JP6093302B2 - 免疫原性組成物 - Google Patents

Description

この出願は、２０１０年９月１６日に出願された米国仮出願第６１／３８３，６６８号；および２０１１年１月３１日に出願された英国特許出願第１１０１６６５．６号（これらの両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

技術分野
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖とキャリアタンパク質のコンジュゲートを含む免疫原性組成物の分野にある。この組成物は、免疫するのに有用である。

細菌の莢膜糖は、長年にわたり莢膜形成菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンに用いられている。糖はＴ非依存性抗原であるが、その免疫原性は低い。キャリアとコンジュゲートすることにより、Ｔ非依存性抗原をＴ依存性抗原に転換し、それにより、記憶応答を増強し、防御免疫の発生を可能にすることができる。したがって、最も有効な糖ワクチンは複合糖質に基づき、コンジュゲートワクチンの原型はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものである［例えば、非特許文献１（参考文献８４）の第１４章を参照されたい］。

ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００４） ＩＳＢＮ ０−７２１６−９６８８−０

コンジュゲートワクチンについて記載されている別の細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは「Ｂ群連鎖球菌」または単に「ＧＢＳ」としても公知である。この研究の大半は、Ｄｅｎｎｉｓ Ｋａｓｐｅｒおよび共同研究者によって実施され、参考文献１〜９などの文書に記載されている。ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶのそれぞれに対するコンジュゲートワクチンは、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが示されている［１０］。しかし、別の改善されたＧＢＳコンジュゲートワクチンが依然として必要である。

第１の態様では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩまたはＶ由来の莢膜糖である１または複数のコンジュゲートを用いる。特に、本発明は、これらのコンジュゲートのうちの１または複数を含む免疫原性組成物を提供する。この組成物は、これらのＧＢＳ血清型（複数可）による感染を予防するためのワクチンとして用いることができる。

第２の態様では、本発明は、ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｓｅｄ）患者に、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。典型的には、コンジュゲートは、本発明の第１の態様の免疫原性組成物中のＧＢＳコンジュゲートのうちの１種である。

免疫原性組成物
一実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。第２の実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。第３の実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。第４の実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。

免疫原性組成物は、１より多いコンジュゲートを含んでよい。２種、３種または４種のコンジュゲートを含む本発明の実施形態が下に記載されている。これらの組成物に関して、本発明者らは、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む組成物により、ＧＢＳ血清型Ｉｂに加えて、ＧＢＳ血清型Ｉａに対する防御を付与することができることを見出した。この知見は、Ｉｂ型コンジュゲートではＩａ型細菌を死滅させることができる抗体を誘導することができないことを示唆している参考文献１１の教示とは対照的である。したがって、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む下記の実施形態は、それにより、血清型Ｉａに対する防御が増強され（組成物がキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートも含む場合）、また、組成物がキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含まない場合でさえも防御がもたらされ得るという点で有利であり得る。

上記の通り、免疫原性組成物は、２種のコンジュゲートを含んでよい。一実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖である。第２の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である。第３の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。第４の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である。第５の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。第６の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。

同様に、免疫原性組成物は、３種のコンジュゲートを含んでよい。一実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第３のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である。本発明者らは、そのような組成物（例えば、下に例示されている）が、ＧＢＳによる感染を予防するためのワクチンとして用いるために特に適していることを見出した。したがって、この実施形態は本発明の好ましい実施形態である。第２の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第３のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。第３の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であり、第３のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。第４の実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であり、第３のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。

同様に、免疫原性組成物は、４種のコンジュゲートを含んでよい。一実施形態では、第１のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であり、第２のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であり、第３のコンジュゲートは、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であり、第４のコンジュゲートはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖である。

典型的には、上記の免疫原性組成物は、具体的に記載されているもの以外の任意のコンジュゲート、特に、具体的に記載されているもの以外のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートは含まない。しかし、いくつかの実施形態では、組成物は、他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートを含めた他のコンジュゲートを含んでよい。例えば、組成物は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含んでよい。同様に、組成物は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＶＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含んでよい。別の可能性では、組成物は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＶＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含んでよい。

上記の免疫原性組成物は、単位用量あたり任意の適切な量の莢膜糖（複数可）を含んでよい。莢膜糖（複数可）の適量は、単位用量あたり０．１μｇ〜５０μｇであり得る。典型的には、各ＧＢＳ莢膜糖は、１μｇ〜３０μｇ、例えば、２μｇ〜２５μｇ、特に、５μｇ〜２０μｇの量で存在する。莢膜糖（複数可）の適量としては、単位用量あたり５μｇ、１０μｇおよび２０μｇを挙げることができる。本発明者らは、これらの量が、特に、免疫原性組成物がＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖を含む場合に適することを見出した。したがって、上記の実施形態における各莢膜糖の単位用量あたりの適量は、以下の表中の番号を付した選択肢から選択することができ、組成物中の莢膜糖（複数可）が由来する血清型（複数可）を参照することにより関連する実施形態が示されている：

表Ｃに記載の投薬の選択肢に関して、本発明者らは、選択肢１、１４および２７が、特に、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合に有効であることを見出した。したがって、これらの投薬の選択肢は、本発明において用いるため、特に、この実施形態のために好ましい。潜在的な毒性を低下させるために、単位用量あたりの莢膜糖（複数可）の総量を最小限にすることが有利であり得る。したがって、投薬の選択肢１が特に好ましい。

単位用量あたりの莢膜糖（複数可）の量をさらに少なくすることが可能であり得る。特に、莢膜糖（複数可）の適量は、単位用量あたり０．１μｇ〜５μｇであり得る。したがって、典型的には、各ＧＢＳ莢膜糖は、単位用量あたり０．１μｇ〜５μｇ、例えば、０．５μｇ、２．５μｇまたは５μｇの量で存在してよい。例えば、各ＧＢＳ莢膜糖は、単位用量あたり０．５μｇ〜５μｇ、１μｇ〜４μｇ、２μｇ〜３μｇ、または約２．５μｇの量で存在してよい。本発明者らは、これらの量が、特に、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合に適切であると想定する。したがって、この実施形態における各莢膜糖の単位用量あたりの適量は、下記の表中の番号を付した選択肢から選択することができる：

表Ｃ’に記載の投薬の選択肢に関して、本発明者らは、特に、選択肢１、１４および２７を想定する。これらの選択肢では、各ＧＢＳ莢膜糖の量は同じである（例えば、下に例示されている高用量の組成物の場合と同様に）。

免疫原性組成物が１より多いコンジュゲートを含む上記の実施形態では、所与の莢膜糖の質量と他の莢膜糖（複数可）の質量の比率は変動してよい。したがって、上記の実施形態における各莢膜糖についての適切な比率（ｗ／ｗ）は、以下の表中の番号を付した選択肢から選択することができ、組成物中の莢膜糖（複数可）が由来する血清型（複数可）を参照することにより関連する実施形態が示される：

表Ｆに記載の比率の選択肢に関して、本発明者らは、選択肢１が、特に、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合に有効であることを見出した。したがって、この比率の選択肢は、本発明において用いるため、特に、この実施形態のために好ましい。

上記の通り、本発明は、一部において、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。本発明者らは、これらの組成物中のＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する免疫応答が、免疫原性組成物が１または複数の別の抗原を含む場合に減弱し得ることを見出した。理論に束縛されることを望むものではないが、別の抗原（複数可）が存在することにより「免疫干渉」が生じ、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する応答が減弱すると考えられる。

本発明者らは、これらの免疫原性組成物中のＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する応答が、組成物がアジュバントを含む場合に改善され得ることを見出した。この知見は、アジュバントではＧＢＳコンジュゲートに対する免疫応答を改善することができないことを示唆している参考文献１２の教示とは対照的である。したがって、別の実施形態では、本発明は、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖を含まない１または複数の抗原と、ｃ）アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。成分ｂ）の抗原（複数可）は、他のＧＢＳ血清型（複数可）由来の莢膜糖（複数可）を含むコンジュゲート（複数可）であってよい。例えば、これらのコンジュゲート（複数可）は、キャリアタンパク質（複数可）にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ（複数可）由来の莢膜糖（複数可）であってよい。したがって、本発明のこの実施形態は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含み、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖である１または複数のコンジュゲートをさらに含み、アジュバントをさらに含む本明細書に記載の任意の免疫原性組成物を包含する。あるいは、成分ｂ）の抗原（複数可）は、他の種類（複数可）の抗原、例えば、下で「コンジュゲートと他の抗原の組み合わせ」および「ＧＢＳタンパク質抗原」という表題の下で記載されている抗原であってよい。したがって、本発明のこの実施形態は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲート、および他のＧＢＳ血清型（複数可）由来の莢膜糖（複数可）を含むコンジュゲートを含まない１または複数の抗原を含み、アジュバントをさらに含む本明細書に記載の任意の免疫原性組成物も包含する。本発明者らは、下記の通り、本発明のこの実施形態におけるアジュバントは、例えばアルミニウム塩であってよいことを見出した。当業者は、これらの組成物において用いることができる他のアジュバントを同定することができるであろう。

本発明者らは、この莢膜糖の用量を増加させると、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する応答を改善することができることも見出した。特に、免疫原性組成物が、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＶ型以外のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含む場合には、Ｖ型の莢膜糖の用量が他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖の用量よりも多いと、Ｖ型の莢膜糖に対する応答を改善することができる。したがって、別の実施形態では、本発明は、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）それぞれがキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＶ型以外のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖である１または複数のコンジュゲートとを含み、Ｖ型の莢膜糖の用量が他のＧＢＳ血清型（複数可）由来の莢膜糖（複数可）の総用量（複数可）よりも多い、または他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖の用量の少なくとも１つの用量、もしくは平均用量よりも多い免疫原性組成物を提供する。Ｖ型の莢膜糖の用量は、１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍多くてよい。成分ｂ）が１より多いコンジュゲートを含む場合、Ｖ型の莢膜糖の用量は他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖の平均用量よりも多いことが典型的である。成分ｂ）のコンジュゲート（複数可）は、Ｖ型以外の任意のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートであってよい。例えば、これらのコンジュゲート（複数可）は、キャリアタンパク質（複数可）にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ（複数可）由来の莢膜糖（複数可）であってよい。したがって、本発明のこの実施形態は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを含み、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖である１または複数のコンジュゲートをさらに含み、Ｖ型の莢膜糖の用量が他のＧＢＳ血清型（複数可）由来の莢膜糖（複数可）の総用量（複数可）よりも多い、または他のＧＢＳ血清型由来の莢膜糖の用量の少なくとも１つの用量、もしくは平均用量よりも多い、本明細書に記載の任意の免疫原性組成物を包含する。本発明者らは、これらの組成物中の他のＧＢＳ血清型（複数可）由来の莢膜糖に対する免疫応答が、Ｖ型の莢膜糖の用量の方が多いことにより減弱し得ることも見出した。この結果は、上記の通り、組成物がアジュバントを含む場合に軽減され得る。さらに、この知見は、アジュバントではＧＢＳコンジュゲートに対する免疫応答を改善することができないことを示唆している参考文献１２の教示とは対照的である。

本発明の免疫原性組成物を投与する方法を以下に論じる。簡単に述べると、本発明の免疫原性組成物は、単回用量または複数回用量で投与することができる。本発明者らは、特に、免疫原性組成物がＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖を含む場合、より詳細には、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合には、本発明の免疫原性組成物を単回用量で投与することが有効であることを見出した。したがって、単回用量で投与することは本発明において、特に、これらの実施形態に好ましい。

あるいは、１つの単位用量の後に第２の単位用量を続けることが有効であり得る。典型的には、第２（または第３、第４、第５など）の単位用量は第１の単位用量と同一である。第２の単位用量は、第１の単位用量の後の任意の適切な時間、特に、１カ月後、２カ月後または３カ月後に投与することができる。例えば、免疫原性組成物が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖を含む場合には、第１の単位用量の３カ月後に第２の単位用量を投与することができる。別の例では、免疫原性組成物が、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖を含む場合には、第１の単位用量の１カ月後に第２の単位用量を投与することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、例えば、下記の通り、大腿または上腕への筋肉内投与により、筋肉内に投与される。

下記の通り、本発明の免疫原性組成物は、１または複数のアジュバントを含んでよい。しかし、本発明者らは、特に、免疫原性組成物が、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂおよび／またはＩＩＩ由来の莢膜糖を含む場合、より詳細には、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合には、アジュバントを含まない組成物を用いることが有効であることを見出した。潜在的な毒性を低下させるために、アジュバントを除くことが有利であり得る。したがって、本発明において用いるため、特に、これらの実施形態には、いかなるアジュバントも含有しない（特に、いかなるアルミニウム塩アジュバントも含有しない）免疫原性組成物が好ましい。

莢膜糖
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖に基づく。莢膜糖は、ＧＢＳのペプチドグリカン骨格と共有結合で連結し、また、ペプチドグリカン骨格に結合した別の糖であるＢ群抗原とは異なる。

ＧＢＳ莢膜糖は化学的に関連するが、抗原性が全く異なる。すべてのＧＢＳ莢膜糖が以下の三糖コアを共有する：
β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ（１→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃｐ
種々のＧＢＳ血清型は、このコアの修飾のされ方が異なる。血清型ＩａとＩＩＩの差異は、例えば、このコアにおいて、連続した三糖コアを連結するためにＧｌｃＮＡｃ（Ｉａ）またはＧａｌ（ＩＩＩ）のいずれかが使用されることから生じる（図１）。血清型ＩａおよびＩｂはどちらも、コア内のＧｌｃＮＡｃに連結した［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］二糖を有するが、連結は１→４（Ｉａ）または１→３（Ｉｂ）のいずれかである。

ＧＢＳ関連疾患は、主に血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩから生じ、その８５％超が５種の血清型：Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶによって引き起こされる。本発明は、これらの４種の血清型のうちの１または複数由来の糖、特に、血清型：Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩのうちの１または複数由来の糖を用いることが好ましい。図２に示されている通り、これらの４種の血清型のそれぞれの莢膜糖は、（ａ）すべての場合においてガラクトース残基に２→３で連結している末端のＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）残基（一般にシアル酸と呼ばれる）と、（ｂ）三糖コア内部のＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）とを含む。

４種の糖のすべてが三糖コア内部のガラクトース残基を含むが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩは、各繰り返し単位内に追加的なガラクトース残基も含有する。

本発明に従って使用される糖は、それらの天然の形態であってよく、または修飾されていてよい。例えば、糖は、天然の莢膜糖よりも短くてよく、または化学的に修飾されていてよい。特に、本発明において使用される血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献１３および１４に記載の通り修飾されていてよい。例えば、参考文献１３および１４に記載の通り実質的に脱シアル化された血清型Ｖの莢膜糖（図３）が、本発明において用いるために具体的に想定される。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖は、参考文献１３に記載の通り、精製されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖を弱酸性条件下で（例えば、０．１Ｍの硫酸、８０℃で６０分間）処理することによって、またはノイラミニダーゼで処理することによって調製することができる。脱シアル化されたＧＢＳ血清型Ｖの莢膜糖を調製するための好ましい方法は、精製された糖を１Ｍの酢酸を用いて、８１℃＋／−３℃で２時間処理することによる。したがって、本発明に従って使用される糖は、天然に見出されるような実質的に全長の莢膜多糖であってよく、または、天然の長さよりも短くてよい。全長の多糖は、本発明で用いるために、例えば、弱酸中での加水分解によって、加熱によって、サイズ選別クロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などによって解重合させて、より短い断片を得ることができる。鎖長は、ウサギにおいてＧＢＳ糖の免疫原性に影響を及ぼすことが報告されている［４］。特に、本発明において使用される血清型ＩＩおよび／またはＩＩＩの莢膜糖は、参考文献１５および１６に記載の通り解重合させることができる。これらの文書には、ＩＩ型およびＩＩＩ型の莢膜糖を、穏やかな脱アミノ切断により部分的に解重合させて、末端の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基が還元された抗原断片にすることが記載されている。簡単に述べると、莢膜糖を０．５ＮのＮａＯＨに溶解させ、７０℃で約１〜４時間加熱する。このインキュベーションの長さによって解重合の程度を制御し、これは、標準の方法によって（例えば、参考文献１５に記載のＨＰＬＣによって）決定することができる。試料を氷水浴内で冷却した後、氷酢酸を加えてｐＨ４にする。次いで、部分的にＮ−脱アシル化された生成物を、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮＯ_２を４℃で２時間にわたって撹拌しながら加えることによって脱アミノ化する。新たに形成された２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基の遊離のアルデヒドは、下記の通り、キャリアタンパク質とコンジュゲートするために用いることができる。

