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CN113769148B - PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用 - Google Patents

PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用 Download PDF

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CN113769148B CN202111138724.9A CN202111138724A CN113769148B CN 113769148 B CN113769148 B CN 113769148B CN 202111138724 A CN202111138724 A CN 202111138724A CN 113769148 B CN113769148 B CN 113769148B
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Abstract

本申请实施例公开了PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂的应用。PslG蛋白能够促进隐形眼镜护理液的杀菌效果，显著降低细菌的吸附，显著降低生物被膜形成能力以及增强清除已形成的生物被膜的作用。PslG蛋白为具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列95％以上的相似性的氨基酸序列。本申请实施例还公开了一种隐形眼镜护理液，包括PslG蛋白、杀菌剂和药学上可接受的载体。本申请实施例还公开了一种用于隐形眼镜护理的试剂盒，包括PslG蛋白和隐形眼镜护理液，该隐形眼镜护理液包括杀菌剂和药学上可接受的载体。

Description

PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用。
背景技术
生物被膜(biofilm)是一种或多种微生物由胞外多聚物相联合而形成的类似高等生物组织的微生物膜性聚集体。与浮游菌细胞相比，生物被膜内的菌细胞对不良生存环境的抵抗力极大增强，且对抗菌和抑菌物质具有更强的耐受能力。一些临床菌株，例如，革兰氏阴性菌的铜绿假单胞菌，在隐形眼镜清洁不完全的状况下容易造成眼部感染，且因其易形成生物被膜，使眼部感染难以治疗及根除。已发现胞外多聚物降解酶，特别是糖苷水解酶PslG蛋白能高效抑制和瓦解生物被膜，且通过PslG蛋白处理后从生物被膜中游离出的菌细胞对抗生素表现敏感。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂的应用。
在一些实施例中，所述PslG蛋白为具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列95％以上的相似性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述隐形眼镜护理液包含选自双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水中的至少一种的杀菌剂；所述双胍聚合物包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢中的至少一种。
在一些实施例中，所述隐形眼镜护理液还包含药学上可接受的载体。
在一些实施例中，所述药学上可接受的载体选自渗透压调节剂、增稠剂、保湿剂、pH调节剂、络合剂、清洁剂中的一种或多种。
在一些实施例中，所述PslG蛋白在所述隐形眼镜护理液中的终浓度为1-103nM。
在一些实施例中，所述隐形眼镜护理液中的所述杀菌剂的终浓度为2×10-5-20nM。
在一些实施例中，所述隐形眼镜护理液用于硬性隐形眼镜和/或软性隐形眼镜。
根据本申请的一个方面，提供了一种隐形眼镜护理液。该隐形眼镜护理液可以包括PslG蛋白、杀菌剂和药学上可接受的载体。所述杀菌剂选自双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水中的至少一种；所述双胍聚合物包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢中的至少一种。
根据本申请的一个方面，提供了一种用于隐形眼镜护理的试剂盒。该试剂盒可以包括PslG蛋白和隐形眼镜护理液。该隐形眼镜护理液可以包括杀菌剂和药学上可接受的载体。所述杀菌剂选自双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水中的至少一种；所述双胍聚合物包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢中的至少一种。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构。
图1示出了在抑制96孔PVC微孔板中生物被膜形成实验中使用处理组、PslG蛋白处理组、博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组处理后生物被膜的生物量OD560值的统计结果的图。
图2示出了使用与图1相同的处理组处理后生物被膜结晶紫染色结果的图。
图3示出了在抑制96孔PVC微孔板中生物被膜形成实验中使用处理组、PslG蛋白处理组、海昌护理液处理组和PslG蛋白联合海昌护理液处理组处理后生物被膜的生物量OD560值的统计结果的图。
图4示出了使用与图3相同的处理组处理后生物被膜结晶紫染色结果的图。
图5示出了在瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验中使用处理组、PslG蛋白处理组、博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组处理后生物被膜的生物量OD560值的统计结果的图。
