[go: up one dir, main page]

JP5965108B2 - 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ - Google Patents

遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ Download PDF

Info

Publication number
JP5965108B2
JP5965108B2 JP2011132349A JP2011132349A JP5965108B2 JP 5965108 B2 JP5965108 B2 JP 5965108B2 JP 2011132349 A JP2011132349 A JP 2011132349A JP 2011132349 A JP2011132349 A JP 2011132349A JP 5965108 B2 JP5965108 B2 JP 5965108B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
array
dna
oligonucleotide
sequence
analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2011132349A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2011234723A (ja
Inventor
ラドジェ・ドラマナック
マシュー・ジェイ・カロウ
スネザナ・ドラマナック
ブライアン・ケイ・ハウザー
ヤン・ジョージ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Callida Genomics Inc
Original Assignee
Callida Genomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37571035&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP5965108(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Callida Genomics Inc filed Critical Callida Genomics Inc
Publication of JP2011234723A publication Critical patent/JP2011234723A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5965108B2 publication Critical patent/JP5965108B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/151—Modifications characterised by repeat or repeated sequences, e.g. VNTR, microsatellite, concatemer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/313—Branched oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/125—Rolling circle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/513—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the pattern of the arrayed oligonucleotides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/778—Nanostructure within specified host or matrix material, e.g. nanocomposite films
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/789—Of specified organic or carbon-based composition in array format
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/789—Of specified organic or carbon-based composition in array format
    • Y10S977/79—Of specified organic or carbon-based composition in array format with heterogeneous nanostructures
    • Y10S977/791—Molecular array
    • Y10S977/792—Nucleic acid array, e.g. human genome array
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y10S977/88—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure with arrangement, process, or apparatus for testing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/84—Manufacture, treatment, or detection of nanostructure
    • Y10S977/882—Assembling of separate components, e.g. by attaching

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Description

この発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号1 U01 AI057315-01の下に政府の補助を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、個別分子の集団をハイスループット解析するための方法および組成物に関し、より具体的には、単分子アレイの製作にかかわる方法および組成物、ならびにその応用、特に核酸シークエンシングおよび遺伝子解析におけるその応用に関する。
大規模分子解析は、人間においても、多くの経済的に重要な植物および動物においても、健康状態および疾患状態に関わる広範囲にわたるさまざまな生物学的現象を理解する上で、その中核をなしている（例えばCollinsら (2003), Nature, 422: 835-847；Hirschhornら (2005), Nature Reviews Genetics, 6: 95-108；National Cancer Institute, Report of Working Group on Biomedical Technology「Recommendation for a Human Cancer Genome Project」(2005年2月））。そのような解析の規模を拡大しコストを下げるには、小型化が極めて重要であることがわかっており、小型化への重要な方策として、プローブまたは分析物のマイクロアレイが使用されている。そのようなアレイは、現在利用することのできる（または現在出現しつつある）大規模遺伝子解析およびプロテオミクス技法（一塩基多型検出、コピー数算定、核酸シークエンシングなどのための技法を含む）の大半において、重要な役割を果たしている（例えばKennedyら (2003), Nature Biotechnology, 21: 1233-1237；Gundersonら (2005), Nature Genetics, 37: 549-554；PinkelおよびAlbertson (2005), Nature Genetics Supplement, 37: S11-S17；Leamonら (2003), Electrophoresis, 24: 3769-3777；Shendureら (2005), Science, 309: 1728-1732；Cowieら (2004), Human Mutation, 24: 261-271など）。しかし、そのような技法で現在使用されているマイクロアレイの規模は、例えば個人ゲノムシークエンシング、複雑な微生物群集の変化を個人または環境の健康状態の指標として使用するための環境シークエンシング（environmental sequencing）、ゲノム特徴を複雑な形質（例えば癌、糖尿病、心血管疾患などに対する罹病性）と関連づける研究などといった作業が実用的になるような、真に低コストな解析という目標を満たすために必要な規模には、今なお到達していない（例えばCollinsら（前掲）；Hirschhornら（前掲）；Tringeら (2005), Nature Reviews Genetics, 6: 805-814；Service (2006), Science, 311: 1544-1546）。
アレイベースのDNAシークエンシングスキームにおいて解析規模を拡大することは、アレイの加工寸法が分子レベルまで減少するにつれて、とりわけに困難になる。というのも、大半のスキームは、高密度アレイを形成させるための手法を必要とするだけでなく、複雑な生化学的ステップの反復サイクルも必要とし、それらがアレイの完全性、シグナル生成、シグナル検出などの問題を複雑にするからである（例えばMetzker (2005), Genome Research, 15: 1767-1776；Shendureら (2004), Nature Reviews Genetics, 5: 335-344；Weiss (1999), Science, 283: 1676-1683）。いくつかのアプローチでは非増幅ターゲット配列の高密度アレイが使用されているが、「SBS（sequencing by synthesis）」ケミストリーを使用した場合、これらのアレイは深刻なシグナル／ノイズ比問題を起こす（例えばBalasubramanianらの米国特許第6,787,308号）。他のアプローチでは、ランダムに配置されたターゲット配列のin situ増幅を使用し、続いて「SBS」ケミストリーが適用されている。そのようなアプローチも、例えば（i）ターゲット配列クラスターサイズの著しい変動、（ii）ポリメラーゼによって行われる伸長ステップにおける位相の段階的喪失、（iii）読み取り長を抑制するシークエンシングサイクル効率の欠如など、さまざまな問題を引き起こしている（例えばKartalovら, Nucleic Acids Research, 32: 2873-2879 (2004)；Mitraら, Anal. Biochem., 320: 55-65 (2003)；Metzker（前掲））。
上記を考慮すると、多数の個別分子、例えば哺乳類サイズのゲノム全体を実質的にカバーするDNAフラグメントを、単一の解析作業で並列に、効率よく簡便に解析することを可能にするような分子アレイおよびアレイイング技法を利用することができれば、医学、生命科学、および農学分野にとって好都合だろう。
一態様として、本発明は、高密度単分子アレイ、そのような組成物を作製し使用する方法、およびそのような方法を実行するためのキットを提供する。本発明の組成物は、一形態として、表面上に配置された複数の異なる単分子のランダムアレイであって、それらの単分子はそれぞれ、高分子構造および少なくとも一つの分析物を含み、各高分子構造が、表面上の一つ以上の官能基との結合を形成する能力を持つ複数の取付け官能基を含むようになっているアレイを包含する。ある態様では、分析物は高分子構造の一構成要素であり、別の態様では、分析物が高分子構造に、そのような構造上のユニークな官能基と分析物上の反応性基または取付け部分との間の結合によって取付けられる。もう一つの態様として、本発明の組成物は、表面上に配置された単分子のランダムアレイであって、それらの単分子はそれぞれ、少なくとも一つのターゲットポリヌクレオチドのコンカテマーを含み、かつそれぞれが、表面上の一つ以上の官能基とコンカテマー上の相補的官能基との間の結合によって、表面に取付けられるアレイを包含する。もう一つの形態として、本発明の組成物は、表面上に配置された単分子のランダムアレイであって、単分子がそれぞれ、少なくとも一つのターゲットポリヌクレオチドおよび少なくとも一つのアダプターオリゴヌクレオチドのコンカテマーを含み、かつそれぞれが、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドとコンカテマー中の取付けオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖の形成によって、そのような表面に取付けられるアレイを包含する。さらにもう一つの形態として、本発明の組成物は、表面上に配置された単分子のランダムアレイであって、各単分子はユニークな官能基および複数の相補的官能基を持つ二官能性高分子構造を含み、各単分子は、表面上の一つ以上の官能基と二官能性高分子構造上の相補的官能基との間の結合によって、表面に取付けられ、ユニークな官能基は、相補的官能基に対してオルソゴナルな化学反応性を持つと共に、分析物との共有結合を形成する能力を持つアレイを包含する。上記の組成物に関し、もう一つの態様では、そのような単分子が、所定の位置を持つ不連続な相隔たる領域上にランダムに分布して平面アレイ状に配置される。好ましくは、この態様においては、不連続な相隔たる領域がそれぞれ、単一の分子の捕捉しか許さない面積を持ち、かつそれぞれが、他の単分子を実質的に含まない領域間間隙によって取り囲まれる。
一態様として、本発明は、（a）表面を持つ支持体；および（b）表面に取付けられた複数のポリマー分子を含む、ポリマー分子のアレイであって、各ポリマー分子はランダムコイル状態を持ち、かつ一つ以上の線状ポリマーユニットの複数コピーの分岐構造または線状構造を含んでいて、ポリマー分子が、表面上のランダムコイルの投影像と実質的に等価な領域内で、表面に取付けられ、かつポリマー分子の少なくとも30パーセントを別々に検出することができるような密度で、ランダムに配置されるようなアレイを包含する。後により詳しく議論するように、ポリマー分子が線状である場合はいつでも、一実施形態として、上記投影像に関して「実質的に等価な」とは、そのような線状ポリマーの末端間距離の二乗平均平方根に等しい直径を持つ実質的に円形の領域を意味する。もう一つの実施形態として、線状ポリマーまたは分岐ポリマーに関して、「実質的に等価な」とは、そのポリマーの全長の半分以下、またはもう一つの実施形態として10分の1以下、またはもう一つの実施形態として100分の1以下である直径を持つ実質的に円形の領域を意味する。
もう一つの態様として、本発明は、（a）表面を持つ支持体；および（b）表面に取付けられた複数のポリヌクレオチド分子を含む、ポリヌクレオチド分子のアレイであって、各ポリヌクレオチド分子はランダムコイル状態を持ち、かつターゲット配列の複数コピーのコンカテマーを含み、ポリヌクレオチド分子が、表面上のランダムコイルの投影像に実質的に等価な領域内で、表面に取付けられ、かつポリヌクレオチド分子の少なくとも30パーセントが少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、ランダムに配置されるようなアレイを包含する。
与えられたポリマー分子のアレイを作製する方法であって、各ポリマー分子はランダムコイル状態または類似の状態または他の三次元状態を持ち、かつ一つ以上の線状ポリマーユニットの複数コピーの分岐構造または線状構造を含み、既存のポリマー分子が、表面上のランダムコイルの投影像に実質的に等価な領域内で、またはそのポリマーの全長の半分以下、10分の1以下もしくは100分の1以下であるサイズを持つ領域内で、表面に取付けられ、かつポリマー分子の少なくとも20パーセントまたは少なくとも30パーセントを別々に検出することができるような密度で、ランダムに配置されるような方法。
さらにもう一つの態様として、本発明は、（a）不連続な相隔たる領域（各不連続な相隔たる領域は、1μm2未満の面積を持ち、かつそこに取付けられた反応性官能基を含有する）の規則的アレイを有する平面状の表面を持つ支持体；および（b）表面に取付けられた複数の単分子（各単分子は、高分子構造と、取付け部分を持つ少なくとも一つの分析物とを含み、各高分子構造が、ユニークな官能基と、不連続な相隔たる領域の反応性官能基との結合を形成する能力を持つ複数の取付け官能基とを含み、分析物が、ユニークな官能基と分析物の取付け部分との間の結合によって高分子構造に取付けられるようになっている）を含む、単分子のアレイであって、複数の単分子が、不連続な相隔たる領域上に、その不連続な相隔たる領域の少なくとも過半数が単分子を一つだけ含有するように、ランダムに配置されるアレイを提供する。
もう一つの態様として、本発明は、（a）捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられている表面を持つ支持体；および（b）表面に取付けられた複数のポリヌクレオチド分子を含む、ポリヌクレオチド分子のアレイであって、各ポリヌクレオチド分子は、ターゲット配列およびアダプターオリゴヌクレオチドの複数コピーのコンカテマーを含み、ポリヌクレオチド分子は、捕捉オリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドとの間に形成される一つ以上の複合体によって、表面に取付けられるようになっており、ポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド分子の少なくとも過半数が少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、表面にランダムに配置されるアレイを提供する。この態様の一実施形態では、表面が、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域は、ポリヌクレオチド分子のサイズと等価なサイズを持ち、かつそこに取付けられた捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、実質上全てのそのような領域にポリヌクレオチド分子が多くとも一つだけ取付けられている。
さらに本発明は、ポリヌクレオチド分子のアレイを作製する方法であって、以下のステップを含む方法を包含する：（a）ソースDNAからのDNAフラグメントおよびアダプターオリゴヌクレオチドのコンカテマーをそれぞれが含む、複数のポリヌクレオチド分子を生成させるステップ；および（b）捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられている表面を持つ支持体上に、ポリヌクレオチド分子が、捕捉オリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドとの間に形成される一つ以上の複合体によって表面に固定されるように、かつポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の過半数が少なくとも50nmという最近接距離を持つような密度で、表面上にランダムに分布するように、複数のポリヌクレオチド分子を配置し、それによってポリヌクレオチド分子のアレイを形成させるステップ。
もう一つの態様として、本発明は、ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、（a）ターゲットポリヌクレオチドから複数のターゲットコンカテマーを生成させるステップ（各ターゲットコンカテマーは、ターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、上記複数のターゲットコンカテマーには、ターゲットポリヌクレオチドを実質的にカバーする数のフラグメントが含まれる）；（b）ターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを形成させるステップ；（c）各ターゲットコンカテマー中の各フラグメントの少なくとも一部の配列を同定するステップ；および（d）コンカテマーのフラグメントの各部分の配列のアイデンティティからターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を再構築するステップ、を含む方法を提供する。この態様の好ましい実施形態では、同定するステップが、（a）第1のプローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ；（b）第2のプローブセットからの一つ以上のプローブを、その一つ以上のプローブとターゲットコンカテマー上の相補的配列との間の完全にマッチした二重鎖の形成を許す条件下で、ランダムアレイにハイブリダイズさせるステップ；（c）ターゲットコンカテマーに対して、隣接した部位でハイブリダイズした、第1セットおよび第2セットからのプローブを、連結するステップ；（d）連結した第1プローブおよび第2プローブの配列を同定するステップ；ならびに（e）ターゲットポリヌクレオチドの配列を、連結したプローブの配列のアイデンティティから決定することができるまで、ステップ（a）〜（d）を繰り返すステップ、を包含する。
もう一つの態様として、本発明は、本発明のランダムアレイを作製するためのキット、および本発明のランダムアレイの応用（特に一つ以上のターゲットポリヌクレオチドのハイスループット解析）を実行するためのキットを包含する。
本発明は、ターゲット分析物分子を組み込むことまたは取付けておくことができる線状および/または分岐ポリマー構造を含む単分子のアレイを提供することにより、マイクロアレイ分野に著しい進歩をもたらす。ある形態では、そのような単分子が、哺乳類サイズのゲノムの高効率高分解能解析（例えば、そのようなゲノムの全部または実質的部分の配列決定、複数のゲノムの選択した領域からのタグ付フラグメントの配列決定、遺伝子発現のデジタルリードアウト、およびコピー数パターン、メチル化パターン、染色体安定性、個体の遺伝的変異などのゲノムワイドな評価）を可能にする密度でアレイされたターゲットポリヌクレオチドのコンカテマーである。
