および／または０〜７０％のコムギ、および／または０〜７０％のオオムギ、および／または０〜３０％のエンバク、および／または０〜４０％の大豆ミール、および／または０〜２５％の魚粉、および／または０〜２５％の肉および骨粉、および／または０〜２０％のホエーを含有する。
動物用食餌は、たとえば、マッシュ飼料（非ペレット化）またはペレット化飼料として製造可能である。典型的には、ミル処理飼料原料が混合され、そして対象種の仕様に準拠して十分量の必須ビタミンおよびミネラルが添加される。酵素は、固体または液体の酵素配合物として添加可能である。たとえば、マッシュ飼料では、固体または液体の酵素配合物が、成分混合工程の前またはその最中に添加されうる。また、ペレット化飼料では、（液体または固体）リゾチーム／酵素調製物が、飼料成分工程の前またはその最中に添加されうる。典型的には、液体リゾチーム／酵素調製物がペレット化工程後に添加されている。酵素はまた、飼料添加物または予備混合物に組み込まれうる。
食餌中の最終酵素濃度は、０．０１〜２００ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ食餌の範囲内、たとえば、０．５〜２５ｍｇ酵素タンパク質／ｋｇ動物用食餌の範囲内である。
クリーニング組成物または洗剤組成物
本発明に係るリゾチームは、洗剤組成物、とくに、７以下のｐＨを有する液体洗剤に添加されうるので、その成分になりうる。
本発明に係る洗剤組成物は、たとえば、汚れた布の前処理に好適な洗濯添加剤組成物を含む手洗い用もしくは機械用の衣類洗剤組成物およびリンス添加柔軟仕上げ剤組成物として配合されうるか、または一般家庭用硬質表面クリーニング操作で使用するための洗剤組成物として配合されうるか、または手洗い用もしくは機械用の食器洗浄操作のために配合されうる。
特定の態様では、本発明は、本発明に係るリゾチームを含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤さらには洗剤組成物は、１つ以上の他の酵素、たとえば、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、たとえば、ラッカーゼ、および／またはペルオキシダーゼを含みうる。
一般的には、所定の酵素の性質は、所定の洗剤（すなわち、ｐＨ最適値、他の酵素成分および非酵素成分との適合性など）に適合すべきであり、また、酵素は、有効量で存在すべきである。
一実施形態では、本発明は、１つ以上の追加のクリーニング成分と組み合わせて本発明に係る酵素を含むクリーニング組成物または洗剤組成物に関する。追加のクリーニング成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に示される例示的成分（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとする従来の成分を含む。
成分の選択は、テキスタイルの保護のために、クリーニングされるテキスタイルのタイプ、汚れのタイプおよび／または程度、クリーニングが行われる温度、ならびに洗剤製品の配合を考慮することを含みうる。以下に挙げる成分は、特定の機能に従って分類されるが、成分は、当業者であればわかるであろう１つ以上の追加の機能を有しうるので、これは、限定条件とみなされるべきではない。
クリーニング組成物または洗剤組成物は、テキスタイル、たとえば、布、クロス、またはリネンの洗濯に、または硬質表面、たとえば、床、テーブル、または食器洗浄物のクリーニングに好適でありうる。
本発明はまた、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター、および宿主細胞と、さらにはポリペプチドを産生および使用する方法と、に関する。
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／または非イオン性および／または半極性および／または双性イオン性またはそれらの混合物であってもよい１種以上の界面活性剤を含みうる。特定の実施形態では、洗剤組成物は、１種以上の非イオン性界面活性剤と１種以上のアニオン性界面活性剤との混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約０．１重量％〜６０重量％、たとえば、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約１０％のレベルで存在する。界面活性剤は、所望のクリーニング用途に基づいて選択され、当技術分野で公知の任意の従来型の界面活性剤を含む。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の界面活性剤を利用しうる。
洗剤は、その中に含む場合、通常、約１重量％〜約４０重量％、たとえば、約５％〜約３０％、たとえば、約５％〜約１５％または約２０％〜約２５％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の例としては、スルフェートおよびスルホネート、特定的には、線状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐状アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（スルフェート）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、アルキルスルフェート（ＡＳ）、たとえば、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、脂肪アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第一級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（ＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ、また、アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪アルコールエーテルスルフェートとしても知られる）、第二級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキルまたはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはスルホ石鹸のジエステルおよびモノエステル、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
洗剤は、その中に含む場合、通常、約０重量％〜約１０重量％のカチオン性界面活性剤を含有するであろう。カチオン性界面活性剤の例としては、アルクリルジメチルエタノールアミンクアット（ＡＤＭＥＡＱ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド（ＤＳＤＭＡＣ）、およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルコキシル化第四級アンモニウム（ＡＱＡ）化合物、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
洗剤は、その中に含む場合、通常、約０．２重量％〜約４０重量％、たとえば、約０．５％〜約３０％、特定的には、約１％〜約２０％、約３％〜約１０％、たとえば、約３％〜約５％または約８％〜約１２％の非イオン性界面活性剤を含有するであろう。非イオン性界面活性剤の例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪アルコール（ＰＦＡ）、アルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、たとえば、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、またはグルコサミンＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルカミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、さらにはＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮという商品名で入手可能な製品、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
洗剤は、その中に含む場合、通常、約０重量％〜約１０重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の例としては、アミンオキシド（ＡＯ）、たとえば、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
洗剤は、その中に含む場合、通常、約０重量％〜約１０重量％の双性イオン性界面活性剤を含有するであろう。双性イオン性界面活性剤の例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタイン、スルホベタイン、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、水性溶液中に疎水性化合物を（または反対に非極性環境中に極性物質を）可溶化する化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水性および疎水性の両方の特性（界面活性剤から知られるようないわゆる両親媒性）を有するが、ヒドロトロープの分子構造は、一般的には、自然自己会合に有利でない（たとえば、Ｈｏｄｇｄｏｎ ａｎｄ Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２：１２１−１２８によるレビューを参照されたい）。ヒドロトロープは、ミセル相、ラメラ相、または他の明確に規定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質に見いだされるような自己会合が起こる臨界濃度を示さない。その代わりに、多くのヒドロトロープは、アグリゲートのサイズが濃度の増加と共に増加する連続タイプのアグリゲーション過程を示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水と油と界面活性剤とポリマーとの混合物を含めて、極性および非極性の特性の物質を含有する系の相挙動、安定性、およびコロイド性を変化させる。ヒドロトロープは、典型的に、医薬、パーソナルケア、食品から技術的用途までの産業にわたり使用される。洗剤組成物中でのヒドロトロープの使用により、たとえば、相分離や高粘度などの望ましくない現象を引き起こすことなく界面活性剤のより濃厚な配合物を可能にする（水の除去により液体洗剤をコンパクト化するプロセスの場合など）。
洗剤は、０〜５重量％、たとえば約０．５〜約５％または約３％〜約５％のヒドロトロープを含有しうる。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のヒドロトロープを利用しうる。ヒドロトロープの例としては、ナトリウムベンゼンスルホネート、ナトリウムｐ−トルエンスルホネート（ＳＴＳ）、ナトリウムキシレンスルホネート（ＳＸＳ）、ナトリウムクメンスルホネート（ＳＣＳ）、ナトリウムシメンスルホネート、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ナトリウムヒドロキシナフトエート、ナトリウムヒドロキシナフタレンスルホネート、ナトリウムエチルヘキシルスルフェート、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約０〜６５重量％、たとえば、約５％〜約４５％の洗剤ビルダーもしくはコビルダーまたはそれらの混合物を含有しうる。食器洗浄洗剤では、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特定的には５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは、特定的にはＣａおよびＭｇとの水溶性錯体を形成するキレート化剤でありうる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のビルダーおよび／またはコビルダーを利用しうる。ビルダーの例としては、ゼオライト、ジホスフェート（ピロホスフェート）、トリホスフェートたとえば三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）、カーボネート、たとえば、炭酸ナトリウム、可溶性シリケート、たとえば、メタケイ酸ナトリウム、層状シリケート類（たとえば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）、エタノールアミン、たとえば、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、イミノジエタノールとしても知られる）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ、２，２’，２”−ニトリロトリエタノールとしても知られる）、およびカルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
洗剤組成物はまた、０〜２０重量％、たとえば、約５％〜約１０％の洗剤コビルダーまたはその混合物を含有しうる。洗剤組成物は、コビルダーを単独でまたはビルダーたとえばゼオライトビルダーと組み合わせて含みうる。コビルダーの例としては、ポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマー、たとえば、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる例としては、シトレート、キレート化剤、たとえば、アミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、およびホスホネート、ならびにアルキルまたはアルケニルコハク酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加の特定例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラ−（メチレン）（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡまたはＤＴＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）、およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびにそれらの組合せおよび塩が挙げられる。さらなる例示的ビルダーおよび／またはコビルダーは、たとえば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に記載されている。