图6示出了是在抑制隐形眼镜中生物被膜形成及活菌计数实验中使用PslG蛋白、博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组以及海昌护理液处理组和PslG蛋白联合海昌护理液处理组处理后活菌计数的统计结果的图。
图7示出了在瓦解隐形眼镜中已形成的生物被膜及活菌计数实验中使用博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组处理后活菌计数的统计结果的图。
图8示出了瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验中PslG蛋白在博士伦护理液中放置不同时间后处理后的生物被膜的生物量OD560值的统计结果的图。
图9示出了使用与图8相同的处理组处理后的生物被膜结晶紫染色结果的图。
图10示出了在瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验中使用处理组、PslG蛋白处理组、顺序使用组、PslG蛋白联合博士伦护理液处理组以及博士伦护理液处理组处理后生物被膜的生物量OD560值的统计结果的图。
图11示出了使用与图10相同的处理组处理后的生物被膜结晶紫染色结果的图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本申请应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本申请和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本申请将PslG蛋白应用于隐形眼镜护理液，以实现对隐形眼镜上铜绿假单胞菌及其生物被膜有效的抑制和清除。
根据本申请的一方面，提供了PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂的应用。
如本文所用，“PslG蛋白”、“PslG”之间可以互换使用，均指来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PslG基因编码的功能未知的蛋白或其他类似微生物的同源蛋白。应理解，PslG蛋白还包括该PslG蛋白的野生型和突变型，以及包括该PslG蛋白的活性片段或衍生蛋白。
在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列90％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列92％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列95％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQID NO:1所示的氨基酸序列98％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
一些实施例中，隐形眼镜护理液可以用于所有类型的隐形眼镜(又称角膜接触镜)。隐形眼镜根据材料的不同可以包括硬性隐形眼镜、软性隐形眼镜等或其组合(例如，硬性和软性隐形眼镜)。软质隐形眼镜、硬(刚)质和软质或柔质可透气隐形眼镜、硅酮水凝胶(质地的)隐形眼镜、硅非水凝胶(质地的)隐形眼镜以及传统的硬质隐形眼镜。软性硬性眼镜的材料为亲水性合成高分子化合物。软性硬性眼镜也即一般所称的“隐形眼镜”。硬性隐形眼镜可以包括RGP眼镜(Rigid GasPermeable Contact Lens)、OK镜(Orthokeratology)等。
在一些实施例中，隐形眼镜护理液可以包括杀菌剂和药学上可接受的载体。示例性杀菌剂可以包括双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水等或其组合。双胍聚合物可以包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢等或其组合。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚六亚甲基双胍。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚胺丙基双胍和/或聚季铵盐-1。示例性药学上可接受的载体可以包括渗透压调节剂、增稠剂、保湿剂、pH调节剂、络合剂、清洁剂等或其组合。示例性渗透压调节剂可以包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、右旋糖、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇等或其组合。示例性增稠剂可以包括卡波姆940、卡波姆941、卡波姆Ultrez 20、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶或海藻酸钠等或其组合。示例性保湿剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸钠、甘露醇、甘油、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、己二酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、木糖醇、山梨糖醇、海藻糖、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等或其组合。示例性pH调节剂可以包括盐酸、氢氧化钠、硼酸、硼酸钠、硼砂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨甲基丙醇、氨丁三醇等或其组合。示例性络合剂可以包括乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)、柠檬酸钠等或其组合。示例性清洁剂可以包括Tetronic1304、Tetronic1107、泊洛沙姆237、泊洛沙姆F127等或其组合。