本発明の方法および組成物のさまざまな実施形態を図1A〜1Iに図解する。 ポリヌクレオチド分析物のコンカテマーを生成させるためにゲノムDNAフラグメントを環状化する方法を図2A〜2Bに図解する。 大腸菌フラグメントのコンカテマーが配置されているガラス表面の画像。 オリゴヌクレオチドプローブを使って選択的に標識される、二つの異なる生物に由来するコンカテマーの画像。 特異的ライゲーションプローブによってそのそれぞれが同定される、縮重塩基を含有するDNAフラグメントのコンカテマーの画像。 特異的プローブによってそのペアが同定される、縮重塩基のセグメントを含有するDNAフラグメントのコンカテマーの画像。 酵素的ミスマッチ検出を使って基準配列と試験配列との間の配列の相違を同定し、そこからDNAサークルを構築するためのスキーム。 酵素的ミスマッチ検出を使って基準配列と試験配列との間の配列の相違を同定し、そこからDNAサークルを構築するためのもう一つのスキーム。
本発明の実施には、別段の表示がない限り、当業者の技量の範囲を超えない有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技法および記述を使用する。そのような通常の技法には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、およびラベルを用いるハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技法の具体例は後述の実施例に見ることができる。ただし、他の等価な通常の技法も、もちろん使用することができる。そのような通常の技法および記述は、標準的実験マニュアル、例えば「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」(I〜IV巻)、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、「Cells: A Laboratory Manual」、「PCR Primer: A Laboratory Manual」および「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（いずれもCold Spring Harbor Laboratory Press刊）、Stryer, L. (1995)「Biochemistry」（第4版、Freeman、ニューヨーク）、Gait「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」（1984、IRL Press、ロンドン）、NelsonおよびCox (2000)「Lehninger, Principles of Biochemistry」（第3版、W.H.Freeman Pub.、ニューヨーク州ニューヨーク）、ならびにBergら(2002)「Biochemistry」（第5版、W.H.Freeman Pub.、ニューヨーク州ニューヨーク）などに見出すことができ、これらは全て、あらゆる目的で、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
本発明は、分子（特にDNAフラグメント、例えばゲノムDNAフラグメント）の集団を大規模パラレル解析するためのランダム単分子アレイを提供する。一般に、本発明の単分子は、取付け部分および分析物部分を含む。取付け部分は、表面（特に、その表面または取付けられた分析物から生成するシグナルが濃縮されるように、表面上のコンパクトな面積または限られた面積）への多価取付けに対応する、高分子構造を含む。すなわち、高分子構造は表面のコンパクトかつ限定された領域を占有する。本発明の高分子構造はさまざまな方法で表面に結合させることができる。多価結合は共有結合でも非共有結合でもよい。非共有結合には、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドと高分子構造中の相補的配列との間の二重鎖の形成、および引力的非共有結合相互作用、例えばファンデルワールス力、水素結合、イオン相互作用および疎水相互作用などによる表面への吸着が含まれる。多価共有結合は、後に詳述するように、高分子構造中の複数の相補的官能基と反応することができる反応性官能基を表面上に用意することによって、達成することができる。分析物部分は、ユニークな結合を使って高分子構造に取付けることができるか、または高分子構造と一体化して高分子構造の一部分を形成することができる。本発明の単分子は、通常は溶液から、支持材料の表面上にランダムに配置される。したがって、ある態様では、単分子が、ポアソン分布に非常に近い形で、表面上に均一に分布する。もう一つの態様では、単分子は、不連続な相隔たる領域を含有する表面上に配置され、単分子はそれらの領域に取付けられる。好ましくは、高分子構造、製造方法、およびそのような不連続な相隔たる領域の面積は、実質上全てのそのような領域が単分子を多くとも一つだけ含有するように選択される。好ましくは、本発明の単分子、特にコンカテマーは、表面上でほぼランダムコイルコンフィギュレーションをとり、不連続な相隔たる領域の面積に閉じこめられる。ある態様では、不連続な相隔たる領域が、規則的アレイ中に、直線的（rectilinear）パターン、六角形パターンなどに対応しうる所定の位置を持つ。そのような領域の規則的アレイは、解析中にアレイから収集されるシグナルの検出およびデータ解析にとって好都合である。また、不連続な相隔たる領域の限られた面積に閉じこめられた単分子は、（解析作業に蛍光プローブを使用する場合は特に）より濃縮されたシグナルまたはより強いシグナルを与え、その結果、シグナル／ノイズ値を高める。本発明の単分子は、不連続な相隔たる領域上に、ある与えられた領域が通常は同様の確からしさで異なる単分子のいずれかを受け取るように、ランダムに分布する。言い換えると、結果として生じるアレイは、製作直後は、空間的にアドレス可能（spatially addressable）ではないが、同定またはデコーディング作業を行うことによって、空間的にアドレス可能にすることができる。すなわち、単分子のアイデンティティは識別可能であるが、わかっているわけではない。後に詳述するように、いくつかの実施形態では、不連続な相隔たる領域のサブセットであって、例えば捕捉オリゴヌクレチドおよびアダプターオリゴヌクレオチドの相補的配列によって規定されるような、対応するサブセットからの単分子しか受け取らないものが存在する。
本発明の高分子構造は、ポリマー（分岐ポリマーまたは線状ポリマー）を含み、合成物（例えば分岐DNA）でもよいし、天然源に由来するもの（例えば患者のゲノムDNAから得られる線状DNAフラグメント）であってもよい。通例、高分子構造は、合成物であっても、天然源に由来するものであって、両者の組み合わせであってもよい線状一本鎖DNAフラグメントのコンカテマーを含む。本明細書で使用する「ターゲット配列」という用語は、合成核酸または天然源（例えば患者標本など）由来の核酸を指す。通例、ターゲット配列は、本発明の方法によって（例えばRCRによって）生成させたコンカテマーの一部分であるが、他の構造、例えばデンドリマー、および他の分岐構造などの一部であってもよい。ターゲット配列が合成物であるか天然源に由来する場合、それらは通例、本発明の高分子構造または単分子を形成させる過程において、さまざまな方法によって複製される。そのような方法はコピー中にエラーを導入する場合があるが、それでもなお、それらは「ターゲット配列」という用語に包含されると理解される。
高分子構造の個々の特徴または構成要素は、個々の実施形態におけるさまざまな設計目標を満たすように選択することができる。例えば、いくつかの実施形態では、例えばユニークな結合の一部として非可撓性分子スペーサーを設けることなどによって、分析物分子を表面からできる限り遠くに保っておくことが有利になりうる。もう一つの例として、一つの不連続な相隔たる領域に複数の高分子構造が取付けられるのを効果的に防ぐサイズを持つように、反応性官能基を選択することもできる。さらにもう一つの例として、例えば溶解度を高めること、水素結合による二次構造の形成を促進することなどとといった他のさまざまな目的で、高分子構造に他の官能基を設けることもできる。
ある態様では、高分子構造が十分に大きく、そのサイズ、例えば通常の生理食塩溶液中で占める体積の長さ寸法（直径など）は、不連続な相隔たる領域のサイズとほぼ等価である。線状ポリヌクレオチドである高分子構造の場合、一態様として、サイズは数千ヌクレオチド（例えば10,000）から数十万ヌクレオチド（例えば10万〜20万）の範囲に及びうる。後に詳述するように、いくつかの実施形態では、環状DNAを生成させてから、それらをローリングサークル複製反応で複製して、環状DNAの相補鎖のコンカテマーを形成させることによって、そのような高分子構造が作製される。
図1A〜1Gに模式的に示す実施形態で、上述の概念を、より詳しく説明する。これらの図面を説明した後、本発明の諸要素をさらに詳しく開示し、実施例を挙げる。上述のように、ある態様では、本発明の高分子構造が、ターゲット配列またはターゲットフラグメントのコンカテマーを含む一本鎖ポリヌクレオチドである。特に、そのようなポリヌクレオチドは、ターゲット配列およびアダプターオリゴヌクレオチドのコンカテマーであることができる。例えば、ソース核酸（1000）を処理（1001）して、好ましくは50〜600ヌクレオチド、より好ましくは300〜600ヌクレオチドの範囲の一本鎖フラグメント（1006）を形成させ、次にそれらをアダプターオリゴヌクレオチド（1004）に連結して、アダプター-フラグメントコンジュゲートの集団（1002）を形成させる。ソース核酸（1000）は、通常の技法を使って試料から抽出されたゲノムDNA、または通常の技法によって作成されたcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー、または合成DNAなどであることができる。処置（1001）は普通、例えば化学的断片化、酵素的断片化、または機械的断片化などといった通常の技法による断片化と、それに続く変性による、一本鎖DNAフラグメントの作成を伴う。この例では、アダプターオリゴヌクレオチド（1004）を使って、図2Aに図解する方法により、DNAサークルの集団（1010）を形成させる（1008）。ある態様では、集団（1010）の各メンバーが、同一のプライマー結合部位を持つアダプターと、ソース核酸（1000）に由来するDNAフラグメントとを有する。アダプターは、他の機能的要素、例えば限定するわけではないが、タグ付け配列、取付け配列、パリンドローム配列、制限部位、官能化配列などを持っていてもよい。別の実施形態として、異なるプライマー結合部位を持つアダプターを用意することにより、DNAサークルのクラスを作り出してもよい。DNAサークル（1010）を形成させた後、プライマーおよびローリングサークル複製（RCR）試薬を加えることにより、通常のRCR反応で、アダプターオリゴヌクレオチドおよびDNAフラグメントの相補鎖のコンカテマー（1015）の集団（1012）を生成させる（1011）ことができ、次に、その集団を、通常の分離技法で単離することができる。あるいは、考えうる配列を全て含有する混合物から、またはサークルが合成物である場合には、サークル複製用の選択された配列を持つオリゴヌクレオチドの限られた混合物から、短いオリゴヌクレオチド（例えば6マー）の逐次ライゲーションによって、RCRを実行してもよい。また、ターゲット分子の始まりと終わりの両方に相補的なブリッジングテンプレートDNAの存在下でターゲットDNAのライゲーションを行うことによって、コンカテマーを生成させることもできる。異なるターゲットDNAの集団を、対応するブリッジングテンプレートの混合物によって、コンカテマーに変換することができる。次に、単離されたコンカテマー（1014）を、支持体表面（1018）上に配置して（1016）、単分子のランダムアレイを形成させる。取付けが不完全な単分子または先の製造ステップからくる他の試薬類であってその存在が望ましくないものまたは表面（1018）に非特異的に結合するものを除去するために、取付けには、さまざまなストリンジェンシーの洗浄ステップも含まれうる。コンカテマー（1020）は、共有結合および非共有結合を含むさまざまな技法によって、表面（1018）に固定することができる。一実施形態として、アダプターオリゴヌクレオチドのセグメント（例えばプライマー結合部位または他の要素）との複合体（例えば二本鎖二重鎖）を形成する捕捉オリゴヌクレオチドを、表面（1018）に取付けておくことができる。別の実施形態として、アダプターオリゴヌクレオチドとの三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドクランプなどの構造を、捕捉オリゴヌクレチドが含んでもよい（Gryaznovらの米国特許第5,473,060号）。もう一つの実施形態として、例えばマイクロアレイにcDNAを取付けるために用いられる技法と同じ技法により、コンカテマー上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する反応性官能基を、表面（1018）が持っていてもよい（例えばSmirnovら (2004), Genes, Chromosomes & Cancer, 40: 72-77；Beaucage (2001), Current Medicinal Chemistry, 8: 1213-1244；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。疎水表面、例えば低濃度のさまざまな反応性官能基（例えば-OH基）を持つ清浄なガラス表面に、長いDNA分子（例えば数百ヌクレオチド以上）を効率よく取付けることもできる。DNAフラグメントのコンカテマーは、表面への配置後に、in situで、さらに増幅することができる。例えば配置後に、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによってアダプター配列中の制限部位を再構成させることにより、コンカテマーを切断し、次に、そのフラグメントを後述のように環状化し、RCR反応によって、in situで増幅させる。
図1Bに、単分子（例えば一本鎖ポリヌクレオチド）のランダムアレイの表面の一片（1102）を図解する。そのような分子は、通常の条件（例えばTE、SSC、SSPEなどの通常のDNAバッファー、室温）下で、約100〜300nmの直径を持つ溶液中の球状容積をほぼ満たすランダムコイルを形成し、その直径は、当業者には周知の形で、DNAのサイズおよびバッファー条件に依存する（例えばEdvinsson「On the size and shape of polymers and polymer complexes」Dissertation 696 (University of Uppsala, 2002)）。ランダムコイルポリマー（例えば一本鎖DNA）のサイズの一尺度は、末端間距離の二乗平均平方根であり、これは大雑把に言ってランダムコイル状構造の直径の尺度である。本明細書において「ランダムコイル直径」というそのような直径は、例えばZetasizer Nano System（Malvern Instruments、英国）などの装置を使って、光散乱法で測定することができる。本発明の高分子構造の他のサイズ尺度には、分子量（例えばダルトンで表したもの）、および総ポリマー長（分岐ポリマーの場合、これはその分枝の全ての長さの和である）が含まれる。表面に取付けると、取付けケミストリー、結合の密度、表面の性質などに依存して、一本鎖ポリヌクレオチドは、平均して、ランダムコイルコンフィギュレーションのコンカテマーの直径にほぼ等しい直径（1110）を持つ破線の円（1108）によって規定される領域（1107）によって区切られる扁平なスフェロイド状容積を満たす。言い方を変えると、一態様として、高分子構造（例えばコンカテマーなど）は、表面（1102）上へのそのランダムコイル状態の投影像に実施的に等価な領域（例えば破線の円（1108）で図示される領域）内で、表面（1102）に取付けられる。高分子構造が占める面積は変動しうるので、いくつかの実施形態では、予想面積が、投影像（1108）の面積の2〜3倍から、そのような面積の小部分（例えば25〜50パーセント）までの範囲内に含まれうる。どこか他の項で言及するように、表面上にコンパクトな形態の高分子構造を保つことにより、高分子構造またはコンカテマーの構成要素に特異的なプローブ（例えば蛍光標識オリゴヌクレオチド）に、より強いシグナルを生じさせることが可能になる。領域（1107）の直径（1110）および単分子を含有する最近接領域までの距離（1106）は、アレイの製作において重要な二つの量である。表面上の単分子の近接性を測定するには、領域（1107）の中心間距離、領域（1007）のエッジ間距離など、さまざまな距離測定基準を使用することができる。ここでは、通例、中心間距離を使用する。本発明のアレイを製作する場合、これらのパラメータの選択は、一つには、解析工程で使用するシグナル生成系およびシグナル検出系に依存する。一般的には、分子の少なくとも20パーセント、または少なくとも30パーセント、または少なくとも40パーセント、または少なくとも過半数を、使用するシグナル生成系およびシグナル検出系で個別に解像することが可能になるような単分子の密度を選択する。ある態様では、単分子の少なくとも70パーセントを個別に解像することが可能になるような密度が選択される。ある態様では、走査型電子顕微鏡を、例えば金ナノ粒子ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合（例えばNieら (2006), Anal. Chem., 78: 1528-1534；これは参照により本明細書に組み入れられる）はいつでも、単分子の少なくとも過半数が50nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され；またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは100nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。もう一つの態様では、光学顕微鏡を、例えば蛍光ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が200nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され；またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは200nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。さらにもう一つの態様では、光学顕微鏡を、例えば蛍光ラベルを持つ分子特異的プローブと共に使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が300nm以上の最近接距離を持つように、密度が選択され；またもう一つの態様では、単分子の少なくとも70パーセントは300nm以上、または400nm以上、または500nm以上、または600nm以上、または700nm以上、または800nm以上の最近接距離を持つことが保証されるように、そのような密度が選択される。さらにもう一つの実施形態では、光学顕微鏡を使用する場合はいつでも、単分子の少なくとも過半数が、その顕微鏡の最小特徴解像力（minimal feature resolution power）の少なくとも2倍の最近接距離を持つように、密度が選択される。もう一つの態様では、別々に検出することができるポリマー分子の密度が、1μm2あたり少なくとも1000、または1μm2あたり少なくとも10,000、または1μm2あたり少なくとも100,000になるように、本発明のポリマー分子が表面上に配置される。
図1Cの特定実施形態を例示する本発明のもう一つの態様では、ランダムに配置される単分子の密度を、望ましい最近接距離が確保されるように選択する要件が、単分子を取付けるための実質上唯一の部位である不連続な相隔たる領域を表面上に設けることによって、取り除かれる。すなわち、そのような実施形態では、不連続な相隔たる領域の間にある表面上の領域（本明細書ではこれを「領域間部分」という）が、コンカテマーまたは他の高分子構造がそのような領域には結合しないという意味で、不活性である。いくつかの実施形態では、そのような領域間部分をブロッキング剤（例えばコンカテマーDNAとは無関係なDNA、他のポリマーなど）で処理することができる。図1Aの場合と同様に、ソース核酸（1000）を断片化し、環状化（1010）のためにアダプターを付加（1002）し、次に、RCRによってコンカテマーを形成させる（1012）。次に、表面（1120）の設計および製作によって決定される最近接距離（1124）をそれぞれに持つ不連続な相隔たる領域（1122）の規則的アレイを有する表面（1120）に、単離されたコンカテマー（1014）を適用する。後に詳述するように、捕捉オリゴヌクレオチドまたは反応性官能基で誘導体化するためのミクロン寸法およびサブミクロン寸法を持つ不連続な相隔たる領域（1122）のアレイは、電子線リソグラフィー、ナノインプリント技術、フォトリソグラフィーなどの、通常の半導体製作技法を使って製作することができる。一般に、単分子を表面（1120）に適用した時に実質上全ての領域（1122）が一つを超える単分子によって占有されないように、不連続な相隔たる領域（1122）の面積は、取付けケミストリー、使用する高分子構造などと共に、本発明の単分子のサイズに一致するように選択される。不連続な相隔たる領域一つにつき一つだけの単分子を持つ可能性は、反応性官能基または捕捉オリゴヌクレオチドの密度を、そのような部分が単分子上の各々の相補鎖よりも少なくなるように選択することによって、増加させることができる。そうすることで、単分子は、ある特定の不連続な相隔たる領域における表面への結合を全て「占有」することになり、その結果として、第2の単分子が同様に同じ領域に結合する機会を減少させる。特に、ある実施形態では、不連続な相隔たる領域中の捕捉オリゴヌクレオチドの実質上全てが、単一の高分子構造上のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ある態様では、不連続な相隔たる領域が、単分子の相補的官能基またはアダプターオリゴヌクレオチドの数の約10パーセント〜約50パーセントであるような数の反応性官能基または捕捉オリゴヌクレオチドを含有する。捕捉オリゴヌクレオチドの長さおよび配列は、幅広く変動することができ、周知の原理に従って選択することができる（例えばWetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227-259 (1991)；Hamesら編「Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード、1985）の第1章（BrittenおよびDavidson））。ある態様では、捕捉オリゴヌクレオチドの長さが6〜30ヌクレオチドの範囲にあり、もう一つの態様では、8〜30ヌクレオチド、または10〜24ヌクレオチドの範囲にある。捕捉オリゴヌクレオチドの長さは、(i）表面への高分子構造の効果的な結合をもたらし、その結果として、解析作業のステップ（例えば洗浄など）中に起こる高分子構造の損失が最小限に抑えられるように、かつ（ii）（分析物分子がコンカテマー中のDNAフラグメントである場合は特に）分析物分子における解析作業との干渉が回避されるように、選択される。（i）に関し、ある態様では、ストリンジェントな洗浄でも解離しないほど十分に安定な二重鎖が捕捉オリゴヌクレオチドとそれらの相補鎖との間に得られるように、配列および長さを選択する。(ii）に関し、DNAフラグメントがある特定の生物種に由来する場合は、データベースが利用可能であるなら、それを使って、そのDNAフラグメントと偽ハイブリッドまたは望ましくないハイブリッドを形成するかもしれない潜在的捕捉配列を選別することができる。捕捉オリゴヌクレオチドの配列を選択する際の他の因子は、プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドタグなどを選択する際に考慮される因子と類似しており、それらについては、後に「定義」の項で言及する参考文献からもわかるように、十分な手引きがある。いくつかの実施形態では、不連続な相隔たる領域が2種類以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、異なる捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれが異なる長さおよび異なる配列を持つこともできる。不連続な相隔たる領域の規則的アレイを使用する実施形態の一側面では、最近接領域にある捕捉オリゴヌクレオチドの配列が異なる配列を持つように、捕捉オリゴヌクレオチドの配列を選択する。直線的アレイの場合は、配列タイプが交互する列によって、そのような構成が達成される。別の実施形態では、表面が、不連続な相隔たる領域のサブアレイを複数持ち、異なるサブアレイのそれぞれが、他のサブアレイとは異なる別個のヌクレオチド配列を持つ捕捉オリゴヌクレオチドを持っていてもよい。複数のサブアレイには、2個のサブアレイ、または4個以下のサブアレイ、または8個以下のサブアレイ、または16個以下のサブアレイ、または32個以下のサブアレイ、または64個以下のサブアレイが含まれうる。さらに別の実施形態では、表面が5000個以下のサブアレイを含みうる。ある態様では、表面基の望ましくない影響または捕捉オリゴヌクレオチドもしくは他の試薬との相互作用を最小限に抑えるために、マイクロアレイで行われるのと同様に、捕捉オリゴヌクレチドが、スペーサー分子（例えばポリエチレングリコールなどの不活性鎖）によって、アレイの表面に取付けられる。