破傷風トキソイドキャリアとコンジュゲートを形成するために、解重合した材料を用いることを含めた、エンド−β−ガラクトシダーゼによる血清型ＩＩＩの莢膜糖の解重合が報告されている［参考文献１＆４〜６］。ＧＢＳ血清型ＩＩＩおよびＶＩＩＩ由来の莢膜多糖のオゾン分解も解重合のために用いられている［１７］。ＭＷ＞３０ｋＤａの糖を用いることが好ましく、実質的に全長の莢膜多糖を用いることができる。血清型Ｉａについては、ＭＷが１５０〜３００ｋＤａ、特に、１７５〜２７５ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約２００ｋＤａまたは約２６０ｋＤａである血清型Ｉａの糖を用いる。血清型Ｉｂについては、ＭＷが１５０〜３００ｋＤａ、特に、１７５〜２５０ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約２００ｋＤａまたは約２３０ｋＤａである血清型Ｉｂの糖を用いる。血清型ＩＩＩについては、ＭＷが５０〜２００ｋＤａ、特に、８０〜１５０ｋＤａの範囲である多糖を用いることが好ましい。典型的には、ＭＷが約１００ｋＤａまたは約１４０ｋＤａである血清型ＩＩＩ糖を用いる。血清型Ｖについては、ＭＷが最大で約５０ｋＤａである多糖を用いることも好ましい。典型的には、ＭＷが約１００ｋＤａである血清型Ｖの糖を用いる。これらの分子質量は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅから入手可能なものなどのデキストラン標準物質と比較してゲル濾過によって測定することができる［１８］。

糖は、天然に見出される莢膜糖と比較して化学的に修飾することができる。例えば、糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（Ｎ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的にまたは完全に）などをされてよい。脱アセチル化は、コンジュゲートする前、その間、またはその後に起こり得るが、コンジュゲートする前に起こることが好ましい。特定の糖に応じて、脱アセチル化は免疫原性に影響を及ぼす場合と影響を及ぼさない場合がある。種々の血清型のＧＢＳ糖に対するＯ−アセチル化の関連性は参考文献１９において論じられており、いくつかの実施形態では、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化が、コンジュゲートする前、その間およびその後で、例えば、保護／脱保護によって、再アセチル化によってなどで保持される。しかし、典型的には、本発明において使用されるＧＢＳ糖は、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さない。特に、ＧＢＳ糖が、下記の通り塩基抽出によって精製された場合には、Ｏ−アセチル化は一般には失われる（参考文献１９）。脱アセチル化の作用などは、常套的なアッセイによって評価することができる。

莢膜糖は、本明細書の参考文献、例えば、参考文献２および２０などに記載の公知の技法によって精製することができる。典型的なプロセスは、塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびさらなる限外濾過を伴う。ＧＢＳ細胞を、細菌の細胞壁を切断して細胞壁成分を遊離させる酵素であるムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）で処理することも有用である。

代替として、参考文献２１に記載の精製プロセスを用いることができる。このプロセスは、塩基抽出、エタノール／ＣａＣｌ_２処理、ＣＴＡＢ沈殿、および再可溶化を伴う。別の代替のプロセスが参考文献２２に記載されている。

しかし、本発明は、天然の供給源から精製された糖に限定されず、糖は、全合成または部分合成などの他の方法によって得ることができる。

コンジュゲーション
本発明は、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩまたはＶ由来の莢膜糖であるコンジュゲートに関する。一般に、糖とキャリアの共有結合性コンジュゲーションにより、糖の免疫原性がＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換されるので、糖の免疫原性が増強され、したがって免疫記憶が刺激される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり［例えば、参考文献２３］、これは周知の技法である［例えば、参考文献２４〜３２に概説されている］。したがって、本発明のプロセスは、精製された糖をキャリア分子とコンジュゲートするさらなるステップを含み得る。

ＧＢＳ糖のコンジュゲーションは、広く報告されている。例えば、参考文献１〜９を参照されたい。ＧＢＳ糖をコンジュゲートするための典型的な先行技術のプロセスは、典型的には、精製された糖の、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＣＲＭ１９７などのキャリアタンパク質との還元アミノ化を伴う［２］。還元アミノ化には、キャリアのアミノ酸の側鎖上のアミン基および糖のアルデヒド基が関与する。ＧＢＳ莢膜糖はそれらの天然の形態ではアルデヒド基を含まないので、典型的には、これを生じさせた後に、糖のシアル酸残基の一部（例えば、５％から４０％間、特に、１０％から３０％間、好ましくは約２０％）を酸化することに（例えば、過ヨウ素酸酸化）よってコンジュゲートする［２、３３］。ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶのそれぞれについて、このように調製されたコンジュゲートワクチンはヒトにおいて安全かつ免疫原性であることが示されている［１０］。典型的には、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのすべてがこのように調製されたものである。しかし、本発明において脱シアル化された血清型Ｖの莢膜糖を用いる場合には、この糖にアルデヒド基を生じさせた後に、糖のガラクトース残基の一部（例えば、５％から４０％間、特に、１０％から３０％間、好ましくは約２０％）を酸化すること（例えば、過ヨウ素酸酸化）によってコンジュゲートすることができる［１４］。代替のコンジュゲーションプロセスは、参考文献３４に記載の通り、糖の−ＮＨ_２基（脱Ｎ−アセチル化によるものか、またはアミンの導入後のもの）を、二官能性リンカーと併せて用いることを伴う。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのうちの１または複数はこのように調製されたものである。別の代替のプロセスが参考文献１５および１６に記載されている。このプロセスでは、穏やかな脱アミノ切断によるＩＩ型またはＩＩＩ型の莢膜糖の解重合に由来する、末端の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基の遊離のアルデヒド基を還元アミノ化によるコンジュゲーションのために用いる。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物中のコンジュゲートのうちの１または複数はこのように調製されたものである。

本発明は、一般にはタンパク質であるキャリア分子の使用に関する。有用なキャリアタンパク質としては、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの、細菌の毒素または類毒素が挙げられる。毒素または類毒素の断片、例えば、破傷風トキソイドの断片Ｃも用いることができる［３５］。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体［３６〜３８］は、本発明に対して特に有用である。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［３９］、合成ペプチド［４０、４１］、熱ショックタンパク質［４２、４３］、百日咳タンパク質［４４、４５］、サイトカイン［４６］、リンフォカイン［４６］、ホルモン［４６］、増殖因子［４６］、ヒト血清アルブミン（組換え型であることが好ましい）、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４７］例えば、Ｎ１９［４８］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［４９、５０］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［５１］、ニューモリシン［５２］、鉄取り込みタンパク質（ｉｒｏｎ−ｕｐｔａｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）［５３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［５４］、組換え型のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの細胞外タンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ｒＥＰＡ）［５５］、ＧＢＳタンパク質（下記特にＧＢＳ６７を参照されたい）［２０６］などが挙げられる。

キャリアへの結合は、例えば、キャリアタンパク質のリジン残基の側鎖の−ＮＨ_２基、またはアルギニン残基の側鎖の−ＮＨ_２基、またはＮ末端の−ＮＨ_２基を介することが好ましい。結合は、例えば、システイン残基の側鎖の−ＳＨ基を介してもよい。

例えば、キャリアが抑制される危険性を低下させるために、１より多いキャリアタンパク質を用いることが可能である。したがって、異なるＧＢＳ血清型に対して異なるキャリアタンパク質を用いることができ、例えば、血清型Ｉａの糖をＣＲＭ１９７とコンジュゲートすることができ、その一方で血清型Ｉｂの糖を破傷風トキソイドとコンジュゲートすることができる。特定の糖抗原に対して１より多いキャリアタンパク質を用いることも可能であり、例えば、血清型ＩＩＩの糖を２群にし、その一部をＣＲＭ１９７とコンジュゲートし、その他を破傷風トキソイドとコンジュゲートすることができる。しかし、典型的には、すべての糖に対して同じキャリアタンパク質を用いることが好ましい。

単一のキャリアタンパク質は、１より多い糖抗原を保有してよい［５６、５７］。例えば、単一のキャリアタンパク質を、血清型ＩａおよびＩｂ由来の糖とコンジュゲートすることができる。この目標を実現するために、コンジュゲーション反応の前に異なる糖を混合することができる。しかし、典型的には、各血清群に対してコンジュゲートを別々にし、コンジュゲートした後に異なる糖を混合することが好ましい。別々のコンジュゲートは、同じキャリアに基づいてよい。

典型的には、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：５（すなわちタンパク質過剰）から５：１（すなわち糖過剰）の間、特に、１：５から２：１の間の比率であるコンジュゲートを用いる。本発明においてキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを用いる場合には、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は、典型的には、約１：１から１：２の間、特に、約１：１．３である。同様に、本発明においてキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを用いる場合には、比率は、典型的には、約１：１から１：２の間、特に、約１：１．３である。本発明においてキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを用いる場合には、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は、典型的には、約３：１から１：１の間、特に、約２：１である。しかし、糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が約１：１〜１：５、特に、約１：３．３である、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩも用いることができる。最後に、本発明においてキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを用いる場合には、比率は、典型的には、約２：１から１：１の間、特に、約１．１：１である。したがって、特に、長い糖鎖では、糖の重量過剰が典型的である。

組成物は、少量の遊離のキャリアを含んでよい［５８］。所与のキャリアタンパク質が本発明の組成物中に遊離の形態にコンジュゲートさせた形態の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形態は、全体として、組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であることが好ましく、２重量％未満で存在することがより好ましい。

コンジュゲートした後、遊離の糖にコンジュゲートさせた糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含めた多くの適切な方法がある［参考文献５９＆６０なども参照されたい］。好ましい方法は参考文献６１に記載されている。

本発明の組成物が解重合したオリゴ糖を含む場合、解重合がコンジュゲーションに先行することが好ましい。

コンジュゲートと他の抗原の組み合わせ
本発明の免疫原性組成物は、１または複数の別の抗原を含んでよい。

別の抗原（複数可）は、別のＧＢＳコンジュゲートを含んでよい。異なるＧＢＳコンジュゲートは同じＧＢＳ血清型由来の異なる種類のコンジュゲートおよび／または異なるＧＢＳ血清型由来のコンジュゲートを含んでよい。組成物は、典型的には、別々のコンジュゲート（例えば、各血清型に対して異なるコンジュゲート）を調製し、次いでコンジュゲートを組み合わせることによって生成される。

別の抗原（複数可）は、下に詳述されているＧＢＳのアミノ酸配列を含んでよい。

別の抗原（複数可）は、非ＧＢＳ病原体由来の抗原を含んでよい。したがって、本発明の組成物は、追加的な細菌性抗原、ウイルス性抗原または寄生生物性抗原を含めた１または複数の非ＧＢＳ抗原をさらに含んでよい。これらは以下から選択することができる：
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原、参考文献６２〜６８中のものなど。タンパク質「２８７」（以下を参照されたい）および誘導体（例えば、「ΔＧ２８７」）が特に好ましい。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物、例えば、参考文献６９、７０、７１、７２などに開示されているものなど。
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖抗原、例えば、参考文献７３に開示されている血清群Ｃ由来のオリゴ糖または参考文献７４のオリゴ糖。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、参考文献７５〜７７；参考文献８４の第２２章および２３章］。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、不活化ウイルス［例えば、７８、７９；参考文献８４の第１５章］。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、表面抗原および／またはコア抗原など［例えば、７９、８０；参考文献８４の第１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８１］。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じてパータクチンならびに／または凝集原２および凝集原３とも組み合わせて［例えば、参考文献８２＆８３；参考文献８４の第２１章］。
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献８４の第１３章］。
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド［例えば、参考文献８４の第２７章］。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原［例えば、参考文献８４の第１４章］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、６２、６３、６４］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、９２］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、９３］。
−ポリオ抗原（複数可）［例えば、９４、９５；参考文献８４の第２４章］、例えば、ＩＰＶ。
−狂犬病抗原（複数可）［例えば、９６］、例えば、凍結乾燥不活化ウイルス［例えば９７、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］。
−麻疹抗原、流行性耳下腺炎抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献８４の第１９章、２０章および２６章］。
−インフルエンザ抗原（複数可）［例えば、参考文献８４の第１７章および１８章］、例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、９８］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、９９、１００、１０１］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、１０２］。

糖抗原または炭水化物抗原を用いる場合、免疫原性を増強するために、その抗原をキャリアとコンジュゲートすることが好ましい。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌の糖抗原のコンジュゲーションが周知である。

毒性のタンパク質抗原は、必要な場合、解毒することができる（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒［８３］）。

組成物にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。

抗原をアルミニウム塩に吸着させることができる。組成物中に１より多いコンジュゲートが存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。

ある種類の好ましい組成物は、ヘルペスウイルス、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓなどの性感染病原体由来の別の抗原を含む。別の種類の好ましい組成物は、高齢者および／または免疫無防備状態に影響を及ぼす別の抗原を含み、したがって、本発明のＧＢＳ抗原を、以下の非ＧＢＳ病原体由来の１または複数の抗原と組み合わせることができる：インフルエンザウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、およびパラインフルエンザウイルス。

組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を惹起するために十分なものである。

本発明の組成物にタンパク質抗原を用いる代替として、抗原をコードする核酸を用いることができる［例えば、参考文献１０３〜１１１］。したがって、本発明の組成物のタンパク質成分を、そのタンパク質をコードする核酸（例えば、プラスミドの形態のＤＮＡであることが好ましい）で置き換えることができる。

実際面で、本発明の組成物に含める抗原の数には上限がある場合がある。本発明の組成物中の抗原（ＧＢＳ抗原を含む）の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、または２未満であってよい。本発明の組成物中のＧＢＳ抗原の数は、６未満、５未満、４未満、３未満、または２未満であってよい。

薬学的方法および使用
本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容されるキャリアをさらに含んでよい。典型的な「薬学的に許容されるキャリア」としては、それ自体は、組成物を受け取る個体に対して有害な、抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的には、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、スクロース［１１２］、トレハロース［１１３］、ラクトース、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）である。そのようなキャリアは当業者に周知である。ワクチンは、例えば、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有してよい。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在してよい。滅菌された、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水が典型的なキャリアである。薬学的に許容される賦形剤の詳細な論述は、参考文献１１４において入手可能である。

本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液または懸濁液）または乾燥した形態（例えば、凍結乾燥したもの）であってよい。乾燥ワクチンを用いる場合には、注射する前に液体媒体中に再構成する。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）製品が凍結乾燥した形態で存在している。本発明の免疫原性組成物が１より多いＧＢＳ血清型由来の莢膜糖を含むコンジュゲートを含む場合、コンジュゲートを別々に調製し、混合し、次いで凍結乾燥することが典型的である。このように、本明細書に記載のコンジュゲートを２種、３種または４種などを含む凍結乾燥した組成物を調製することができる。凍結乾燥の間、コンジュゲートを安定化するために、糖アルコール（例えば、マンニトール）および／または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を、例えば、１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約２５ｍｇ／ｍｌ）で組成物に含めることが好ましい場合がある。スクロースの使用は、ＧＢＳコンジュゲートワクチンの安定剤として推奨されている（参考文献１１５）。しかし、本発明の安定剤はマンニトールであることが典型的である。乾燥ワクチンを、注射する前に液体媒体中に再構成する場合、残留するマンニトールの濃度は、典型的には、約２〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、３．７５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌまたは１５ｍｇ／ｍｌになる。マンニトールの使用は、マンニトールがＧＢＳ莢膜糖の単糖サブユニットとは化学的に別個であるので有利である。これは、例えば品質管理分析のための莢膜糖の検出は、マンニトールに干渉されない上記糖のサブユニットの存在に基づいてよいことを意味する。対照的に、スクロースのような安定剤は、グルコースを含有し、これは上記糖におけるグルコースサブユニットの検出に干渉し得る。

組成物はバイアル中に存在してよく、または組成物は充填済み注射器中に存在してよい。注射器は、針を伴って、または伴わずに供給することができる。注射器は、組成物の単回用量を含み、一方バイアルは、単回用量または複数回用量を含むことができる。

本発明の水性組成物は、他のワクチンを凍結乾燥した形態から再構成するためにも適している。本発明の組成物がそのような即時の再構成のために用いるものである場合、本発明は、バイアル２つを含み得るキット、または、充填済み注射器１つとバイアル１つを含み、注射する前に注射器の内容物を用いてバイアルの内容物を再活性化することができるキットを提供する。

本発明の組成物は、単位用量形態または複数回用量形態に包装することができる。複数回用量形態には充填済み注射器よりもバイアルの方が好ましい。有効な投与体積は常套的に確立することができるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射するためには、体積０．５ｍｌである。