在一些实施例中，隐形眼镜护理液可以是海昌护理液(生产批号为1200151)，包括聚六亚甲基双胍、乙二胺四乙酸二钠、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施例中，隐形眼镜护理液可以是博士伦隐形眼镜多功能护理液(生产批号为42010136)，包括透明质酸钠、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、硼酸、硼酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、纯水，以及聚胺丙基双胍和聚季铵盐-1。
在一些实施例中，PslG蛋白可以包含于隐形眼镜护理液中，例如，PslG蛋白可以是制备隐形眼镜护理液的组分。在一些实施例中，PslG蛋白可以不包含于隐形眼镜护理液中，例如，PslG蛋白可以独立包装。
在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为0.1-103nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为0.5-103nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为1-103nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为10-103nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为10-950nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为100nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为50nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为25nM。在一些实施例中，PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的终浓度为1nM。
在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为1×10-5-30nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为1.5×10-5-25nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.5×10-5-15nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为3×10-5-10nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为3.5×10-5-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为1.8×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.2×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.4×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.6×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.8×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为3×10-5-20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为1×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为1.5×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.2×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.4×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.5×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.6×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为2.8×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为3×10-5nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为10nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为15nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为20nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为25nM。在一些实施例中，隐形眼镜护理液中的杀菌剂的终浓度为30nM。
PslG蛋白可以作为隐形眼镜护理液的增强剂，用于增强隐形眼镜护理液的杀菌消毒效果，增强隐形眼镜护理液对生物被膜的清除能力。在一些实施例中，PslG蛋白可以作为制备隐形眼镜护理液的组分。在一些实施例中，PslG蛋白可以是单独的制剂，与隐形眼镜护理液一起组成用于隐形眼镜护理的试剂盒。在使用时，例如，可以先使用PslG蛋白处理隐形眼镜，之后使用隐形眼镜护理液处理隐形眼镜；又例如，可以先使用隐形眼镜护理液处理隐形眼镜，之后使用PslG蛋白处理隐形眼镜；再例如，可以将隐形眼镜护理液与PslG蛋白同时处理隐形眼镜。