ある態様では、不連続な相隔たる領域（1122）の面積が1μm2未満であり；もう一つの態様では、不連続な相隔たる領域（1122）の面積が0.04μm2〜1μm2の範囲にあり；さらにもう一つの態様では、不連続な相隔たる領域（1122）の面積が0.2μm2〜1μm2である。もう一つの態様では、不連続な相隔たる領域の形状がほぼ円形または正方形であり、その結果、それらのサイズを単一の長さ寸法で示すことができる場合に、そのような領域のサイズが、125nm〜250nmの範囲、または200nm〜500nmの範囲にある。ある態様では、最も近接した領域（1122）の中心間距離が0.25μm〜20μmの範囲にあり；もう一つの態様では、そのような距離が1μm〜10μmの範囲、または50〜1000nmの範囲にある。ある態様では、領域（1120）を、表面（1018）上に、領域（1122）が所定の位置を持つような事実上任意のパターンで、すなわち、シグナル収集およびデータ解析機能の効率を高める任意の規則的アレイに、整列させることができる。そのようなパターンには、領域（1122）の同心円、らせんパターン、直線的パターン、六角形パターンなどが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましくは、領域（1122）を直線的パターンまたは六角形パターンに整列させる。
図1Dに図解するように、一定の実施形態では、ソース核酸（1200）から製造されるDNAサークルが、アダプターオリゴヌクレオチドを含まなくてもよい。先と同様に、ソース核酸（1200）を断片化し、変性させること（1202）により、好ましくは約50〜600ヌクレオチドのサイズ範囲、より好ましくは約300〜約600ヌクレオチドのサイズ範囲の一本鎖フラグメントの集団（1204）を形成させ、次に、CircLigase（Epicentre Biotechnologies、ウィスコンシン州マディソン）などの環状化リガーゼを使った非テンプレート駆動型の反応で、それらを環状化する。DNAサークル（1206）の形成後に、選ばれた配列に結合するプライマーの混合物を用意することにより、コンカテマーを生成させる。プライマーの混合物は、DNAサークル（1206）の総数のサブセットだけがコンカテマーを生成するように選択することができる。コンカテマーを生成させた後（1208）、それらを単離し、表面（1210）に適用することにより、本発明のランダムアレイを形成させる。
上述のように、本発明の単分子は取付け部分および分析物部分を含み、その取付け部分が、表面へのその単分子の多価取付けをもたらす高分子構造を含むようになっている。図1Eに図解するように、高分子構造は、反応中のDNAサークルが合成物であるRCR反応によって作製されるコンカテマーであってもよい。次に、コンカテマー上のユニークな官能基を使って、単分子の分析物部分を取付ける。事実上どんな配列の合成DNAサークルでも、周知の技法を使って、数百ヌクレオチド（例えば200ヌクレオチド）までのサイズであれば簡便に、また、難しくはなるが、何百ヌクレオチドもの（例えば500ヌクレオチドまでの）サイズでも、作成することができる（例えばKoolの米国特許第5,426,180号；Dolinnayaら (1993), Nucleic Acids Research, 21: 5403-5407；Rubinら (1995), Nucleic Acids Research, 23: 3547-3553など；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。プライマー結合部位（1301）を含む合成DNAサークル（1300）を、PCR反応（1306）でプライマー（1302）と組み合わせることにより、コンカテマー（1308）を作成する。通例、この実施形態では、すべてのサークルが同じ配列を持つが、例えばコンカテマーのサブセットを、アレイの予め選択した領域に、相補的な取付け部分（例えばアダプター配列と捕捉オリゴヌクレオチド）を使って誘導するために、異なる配列を使用することもできる。分析物上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する能力を持つ官能基（1304；「R」と呼ぶ）をその5'末端に持つプライマー（1302）を合成する。代表的官能基には、市販の化学薬品（例えばGlen Research）を使って取付けることができるアミノ基、スルフヒドリル基などがある。コンカテマー（1308）を表面（1310）に適用してアレイ（1314）を形成させた後、取付け部分を持つ分析物（1312）をアレイ（1310）に適用すると、ユニークな官能基R（1311）と取付け部分（1312）との反応により、コンカテマーとの結合が形成される。あるいは、アレイ（1310）への適用に先だって、取付け部分とユニークな官能基とが反応して結合を形成できるようにコンカテマー（1308）を分析物（1312）と混合した後、得られたコンジュゲートをアレイ（1310）に適用してもよい。コンカテマー（1308）と多くの分析物クラスとを連結するための適当な取付け部分およびユニークな官能基の選択については、文献に豊富な手引きがある。一態様として、タンパク質またはペプチド分析物をコンカテマーに連結するために、多くのホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬が市販され（例えばPierce）、参照により本明細書に組み入れられるHermanson「Bioconjugate Techniques」（Academic Press、ニューヨーク、1996）などの文献に開示されている。例えば、ユニークな官能基がアミノ基である場合はいつでも、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン（SMPT）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB）、スクシンイミジル6-((ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノエート（SIAX）などの試薬を使って、コンカテマー（1308）を分析物上のスルフヒドリル基に連結することができる。分析物上の適切な相補的官能基には、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボニル基などがあり、これらは分析物上に天然に存在する場合もあるし、適切なホモ二官能性またはヘテロ二官能性試薬との反応によって付加することもできる。分析物分子は、非共有結合、例えばビオチン-ストレプトアビジン結合、複合体（例えばコンカテマーに取付けられた第1オリゴヌクレオチドと分析物に取付けられたまたは分析物の一部を形成している相補的オリゴヌクレオチドとの二重鎖）の形成などの結合を使って、高分子構造に取付けることもできる。分析物には、核酸（例えばDNAまたはRNAフラグメント）、多糖、タンパク質などの生体分子が含まれる。
上述のように、本発明の高分子構造は、線状ポリマー、例えばDNAフラグメントのコンカテマーに加えて、分岐ポリマーも含みうる。代表的な分岐ポリマー構造を図1Fおよび1Gに図解する。図1Fには、主鎖ポリヌクレオチド（1400）と複数の分枝ポリヌクレオチド（1402）とを含む分岐DNA構造が図解されている。この分岐DNA構造において、前記複数の分枝ポリヌクレオチドは、それぞれがその5'末端によって主鎖ポリヌクレオチド（1400）に接続されて、主鎖ポリヌクレオチド（1400）上の単一の5'末端（1404）以外は全て3'である末端を持つ櫛状の構造を形成しており、その単一の5'末端はユニークな官能基を持つように誘導体化される。後述するように、そのようなユニークな官能基は反応性化学基（例えば保護されたまたは保護されていないアミン、スルフヒドリルなど）であってもよいし、それに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを有する分析物を捕捉するためのユニーク配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、そのようなユニークな官能基は、例えばビオチンなどの捕捉部分であってもよい。そのような分岐DNA構造は、公知の技法を使って合成される（例えばGryaznovの米国特許第5,571,677号；Urdeaらの米国特許第5,124,246号；Seemanらの米国特許第6,255,469号など；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。そのような高分子構造がポリヌクレオチドである場合はいつでも、その構成要素の配列を自己集合が容易になるように選択するか、あるいはそれらを専用の連結ケミストリー（例えば以下に開示するもの）を使って連結することができ、その場合は、他の因子（例えば、いくつかの実施形態では、自己アニーリングの回避、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドへの容易な結合など）に基づいて、配列が選択される。図1Gには、デンドリマー構造が図解されている。このデンドリマー構造はオリゴヌクレオチド（1406）を含み、それが、それぞれに二つの官能基（1410；「R」で示す）を持つ複数の三価連結基（1408）で誘導体化される。さらに、それらの官能基により、追加ポリマー（1407）（例えばポリヌクレオチド）を取付けて、オリゴヌクレオチド（1406）への結合を形成させ、その結果として高分子構造（1409）を形成させることができる。そしてまた、それを多価リンカーで同様に誘導体化すれば、核酸デンドリマーを形成することができる。オリゴヌクレオチド用の三価リンカー（1408）は、Iyerらの米国特許第5,916,750号に開示されており、この特許は参照により本明細書に組み入れられる。図1Hに図解するように、そのようなデンドリマー構造または分岐構造（1411）が構築されたら、それらは、線状ポリヌクレオチドについて上述したように、アレイ（1420）に取付けることができ、その後、分析物（1430）を、ユニークな官能基（1410）によって取付けることができる。場合によっては、未反応のユニークな官能基（1422）を、通常の技法でキャッピングしてもよい。あるいは、デンドリマー構造または分岐構造（1411）を、まず分析物（1430）と、例えば溶解した状態で混合して、コンジュゲートを形成させ、次にそのコンジュゲートをアレイ（1420）上に配置する。図1Iに示すように、分析物が遊離の3'末端を持つポリヌクレオチド（1440）である場合は、その末端をin situ RCR反応で伸長させて、ターゲット配列またはさらなる付加のための他の配列のコンカテマーを形成させることができる。同様に、ポリヌクレオチド分析物は、通常の技法を使ったライゲーションによって伸長させることもできる。
ソース核酸およびターゲット配列の環状化
本発明の一態様では、高分子構造が、試料（例えば患者、経済的に重要な生物などから得られるゲノムDNAまたはcDNA）から抽出または誘導されるポリヌクレオチド分析物（すなわちターゲット配列）のコンカテマーを含む。そのような単分子を含む本発明のランダムアレイは、配列決定、SNP測定、アレルの定量、コピー数測定などを含むゲノムワイドな解析を行うのに役立つ。哺乳類サイズのゲノムの場合、好ましくは断片化を少なくとも二段階で行い、第1段階では、約100キロ塩基（Kb）〜約250キロ塩基のサイズ範囲にあるフラグメントの集団を生成させ、各100〜250Kbフラグメントに個別に適用される第2段階では、約50〜600ヌクレオチド、より好ましくは約300〜600ヌクレオチドのサイズ範囲にある、ランダムアレイ用のコンカテマーを生成させるためのフラグメントを生成させる。本発明のいくつかの態様では、断片化の第1段階を、そのようなフラグメントの予め決定されたサブセット（例えばシグナル伝達系路のタンパク質をコードする遺伝子を含有するフラグメントなど）を選択するために使用することもできる。本発明のアレイを構築するのに必要なゲノムDNAの量は広く変動しうる。ある態様では、哺乳類サイズのゲノムに関して、少なくとも10ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させ；もう一つの態様では、少なくとも30ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させ；もう一つの態様では、少なくとも60ゲノム相当のDNAからフラグメントを生成させる。
ゲノムDNAは、例えばSambrookら（前掲）1999；「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubelら編（John Wiley and Sons, Inc.、ニューヨーク、1999）などに開示されているような通常の技法を使って取得される。ゲノムDNAの単離にとって重要な因子には、以下に挙げるものが含まれる：1）DNAがDNAプロセシング酵素を含まず、塩類の混入がないこと；2）ゲノム全体を等しく表していること；および3）DNAフラグメントの長さが約5,000〜100,000bpであること。多くの場合、抽出されたDNAは消化する必要がない。なぜなら、溶解および抽出中に生じる剪断力が望ましい範囲のフラグメントを生成させるからである。もう一つの実施形態として、制限エンドヌクレアーゼを使った酵素的断片化によって、さらに短いフラグメント（1〜5kb）を生成させることができる。ある実施形態では、10〜100ゲノム相当のDNAにより、フラグメントの集団がゲノム全体をカバーすることを保証する。少量のDNAしか利用できず、例えば容器の壁などへの非特異的結合による損失の危険がある場合はいつでも、担体DNA（例えば無関係な環状合成二本鎖DNA）を用意し、それを試料DNAと混合して使用することが有利なこともある。
フラグメントを生成させる場合、どちらの段階においても、フラグメントはゲノム全体に由来してもよいし、ゲノムの選ばれたサブセットに由来してもよい。ゲノムのサブセットからのフラグメントの単離または濃縮には、参照により本明細書に組み入れられる以下の文献によって例示されるように、多くの技法を利用することができる：Kandpalら (1990), Nucleic Acids Research, 18: 1789-1795；Callowらの米国特許出願公開第2005/0019776号；Zabeauらの米国特許第6,045,994号；Deugauらの米国特許第5,508,169号；Sibsonの米国特許第5,728,524号；Guilfoyleらの米国特許第5,994,068号；Jonesらの米国特許出願公開第2005/0142577号；Gullbergらの米国特許出願公開第2005/0037356号；Matsuzakiらの米国特許出願公開第2004/0067493号など。
哺乳類サイズのゲノムの場合、ゲノムDNAの最初の断片化は、一つ以上の「稀な」切断制限エンドヌクレアーゼ（例えばNot I、Asc I、Bae I、CspC I、Pac I、Fse I、Sap I、Sfi I、Psr Iなど）を使った消化によって達成することができる。その結果生じたフラグメントは、直接使用することもできるし、あるいは既に配列決定されているゲノムの場合には、特異的フラグメントをそのような消化DNAから単離した後、図2Bに図解するような加工に使用してもよい。ゲノムDNA（230）を稀な切断制限エンドヌクレアーゼで消化（232）してフラグメント（234）を生成させた後、そのフラグメント（234）をさらに、5'一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えばλエキソヌクレアーゼ）で短時間（すなわち反応を完了させない）消化して、フラグメントの末端にある制限部位配列に隣接する配列（237）を露出させる。そのような露出させた配列は、各フラグメントにユニークであるだろう。したがって、所望のフラグメントの末端に特異的なビオチン化プライマー（241）を、単離用の捕捉オリゴヌクレオチドにアニールさせるか、あるいは、そのようなフラグメントを、捕捉部分（例えばビオチン）を持つプライマーにアニールさせ、鎖置換活性を持たないDNAポリメラーゼ（例えばTaqポリメラーゼStoffelフラグメント）で伸長させることができる。そのような伸長後は、プライマー（241）の3'末端がフラグメントの上側の鎖（top strand）（242）に接し、それらを連結することで、連続した鎖を形成させることができるようになる。鎖置換活性を持ち、上側の鎖を合成によって置き換えるDNAポリメラーゼを使って、後者のアプローチを実行することもできる。どちらのアプローチでも、次に、ビオチン化されたフラグメントを、ストレプトアビジンで誘導体化された固形支持体（239）を使って単離（240）することができる。
もう一つの態様では、ゲノムDNAテンプレートからのプライマー伸長を使って、ゲノムの関心領域を取り囲む10キロ塩基を超える選ばれた配列の線形増幅物を生成させる。例えば、所定サイズのターゲットの集団を作り出すために、フォワードプライマーを使って20サイクルの線形増幅を行った後、リバースプライマーを使った20サイクルを行う。2番目のプライマーを適用する前に、長いDNAを精製するための標準的カラムを使って最初のプライマーを除去するか、数個のウラシル塩基が組み込まれている場合には、最初のプライマーを分解する。フォワード鎖よりも多数のリバース鎖が生成して、二本鎖分子と一本鎖のリバース鎖の集団が得られる。リバースプライマーをビオチン化すれば、ストレプトアビジンビーズに捕捉することができ、これを加熱すると、捕捉されたホモ二重鎖を融解することができる。取付けられた分子は全て一本鎖で、元のゲノムDNAの一方の鎖を表すことになる。
生成した産物は、0.2〜2kbのサイズ、より好ましくは0.3〜0.6kbのサイズ（固形支持体からそれらを効果的に放出させる）に断片化し、RCR反応のために環状化することができる。図2Aに図解する環状化の一方法では、ゲノムDNA（200）を断片化し、変性した（202）後に、一本鎖DNAフラグメント（204）を、まずターミナルトランスフェラーゼで処理（206）することによって、3'末端にポリdAテール(208）を取付ける。次に、一方の末端がポリdAテールに相補的であり、かつ他方の末端が縮重ヌクレオチドのセグメントのおかげで任意の配列に相補的であるブリッジングオリゴヌクレオチド（210）を利用して、遊離末端のライゲーション（212）を分子内で行う。ブリッジングオリゴヌクレオチド（210）の二重鎖領域（214）は、少なくともRCR用のプライマー結合部位を含有し、いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドに対する相補鎖を与える配列（これは、プライマー結合部位配列と同じであっても異なってもよく、あるいはプライマー結合部位配列とオーバーラップしてもよい）を含有する。捕捉オリゴヌクレオチドの長さは広く変動しうる。ある態様では、捕捉オリゴヌクレオチドと、ブリッジングオリゴヌクレオチド中のそれらの相補鎖とが、10〜100ヌクレオチドの範囲（より好ましくは10〜40ヌクレオチドの範囲）の長さを持つ。いくつかの実施形態では、二重鎖領域（214）が、例えばオリゴヌクレオチドタグ（例えばその関連DNAフラグメントの由来源となったソース核酸を同定するためタグ）などの追加要素を含有してもよい。すなわち、いくつかの実施形態では、異なるソース核酸からサークルまたはアダプターライゲーションまたはコンカテマーを別々に製造し、その際にユニークなタグを含有するブリッジングアダプターを使用しておいて、その後に、それらを混合して、ランダムアレイを作成するためのコンカテマー製造または表面への適用に使用することができる。そのようなランダムアレイでは、コンカテマー中の対応タグ配列に相補的な標識タグをハイブリダイズさせることによって、またはアダプター全体もしくはアダプターのタグ領域を配列決定することによって、関連フラグメントを同定することができる。環状産物（218）は、通常の精製カラム、または一つ以上の適当なエキソヌクレアーゼによる非環状DNAの消化、またはその両者によって、簡便に単離することができる。