漂白系
洗剤は、０〜５０重量％、たとえば、約０．１％〜約２５％の漂白系を含有しうる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の漂白系を利用しうる。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素源たとえば過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウム、前形成過酸、およびそれらの混合物が挙げられる。好適な前形成過酸としては、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、たとえばＯｘｏｎｅ（Ｒ））、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。漂白系の例としては、たとえば、過ホウ酸のナトリウム塩（通常、一水和物または四水和物）などのアルカリ金属塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩をはじめとする無機塩を、過酸形成漂白活性化剤と組み合わせて含みうる、過酸化物に基づく漂白系が挙げられるが、これに限定されるものではない。漂白活性化剤という用語は、本明細書では、過酸化水素のような過酸素漂白剤と反応して過酸を形成する化合物を意味する。こうして形成された過酸は、活性化漂白剤を構成する。ここで使用するのに好適な漂白活性化剤としては、エステル、アミド、イミド、またはアンヒドリドのクラスに属するものが挙げられる。好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム４−［（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）オキシ］ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）ベンゾエート（ＤＯＢＳ）、４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、ならびに／または国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されるものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは、欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、そのファミリーでとくに好ましいのは、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）である。ＡＴＣまたはトリアセチンのような短鎖トリグリセリドは、最終的にクエン酸およびアルコールに分解するので環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、貯蔵時、製品中で良好な加水分解安定性を有し、効率的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、洗濯添加剤に良好なビルダー能を提供する。他の選択肢として、漂白系は、たとえば、アミド型、イミド型、またはスルホン型のペルオキシ酸を含みうる。漂白系はまた、６−（フタロイルアミド）ペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含みうる。漂白系はまた、漂白触媒を含みうる。いくつかの実施形態では、漂白剤成分は、次式：
を有する有機触媒、
（ｉｉｉ）およびそれらの混合物、
からなる群から選択される有機触媒でありうる。式中、各Ｒ1は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐状アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する線状アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐状アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する線状アルキル基、より好ましくは、各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、ｉｓｏ−ノニル、イソデシル、ｉｓｏ−トリデシル、およびイソペンタデシルからなる群から選択される。他の例示的な漂白系は、たとえば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレットおよび国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白剤は、たとえば、スルホン化亜鉛フタロシアニンでありうる。
ポリマー
洗剤は、０〜１０重量％、たとえば、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％、または０．２〜１％のポリマーを含有しうる。洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意のポリマーを利用しうる。ポリマーは、以上に挙げたコビルダーとして機能しうるか、または再付着防止性、繊維保護性、防汚性、染料転写防止性、グリースクリーニング性、および／または消泡性を提供しうる。いくつかのポリマーは、以上に挙げた性質の２つ以上および／または以下に挙げるモチーフの２つ以上を有しうる。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、およびポリカルボキシレート、たとえば、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水変性ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマーグリコールとのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）とポリ（オキシエテンテレフタレート）とのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）、およびポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、およびジクアテルニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーは、たとえば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。以上に挙げたポリマーの塩も利用可能であると考えられる。
布染色剤
本発明に係る洗剤組成物はまた、染料や顔料などの布染色剤を含みうる。この布染色剤は、洗剤組成物中に配合した場合、前記布が、前記洗剤組成物を含む洗浄／洗濯液に接触した時、布上に堆積可能であるので、可視光の吸収／反射を介して前記布の色調を変化させる。蛍光増白剤は、少なくともいくらかの可視光を発する。これとは対照的に、布染色剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するので、表面の色調を変化させる。好適な布染色剤としては、染料および染料−クレーコンジュゲートが挙げられる。また、顔料をも含んでいてもよい。好適な染料としては、小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な小分子染料としては、たとえば、国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレット、および欧州特許第１８７６２２６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、およびベーシックレッドのＣｏｌｏｕｒ Ｉｎｄｅｘ（Ｃ．Ｉ．）分類に分類される染料またはそれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％、約０．００００８ｗｔ％〜約０．０５ｗｔ％、さらには約０．０００１ｗｔ％〜約０．０４ｗｔ％の布染色剤を含む。組成物は、０．０００１ｗｔ％〜０．２ｗｔ％の布染色剤を含みうる。これは、組成物が単位用量パウチの形態である場合、とくに有利でありうる。好適な染色剤はまた、たとえば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレットおよび国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットにも記載されている。
追加の酵素
一態様では、本発明は、本発明に係るリゾチームを含む洗剤添加剤を提供する。 洗剤添加剤さらには洗剤組成物は、１つ以上の追加の酵素、たとえば、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、たとえば、ラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含みうる。
一般的には、所定の酵素の性質は、所定の洗剤（すなわち、ｐＨ最適値、他の酵素および非酵素成分との適合性など）に適合すべきであり、また、酵素は、有効量で存在すべきである。
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）に由来するセルラーゼ、たとえば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書、および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｋｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される菌類のセルラーゼが挙げられる。
とくに好適なセルラーゼは、カラーケア効果を有するアルカリ性セルラーゼまたは中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号明細書、欧州特許第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載のセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、たとえば、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０５３１３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレット、および国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載のものである。
市販のセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、およびＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物起源、植物起源、または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくは微生物アルカリプロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼでありうる。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特定的には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、たとえば、スブチリシンノボ、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、およびスブチリシン１６８である（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載されている）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（たとえば、ブタ起源またはウシ起源のもの）、ならびに国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のプロテアーゼである。
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレット、および国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体、特定的には、次の位置：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、および２７４の１つ以上に置換を有する変異体である。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、プライマーゼ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）、またＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）およびＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）が挙げられる。