根据本申请的另一方面，提供了一种隐形眼镜护理液。该隐形眼镜护理液包括PslG蛋白或其活性片段、杀菌剂和药学上可接受的载体。示例性杀菌剂可以包括双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水等或其组合。双胍聚合物可以包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢等或其组合。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚六亚甲基双胍。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚胺丙基双胍和/或聚季铵盐-1。示例性药学上可接受的载体可以包括渗透压调节剂、增稠剂、保湿剂、pH调节剂、络合剂、清洁剂等或其组合。示例性渗透压调节剂可以包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、右旋糖、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇等或其组合。示例性增稠剂可以包括卡波姆940、卡波姆941、卡波姆Ultrez 20、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶或海藻酸钠等或其组合。示例性保湿剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸钠、甘露醇、甘油、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、己二酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、木糖醇、山梨糖醇、海藻糖、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等或其组合。示例性pH调节剂可以包括盐酸、氢氧化钠、硼酸、硼酸钠、硼砂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨甲基丙醇、氨丁三醇等或其组合。示例性络合剂可以包括乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)、柠檬酸钠等或其组合。示例性清洁剂可以包括Tetronic1304、Tetronic1107、泊洛沙姆237、泊洛沙姆F127等或其组合。
在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列90％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列92％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列95％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有与SEQID NO:1所示的氨基酸序列98％以上相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些实施例中，PslG蛋白可以为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
PslG蛋白与隐形眼镜护理液协同作用能够有效抑制生物被膜的形成并清除已形成的生物被膜，从而有效抑制细菌的生长。在隐形眼镜护理液中添加PslG蛋白，由于PslG蛋白与隐形眼镜护理液协同作用，降低了隐形眼镜护理液中杀菌剂的使用量，使得隐形眼镜护理液产品更温和。
根据本申请的再一方面，提供了一种用于隐形眼镜护理的试剂盒。该试剂盒可以包括PslG蛋白或其活性片段的制剂和隐形眼镜护理液。该制剂可以是以溶液、片剂、粉末等形式存在。该隐形眼镜护理液可以包括杀菌剂和药学上可接受的载体。示例性杀菌剂可以包括双胍聚合物、聚季铵盐-1、壳聚糖、季铵盐壳聚糖、氯已定、山梨酸、苯扎氯铵、肉豆蔻酰丙基二甲胺、双氧水等或其组合。双胍聚合物可以包括聚氨丙基双胍、聚六亚甲基双胍、聚亚己基双胍、聚胍氯化氢等或其组合。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚六亚甲基双胍。在一些实施例中，杀菌剂可以是聚胺丙基双胍和/或聚季铵盐-1。示例性药学上可接受的载体可以包括渗透压调节剂、增稠剂、保湿剂、pH调节剂、络合剂、清洁剂等或其组合。示例性渗透压调节剂可以包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、右旋糖、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇等或其组合。示例性增稠剂可以包括卡波姆940、卡波姆941、卡波姆Ultrez 20、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶或海藻酸钠等或其组合。示例性保湿剂可以包括聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸钠、甘露醇、甘油、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、己二酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、木糖醇、山梨糖醇、海藻糖、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等或其组合。示例性pH调节剂可以包括盐酸、氢氧化钠、硼酸、硼酸钠、硼砂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨甲基丙醇、氨丁三醇等或其组合。示例性络合剂可以包括乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)、柠檬酸钠等或其组合。示例性清洁剂可以包括Tetronic1304、Tetronic1107、泊洛沙姆237、泊洛沙姆F127等或其组合。
在一些实施例中，可以先使用PslG蛋白制剂处理隐形眼镜，之后使用隐形眼镜护理液处理隐形眼镜。在一些实施例中，可以先使用隐形眼镜护理液处理隐形眼镜，之后使用PslG蛋白制剂处理隐形眼镜。在一些实施例中，可以将隐形眼镜护理液与PslG蛋白制剂同时处理隐形眼镜。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实验材料