上述のように、望ましいサイズ範囲（例えば50〜600ヌクレオチド）のDNAフラグメントは、テンプレートを必要とせずに一本鎖DNAを環状化する一本鎖DNAリガーゼとして、CircLigaseなどの環状化酵素を使って、環状化することもできる。CircLigaseは、製造者の指示（Epicentre、ウィスコンシン州マディソン）に従って使用される。DNAフラグメントと一つ以上のアダプターとを含む一本鎖DNAサークルを形成させるための好ましいプロトコールは、以下に詳述するように、T4リガーゼなどの標準的リガーゼを使ってアダプターをDNAフラグメントの一端に連結し、次にCircLigaseを使ってサークルを閉じることである。
アダプターオリゴヌクレオチドとターゲット配列とを含むDNAサークルを、T4リガーゼを使って生成させるための代表的プロトコール。ターゲット配列は合成オリゴT1N（配列：5'-NNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNATCGTNCAAACGTCAGTCCANGAATCNAGATCCACTTAGANTGNCGNNNNNNNN-3'）（配列番号1）である。アダプターは二つの別々のオリゴで構成される。T1Nの5'末端につながるアダプターオリゴはBR2-ad（配列：5'-TATCATCTGGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGGACATTAACGGAC-3'）（配列番号2）であり、T1Nの3'末端につながるアダプターオリゴはUR3-ext（配列：5'-ACCTTCAGACCAGAT-3'）（配列番号3）である。UR3-extは、第2アダプターの挿入に備えてDNAサークルを線状化するための手段になるように、IIs型制限酵素部位（Acu I：CTTCAG）を含有する。BR2-adをBR2-temp（配列5'-NNNNNNNGTCCGTTAATGTCCTCAG-3'）（配列番号4）にアニールさせて、二本鎖アダプターであるBR2アダプターを形成させる。UR3-extをビオチン化UR3-temp（配列5'-[ビオチン]ATCTGGTCTGAAGGTNNNNNNN-3'）（配列番号5）にアニールさせて、二本鎖アダプターであるUR3アダプターを形成させる。1pmolのターゲットT1Nを、25pmolのBR2アダプターおよび10pmolのUR3アダプターに、50mMトリス-Cl（pH7.8）、10％PEG、1mM ATP、50mg/L BSA、10mM MgCl2、0.3単位/μlのT4 DNAリガーゼ（Epicentre Biotechnologies、ウィスコンシン州）および10mM DTTを含有する、最終体積10μlの単一のライゲーション反応で、連結する。ライゲーション反応を、15℃で11分間、37℃で1分間を18回繰り返すという温度サイクリングプログラムで、インキュベートする。70℃で10分間加熱することによって反応を停止させる。連結した産物をストレプトアビジン磁気ビーズ（New England Biolabs、マサチューセッツ州）で捕捉することにより、過剰のBR2アダプターを除去する。3.3μlの4×結合バッファー（2M NaCl、80mMトリスHCl pH7.5）をライゲーション反応に加え、次にそれを、1×結合バッファー（0.5M NaCl、20mMトリスHCl pH7.5）中のストレプトアビジン磁気ビーズ15μgと混合する。室温で15分間インキュベートした後、ビーズを4体積の低塩濃度バッファー（0.15M NaCl、20mMトリスHCl pH7.5）で2回洗浄する。溶出バッファー（10mMトリスHCl pH7.5）を70度に予熱し、そのうちの10μlをビーズに70℃で5分間加える。磁気分離後に、上清を一次精製試料としてとっておく。上記と同様にBR2-adに対して逆相補的であるビオチン化オリゴBR-rc-bio（配列：5'-[ビオチン]CTTTTGTCTTCCTAACATCC-3'）（配列番号6）を予め結合しておいた磁気ビーズを使って過剰のUR3アダプターを除去することにより、この試料をさらに精製する。最終精製試料中のアダプター-ターゲット連結産物の濃度は、尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によって見積られる。環状化は、1mM ATPおよび供給者が提供する標準バッファー中、0.2単位/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Epicentre Biotechnologies）を使って、ライゲーション産物をリン酸化することによって行われ、0.3単位/μlのT4 DNAリガーゼ（Epicentre Biotechnologies）および1mM ATPを使って、10倍モル過剰のスプリント（splint）オリゴUR3-closing-88（配列5'-AGATGATAATCTGGTC-3'）（配列番号7）で環状化される。環状化された産物は、以下に説明するRCR反応を行うことによって確認される。
ローリングサークル複製によるポリヌクレオチドコンカテマーの生成
本発明の一態様では、単分子が、通常のローリングサークル複製（RCR）反応で作成されたポリヌクレオチド（通例、ポリヌクレオチド分析物、すなわちターゲット配列）のコンカテマーを含む。RCR反応の条件および試薬を選択するための手引きは、参照により本明細書に組み入れられる以下の文献からもわかるように、当業者が利用できる数多くの文献に見出すことができる：Koolの米国特許第5,426,180号；Lizardiの米国特許第5,854,033号および同第6,143,495号；Landegrenの米国特許第5,871,921号など。一般に、RCR反応の構成要素は、一本鎖DNAサークル、DNAサークルにアニールする一つ以上のプライマー、DNAサークルにアニールさせたプライマーの3'末端を伸長するための鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および通常のポリメラーゼ反応バッファーが含まれる。そのような構成要素を、プライマーがDNAサークルにアニールし、DNAポリメラーゼによって伸長されて、DNAサークル相補鎖のコンカテマーを形成することができるような条件下で混合する。代表的なRCR反応プロトコールは以下のとおりである。50μLの反応混合物に以下の成分を集める：2〜50pmolの環状DNA、0.5単位/μLのファージφ29 DNAポリメラーゼ、0.2μg/μLのBSA、3mM dNTP、1×φ29 DNAポリメラーゼ反応バッファー（Amersham）。RCR反応を30℃で12時間行う。いくつかの実施形態では、からみ合いおよび他の分子間相互作用を避けるために、ポリメラーゼ反応における環状DNAの濃度を、低く（1mlあたり約100億〜1000億サークル、すなわち1ピコリットルあたり10〜100サークル）選択することができる。
好ましくは、RCRによって作成されるコンカテマーは、ほぼ均一なサイズである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のアレイを作製する方法が、コンカテマーをサイズ選択するステップを含みうる。例えばある態様では、集団として分子量の変動係数が約30％未満であるコンカテマーを選択し、もう一つの実施形態では約20％未満であるコンカテマーを選択する。ある態様では、極めて長いコンカテマー（例えば、ポリメラーゼによってより高速に合成されるDNAサークルが生成するもの）の存在を減少させるために、RCR反応混合物に低濃度の連鎖停止剤（例えばddNTP類）を加えることによって、サイズの均一性が、さらに改善される。ある実施形態では、50〜250Kbの範囲、または50〜100Kbの範囲の予想コンカテマーサイズをもたらすような濃度のddNTP類を使用する。もう一つの態様として、通常の分離技法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、膜濾過などを使って、特定サイズ範囲のコンカテマーを濃縮してもよい。
分岐ポリマーおよびDNAアセンブリを含む高分子構造の生成
本発明の一態様では、高分子構造が、少なくとも一つのユニークな官能基（ポリヌクレオチドの場合、これは通例、5'または3'末端の官能基である）と、固形支持体の表面の反応性官能基と特異的に反応する能力を持つ複数の相補的官能基とを持つポリマーを含む。分岐ポリマー（特に分岐ポリヌクレオチド）を含む高分子構造は、Gryaznov（前掲）、Urdea（前掲）などの文献に開示されているように、さまざまな方法で合成することができる。一態様として、本発明の分岐ポリマーには、櫛型分岐ポリマーが包含され、これは、一つ以上の分岐点が内部モノマーおよび/または連結部分に置かれた線状ポリマーユニットを含む。本発明の分岐ポリマーにはフォーク型分岐ポリマーも包含され、これは、一つまたは二つの分岐点が末端モノマーおよび/または連結部分に置かれた線状ポリマーユニットを含む。本発明の高分子構造には、一つ以上の二重鎖または三重鎖によって一つに結合された線状および/または分岐ポリヌクレオチドのアセンブリも包含される。そのようなアセンブリは、例えばGoodmanら, Science, 310: 1661-1665 (2005)；Biracら, J. Mol. Graph Model, (April 18, 2006)；Seemanらの米国特許第6,255,469号など（これらは参照により本明細書に組み入れられる）などによって開示されているように、構成要素線状ポリヌクレオチドから自己集合させうる。ある態様では、本発明の線状ポリマーユニットが、「-(M-L)n-」の形式を持つ（式中、Lはリンカー部分であり、Mは、不活性非立体障害スペーサー部分として役立つことから、他の構成要素を取付けるための分岐点として、あるいはラベルを取付けるための部位；例えばUrdeaらの米国特許第5,124,246号またはWangらの米国特許第4,925,785号に記述されているようにアンプリファイヤ（amplifier）鎖またはアンプリファイヤ構造にハイブリダイズまたは結合させるオリゴヌクレオチドまたは他の結合ポリマーを取付けるための部位；例えばWhiteleyらの米国特許第4,883,750号に記述されているように「フック（hook）」を取付けるための部位；あるいは溶解度に影響を与え、二重鎖および/または三重鎖形成を促進するための他の基（例えばインターカレーター、アルキル化剤など）を取付けるための部位として役立ちうる反応性官能基を提供することまで、さまざまな機能を提供するために、広範囲にわたるさまざまな化学構造から選択されうるモノマーである）。以下の参考文献には、本発明における使用に適したいくつかのホスホロアミダイトおよび/またはハイドロゲンホスホネートモノマーが開示されており、それらの合成およびオリゴヌクレオチドへの組み込みに関する手引きが記載されている：Newtonら, Nucleic Acids Research, 21:1155-1162 (1993)；Griffinら, J. Am. Chem. Soc., 114:7976-7982 (1992)；Jaschkeら, Tetrahedron Letters, 34:301-304 (1992)；Maらの国際出願PCT/CA92/00423；Zonらの国際出願PCT/US90/06630；Durandら, Nucleic Acids Research, 18:6353-6359 (1990)；Salunkheら, J. Am. Chem. Soc., 114:8768-8772 (1992)；Urdeaらの米国特許第5,093,232号；Ruthの米国特許第4,948,882号；Cruickshankの米国特許第5,091,519号；Haralambidisら, Nucleic Acids Research, 15:4857-4876 (1987)など。より具体的には、Mは、1〜20個の炭素原子と酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される0〜10個のヘテロ原子とを含有する直鎖状、環状、または分岐状の有機分子構造である。好ましくは、Mは、1〜16個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール；3〜8個の炭素原子と、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される1〜3個のヘテロ原子とを持つ複素環；グリコシル；またはヌクレオシジルである。より好ましくは、Mは、1〜8個の炭素原子を含有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール；グリコシル；またはヌクレオシジルである。好ましくは、Lは、リン（V）連結基であり、これは、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルまたはエチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどであることができる。一般に、ホスホロアミダイトまたはハイドロゲンホスホネート前駆体から誘導される結合は好ましいので、本発明の線状ポリマーユニットは、例えばApplied Biosystems, Inc.（カリフォルニア州フォスターシティー）モデル394などの市販自動DNA合成装置を使って、簡便に合成することができる。nは、MおよびLの性質に依存してかなり変化しうる。通例、nは約3から約100まで変化する。Mがヌクレオシドもしくはその類似体またはヌクレオシドサイズのモノマーであり、Lがリン（V）結合である場合、nは約12から約100まで変化する。好ましくは、Mがヌクレオシドもしくはその類似体またはヌクレオシドサイズのモノマーであり、Lがリン（V）結合である場合、nは約12〜約40まで変化する。ポリマーユニットは、それらの間に一つ以上の共有結合架橋を形成させることによって、アセンブルすることができる。ある態様では、一つ以上の構成要素上にあるチオール、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート基を、一つ以上の他の構成要素上にあるハロアシル-またはハロアルキル-アミノ基と反応させて、一つ以上のチオ-もしくはジチオ-ホスホリルアシルまたはチオ-もしくはジチオ-ホスホリルアルキル架橋を形成させることにより、架橋が形成される。一般に、そのような架橋は、以下に挙げる形式の一つを持つ：-NHRSP(=Z)(O-)-- または-NHRS-（式中、Rはアルキルまたはアシルであり、Zは硫黄または酸素である）。アセンブリ反応には、その実施形態に依存して2〜20個の構成要素が関与しうるが、好ましくは2〜8個の構成要素が関与し、より好ましくは2〜4個の構成要素が関与する。好ましくは、上記ハロアシルアミノまたはハロアルキルアミノ基はハロアセチルアミノ基であり、より好ましくはハロアセチルアミノ基がブロモアセチルアミノ基である。ハロアシル-またはハロアルキル-アミノ基のアシル部分またはアルキル部分は、1〜12個の炭素原子を含有し、より好ましくは、そのような部分が1〜8個の炭素原子を含有する。反応は広範囲にわたるさまざまな溶媒系で行うことができるが、一般的には、アセンブリ反応は液体水性条件下で行われるか、例えば液体水性反応混合物の温度を低下させることによって得られる氷中に凍結した状態で行われる。もう一つの選択肢として、DMSO/H2Oにおけるチオホスホリルアセチルアミノ架橋の形成が、Thuongら, Tetrahedron Letters, 28:4157-4160 (1987)およびFrancoisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 86:9702-9706 (1989)によって報告されている。典型的な水性条件には、25mM NaClおよび15mMリン酸緩衝液（pH7.0）中、4μMの反応物が含まれる。チオ-もしくはジチオ-ホスホリルアシル-またはチオ-もしくはジチオ-ホスホリルアルキル-アミノ架橋は好ましい。なぜなら、それらは、硝酸銀、ヨウ化カリウムなどの酸化剤によって、容易にかつ選択的に切断することができるからである。好ましくは、架橋のおよそ百倍モル過剰に相当する濃度のヨウ化カリウムKI3を使って、架橋を切断する。通例、KI3は約0.1Mの濃度で使用される。これらの架橋の切断が容易であることは、複雑な高分子構造の合成において、著しい利点である。というのも、それは、最終産物を解析して最終産物の構造が正しいことを確認するための簡便な方法になるからである。3'-ハロアシルまたはハロアルキル-アミノ（この例ではハロアセチルアミノ）誘導体化オリゴヌクレオチド1を、5'-ホスホロチオエート誘導体化オリゴヌクレオチド2と、以下のスキームに従って反応させる：
5'-BBB ... B-NHC(=O)CH2X＋ （1）
S-P(=O)(O-)-BBB ... B-3'→ （2）
5'-BBB ... B-NHC(=O)CH2SP(=O)(O-)O-BBB ... B-3'
［式中、Xはハロであり、Bはヌクレオチドである］。ヌクレオチドが、より一般的な上述のポリマーユニット（M-L)nの代表例に過ぎないことは、言うまでもない。化合物1は、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中のN-スクシンイミジルハロアセテートを、ホウ酸ナトリウムバッファー中の3'-アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と、室温で反応させることによって製造することができる。約35分後に、その混合物を（例えばH2Oで）希釈し、脱塩し、（例えば逆相HPLCによって）精製する。Y-アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体は、GryaznovおよびLetsinger, Nucleic Acids Research, 20:3403-3409 (1992)に記述されているように製造することができる。簡単に述べると、脱保護後に、標準的なスクシニル結合によって支持体に連結されているデオキシチミジンの5'ヒドロキシルを、ジクロロメタン/ジイソプロピルエチルアミンなどの適当な溶媒中で、クロロ-(ジイソプロピルエチルアミノ)-メトキシホスフィンとの反応により、ホスフィチル化する。テトラゾールで活性化した後、その5'-ホスフィチル化チミジンを5'-トリチル-O-3'-アミノ-3'-デオキシヌクレオシドと反応させて、ヌクレオシド部分がホスホロアミデート結合によって共有結合的に接合されているヌクレオシド-チミジン二量体を形成させる。オリゴヌクレオチドの残りの部分は、標準的なホスホロアミダイトケミストリーによって合成される。スクシニル結合を切断した後、酸処理（例えば80％酢酸水溶液、室温で18〜20時間）によってホスホロアミデート結合を切断することにより、3'末端アミノ基を持つオリゴヌクレチドを生成させる。5'-モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド2は、以下のように形成される：5'モノホスフェートを、オリゴヌクレチドの5'末端に、化学的にまたはキナーゼを使って酵素的に取付ける（例えばSambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク、1989））。好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の最終ステップとして、Eckstein編「Oligonucleotides and Analogues」（IRL Press、オックスフォード、1991）の第12章にThuongおよびAssclineが記載している、またはTetrahedron Lett., 27:4705 (1986)にHornおよびUrdeaが記載している、化学的リン酸化により（例えばClontech Labortories（カリフォルニア州パロアルト）の5'Phosphate-ON（商標）などといった市販の試薬を使って）モノホスフェートを付加する。次に、その5'-モノホスフェートを、通常の硫化剤、例えばS8の5％ピフィジン（pyfidine）/CS2溶液による処理（1：1、v/v、室温で45分間）、または米国特許第5,003,097号、同第5,151,510号、もしくは同第5,166,387号に記載されている硫化剤による処理を使って硫化する。モノホスホロジチオエートも類似の手法で製造される（例えばFroehlerらの欧州特許公開0 360 609 A2；Caruthersらの国際出願PCT/US89/02293など）。上記と同様に、5'-ハロアセチルアミノ誘導体化オリゴヌクレオチド3を、以下のスキームに従って、3'-モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド4と反応させる：
3'-BBB ... B-NHC(=O)CH2X＋ （3）
S-P(=O)(O-)O-BBB ... B-5'→ （4）
3'-BBB ... B-NHC(=O)CH2SP(=O)(O-)-BBB ... B-5'
［式中、jマーおよびkマーのヌクレオチドモノマーが反対向きである点以外、記号は上記と同意義である］。この場合、化合物3は、3'-アミノオリゴヌクレオチドについて上述したように、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中のN-スクシンイミジルハロアセテートを、ホウ酸ナトリウムバッファー中の5'-アミノデオキシリボヌクレオチド前駆体と室温で反応させることによって、製造することができる。5'-アミノデオキシヌクレオシドは、Glinskiら, J. Chem. Soc. Chem. Comm., 915-916 (1970)；Millerら, J. Org. Chem. 29:1772 (1964)；Ozolsら, Synthesis, 7:557-559 (1980)；およびAzhayevら, Nucleic Acids Research, 6:625-643 (1979)（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に従って製造される。3'-モノホスホロチオエートオリゴヌクレオチド4は、ThuongおよびAsscline（前掲）が記述しているように、製造することができる。オリゴヌクレオチド1と4および2と3を反応させて、それぞれ二つの5'末端または二つの3'末端を持つポリマーユニットを形成させてもよい。