組成物のｐＨは、６から８の間であることが好ましく、約７であることが好ましい。安定なｐＨは、緩衝液を用いることによって維持することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物はリン酸二水素カリウム緩衝液を含む。リン酸二水素カリウム緩衝液は、約１〜１０ｍＭ、例えば、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭまたは５．０ｍＭのリン酸二水素カリウムを含んでよい。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を用いることが好ましい［１１６］。組成物は、滅菌され得、かつ／または発熱物質が不含であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。

本発明の組成物は免疫原性であり、ワクチン組成物であることがより好ましい。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するためのもの）または治療的（すなわち、感染を処置するためのもの）のいずれかであり得るが、典型的には、予防的である。ワクチンとして用いる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）、ならびに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、その量を個体に単回用量またはシリーズの一部として投与することが、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、処置される個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置にあたる医師による医学的な状況に関する評価、および他の関連因子に応じて変動する。常套的な試行によって決定することができる量は比較的広範囲に入ることが予想される。

各用量の中で、個々の糖抗原の量は、一般に、０．１μｇから５０μｇの間（糖の質量として測定する）、特に、１μｇから５０μｇの間または０．５μｇから２５μｇの間、より詳細には、２．５〜７．５μｇ、例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇまたは約２５μｇになる。各用量の中で、ＧＢＳ莢膜糖の総量は、一般に≦７０μｇ（糖の質量として測定する）、例えば、≦６０μｇである。特に、総量は、≦４０μｇ（例えば、≦３０μｇ）または≦２０μｇ（例えば、≦１５μｇ）であってよい。本発明者らは、これらの総量が、特に、免疫原性組成物が、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む場合に有効であることを見出した。したがって、これらの総量は、本発明において用いるため、特に、この実施形態のために好ましい。潜在的な毒性を低下させるために、単位用量あたりの莢膜糖（複数可）の総量を最小限にすることが有利であり得る。したがって、総量は≦２０μｇ、例えば、≦１５μｇ、≦７．５μｇまたは≦１．５μｇであることが好ましい。

ＧＢＳは、体の種々の領域に影響を及ぼし、したがって、本発明の組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、注射剤として、液剤または懸濁剤のいずれかとして調製することができる。組成物は、肺への投与のために、例えば、細粉または噴霧剤を用いて吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）として調製することができる。組成物は、坐薬または膣坐薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳または眼に投与するために、例えば、噴霧剤、点滴薬、ゲル剤または散剤として調製することができる［例えば、参考文献１１７＆１１８］。肺炎球菌の糖［１１９、１２０］、Ｈｉｂの糖［１２１］、ＭｅｎＣの糖［１２２］、およびＨｉｂ糖とＭｅｎＣ糖のコンジュゲートの混合物［１２３］の経鼻投与での成功が報告されている。

本発明の組成物は、特に、複数回用量形式で包装する場合には、抗菌薬を含んでよい。

本発明の組成物は、洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでよい。洗浄剤は、一般に、低レベルで、例えば、＜０．０１％で存在する。

本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでよい。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度が典型的である。いくつかの実施形態では、４〜１０ｍｇ／ｍｌ、例えば、９．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、６．７５ｍｇ／ｍｌまたは４．５ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度を用いることができる。

本発明の組成物は、一般に、バッファを含む。リン酸バッファが典型的である。

本発明の組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。特に、組成物は、１または複数のアジュバントを含んでよい。そのようなアジュバントとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：
Ａ．無機物を含有する組成物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、無機物を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献１２４に開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取る。これらの塩への吸着が好ましい。無機物を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる［１２５］。

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを用いることができる。これらの名称は慣習的であるが、どちらも、存在する実際の化合物についての正確な記載ではないので、利便性のためだけに使用される（例えば、参考文献１２６の第９章を参照されたい）。本発明では、アジュバントとして一般に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「ホスフェート」アジュバントを用いることができる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含有する（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。

繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわち、アジュバント自体は生理的なｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムアジュバントは、一般に、０．３から１．２の間、好ましくは０．８から１．２の間、より好ましくは０．９５±０．１のＰＯ_４／Ａｌモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）を有する。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真で観察されるような板状の形態）である。粒子の典型的な直径は、任意の抗原が吸着した後に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり０．７から１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファのようなバッファを加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、通常、４．０から７．０の間、より好ましくは５．０から６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するために用いるアルミニウム塩の懸濁液は、バッファ（例えば、リン酸バッファまたはヒスチジンバッファまたはトリスバッファ）を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁液は、滅菌されており、発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁液は、例えば、１．０ｍＭから２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭの間、およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性ホスフェートイオンを含んでよい。懸濁液は、塩化ナトリウムも含んでよい。

本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることができる。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化物よりも多く、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在してよい。

患者に投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

典型的なアジュバントであるリン酸アルミニウムアジュバントは、０．８４から０．９２の間のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質のアルミニウムヒドロキシホスフェートであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。低用量のリン酸アルミニウム、例えば、用量あたりコンジュゲートあたり５０μｇから１００μｇの間のＡｌ^３＋を用いた吸着を用いることができる。

Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した油エマルジョン組成物としては、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）などのスクアレン−水エマルジョンが挙げられる［参考文献１２６の第１０章； 参考文献１２７〜１２９も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして使用される。

組成物において用いるために特に好ましいアジュバントはサブミクロンの水中油エマルジョンである。本明細書で用いるための好ましいサブミクロンの水中油エマルジョンは、必要に応じて様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン、例えば、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、および、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロンの水中油エマルジョンである。組成物において用いるためのサブミクロンの水中油エマルジョン、それを作製する方法、およびムラミルペプチドなどの免疫賦活剤は、参考文献１２７＆１３０〜１３１に詳しく記載されている。

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。

Ｃ．サポニン処方物［参考文献１２６の第２２章］
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見出されるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）から、商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製された処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の生成方法は参考文献１３２に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい［１３３］。

サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる［参考文献１２６の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンも含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに用いることができる。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１または複数を含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは、参考文献１３３〜１３５にさらに記載されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加的な洗浄剤（複数可）を欠いてよい［１３６］。

サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説は、参考文献１３７＆１３８に見出すことができる。

Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、必要に応じてリン脂質と組み合わされ、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができ、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１３９〜１４４においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば、参考文献１４５においてさらに論じられている。

Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性の誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を含む。

ＬＰＳの無毒性の誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの「小粒子」形態は、参考文献１４６に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過するのに十分小さい［１４６］。他の無毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣体、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［１４７、１４８］。

リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献１４９＆１５０に記載されている。

本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。

ＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾を含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献１５１、１５２および１５３には、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置き換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１５４〜１５９においてさらに論じられている。

ＣｐＧ配列、例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフは、ＴＬＲ９に向けられ得る［１６０］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどの、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよく、または、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１６１〜１６３において論じられている。ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために５’末端を利用できるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献１６０＆１６４〜１６６を参照されたい。

細菌性のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来することが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献１６７に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は参考文献１６８に記載されている。毒素または類毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく、Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２であることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献１６９〜１７６に見出すことができる。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる参考文献１７７に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。

Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１７８］など）［１７９］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。

Ｇ．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア［１８０］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体が挙げられる。キトサンおよびそれらの誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる［１８１］。

Ｈ．微小粒子
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて、生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、それを、負に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン洗浄剤を用いて）。

Ｉ．リポソーム（参考文献１２６の第１３章＆第１４章）
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、参考文献１８２〜１８４に記載されている。

Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１８５］を含む。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１８６］ならびに少なくとも１つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１８７］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１８８および１８９に記載されている。

Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

Ｍ．イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物「レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）３Ｍ」）が挙げられ、参考文献１９０および１９１にさらに記載されている。

Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
すべてが本発明においてアジュバントとして用いるのに適したチオセミカルバゾン化合物、ならびに化合物を処方、製造、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１９２に記載のものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核細胞を、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン産生について刺激することにおいて特に有効である。

Ｏ．トリプタントリン化合物
すべてが本発明においてアジュバントとして用いるのに適したトリプタントリン化合物、ならびに化合物を処方、製造、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１９３に記載のものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、ヒト末梢血単核細胞を、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン産生について刺激することにおいて特に有効である。

本発明は、上記で同定したアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下の組み合わせを本発明においてアジュバント組成物として用いることができる：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン［１９４］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１９５］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋ ３ｄＭＰＬ ＋ ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［１９６］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ［１９７］；（６）サブミクロンのエマルジョンに微小流動化した、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせたかのいずれかの、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ。（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１または複数の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。

免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、参考文献１２６の第７章に開示されている。

アルミニウム塩アジュバントの使用が特に好ましく、一般に、抗原はそのような塩に吸着される。本発明の組成物では、いくつかの抗原は水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原はリン酸アルミニウムと会合させることが可能である。しかし、一般には、単一の塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩を用いるがその両方は用いないことが好ましい。すべてのコンジュゲートが吸着する必要はない、すなわち、一部またはすべてが溶液中で遊離していてよい。

処置方法
本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法であって、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含む方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体を伴うことが好ましい。この方法により、追加免疫応答を生じさせることができる。

哺乳動物はヒトであることが好ましい。ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは、子（例えば、幼児または乳児）またはティーンエイジャーであることが好ましく、ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、ヒトは、成人であることが好ましい。例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために小児用ワクチンを成人に投与することもできる。処置するために好ましいヒトのクラスは、妊娠可能な年齢の女性（例えば、ティーンエイジャー以上）である。別の好ましいクラスは妊婦である。高齢の患者（例えば、５０歳超、６０歳超、７０歳超、８０歳超または９０歳超など、特に、６５歳超の高齢の患者）、特に、ＧＢＳ感染の危険性が増す可能性があるナーシングホームで生活している高齢の患者（［１９８］）は、処置するために好ましい別のヒトのクラスである。いくつかの実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前にＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。他の実施形態では、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する。特に、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有する可能性がある。その代わりに、またはそれに加えて、ヒトは、薬学的組成物を投与する前に、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を検出不可能なレベルで有し得る。莢膜糖（複数可）に対する抗体のレベル（複数可）は、下のヒト試験（１）において記載されているＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。抗体のレベル（複数可）は、投与する１カ月前、特に、投与する１カ月前以内（例えば、２週間以内、１週間以内または投与当日）のレベルと同様であってよい。これらの検出不可能なレベル（複数可）の莢膜糖（複数可）に対する抗体を有する女性の新生児のＧＢＳ感染率はより高い可能性がある。これは、この母系のＧＢＳ莢膜糖に対する抗体のレベルが高いことが、新生児における疾患リスクの低下と相関するからである［参考文献１９９および２００］。したがって、これらの女性への投与が本発明において具体的に想定される。

いくつかの実施形態では、患者は、例えば、予備免疫した患者のセクションで本発明の第２の態様に関して下に記載されている通り、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫されている。これらの実施形態では、免疫原性組成物中の少なくとも１つのコンジュゲートは、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であることが好ましい。本発明者らは、患者がジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫されている場合、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体上に糖が提示されることによって莢膜糖に対する免疫応答が改善され得ることを見出した。組成物中の、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせた莢膜糖は、例えば、ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来であってよい。特に、莢膜糖は、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来であってよい（下に例示されている通り）。これらの実施形態では、組成物中のＧＢＳ由来の莢膜糖のすべてがジフテリアトキソイドまたはその誘導体とコンジュゲートしていることが典型的である。キャリアまたは予備免疫抗原がジフテリアトキソイドの誘導体である場合には、その誘導体は、Ｄｔと免疫学的に交差反応性のままであることが好ましく、ＣＲＭ１９７であることが好ましい。

他の実施形態では、患者は、例えば、予備免疫した患者および破傷風トキソイドキャリアのセクションで本発明の第２の態様に関して下に記載されている通り、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫されている。これらの実施形態では、免疫原性組成物中の少なくとも１つのコンジュゲートは、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であることが好ましい。莢膜糖に対する免疫応答は、患者が、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫されている場合、破傷風トキソイドまたはその誘導体上に糖が提示されることによって改善され得る。組成物中の、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせた莢膜糖は、例えば、ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来であってよい。特に、莢膜糖は、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来であってよい。これらの実施形態では、組成物中のＧＢＳ由来の莢膜糖のすべてが破傷風トキソイドまたはその誘導体とコンジュゲートしていることが典型的である。

本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。

本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。

これらの使用および方法は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患、例えば、新生児敗血症または菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎、化膿性関節炎などを予防および／または処置するためのものであることが好ましい。

疾患を予防する被験体は、本発明のコンジュゲートを受ける被験体と同じでなくてよい。例えば、子を保護するために、女性（妊娠前または妊娠中の）にコンジュゲートを投与することができる（いわゆる「母体免疫」［２０１〜２０３］）。

治療的処置の効力を調査する１つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、ＧＢＳ感染をモニターすることを包含する。予防的処置の効力を調査する１つの方式は、組成物を投与した後に、ＧＢＳ抗原に対する免疫応答をモニターすることを包含する。

本発明の好ましい組成物は、各抗原性成分に対する抗体保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準よりも優れている抗体価を、ヒト被験体の許容できる百分率でヒトに付与することができる。関連する抗体価が、宿主が抗原に対して抗体陽転すると考えられる抗体価を超える抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの組織により公開されている。被験体の統計的に有意な試料の８０％超、より好ましくは９０％超、さらに好ましくは９３％超、最も好ましくは９６〜１００％が抗体陽転することが好ましい。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接的な送達は、非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔へ）、または直腸投与、経口投与、膣への投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺への投与は他の粘膜投与によって実現することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介してよいが、その代わりに無針注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。

本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってよい。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで用いることができる。一次用量スケジュールの後に、追加免疫用量スケジュールを続けることができる。初回刺激用量の間（例えば、４〜１６週の間）、および初回刺激と追加免疫との間の適切なタイミングは、常套的に決定することができる。

ＧＢＳタンパク質抗原
上記の通り、ＧＢＳタンパク質を本発明の組成物に含めることができる。ＧＢＳタンパク質は、本発明のコンジュゲートのためのキャリアタンパク質、他のコンジュゲートのためのキャリアタンパク質、またはコンジュゲートしていないタンパク質抗原として用いることができる。

本発明で用いるためのＧＢＳタンパク質抗原としては、参考文献９９および２０４〜２０６に開示されているものが挙げられる。本発明で用いるための２種の好ましいＧＢＳタンパク質抗原はＧＢＳ６７およびＧＢＳ８０として公知である［参考文献９９を参照されたい］。本発明で用いるためのさらに好ましいＧＢＳタンパク質抗原は、Ｓｐｂ１として公知である［参考文献２０７を参照されたい］。これらの３つの抗原のさらなる詳細は下に示されている。

これらの３種のＧＢＳタンパク質の全長配列は、本明細書の配列番号１〜３である。したがって、本発明の組成物は、（ａ）配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１〜３のうちの１または複数に対する配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１〜３の断片を含むポリペプチドを含んでよい。

本発明の組成物は、これらのＧＢＳタンパク質抗原の混合物も含んでよい。

特に、本発明の組成物は、
（ａ_１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_１）（ｉ）配列番号１に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１の断片を含むポリペプチドと、
（ａ_２）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_２）（ｉ）配列番号２に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号２の断片を含むポリペプチドと
を含んでよい。

同様に、本発明の組成物は、
（ａ_１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_１）（ｉ）配列番号１に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１の断片を含むポリペプチドと、
（ａ_２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_２）（ｉ）配列番号３に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号３の断片を含むポリペプチドと
を含んでよい。

同様に、本発明の組成物は、
（ａ_１）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_１）（ｉ）配列番号２に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号２の断片を含むポリペプチドと、
（ａ_２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_２）（ｉ）配列番号３に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号３の断片を含むポリペプチドと
を含んでよい。

本発明の組成物は、
（ａ_１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_１）（ｉ）配列番号１に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１の断片を含むポリペプチドと、
（ａ_２）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_２）（ｉ）配列番号２に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号２の断片を含むポリペプチドと、
（ａ_３）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ_３）（ｉ）配列番号３に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号３の断片を含むポリペプチドと
を含んでよい。

本発明で用いるために好ましい他の３種のＧＢＳタンパク質抗原が、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ２７６、およびＧＢＳ３２２として公知である［参考文献９９を参照されたい］。血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ分離株由来の野生型ＧＢＳ１０４のアミノ酸配列が、参考文献２１において配列番号３としてその中に示されている。本明細書において、配列番号１を参照することによって本発明の実施形態が定義されている場合、配列番号１への参照は、参考文献２１の配列番号３への参照で置き換えることができる。血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ分離株由来の野生型ＧＢＳ２７６のアミノ酸配列が、参考文献２１において配列番号４としてその中に示されている。本明細書において、配列番号２を参照することによって本発明の実施形態が定義されている場合、配列番号２への参照は、参考文献２１の配列番号４への参照で置き換えることができる。血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ分離株由来の野生型ＧＢＳ３２２のアミノ酸配列が、参考文献２１において配列番号５としてその中に示されている。本明細書において、配列番号３を参照することによって本発明の実施形態が定義されている場合、配列番号３への参照は、参考文献２１の配列番号５への参照で置き換えることができる。