1.培养基：
LBNS固体培养基(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、琼脂粉15g，去离子水补足至1000ml。
LBNS液体培养基(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g，去离子水补足至1000ml。
Jensen’s液体培养基(pH 7.3)：NaCl 5g、K2HPO4 2.51g、L-谷氨酸单钠盐15.56g、缬氨酸2.81g、苯丙氨酸1.32g、葡萄糖13.87g、MgSO4·7H2O 0.165g、CaCl2·2H2O 0.105mg、FeSO4·7H2O 5.5μg、ZnSO4·7H2O 12μg、去离子水补足至1000ml。
2.菌株：铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1，为研究生物被膜的模式菌株之一。多糖水解酶：PslG蛋白
3.隐形眼镜护理液
a.博士伦隐形眼镜多功能护理液(BAUSCH&LOMB Biotrue Multi-purposeSolution)，简称“博士伦护理液”。
生产批号：42010136
产品成分：无菌等渗溶液，含透明质酸钠、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、硼酸、硼酸钠、依地酸二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、纯水，以及具有双重消毒系统的防腐剂(0.00013％聚胺丙基双胍和0.0001％聚季铵盐-1)。
b.海昌护理液(HYDRON AQUA-CLEAN contact lenses Solution)，以下简称“海昌护理液”。
生产批号：1200151
主要有效成分及含量如下：聚六亚甲基双胍：0.0015mg/ml±20％；乙二胺四乙酸二钠：0.5mg/ml±20％；泊洛沙姆：2.0mg/ml±20％；聚乙烯吡咯烷酮：0.118mg/ml±20％。
4.其他材料：
库博光学(cooper vision)宝睛润进口日抛近视隐形眼镜(100度)；
PBS缓冲液；
96孔PVC微孔板；
96孔硬质板(NEST)；
24孔板(NEST)。
利用多糖水解酶PslG蛋白(PslG蛋白)促进护理液的抑菌及清除生物被膜作用
实验流程
抑制96孔PVC微孔板中生物被膜形成实验流程
1、将铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1接种至在LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1的平板上挑取PAO1单菌落，接种至LBNS液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。
3、将过夜的培养液以1:100(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，分为对照组、PslG蛋白处理组、隐形眼镜护理液处理组(例如，实施例1中为博士伦护理液处理组、实施例2中为海昌护理液处理组)、PslG蛋白联合隐形眼镜护理液处理组。PslG蛋白处理组为添加PslG蛋白至终浓度为50nM；隐形眼镜护理液处理组为添加隐形眼镜护理液2μL/100μL；PslG蛋白联合隐形眼镜护理液处理组为添加PslG蛋白至终浓度为50nM同时添加隐形眼镜护理液2μL/100μL。以每孔100μL的混合液加入至96孔PVC微孔板中30度静止培养，以在气液交界处长成生物被膜。
4、用移液枪吸取菌膜下的菌液，转移至96孔硬质板中，用酶标仪测定OD600以此观测铜绿假单胞菌细胞的生长情况(可选)。
5、96孔PVC微孔板用PBS清洗生物被膜三次，将0.1％结晶紫溶液以120μL/孔加入至96孔PVC微孔板中，对小孔内牢固吸附的细菌细胞进行染色，30度静止处理30min。
6、96孔PVC微孔板用PBS清洗三次后进行拍照，再以200μL/孔添加40％乙酸溶液溶解吸附在PVC板上的结晶紫，并将溶液转移至96孔硬质板中用酶标仪测定OD560以此来比较处理后的生物被膜的生物量。
瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验流程
1、将铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1接种至在LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1的平板上挑取PAO1单克隆，接种至LBNS液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。
3、将过夜的培养液以1:100(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，以100μL/孔加入至96孔PVC微孔板中30度静止培养2h以在气液交界处长成生物被膜。
4、用移液枪吸取菌膜下的菌液，用相应的溶液重悬得到不同的组。实施例3中为PBS对照组、PslG蛋白处理组、博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组。PslG蛋白处理组为在PBS缓冲液中添加PslG蛋白至终浓度为50nM；博士伦护理液处理组为将PBS缓冲液换成博士伦护理液；PslG蛋白联合博士伦护理液处理组为在博士伦护理液添加PslG蛋白至终浓度为50nM。实施例6中为PBS对照组、博士伦护理液处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组。PBS对照组和博士伦护理液处理组与实施例3中相同，PslG蛋白联合博士伦护理液处理包括在博士伦护理液中不同放置时间的PslG蛋白联合博士伦护理液的处理组，其中PslG蛋白与博士伦护理液室温下放置0周、1周、4周、5周、6周、12周，得到不同的放置时间的添加有PslG蛋白的博士伦护理液。处理2h后，96孔PVC微孔板用PBS清洗生物被膜三次，用0.1％结晶紫溶液以120μL/孔加入至96孔PVC微孔板中，30度静止处理30min。