リパーゼおよびクチナーゼ：好適なリパーゼおよびクチナーゼとしては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体酵素が包含される。例としては、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、たとえば、欧州特許第２５８０６８号明細書および欧州特許第３０５２１６号明細書に記載のＴ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（旧名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））に由来するリパーゼ、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、たとえば、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来するクチナーゼ（国際公開第９６／１３５８０号パンフレット）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（これらのうちのいくつかは、現在、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に改名された）、たとえば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ属の種の株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）の株に由来するリパーゼ、ＧＤＳＬ型ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）リパーゼ（国際公開第１０／０６５４５５号パンフレット）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に由来するクチナーゼ（国際公開第１０／１０７５６０号パンフレット）、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するクチナーゼ（米国特許第５，３８９，５３６号明細書）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）に由来するリパーゼ（国際公開第１１／０８４４１２号パンフレット）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第１１／０８４４１７号パンフレット）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するリパーゼ（国際公開第１１／０８４５９９号パンフレット）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）（国際公開第１１／１５０１５７号パンフレット）およびＳ．プリスチナエスピラリス（ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）（国際公開第１２／１３７１４７号パンフレット）に由来するリパーゼが挙げられる。
他の例は、欧州特許第４０７２２５号明細書、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／３４４５０号パンフレット、国際公開第００／６００６３号パンフレット、国際公開第０１／９２５０２号パンフレット、国際公開第０７／８７５０８号パンフレット、および国際公開第０９／１０９５００号パンフレットに記載されるようなリパーゼ変異体である。
好ましい市販のリパーゼ製品としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）およびＬｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｌｕｍａｆａｓｔ（当初はＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ製）、ならびにＬｉｐｏｍａｘ（当初はＧｅｎｅｎｃｏｒ製）が挙げられる。
さらに他の例は、アシルトランスフェラーゼまたはペルヒドロラーゼとして参照されることもあるリパーゼ、たとえば、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡに対して相同性を有するアシルトランスフェラーゼ（国際公開第１０／１１１１４３号パンフレット）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に由来するアシルトランスフェラーゼ（国際公開第０５／５６７８２号パンフレット）、ＣＥ７ファミリーに由来するペルヒドロラーゼ（国際公開第０９／６７２７９号パンフレット）、およびＭ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの変異体、特定的には、Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ製の市販品Ｇｅｎｔｌｅ Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｅａｃｈで使用されるＳ５４Ｖ変異体（国際公開第１０／１０００２８号パンフレット）である。
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌起源または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。アミラーゼとしては、たとえば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から取得されるα−アミラーゼ、たとえば、より詳細には英国特許第１，２９６，８３９号明細書に記載されるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特定の株から取得されるものが挙げられる。
有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレット、および国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体、特定的には、次の位置、すなわち、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および４４４の１つ以上に置換を有する変異体である。
市販のアミラーゼは、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）である。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物起源、細菌起源、または菌類起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学操作された突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、たとえば、Ｃ．シネレウス（ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のもの、およびその変異体、たとえば、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレット、および国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載のものが挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
洗剤酵素は、１つ以上の酵素を含有する個別の添加剤を添加することにより、またはこれらの酵素をすべて含む組合せ添加剤を添加することにより、洗剤組成物に組み込みうる。本発明に係る洗剤添加剤、すなわち、個別の添加剤または組合せ添加剤は、たとえば、顆粒、液体、スラリーなどとして配合可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、顆粒、特定的には非発塵性顆粒、液体、特定的には安定化液体、またはスラリーである。
非発塵性顆粒は、たとえば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されるように作製され得、任意選択で、当技術分野で公知の方法により被覆されうる。ワックス被覆材料の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール、アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有する、かつ中で１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、ならびに脂肪酸のモノおよびジおよびトリグリセリドである。流動床技術による用途に好適なフィルム形成性被覆材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に与えられている。液体酵素調製物は、たとえば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより、安定化されうる。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示される方法に従って調製されうる。
補助材料
衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の洗剤成分を利用することも可能である。他の任意選択の洗剤成分としては、単独または組合せのいずれかで、防食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、防皺剤、殺細菌剤、結合剤、防食剤、崩壊剤／破砕剤、染料、酵素安定剤（ホウ酸およびボレート、ＣＭＣ、および／またはプロピレングリコールなどのポリオール）、クレーを含む柔軟仕上げ剤、充填剤／加工助剤、蛍光増白剤／光学増白剤、増泡剤、泡（石鹸泡）制御剤、香料、汚れ懸濁剤、軟化剤、石鹸泡抑制剤、変色防止剤、およびウィッキング剤、が挙げられる。衣類洗剤で使用することが当技術分野で公知の任意の成分を利用しうる。そのような成分の選択は、十分に当業者の技能の範囲内にある。
分散剤 − 本発明に係る洗剤組成物はまた、分散剤をも含有可能である。特定的には、粉末洗剤は、分散剤を含みうる。好適な水溶性有機材料としては、ホモもしくはコポリマー酸またはそれらの塩が挙げられる。このポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子により互いに分離された少なくとも２つのカルボキシル基を含む。好適な分散剤は、たとえば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
染料転写阻害剤 − 本発明に係る洗剤組成物は、１つ以上の染料転写阻害剤をも含みうる。好適な高分子染料転写阻害剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。染料転写阻害剤は、当該組成物中に存在する場合、組成物重量基準で約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、さらには約０．１％〜約３％のレベルで存在しうる。
蛍光増白剤 − 本発明に係る洗剤組成物は、好ましくは、蛍光増白剤や光学増白剤などクリーニングされる物品の色調を整えうる追加成分を含有する。増白剤は、存在するのであれば、好ましくは約０．０１％〜約０．５％のレベルである。衣類洗剤組成物で使用するのに好適な任意の蛍光増白剤は、本発明に係る組成物で使用可能である。最も一般的に使用される蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体、およびビスフェニル−ジスチリル誘導体のクラスに属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体型の蛍光増白剤の例としては、４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、および２−（スチルビル−４”−ナフト−１，２’：４，５）−１，２，３−トリゾール−２”−スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光増白剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能なＴｉｎｏｐａｌ ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニルスチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。同様に好ましいのは、蛍光増白剤であり、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａにより供給されるＰａｒａｗｈｉｔｅ ＫＸが市販されている。本発明で使用するのに好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。好適な蛍光増白剤レベルは、約０．０１から、０．０５から、約０．１から、さらには約０．２ｗｔ％から、０．５さらには０．７５ｗｔ％の上限レベルまでのより低いレベルを含む。
防汚性ポリマー − 本発明に係る洗剤組成物はまた、綿系およびポリエステル系の布などの布からの汚れの除去、特定的には、ポリエステルに系の布からの疎水性汚れの除去を支援する１つ以上の防汚性ポリマーをも含みうる。防汚性ポリマーは、たとえば、ノニオン性もしくはアニオン性のテレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連コポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドである。たとえば、Ｃｈａｐｔｅｒ ７ ｉｎ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照されたい。他のタイプの防汚性ポリマーは、コア構造とそのコア構造に結合された複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されるポリアルキルエンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含みうる。さらに、ランダムグラフトコポリマーも、好適な防汚性ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に、より詳細に記載されている。他の防汚性ポリマーは、置換ポリサッカリド構造、特定的には、変性セルロース誘導体などの置換セルロース系構造、たとえば、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものである。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン変性セルロース、非イオン変性セルロース、カチオン変性セルロース、双性イオン変性セルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。
再付着防止剤 − 本発明に係る洗剤組成物は、１つ以上の再付着防止剤、たとえば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、およびエトキシル化ポリエチレンイミンをも含みうる。以上の防汚性ポリマーの下に記載されたセルロース系ポリマーはまた、再付着防止剤としても機能しうる。
他の好適な補助材料としては、収縮防止剤、防皺剤、殺細菌剤、結合剤、担体、染料、酵素安定剤、柔軟仕上げ剤、充填剤、泡制御剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、石鹸泡抑制剤、溶媒、および液体洗剤用構造剤および／または構造弾性化剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
バイオフィルム
バイオフィルム中で増殖する微生物は、従来の懸濁培養で増殖させた時の同一微生物よりもすべてのタイプの抗微生物剤に対して感受性が低い。