特定の配列番号に応じて、（ｉ）における配列同一性の程度は、５０％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）を超えることが好ましい。これらのポリペプチドは、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子バリアントおよび機能的変異体を含む。典型的には、２つのポリペプチド配列間の５０％以上の同一性が、機能的同等性の指標になると考えられる。ポリペプチド間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を用いて決定することが好ましい。

特定の配列番号に応じて、（ｉｉ）の断片は、該配列由来の少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含むべきであり、特定の配列に応じて、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である。断片は、該配列の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または、好ましくはＢ細胞エピトープを含んでよい。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは経験的に同定することができる（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［２０８、２０９］または同様の方法を用いて）、またはＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、予測することができる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標［２１０］、マトリックスベースの手法［２１１］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２１２］、ニューラルネットワーク［２１３］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２１４、２１５］、ＡＤＥＰＴ［２１６］、Ｔｓｉｔｅｓ［２１７］、親水性［２１８］、抗原性指標［２１９］または参考文献２２０に開示されている方法などを用いて）。他の好ましい断片は、配列番号１〜３の、それらのＮ末端のアミノ酸残基を有さない、またはそれらのＮ末端のシグナルペプチドを有さない断片である。リーダー配列領域もしくはシグナル配列領域、膜貫通領域、細胞質領域または細胞壁アンカリングモチーフなどの１または複数のドメインの除去を用いることができる。特定のタンパク質の好ましい断片を、全長の特定のタンパク質に結合させることができる抗体に結合させることができ、例えば、配列番号１、２または３に結合する抗体に結合させることができる。いくつかの有用な断片が下に示されている（配列番号４〜１３）。

これらのポリペプチドは、配列番号１〜３と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存されたアミノ酸の置き換え、すなわち、１つのアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸との置き換えを含んでよい。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、４つのファミリー：（１）酸性、すなわち、アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時には、一緒に芳香族アミノ酸に分類される。一般に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物活性に対して主要な影響を有さない。ポリペプチドは、配列番号１〜３と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸の欠失を含んでもよい。ポリペプチドは、配列番号１〜３と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸のそれぞれ）を含んでもよい。

本発明のポリペプチドは、多くの方式で、例えば、化学合成によって（全体的または部分的に）、長いポリペプチドを、プロテアーゼを用いて消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物から（例えば、組換え発現体から）、生物体自体から（例えば、細菌培養後に、もしくは患者から直接）精製することによってなどで調製することができる。＜４０アミノ酸長のペプチドを生成するための好ましい方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成を伴う［２２１、２２２］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［２２３］化学に基づく方法などの固相ペプチド合成が特に好ましい。酵素的合成［２２４］も一部または全部に用いることができる。化学合成の代替として、生物学的合成を用いることができ、例えば、ポリペプチドを翻訳によって生成することができる。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。生物学的方法は、一般に、Ｌ−アミノ酸に基づくポリペプチドの生成に限られるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子の）の操作を用いて、Ｄ−アミノ酸（または他の非天然アミノ酸、例えば、ヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン（ａｚｉｄｏｈｏｍｏａｌａｎｉｎｅ）など）の導入を可能にすることができる［２２５］。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合、化学合成を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合による修飾を有してよい。

これらのＧＢＳタンパク質が本発明の組成物に含まれる場合には、これらのＧＢＳタンパク質は種々の形態をとることができる（例えば、天然の形態、融合形態、グリコシル化された形態、グリコシル化されていない形態、脂質付加された形態、脂質付加されていない形態、リン酸化された形態、リン酸化されていない形態、ミリストイル化された形態、ミリストイル化されていない形態、単量体の形態、多量体の形態、粒子形態、変性した形態など）。これらのＧＢＳタンパク質は、精製された形態または実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）、特に、他のＧＢＳポリペプチドまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない）形態で用いることが好ましい。

ＧＢＳ６７
血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ株から配列決定されたＧＢＳ６７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、参考文献９９に配列番号３７４５＆３７４６として記載されている。このアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１である：

ＧＢＳ６７は、Ｃ末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号１のＣ末端に最も近い下線が引かれている領域によって示されている。膜貫通領域から１または複数のアミノ酸を除去することができ、またはアミノ酸を膜貫通領域の前で切断することができる。そのようなＧＢＳ６７断片の例は、配列番号４として下に記載されている。

ＧＢＳ６７は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号１においてイタリック体で示されている。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えＧＢＳ６７タンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、本発明において用いるためのＧＢＳ６７の１つの好ましい断片では、上記膜貫通および上記細胞壁アンカーモチーフをＧＢＳ６７から除去する。そのようなＧＢＳ６７断片の例は下に配列番号５として記載されている。

あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現させたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、または組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞または細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。

保存されたリジン残基を含有する３つのピリンモチーフがＧＢＳ６７において同定されている。保存されたリジン残基は、アミノ酸残基４７８および４８８、アミノ酸残基３４０および３４２、およびアミノ酸残基７０３および７１７にある。ピリン配列、特に、保存されたリジン残基は、ＧＢＳ６７のオリゴマーのピリ線毛様構造の形成に重要であると考えられている。ＧＢＳ６７の好ましい断片は、少なくとも１つの保存されたリジン残基を含む。保存されたグルタミン酸残基を含有する２つのＥボックスもＧＢＳ６７において同定されている。ＧＢＳ６７の好ましい断片は、少なくとも１つの保存されたグルタミン酸残基を含む。ＧＢＳ６７は、アルファヘリックス構造を形成することが予測されるいくつかの領域を含有する。そのようなアルファヘリックス領域は、コイルドコイル構造を形成する可能性があり、また、ＧＢＳ６７のオリゴマー形成に関与する可能性がある。ＧＢＳ６７は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓコラーゲン結合表面タンパク質（ｐｆａｍ０５７３８）のＣｎａ＿Ｂドメインと相同な領域も含有する。この領域は、ベータサンドイッチ構造を形成し得る。 ＧＢＳ６７は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）型Ａドメインと相同な領域を含有する。

血清型ＩｂのＨ３６Ｂ株から配列決定されたＧＢＳ６７のアミノ酸配列が参考文献２２６に配列番号２０９０６として記載されている。このアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２４である：

いくつかの実施形態では、ＧＢＳ６７のこのバリアントを用いることができる。したがって、本明細書において、配列番号１を参照することによって本発明の実施形態が定義されている場合、配列番号１への参照は、配列番号２４への参照で置き換えることができる。

血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ株から配列決定されたＧＢＳ６７と同様に、血清型ＩｂのＨ３６Ｂ株から配列決定されたＧＢＳ６７は、Ｃ末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号２４のＣ末端に最も近い下線が引かれている領域によって示されている。膜貫通領域から１または複数のアミノ酸を除去することができ、またはアミノ酸を膜貫通領域の前で切断することができる。そのようなＧＢＳ６７断片の例は下に配列番号２５として記載されている。

血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ株から配列決定されたＧＢＳ６７と同様に、血清型ＩｂのＨ３６Ｂ株から配列決定されたＧＢＳ６７は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号２４においてイタリック体で示されている。したがって、本発明において用いるためのＧＢＳ６７の１つの好ましい断片では、上記膜貫通および上記細胞壁アンカーモチーフをＧＢＳ６７から除去する。そのようなＧＢＳ６７断片の例は下に配列番号２６として記載されている。

ＧＢＳ８０
ＧＢＳ８０とは、推定上の細胞壁表面アンカーファミリータンパク質をいう。血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ分離株から配列決定されたＧＢＳ８０のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、参考文献９９において配列番号８７７９＆８７８０として記載されている。このアミノ酸配列は下に配列番号２として記載されている：

ＧＢＳ８０は、Ｎ末端のリーダー配列領域またはシグナル配列領域を含有し、それは、上記の下線が引かれている配列によって示されている。ＧＢＳ８０のリーダー配列領域またはシグナル配列領域から１または複数のアミノ酸を除去することができる。そのようなＧＢＳ８０断片の例は下に配列番号６として記載されている：

ＧＢＳ８０は、Ｃ末端の膜貫通領域を含有し、それは、上記の配列番号２の末端近くの下線が引かれている配列によって示される。１または複数のアミノ酸を膜貫通領域および／または細胞質領域から除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号７として記載されている：

ＧＢＳ８０は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含有し、それは上記の配列番号２においてイタリック体で示されている。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えＧＢＳ８０タンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、膜貫通領域および／または細胞質領域ならびに細胞壁アンカーモチーフを、ＧＢＳ８０から除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号８として記載されている。

あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現させたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、または組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞または細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。

一実施形態では、リーダー配列領域もしくはシグナル配列領域、膜貫通領域および細胞質領域および細胞壁アンカーモチーフをＧＢＳ８０配列から除去する。そのようなＧＢＳ８０断片の例は下に配列番号９として記載されている：

ＧＢＳ８０の特定の免疫原性断片はタンパク質のＮ末端に向かって位置し、本明細書では配列番号１０として示される：

Ｓｐｂ１
血清型ＩＩＩのＣＯＨ１株由来の野生型ＳｐｂＩ配列は、本明細書では配列番号３である：

野生型ＳｐｂＩは、Ｎ末端のリーダー配列領域またはシグナル配列領域を含有し、それは、上記の下線が引かれた配列によって示されている（アミノ酸１〜２９）。ＳｐｂＩのリーダー配列領域またはシグナル配列領域由来の１または複数のアミノ酸を除去することができる。そのようなＳｐｂＩ断片の例は下に配列番号１１として記載されている：

野生型ＳｐｂＩ配列は、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフ（ＬＰＳＴＧ）を含有する。いくつかの組換え型の宿主細胞系では、宿主細胞からの組換えＳｐｂＩタンパク質の分泌を容易にするために、このモチーフを除去することが好ましい場合がある。したがって、細胞壁アンカーモチーフおよびこのモチーフのＣ末端側の配列を、ＳｐｂＩから除去することができる。そのような断片の例は下に配列番号１２として記載されている：

あるいは、いくつかの組換え型の宿主細胞系では、組換えによって発現されたタンパク質を細胞壁に係留するために、細胞壁アンカーモチーフを用いることが好ましい場合がある。発現されたタンパク質の細胞外ドメインは、精製中に切断することができ、または組換えタンパク質は、最終の組成物中に、不活化した宿主細胞または細胞膜のいずれかに結合させたまま残すことができる。

一実施形態では、リーダー配列領域もしくはシグナル配列領域、細胞壁アンカーモチーフおよびこのモチーフのＣ末端側の配列をＳｐｂＩから除去する。そのようなＳｐｂＩ断片の例は下に配列番号１３として記載されている：

保存されたグルタミン酸残基を含有するＥボックスもＳｐｂＩにおいて同定されており（下線が引かれている）、残基４２３（太字）に保存されたグルタミン酸を有する。Ｅボックスモチーフは、オリゴマーのピリ線毛様構造の形成に重要である可能性があり、したがって、ＳｐｂＩの有用な断片は保存されたグルタミン酸残基を含んでよい。

野生型Ｓｐｂ１配列は、シャイン−ダルガルノ配列のコア配列（下線が引かれている）を含む上流の１２ｍｅｒの

配列（配列番号１４）を有する内部メチオニンコドン（Ｍｅｔ−１６２）を含む。このシャイン−ダルガルノ配列には、切断されたＳｐｂ１配列の翻訳が開始されることが見出されている。この部位における翻訳の開始を妨げるために、シャイン−ダルガルノ配列を、発現のために用いられるＳｐｂ１−コード配列において攪乱することができる。任意の適切なヌクレオチドを変異させてリボソームの結合を妨げることができるが、この配列は、シャイン−ダルガルノコアおよび内部メチオニンコドンを有するインフレームの両者の一部であるＧＧＡグリシンコドンを含む。コードされるグリシンを変化させず、それにより、Ｓｐｂ１配列のいかなる変化も回避しながら、このコドンの３番目の塩基をＣ、ＧまたはＴに変異させることができる。

本発明の組成物は、参考文献［２２７］においてアミノ酸配列ＮＨ_２−Ｗ−Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ｚ−ＣＯ_２Ｈ（式中：Ｘは、Ｓｐｂ１配列であり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｙは、ＧＢＳ８０配列であり、Ｗは任意選択のＮ末端配列であり、Ｚは任意選択のＣ末端配列である）で定義済みのポリペプチドを含んでもよい。このポリペプチドのさらなる詳細は、下に示されている。

これらの組成物は、上記のＧＢＳタンパク質抗原のうちの１または複数も含んでよい。特に、本発明の組成物は、（ａ）アミノ酸配列ＮＨ_２−Ｗ−Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ｚ−ＣＯ_２Ｈのポリペプチドと、（ｂ_１）上記の配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドならびに／または（ｂ_２）（ｉ）上記の配列番号１に対して配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）上記の配列番号１の断片を含むポリペプチドとを含んでよい。

ポリペプチドＮＨ_２−Ｗ−Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ｚ−ＣＯ_２Ｈ
典型的には、ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘ−Ｌ−Ｙを含み、式中、ＸはＳｐｂ１配列であり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｙは、ＧＢＳ８０配列である。

Ｘ：Ｓｐｂ１配列
Ｘ部分はＳｐｂ１配列である。このＳｐｂ１配列は、被験体に投与されると、野生型Ｓｐｂ１タンパク質、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有するＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅタンパク質（ＣＯＨ１株の全長の野生型配列）に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。

Ｓｐｂ１配列は、配列番号１３に対して少なくともａ％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。ａの値は、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９以上から選択することができる。Ｓｐｂ１配列は、配列番号１３を含み得る。

Ｓｐｂ１配列は、配列番号３の断片および／または配列番号１３の断片を含み得る。断片は、通常、配列番号３／１３の少なくともｂアミノ酸を含み、ｂは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００以上から選択される。断片は、通常、配列番号３／１３の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または、好ましくはＢ細胞エピトープを含む。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、上記の方法によって同定することができる。上で説明した通り、配列番号１３はそれ自体が配列番号３の断片である。

Ｓｐｂ１配列は、上で定義された配列番号１３に対する少なくともａ％の同一性も有し、配列番号１３の断片も含むアミノ酸配列を含み得る。

Ｘ部分は、通常、少なくともｃアミノ酸長であり、ｃは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００以上から選択される。

Ｘ部分は、通常、ｄアミノ酸長以下であり、ｄは、５００、４８０、４６０、４４０、４２０、４００、３８０、３６０、３４０、３２０、３００、２８０、２６０、２４０、２２０、２００、またはそれ未満から選択される。

Ｘ部分は、通常、３００〜５００の間のアミノ酸長、例えば、３５０〜４８０アミノ酸長、４００〜４６０アミノ酸長、４３０〜４５０アミノ酸長である。

血清型ＩＩＩのＣＯＨ１株由来の野生型ＳｐｂＩ配列は上記の配列番号３である。上記の「ＳｐｂＩ」セクションに記載のそれらの特定の誘導体を本発明のこの実施形態のＳｐｂ１配列に適用することができる。

Ｙ：ＧＢＳ８０配列
Ｙ部分は、ＧＢＳ８０配列である。このＧＢＳ８０配列は、被験体に投与されると、野生型ＧＢＳ８０タンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸配列（２６０３Ｖ／Ｒ株由来の全長の野生型配列）を有するＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅタンパク質に結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。

ＧＢＳ８０配列は、配列番号９に対して少なくともｅ％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ｅの値は、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９以上から選択することができる。ＧＢＳ８０配列は、配列番号９を含み得る。

ＧＢＳ８０配列は、配列番号２の断片または配列番号９の断片を含み得る。断片は、通常、配列番号２／９の少なくともｆアミノ酸を含み、ｆは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００以上から選択される。断片は、通常、配列番号２／９の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または、好ましくはＢ細胞エピトープを含む。上で説明した通り、配列番号９はそれ自体が配列番号２の断片である。

ＧＢＳ８０配列は、上で定義された、配列番号９に対する少なくともｅ％の同一性も有し、配列番号９の断片も含むアミノ酸配列を含み得る。

Ｙ部分は、通常、少なくともｇアミノ酸長であり、ｇは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００以上から選択される。

Ｙ部分は、通常、ｈアミノ酸長以下であり、ｈは、６００、５８０、５６０、５４０、５２０、５００、４８０、４６０、４４０、４２０、４００、３８０、３６０、３４０、３２０、３００、２８０、２６０、２４０、２２０、２００、またはそれ未満から選択される。