实施例7中为PBS对照组、PslG蛋白处理组、博士伦护理液处理组、PslG先处理30分钟博士伦再处理2小时的顺序使用处理组(简称为“顺序使用处理组”)以及PslG蛋白联合博士伦护理液处理组，其中PBS对照组和PslG蛋白处理组均处理30min，PslG蛋白处理组和博士伦护理液处理组处理2.5h后，96孔软板用PBS清洗生物被膜三次，用0.1％结晶紫溶液以120μL/孔加入至96孔软板中，30度静止处理30min。
5、96孔PVC微孔板用PBS清洗三次后进行拍照，再以200μL/孔添加40％乙酸溶液溶解吸附在PVC板上的结晶紫，将溶液转移至96孔硬质板中用酶标仪测定OD560以此来比较处理后的生物被膜的生物量。
抑制隐形眼镜中生物被膜形成及活菌计数实验流程
1、将铜绿假单胞菌PAO1接种至在LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1的平板上挑取PAO1单克隆，接种至LBNS液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。
3、将过夜的培养液以1:100(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，分为博士伦护理液处理组、PslG蛋白联合博士伦护理液处理组、海昌护理液处理组和PslG蛋白联合海昌护理液处理组、以及PslG与PBS溶液处理组。博士伦隐形眼镜处理组为博士伦护理液；PslG蛋白联合博士伦护理液处理组为在博士伦护理液添加PslG蛋白至终浓度为50nM；海昌护理液处理组为海昌护理液；PslG蛋白联合海昌护理液处理组为在海昌护理液中添加PslG蛋白至终浓度为50nM；PslG蛋白与PBS溶液处理组为在PBS溶液中添加PslG蛋白至终浓度为50nM。以1mL/孔加入至24孔板中同时加入隐形眼镜片30度静止培养8h以在气液交界处长成生物被膜。
4、用干净的镊子将隐形眼镜片取出，用PBS清洗三次，再转移至5ml PBS缓冲液中高速涡旋5min，涡旋后的溶液上清用PBS进行10倍梯度稀释，点到不含抗生素的LBNS平板上。
5、37℃过夜培养后，记录菌落数量，计算生物被膜中的活菌数量。
瓦解隐形眼镜中已形成的生物被膜及活菌计数实验流程
1、将铜绿假单胞菌PAO1接种至在LBNS固体培养基平板上，37℃静置培养过夜。
2、从完成步骤1的平板上挑取PAO1单克隆，接种至LBNS液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。
3、将过夜的培养液以1:100(V:V)的接种量接种于Jensen液体培养基中，以1mL/孔加入至24孔板中同时加入隐形眼镜片30度静止培养2h以在气液交界处长成生物被膜。
4、用移液枪吸取菌膜下的菌液，用相应的溶液重悬，实验组分为博士伦护理液处理组和PslG蛋白+博士伦护理液处理组。博士伦隐形眼镜处理组为博士伦护理液；PslG蛋白+博士伦护理液处理组为在博士伦护理液添加PslG蛋白至终浓度为50nM。处理2h后，用干净的镊子将隐形眼镜片取出，用PBS清洗三次，再转移至5ml PBS缓冲液中高速涡旋5min，涡旋后的溶液上清用PBS进行10倍梯度稀释，点到不含抗生素的LBNS平板上。
5、37℃过夜培养后，记录菌落数量，计算生物被膜中的活菌数量。
实施例1、PslG蛋白和博士伦护理液联用显著提高杀菌效果同时显著抑制细菌吸附
根据上述实验流程中的抑制96孔PVC微孔板中生物被膜形成实验流程进行实验，隐形眼镜护理液处理组为采用博士伦护理液进行处理的博士伦护理液处理组。步骤3中30度静止培养24h后再进行OD600和OD560的测定实验，结果如下所示。
各个处理组的OD600值如下表1所示。OD600值表示铜绿假单胞菌菌体细胞密度。
表1.各个处理组处理后菌液的OD600值
Figure GDA0003617288100000111
根据表1结果，相较于对照组和PslG蛋白处理组以及博士伦护理液处理组，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组的OD600值更低。OD600值越小，说明菌体密度越小，杀菌性能越好。因此，PslG蛋白与博士伦护理液联用具有比单独使用博士伦护理液和PslG蛋白更优的杀菌效果。
各个处理组处理后生物被膜的OD560值如图1所示。OD560值用于表示吸附在96孔PVC微孔板上的生物被膜的生物量。OD560值越小，表示吸附的生物被膜的生物量越小，降低细菌吸附的能力越强，降低生物被膜形成能力越强。24h的生物被膜形成抑制实验中，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组的生物被膜生物量(OD560值)比两者单用的生物被膜生物量更低，显示出比两者单用更强的降低细菌吸附的能力，更强的降低生物被膜形成能力。
各个处理组处理后的生物被膜颜色如图2所示。颜色越浅，表示被染色的菌体量越少，降低细菌吸附的能力越强，降低生物被膜形成能力越强。24h的生物被膜形成抑制实验中，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组的溶液颜色比两者单用的颜色更浅，显示出比两者单用更强的降低细菌吸附的能力，更强的降低生物被膜形成能力。
因此，PslG蛋白作为博士伦护理液的增强剂，能够促进博士伦护理液的杀菌效果，显著降低细菌的吸附，显著降低生物被膜形成能力。
实施例2、PslG蛋白和海昌护理液联用显著抑制细菌吸附
根据上述实验流程中的抑制96孔PVC微孔板中生物被膜形成实验流程进行实验，隐形眼镜护理液处理组为采用海昌护理液进行处理的海昌护理液处理组。步骤3中30度静止培养10h后再进行OD560的测定实验(即，步骤4省略)。
各个处理组处理后生物被膜的OD560值如图3所示，10h的生物被膜形成抑制实验中，相较于对照组和PslG蛋白处理组以及海昌护理液处理组，PslG蛋白联合海昌护理液处理组的OD560值更低，显示出比两者单用更强的降低细菌吸附的能力，更强的降低生物被膜形成能力。