飢餓細菌がさまざまな抗微生物剤チャレンジに対してかなり低い感受性でありうることは、周知である。たとえば、ペニシリンなどのいくつかの古典的抗生物質は、低分裂または非分裂の細菌内で十分に機能する。リゾチームは、細菌の増殖状態にかかわらずペプチドグリカン層を攻撃して破壊するので、効果を維持する。
バイオフィルムの抑制；例示的な歯科水ライン：
歯科水ライン内のバイオフィルム蓄積は、ほんの数例を挙げれば、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）の種からなるバイオフィルムを含有しうる。また、システム内の抗吸戻し弁の故障の結果として、口腔内に一般的には見いだされた種が定着する可能性がある。免疫無防備状態の患者が関与する場合、当然ながら、交差感染のリスクは、潜在的リスクがさらに高くなり、今日では、この範疇の患者の数き、着実に増大し続けている。歯科水ライン中の細菌バイオフィルム蓄積を効果的に抑制する必要性が存在する。バイオフィルムのレビューは、Ｗａｔｎｉｃｋ Ｐ ａｎｄ Ｋｏｌｔｅｒ Ｒ ２０００），“Ｂｉｏｆｉｌｍ，ｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ”，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；１８２（１０）：２６７５−９に見いだしうる。
市販の喉用トローチ製品の典型的な例は、ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＩＮＧＥＬＨＥＩＭ ＦＲＡＮＣＥ製のＬｙｓｏｐａｉｎｅである。
活性成分：
バシトラシン ２００Ｕ．Ｉ．
（６５ｉｕ／ｍｇまで）
パパイン ２ｍｇ
３０ＮＫ／ｍｇまで
リゾチームクロルヒドレート ５ｍｇ
２６０００Ｕ ＦＩＰ／ｍｇまで：緩衝液中に懸濁された細菌の溶解のＯＤ速度測定により決定される単位。単位決定は、緩衝液中に懸濁された細菌培養物の濁度の溶解誘導変化により測定された。
非活性成分：
サッカリン賦形剤
マグネシウムステアレート賦形剤
メントール芳香剤
ソルビトール賦形剤
口腔咽頭の周口膜に限定された点感染の局所治療用。注意、一般的な細菌感染の臨床徴候が明らかな場合、抗生物質療法が推奨される。
練り歯磨き：
リゾチームは、単独でまたは他の酵素さらには抗微生物ペプチドとの組合せで使用可能である。他の酵素の例は、グルコースオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼである。
リゾチームを含む典型的な練り歯磨き組成物は、Ｌａｃｌｅｄｅ，Ｉｎｃ．（２０３０ Ｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｇｕｅｚ，ＣＡ ９０２２０，ＵＳＡ）製の「Ｂｉｏｔｅｎｅ」である。
活性成分
含有物：ラクトペルオキシダーゼ（１００ｇｍ）
不活性成分
グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、ナトリウムモノフルオロホスフェート、ソルビトール、グリセリン、ピロリン酸カルシウム、水和シリカ、ジリトール、セルロースガム、風味剤、ナトリウムベンゾエート、β−ｄ−グルコース、チオシアン酸カリウム
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらを本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。
株
アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８株は、ＧＨ２５酵素をコードするアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）遺伝子を発現するために使用した。Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８は、ｐｙｒＧ遺伝子でＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子を破壊することによりｐｙｒＧ栄養要求性が回復されたアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ３５５（国際公開第２００２／４０６９４号パンフレット）のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）破壊遺伝子誘導体である。菌類培養中央局（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｒ Ｓｃｈｎｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅ）によれば、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２は、日本国の津久井湖の近くでブタ糞便コンポストのスラッジから１９８４年にＡ．ヨネダ（Ａ．Ｙｏｎｅｄａ）により単離された。アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）Ｔｏｃ１５１２は、ＧＨ２５酵素（ＳＥＱ ＩＤ：７）および変異体をコードするアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）遺伝子を発現するために使用した。Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）は、ｐｙｒＧ遺伝子でトランスフォームしてウリジン不在下での増殖能により選択された形質転換体でありうるｐｙｒＧ欠損株である。
培地および溶液
ＹＰ培地は、１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクトペプトン、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
ＬＢ培地は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
ＭＤＵ−２ Ｂｐ培地は、１リットルあたり４５ｇのマルトース−１Ｈ2Ｏ、７ｇの酵母エキス、１２ｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、２ｇのＫ2ＳＯ4、５ｇのウレア、１ｇのＮａＣｌ、０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液ｐＨ５．０で構成されていた。
Ｇ２−Ｇｌｙ培地は、１８ｇの酵母エキス、２４ｇのグリセロール（８６〜８８％）、１ｍｌのＤｏｗｆａｘ ６３Ｎ１０、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ寒天培地は、１％（ｗ／ｖ）のデキストロース、１％の可溶性デンプン、０．５％（ｗ／ｖ）のペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）のＫ2ＨＰＯ4、および寒天１５ｇ（ｗ／ｖ）のＢａｃｔｏで構成されていた。滅菌後、１％（ｗ／ｖ）のＮａ2ＣＯ3を個別に添加した。
Ｂａｃｔｏ寒天プレートは、ＬＢ培地および１リットルあたり１５ｇのＢａｃｔｏ寒天で構成されていた。
ＰＤＡ寒天プレートは、ジャガイモ浸出液で構成されていた（ジャガイモ浸出液は、３００ｇのスライスされた（洗浄したが皮むきしていない）ジャガイモを水中で３０分間煮沸してからデカントし、ブロスをチーズクロスに通して濾すことにより作製された。次いで、懸濁液の全体積が１リットルになるまで蒸溜水を添加して、続いて、２０ｇ（ｗ／ｖ）のデキストロースおよび２０ｇ（ｗ／ｖ）の寒天粉末を添加した。１５ｐｓｉで１５分間オートクレーブ処理することにより培地を滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａ，１９９８）。
ＣＯＶＥスクロースプレートは、３４２ｇのスクロース、２０ｇの寒天粉末、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。１５ｐｓｉで１５分間オートクレーブ処理することにより培地を滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａ，１９９８）。培地を６０℃に冷却して、１０ｍＭのアセトアミド、１５ｍＭのＣｓＣｌ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（５０μｌ／５００ｍｌ）を添加した。
ＮａＮＯ3スクロースプレートは、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２０ｇの寒天粉末、３４２ｇのスクロース、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。１５ｐｓｉで１５分間オートクレーブ処理することにより培地を滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ａ，１９９８）。培地を６０℃に冷却し、１０ｍＭのＮａＮＯ３およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（５０μｌ／５００ｍｌ）を添加した。
ＬＢ寒天プレートは、３７ｇのＬＢ寒天および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２６ｇのＫＣＬ、２６ｇのＫＨ2ＰＯ4、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．８ｇのＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
ＡＭＧ微量金属は、１リットルあたり１４．３ｇのＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ2、１３．８ｇのＦｅＳＯ4、８．５ｇのＭｎＳＯ4、３．０ｇのクエン酸で構成されていた。
ＣＯＶＥ Ｎｇｌｙ斜面は、１０ｇの１００％グリセロール、５０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２１８ｇのソルビトール、２．０２ｇのＫＮＯ3、２５ｇの寒天、および１リットルまでの脱イオン水で構成されていた。
実施例１：
リゾチームアッセイ
キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）は、すべてのキサンタンガム製造のための生産生物である。高粘性キサンタン溶液からのキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細胞の分離は、工業生産でコストのかかるプロセスである（Ｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ６９００７２，Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第７１８３１１号明細書、米国特許第５７０２９２７号明細書）。現在では、発酵液からキサンタンを回収する有利な方法は、殺菌により細菌細胞および酵素を破壊した後、アルコール、主にイソプロパノールを用いて沈殿させるものである（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｗ．Ｉ．；Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｋ．Ｄｅｖ．（１９７８），“Ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ：Ａ ｕｎｉｑｕｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｏｒ ｆｏｏｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９：１７７）。続いて、キサンタン／細胞デブリ沈殿物をスプレー乾燥させ、粉末状にミル処理する。アルコールは、蒸留により回収される。キサンタンガムのいくつかの市販の調製物中には有意量のキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細胞壁デブリがあり、このデブリは、ペプチドグリカンリッチのキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細胞壁材料であるので、このガムは、ペプチドグリカン分解活性を調べる便利なアッセイとして使用可能である。
固体プレートアッセイ：
商業的に調製されたキサンタンガム（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ−１２５３）を０．５％ｗ／ｖになるように０．７％のアガロースの存在下で緩衝溶液中または細菌増殖培地中に溶解させ、次いで、オートクレーブ処理する。酵素調製物、上清、または生物体を、Ｂａｃｔｏ寒天プレートから切り抜かれたウェル中に堆積させるか、または培地の表面上に直接に堆積させる。調製物は、プレート中で透明化ゾーンを形成可能である。この透明化ゾーンは、細菌細胞壁材料の分解の指標となりうる。
液体透明化アッセイ：
商業的に調製されたキサンタンガムを塩化ナトリウムの存在下または不在下で緩衝溶液中に溶解させる。溶液をオートクレーブ処理して、キサンタンガム透明化試験に使用する。酵素調製物、上清、または生物体をアッセイ培地に添加してインキュベートする。得られた処理物を分光光度計により測定して、溶液のＯＤを決定する。典型的には、６００ｎｍの波長が使用される。
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）に由来するリゾチームコード遺伝子（配列番号４）のクローニングおよび特性解析
ゲノム配列情報は、米国エネルギー省共同ゲノム研究（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＪＧＩ）により発生された。菌類培養中央局（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｒ Ｓｃｈｎｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅ）によれば、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２は、日本国の津久井湖の近くでブタ糞便コンポストのスラッジから１９８４年にＡ．ヨネダ（Ａ．Ｙｏｎｅｄａ）により単離された。ゲノムの予備集合をＪＧＩからダウンロードして、Ｐｅｄａｎｔ−Ｐｒｏ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｂｉｏｍａｘ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＡＧ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。ソフトウェアにより構築された遺伝子モデルをゲノム中のＧＨ２５相同体を検出するための出発点として使用した。指標として複数の公知のＧＨ２５タンパク質配列を手動で使用して、より精密な遺伝子モデルを構築した。
Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ寒天上、ｐＨ９、３０Ｃで、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２を７日間増殖した。菌糸体をプレートから直接採取し、土壌用のＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ ＫｉｔによりＤＮＡを単離した（ｗｗｗ．ｍｐｂｉｏ．ｃｏｍ）。ＤＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリス緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７、５中に溶出させ、使用時まで４Ｃで貯蔵した。
Ａ．アルカロフィラム（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ゲノムＤＮＡからＡ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５遺伝子をＰＣＲ増幅するために、以下の表１に示される一対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、発現ベクターｐＤａｕ１０９中に断片を直接クローニングした（国際公開第２００５／０４２７３５号パンフレット）。
ボールド文字は、コード配列を表す。下線付き配列は、ｐＤａｕ１０９の挿入部位に相同的である。
ＰＣＲ反応（２５μｌ）は、１２．５μｌの２×ＩＰＲＯＯＦ（商標）ＨＦ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０，５μｌのプライマーＦ−Ｐ２４２Ｍ９（１００μＭ）、０，５μｌのプライマーＲ−Ｐ２４２Ｍ９（１００μＭ）、０，５μｌのゲノム（１００ｎｇ／μｌ）、および１１μｌの脱イオン水で構成されていた。
ＰＣＲ反応（２５μｌ）は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ−５３０Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）、５μｌの５×Ｐｆｕｓｉｏｎ緩衝液、０，５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０，５μｌのプライマーＦ−Ｐ２４２Ｍ９（１００μＭ）、０，５μｌのプライマーＲ−Ｐ２４２Ｍ９（１００μＭ）、０，５μｌのゲノム（１００ｎｇ／μｌ）、および１８μｌの脱イオン水で構成されていた。９５℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、７２℃で２分３０秒間を各３５サイクル、７２℃で１０分間を１サイクルにプログラムされたＤＹＡＤ（登録商標）Ｄｕａｌ−Ｂｌｏｃｋ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中でＰＣＲ反応をインキュベートした。サンプルを１２℃に冷却した後、取り出して、さらなる処理に付した。
ＴＡＥ緩衝液を用いて１％アガロースゲル電気泳動により５μｌのＰＣＲ反応を分析した。ここで、約８７４ｂｐの産物バンドが観察された。製造業者の説明書に従って、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標）ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ ＤＮＡおよびＧｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、残りのＰＣＲ反応を精製した。
次いで、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、断片をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩ消化されたｐＤａｕ１０９中にクローニングし、プラスミドｐＰ２４２Ｍ９を得た。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂａｍ ＨＩ消化ｐＤａｕ１０９中へのＰ２４２Ｍ９遺伝子のクローニングにより、ＮＡ２−ｔｐｉ二重プロモーターの制御下にあるアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）Ｐ２４２Ｍ９遺伝子の転写がもたらされた。ＮＡ２−ｔｐｉは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳リーダーにより非翻訳リーダーが置き換えられたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼをコードする遺伝子からの修飾プロモーターである。
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ説明書に従ってクローニングプロトコルを実施し、Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５構築物を発生した。処理されたプラスミドおよび挿入断片を製造業者のプロトコルに従ってＦｕｓｉｏｎ Ｂｌｕｅ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）内にトランスフォームし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが追加されたＬＢプレート上にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、ＬＢアンピシリンプレート上での選択下、コロニーの増殖が観察された。Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５構築物でトランスフォームされた１０個のコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが追加されたＬＢ培地中で培養し、製造業者の説明書に従って５Ｐｒｉｍｅ製のＦＡＳＴＰｌａｓｍｉｄミニキット（５ＰＲＩＭＥ ＧｍｂＨ，Ｋｏｅｎｉｇｓｔｒａｓｓｅ ４ａ，２２７６７ Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドを単離した。
ＰＣＲエラーのない代表的なプラスミド発現クローンを決定するために、単離されたプラスミドをベクタープライマーにより配列決定した。バージョン３．１ ＢＩＧ−ＤＹＥ（商標）ターミネーター化学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびプライマー歩行戦略を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３０ｘｌ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２ ＧＨ２５ゲノムクローンのＤＮＡ配列決定を行った。ヌクレオチド配列データの品質を精査し、ＰＨＲＥＤ／ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）の助けを借りて、すべての配列を互いに比較した。得られた配列は、ＪＧＩからの配列と同一であった。
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および配列番号４に示される。コード配列は、停止コドンを含めて８３８ｂｐであり、１５４ｂｐ（ヌクレオチド１４８〜３０１）の１つのイントロンにより中断される。コードされた予測タンパク質は、２２７アミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６）を用いて、１９残基のシグナルペプチドを予測した。予測成熟タンパク質は、２０７アミノ酸を含有する。
すべての実験にアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）株ＭＴ３５６８を使用した。アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８は、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳ遺伝子のノックアウトプロセスでｐｙｒＧ栄養要求性が回復されたＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ３５５のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）破壊誘導体である（国際公開第２００２／４０６９４号パンフレット）。欧州特許第０２３８０２３号明細書、１４〜１５頁の方法に従って、Ａ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８プロトプラストを調製した。Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８の新しいプロトプラストを調製して、ｐＰ２４２Ｍ９ ＧＨ２５プラスミドでトランスフォームした。以上のミニプレップ手順からのプラスミドＤＮＡを用いて、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８をトランスフォームした。
約３．０μｇの全ＤＮＡを含有する６μｌをトランスフォーメーションに使用した。ＤＮＡを１００μｌのＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８プロトプラストおよび２５０μｌの６０％ＰＥＧ４０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号９５９０４）に穏やかに添加した。次のようにして６０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００を調製した。ＰＥＧ４０００粉末を二重蒸留Ｈ２Ｏ中に溶解させ、次いで、溶解するまで８００ワットのマイクロ波オーブンオーブン内で１０〜２０秒間加熱した。溶解溶液を室温に冷却し、次いで、それぞれ１０ｍＭの最終濃度になるようにＣａＣｌ２溶液およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）で調整した。６０％ＰＥＧ４０００溶液を添加した後、チューブを穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１０ｍＭアセトアミドを含む６ｍｌの上層寒天に混合物を添加し、１０ｍＭアセトアミドを含むＣＯＶＥ−ソルビトールプレート上にプレーティングした。
プレートを３７℃で３日間以上インキュベートし、次いで、２６℃に２日間移行した。最初に０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０溶液中に白色１０μｌ接種ピン（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を浸漬することにより、４つの個別のコロニーからの胞子を採取し、胞子形成コロニーを選択プレート上に接触させ、１０ｍＭアセトアミドを含有する新しいＣＯＶＥソルビトールプレート上にピンを用いて再画線した。２６℃で５日後、再画線コロニーからの胞子を用いて９６ウェルディープディッシュプレート（ＮＵＮＣ、カタログ番号２６０２５１，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に接種した。ディープディッシュプレートのウェルは、５００μｌのＹＰ＋２％グルコース培地またはＹＰ＋２％マルトデキストリン培地のいずれかを含有していた。接種されたプレートをガス透過性テープ（８９００９−６５６，ＶＷＲ．ｃｏｍ）で密閉した。プレートを３０Ｃで５日間静置インキュベートした。ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびクーマシーブルー染色を用いて、２０μｌの採取された培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析することにより、発現を検証した。さらなる試験のために１つの形質転換体を選択し、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＥＸＰ０３８６４と命名した。
ＥＸＰ０３８６４の胞子をＤＡＰ−４Ｃ−１培地中に接種した（バッフルを備えた５００ｍｌエルレンマイヤー振盪フラスコ中１００ｍｌ）。培養物を２６℃および１５０ｒｐｍで３日間、必要であれば４日間インキュベートした。以上のようにＳＤＳゲルで泳動させてタンパク質の量を試験した。
リゾチーム活性に関するプレート試験
リゾチームプレートアッセイの節に記載したように、ｐＨ５、７、および８でキサンタンガムを用いて、スポットアッセイを行った。
以下の緩衝液中に１．５％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１５５１０−０２７、電気泳動グレード）溶液を調製した。
ｐＨ約５−水中
ｐＨ約７−０．０２Ｍリン酸カリウムｐＨ７中
ｐＨ約８−０．０２Ｍリン酸カリウムｐＨ８中
アガロースを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。融解された１．５％アガロース中に０．５％キサンタンガム（Ｓｉｇｍａ Ｇ１２５３）を溶解させ、混合物をペトリプレート中に注加した。プレートを設置した時、サンプル適用ウェルをＰ−１０００ピペット先端（直径３ｍｍにカットした）で真空ラインに接続した。
ＥＸＰ０３８９９の２０μｌの培養液を適用ウェル中に堆積し、３７℃で一晩インキュベートした。リゾチーム活性を有するサンプルは、透明化ゾーンが観察され、キサンタンガム中に細胞デブリが観察された。ＥＸＰ０３８６４からの培養液は、そのような透明化ゾーンを呈し、一方、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）非形質転換トランスフォーメーション宿主ＭＴ３５６８は、顕著な透明化ゾーンを生成しなかった。残りの培養物ＥＸＰ０３８９９流体を０．２２μｍカットオフのＦａｓｔ ＰＥＳ Ｂｏｔｔｌｅトップフィルターに通して濾過し、さらなる使用時まで−２０℃でアリコートで貯蔵した。
実施例３：ＲＤＡ（放射状拡散アッセイ）