Ｙ部分は、通常３５０〜５５０の間のアミノ酸長、例えば、４００〜５２０アミノ酸長、４５０〜５００アミノ酸長、４７０〜４９０アミノ酸長である。

血清型Ｖの２６０３Ｖ／Ｒ分離株由来の野生型ＧＢＳ８０配列は上記の配列番号２である。上記の「ＧＢＳ８０」セクションに記載のそれらの特定の誘導体を本発明のこの実施形態のＧＢＳ８０配列に適用することができる。

Ｌ：リンカー
ポリペプチドは、必要に応じて、Ｘ部分とＹ部分を連結するためのＬ部分を含む。Ｌ部分は、典型的には、短いアミノ酸配列、例えば、２〜４０アミノ酸の範囲のアミノ酸配列であり、例えば、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸または４０アミノ酸からなる。

リンカーは、通常、少なくとも１つのグリシン残基を含有し、それにより、構造的な柔軟性が高まる。リンカーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのグリシン残基を含有してよい。グリシンは、少なくとも２つの連続したグリシンを、Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド配列、またはそれよりも長いオリゴＧｌｙ配列、すなわち、Ｇｌｙ_ｎ（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの）、例えば、配列番号１５で含むように配置されていてよい：
ＧＧＧＧ 。

リンカーは、制限酵素の認識配列に見出されるコドンにコードされ得る。例えば、特定の制限酵素の標的である６ｍｅｒの配列がジペプチドをコードし得る。したがって、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）の認識配列がＧｌｙ−Ｓｅｒをコードし、したがって、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒジペプチド配列を含み得る。そのような配列により、クローニングおよび操作が容易になる。

有用なリンカー配列としては、上記の配列番号１５および下記の配列番号１６、１７および１８が挙げられる：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１６）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＬ（配列番号１７）
ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１８） 。

しかし、好ましいリンカーは、ヒトポリペプチド配列に共通する１０以上連続したアミノ酸を共有する配列を含まない。例えば、本発明で用いることができる１つのグリシンリッチリンカー配列は、１４ｍｅｒの配列番号１６である。しかし、この１４ｍｅｒは、ヒトＲＮＡ結合性タンパク質（ｇｉ：８０５１６３１）にも見出され、したがって、Ｌ部分内では避けることが好ましい。

Ｗ：Ｎ末端配列
Ｘ部分はポリペプチドのＮ末端にあってよいが、Ｘの上流にアミノ酸を有することも可能である。これらの任意選択のアミノ酸がＷ部分を形成する。

Ｗ部分は、典型的には、短いアミノ酸配列、例えば、２〜４０アミノ酸の範囲のアミノ酸配列であり、例えば、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸または４０アミノ酸からなる。

Ｗ部分の例は、タンパク質の輸送を導くリーダー配列であり、または、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの）を含む。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。

新生ポリペプチドのＷ部分には、ポリペプチドのＮ末端メチオニン（細菌におけるホルミル−メチオニン、ｆＭｅｔ）がもたらされ得る。しかし、１または複数のアミノ酸を新生Ｗ部分のＮ末端から切断し、本発明のポリペプチドのＷ部分が必ずしもＮ末端メチオニンを含まないようにすることができる。

有用なＷ部分としては、配列番号１９：
ＭＡＳ
が挙げられる。

Ｚ：Ｃ末端配列
Ｙ部分はポリペプチドのＣ末端にあってよいが、Ｙの下流のアミノ酸を有することも可能である。これらの任意選択のアミノ酸がＺ部分を形成する。

Ｚ部分は、典型的には、短いアミノ酸配列、例えば、２〜４０アミノ酸の範囲のアミノ酸配列であり、例えば、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸、３１アミノ酸、３２アミノ酸、３３アミノ酸、３４アミノ酸、３５アミノ酸、３６アミノ酸、３７アミノ酸、３８アミノ酸、３９アミノ酸または４０アミノ酸からなる。

Ｚ部分の例としては、タンパク質の輸送を誘導する配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの）を含む）、またはタンパク質の安定性を増強する配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡの１４ｋＤａの断片、ビオチン化したペプチド、マルトース結合タンパク質、エンテロキナーゼフラグなどは、当業者には明らかである。１つの有用なＺ部分は、配列番号２０：
ＨＨＨＨＨＨ
を含む。

有用な組み合わせ
種々のＸ部分、Ｙ部分およびＬ部分の有用な組み合わせとしては以下が挙げられるが、これに限定されない：

ポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。ｉの値は、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９以上から選択することができる。ポリペプチドは、配列番号２１を含み得る。

ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ｉの値は、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９以上から選択することができる。ポリペプチドは、配列番号２３を含んでよい。

本発明で使用するポリペプチドは、
（ａ）配列番号２１または２３と同一（すなわち、１００％同一）であり、
（ｂ）配列番号２１または２３と配列同一性を共有し、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置にあってよく、または連続してよい、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれを超える）単一のアミノ酸の変更（欠失、挿入、置換）を有し、かつ
（ｄ）配列番号２１または２３を、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いてアラインメントすると、ｘアミノ酸のＮ末端からＣ末端まで動くウィンドウのそれぞれが（ｐアミノ酸（ｐ＞ｘ）まで伸長するアラインメントについて、そのようなウィンドウがｐ−ｘ＋１存在するような）少なくともｘ・ｙ同一のアラインメントされたアミノ酸を有する（ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、ｘ・ｙが整数でない場合には、最も近い整数に切り上げる）アミノ酸配列を含んでよい。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［２２８］であり、そこでは初期状態のパラメータ（例えば、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．５を用いてＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を用いる）を用いる。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ内のニードル（ｎｅｅｄｌｅ）ツールにおいて都合よく実行される［２２９］。

群（ｃ）の中で、欠失または置換はＮ末端および／またはＣ末端におけるものであってよく、または、２つの末端の間におけるものであってよい。したがって、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は欠失の例である。切断は、Ｎ末端および／またはＣ末端における４０（またはそれより多くの）アミノ酸に至るまでの欠失を伴ってよい。

ポリペプチド内のＳｐｂ１配列およびＧＢＳ８０配列は、１または複数のＧＢＳ株から得ることができる。例えば、配列番号２１および２３は、ＣＯＨ１株由来のＳｐｂ１配列と２６０３Ｖ／Ｒ株由来のＧＢＳ８０配列を含む。

ポリペプチド
ポリペプチド、または個々の部分は、配列番号２、３、９、１０、１３、２１または２３と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存されたアミノ酸の置き換え、すなわち、１つのアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸での置き換えを含み得る。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に、４つのファミリー：（１）酸性、すなわち、アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時には、一緒に芳香族アミノ酸に分類される。一般に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物活性に対して主要な影響を有さない。ポリペプチドは、参照配列と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一のアミノ酸の欠失を有し得る。ポリペプチドは、参照配列と比較して、１または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸のそれぞれ）も含み得る。

ポリペプチドは、上記の通り、多くの方式で調製することができる。ポリペプチドは、上記の通り、種々の形態（例えば、天然の形態、融合形態、グリコシル化された形態、グリコシル化されていない形態、脂質付加された形態、脂質付加されていない形態、リン酸化された形態、リン酸化されていない形態、ミリストイル化された形態、ミリストイル化されていない形態、単量体の形態、多量体の形態、粒子形態、変性された形態など）を取ることができる。ポリペプチドは、上記の通り、精製された形態または実質的に精製された形態で提供されることが好ましい。

「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含んでよく、また、ポリマーは、非アミノ酸により乱されていてよい。この用語は、自然に修飾された、または介入；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは改変により修飾されたアミノ酸のポリマーも包含する。この定義には、例えば、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として生じ得る。ポリペプチドは、自然にまたは人為的にグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドが、対応する天然に存在するポリペプチドに見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。

ポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸長（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００以上）であり得る。ポリペプチドは１１００アミノ酸よりも短くてよい。

予備免疫
第２の態様では、本発明は、ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。典型的には、コンジュゲートは、上記の通り、本発明の第１の態様の免疫原性組成物中のＧＢＳコンジュゲートのうちの１つである。言い換えれば、少なくとも１つのコンジュゲートが、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖である本発明の第１の態様の免疫原性組成物を、本発明の第２の態様において用いることができる。組成物中の、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせた莢膜糖は、例えば、ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来であってよい。特に、莢膜糖は、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来であってよい（下に例示されている通り）。この態様では、組成物中のＧＢＳ由来の莢膜糖のすべてがジフテリアトキソイドまたはその誘導体とコンジュゲートしていることが典型的である。キャリアまたは予備免疫抗原がジフテリアトキソイドの誘導体である場合には、その誘導体は、Ｄｔと免疫学的に交差反応性のままであることが好ましく、ＣＲＭ１９７であることが好ましい。本発明者らは、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートは、キャリア誘導性エピトープ抑制（または一般に公知の通り「キャリア抑制」）、特に、キャリアによる初回刺激から生じる抑制を受けないようであることを見出した。以下に論じるように、「キャリア抑制」とは、動物を、キャリアタンパク質を用いて予備免疫することにより、その動物において後に、そのキャリア上に提示される新しい抗原エピトープに対する免疫応答が惹起されることが妨げられる現象である［２３０］。この公知の現象とは対照的に、本発明者らは、ＧＢＳ莢膜糖とジフテリアトキソイドまたはその誘導体のコンジュゲートに対する免疫応答を、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いた予備免疫により実際に改善することができることを見出した。

参考文献２３１において報告されている通り、いくつかのワクチン抗原が同じタンパク質成分（コンジュゲート中の免疫原および／またはキャリアタンパク質として用いられる）を含有する場合には、それらの抗原間で干渉が潜在的に存在する。参考文献２３１では、破傷風トキソイド（Ｔｔ）キャリアにコンジュゲートさせた抗原に対する免疫応答は、Ｔｔに対する既存の免疫によって抑制された。

参考文献２３２では、ＨｉｂコンジュゲートのためのキャリアがＤ−Ｔ−Ｐワクチン由来の破傷風抗原と同じである場合に、Ｄ−Ｔ−ＰワクチンとＨｉｂコンジュゲートワクチンの組み合わせがどのように悪影響を及ぼしたかが報告されている。その著者らは、複数のコンジュゲートを含むワクチンを導入する場合には、一般的なキャリアタンパク質による干渉から生じるこの「キャリア抑制」現象を考慮に入れるべきであると結論づけている。

参考文献２３１および２３２とは対照的に、参考文献２３３では、破傷風トキソイドを用いた初回刺激には、その後に投与されたＨｉｂ−Ｔｔコンジュゲートに対する免疫応答に対する負の影響はなかったが、母体から獲得した抗Ｔｔ抗体を有する患者において抑制が認められたことが報告されている。しかし、参考文献２３４では、破傷風ワクチン接種によって生じた既存の抗Ｔｔ抗体を有する患者においてＴｔベースのペプチドコンジュゲートについての「エピトープ抑制」作用が報告された。

参考文献２３５では、キャリアとしてＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の解毒された変異体）を有するコンジュゲートは、以前にジフテリア毒素をワクチンの一部として（例えば、Ｄ−Ｔ−ＰワクチンまたはＤ−Ｔワクチンの一部として）受けたことのない小児では効力がない可能性があることが示唆された。この研究は、参考文献２３６においてさらに発展され、そこでは、Ｄ−Ｔ免疫により、キャリアによる初回刺激作用がその後のＨｉｂコンジュゲートを用いた免疫にわたって持続することが認められた。

参考文献２３７では、その著者らは、ジフテリアトキソイドキャリアタンパク質または破傷風トキソイドキャリアタンパク質を用いた予備免疫により、これらのキャリアにコンジュゲートさせたＨｉｂ莢膜糖を用いたその後の免疫後の抗Ｈｉｂ抗体レベルの上昇が低下し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が同等に影響を受けたことを見出した。コンジュゲートのキャリア部分に対する応答も抑制された。さらに、１種のコンジュゲートを用いた予備免疫が、４週間後に投与した第２のコンジュゲートのキャリア部分および糖部分の両方に対する免疫応答に影響を及ぼすことが認められたので、より一般的な非エピトープ特異的抑制が認められた。

異なるキャリアタンパク質の、単一の多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンへの使用が参考文献２３８に報告されており、そこでは、キャリア抑制を回避するために複数のキャリアが用いられている。その著者らは、多価のコンジュゲートワクチンにおいて、負の干渉が生じることなく許容され得るキャリアタンパク質の最大負荷量が存在すると予測している。参考文献２３９では、混合キャリアタンパク質を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンにより、抗肺炎球菌への応答と並行して、キャリアに対する意図しない追加免疫応答が惹起されたことが報告された。

参考文献２４０では、ジフテリアおよび破傷風による追加免疫を、一価の髄膜炎菌血清群Ｃコンジュゲートと一緒に施すことができるかどうかの調査であり、キャリアが破傷風トキソイドキャリアであり、患者が破傷風を含有するワクチンを用いた予備免疫を受けている場合に、髄膜炎菌コンジュゲートに対する力価が低下したことが見出された。

糖コンジュゲートに対する免疫応答への負の影響を有するキャリアを用いた初回刺激の問題に加えて、逆も起こり得る、すなわち、コンジュゲートを用いた免疫がキャリアに対する免疫応答への負の影響を有する場合がある［２４１］。

したがって、この本発明の第２の態様は、ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。この態様は、ＧＢＳによる感染に対してジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者を免疫することに用いるためのジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートも提供する。この態様は、さらに、ＧＢＳによる感染に対して、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者を免疫するための医薬品の製造における、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートの使用を提供する。

予備免疫した患者
免疫されるこの患者は、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体で予備免疫されている。ジフテリアトキソイドまたはその誘導体は、ＧＢＳ以外の生物体の莢膜糖とジフテリアトキソイドまたはその誘導体のコンジュゲート中のキャリアとして投与することができる。典型的な予備免疫は、ジフテリアトキソイド抗原；ジフテリアトキソイドキャリアまたはＣＲＭ１９７キャリアを用いたＨｉｂ莢膜糖コンジュゲート；および／またはジフテリアトキソイドキャリアまたはＣＲＭ１９７キャリアを用いた肺炎球菌の莢膜糖コンジュゲートを含む。

患者は、予備免疫抗原（複数可）の少なくとも１回の（例えば、１回、２回、３回またはそれより多くの）用量を受け、その用量（または複数回用量の最初）を、患者に、ＧＢＳコンジュゲートを用いて免疫する少なくとも６カ月前（例えば、６カ月前、９カ月前、１２カ月前、１５カ月前、１８カ月前、２１カ月前、２４カ月前、３６カ月前、４８カ月前、６０カ月前、１２０カ月前、１８０カ月前、２４０カ月前、３００カ月前、またはそれよりも前）に、本発明のこの態様に従って投与する。患者の好ましい群では、予備免疫は、出生後３年以内、例えば、出生後２年以内、出生後１年以内、出生後６カ月以内、または、さらには出生後３カ月以内、出生後２カ月以内または出生後１カ月以内に行われる。本発明のこの態様に従って免疫される適切な患者については、上の処置方法のセクションにおいて記載されている。

予備免疫抗原がジフテリアトキソイドである場合には、患者は、典型的には、トキソイドをＤ−Ｔ−Ｐ予備免疫またはＤ−Ｔ予備免疫において「Ｄ」抗原として受ける。そのような免疫は、典型的には、２カ月齢、３カ月齢、および４カ月齢の新生児に与えられる。免疫が百日咳ワクチンを含む場合、そのワクチンは、細胞全体または細胞性の百日咳ワクチン（「Ｐｗ」）であってよいが、無細胞の百日咳ワクチン（「Ｐａ」）であることが好ましい。予備免疫Ｐａワクチンは、一般に、以下の周知かつよく特徴付けられたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原：（１）化学的手段または部位特異的変異誘発のいずれかによって解毒された百日咳トキソイド（「ＰＴ」）、例えば、「９Ｋ／１２９Ｇ」変異体［２４２］；（２）線維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）；（３）パータクチン（「６９キロダルトンの外膜タンパク質」としても公知）のうちの１つ、２つまたは３つを含む。無細胞の百日咳ワクチンは、凝集原２および／または凝集原３を含んでもよい。Ｄ−Ｔ−Ｐ予備免疫における「Ｔ」抗原は、典型的には、破傷風トキソイドである。

予備免疫抗原がジフテリアトキソイドである場合には、患者は、同様に、またはその代わりに、トキソイドをタンパク質−糖コンジュゲートのキャリアタンパク質として受けることができる。そのようなコンジュゲートとしては、「ＰＲＰ−Ｄ」Ｈｉｂコンジュゲート［参考文献［２４３］の表１４−７を参照されたい、例えば、ＰｒｏＨＩＢＩＴ（商標）製品が挙げられる。