各个处理组处理后的生物被膜颜色如图4所示。10h的生物被膜形成抑制实验中，PslG蛋白联合海昌护理液处理组的溶液颜色比两者单用的颜色更浅，显示出比两者单用更强的降低细菌吸附的能力，更强的降低生物被膜形成能力。
因此，PslG蛋白作为海昌护理液的增强剂，能够显著降低细菌的吸附，显著降低生物被膜形成能力。
实施例3、PslG蛋白和博士伦护理液联用可更高效的清除孔板上已形成的生物被膜
根据上述实验流程中的瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验流程进行实验，各个处理组处理后生物被膜的OD560值结果如图5所示。相较于对照组和PslG蛋白处理组以及博士伦护理液单独处理组，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组OD560值更低，表示经由PslG蛋白和博士伦护理液处理后，相对于两者单用，残存的生物被膜的生物量更少，清除生物被膜的能力更强。
因此，PslG蛋白作为博士伦护理液的增强剂，能够促进博士伦护理液的清除生物被膜的作用。
实施例4、PslG蛋白与隐形眼镜护理液联用使镜片上吸附的细菌量显著减低
根据实验流程中的抑制隐形眼镜中生物被膜形成及活菌计数实验流程进行实验，结果如下所示。
隐形眼镜片经由高速涡旋、活菌计数，活菌计数结果如图6所示，与隐形眼镜护理液单独处理组和PslG蛋白和PBS溶液处理组相比，PslG蛋白和隐形眼镜护理液联用处理组的活菌数量显著降低，表明PslG蛋白和隐形眼镜护理液联用能使镜片上吸附的细菌数量降低，能够有效抑制生物被膜的形成。因此，PslG蛋白作为隐形眼镜护理液(例如，博士伦护理液、海昌护理液)的增强剂，能够降低隐形眼镜上吸附活菌的数量，降低细菌的吸附，有效抑制生物被膜的形成。
实施例5、PslG蛋白与隐形眼镜护理液联用可将生物被膜细菌清除率提升10倍
根据实验流程中的瓦解隐形眼镜中已形成的生物被膜及活菌计数实验流程进行实验，结果如下。
处理后的隐形眼镜片再经由高速涡旋、活菌计数，活菌计数结果如图7所示，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组相对于博士伦护理液处理组能使隐形眼镜镜片上吸附的活菌数量降低10倍左右，表明对于已形成的生物被膜，PslG蛋白联合博士伦护理液处理组能够有效清除生物被膜的细菌。
实施例6、PslG蛋白可以在护理液中长时间储存
根据实验流程中的瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验流程进行实验，各个处理组处理后生物被膜的OD560值结果如图8所示。PslG蛋白联合伦护理液处理组，其中PslG蛋白在博士伦护理液中室温下放置0周、1周、4周、5周、6周、12周处理均显示出比对照组和博士伦护理液处理组更低的生物量，说明对于已形成的生物被膜，放置不同时间的PslG蛋白和博士伦护理液均能有效清除生物被膜。且PslG蛋白在博士伦护理液中室温下放置1周、4周、5周、6周、12周与0周的效果相差不大，说明PslG蛋白可以在博士伦护理液中长时间储存且活性不受影响。
各个处理组处理后的生物被膜颜色如图9所示，PslG蛋白联合伦护理液处理组均比对照组和博士伦护理液处理组颜色更浅，说明吸附的生物量较少，清除生物被膜的效果更好。且PslG蛋白在博士伦护理液中室温下放置1周、4周、5周、6周、12周与0周的溶液颜色相差不大，说明PslG蛋白可以在博士伦护理液中长时间储存且活性不受影响。
实施例7、PslG蛋白和博士伦护理液分开使用和联用均可更高效的清除孔板上已形成的生物被膜
根据上述实验流程中的瓦解96孔PVC微孔板中已形成的生物被膜实验流程进行实验，各个处理组处理后生物被膜的OD560值结果如图10所示。相较于对照组和PslG蛋白处理组以及博士伦护理液单独处理组，顺序使用处理组和PslG蛋白联合博士伦护理液处理组OD560值更低，表示经由PslG蛋白和博士伦护理液处理(联合使用、顺序使用)后，相对于两者单用，残存的生物被膜的生物量更少，清除生物被膜的能力更强。
另一方面，PslG蛋白和博士伦护理液顺序处理(即，先使用PslG蛋白再使用博士伦护理液)与联合处理效果一致，表明PslG蛋白与隐形眼镜护理液的使用顺序不会影响对生物被膜的处理效果，均能显著清除生物被膜。
各个处理组处理后的生物被膜颜色如图11所示。颜色越浅，表示被染色的菌体量越少，清除生物被膜的效果更好。其结果与图10的结果相对应。
本申请所披露的PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂，能够促进隐形眼镜护理液的杀菌效果，显著降低细菌的吸附，显著降低生物被膜形成能力；(2)PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂，能够促进隐形眼镜护理液的清除生物被膜的作用；(3)PslG蛋白可以在博士伦护理液中长时间储存且活性不受影响，长时间储存后的PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂，能够促进隐形眼镜护理液的杀菌效果，显著降低细菌的吸附，显著降低生物被膜形成能力，能够促进隐形眼镜护理液的清除生物被膜的作用。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Gln Val Leu Lys Ala Pro Arg Ala Val Val Trp Lys Asp Phe
1 5 10 15
Leu Gly Val Asn Ala Gln Phe Leu Trp Phe Ser Pro Glu Arg Tyr Asn
20 25 30
Lys Gln Ile Asp Arg Leu Gln Asp Leu Gly Leu Glu Trp Val Arg Leu
35 40 45
Asp Leu His Trp Asp Arg Leu Glu Thr Ala Glu Asp Gln Tyr Gln Leu
50 55 60