分枝を取付けるための反応性官能基は、さまざまな部位に導入することができる。好ましくは、ポリマーユニットまたはループ上の選ばれたモノマーまたは連結部分に、アミノ官能基を導入し、次にそれを、上述のようにハロアセチルアミノ基に変換する。ヌクレオシドモノマーのアミノ誘導体化塩基は、Urdeaらの米国特許第5,093,232号；Ruthの米国特許第4,948,882号；Haralambidisら, Nucleic Acids Research, 15:4857-4876 (1987)などに教示されているように、導入することができる。Clontech Laboratories（カリフォルニア州パロアルト）からAminomodifier II（商標）として市販されている保護ヒドロキシアミンホスホロアミダイトによって、アミノ官能基を導入することもできる。好ましくは、例えばAgrawalら, Nucleic Acids Research, 18:5419-5423 (1990)；およびJagerら, Biochemistry, 27:7237-7246 (1988)に教示されているように、I2およびアルキルジアミンを使ったホスファイト結合の酸化によって、誘導体化されたホスホロアミデート結合を生成させることにより、アミノ官能基を導入する。一般に、上記の手法については、ハロアシル-またはハロアルキル-アミノ誘導体化ポリマーユニットを、ホスホロチオエート誘導体化ポリマーユニットとは別個に製造することが好ましく、そうしない場合は、ホスホロチオエート部分に保護基が必要である。
ランダムアレイを構築するための固相表面
本発明では広範囲にわたるさまざまな支持体を使用することができる。ある態様では、支持体が、表面（好ましくは、調査対象の単分子を同じ平面に置くことができるように、実質的に平面状である表面）を持つ堅い固体である。平面状という特徴は、検出光学機器による効率の良いシグナル収集を可能にする。もう一つの態様では、本発明の固形支持体が無孔性である（特に、単分子のランダムアレイが、所要体積の小さいハイブリダイゼーション反応によって解析される場合）。適切な固形支持体材料として、例えばガラス、ポリアクリルアミド被覆ガラス、セラミックス、シリカ、シリコン、石英、種々のプラスチックなどの材料が挙げられる。一態様として、平面状の表面の面積は0.5〜4cm2の範囲にあることができる。ある態様では、固形支持体が、均一にシラン処理された表面を持つ顕微鏡スライドなどのガラスまたは石英である。これは、例えば酸処理後に、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、および無水キシレン（8：1：24 v/v）の溶液に、80℃で浸漬することなど、通常のプロトコールを使って達成することができる（例えばBeattieら (1995), Molecular Biotechnology, 4: 213）。そのような表面は、例えば表面への適用に先だって捕捉オリゴヌクレオチドに3'または5'トリエチレングリコールホスホリルスペーサーを設けること（これにより、エポキシシラン化された表面が形成される）などによって（Beattieら（前掲）参照）、捕捉オリゴヌクレオチドの末端取付けが可能になるように、たやすく処理される。Beaucage（前掲）の開示からもわかるように、ガラスおよび他の表面に反応性官能基を付加するには、他にも多くのプロトコールを使用することができる。
酵素処理が必要でない場合はいつでも、捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましい性質（例えば増加した二重鎖安定性）を付与する非天然ヌクレオシド単位および/または結合を含むことができる。そのような化合物として、ペプチド核酸（PNA）、ロックト核酸（LNA）、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホロアミデート、オリゴ-2'-O-アルキルリボヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限るわけではない。
不連続な相隔たる領域のパターンが要求される本発明の実施形態では、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、およびナノプリンティングを使って、そのようなパターンを広範囲にわたるさまざまな表面上に生成させることができる（例えばPirrungらの米国特許第5,143,854号；Fodorらの米国特許第5,774,305号；Guo, (2004) Journal of Physics D: Applied Physics, 37: R123-141；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。
ある態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面を、フォトリソグラフィーによって製作する。市販の光学的に平坦な石英基板に、厚さ100〜500nmのフォトレジスト層をスピンコーティングする。次にそのフォトレジストを石英基板上に焼き締める。活性化すべき領域のパターンを持つレチクルの像を、フォトレジストの表面に、ステッパーを使って投影する。露光後に、フォトレジストを現像して、UV光源に曝された投影パターン部分を除去する。これは、プラズマエッチング（極めて微細な細部を生じることができる乾式現像技法）によって達成される。次に、残っているフォトレジストを強化するために、基板を焼き締める。焼き締め後、石英ウエハは官能化できる状態になっている。次に、そのウエハを、3-アミノプロピルジメチルエトキシシランの蒸着に付す。アミノ官能化モノマーの密度は、モノマーの濃度および基板のばく露時間を変えることにより、緻密に制御することができる。プラズマエッチング工程によって露出された石英の部分だけが、モノマーと反応し、モノマーを捕捉しうる。次に、アミノ官能化モノマーの単層を露出した石英にキュアするために、基板を再び焼き締める。焼き締め後は、残留フォトレジストをアセトンで除去することができる。レジストとシランとでは結合ケミストリーが異なるので、基板上のアミノシラン官能化部分は、アセトン洗浄でも、無傷のままであることができる。これらの部分は、それらをピリジンおよびN,N-ジメチルホルムアミドの溶液中、p-フェニレンジイソチオシアネートと反応させることによって、さらに官能化することができる。この場合、基板はアミノ修飾オリゴヌクレチドと反応する能力を持つ。あるいは、5'-カルボキシ修飾剤-c10リンカー（Glen Research）を持つオリゴヌクレオチドを製造することもできる。この技法では、オリゴヌクレオチドをアミン修飾支持体に直接取付けることができるので、追加の官能化ステップを回避することができる。
もう一つの態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面が、ナノインプリントリソグラフィー（NIL）によって製作される。DNAアレイを作成するために、一般に転写層と呼ばれるレジストの層を、石英基板にスピンコーティングする。次に、一般にインプリント層と呼ばれるもう一つのタイプのレジストを、転写層の上に塗布する。次に、マスターインプリントツールにより、インプリント層に陥凹を作る。インプリント層の総厚を、インプリントの低部が転写層に達するまで、プラズマエッチングで減少させる。転写層はインプリント層より除去しにくいので、大半が手つかずのまま残る。次にインプリント層および転写層を、加熱によって硬化させる。次に、インプリントの低部が石英に達するまで、基板をプラズマエッチャーに入れる。次に、上述のように蒸着によって基板を誘導体化する。
もう一つの態様では、複数の不連続な相隔たる領域を含有する表面を、ナノプリンティングによって製作する。この工程では、フォトリソグラフィー、インプリントリソグラフィー、または電子線リソグラフィーを使って、プリントヘッド上に要求されるフィーチャーのネガ像であるマスターモールドを作る。プリントヘッドは、通例、ポリジメチルシロキサン（PDMS）などの柔らかい可撓性ポリマーで作られている。この材料、または異なる性質を持つ材料の層を、石英基板上にスピンコーティングする。次に、モールドを使って、レジスト材料のトップ層に、制御された温度および圧力条件下で、フィーチャーを型押しする。次に、そのプリントヘッドをプラズマベースのエッチング工程に付して、プリントヘッドのアスペクト比を改善し、型押しされた材料の経時的弛緩によるプリントヘッドの歪みを除去する。均一に誘導体化された表面上にアミン修飾オリゴヌクレオチドのパターンを沈着させることにより、ナノプリンティングを使って、ランダムアレイ基板を作製する。これらのオリゴヌクレオチドは、RCR産物用の捕捉プローブとして役立つだろう。ナノプリンティングの潜在的利点の一つは、交互配置された異なる捕捉プローブのパターンをランダムアレイ支持体上にプリントできることである。これは、それぞれのヘッドが異なるパターンを持ち、全てのパターンが組み合わされて最終構造の支持体パターンを形成する、複数のプリントヘッドを使った逐次プリントによって達成されるだろう。そのような方法により、ランダムアレイ内でのDNA要素の位置符号化（positional encoding）が、いくらか可能になる。例えば、特定の配列を含有する対照コンカテマーを、ランダムアレイの全体にわたって規則的な間隔で結合させることができる。
さらにもう一つの態様では、コアおよび被覆材料を持つ約100億〜1億本の光ファイバーの束または束の束から製造されたプリンティングヘッドまたはインプリントマスターを使って、サブミクロンサイズの捕捉オリゴヌクレオチドスポットの高密度アレイを製造する。ファイバーを牽引し融合させることにより、類似するサイズまたは2〜5分の1もしくは2〜5倍のサイズを持つ被覆材料によって隔てられた約50〜1000nmのコアを持つユニークな材料が作成される。被覆材料のディファレンシャルエッチング（溶解）により、非常に数多くのナノサイズのポストを持つナノプリンティグヘッドが得られる。このプリンティングヘッドは、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的（タンパク質、オリゴペプチド、DNA、アプタマー）もしくは化学的化合物（例えばさまざまな活性基を持つシラン）を沈着させるために使用することができる。ある実施形態では、グラスファイバーツールを、パターニングされる支持体として使用して、オリゴヌクレオチドまたは他の生物学的もしくは化学的化合物を沈着させる。この場合は、エッチングで作り出されたポストだけが、沈着させる材料と接触するだろう。また、コアを通る光を導き、光誘発性化学反応がコアの先端表面だけで起こって、その結果として、エッチングの必要を排除することが可能になるように、溶融ファイバー束の平坦な切り口を使用することもできる。どちらの場合も、次に、同じ支持体を、オリゴヌクレオチドまたは他の反応物をタグ付けするために使用した蛍光ラベルをイメージングするための導光/集光装置として、使用することができる。この装置は、大きな視野を大きな開口数（潜在的に＞1）と共に与える。活性材料またはオリゴヌクレオチドの沈着を行うスタンピングツールまたはプリンティングツールを使って、2〜100種類のオリゴヌクレオチドを、交互的パターンでプリントすることができる。この工程には、約50〜500nmへのプリントヘッドの正確な位置決めが要求される。このタイプのオリゴヌクレオチドアレイは、2〜100種類のDNA集団（例えば異なるソースDNA）を取付けるために使用することができる。また、DNA特異的アンカーまたはタグを使用することにより、サブ光分解能（sub-light resolution）スポットからのパラレル読出しにも、使用することができる。情報は、DNA特異的タグ（例えば16個のDNAに対する16個の特異的アンカー）によってアクセスすることができ、5〜6色の組み合わせにより、16回のライゲーションサイクルまたは1回のライゲーションサイクルと16回のデコーディングサイクルを使って、2塩基を読み取ることができる。このアレイ作製方法は、1フラグメントあたりに要求される情報が限られている（例えばサイクル数が少ない）場合には効率がよく、したがって、1サイクルあたりの情報量または1表面あたりのサイクル数が増加する。
ある実施形態では、「不活性」コンカテマーを使って、試験コンカテマーを取付けるための表面を準備する。表面をまず、2タイプの合成コンカテマー（一方は捕捉コンカテマーであり、他方はスペーサーコンカテマーである）上に存在する結合部位に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで覆う。スペーサーコンカテマーは、試験コンカテマーの製造に使用するアダプターに相補的なDNAセグメントを持たず、捕捉コンカテマーに対して約5〜50（好ましくは10）倍過剰に使用される。捕捉オリゴヌクレオチドを持つ表面を、スペーサーコンカテマーが捕捉コンカテマーに対して約10倍（または5〜50倍）過剰に使用されている合成コンカテマー（連鎖ライゲーション（chain ligation）またはRCRによって製造）の混合物で、「飽和」させる。スペーサーコンカテマーと捕捉コンカテマーの比が約10：1であるため、捕捉コンカテマーは大部分がスペーサーコンカテマーの海に浮かぶ個別の島になる。10：1という比により、二つの捕捉コンカテマーは平均すると二つのスペーサーコンカテマーで隔てられることになる。コンカテマーが約200nmの直径を持つとすると、二つの捕捉コンカテマーは約600nmの中心間間隔を持つことになる。次に、この表面を使って、捕捉コンカテマーの一領域（ただしスペーサーコンカテマー上には存在しない領域）に相補的な結合部位を持つ試験コンカテマーまたは他の分子構造を取付ける。一つの捕捉コンカテマースポットにつき試験コンカテマーが一つだけ取付けられることを保証するために、捕捉コンカテマーは、試験コンカテマー中の結合部位の数より少ないコピー数を持つように製造することができる。試験DNAは捕捉コンカテマーだけに結合することができるので、集塊を作らずに高い部位占有率を持つ試験コンカテマーのアレイを製造することができる。ランダムな取付けであるため、表面上のいくつかの部分にはコンカテマーが何も取付けられていないということもありうるが、遊離の捕捉オリゴヌクレオチドを持つこれらの部分は、試験コンカテマーを結合することができないだろう。というのも、試験コンカテマーは捕捉オリゴヌクレオチドに対する結合部位を持たないように設計されるからである。ここに記載する個々の試験コンカテマーのアレイは、格子パターンには整列されないだろう。秩序正しい格子パターンはデータ収集を単純化するはずである。なぜなら、必要なピクセル数が少なくなり、画像解析システムもそれほど精巧でなくてよいからである。
一態様として、複数の本発明のアレイを単一の表面上に置くことができる。例えば、標準的な96または384ウェルプレート形式に合致するように、パターニングされたアレイ基板を作成することができる。作成フォーマットは、一片のガラスまたはプラスチックおよび他の光学適合材料上、9mmピッチの6mm×6mmアレイの8×12パターンまたは4.5mmピッチの3.33mm×3.33mmの16×24パターンであることができる。ある例では、各6mm×6mmアレイが、1マイクロメートルピッチの250〜500nm角の領域3600万個からなる。ユニットアレイ間で異なる反応が混合しないように、疎水性もしくは他の表面または物理的障壁を使用することができる。
一例として、シリコン、石英、またはガラス表面上の二酸化ケイ素にリソグラフィーで規定した部位を、3-アミノプロピルジメチルエトキシシランなどのシラン処理剤でシラン処理した後、p-フェニレンジイソチオシアネートなどの誘導体化剤で誘導体化することにより、DNA試料用の結合部位（すなわち不連続な相隔たる領域）を調製する。例えば、結合部位は、フォトリソグラフィー、電子線直接描画、またはナノインプリントリソグラフィーによって作成された四角形、円形または規則的/不規則的多角形であることができる。結合部位間の領域における非特異的結合の最小化。結合部位を取り囲む区域の湿潤性（疎水性対親水性）および反応性を制御して、その区域（すなわち結合部位以外の場所）におけるDNA試料の結合を防ぐことができる。例えば、この区域は、表面に共有結合するヘキサメチルジシラザン（HMDS）などの薬剤を使って、疎水性になるように、したがってDNA試料の親水性結合には適さなくなるように、製造することができる。同様に、この区域をDNA試料に対して非反応性にするフッ素系炭素化合物などの化学薬剤で、この区域をコーティングしてもよい。
先の段落に挙げた三つの表面製作工程では、以下の代表的ステップに従う。フォトリソグラフィーの場合：
1）ガラスウエハを洗浄する
2）HMDSで表面をプライミングする
3）フォトレジストに結合部位をパターニングする
4）HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする
5）0.3％3-アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する
6）裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする
7）ウエハをチップに裁断する
8）フォトレジストを剥がす
9）10％ピリジンおよび90％N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）の溶液で、溶液1mlにつき2.25mgのp-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）を使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。
電子線直接描画による表面製作の場合：
1）ガラスウエハを洗浄する
2）HMDSで表面をプライミングする
3）電子線でPMMAに結合部位をパターニングする
4）HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする
5）0.3％3-アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する
6）裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする
7）ウエハをチップに裁断する
8）フォトレジストを剥がす
9）10％ピリジンおよび90％N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）の溶液で、溶液1mlにつき2.25mgのp-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）を使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。
ナノインプリントリソグラフィーによる表面製作の場合：
1）ガラスウエハを洗浄する
2）HMDSの表面をプライミングする
3）転写層でウエハをコーティングする
4）ナノインプリントテンプレートおよび転写層の上にあるフォトポリマーを使って、コンタクトプリントパターニングする
5）パターンを転写層まで乾式エッチングする
6）HMDSを除去するために酸素で結合部位表面を反応性イオンエッチングする
7）0.3％3-アミノプロピルジメチルエトキシシランでシラン処理する
8）裁断中のウエハを保護するためにフォトレジストでコーティングする
9）ウエハをチップに裁断する
10）フォトレジストを剥がす
11）10％ピリジンおよび90％N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）の溶液で、溶液1mlにつき2.25mgのp-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）を使って、結合部位を2時間誘導体化した後、メタノール、アセトン、および水ですすぐ。
上述のように、ガラス表面も、本発明のランダムアレイを構築するために使用することができる。例えば、適切なガラス表面を、顕微鏡カバースリップから構築することができる。顕微鏡カバースリップ（22mm角、厚さ約170μm）をテフロン（登録商標）製ラックに入れる。それらを95％エタノール/水中の3M KOHに、2分間浸漬する。次に、それらを水中ですすいだ後、アセトンですすぐ。これにより、表面汚染が取り除かれ、シラン処理の準備がガラスに施される。プラズマ洗浄はKOH洗浄に代わる一方法である。ガラスの代りに溶融シリカまたは溶融石英を使用することもできる。清浄な乾燥したカバースリップを、アセトン中の0.3％3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン、0.3％水に浸漬する。それらを45分間反応させておく。次にそれらをアセトン中ですすぎ、100℃で1時間、キュアする。3-アミノプロピルジメチルエトキシシランはガラス表面上に単層を形成するので、3-アミノプロピルトリエトキシシランの代用品として使用することができる。単層表面の方が低いバックグラウンドをもたらす。シラン処理剤は蒸着法を使って適用することもできる。3-アミノプロピルトリエトキシシランは、液相で沈着させると、より多くのポリマー表面を形成する傾向がある。次に、アミノ修飾シランをチオシアネート基で終端させる。これは、10％ピリジンおよび90％N,N-ジメチルホルムアミド（DMF)の溶液中、溶液1mlにつき2.25mgのp-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）を使って行われる。反応を2時間行った後、スライドをメタノール中で洗浄し、次にアセトン、および水ですすぐ。次に、カバースリップを乾燥すると、プローブを結合する準備が整う。シラン処理剤の末端にあるアミノ基を修飾するために使用することができる化学薬品は他にもある。例えば、グルタルアルデヒドを使って、シラン処理剤の末端にあるアミノ基を、アミノ修飾オリゴヌクレオチドにカップリングすることができるアルデヒド基に修飾することができる。100mM重炭酸ナトリウム水溶液中の10〜50μM捕捉オリゴヌクレオチド溶液を表面に適用することによって、捕捉オリゴヌクレオチドをカバースライドの表面に結合させる。溶液を乾燥させた後、水中で洗浄する。3-アミノ基をPDCで終端させることを避け、5'末端がカルボキシル基またはアルデヒド基で修飾されている捕捉オリゴヌクレオチドへの（3-アミノ末端の）直接コンジュゲーションを行うことが有益であるかもしれない。カルボキシル基の場合は、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド）を含有する溶液に、オリゴヌクレオチドを適用する。アルデヒド基の場合は、オリゴを5〜10分間濡れた状態に保ってから、表面を1％水素化ホウ素ナトリウムで処理する。