予備免疫抗原がＣＲＭ１９７である場合には、患者は、典型的には、Ｈｉｂコンジュゲートおよび／または多価の肺炎球菌コンジュゲートを用いて予備免疫されている。そのような免疫は、典型的には、２カ月齢、３カ月齢、および４カ月齢の新生児に与えられる。ＣＲＭ１９７キャリアを用いるＨｉｂコンジュゲートとしては、「ＨｂＯＣ」コンジュゲート［参考文献２４３の表１４−７］、例えば、ＨｉｂＴＩＴＥＲ（商標）製品が挙げられる。ＣＲＭ１９７キャリアを用いる肺炎球菌コンジュゲートとしては、７価のＰＣＶ７混合物、例えば、ＰｒｅｖＮａｒ（商標）ワクチン［２４４］が挙げられる。患者は、血清群Ｃ髄膜炎菌（「ＭｅｎＣ」）コンジュゲートを用いて予備免疫されていてもよい。ＣＲＭ１９７キャリアを用いるＭｅｎＣコンジュゲートとしては、Ｍｅｎｉｎｖａｃｔ（商標）／Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）［２４５］およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）が挙げられる。

予備免疫が、コンジュゲートした抗原を用いたものであった場合には、患者は、ほぼ必然的に、コンジュゲートの低レベルのコンタミネーション（例えば、保管している間にコンジュゲートが加水分解することによって引き起こされる）の結果として少量の遊離のジフテリアトキソイド（または誘導体）も受けているが、この少量では、典型的には、有意な免疫応答をもたらすためには適していない。

ジフテリアトキソイドは、周知のよく特徴付けられたタンパク質であり［例えば、参考文献２４３の第１３章を参照されたい］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅのＡＤＰリボシル化外毒素を、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの不活性化する化学物質で処理することによって得ることができる。ＣＲＭ１９７も周知であり、よく特徴付けられており［２４６〜２４９］、コンジュゲートさせた糖ワクチン中のキャリアとして広く用いられている。ＣＲＭ１９７およびＤｔは多くのキャリアエピトープを共有する。

予備免疫の結果は、患者の免疫系が予備免疫抗原に曝露されているということである。ジフテリアトキソイド（Ｄｔ）を用いた予備免疫については、これは一般に、患者が抗Ｄｔ抗体応答を生じ（典型的には、抗Ｄｔ力価＞０．０１ＩＵ／ｍｌが得られるまで）、Ｄｔに特異的な記憶Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球を保有することになることを意味する、すなわち、Ｄｔを用いた予備免疫は、典型的には、患者における既往性の抗Ｄｔ免疫応答を惹起するために適している。Ｄｔ（または誘導体）がコンジュゲート中の糖のキャリアである場合の予備免疫については、予備免疫により抗糖応答が生じ、患者は糖に特異的な記憶Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球を保有することになる、すなわち、予備免疫は、典型的には、患者における既往性の抗糖免疫応答を惹起するために適している。予備免疫は、好ましくは、患者において、例えば、ジフテリア疾患に対して防御免疫を惹起するために適していた。

したがって、本発明のこの態様に従って免疫される患者は、一般の患者とは区別可能である。なぜなら、彼らは、その免疫系がすでに予備免疫抗原に対する免疫応答を開始している一般集団のサブセットのメンバーであり、したがって、ジフテリアトキソイド（またはその誘導体）キャリアを含むＧＢＳコンジュゲートを用いたこの態様による免疫により、このサブセットでは、以前に予備免疫抗原に対する免疫応答が開始されていない患者における免疫応答とは異なる免疫応答が惹起されるからである。Ｄｔ（または誘導体）をコンジュゲート（特に、Ｈｉｂコンジュゲート）のキャリアとして用いて予備免疫されている患者が好ましい。特に好ましい患者は、Ｄｔ（または誘導体）をコンジュゲートのキャリアとして、そして、また、Ｄｔをコンジュゲートしていない免疫原として用いて予備免疫されている。

ジフテリアトキソイド（または誘導体）をコンジュゲートした形態またはコンジュゲートしていない形態で用いて予備免疫されているだけでなく、患者は、他の抗原を用いて予備免疫されていてもよい。そのような抗原としては、これらに限定されないが、百日咳抗原（複数可）−上記を参照されたい；破傷風トキソイド−上記を参照されたい；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型−上記を参照されたい；Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；ポリオウイルス、例えば、不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−上記を参照されたい；インフルエンザウイルス；ＢＣＧ；Ａ型肝炎ウイルス抗原；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；風疹ウイルス；水痘ウイルスなどが挙げられる。

患者は、１または複数のＧＢＳコンジュゲートを用いて予備免疫されていてもされていなくてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、患者が最初にＧＢＳコンジュゲートに受けた時点で、その患者はすでにＤｔ（または誘導体）を用いて予備免疫されている。他の実施形態では、ＧＢＳコンジュゲートを、すでに（ｉ）Ｄｔまたは誘導体および（ｉｉ）ＧＢＳコンジュゲートの両方を用いて予備免疫されている患者に投与する。

破傷風トキソイドキャリア
この本発明の第２の態様は、ジフテリアトキソイドキャリア（およびそれらの誘導体）との関連で、破傷風トキソイドは用いないことが好ましいことが上記されているが、この態様の代替的な実施形態では、破傷風トキソイド（または誘導体）キャリアを用い、ジフテリアトキソイドは用いないことが好ましい。したがって、これらの代替的な実施形態では、上記の定義をそのように改変することができる。

例えば、本発明の第２の態様は、ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。この態様は、ＧＢＳによる感染に対して、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者を免疫することにおいて用いるための、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートも提供する。この態様は、さらに、ＧＢＳによる感染に対して、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者を免疫するための医薬品の製造における、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートの使用を提供する。破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートは、キャリア抑制、特に、キャリアによる初回刺激から生じる抑制を受けない可能性がある。ＧＢＳ莢膜糖−破傷風トキソイドまたはその誘導体のコンジュゲートに対する免疫応答を、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いた予備免疫により、実際に改善することができる。

典型的には、コンジュゲートは、上記の通り、本発明の第１の態様の免疫原性組成物中のＧＢＳコンジュゲートのうちの１つである。言い換えれば、少なくとも１つのコンジュゲートが、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖である本発明の第１の態様の免疫原性組成物を、本発明の第２の態様において用いることができる。組成物中の、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせた莢膜糖は、例えば、ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来であってよい。特に、莢膜糖は、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来であってよい。この態様では、組成物中のＧＢＳ由来の莢膜糖のすべてが破傷風トキソイドまたはその誘導体とコンジュゲートしていることが典型的である。

破傷風トキソイドは、周知のタンパク質であり［例えば、参考文献２４３の第２７章を参照されたい］、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉのＡＤＰリボシル化外毒素を不活性化することによって得ることができる。患者は、典型的には、破傷風トキソイドをＤ−Ｔ−Ｐ予備免疫またはＤ−Ｔ予備免疫において「Ｔ」抗原として、またはコンジュゲート中のキャリアタンパク質として受けている。そのようなコンジュゲートとしては、「ＰＲＰ−Ｔ」Ｈｉｂコンジュゲート［参考文献２４３の表１４−７を参照されたい］、例えば、ＡｃｔＨＩＢ（商標）製品、ＯｍｎｉＨＩＢ（商標）製品およびＨＩＢＥＲＩＸ（商標）製品が挙げられる。

一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから独占的になり、または、追加的な何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでよい。

「約」という用語は、数値ｘとの関連では、例えば、ｘ±１０％を意味する。

「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語を本発明の定義から除くことができる。

糖環は、開いた形態および閉じた形態で存在できること、ならびに、本明細書の構造式において閉じた形態が示されていても、開いた形態も本発明に包含されることが理解されよう。同様に、糖は、ピラノース型およびフラノース型で存在できること、ならびに、本明細書の構造式においてピラノース型が示されていても、フラノース型も包含されることが理解される。糖の異なるアノマー形態も包含される。

具体的に規定されていない限り、２つまたはそれより多くの成分を混合するステップを含むプロセスは、いかなる特定の混合の順序も必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合には、２つの成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組み合わせ物を、第３の成分と組み合わせることができるなどである。

抗体は、一般に、それらの標的に特異的である。したがって、抗体は、標的に対して、無関連の対照タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンに対する親和性よりも高い親和性を有する。

別段の指定のない限り、ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を用いて決定することが好ましい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物。
（項目２）
ＧＢＳ莢膜糖の総量が≦７０μｇである、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目３）
各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量あたり１μｇ〜３０μｇの量で存在する、項目１または項目２に記載の免疫原性組成物。
（項目４）
各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量あたり５μｇ、１０μｇまたは２０μｇの量で存在する、項目３に記載の免疫原性組成物。
（項目５）
単位用量あたりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の量が、表Ｃの２列目に記載の投薬の選択肢のうちの１つに対応する、項目４に記載の免疫原性組成物。
（項目６）
単位用量あたりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の量が、２０μｇ、２０μｇおよび２０μｇ；１０μｇ、１０μｇおよび１０μｇ；ならびに５μｇ、５μｇおよび５μｇからなる群から選択される、項目５に記載の免疫原性組成物。
（項目７）
単位用量あたりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の量が５μｇ、５μｇおよび５μｇである、項目６に記載の免疫原性組成物。
（項目８）
各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量あたり０．１μｇ〜５μｇの量で存在する、項目１または項目２に記載の免疫原性組成物。
（項目９）
各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量あたり０．５μｇ、２．５μｇまたは５μｇの量で存在する、項目８に記載の免疫原性組成物。
（項目１０）
単位用量あたりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の量が、表Ｃ’に記載の投薬の選択肢のうちの１つに対応する、項目９に記載の免疫原性組成物。
（項目１１）
前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の質量比が、表Ｆの２列目に記載の比率の選択肢のうちの１つに対応する、項目１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１２）
前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の質量比が１：１：１である、項目１１に記載の免疫原性組成物。
（項目１３）
１つの単位用量を投与し、その後、該第１の単位用量の３カ月後に第２の単位用量を投与するためのものである、項目１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１４）
ｄ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートをさらに含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１５）
１つの単位用量を投与し、その後、該第１の単位用量の１カ月後に第２の単位用量を投与するためのものである、項目１４に記載の免疫原性組成物。
（項目１６）
単回用量で投与するためのものである、項目１から１２および１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１７）
アルミニウム塩アジュバントを含有しない、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１８）
いかなるアジュバントも含有しない、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目１９）
前記ａ）、ｂ）および／またはｃ）中のキャリアタンパク質が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７である、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２０）
前記ａ）、ｂ）およびｃ）中のキャリアタンパク質がＣＲＭ１９７である、項目１９に記載の免疫原性組成物。
（項目２１）
前記コンジュゲート（複数可）が、コンジュゲーション前に糖（複数可）のシアル酸残基の１０％〜３０％を酸化することによって生じたアルデヒド基の還元アミノ化によって得ることができる、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２２）
前記ＧＢＳ莢膜糖（複数可）が、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さない、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２３）
前記ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖が、１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、前記ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖が、１５０〜３００ｋＤａの範囲のＭＷを有し、かつ／または前記ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖が５０〜２００ｋＤａの範囲のＭＷを有する、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２４）
キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートが、約１：１から１：２の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有し、かつ／またはキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートが、約３：１から１：１の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２５）
筋肉内に投与するためのものである、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２６）
（ａ）配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１〜３のうちの１または複数に対する配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１〜３の断片を含むポリペプチドをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２７）
注射可能な液剤または懸濁剤である、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２８）
凍結乾燥されている、項目１から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目２９）
前記コンジュゲート（複数可）を安定化するためにマンニトールを含む、項目２８に記載の免疫原性組成物。
（項目３０）
リン酸二水素カリウムバッファを含む、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３１）
塩化ナトリウムを含む、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３２）
ワクチンである、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３３）
ヒトに投与するためのものである、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３４）
妊娠可能な年齢の女性、妊婦および高齢の患者から選択されるヒトに投与するためのものである、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３５）
妊婦に投与するためのものである、項目３４に記載の免疫原性組成物。
（項目３６）
投与前に、前記ヒトが、検出不可能なレベルの、ＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖に対する抗体、ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖に対する抗体、および／またはＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖に対する抗体を有する、項目３３から３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３７）
医薬品として用いるためのものである、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目３８）
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患を予防および／または処置するためのものである、項目３７に記載の免疫原性組成物。
（項目３９）
前記疾患が新生児敗血症、菌血症、新生児肺炎、新生児髄膜炎、子宮内膜炎、骨髄炎または化膿性関節炎である、項目３８に記載の免疫原性組成物。
（項目４０）
前記組成物がジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に投与するためのものであり、前記免疫原性組成物中の少なくとも１つのコンジュゲートがジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖である、前記項目のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（項目４１）
ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に、ジフテリアトキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
（項目４２）
前記コンジュゲートが、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物中に存在し、前記ＧＢＳ由来の莢膜糖が、該ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来の莢膜糖である、項目４１に記載の方法
（項目４３）
前記ＧＢＳ由来の莢膜糖が前記ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記免疫原性組成物が項目１から３９のいずれか一項に記載の特徴を有する、項目４２または項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＧＢＳによる感染に対して患者を免疫するための方法であって、破傷風トキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に、破傷風トキソイドまたはその誘導体にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖であるコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
（項目４６）
前記コンジュゲートが、ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物中に存在し、前記ＧＢＳ由来の莢膜糖が、前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩ由来の莢膜糖である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＧＢＳ由来の莢膜糖が前記ＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記免疫原性組成物が項目１から３９のいずれか一項に記載の特徴を有する、項目４６または項目４７に記載の方法。

図１は、ＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩにおける繰り返し構造同士間の差異を示す。 図２は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ＆Ｖにおける莢膜糖の繰り返し構造を示す。 図３は、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖の脱シアル化形態の繰り返し構造を示す。 図４は、アジュバントあり、およびアジュバントなしの、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ莢膜糖とＣＲＭ１９７とのコンジュゲートを投与する前の、ＣＲＭ１９７での初回刺激の効果を示す。

コンジュゲート生成
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ由来の精製莢膜糖を、過ヨウ素酸酸化、その後の還元アミノ化によってキャリアタンパク質にコンジュゲートさせた（参考文献２）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｖ由来の精製脱シアル化莢膜糖を、過ヨウ素酸酸化、その後の還元アミノ化によってキャリアタンパク質にコンジュゲートさせた（参考文献１４）。ほとんどの場合におけるキャリアタンパク質は、ＣＲＭ１９７であった。破傷風トキソイドを、特に示された場合、キャリアタンパク質として使用した。

マウス試験（１）。

この試験では、一価ワクチンまたは混合ワクチンのいずれかとしての、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートの効力および免疫原性に対するアジュバントの効果を、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデル（ａｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｎａｌ−ｎｅｏｎａｔａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）において評価した。

参考文献２５０から適応された母体−新生仔攻撃マウスモデルを使用することによって、能動ワクチン接種した雌親から経胎盤性に得た特異的抗体の新生仔における効力を評価する。具体的には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）からの５〜６週齢の雌ＣＤ−１マウスに、アジュバントあり、およびアジュバントなしで、１日目、２１日目、および最終的に３５日目に、腹腔内注射によってワクチン接種し、２回または３回免疫する。最後の免疫の後、マウスを出産まで飼育し、保持する。免疫されていない子の９０％に致死性であるＧＢＳ株の種菌（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス０．０５ｍＬ）（１００〜１０００倍のＬＤ５０）を使用して、新生仔マウスを攻撃する。攻撃は、生後４８時間以内の腹腔内経路によるものである。７２時間で生存している子の数を記録し、フィッシャーの正確検定を使用して、生存率をすべての処置群において比較する。対照群において、雌親に、同じ経路によって、同じ投与スケジュールを使用してＰＢＳを与える。最後に免疫してから２週間後に血液試料を収集し、２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（以下に記載するＥＬＩＳＡ、およびオプソノファゴサイトーシス（Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）アッセイ）を使用して免疫原性評価を行う。

ＥＬＩＳＡアッセイを実施して免疫後に生成されるＧＢＳ特異的抗体の力価を決定する。ＥＬＩＳＡは、各莢膜糖（ｓａｃｃｈａｒｄｅ）抗原に対する全ＩｇＧを定量化するのにも使用する。各個々のマウスからの血清を分析し、幾何平均力価（ＧＭＴ）を各群について計算する。莢膜糖の型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩについての抗体価を、マウスＥＬＩＳＡ単位（Ｍｏｕｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｕｎｉｔ）（ＭＥＵ）として表し、基準線アッセイ法（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ）に基づいて計算する。