最初に、Ｌｅｈｒｅｒら（Ｌｅｈｒｅｒ ＲＩ，Ｒｏｓｅｎｍａｎ Ｍ，Ｈａｒｗｉｇ ＳＳ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３７：１６７−７３）によりすでに記載されたＲＤＡにいくつかの変更を加えて、組換え発現リゾチームを含有する培養上清および精製画分の抗微生物活性を確認した。簡潔に述べると、１％アガロースを含む３０ｍＬの融解１／１０ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を４２℃に冷却し、Ｓ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５１３６５または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ６８２（ＡＴＣＣ１０５３６）を５．０×１０５ｃｆｕ／ｍＬで添加し、単一ウェルｏｍｎｉｔｒａｙ（Ｎｕｎｃ）プレート中に注加した。ｏｍｎｉｔｒａｙプレートにＴＳＰプレート（Ｎｕｎｃ）を重ねて凝固させた。１時間後、ＴＳＰプレートを除去し、１０μＬの対象化合物を試験しうる９６個の１ｍｍウェルを残す。
１ウェルあたり１０μｌの試験溶液をスポットし、プレートを３７℃でＯ／Ｎインキュベートした。翌日、透明化ゾーンは、試験細菌が増殖しないことから抗微生物活性の指標となった。生細胞内では紫色ホルマザンに還元されるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、黄色テルトラゾール）を用いて着色することにより、透明化ゾーンを可視化した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔｉｍ （１９８３），“Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（１−２）：５５−６３）。この着色は、生細胞の暗着色を提供し、生細胞のない透明化ゾーンの着色を提供しない。
アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ２５リゾチーム（Ｋｏｒｃｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．（２０１０）Ｆ６６，９７３−９７７に開示されるように調製された）を参照として試験に組み入れた。以下の表２に示される精製サンプルをＲＤＡアッセイで試験した。
透明化ゾーンの測定
三重試験方式で実験を行ったところ、すべて同一の透明化ゾーン／阻害ゾーンが測定された（図１参照）。以下の表３は、ｍｍ単位で透明化ゾーンを示す。
精製リゾチームＡ．アルカロフィラム（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２４（配列番号４）は、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）およびグラム陰性菌細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の生存細胞に対して抗微生物活性を示した。
抗微生物活性は、非形質転換アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）産生宿主からの培養上清には存在してない（結果は示されていない）。
Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２４（配列番号２）では、適用ゾーンの周りに明確な境界のない大きな透明化ゾーンが観察された。Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）リゾチーム（配列番号２）およびアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ２５参照リゾチームは、この実施例で試験した２つの細菌に対して異なる活性および特異性を有することが実験から示唆される。
実施例４：濁度アッセイ
分光光度計により５４０ｎｍで測定される再懸濁されたミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）ＡＴＴＣ Ｎｏ．４６９８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｍ３７７０）またはエキシグオバクテリウム・ウンデア（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｎｄｅａ）（ＤＳＭ１４４８１）の溶液の吸光度／光学濃度の減少（低下）を測定することにより、リゾチームの活性を決定した。
ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）基質の調製
使用前、０．５ｍｇ細胞／ｍＬの濃度になるように細胞をクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６．５中に再懸濁し、５４０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定した。次いで、細胞濃度がＯＤ５４０＝１．０に等しくなるように、細胞懸濁液を調整した。次いで、使用前、調整された細胞懸濁液を低温貯蔵した。４時間以内に再懸濁細胞を使用した。
クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６．５の調製
２９ｍＬの０．１Ｍクエン酸を６１ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4と混合し、ｐＨ６．５になるようにＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。
エキシグオバクテリウム・ウンデ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｎｄａｅ）の乾燥細胞（基質）の調製
Ｅ．ウンダエ（Ｅ．ｕｎｄａｅ）（ＤＳＭ１４４８１）の培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで５００ｍＬ振盪フラスコ内の１００ｍＬ ＬＢ培地（Ｆｌｕｋａ５１２０８、２５ｇ／Ｌ）中で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を２０℃および５０００ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを無菌ｍｉｌｌｉＱ水中で２回洗浄し、そしてＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に再懸濁した。洗浄された細胞を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、できるかぎり多くの上清をデカントした。洗浄された細胞を真空遠心分離機中で１時間乾燥させた。５４０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）＝１になるように、細胞ペレットをクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６．５中に再懸濁した。
濁度アッセイによるリゾチーム抗微生物活性の測定
測定対象のリゾチームサンプルを１００〜２００ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度になるようにクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ６．５中に希釈し、使用時まで氷上に保持した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中で、２００μＬの基質を各ウェルに添加し、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中、２５℃または３７℃でプレートを５分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの吸光度を５４０ｎｍで測定した（開始値）。活性測定を開始するために、２０μＬの希釈リゾチームサンプルを各基質（２００μＬ）に添加し、５４０ｎｍでの吸光度の速度論的測定を開始し、２５℃または３７℃で最小で３０分間、最大で２４時間行った。５４０ｎｍでの測定吸光度を各ウェルでモニターした。リゾチームがリゾチーム活性を有する場合、経時的に吸光度の低下が観察される。
アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ２５リゾチーム（Ｋｏｒｃｚｙｎｓｋａら（２０１０）以上に）を参照として試験に組み入れた。結果を表４に示す。
実施例５：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）中のＰ２４２Ｍ９ ＧＨ２５タンパク質の精製
リゾチームを有する発酵上清を０．２２μｍのカットオフのＦａｓｔ ＰＥＳ Ｂｏｔｔｌｅトップフィルターに通して濾過した。１０％酢酸を用いてｐＨを４．５に調整した。ｐＨ調整後、溶液は、少し濁った状態になったが、０．２２μｍのカットオフのＦａｓｔ ＰＥＳ Ｂｏｔｔｌｅトップフィルターに通して濾過することにより除去された。
前処理後、緩衝液Ａとして５０ｍＭ酢酸Ｎａ ｐＨ４．５および緩衝液Ｂとして５０ｍＭ酢酸Ｎａ＋１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ４．５を用いて、ＳＰセファロース、ＸＫ２６カラム中約５０ｍｌのクロマトグラフィーにより、約６５０ｍｌのリゾチーム含有溶液を精製した。クロマトグラム（２８０および２５４ｎｍの吸収）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づいて、カラムからの画分をプールした。プール画分の緩衝液交換を行って５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５にし、１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを用いて濃縮した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定された分子量は約２２ｋＤであり、純度は＞９５％いであった。
実施例６：Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５の温度安定性
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５リゾチーム（配列番号４）に対して温度安定性を決定した。この試験の目的は、６０℃〜８５℃での熱処理後、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチームの残存活性を決定することである。
サンプルを異なる温度で、短時間（３０秒間および６０秒間）インキュベートし、その後、基質としてグラム陽性細菌ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を用いてクエン酸−リン酸緩衝液中、３７℃で残存活性を１時間測定した。５４０ｎｍでのＯＤ低下濁度アッセイを用いて、リゾチーム活性を決定した。
熱処理
予備加熱されたＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００）を用いて、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（配列番号４）の緩衝溶液中、異なる温度で熱処理を３０／６０秒間行った。３０または６０秒間のいずれに対しても、６０、６５、７０、７５、８０、および８５℃を使用し、その後、サンプルを即座に冷却するために、チューブを氷浴に配置した。
濁度アッセイ
分光光度計により５４０ｎｍで測定される再懸濁されたミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）（ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）とも呼ばれる）ＡＴＴＣ Ｎｏ．４６９８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｍ３７７０）の溶液の吸光度／光学濃度の減少（低下）を測定することにより、リゾチームの活性を決定した。
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）基質の調製
使用前、クエン酸−リン酸緩衝液（２９ｍＬの０．１Ｍクエン酸を６１ｍＬの０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と混合し、ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いてｐＨ６．５に調整することにより調製された）中に０．５ｍｇ細胞／ｍＬの濃度になるように細胞を再懸濁し、５４０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定した。次いで、細胞濃度がＯＤ５４０＝１．０に等しくなるように、細胞懸濁液を調整した。次いで、使用前、調整された細胞懸濁液を低温貯蔵した。４時間以内に懸濁細胞を使用した。
濁度アッセイによるリゾチーム抗微生物活性の測定
リゾチームサンプルを１００〜２００ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度になるようにクエン酸−リン酸緩衝液中に希釈し、使用時まで氷上に保持した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中で、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中、３７℃でプレートを５分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの吸光度を５４０ｎｍで測定した（開始値）。活性測定を開始するために、希釈リゾチームサンプル（２０μＬ）を各ウェル中のｐＨ調整希釈基質（２００μＬ）に添加し、５４０ｎｍでの吸光度の速度論的測定を開始し、３７℃で最小で３０分間、最大で２４時間行った。
５４０ｎｍでの測定吸光度を各ウェルでモニターした。リゾチームが抗微生物活性を有する場合、経時的に吸光度の低下が観察される。Ｔ＝０と時間点との間の吸光度差をΔＯＤとして計算し、試験物質間で比較した（表５および図２）。パーセント残存活性は、熱処理されなかったサンプルのΔＯＤを含む熱処理されたサンプルのΔＯＤを比較することにより計算された。以上に記載の実験を三重試験方式で行った。
Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５リゾチームは、８５℃でさえも３０秒後、安定であり、ＧＨ２５リゾチームは、８５℃で６０秒後でさえも８０％超の活性を維持することが結果から示される。
実施例７：ＤＳＣを用いて決定されるＰ２４２Ｍ９ ＧＨ２５の熱安定性
プレパックＰＤ−１０カラムを使用して、実施例７に記載されるように精製されたリゾチーム（Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５）のタンパク質サンプルのアリコートの緩衝液交換を行った（以下の表中の緩衝液を参照されたい）。サンプルを０．４５μｍ濾過し、緩衝液で約２のＡ２８０単位に希釈した。緩衝液を参照溶液として使用した。オートサンプラーを備えたＶＰキャピラリーＤＳＣ機器（ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、異なるｐＨ値でのリゾチームの熱安定性を決定した。一定のプログラム加熱速度で緩衝液中でリゾチーム溶液を加熱した後、得られたサーモグラム（Ｃｐ対Ｔ）中の変性ピーク（主吸熱ピーク）の上端として熱変性温度Ｔｄ（℃）を得た。
サンプルおよび参照溶液（約０．５ｍｌ）を２０℃で１０分間熱平衡化し、２００Ｋ／時の走査速度で２０〜１１０℃でＤＳＣ走査を行った。ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（バージョン７．０３８３）を用いて、データ処理を行った。変性温度は、約±０．５℃の確度で決定された。ＤＳＣ測定の結果を表７および図３にまとめる。
実施例８：アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｍ）からのリゾチームコード遺伝子（配列番号８）のクローニングおよび発現
配列番号３として同定されたヌクレオチド配列に基づいて、配列番号７を有する合成遺伝子をＧｅｎｅ Ａｒｔ（ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ ＢｉｏＰａｒｋ，Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．１１，９３０５３，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。以下の表８に列挙されたＰＣＲプライマーセットを用いて、合成ＧＨ２５遺伝子をＰＣＲ増幅した。クローニング目的で、制限部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩをＰＣＲ断片の末端に導入した（制限部位は、以下に列挙されたプライマー配列中に下線付きであり、ボールド体はコード配列を表す）。
ＰＣＲ断片をスピン精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで最初消化された二重Ａ．オリザエ（Ａ．Ｏｒｙｚａｅ）／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド発現ベクターｐＥＮＩ１８９８中をライゲートした。ＨｉｎｄＩＩＩによるベクターの消化、続くアガロースゲル精製ベクターの再ライゲーションにより、ＡＭＡ配列（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ ９８（１）：６１−６７）が除去されているので、ｐＥＮＩ１８９８は、ベクターｐＥＮＩ１８６１（国際公開第０３／０７０９５６号パンフレット）から改変されている。さらに、ｐＥＮＩ１８６１は、ｐｙｒＧ遺伝子を有し、ｐｙｒＧ欠損アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株を補完しうる。
室温で５分間インキュベーションした後、ライゲーション反応をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームし、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレー上にプレーティングした。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを選択された形質転換体から精製し、クローニング手順の検証のために配列決定した。
コードされた予測タンパク質は、２４８アミノ酸であり、２３残基のシグナルペプチドおよび２０７アミノ酸の成熟タンパク質を含有する。配列番号４の成熟配列は、配列番号８の成熟配列と同一である。
実施例９：リゾチームＧＨ２５変異体のクローニングおよび発現
ＧＨ２５遺伝子の変異体
合成ＧＨ２５リゾチーム遺伝子中に単一のアミノ酸変化を含有する１０種の変異体をクローニングして発現させた。ＧＨ２５リゾチームの変異体は、次のように、Ｗ１０Ｈ、Ｙ２８Ｍ、Ｓ３９Ｄ、Ｇ９２Ｐ、Ａ９３Ｍ、Ｅ９７Ａ、Ｖ１３３Ｍ、Ｔ１４２Ｎ、Ｆ１７８Ｉ、またはＤ１９０Ａの単一置換からなる。
ＧＨ２５の変異体のクローニング
以上に記載のＧＨ２５変異体を発生するために、所望の配列変化（置換）が導入された突然変異原性プライマーを用いて、ＰＣＲに基づく部位指向突然変異誘発を行った。十分なフランキングヌクレオチド（１５〜２５）を含むオリゴヌクレオチドの中間に突然変異が位置するように、プライマーを設計した。ＧＨ２５を含有するプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＰＣＲを構成した。製造業者の説明書に従って、ＰＣＲ産物を用いてコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ １０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフォームした。プラスミドＤＮＡをモノクローナル形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から単離し、配列決定して所望の置換の存在を検証した。
ＧＨ２５および変異体のトランスフォーメーションおよび発現
実施例２に記載されるＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴｏＣ１５１２プロトプラスト（国際公開第２００５／０７０９６２号パンフレット）中へのトランスフォーメーションのために、リゾチーム遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ ｐＥＮＩ１８９８を使用し、適正構築物を有する形質転換体を選択するためにウリジンを含まないＮａＮＯ３スクロースプレートにプレーティングした。プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。
３７℃で７２時間、ＮａＮＯ３スクロースプレート上にコロニーを再画線することにより、単一のコロニーを単離は、３４℃で７２時間、ＹＰ培地中で増殖させた。ブロスの検査後、基質としてミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）細胞壁を用いて、ｐＨ６．４の５０ｍＭ３，３ジメチルグルタル酸中で濁度アッセイを行うことにより、リゾチームを発現するコロニーを選択した。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による約２３ｋＤａのバンドの目視検査により、リゾチームの発現を確認した。
リゾチームを発現する形質転換体を再画線し、３７℃でＣＯＶＥ Ｎ−ｇｌｙ斜面上でさらに５日間増殖し、２００ｍｌのＧ２−Ｇｌｙ振盪フラスコに接種した。３０℃で激しく攪拌しながら１日培養した後、３ｍｌの各培養物を振盪フラスコ中の２００ｍｌのＭＤＵ−２Ｂｐに移動して、３０℃で３日間培養した。以上の実施例６のＰ２４２Ｍ９ ＧＨ２５リゾチームの精製と同様にして、培養ブロスを精製した。
実施例１０：抗微生物活性
Ｐ２４２Ｍ９ ＧＨ２５リゾチーム、合成ＧＨ２５リゾチーム および合成ＧＨ２５リゾチームの１１種の変異体の抗微生物活性を、２つのクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）株で試験した。
方法および材料
リゾチームへの暴露前および暴露後、Ｃｌ．パーフリンジェンス（Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）培養物の光学濃度およびコロニー形成単位数の両方を測定することにより、活性を決定した。活性リゾチームへのＣｌ．パーフリンジェンス（Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の暴露は、細菌の死滅および対応する光学濃度の減少（ＯＤ低下）およびコロニー形成単位数の減少両方をもたらすであろう。
簡潔に述べると、リゾチームストック溶液を５０μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ中で（ｐＨ６）希釈した。これらの５０μｇ／ｍＬ溶液の二倍希釈シリーズをＰＢＳ（ｐＨ６）中で行って、０．４μｇ／ｍＬの最終濃度にした。
次いで、Ｃｌ．パーフリンジェンス（Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の一晩培養物をＰＢＳ（ｐＨ６）中に再懸濁させた。ＯＤ５４６を測定して１に調整した。培養物（７５μｌ）を調製されたリゾチーム溶液（７５μｌ）とマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中で１：１混合して、０．４〜２５μｇ／ｍｌの範囲内のリゾチームの最終濃度（リゾチームの全量で７濃度）へのＣｌ．パーフリンジェンス（Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の暴露を行った。嫌気的条件下、４２℃で培養物をリゾチームに４時間暴露した。暴露後の時間点０および４時間でＯＤ５４６およびＣＦＵ／ｍｌを測定した。
結果
活性試験の結果は、表９、１０、および１１ならびに図４および５に示される。表９は、ＧＨ２５リゾチームまたは変異体の１ｍＬあたりのクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の２つの株のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の減少を示している。活性リゾチームへの暴露は、典型的には、ＣＦＵ／ｍＬの１〜２対数減少をもたらした。ＣＦＵ／ｍｌの減少≧１ｌｏｇの場合、リゾチーム活性が有意であると評価した。
表１０は、ＧＨ２５リゾチームＰ２４２Ｍ９（配列番号４）、合成ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８）、または配列番号８の１１種の変異体への暴露時のクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＮＮ０１２６０の光学濃度低下（ΔＯＤ）を示している。
９つの位置の突然変異は、リゾチーム活性の損失を生じなかったことが結果から示される。しかしながら、位置９７の突然変異は、活性の損失を生じたことから、この位置では突然変異を行えないことが示唆される。
実施例１１：ｐＨ活性プロファイル
どのｐＨでＧＨ２５リゾチームまたは変異体がピークリゾチーム活性を有するかを決定するために、一連のｐＨ値に対して５４０ｎｍで分光光度計により測定される再懸濁されたミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＴＣ Ｎｏ．４６９８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｍ３７７０）の溶液の吸光度／光学濃度の減少（低下）を測定することにより、本発明に係るリゾチームのｐＨ活性プロファイルを決定した。
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）基質を実施例６に記載したように調製した。実験開始前、ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いてクエン酸−リン酸緩衝液を次のｐＨ値、すなわち、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、および７．０の１つに調整したこと以外は、実施例６に記載したように、リゾチーム抗微生物活性を測定した。以上に記載の実験を二重試験方式または三重試験方式で行った。結果は、以下の表１２に示される。
置換Ｙ２８Ｍ、Ｇ９２Ｐ、Ａ９３Ｍ、Ｖ１３３Ｍ、Ｔ１４２Ｎ、またはＦ１７８Ｉを有する本発明に係るＧＨ２５リゾチーム変異体は、野生型リゾチームと比較して、ｐＨ活性プロファイルの有意な変化を伴うことなく抗微生物活性を維持したことが、結果から示される。置換Ｗ１０ＨまたはＳ３９Ｄを有する本発明に係るＧＨ２５リゾチーム変異体は、抗微生物活性を維持しつつ０．５ｐＨ単位だけｐＨプロファイルが増大されるように改変されたｐＨプロファイルをもたらすことが示される。
実施例１２：胃内安定性
ペプシンを含有する人工胃液（ｐＨ２）中で１時間までインキュベートした後、濁度アッセイにより、ニワトリ卵白リゾチーム、Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８および２つの変異体（Ｗ１０ＨおよびＳ３９Ｄ）の活性を活性試験した。次いで、この活性を、ペプシンを含有する胃液と共にインキュベーションを行うことなく同一のまたは等価な条件下で各リゾチームに対して作成された標準曲線と、比較した。
異なるリゾチームを人工胃液中で０、１５、３０、または６０分間の時間間隔でインキュベートした。インキュベーション後、停止緩衝液を添加してｐＨを上昇させることにより、低ｐＨおよびペプシンがリゾチームのペプチド結合を分解するのを防止した。ペプシンの不活性化後、比較のために、対象のリゾチームの異なる濃度の標準曲線を用いて、活性濁度アッセイを行った。
人工胃液：（ＨＣｌ ｐＨ２、１ｍｇ／ｍｌペプシン、０．１Ｍ ＮａＣｌ）。
溶液Ａ：０．０１Ｍ ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ（２７５μｌ １Ｍ ＨＣｌと２．５ｍｌ １Ｍ ＮａＣｌとを混合して、２５ｍｌの全体積になるように２２．２３ｍｌのＭＱ水を添加することにより、調製された）。
溶液Ｂ：０．０１Ｍ ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌペプシン（５０ｍｇペプシンを秤取して５ｍｌの溶液Ａを添加することにより、調製された）。
標準曲線の作成