本発明のもう一つの態様では、ナノメートルサイズのビーズを使って、ランダムアレイを製造する。コンカテマーを生成させるために使用するサークル中のアダプターオリゴヌクレオチドに相補的な短いオリゴヌクレオチド（例えば6〜30ヌクレオチド）で誘導体化されたサブミクロン（例えば20〜50nm範囲）のガラスタイプまたは他のタイプのビーズを使用する。ビーズ上のオリゴヌクレオチドの数および配列の長さは、溶解した状態でコンカテマーを弱く結合するように、制御することができる。ビーズの反応速度は、固相支持体のみの場合より、はるかに速いはずである。コンカテマーを結合した後、ビーズをアレイ基板の表面に沈降させる。アレイ基板は、表面への優先的結合と、それによる間隔の空いたコンカテマーのアレイの形成を可能する条件を選択することができるように、より長く、より安定で、より多くのオリゴヌクレオチドを持つ。ビーズが磁気ビーズである場合は、磁場を使ってそれらを表面に引張ることができ、それらを表面付近で移動させるために使用することもできる。あるいは、遠心分離を使ってビーズを表面上に濃縮することもできる。代表的なプロトコールは以下のとおりである：1．1μlにつき100万個のコンカテマーを含むコンカテマー溶液20μlの調製物を、約8塩基長（異なる条件下で6〜16塩基を使用しうる）の捕捉ヌクレオチド約500個を持つ2000万個のナノビーズと混合する。100nmナノビーズは約40,000nm2あり、4000個までの短いオリゴヌクレオチドを保持することができる。捕捉プローブの密度を制御するための一方法は、この場合であれば、同じ取付けケミストリーを持つ2〜4塩基長オリゴヌクレオチドを約8倍多く、捕捉プローブと混合することである。また、もっと小さいナノビーズ（20〜50nm）を使用することもできる。2．300を超えるコピーを持つコンカテマーが、有意な個数でナノビーズに付着するように、反応条件（温度、pH、塩濃度）を調節する。3．その反応を、同じストリンジェント条件下で、サイズが約200nmの活性部位1600万個を持つ4×4mmのパターニングされた表面を有する支持体に適用し、ナノビーズを基板表面上に自然にまたは強制的に沈降させて、大きいコンカテマーをナノビーズと共に連れてくる。ナノビーズ-コンカテマーが移動する必要がある最大距離は約1mmである。ビーズの垂直移動は、潜在的コンカテマー-コンカテマー遭遇の数を最小化する。反応溶液は、少しずつ（例えば5μlずつ4回）適用することができる。この場合、適用される溶液の厚さ（例えばナノビーズ最大移動距離）は、わずかに約250ミクロンである。4．反応のストリンジェンシーをさらに増加させることにより、コンカテマーをナノビーズから放出させ、それらを、長さ20〜50塩基の捕捉オリゴヌクレオチド約300個を持つ支持体上の活性部位に取付ける。5．ナノビーズに取付けたコンカテマーは、最初は主として、支持体上の活性部位の間に沈降するだろう。なぜなら、不活性表面は活性表面よりも25倍多いからである。ナノビーズ-コンカテマーを約1〜数ミクロン移動させるために、わずかな水平移動力（例えば基板傾斜などの力）をかけてもよい。
検出機器
上述のように、本発明に従って作製されたランダムアレイ上の単分子からはシグナルが生成し、そのシグナルは、走査電子顕微鏡、近接場走査型光学顕微鏡（NSOM）、全反射照明蛍光顕微鏡（TIRFM）など、いくつかの検出システムによって検出される。表面上のナノスケール構造を解析し検出することを目的とするそのような技法の応用については、以下に挙げる文献（これらは参照により本明細書に組み入れられる）からもわかるように、豊富な手引きが文献に見出される：Reimerら編「Scanning Electron Microscopy: Physics of Image Formation and Microanalysis」第2版（Springer, 1998）；Nieら, Anal. Chem., 78: 1528-1534 (2006)；Hechtら, Journal Chemical Physics, 112: 7761-7774 (2000)；Zhuら編「Near-Field Optics: Principles and Applications」（World Scientific Publishing、シンガポール、1999）；Drmanacの国際特許公開WO 2004/076683；Lehrら, Anal. Chem., 75: 2414-2420 (2003)；Neuschaferら, Biosensors & Bioelectronics, 18: 489-497 (2003)；Neuschaferらの米国特許第6,289,144号など。特に興味深いのは、例えばNeuschaferらの米国特許第6,289,144号；Lehrら（前掲）；およびDrmanacの国際特許公開WO 2004/076683などに開示されているTIRFMである。一態様として、本発明のアレイと共に使用される機器は、三つの基本構成要素を含む：（i）プローブ、洗浄液などの試薬類を貯蔵し、アレイに移動させ、加工するためのフルイディクスシステム；(ii）アレイを保持または包含し、フロースルーおよび温度制御能を持つ、反応チャンバまたはフローセル；ならびに（iii）照明および検出システム。ある実施形態では、フローセルが、温度を約5〜95℃（より具体的には10〜85℃）の範囲に維持することができる温度制御サブシステムを持ち、毎秒約0.5〜2℃の速度で温度を変化させることができる。
一態様として、本発明の高分子構造を結合するために誘導体化されている1インチ角で厚さ170マイクロメートルのカバースリップ用のフローセルを使用することができる。このセルは、二つの平面の間にガラスおよびガスケットをサンドイッチ状に挟むことによって、「アレイ」を封入する。一方の平面は、イメージングを可能とするのに十分なサイズの開口部と、カバースリップ用のインデキシングポケット（indexing pocket）を持つ。他方の平面は、ガスケット用のインデキシングポケット、流体ポート、および温度制御システムを持つ。一つの流体ポートは、流体をフローセルから「引く」または「押す」シリンジポンプに接続され、他のポートは、漏斗状の混合チャンバに接続される。また、そのチャンバには液面センサが装備される。溶液類は漏斗内に投入され、必要に応じて混合された後、フローセル内に引き込まれる。液面センサが、フローセルに接続された漏斗中の空気を読み取ったら、液体を漏斗まで戻すために、ポンプを既知量だけ逆転させる。これにより、空気がフローセルに入るのを防ぐ。サンドイッチ状に挟むことによって起こる流体流れ/毛細管効果を調整するために、カバースリップ表面を区分けして、ストリップに分割してもよい。そのような基板は、毛細管流動効果を排除することによって基板上をバッファーが一様に流れやすくなるように、「開放（open air）」/「オープンフェイス（open face）」チャンバに格納することができる。イメージングは、TIRFまたは落射照明およびZeiss axiovert 200上の1.3メガピクセルHamamatsu orca-er-agなどのシステムを使って、100倍対物レンズで達成することができる。この構成は、基板にランダムに結合したRCRコンカテマー（無秩序アレイ）をイメージングする。イメージング速度は、対物レンズ拡大倍率を下げること、格子パターニングされたアレイを使用すること、および各画像で収集されるデータのピクセル数を増やすことによって改善することができる。例えば、最大4台（またはそれ以上）のカメラを、好ましくは10〜16メガピクセルの範囲で使用することができる。最大四つ（またはそれ以上）の発光スペクトルにまたがってピクセルデータを収集するために、複数のバンドパスフィルタおよび二色性ミラーも使用することができる。倍率が低下した対物レンズの低下した集光度を補償するために、励起光源の出力を増加させることができる。試料をハイブリダイズ/反応させている間もイメージングシステムを遊ばせておかないように、各カメラに一つ以上のフローチャンバを使用することによって、スループットを増加させることができる。アレイのプロービングは不連続的に行うことができるので、二つ以上のイメージングシステムを使用することにより、一組のアレイからデータを収集して、アッセイ時間をさらに減少させることができる。
イメージング工程中は、基板に焦点を合わせておかなければならない。焦点を保つ際に重要な因子には、基板の平坦性、焦平面に対する基板の直交性、および基板を歪ませうる機械的力などがある。基板の平坦性は十分に制御することができ、1/4波長より良好な平坦性を持つガラスプレートは容易に得られる。基板上の一様でない機械的力は、ハイブリダイゼーションチャンバの適正な設計によって、最小限に抑えることができる。焦平面に対する直交性は、よく調節された高精度ステージによって達成することができる。自動焦点ルーチンは一般に動作するのに余分な時間を要するので、それらは、必要な場合に限って、実行することが望ましい。各画像を取得した後は、その画像の焦点が合っているかどうかを決定するために、速いアルゴリズムを使って画像が解析されるだろう。画像の焦点が合っていない場合は、自動焦点ルーチンが動作するだろう。その場合は、次のイメージングサイクル時に、そのアレイのそのセクションに戻ったときに使用するために、対物レンズのZ位置情報が保存されるだろう。対物レンズのZ位置を基板上のさまざまな位置でマッピングすることにより、基板画像取得に必要な時間が短縮されるだろう。
蛍光の基づくシグナルに適した照明および検出システムは、80ミリワット532nm固体レーザーに結合されたTIRFスライダを装備したZeiss Axiovert 200である。このスライダは、正しいTIRF照明角度で、対物レンズを通して基板を照明する。TIRFは、基板と光学的に結合されたプリズムを通して基板を照明することにより、対物レンズを利用せずに達成することもできる。基板上でTIRFを実行するために平面導波路も使用することができる。落射照明も使用することができる。光源はラスター、スプレッドビーム、コヒーレント、インコヒーレントであることができ、単スペクトル源またはマルチスペクトル源に由来することができる。
イメージングシステムの一実施形態は、1.25mmの視野を持つ20倍レンズを含み、検出は10メガピクセルカメラで達成される。そのようなシステムは、パターニングされたアレイに1ミクロンピッチで取付けられた約150万個のコンカテマーをイメージングする。この構成では、コンカテマー1個につき約6.4個のピクセルがある。コンカテマーあたりのピクセルの数は、対物レンズの視野を増減することによって調節することができる。例えば、1mmの視野は、コンカテマーあたり10ピクセルという値をもたらし、2mmの視野はコンカテマーあたり2.5ピクセルという値をもたらす。対物レンズの倍率およびNAに対して視野を調節することにより、光学機器および画像解析ソフトウェアによる解像がまだ可能な、最も低いコンカテマーあたりのピクセル数を得ることができる。
TIRF照明および落射照明には、どちらも、ほとんどどんな光源でも使用することができる。照明スキームの一つは、共通の単色照明光源セット（6〜8色におよそ4つのレーザー）をイメージャー間で共有することである。各イメージャーは、任意の与えられた時刻に、異なる波長でデータを収集し、光源は、光学スイッチングシステムによって、そのイメージャーに切り替えられる。そのような実施形態では、照明光源は、好ましくは、少なくとも6つ、より好ましくは8つの異なる波長を生じる。そのような光源には、気体レーザー、ファイバーカプラで結合された複数のダイオード励起固体レーザー、濾波されたキセノンアーク灯、波長可変レーザー、またはより新規なSpectralum Light Engine（近日中にTidal Photonicsから販売される）などがある。Spectralum Light Engineは、プリズムを使って、光をスペクトル的に分離する。スペクトルは、Texas Instruments Digital Light Processorに投射され、これは、そのスペクトルの任意の部分をファイバーまたは光コネクタに選択的に反射することができる。このシステムは、バルブの加齢に伴うまたはバルブ交換による強度の相違を自動的に補償するために、個々の波長を横断して出力を監視し、較正して、それらを一定に保つ能力を持つ。
以下の表は、考えうるレーザー、色素およびフィルタの例を表す。
Figure 0005965108
24時間で1領域につき約350（1色につき約60）の画像により60億のコンカテマーをうまくスコアリングするには、各イメージャーについてパラレル画像取得、画像取得速度の増加、および視野の増加を組み合わせる必要があるだろう。加えて、イメージャーは6〜8色をサポートしうる。市販の顕微鏡は普通、約1mmの視野を20倍の倍率、0.8のNAでイメージングする。0.5ミクロンというコンカテマーピッチ案では、これは、1画像あたりほぼ400万のコンカテマーということになる。これは、1回のハイブリダイゼーションサイクルあたり60億のスポットに約1,500の画像、または350回のイメージングサイクルで50万の画像をもたらす。大規模シークエンシング作業では、各イメージャーが、好ましくは、16メガピクセルCCDへの300ミリ秒の露出時間として、1日あたり約200,000の画像を取得する。したがって、好ましい機器設計は、それぞれが4つのフローセルを担当する4つのイメージャーモジュールである（合計16のフローセル）。上述のイメージングスキームは、各イメージャーが1000万ピクセルのCCD検出器を持ち、ほぼ300ミリ秒の露出時間で使用されると仮定している。これは、6つの蛍光体ラベルについてデータを収集するための方法として、許容できるはずである。このイメージング技法の考えうる短所の一つは、他の蛍光体はイメージングされているのに、一定の蛍光体が光源によって意図せずに光退色するかもしれないことである。光力を低く維持し、露出時間を最小限に保つことにより、光退色が著しく減少するだろう。インテンシファイドCCD（ICCD）を使用することにより、標準CCDより何桁も低い照明強度および露出時間でほぼ同じ品質のデータを収集することができるだろう。ICCDは一般に1〜1.4メガピクセルの範囲で入手することができる。要求される露出時間がはるかに短いので、1メガピクセルICCDは、標準CCDが一つの画像を取得する時間で10以上の画像を取得することができる。高速フィルタホイールおよび高速フローセルステージと一緒に使用すれば、1メガピクセルICCDは、10メガピクセル標準CCDと同じ量のデータを収集することができるはずである。
より高い開口数でより大きな視野をイメージングする能力を持つ光学機器は、カスタムレンズアセンブリとして製作することができる。3mmの視野をNA＞0.9でイメージングする能力を持つ20倍の光学機器を製作することができそうである。そのようなイメージングシステム二つを、高ピクセル数CCDまたはCCDモザイクアレイと組み合わせると、ほぼ14時間で、全8フローセルアッセイをイメージングできるはずである。上述のように、16フローセルを用いることによって、さらなるゲインを実現することができる。フローセルの数を二倍にすると、各視野あたりの画像数が減ることにより、イメージング時間が9時間に短縮されるだろう。
コンカテマーおよび他のランダムDNAアレイでの反応効率は、プローブ、アンカーまたはプライマーおよび酵素の効率的な使用に依存しうる。これは、DNAを反応体積の異なる部分から表面の近傍に持ってくるために、液体を混合する（例えばフロースルーチャンバで液体を前後にプールする）か、撹拌するか、水平もしくは垂直電場を印加することによって達成しうる。効率のよい低コストアッセイ反応のためのアプローチの一つは、反応混合物を液滴などの薄層またはサイズ/厚さが約1〜数ミクロン（ただし好ましくは10ミクロン未満）の層に適用することである。1×1ミクロンスポット部分に指定された1×1×1ミクロン体積では、1pmol/1μl（1μM濃度）で、約1000分子のプローブが1〜1000コピーのDNAに近接しているだろう。100〜300分子までのプローブを使用すれば、プローブ濃度を有意に低下させず、有意なシグナルを得るのに十分なプローブが反応することになるだろう。このアプローチは、プローブおよび酵素を除去および洗浄するために開け閉めしておける開放反応チャンバで使用することができる。
上述のように、複数のカメラと複数のフローセルを使うことによって、より高いスループットを達成することができる。1台のロボット液体処理ガントリーで例えば16のフローセルに対応することができる。また、システムの構成要素は全て、共通の温度制御システムおよび試薬セットを共有することができる。コンビナトリアルSBHシークエンシング作業の場合、ロボットは、フローセル漏斗に分配するために、プローブプールおよびライゲーションバッファーを準備をすることができる。専用シリンジポンプは、洗浄液およびハイブリダイゼーションバッファーを、各フローセルの漏斗ポートに直接分配することができる。各イメージャーは、2〜4フローセルのグループに対応することができる。フローセルの各グループは、研究用顕微鏡によく見られる自動プレートステージと同様のXYモーションプラットフォーム上に置くことができる。システム制御および全システム構成要素間の協調は、マスターコンピュータで動作しているソフトウェアによって行うことができる。制御ソフトウェアはアッセイサイクルを非同期的に実行することにより、アッセイ全体を通して各イメージャーを連続的に動作させることができる。フローセルは、一つの加熱器と一つの冷却器とを持つ温度制御システムに接続され、各フローセルまたは2〜4ブロックのセルを需要に応じて独立して加熱または冷却することを可能にする。各フローセル温度を監視することができ、フローセル温度が設定閾値未満に低下したら、バルブは熱水再循環側に開きうる。同様に、フローセルが設定閾値を上回ったら、バルブは冷水再循環側に開きうる。フローセルが設定温度範囲内にある場合は、どちらのバルブも開かない。熱および冷再循環水はアルミニウムフローセルボディを通過するが、アッセイバッファーおよび試薬類とは別々で隔離されたままである。
ターゲット配列コンカテマーのランダムアレイの配列解析
上述のように、生体分子（例えばゲノムDNAフラグメントまたはcDNAフラグメント）のランダムアレイは、大規模配列決定のプラットフォーム、およびSAGE（serial analysis of gene expression）法やMPSS（masively parallel signature sequencing）法によってなされる測定と同様の方法で配列タグを計数することに基づくゲノムワイドな測定のプラットフォームになる（例えばVelculescuら, (1995), Science 270, 484-487；およびBrennerら (2000), Nature Biotechnology, 18: 630-634）。そのようなゲノムワイドな測定には、限定するわけではないが、例えば、当業者に知られる広範囲にわたるさまざまなアッセイによって行うことができるような、多形（ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入、逆位など）の決定、メチル化パターン、コピー数パターンなどの決定が含まれる（例えばSyvanen (2005), Nature Genetics Supplement, 37: S5-S10；Gundersonら (2005), Nature Genetics, 37: 549-554；Fanら (2003), Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, LXVIII: 69-78；および米国特許第4,883,750号；同第6,858,412号；同第5,871,921号；同第6,355,431号など；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。
本発明のランダムアレイでは、例えば、限定するわけではないが、ハイブリダイゼーションに基づく方法、例えばDrmanacの米国特許第6,864,052号；同第6,309,824号；および同第6,401,267号；ならびにDrmanacらの米国特許出願公開第2005/0191656号（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているもの、SBS法、例えばNyrenらの米国特許第6,210,891号；Ronaghiの米国特許第6,828,100号；Ronaghiら (1998), Science, 281: 363-365；Balasubramanianの米国特許第6,833,246号；Quakeの米国特許第6,911,345号；Liら, Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 414-419 (2003)（これらは参照により本明細書に組み入れられる）、ならびにライゲーションに基づく方法、例えばShendureら (2005), Science, 309: 1728-1739（これは参照により本明細書に組み入れられる）など、さまざまなシークエンシング方法を使用することができる。一態様として、本発明に従ってターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法は、以下に挙げるステップを含む：（a）ターゲットポリヌクレオチドから複数のターゲットコンカテマーを生成させるステップ（各ターゲットコンカテマーはターゲットポリヌクレオチドのフラグメントのコピーを複数含み、複数のターゲットコンカテマーには、ターゲットポリヌクレオチドを実質的にカバーする数のフラグメントが含まれる）；（b）ターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたターゲットコンカテマーのランダムアレイを形成させるステップ；（c）各ターゲットコンカテマー中の各フラグメントの少なくとも一部の配列を同定するステップ；および（d）コンカテマーのフラグメントの各部分の配列のアイデンティティからターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を再構築するステップ。通例、「実質的ににカバーする」とは、解析されるDNAの量が、ターゲットポリヌクレオチドの少なくとも2コピーに相当するものを含有すること、もう一つの態様では少なくとも10コピー、もう一つの態様では少なくとも20コピー、もう一つの態様では少なくとも100コピーに相当するものを含有することを意味する。ターゲットポリヌクレオチドには、ゲノムDNAフラグメントおよびcDNAフラグメントなどのDNAフラグメント、ならびにRNAフラグメトを含めることができる。
一態様として、複数のDNAまたはRNAフラグメント中の配列を決定するために本発明と共に使用されるシークエンシング方法は、以下のステップを含む：（a）それぞれがDNAまたはRNAフラグメントのコンカテマーを含む複数のポリヌクレオチド分子を生成させるステップ；（b）ターゲットコンカテマーの少なくとも過半数が光学的に解像可能であるような密度で表面に固定されたポリヌクレオチド分子のランダムアレイを形成させるステップ；および（c）解像可能なポリヌクレオチド中の各DNAまたはRNAフラグメントの少なくとも一部の配列を、光学的に検出可能な反応物の少なくとも一つの化学反応を使って同定するステップ。ある実施形態では、そのような光学的に検出可能な反応物がオリゴヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、そのような光学的に検出可能な反応物がヌクレオシド三リン酸、例えばコンカテマーにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させるために使用することができる蛍光標識ヌクレオシド三リン酸である。もう一つの実施形態では、そのような光学的に検出可能な試薬が、コンカテマー上で隣接した二重鎖を形成する第1オリゴヌクレオチドと第2オリゴヌクレオチドとを連結することによって形成されるオリゴヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、そのような化学反応が、例えばコンカテマーにハイブリダイズしたプライマーを伸長させることなどによる、DNAまたはRNAの合成である。さらにもう一つの実施形態では、上記の光学的に検出可能な反応物が、核酸結合性オリゴペプチドまたはポリペプチドまたはタンパク質である。