オプソノファゴサイトーシスアッセイ（ＯＰＡ）を実施して、補体媒介のＧＢＳ死滅化をなすことができるワクチン誘導抗体の力価を評価する（参考文献２５１に記載された手法を使用して）。アッセイは、以下の成分、すなわち、細菌、食細胞（ヒト血液から抽出されたＰＭＮ、または分化ＨＬ−６０細胞系）、補体、および免疫血清を組み合わせることによって実施する。反応ミックスのアリコートを、３７℃で１時間インキュベートする前およびその後に蒔いて、残っているコロニー形成単位（ＣＦＵ）を決定した。オプソノファゴサイトーシス死滅化の量（死滅の対数）を、初期時点で存在するＣＦＵ数の対数から生存するコロニー数の対数を減じることによって決定する。免疫前の血清、およびＰＭＮを含まない熱不活化した補体を、陰性対照として使用する。殺菌力価を、細菌を５０％低減する血清希釈度の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｓｅｒｕｍ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として表す。

本試験では、０日目および２１日目に、アジュバント（水酸化アルミニウムまたはＭＦ５９）の存在下で、３つの異なるコンジュゲートを２回投与して（それぞれ１μｇ）、雌ＣＤ１マウスを免疫した。新生仔を、以下の表１に示す型特異的株で攻撃した。

水酸化アルミニウムおよびＭＦ５９の両方で、３つすべての血清型について、一価ワクチンを用いて高レベルの防御が達成された。しかし、アジュバントＭＦ５９を用いた場合、より高い抗体価が存在したけれども、生存率はわずかにより低かった。

追加の実験では、アジュバントが存在する各コンジュゲート１μｇでの組み合わせ物の、０日目、２１日目、および３５日目における３回の投与でマウスを免疫した。新生仔を、以下の表２に示すように型特異的株で攻撃した。

アジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、３つすべての処方物中の、混合ワクチンを用いて高レベルの防御が達成されたが、アジュバントが存在しないものでは、抗体価がより低かった。

マウス試験（２）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおける、血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートの効力および免疫原性に対する凍結乾燥の効果を評価した。アジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、３つの異なるコンジュゲートの、０日目および２１日目における２回の投与で（それぞれ１μｇ）マウスを免疫した。新生仔を、以下の表３に示す型特異的株で攻撃した。

凍結乾燥プロセスは、ＧＢＳコンジュゲートの免疫原性に影響しなかった。抗体価および殺菌力価は、両方の液体処方物および凍結乾燥処方物を投与されたマウスにおいて同等であった。

マウス試験（３）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおける、血清型Ｖ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートの効力に対する凍結乾燥の効果を評価した。アジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しないコンジュゲートの、０日目および２１日目における２回の投与で（それぞれ１μｇ、５μｇ、または１０μｇ）マウスを免疫した。新生仔を、Ｖ型株で攻撃した。結果を、以下の表４に示す。

凍結乾燥プロセスは、ＧＢＳコンジュゲートの免疫原性に影響しなかった。生存率（Ｓｕｒｖｉａｌ ｒａｔｅｓ）は、両方の液体処方物および凍結乾燥処方物を投与されたマウスにおいて同等であった。

マウス試験（４）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶコンジュゲートの混合物の効力に対する様々な用量の効果を評価した。アジュバントを用いないＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートのそれぞれの０．２μｇ、１μｇ、または５μｇでの組み合わせ物の、０日目、および２１日目における２回の投与でマウスを免疫した。以下の表５に示すように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

より高い投与量のＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲートは、防御のレベルを上昇させた。

マウス試験（５）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩおよびＶコンジュゲートの混合物の効力に対する様々な数の投与の効果を評価した。必要に応じて、アラム（ａｌｕｍ）アジュバントが存在する組み合わせ物の、０日目、２１日目、および３５日目における１回、２回、または３回の投与で（各コンジュゲート１μｇ）マウスを免疫した。以下の表６に示したように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

この試験における血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートの混合物を投与した後に、殺菌（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｉａｌ）力価を測定した。ＯＰＡ力価を以下に示す。

免疫の数は、ＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲートに対する免疫応答に強く影響した。
マウス試験（６）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲート単独と比較したＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートの混合物の効力を評価した。アラムアジュバントが存在する、各コンジュゲート１μｇの組み合わせ物、または１μｇのＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲートの、０日目、２１日目、および３５日目における３回の投与でマウスを免疫した。新生仔を、ＣＪＢ１１１および２６０３Ｖ／ＲのＶ型株で攻撃した。結果を以下の表７に示す。

ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する免疫応答は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートも組成物中に存在する場合、減少した。

マウス試験（７）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲート単独と比較したＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートの混合物の免疫原性および効力に対するアジュバントの効果を評価した。アジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、各コンジュゲート１μｇの組み合わせ物、または１μｇのＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲートの、０日目、２１日目、および３５日目における３回の投与でマウスを免疫した。新生仔をＣＪＢ１１１のＶ型株で攻撃した。結果を以下の表８に示す。

やはりまた、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する免疫応答は、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートも組成物中に存在する場合、減少した。アジュバントの添加によって生存が改善されたが、ＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲート単独へのアジュバントの添加は、この実験において、この効果がなかった。
マウス試験（８）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートの混合物の効力に対する、ＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲートの用量を増大させることの効果を評価した。アジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、各コンジュゲート１μｇの組み合わせ物の、０日目、および２１日目における２回の投与で、または１μｇのＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩコンジュゲート、およびＧＢＳ血清型Ｖコンジュゲート５μｇの組み合わせ物の、０日目、および２１日目における２回の投与で、マウスを免疫した。以下の表９に示されるように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

この実験において、混合物中のＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖に対する免疫応答は、アジュバントの添加によってやはりまた改善された。応答は、組成物中のこの莢膜糖の用量を増大させることによっても改善された。しかし、ＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖が高用量で存在すると、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ由来の莢膜糖に対する応答が低減するようであった。この結果は、アジュバントの添加によって低減された。

マウス試験（９）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートと、ＧＢＳ６７タンパク質およびＧＢＳ８０タンパク質との混合物の効力を評価した。様々な異なるアジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、組み合わせ物を用いてマウスを免疫した。以下の表１０に示したように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

この試験において、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートと、ＧＢＳ６７タンパク質およびＧＢＳ８０タンパク質との混合物を投与した後、抗体価を測定した。５つの別個の実験からの結果を以下に示す。

マウス試験（１０）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートと、ＧＢＳ６７タンパク質およびＧＢＳ８０タンパク質との混合物の効力を評価した。０日目、２１日目、および３５日目における、様々な異なるアジュバントが存在するまたはアジュバントが存在しない、組み合わせ物の３回の投与でマウスを免疫した。以下の表１１に示すように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

マウス試験（１１）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートと、ＧＢＳ６７タンパク質およびＳｐｂＩ−ＧＢＳ８０融合タンパク質との混合物の効力を評価した。アジュバントが存在する組み合わせ物を用いてマウスを免疫した。以下の表１２に示されるように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

マウス試験（１２）
この試験では、能動的母体−新生仔攻撃マウスモデルにおいて、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶコンジュゲートの効力を評価した。マウスを各コンジュゲート１μｇで免疫した。以下の表１３に示されるように、新生仔を型特異的株で攻撃した。実験を２回繰り返した。

ＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖を含むコンジュゲートは、ＧＢＳ血清型Ｉｂに加えて、ＧＢＳ血清型Ｉａに対する防御を付与した。

マウス試験（１３）
この試験では、破傷風トキソイド（ＴＴ）キャリアタンパク質またはＣＲＭ１９７キャリアタンパク質にコンジュゲートさせた莢膜糖を試験し、これらの免疫原性について比較した。水酸化アルミニウムアジュバントとともに、それぞれ１μｇのＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートの、０日目および２１日目における２回の投与で、雌ＣＤ１マウスを免疫した。以下の表１４で示されるように、新生仔を、特異的株型で攻撃した。

３つすべての血清型のＣＲＭ１９７コンジュゲートで免疫された群における生存率は、ＴＴコンジュゲートで免疫された群において観察された生存率と同等であった。これらの結果に基づいて、ＣＲＭ１９７を、さらなる開発のためのキャリアタンパク質として選択した。

マウス試験（１４）
この試験では、免疫原性に対する共有結合性コンジュゲーションプロセスの間の莢膜糖酸化のレベルの影響を評価した。いくつかのバッチのＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩコンジュゲートは、ＴＴおよび／またはＣＲＭ１９７のいずれかにコンジュゲートさせた、様々な百分率の酸化で調製した糖を用いて得られ、これらの免疫原性について雌ＣＤ１マウスにおいて試験した。水酸化アルミニウムアジュバントが存在する、３つの異なるコンジュゲートの、０日目、および２１日目における２回の投与で（各１μｇ）マウスを免疫した。以下の表１５で示されるように、新生仔を型特異的株で攻撃した。

１５〜２０％酸化された糖から調製されたコンジュゲートで雌親を免疫したとき、生存率はピークに到達した。抗体価は、機能に何ら影響することなく、酸化のレベルの増大とともに増大した。殺菌力価は、抗体価がより高くなっても増大しなかった。これらの結果および追加の実験（データを示さず）に基づいて、３つすべての血清型についてのＣＰＳ酸化の最適な百分率は、１０〜３０％の間であると定義した。

ウサギおよびラットにおける生殖毒性試験および発生毒性試験
２つの種からの結果は、胚発生または胎児発生に対する、血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートの作用がないことを示した。

ウサギにおいて、３つのコンジュゲートと水酸化アルミニウムアジュバントとの組み合わせ物を、０日目の交配に対して−３５日目、−２１日目、および−７日目（交配前期間）に、ならびに妊娠７日目および２０日目に、または妊娠７日目もしくは２０日目のみに、２０／２０／２０μｇ（各糖の質量に基づく）の臨床用量で、筋肉内注射によって投与した。処置により、任意の用量レベルにおいて、母体毒性、交配に対する作用も、胚致死性、胎児毒性、または催奇形性の証拠ももたらされなかった。

ラットにおいて、同様に、組み合わせ物が投与されたとき、母体毒性、ならびに生殖機能および胚−胎児発生に対する作用の証拠はまったくなく、３回（妊娠中のみ）または６回（妊娠前および妊娠中）の注射で、食塩水中の組み合わせ物を投与された群と、水酸化アルミニウムアジュバント中の組み合わせ物を投与された群の間で、差異はまったく認められなかった。０日目の交配に対して、−３５日目、−２１日目、および−７日目に、ならびに妊娠の６日目、１２日目、および１７日目に、または妊娠の６日目のみ、１２日目のみ、および１７日目のみに注射を与えた。離乳前期間中のＦ１世代仔の生存、臨床状態、または体重に対する作用はまったくなかった。

ヒト試験（１）
この試験では、一価ＧＢＳ血清型Ｉａ莢膜糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンを調査した。１０名の被験体の試験群に、５μｇ、１０μｇ、または２０μｇ（糖の質量として測定）の用量で、１回または２回の注射を与えた。３名の被験体および２名の被験体のプラセボ群に、それぞれ、食塩水の１回および２回の注射を与えた。スクリーニングのとき、および１回目の注射をして１カ月後に各被験体から血液を抜き取り、ＥＬＩＳＡによって分析した。さらに、試験に入って３カ月のときに、２つの注射群は、２回目の注射を受けたその時点で採血され、次いで１カ月後に再び訪れて別の採血を受けた。被験体に最後の注射をしてから６カ月後、１２カ月後、および２４カ月後にさらなる採血を実施した。

ＥＬＩＳＡは、ＧＢＳ Ｉａ（または以下に記載する試験におけるＩｂおよびＩＩＩ）莢膜糖に対する特異的抗体の濃度を測定する。マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍｌの適切なＧＢＳ糖（ＨＳＡにコンジュゲートさせた）でコーティングし、試験被験体からの血清とともに、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともに、３７℃で９０分間インキュベートし、その後、追加で３回洗浄した。基質（ｐＮＰＰ）をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＡＰは、基質の加水分解を触媒し、比色反応を生じ、これは、４０５ｎｍ（参照フィルター ６５０ｎｍ）で、ＥＬＩＳＡリーダーによって定量化することができる。抗体濃度の評価は、検量曲線を使用して行った。各群についての抗Ｉａ抗体の幾何平均濃度（μｇ／ｍｌ）の要約を、以下の表１６に示す。

全体的に、ＧＭＣデータは、ベースラインと後の時点との間に有意な増大を示し（例えば、ＧＭＣは、最後にワクチン接種してから１カ月後に６〜４３μｇ／ｍｌの範囲である）、試験に入って２４カ月の期間にわたって低下するが、群ＧＭＣは、依然としてベースラインより数倍高かった（ＧＭＲは、２４カ月で７〜１４の範囲である）。ＧＭＣ点推定によって判定すると、１回のワクチン接種として５μｇの用量を投与された群は、最後にワクチン接種をしてから１カ月後に、全体的な応答が最も高かった。

３μｇ／ｍＬ以上の抗体レベルを有する被験体の数は、最後にワクチン接種して１カ月後において、異なる用量（５用量、１０用量、および２０用量について、それぞれ２０のうち１１、１３、および１２）、ならびに異なるワクチン接種スケジュール（両方について、２０のうち１８）にわたって同様の数の「応答者」を示した（データを示さず）。５μｇ／ｍＬ以上の抗体レベルを有する被験体の百分率により、同じ観察結果が確認された（データを示さず）。これらのカットオフは、防御の潜在的な血清学的相関物との関連で応答を評価することを可能にすることが意図されている（参考文献２５２に基づく）。これらのデータは、２回目のワクチン接種、またはより高いワクチン用量のいずれかによる観察可能な寄与はまったくないことを示唆する。用量−応答がまったく観察されなかったので、５μｇ以下の用量が成人集団における最適用量となり得ると考えられる。５μｇおよび２０μｇを投与される群について、１回の注射と比較して、２回の注射を与えることから裏付けられる利点は、まったく観察されなかった。１０μｇの用量を投与される群は、１回の注射に対して、２回の注射をした後で、より高いピーク応答を示したが（ワクチン接種後１カ月において）、この傾向は、後続の（定常状態の）時点で逆転した。

安全性分析をいくつかの異なる判定基準に基づいて評価した。安全性問題は目につくことはまったくなく、用量依存応答は、まったく認められなかった。

ヒト試験（２）
この試験では、一価ＧＢＳ血清型ＩｂおよびＩＩＩ莢膜糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンを調査した。１０名の被験体（ｓｕｂｅｃｔ）の試験群に、５μｇ、１０μｇ、または２０μｇ（糖の質量として測定）の用量で、１回または２回の注射を与えた。３名の被験体および２名の被験体のプラセボ群に、それぞれ、食塩水の１回および２回の注射を与えた。スクリーニングのとき、および１回目の注射をして１カ月後に各被験体から血液を抜き取り、ＥＬＩＳＡによって分析した。さらに、試験に入って３カ月のときに、２つの注射群は、２回目の注射を受けたその時点に採血され、次いで１カ月後に再び訪れて別の採血を受けた。被験体に最後の注射をしてから６カ月後、１２カ月後、および２４カ月後にさらなる採血を実施した。各群についての抗Ｉｂ抗体および抗ＩＩＩ抗体の幾何平均濃度の要約を、以下の表１７に示す。

やはりまた、１回の注射と比較して、２回の注射を与えることからの有意な用量−応答または利点は、この小試験において観察されなかった。

安全性分析を、いくつかの異なる判定基準に基づいて評価した。安全性問題は目につくことはまったくなく、用量依存応答は、まったく認められなかった。反応原性指標（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎｄｏｃａｔｏｒ）の中で、注射部位での痛み（血清型Ｉｂについて、９８回の注射のうち１５回発生し、血清型ＩＩＩについて、９６回の注射のうち１４回発生）が、両血清型についての応答型（ｓｏｌｉｃｉｔｅｄ）局所反応における最も一般的な苦情であり、頭痛が応答型全身性反応における最も一般的な苦情であったが、プラセボを受けた個体と、ワクチン接種された個体との間の明白な差異は、まったく観察されなかった。