人工胃液（１６０μｌ）を各マイクロタイターウェルに添加し、続いて、２０μｌクエン酸−リン酸緩衝液を添加した（ニワトリ卵白リゾチームに対してはｐＨ７、Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチームに対してはｐＨ４、ならびに変異体Ｗ１０ＨおよびＳ３９Ｄに対してはｐＨ４．５）。次いで、リゾチーム溶液（２０μｌ）を添加し、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）基質（２０μｌ、実施例６に記載したように調製された）を各ウェルに添加し（標準曲線サンプルさらには時系列サンプル）、ＯＤ５４０ｎｍを３７℃で１時間にわたり各分で測定した。
ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加により異なるリゾチーム（前節に与えられたとおり）に対してクエン酸−リン酸緩衝液を最適ｐＨに調整した以外は、実施例６に記載のように、リゾチーム抗微生物活性を測定した。以上に記載の実験を二重試験方式で行った。結果は、以下の表１３に示される。
ニワトリ卵白リゾチームでは、１５分後でさえも、人工胃液中でのインキュベーション後の残存リゾチーム活性は、劇的に低減された。それと比較して、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）からのＧＨ２５リゾチームは、活性の低下を示さなかった。それに加えて、置換Ｗ１０ＨまたはＳ３９Ｄを有する２つのＧＨ２５変異体もまた、リゾチーム活性を維持し、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）からのＧＨ２５リゾチームに類似した残存活性を示した。
実施例１３：ゲノムＤＮＡの単離
添加されたアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８）およびニワトリ卵白リゾチームとアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（配列番号８）との組合せを用いて、細菌ゲノムＤＮＡ精製の収率を、リゾチームを用いないおよびニワトリ卵白リゾチーム単独でのＤＮＡ精製と比較した。５つの異なる細菌からゲノムＤＮＡを単離した。
方法
接種ループを用いて寒天プレートから細胞を削り取ることにより、または液体培養物を遠心分離することにより、細菌塊を得た。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ５１１０６）の改変版を用いてＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｃｕｂｅまたは手動プロセスのいずれかを用いて精製した。
ＱＩＡｃｕｂｅを用いたＤＮＡ単離：
１０μＬ接種ループにフィットしたコロニースクレープを３ｍＬのＭ９緩衝液（１０００ｍＬ Ｈ２Ｏ中に８．７７ｇ Ｎａ２ＨＰＯ．２Ｈ２Ｏ、３ｇ ＫＨ２ＰＯ４、４ｇ ＮａＣｌ、および０．２ｇ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを溶解させ、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いてｐＨを７に調整することにより、調製された）中に再懸濁した。溶液を３０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、ペレットを３ｍＬ Ｐ１緩衝液（Ｑｉａｇｅｎキット＃５１１０６に含まれる）中に再懸濁した。２００μＬアリコートを１２本の２ｍＬチューブに添加し、１５μＬの水、Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）、ニワトリ卵白リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）、またはＡ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ニワトリ卵白（１０ｍｇ／ｍＬ）１：１混合物を、三重試験方式でチューブに添加した。チューブをＱＩＡｃｕｂｅ中に配置し、Ｑｉａｇｅｎ推奨方法に従って処理した。
手動のＤＮＡ単離：
液体培養物ペレットおよびコロニースクレープを３ｍＬのＭ９緩衝液中に再懸濁した。細菌Ｍ９緩衝懸濁液を３０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、ペレットを３ｍＬのＰ１緩衝液中に再懸濁した。２００μＬアリコートを１２本の２ｍＬチューブに添加し、１５μＬの水、Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）、ニワトリ卵白リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）、またはＡ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ニワトリ卵白（１０ｍｇ／ｍＬ）１：１混合物を、三重試験方式でチューブに添加した。チューブを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、２５μＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼおよび２００μＬ Ｑｉａｇｅｎ緩衝液ＡＬを添加した。次いで、チューブを５６℃で２０分間インキュベートし、次いで、２１０μＬの９６％エタノールを各チューブに添加した。チューブを撹拌し、液体をＱｉａｇｅｎスピンカラムに移し、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを５００μｌ ＡＷ１緩衝液（Ｑｉａｇｅｎキット＃５１１０６に含まれる）で２回洗浄した。１回目の洗浄後、カラムを８０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、２回目の洗浄後、カラムを１５０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。各カラムに１００μＬ ｍｉｌｌｉＱ水（７０℃に加熱した）を添加することにより、ゲノムＤＮＡをカラムから溶出させ、室温で１分間インキュベートし、そしてエッペンドルフチューブ中に８０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。すべてのインキュベーションを三重試験方式で反復した。
結果
単離されたＤＮＡをアガロースゲル上で泳動させてＤＮＡバンドの強度を目視検査することにより、ゲノムＤＮＡの収率を推定した（表１５）。４つの異なる評価尺度を用いて、各細菌株の４つの異なる処理間の相対ＤＮＡ収率を目視により推定した。
Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチームの使用は、鶏卵リゾチームと比較して、６つの事例のうち３つで、同程度またはより良好なゲノムＤＮＡ収率を与えた。Ａ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＧＨ２５リゾチームと鶏卵リゾチームとの組合せの使用は、各リゾチーム単独と比較して、６つの事例のうち５つで、同程度またはより良好なゲノムＤＮＡ収率を与えた。

Claims (31)

  1. （ａ）配列番号４の成熟ポリペプチドまたは配列番号８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）配列番号３の成熟ポリペプチドコード配列または配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
    （ｃ）配列番号３もしくは配列番号７の成熟ポリペプチドコード配列またはそれらの全長相補配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
    （ｄ）１又は数個の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号４または配列番号８の成熟ポリペプチドの変異体、ならびに
    （ｅ）リゾチーム活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリペプチドの断片であって、少なくとも１８４アミノ酸残基を有する前記断片
    からなる群から選択される、リゾチーム活性を有する単離されたポリペプチド。
  2. 前記配列同一性が、少なくとも９０％である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記断片が、少なくとも１９５のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 配列番号４もしくは配列番号８、または配列番号４もしくは配列番号８の成熟ポリペプチド、を含むまたはそれからなるポリペプチドの中から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記成熟ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸２０〜２２７または配列番号８のアミノ酸１〜２０８の中から選択される、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. １つ以上（複数）の位置に置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号４または配列番号８の成熟ポリペプチドの変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
  8. 洗剤組成物である、請求項７に記載の組成物。
  9. 洗濯、食器洗浄、または硬質表面クリーニングのための、請求項８に記載の洗剤組成物。
  10. 前記組成物が、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、およびマンナナーゼ、またはそれらの任意の混合物を含む群から選択される１種以上のさらなる酵素を含む、請求項８〜９のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
  11. 界面活性剤、ビルダー、ハイドロトープ、漂白系、ポリマー、布染色剤、補助材料、分散剤、染料転写阻害剤、蛍光増白剤、防汚性ポリマー、および再付着防止剤を含む群から選択される１つ以上の成分を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
  12. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む動物用飼料組成物。
  13. １種以上のアミラーゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ、β−グルカナーゼ、またはそれらの任意の混合物をさらに含む、請求項１２に記載の動物用飼料組成物。
  14. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドと、
    少なくとも１種の脂溶性ビタミン、および／または
    少なくとも１種の水溶性ビタミン、および／または
    少なくとも１種の微量ミネラルと、
    を含む動物用飼料添加物。
  15. １種以上のアミラーゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ、β−グルカナーゼ、またはそれらの任意の混合物をさらに含む、請求項１４に記載の動物用飼料添加物。
  16. 細菌ゲノムＤＮＡ抽出組成物である、請求項７に記載の組成物。
  17. 前記組成物が１種以上のさらなるリゾチームを追加的に含む、請求項１６に記載の細菌ゲノムＤＮＡ抽出組成物。
  18. バイオフィルム形成の阻害剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  19. 歯科用組成物における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  20. 洗剤組成物における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  21. 動物用飼料における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  22. 細菌の細胞壁を破壊するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  23. 前記ポリペプチドが細菌からのＤＮＡの単離プロセスに使用される、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. （ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて、単離された細菌を処理することと、
    （ｂ）細菌ＤＮＡを回収することと、
    を含む、細菌からのＤＮＡの単離方法。
  25. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  26. 発現宿主内で前記ポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物または発現ベクター。
  27. 前記ポリペプチドの産生を誘導する１つ以上の制御配列に機能可能に連結された請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
  28. （ａ）前記ポリペプチドの産生を助長する条件下で、前記ポリペプチドをその野生型形態で産生する細胞を培養することと、
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収することと、
    を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法。
  29. （ａ）前記ポリペプチドの産生を助長する条件下で請求項２７に記載の宿主細胞を培養することと、
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収することと、
    を含む、リゾチーム活性を有するポリペプチドの産生方法。
  30. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフォームされた、トランスジェニック植物、植物体部分、または植物細胞。
  31. （ａ）前記ポリペプチドの産生を助長する条件下で請求項３０に記載のトランスジェニック植物または植物細胞を培養することと、
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収することと、
    を含む、リゾチーム活性を有するポリペプチドの産生方法。
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