ある態様では、ランダムアレイ上のコンカテマーのポリヌクレオチド分析物のパラレルシークエンシングが、Drmanacが前掲の特許に開示したコンビナトリアルSBH（cSBH）によって達成される。ある態様では、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブセット（各セットは、そのセット内の所定のプローブ長について考えうる全ての配列を持つオリゴヌクレオチドを含むメンバープローブを有する）を用意する。例えば、あるセットが長さ6のプローブを含有するとすると、そのセットは4096（＝46）個のプローブを含有する。もう一つの態様では、第1および第2のオリゴヌクレドプローブセットが、選ばれたターゲットポリヌクレオチドセットを検出するために設計された選ばれたヌクレオチド配列を持つプローブを含む。配列は、一つのプローブまたはプローブプールをハイブリダイズさせ、第2のプローブまたは第2のプローブプールをハイブリダイズさせ、それぞれのターゲット配列上で完全にマッチした二重鎖を形成するプローブを連結し、連結されるプローブを同定して、ターゲット配列に関する配列情報を取得し、全てのプローブまたはプローブプールがハイブリダイズされるまでこれらのステップを繰返し、そのハイブリダイゼーションおよび同定ステップ中に蓄積される配列情報からターゲットのヌクレオチド配列を決定することによって決定される。
シークエンシング作業のために、いくつかの実施形態では、米国特許第6,864,052号に開示されているように、上記のセットをサブセットに分割し、それらをプールして一緒に使用することができる。第1セットおよび第2セットからのプローブを、ターゲット配列に、一緒にまたは順番に、セット全体として、またはサブセットもしくはプールとして、ハイブリダイズさせることができる。第1セットまたは第2セット中のプローブの長さは、ある態様では5〜10ヌクレオチドの範囲、もう一つの態様では5〜7ヌクレオチドの範囲にあって、連結された時に、それらがそれぞれ10〜20および10〜14の範囲の長さを持つライゲーション産物を形成するようになっている。
もう一つの態様として、そのような技法を使って、取付けられたDNAコンカテマーのそれぞれの配列アイデンティティを、「シグネチャー」アプローチで決定することもできる。取付けられたコンカテマーの約25〜50％（いくつかの応用例では10〜30％）が各プローブに対して完全マッチ配列を持つことになるように、約50〜100個あるいは200個のプローブを使用する。このタイプのデータにより、コンカテマー内の各増幅DNAフラグメントを、基準配列にマッピングすることが可能になる。例えば、そのような工程により、4色のラベリングスキームで16回のハイブリダイゼーション/ストリップオフサイクルを使って、64個の4マー（すなわちが考えうる全256個の4マーの25％）をスコアリングすることができる。コンカテマー中に増幅された60〜70塩基フラグメントでは、64プローブのうち約16プローブが陽性になるだろう。というのも、64塩基長の配列には64の考えうる4マー（すなわち全ての考えうる4マーの4分の1）が存在するからである。無関係な60〜70塩基フラグメントは、著しく異なる約16の陽性デコーディングプローブセットを持つことになる。64プローブのうちの16プローブの組み合わせが偶然に存在する確率は10億フラグメントごとに1であり、これは実際上、そのコンカテマーのユニークなシグネチャーになる。20サイクルで80プローブをスコアリングし、20の陽性プローブを生成させると、より一層ユニークであると思われるシグネチャーを生成し、偶然による出現率は10億の10億倍回に1回である。「シグネチャー」アプローチはcDNAライブラリーから新規遺伝子を選択するために使用されたことがある。シグネチャーアプローチの実行は、試験した全てのプローブについて、得られた強度を選別し、陽性プローブ閾値を満たすプローブを所定の（予想される）数まで選択することである。これらのプローブは、そのアレイ中に存在すると予想される全DNAフラグメントの配列にマッピングされるだろう（より長い基準配列のスライディングウィンドウを使用することができる）。選ばれた陽性プローブを全てまたは統計的に十分な数だけ持つ配列が、与えられたコンカテマー中のDNAフラグメントの配列として割り当てられる。もう一つのアプローチでは、前もって測定しておいた完全マッチおよびミスマッチハイブリダイゼーション/ライゲーション効率を使って、予想されるシグナルを、使用したプローブの全てについて定義することができる。この場合は、相関係数に似た尺度を算出することができる。
4マーをスコアリングする好ましい方法は、プローブのペア、例えば：N(5-7)BBBをBN(7-9)と、連結することである（ここに、Bは所定の塩基であり、Nは縮重塩基である）。より長いDNAコンカテマープローブ上でシグネチャーを生成させるには、より多くのユニーク塩基が使用されるだろう。例えば、1000塩基長のフラグメントにおける25％の陽性率は、N(4-6)BBBBおよびBBN(6-8)によって達成されるだろう。より長いフラグメントが、約60〜80プローブという同じ数（4色を使って15〜20のライゲーションサイクル）を必要とすることに注意されたい。
ある実施形態では、与えられた長さの全てのプローブ（例えば4096個のN2-4BBBBBBN2-4）または全てのライゲーションペアを使って、コンカテマー中のDNAの全配列を決定することができる。例えば、N(5-7)B3とBBN(6-8)の1024の組み合わせをスコアリングして（4色を使用すると256サイクル） 、約250塩基（好ましくは約100塩基）までのDNAフラグメントの配列を決定することができる。
多数のNを持つシークエンシングプローブのデコーディングは、効率の差を最小限に抑えるために、縮重塩基における配列のサブセットを複数合成することによって準備することができる。各サブセットを適正な濃度で混合物に加える。また、一部のサブセットは、他のサブセットよりも多くの縮重位置を持ちうる。例えば、セットN(5-7)BBBの64プローブのそれぞれは、4つの異なる合成で製造することができる。一つは、完全に縮重した通常の5〜7塩基であり；2番目はN0-3(A,T)5BBBであり；3番目はN0-2(A,T)(G,C)(A,T)(G,C)(A,T)BBBであり、4番目はN0-2(G,C)(A,T)(G,C)(A,T)(G,C)BBBである。
三つの特異的合成で得たオリゴヌクレオチド調製物を、実験的に決定した量で通常合成に加えて、BBB配列の前にATリッチ（例えばAATAT）または（AもしくはT）および（GもしくはC）交互配列（例えばACAGTもしくはGAGAC）を持つターゲット配列とのハイブリッド生成を増加させる。これらの配列はハイブリッド形成の効率が低いと予想される。1024のターゲット配列全てを、N0-3NNNNNBBBプローブとのハイブリッドを形成する効率について調べることができ、最も弱い結合を与えるタイプを、約1〜10の追加合成で製造し、基本プローブ調製物に加えることができる。
シグネチャーによるデコーディング：小数の異なる試料に対する小数のプローブ：20プローブ中5〜7陽性（4色を使って5サイクル）は、約1万〜10万の異なるフラグメントを識別する能力を持つ。
8〜20マーRCR産物のデコーディング：この応用例では、DNAコンカテマーの形をしたユニークな8〜20塩基認識配列のランダムな分布として、アレイを形成させる。8〜20塩基プローブ領域の配列を決定するために、プローブをデコードする必要がある。これを行うために少なくとも二つの選択肢を利用することができ、以下の例では、12マーについて、その工程を説明する。まず最初に、短いプローブのハイブリダイゼーション特異性および完全にマッチしたハイブリッドのライゲーション特異性を利用して、配列の半分を決定する。12マーに隣接する6〜10塩基は予め定義され、6マー〜10マーオリゴヌクレオチドのサポート（support）として機能する。この短い6マーは、その3'末端で4つの標識6マー〜10マーの一つに連結する。これらのデコーディングプローブは、4つのオリゴヌクレオチドプールからなり、各オリゴヌクレオチドは、4〜9個の縮重塩基と1個の所定塩基とからなる。また、このオリゴヌクレオチドは4つの蛍光ラベルの一つで標識されるだろう。したがって、4つの考えうる塩基A、C、G、またはTのそれぞれは、蛍光色素によって表されるだろう。例えば、これら5群の4つのオリゴヌクレオチドと1つのユニバーサルオリゴヌクレオチド（Us）を、ライゲーションアッセイで使用することにより、12マーの最初の5塩基を配列決定することができる：B＝末端の特定色素またはタグと関連づけられた4塩基のそれぞれ：
UUUUUUUU.BNNNNNNN*
UUUUUUUU.NBNNNNNN
UUUUUUUU.NNBNNNNN
UUUUUUUU.NNNBNNNN
UUUUUUUU.NNNNBNNN。
6個以上の塩基は、追加のプローブプールを使って配列決定することができる。12マーの中央近くの位置における識別を改善するために、6マーオリゴヌクレオチドをさらに12マー配列中に置くことができる。これには、そのシフトに対応するために、非標識オリゴヌクレオチドの3'末端に縮重塩基を組み込む必要があるだろう。これは、12マーの6位および7位に関するデコーディングプローブの一例である。
UUUUUUNN.NNNBNNNN
UUUUUUNN.NNNNBNNN。
同様にして、12マーの右側から6塩基を、固定されたオリゴヌクレオチドおよび5'標識プローブを使って、デコードすることができる。上述のシステムでは、12マーの片側の6塩基を定義するのに6サイクルが必要である。ライゲーション部位から離れた塩基の冗長サイクル解析により、これは7または8サイクルは増加しうる。したがって合計すると、12マーの完全な配列決定は、12〜16サイクルのライゲーションで達成できるだろう。タイプの異なる二つの検出プローブライブラリーを組み合わせることによる、アレイ化DNAの部分的なまたは完全な配列決定。このアプローチでは、一つのセットが一般タイプN3-8B4-6のプローブ（アンカー）を持ち、これがセットBN6-8、NBN5-7、N2BN4-6、およびN3BN3-5からの第1の2または3または4プローブ/プローブプールと連結される。主な要件は、第1セットからのプローブを第2セットからの2〜4またはそれ以上のプローブと共に数サイクルで試験して、より長い連続した配列、例えば5〜6＋3〜4＝8〜10を、ほんの3〜4サイクルで読み取ることである。一例として、この工程は以下のとおりである：
1）1〜4個の4マーまたはより多くの5マーアンカーをハイブリダイズして、1DNAあたり70〜80％の1または2アンカーを得る。プールからどのアンカーが陽性であるかを識別するための一方法は、異なるハイブリッド安定性を持つ（おそらくNの数も異なる）特異的プローブを混合することである。プールからどのアンカーがスポットにハイブリダイズされるかを決定するために、アンカーにタグ付けしてもよい。追加DNAセグメントとしてのタグは、検出方法としてのアジャスタブルディスプレイスメント（adjustable displacement）に、使用することができる。例えば、EEEEEEEENNNAAAAAおよびFFFFFFFFNNNCCCCCプローブは、ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションおよびライゲーション後に、対応する二つのディスプレーサー（displacer）：EEEEEEEENNNNNおよびFFFFFFFFNNNNNNNNによって、差別的に除去することができ、この場合は、2番目の方が効率的である。どのアンカーが陽性であるかを決定するためだけに、別個のサイクルを使用することができる。この目的には、複数の色で標識またはタグ付けされたアンカーを、非標識N7〜N10サポーターオリゴヌクレオチドに連結することができる。
2）4つの塩基に対応する4色を持つBNNNNNNNNプローブをハイブリダイズさせる；二つのアンカーが一つのDNA中で陽性である場合には、弁別的に洗浄して（またはタグに対する相補鎖で置換して）、スコアリングされた二つの塩基のどちらがどちらのアンカーに関連するかを読み取る。このようにして、二つの7〜10塩基配列を同時にスコアリングすることができる。
2-4サイクルにおいてさらなる2-4塩基について4-6塩基のアンカーに伸長して、各アレイにつき16の異なるアンカー（4色を使用する場合、32〜64回の物理的サイクル）を実行して1フラグメントにつき約16の考えうる8マー（合計約100塩基）を決定する（それを基準配列にマッピングするには十分である（100マーが10個の8マーからなるセットを持つ確率は、1兆の1兆倍回に1回未満（10-28）である））。もう一つのアレイ中の同じフラグメント上で並列してスコアリングされた異なるアンカーからのデータを組み合わせることにより、そのフラグメントの配列、ひいてはゲノム全体の配列を、オーバーラップする7〜10マーから生成させることができる。
デコーディングプローブまたは配列決定プローブのより大きなマルチプレックスのための、DNAタグによるプローブのタグ付け。プローブを直接標識する代わりに、それらを、天然塩基または新しい合成塩基（isoGおよびisoCなど）で構成される異なるオリゴヌクオチド配列でタグ付けすることができる。タグは、異なるオリゴヌクレオチド長（約6〜24塩基）および/または配列（GC含量を含む）を使って、それらのアンチタグと極めて正確な結合効率を持つように設計することができる。例えば、4回の連続的サイクルまたは1回のハイブリダイゼーションサイクルとそれに続く弁別的洗浄で、特異的アンチタグを使って認識することができる、4つの異なるタグを設計することができる。弁別的洗浄では、初期シグナルが、各タグにつき、それぞれ95〜99％、30〜40％、10〜20％および0〜5％に低下する。この場合、異なるタグを持つプローブは同じドットにはまれにしかハイブリダイズしないと仮定すると、二つの画像を取得することにより、4つの測定が得られる。それらが連続的に（または2〜16の異なる色で標識して1回に2〜16が）デコードされるとしても、多くの異なるタグを持つことのもう一つの利点は、1回のアッセイ反応に多数の個別に認識できるプローブを使用できることである。このように、プローブが短いインキュベーションおよび除去反応でデコードされるのであれば、4〜64倍長いアッセイ時間（これは、より特異的なまたはより強いシグナルをもたらしうる）が可能だろう。
デコーディング工程には48〜96以上のデコーディングプローブが必要である。これらのプールは、それぞれが異なる蛍光スペクトルを持つ4つの蛍光体でそれらをエンコードすることにより、さらに12〜24以上のプールに組み合わされる。20倍対物レンズを使うと、各6mm×6mmアレイは、10メガピクセルカメラを使って完全にカバーするのに、約30画像を必要としうる。１マイクロメートルアレイ部分のそれぞれは、約8ピクセルによって読まれる。各画像は250ミリ秒で取得される（露光に150ミリ秒およびステージを移動させるのに100ミリ秒）。この速い取得を使うと、各アレイをイメージングするのに約7.5秒あるいは各基板上の96アレイの全セットをイメージングするのに12分を要するだろう。イメージングシステムの一実施形態において、この高い画像取得速度は、それぞれが異なる蛍光体の蛍光スペクトルをイメージングする4つの10メガピクセルカメラによって達成される。カメラは一連の二色性ビームスプリッターを通して顕微鏡に結合される。余分な時間を要する自動焦点ルーチンは、取得した画像の焦点が合っていない場合にのみ動作する。その場合は、次のイメージングサイクル時に、そのアレイのそのセクションに戻ったときに使用するために、Z軸位置情報が保存されるだろう。基板上の各位置について自動焦点位置をマッピングすることにより、画像取得に要する時間が劇的に短縮されるだろう。
各アレイはデコードするのに約12〜24サイクルを要する。各サイクルは、ハイブリダイゼーション、洗浄、アレイイメージング、およびストリップオフステップからなる。これらのステップは、この順に、上記の例の場合、それぞれ5、2、12、および5分を要し、各サイクルにつき合計24分、あるいは作業がリニアに行われたとして、各アレイにつきほぼ5〜10時間を要しうる。各アレイをデコードする時間は、システムが絶えずイメージングできるようにすることによって、2分の1に短縮することができる。これを達成するために、各顕微鏡で二つの別個の基板のイメージングを互い違いに配置する。一つの基板を反応させている間に、他方の基板をイメージングする。
cSBHを使った代表的デコーディングサイクルには、以下のステップが含まれる：（i）アレイの温度をハイブリダイゼーション温度（通常は5〜25℃の範囲）に設定する；（ii）次に、ロボットピペッターを使って、少量のデコーディングプローブを適当な量のハイブリダイゼーションバッファーと予備混合する；（iii）混合した試薬をハイブリダイゼーションチャンバにピペッティングする；（iv）予定の時間、ハイブリダイズさせる；（v）ポンプ（シリンジなど）を使ってチャンバから試薬を排出する；（vi）非ハイブリッドのミスマッチを洗浄するためにバッファーを加える；（vii）チャンバ温度を適当な洗浄温度（約10〜40℃）に調節する；（viii）チャンバを排液する；(ix）イメージングを改善する必要がある場合は、洗浄バッファーを追加する；（x）各アレイを、好ましくは高ピクセル数の高感度ccdカメラ（群）と光学的に結合された中倍率（20倍)顕微鏡対物レンズを使って、イメージングする；プレートステージがチャンバ（あるいは投入ロートを含むフローセル）をオブジェクト（object）の上で動かすか、対物光学アセンブリがチャンバの下で動く；二色性ミラー/ビームスプリッターを使用する一定の光学的配置を使って、マルチスペクトル画像を同時に収集することにより、画像取得時間を短縮することができる；アレイは、アレイ/画像サイズ/ピクセル密度に応じて、セクションごとにイメージイングするか、全体的にイメージングすることができる；セクションは（活性部位作製時に）基板上に予めコードしておいた統計的に有意な空領域を使って画像を整列することによりアセンブルするか、マルチステップナノプリンティング技法を使って作製することができ、例えば特定の捕捉プローブを使って、部位（活性部位のグリッド）を、そのグリッド中に空領域を残してプリントし、次に、別個のプリントヘッドを使って、その領域に異なるパターンまたは捕捉プローブをプリントすることができる；（xi）チャンバを排液してプローブストリップバッファーで置き換え（または既に充填されているバッファーを使用）、チャンバをプローブストリップオフ温度（60〜90℃）に加熱する；ストリップオフステップでは、ストリップオフ温度を下げるために、高pHバッファーを使用することができる；指定した時間、待つ；（xii）バッファーを除去する；（xiii）次のデコーディングプローブプールをセットで使って、次のサイクルを開始する。
ラベルおよび本発明のアレイ上のポリヌクレオチドに対するプローブによるシグナル生成
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、放射性部分、蛍光部分、比色部分、化学発光部分などの直接的または間接的取付けなど、さまざまな方法で標識することができる。DNAを標識する方法およびDNAアダプターを構築する方法に関する包括的な総説は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの構築に応用できる手引きになる。そのような総説には、Kricka, Ann. Clin. Biochem., 39: 114-129 (2002)；Schaferlingら, Anal. Bioanal. Chem., (April 12, 2006)；Matthewsら, Anal. Biochem., Vol 169, 1-25 (1988)；Haugland「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」第10版（Invitrogen/Molecular Probes, Inc.、ユージーン、2006）；KellerおよびManak「DNA Probes」第2版（Stockton Press、ニューヨーク、1993)；ならびにEckstein編「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード、1991）；Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227-259 (1991)；Hermanson「Bioconjugate Techniques」（Academic Press、ニューヨーク、1996）など。本発明に応用できる多くのより具体的な方法が、以下の参考文献例に開示されている：Fungらの米国特許第4,757,141号；Hobbs, Jr.ら 米国特許第5,151,507号；Cruickshankの米国特許第5,091,519号；（レポーター基を取付けるための官能化オリゴヌクレオチドの合成）；Jablonskiら, Nucleic Acids Research, 14: 6115-6128 (1986)（酵素-オリゴヌクレオチドコンジュゲート）；Juら, Nature Medicine, 2: 246-249 (1996)；Bawendiらの米国特許第6,326,144号（誘導体化蛍光ナノ結晶）；Bruchezらの米国特許第6,274,323号（誘導体化蛍光ナノ結晶）など。