ヒト試験（３）
この試験では、健康な、妊娠中でない女性における、三価ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ莢膜糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンを調査した。それぞれ等比率で３種の糖を組み合わせて、２つの異なるワクチン処方物を試験した。２つの異なる用量（５μｇおよび２０μｇ、各糖の質量として測定、０．５ｍｌ中）を、アラムアジュバントあり、およびアラムアジュバントなしで試験した。上記試験では、各処方物について、１回および２回（３０日間離した）の筋肉内注射スケジュールも評価した。ワクチンは、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）４．５ｍｇ、リン酸二水素カリウム０．３４ｍｇ、およびマンニトール７．５ｍｇも含んでいた。試験群を以下の表１８に要約する。２０名の被験体を伴ったプラセボ群（３０日間離した２回の０．９％の食塩水の注射）も試験した。

スクリーニングのとき、および１回目の注射をして１カ月後に各被験体から血液を抜き取り、ＥＬＩＳＡによって免疫原性を分析した。２回注射群は、１カ月の時点で採血を受けた後、２回目の注射を受けた。試験に入って３カ月のときにおいても、すべての群から血液を抜き取った。各群についての抗Ｉａ抗体、抗Ｉｂ抗体、および抗ＩＩＩ抗体の幾何平均濃度（ベースラインの抗体濃度について調整し、プラセボ群を除外）の要約を、以下の表１９に示す。

ワクチンは、免疫原性であり、被験体の８０％〜１００％の間において、異なる血清型にわたってＧＢＳ特異的抗体の少なくとも２倍の増大を誘導した。８つの群からのＧＭＣの比較により、ａ）１回の注射のみと比較して、２回目の注射からの寄与はまったくないこと、ｂ）アジュバントなしと比較してアラムアジュバントを含めることからの寄与はまったくないこと、およびｃ）５／５／５μｇに対して、２０／２０／２０μｇのより高い用量からの寄与はまったくないことが明らかになった。

より具体的には、ＧＢＳ血清型（Ｉａ、Ｉｂ、またはＩＩＩ）のいずれに対しても、１回だけのワクチン注射を与える被験体と比較して、２回のワクチン注射を与える被験体の中で、抗体応答の一貫した増大はまったくなかった。２回目のワクチン注射の寄与のこの欠如は、用量（５／５／５μｇまたは２０／２０／２０μｇ）、または処方（アラムなし、またはアラムアジュバント）にかかわらず観察された。ＧＢＳ Ｉａについて、８つの群のそれぞれについてのＧＭＣ測定値は、試験の６１日目で７〜２０μｇ／ｍｌの範囲であった。これらの結果から、１回注射（ＧＭＣ範囲［９〜２０μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、２回注射（ＧＭＣ範囲［７〜１６μｇ／ｍｌ］）の寄与はまったく観察されなかった。さらに、１回注射対２回注射の比は、１．２［９５％ＣＩ（０．７、２．０）］であった。この結果は、１回注射対２回注射の実用上の同等性を示す（ｐ値＝０．５）。ＧＢＳ Ｉｂについて、８つの群のそれぞれについてのＧＭＣ測定値は、試験の６１日目で２〜７μｇ／ｍｌの範囲であった。１回注射（ＧＭＣ範囲［４〜７μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、２回注射（ＧＭＣ範囲［２〜５μｇ／ｍｌ］）の寄与はまったく観察されなかった。今回、１回注射対２回注射の比は、１．２［９５％ＣＩ（０．７、２．０）］であった。やはりまた、この結果は、実用上の同等性を示す（ｐ値＝０．５）。ＧＢＳ ＩＩＩについて、８つの群のそれぞれについての測定値は、試験の６１日目で５〜１３μｇ／ｍｌの範囲であった。１回注射（ＧＭＣ範囲［５〜１３μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、２回注射（ＧＭＣ範囲［５〜１１μｇ／ｍｌ］）の寄与はまったく観察されなかった。１回注射対２回注射の比は、０．９４［９５％ＣＩ（０．５５、１．６６］であり、同等性を示した（ｐ値＝０．８）。

同様に、アラムなしと比較して、アラムを含めることからのＧＭＣへの寄与はまったく追加されなかった。アラムアジュバントの寄与のこの欠如は、用量（５／５／５μｇまたは２０／２０／２０μｇ）または注射数にかかわらず観察され、３つすべての血清型（Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ）にわたって認められた。ＧＢＳ Ｉａについて、８つの群にわたるＧＭＣは、試験の６１日目で７〜２０μｇ／ｍｌの範囲であり、アラムなし（ＧＭＣ範囲［１３〜１６μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、アラムの寄与をまったく示さなかった（ＧＭＣ範囲［７〜１５μｇ／ｍｌ］）。アラム群と比較したアラムなし群についての群ＧＭＣ比は、１．６［９５％ＣＩ（０．９、２．６）］であった。これは、アラムなしの応答は、アラムありのワクチン処方物と比べて潜在的により高いことを示唆する（ｐ値＝０．１１）。ＧＢＳ Ｉｂについて、ＧＭＣは、試験の６１日目で２〜７μｇ／ｍｌの範囲であり、アラムなし（ＧＭＣ範囲［４〜７μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、アラムの寄与をまったく示さなかった（ＧＭＣ範囲［２〜４μｇ／ｍｌ］）。アラム群と比較したアラムなし群についての群ＧＭＣ比は、１．４［９５％ＣＩ（０．８、２．４）］であり、ＧＭＣ値においてほぼ同等性を意味した（ｐ値＝０．２）。ＧＢＳ ＩＩＩについて、ＧＭＣは、試験の６１日目で５〜１３μｇ／ｍｌの範囲であり、アラムなし（ＧＭＣ範囲［５〜１３μｇ／ｍｌ］（すべてがオーバーラップしている９５％ＣＩ））と比較して、アラムの寄与をまったく示さなかった（ＧＭＣ範囲［５〜１１μｇ／ｍｌ］）。アラム群と比較したアラムなし群についての群ＧＭＣ比は、１．０９［９５％ＣＩ（０．６、１．９）］であり、ＧＭＣ値においてほぼ同等性を意味した（ｐ値＝０．７）。

最後に、データは、２つの用量（コンジュゲート中の３種の糖のそれぞれの５μｇ対２０μｇ）の評価を可能にする。結果は、より高い用量（２０μｇ）が、より高い抗体応答を誘導しないことを示唆する。特に、５μｇを投与される被験体（すべての群にわたる）と２０μｇを投与される被験体（すべての群にわたる）についてのＧＭＣの比は、ＧＢＳ Ｉａについて１．２［９５％ＣＩ（０．７、２．１）］、ＧＢＳ Ｉｂについて０．７［９５％ＣＩ（０．４、１．２）］、およびＧＢＳ ＩＩＩについて１．４［９５％ＣＩ（０．９、２．５）］である。これらの比は、１に近く、１に等しいことについての統計的検定のｐ値は、３つすべての血清型について０．１５超であり、このことは、２つの用量レジメンの間で、誘導される抗体のレベルの識別できる差異がまったくないことを示唆する。

安全性は、局所的および全身性の反応原性の発生率、有害事象および重篤な有害事象、ならびに臨床検査室結果によって測定した。三価ＧＢＳワクチンは、プラセボと比較した場合、８つのワクチン試験群のすべてにおいて、安全で耐容性良好であることが判明した。安全性は、反応の重症度と一緒に、各ワクチン接種後の７日の間に起こる、応答型局所的な（すなわち、注射部位の痛み、斑状出血、紅斑、硬結、および腫張）反応、ならびに応答型全身性の（すなわち、悪寒、吐き気、倦怠感、筋肉痛、頭痛、疲労、関節痛、発疹、発熱［３８℃以上の腋窩温として定義される］、その他）反応を有する被験体の百分率；各ワクチン接種後の１日目から２３日目までに報告された他の有害事象のすべて；最大６１日目までについて、１ワクチン群当たりの、試験からの脱退をもたらす重篤な有害事象および／または有害事象が報告された被験体の百分率によって評価した。

ヒト試験（４）
試験エントリー時点で検出未満の抗体（Ａｂ）レベル（血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩについて、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、０．０８４μｇ／ｍｌ、および０．０６８μｇ／ｍｌ）を有する被験体の応答は、特に重要なものであった。このサブセット分析を、上記ヒト試験（３）からのデータで実施した。各血清型について、データを以下のように評価した。

（ａ）各注射／処方物／用量群についてのＧＭＣ、および対応する９５％ＣＩ。

（ｂ）群の割り当てにかかわらず（ｉ）１回の注射を受けるすべての被験体にわたるＧＭＣ、およびこれを、２回の注射を受けるすべての被験体のＧＭＣと比較した。同様に、アラムを投与される被験体のＧＭＣと比較したアジュバントを投与されない被験体のＧＭＣ、ならびに２０／２０／２０μｇを投与されるすべての被験体のＧＭＣと比較した５／５／５μｇの用量を投与されるＧＭＣ。評価は、計算された比のまわりの両側９５％ＣＩとともに、ＧＭＣ比に基づいた。

（ｃ）検出の最低レベル（ｌｌｄ）の半分として仮定される、ベースラインから少なくとも４倍の変化を有する被験体の比率。

一般に、女性の約２５％および５０％が、それぞれ血清型ＩＩＩおよびＩａ／Ｉｂについての検出限界未満のＡｂレベルを提示した。ベースライン（ベースライン値がｌｌｄの半分を割り当てられる場合）と比較した、６１日目におけるＡｂレベルの４倍以上の増大を達成するこのサブセット中の被験体の百分率は、６４〜９５％（血清型Ｉａ）、８０〜１００％（血清型ＩＩＩ）、および８１〜１００％（血清型Ｉｂ）の範囲である。

完全な試験コホートからの結果と同様に、試験エントリー時点で検出不可能なＡｂレベルを有する被験体はまた、２回注射（１回注射に対して）から、より高い投与量（より低い投与量に対して）から、またはアラムを含めること（アジュバントなしに対して）から追加の利点を示すことができない。すべての１回注射被験体対すべての２回注射被験体についてのＧＭＣの比（６１日目）は、１．１（０．６〜１．８；血清型Ｉａ）、０．７（０．３〜１．５；血清型ＩＩＩ）、および０．９（０．５〜１．４；血清型Ｉｂ）であり、すべての５μｇの投与量の被験体対すべての２０μｇの投与量の被験体については、１．３（０．８〜２．１；血清型Ｉａ）、１．４（０．７〜２．８；血清型ＩＩＩ）、および１．４（０．９〜２．３；血清型Ｉｂ）であり、すべてのアジュバントなしの被験体対すべてのアラムの被験体については、１．４（０．８〜２．４；血清型Ｉａ）、１（０．５〜２．０；血清型ＩＩＩ）、および１．７（１．１〜２．７；血清型Ｉｂ）であった。

マウス試験（１５）
マウスに、０日目に、ＣＲＭ１９７と水酸化アルミニウムアジュバント、または水酸化アルミニウムアジュバント単独で初回刺激し、次いで、２１日目および３５日目に、アジュバントの水酸化アルミニウムアジュバントあり、またはなしの、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ／ＣＲＭ１９７コンジュゲートで免疫した。０日目、ならびに２１日目および３５日目のワクチン接種前に血液を抜き取った。ＧＢＳ血清型ＩＩＩ多糖およびＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に対するＩｇＧ／ＩｇＭ血清力価を、血液試料から測定した。

図４に示したように、ＣＲＭ１９７キャリアで初回刺激すると、初回刺激されていないマウスと比較して、ワクチン（アジュバントあり、またはなし）を１回および２回投与した後に、キャリアに対する、有意に高いＩｇＧ抗体応答がもたらされた（Ｐ＜０．０００２）。初回刺激により、ワクチン（アジュバントあり、またはなし）を２回投与した後に、ＧＢＳ血清型ＩＩＩ多糖に対する良好な抗体応答ももたらされた。初回刺激されていないマウスは、初回刺激されたマウスにおいて観察されたものと同等の抗多糖抗体価に到達するためにアジュバントを必要とした。初回刺激されていないマウスにおいて、複合糖質ワクチンがアジュバントなしで投与されたとき、抗体価は、他の群におけるものより有意に低かった（Ｐ＜０．０３）。

したがって、ＣＲＭ１９７で初回刺激すると、アジュバントなしで投与される場合であっても、コンジュゲートのＧＢＳ莢膜糖成分に対するその後の抗体応答に対して正に影響するようである。

ラット試験およびウサギ試験
三価ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ莢膜糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンの潜在的な生殖毒性および発生毒性を評価するための試験を、ラットおよびウサギにおいて実施した。

ラット試験は、以下の表２０に従って実施した。

水酸化アルミニウムあり、またはなしで、２０μｇの用量で、試験１日目、１５日目、２９日目（交配前期間）、ならびに／または妊娠６日目、１２日目、および１７日目に、雌ラットに三価ワクチンを皮下投与しても、母体毒性および生殖機能もしくは胚胎仔の（ｅｍｂｒｙｏｆｅｔａｌ）発生に対する作用をもたらさなかった。水酸化アルミニウムアジュバントあり、または水酸化アルミニウムアジュバントなしの三価ワクチンを３回または６回注射して処置された群間で、差異はまったく認められなかった。さらに、Ｆ１世代仔の生存、臨床状態、または体重、または生殖能力に対する作用もまったくなかった。

ウサギ試験を、以下の表２１に従って実施した。

試験１日目、１５日目、および２９日目（交配前期間）、ならびに／または妊娠７日目および２０日目に、２０μｇの用量で、雌ウサギに三価ワクチンと水酸化アルミニウムを筋肉内投与しても、母体毒性、交配に対する作用も、胚致死性（ｅｍｂｒｙｏｌｅｔｈａｌｉｔｙ）、胎児毒性もしくは催奇形性の証拠ももたらさなかった。対照およびワクチンで処置された雌ウサギの成体Ｆ１世代の間の差異はまったくなかった。

これらの試験は、三価ワクチンが、免疫原性であり、妊娠中のラットもしくはウサギ、またはこれらの子孫に対する出産前や出産後の作用が全くないことを示した。

安定性試験
三価ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、およびＩＩＩ莢膜糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンの安定性を、２つの異なる温度で１カ月貯蔵する間に測定した。１０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４および３％のマンニトール中に８０μｇの糖／ｍｌで存在するそれぞれ１％の３種の複合糖質をプールすることによって、ワクチンを処方した。３ｍｌの単回用量バイアルに溶液０．３ｍｌを満たし、シリコーン処理されたブロモブチル（ｂｒｏｍｏｂｕｔｈｙｌ）ゴムストッパーで部分的にキャップし、凍結乾燥サイクルに供した。凍結乾燥プロセスが終わった後、バイアルを２〜８℃、または３６〜３８℃で貯蔵した。３６〜３８℃で貯蔵すると、遊離糖内容物のわずかな増加が検出された（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを使用）。しかし、全体的に、三価ワクチンは、２〜８℃、および３６〜３８℃の両方において、最大１カ月貯蔵した後、安定であった。

本発明は、例としてのみ記載されており、本発明の範囲および精神の範囲内に依然としてありながら改変を行うことができることが理解される。

Claims (13)

1. ａ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉａ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｂ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｉｂ由来の莢膜糖であるコンジュゲートと、ｃ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型ＩＩＩ由来の莢膜糖であるコンジュゲートとを含む免疫原性組成物であって、（ｉ）各ＧＢＳ莢膜糖が単位用量あたり５μｇ、１０μｇまたは２０μｇの量で存在し、（ｉｉ）ａ）、ｂ）およびｃ）中のキャリアタンパク質がＣＲＭ１９７であり、かつ、（ｉｉｉ）アルミニウム塩アジュバントを含有しない、免疫原性組成物。
2. 単位用量あたりの前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の量が５μｇ、５μｇおよび５μｇである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 前記ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの莢膜糖の質量比が１：１：１である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
4. ｄ）キャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＧＢＳ血清型Ｖ由来の莢膜糖であるコンジュゲートをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
5. 単回用量で投与するためのものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
6. 前記ＧＢＳ莢膜糖（複数可）が、７位、８位および／または９位のシアル酸残基のＯ−アセチル化を実質的に有さない、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
7. 筋肉内に投与するためのものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
8. （ａ）配列番号１〜３から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１〜３のうちの１または複数に対する配列同一性を有するアミ
   ノ酸配列および／もしくは（ｉｉ）配列番号１〜３の断片を含むポリペプチドをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
9. 前記コンジュゲート（複数可）を安定化するためにマンニトールを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. 医薬品として用いるためのものである、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
11. Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる疾患を予防および／または処置するためのワクチンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
12. 妊娠可能な年齢の女性、妊婦および高齢の患者から選択されるヒトに投与するためのものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. 前記組成物がジフテリアトキソイドまたはその誘導体を用いて予備免疫した患者に投与するためのものであり、前記免疫原性組成物中の少なくとも１つのコンジュゲートがＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＧＢＳ由来の莢膜糖である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。