Ala Ser Leu Asp Gln Leu Val Lys Asp Leu Glu Ala Arg Gln Leu Lys
65 70 75 80
Ser Val Phe Tyr Leu Val Gly Ser Ala Arg Phe Ile Thr Thr Ala Pro
85 90 95
Phe Tyr Ser Pro Phe Gln Asp Gln Tyr Pro Pro Arg Asp Pro Glu Val
100 105 110
Phe Ala Arg Arg Met Ala Met Leu Ser Gln Arg Tyr Pro Ser Val Ala
115 120 125
Ala Trp Gln Val Trp Asn Glu Pro Asn Leu Ile Gly Phe Trp Arg Pro
130 135 140
Lys Ala Asp Pro Glu Gly Tyr Ala Lys Leu Leu Gln Ala Ser Thr Ile
145 150 155 160
Ala Leu Arg Met Val Asp Pro Glu Lys Pro Val Val Ser Ala Gly Met
165 170 175
Ala Phe Phe Ser Glu Met Pro Asp Gly Arg Thr Met Phe Asp Ala Leu
180 185 190
Gly His Leu Gly Val Glu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Thr Tyr His Pro
195 200 205
Tyr Thr Gln Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Pro Trp Asn Leu Asp Phe Val
210 215 220
Ser His Ala Asn Gln Ile Asn Arg Ala Leu Arg Asn Ala Gly Val Pro
225 230 235 240
Ala Ile Trp Ser Thr Glu Trp Gly Trp Ser Ala Tyr Lys Gly Pro Lys
245 250 255
Glu Leu Gln Asp Ile Ile Gly Val Glu Gly Gln Ala Asp Tyr Val Leu
260 265 270
Arg Arg Leu Ala Leu Met Ser Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Ile Phe Leu
275 280 285
Phe Thr Leu Ser Asp Leu Asp Gln Arg Ala Ser Val Arg Asp Arg Asp
290 295 300
Tyr Gly Leu Leu Asp Leu Asp Ala Asn Pro Lys Pro Val Tyr Leu Ala
305 310 315 320
Leu Gln Arg Phe Leu Lys Val Thr Gly Pro Lys Leu Arg Pro Ala Asp
325 330 335
Pro Pro Val Thr Glu Asp Leu Pro Asp Gly Ser Phe Ser Ile Gly Trp
340 345 350
Thr Arg Glu Asp Gly Arg Asn Val Trp Leu Phe Trp Ser Ala Arg Gly
355 360 365
Gly Asn Val Arg Leu Pro Lys Leu Lys Glu Ala Thr Leu His Asp Pro
370 375 380
Leu Ser Gly Lys Val Thr Pro Leu Ser Gly Ser Asp Gly Leu Glu Val
385 390 395 400
Pro Val Lys Ser Ser Leu Gln Met Leu Val Trp Glu
405 410

Claims (5)

1.PslG蛋白作为隐形眼镜护理液的增强剂的应用，其特征在于，
所述PslG蛋白具有增强所述隐形眼镜护理液抑制细菌吸附和生物被膜形成的能力以及增强所述隐形眼镜护理液瓦解已形成的生物被膜的能力和杀菌效果，其中，所述隐形眼镜护理液为博士伦隐形眼镜多功能护理液，其配方为透明质酸钠、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、硼酸、硼酸钠、依地酸二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、纯水以及聚胺丙基双胍和聚季铵盐-1；或海昌护理液，其有效成分为：聚六亚甲基双胍、乙二胺四乙酸二钠、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述PslG蛋白为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PslG蛋白可在所述博士伦隐形眼镜多功能护理液中至少保存12周并保持清除生物被膜的功能。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述隐形眼镜护理液用于硬性隐形眼镜和/或软性隐形眼镜。
5.一种隐形眼镜护理液，其特征在于，包括：
PslG蛋白，所述PslG蛋白在所述隐形眼镜护理液中的终浓度等于50nM；
所述隐形眼镜护理液为博士伦隐形眼镜多功能护理液，其配方为透明质酸钠、硫代甜菜碱、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、硼酸、硼酸钠、依地酸二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、纯水以及聚胺丙基双胍和聚季铵盐-1；或海昌护理液，其有效成分为：聚六亚甲基双胍、乙二胺四乙酸二钠、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮。
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