ある態様では、一つ以上の蛍光色素、例えばMenchenらの米国特許第5,188,934号（4,7-ジクロロフルオレセイン色素）；Begotらの米国特許第5,366,860号（スペクトル的に分割可能なローダミン色素）；Leeらの米国特許第5,847,162号（4,7-ジクロロローダミン色素）；Khannaらの米国特許第4,318,846号（エーテル置換フルオレセイン色素）；Leeらの米国特許第5,800,996号（エネルギー移動色素）；Leeらの米国特許第5,066,580号（キサンテン色素）；Mathiesらの米国特許第5,688,648号（エネルギー移動色素）などを、オリゴヌクレオチドプローブのラベルとして使用する。標識は、以下に挙げる特許および特許出願（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているように、量子ドットを使って行うこともできる：6,322,901；6,576,291；6,423,551；6,251,303；6,319,426；6,426,513；6,444,143；5,990,479；6,207,392；2002/0045045；2003/0017264など。本明細書で使用する「蛍光シグナル生成部分」という用語は、一つ以上の分子の蛍光吸収および/または蛍光放出特性によって情報を伝達するシグナリング手段を意味する。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光スペクトル特徴、エネルギー移動などが含まれる。
標識オリゴヌクレオチドに容易に組み込まれる市販の蛍光ヌクレオチド類似体には、例えばCy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP（Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）、フルオレセイン-12-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、Texas Red(登録商標)-5-dUTP、Cascade Blue(登録商標)-7-dUTP、BODIPY(登録商標)FL-14-dUTP、BODIPY(登録商標)R-14-dUTP、BODIPY(登録商標)TR-14-dUTP、Rhodamine Green(商標)-5-dUTP、Oregon Green(登録商標)488-5-dUTP、Texas Red(登録商標)-12-dUTP、BODIPY(登録商標)630/650-14-dUTP、BODIPY(登録商標)650/665-14-dUTP、Alexa Fluor(登録商標)488-5-dUTP、Alexa Fluor(登録商標)532-5-dUTP、Alexa Fluor(登録商標)568-5-dUTP、Alexa Fluor(登録商標)594-5-dUTP、Alexa Fluor(登録商標)546-14-dUTP、フルオレセイン-12-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、Texas Red(登録商標)-5-UTP、Cascade Blue(登録商標)-7-UTP、BODIPY(登録商標)FL-14-UTP、BODIPY(登録商標)TMR-14-UTP、BODIPY(登録商標)TR-14-UTP、Rhodamine Green(商標)-5-UTP、Alexa Fluor(登録商標)488-5-UTP、Alexa Fluor(登録商標)546-14-UTP（Molecular Probes, Inc.、米国オレゴン州ユージーン）などがある。合成後の取付けに利用することができる他の蛍光体として、なかんずくAlexa Fluor(登録商標)350、Alexa Fluor(登録商標)532、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)568、Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、ダンシル、リサミン（lissamine）ローダミンB、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、Pacific Blue、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Texas Red（Molecular Probes, Inc.（米国オレゴン州ユージーン）から入手することができる）、ならびにCy2、Cy3.5、Cy5.5、およびCy7（Amersham Biosciences（ニュージャージー州ピスカタウェイ）など）が挙げられる。PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、およびAPC-Cy7などのFRETタンデム蛍光体も使用することができ、PE-Alexa色素（610、647、680）およびAPC-Alexa色素も使用することができる。ビオチンまたはその誘導体を、検出オリゴヌクレオチド上のラベルとして使用し、続いて、検出可能に標識されたアビジン/ストレプトアビジン誘導体（例えばフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジン）または検出可能に標識された抗ビオチン抗体で結合することもできる。ジゴキシゲニンをラベルとして組み込み、続いて検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体（例えばフルオレセイン化抗ジゴキシゲニン）で結合することができる。アミノアリル-dUTP残基を検出オリゴヌクレオチドに組み込み、続いてN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）誘導体化蛍光色素（例えば上に列挙したもの）にカップリングすることもできる。一般に、検出可能に標識されたコンジュゲートパートナーを、検出が可能なように結合することができる限り、コンジュゲートペアのどのメンバーでも、検出オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。本明細書で使用する抗体という用語は、任意のクラスの抗体分子、またはそのサブフラグメント（例えばFab）を指す。他の適切な検出オリゴヌクレオチド用ラベルとして、フルオレセイン（FAM）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（DNP）、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン（BrdU）、ヘキサヒスチジン（6×His）、リン-アミノ酸（例えばP-tyr、P-ser、P-thr）、または他の任意の適切なラベルを挙げることができる。ある実施形態では、以下に挙げるハプテン/抗体ペアを検出に使用する（この場合、抗体のそれぞれは検出可能なラベルで誘導体化される）：ビオチン/α-ビオチン、ジゴキシゲニン/α-ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（DNP）/α-DNP、5-カルボキシフルオレセイン（FAM）/α-FAM。以下のスキームで説明するように、プローブを、とりわけハプテンで間接的に標識した後、そのハプテンを、例えばHoltkeらの米国特許第5,344,757号；同第5,702,888号；および同第5,354,657号；Huberらの米国特許第5,198,537号；Miyoshiの米国特許第4,849,336号；MisiuraおよびGaitのPCT公開WO 91/17160等に開示されているように、捕捉剤によって結合することができる。本発明と共に使用するために、多くの異なるハプテン-捕捉剤ペアを利用することができる。代表的なハプテンには、ビオチン、デス-ビオチンおよび他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、CY5、および他の色素、ジゴキシゲニンなどがある。ビオチンの場合、捕捉剤はアビジン、ストレプトアビジン、または抗体であることができる。抗体は、他のハプテンの捕捉剤として使用することができる（多くの色素-抗体ペアが市販されている；例えばMolecular Probes）。
本発明のキット
本明細書に記載する方法の商業化においては、本発明のランダムアレイを構築し、それをさまざまな応用例に使用するための一定のキットが、とりわけ有用である。本発明のランダムアレイを応用するためのキットには、例えば、ターゲットポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのキット、基準DNA配列と試験DNA配列の間の相違の大規模同定を行うためのキット、エクソンをプロファイリングするためのキットなどがあるが、これらに限るわけではない。キットは、典型的には、表面を持つ少なくとも一つの支持体、および本発明のランダムアレイを構築するのに、またはそれを使った応用を行うのに、必要または有用な一つ以上の試薬を含む。そのような試薬には、限定するわけではないが、核酸プライマー、プローブ、アダプター、酵素などがあり、それぞれ、流通に適したパッケージ（例えば、限定するわけではないが、箱、封をした小袋、ブリスター包装およびカートンなど）中の容器（例えば、限定するわけではないが、バイアル、チューブまたはボトルなど）に入れられる。パッケージは典型的には、梱包されている材料の使用法を示すラベルまたは添付文書を含む。本明細書にいう「梱包材料」には、キット中の試薬を配布するための梱包に用いられる任意の物品（例えば、限定するわけではないが、容器、バイアル、チューブ、ボトル、小袋、ブリスター包装、ラベル、タグ、指示シートおよび添付文書など）を包含する。
一態様として、本発明は、ソース核酸から得られるDNAフラグメントのコンカテマーのランダムアレイを作製するためのキットであって、以下の構成要素を含むものを提供する：（i）表面を持つ支持体；および(ii）各DNAフラグメントに連結して、それと共にDNAサークル（各DNAサークルは、ローリングサークル複製反応によって複製されて、表面上にランダムに配置することができるコンカテマーを形成する能力を持つ）を形成させるための少なくとも一つのアダプターオリゴヌクレオチド。そのようなキットにおいて、表面は、不連続な相隔たる領域のアレイを持つ平面状の表面であることができ、その場合、各不連続な相隔たる領域は、前記コンカテマーのサイズと等価なサイズを持つ。不連続な相隔たる領域は、0.1〜20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成してもよい。不連続な相隔たる領域上のコンカテマーは、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持ちうる。不連続な相隔たる領域には捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられていてもよく、捕捉オリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドの相補的領域との間の複合体の形成によってコンカテマーを不連続な相隔たる領域に取付けることができるように、アダプターオリゴヌクレオチドは、それぞれに、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な領域を持つことができる。いくつかの実施形態では、コンカテマーが前記不連続な相隔たる領域にランダムに分布し、最近接距離は0.3〜3μmの範囲にある。そのようなキットはさらに、（a）前記DNAフラグメントにホモポリマーテールを取付けて、前記アダプターオリゴヌクレオチドの第1末端に結合部位を提供するためのターミナルトランスフェラーゼ、（b）前記アダプターオリゴヌクレオチドの鎖を前記DNAフラグメントの末端に連結して前記DNAサークルを形成させるためのリガーゼ、（c）前記アダプターオリゴヌクレオチドの鎖の一領域にアニールさせるためのプライマー、および（d）鎖にアニールさせたプライマーをローリングサークル複製反応で伸長するためのDNAポリメラーゼを含みうる。上述のアダプターオリゴヌクレオチドは、4〜12の範囲の縮重塩基数を持つ第2の末端を持ちうる。
もう一つの態様として、本発明は、ターゲットポリヌクレオチドを配列決定するためのキットであって、以下の構成要素を含むものを提供する：（i）光学的に解像可能な不連続な相隔たる領域のアレイを有する平面状の表面を持つ支持体（各不連続な相隔たる領域は1μm2未満の面積を持つ）；（ii）不連続な相隔たる領域上にランダムに配置された複数のコンカテマーにハイブリダイズさせるための第1のプローブセット（コンカテマーはそれぞれにターゲットポリヌクレオチドのDNAフラグメントのコピーを複数含有する）；および（iii）複数のコンカテマーにハイブリダイズさせるための第2のプローブセット（第1セットからのプローブが第2セットからのプローブと隣接してハイブリダイズする場合はいつでも、それらのプローブが連結されるようになっている）。そのようなキットはさらに、リガーゼ、リガーゼバッファー、およびハイブリダイゼーションバッファーを含みうる。いくつかの実施形態では、不連続な相隔たる領域に捕捉オリゴヌクレオチドが取付けられていてもよく、コンカテマーはそれぞれに捕捉オリゴヌクレチドに相補的な領域を持っていて、前記コンカテマーが、捕捉オリゴヌクレオチドと前記コンカテマーの相補的領域との間の複合体の形成によって、不連続な相隔たる領域に取付けることができるようになっていてもよい。
さらにもう一つの態様として、本発明は、単分子アレイを構築するためのキットであって、以下の構成要素を含むものを提供する：（i）反応性官能基を持つ表面を有する支持体；および（ii）それぞれがユニークな官能基と複数の相補的官能基とを持つ複数の高分子構造（高分子構造は、表面上にランダムに取付けることができ、その取付けは、一つ以上の反応性官能基と一つ以上の相補的官能基との反応によって形成される一つ以上の結合によって形成され、ユニークな官能基は、分析物分子上の官能基と選択的に反応して、単分子アレイを形成させる能力を持つ）。そのようなキットのいくつかの実施形態では、表面が、前記反応性官能基を含有する不連続な相隔たる領域のアレイを有する平面状の表面であり、各不連続な相隔たる領域は1μm2未満の面積を持つ。さらなる実施形態では、不連続な相隔たる領域が、0.1〜20μmの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する。さらなる実施形態では、不連続な相隔たる領域上のコンカテマーが、それらが光学的に解像可能であるような最近接距離を持つ。さらなる実施形態では、高分子構造が、一つ以上のDNAフラグメントのコンカテマーであり、ユニークな官能基がコンカテマーの3'末端または5'末端にある。
もう一つの態様として、本発明は、DNAフラグメントを環状化するためのキットであって、以下の構成要素を含むものを包含する：（a）一つ以上のDNAフラグメントに連結して、それと共にDNAサークルを形成させるための、少なくとも一つのアダプターオリゴヌクレオチド、（b）前記DNAフラグメントにホモポリマーテールを取付けて、前記アダプターオリゴヌクレオチドの第1末端に結合部位を提供するための、ターミナルトランスフェラーゼ、（c）前記アダプターオリゴヌクレオチドを前記DNAフラグメントの末端に連結して、前記DNAサークルを形成させるためのリガーゼ、(d）前記アダプターオリゴヌクレオチドの鎖の一領域にアニールさせるためのプライマー、および（e）鎖にアニールさせたプライマーをローリングサークル複製反応で伸長するためのDNAポリメラーゼ。そのようなキットの一実施形態では、上記のアダプターオリゴヌクレオチドが、4〜12の範囲の縮重塩基数を有する第2の末端を持ちうる。上記のキットはさらに、ターミナルトランスフェラーゼ用の反応バッファー、リガーゼ、およびDNAポリメラーゼを含みうる。さらにもう一つの態様として、本発明は、Circligase酵素（Epicentre Biotechnologies、ウィスコンシン州マディソン）を使ってDNAフラグメントを環状化するためのキットであって、体積排除（volume exclusion）ポリマーを含むものを包含する。もう一つの態様として、そのようなキットはさらに、以下の構成要素を含む：（a）pHを制御し、Circligaseに最適化された塩組成を提供するための反応バッファー、および（b）Circligase補因子。もう一つの態様では、そのようなキット用の反応バッファーが、0.5M MOPS（pH7.5）、0.1M KCl、50mM MgCl2、および10mM DTTを含む。もう一つの態様では、そのようなキットが、Circligase、例えば10〜100μLのCircligase溶液（濃度100単位/μL）を含む。代表的な体積排除ポリマーは米国特許第4,886,741号に開示されており、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、デキストラン硫酸などのポリマーが挙げられる。ある態様では、ポリエチレングリコール（PEG）が50％PEG4000である。ある態様では、サークル形成用のキットが以下の構成要素を含む：
Figure 0005965108
 最終反応体積：20μL。上記の構成要素は以下のプロトコールで使用される：
1．DNA（5'-リン酸基および3'-ヒドロキシル基を持つssDNAテンプレート）の長さに応じてDNAを60〜96℃で加熱する。
2．2.2×反応混合物を60℃で約5〜10分間、予熱する。
3．DNAを96℃まで予熱した場合は、それを60℃に冷却する。
4．DNAとバッファーとを冷却せずに60℃で混合し、2〜3時間インキュベートする。
5．ライゲーション反応を停止するために酵素を熱失活させる。
ミスマッチ酵素切断による大規模突然変異発見
本発明のアレイおよびシークエンシング方法は、ミスマッチ切断技法を用いる多形の大規模同定に使用することができる。突然変異検出のためのいくつかのアプローチでは、ヘテロ二重鎖を使用し、ミスマッチそのものを切断認識に利用する。ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムを使って修飾されたミスマッチにおけるピリミジンによる化学的切断は、切断されたフラグメントを放出させるための一つのアプローチになる。同様にして、酵素T7エンドヌクレアーゼIまたはT4エンドヌクレアーゼVIIも、酵素ミスマッチ切断（EMC）技法に使用されている（例えばYouilら, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 87-91 (1995)；Mashalら, Nature Genetics, 9: 177-183 (1995)；Babonら, Molecular Biotechnology, 23: 73-81 (2003)；Ellisら, Nucleic Acids Research, 22: 2710-2711 (1994)など；これらは参照により本明細書に組み入れられる）。Cleavaseは、Third Wave Technologiesから商品化されている切断フラグメント長多形（cleavage fragments length polymorphism：CFLP）技法で使用される。一本鎖DNAをフォールドさせて二次構造をとらせると、DNAは、その鎖の塩基配列に依存する位置に、内部ヘアピンループを形成するだろう。Cleavaseは一本鎖DNAをそのループの5'側で切断するので、そのフラグメントをPAGEまたは同様のサイズ分割技法によって分離することができる。Mut SおよびMut Yなどのミスマッチ結合タンパク質も、その突然変異部位同定能力を、ヘテロ二重鎖の形成に依拠している。ミスマッチは通常、修復されるが、ゲル電気泳動における移動度シフトまたはエキソヌクレアーゼからの保護によってフラグメントを選択するために、これらの酵素の結合作用を使用することができる（例えばEllisら（前掲））。
ヘテロ二重鎖形成のためのテンプレートは、ゲノムDNAからのプライマー伸長によって調製される。基準DNAの同じゲノム領域について、試験DNAの場合と同じ方法で、ただし別個の反応として、過剰の反対鎖を調製する。生成した試験DNA鎖をビオチン化し、ストレプトアビジン支持体に取付ける。加熱と相補鎖の除去によってホモ二重鎖の形成を防止する。ここで、基準調製物を一本鎖試験調製物と混合して、アニールさせることにより、ヘテロ二重鎖を生じさせる。このヘテロ二重鎖はいくつかのミスマッチを含有すると思われる。残存DNAを洗い流してから、ミスマッチエンドヌクレアーゼを加える。仮に1kbごとにミスマッチがあるとすると、10kbプライマー伸長物の場合は、これにより、約10個のフラグメントが生成すると予想される。切断後に、各フラグメントは各末端でアダプターを結合して、ミスマッチフラグメントサークル選択工程に移行することができる。大きいゲノムフラグメントから得られるミスマッチ切断されたDNAの捕捉。大きいゲノムフラグメントから上述のように調製された5〜10kbのゲノムフラグメントを、ターミナルトランスフェラーゼでビオチン化ジデオキシヌクレオチドを3'末端に付加することによってビオチン化し、過剰のビオチン化ヌクレオチドを濾過によって除去する。同じ配列領域をカバーする基準BACクローンを、同じ6塩基切断因子で消化して、試験DNAから生成するフラグメントと一致させる。ビオチン化ゲノムフラグメントを、BAC基準DNAの存在下で熱変性し、ゆっくりとアニールさせて、ビオチン化ヘテロ二重鎖を生成させる。基準BAC DNAは、ゲノムDNAに対して大過剰であるから、ビオチン化産物の大半がヘテロ二重鎖になる。次に、基準DNAを除去するために、ビオチン化DNAを表面に取付けることができる。残存DNAを洗い流してから、ミスマッチエンドヌクレアーゼを加える。切断後に、各フラグメントは各末端でアダプターを結合して、以下に述べるミスマッチサークル選択工程に移行することができる。（a）DNAをミスマッチの両側で切断する。（b）連結することができる5'オーバーハングを生成させる（4塩基認識部位を持つ適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化で3'オーバーハングも生成させる）。（c）一端に活性オーバーハングを持っているアダプターを導入する。（d）アダプターを、生成した二つのフラグメントのそれぞれに連結する（上側の鎖の3'末端への配列の付加後、5'リン酸基から右側へのライゲーションのみ）。（e）その分子をリン酸化し、ブリッジングオリゴヌクレオチドを使って、一本鎖分子の二つの末端を連結する。(f）環状化後に、RCR反応でプライマーを伸長することによって、コンカテマーを生成させる。
ミスマッチ切断産物からのサークル形成
方法I．上で生成させたヘテロ二重鎖は、図7および図8に図解するように、小さいDNAサークルの選択に使用することができる。図7に示すように、この工程では、試料のヘテロ二重鎖（700）をミスマッチ酵素で処理して、突然変異部（702）を取り囲む両方の鎖（704および706）が切断された産物を生じさせることにより、フラグメント（707）および（705）を得る。T7エンドヌクレアーゼIまたは同様の酵素は、突然変位部位の5'側を切断して、突然変異を取り囲む両方の鎖にさまざま長さの5'オーバーハングを生じさせる。次の段階は、切断産物を増幅およびシークエンシングに適した形で捕捉することである。アダプター（710）を、ミスマッチ切断によって生じたオーバーハングに連結するが（フラグメント（705）だけを図示してある）、オーバーハングの性質がわからないので、少なくとも三つのアダプターが必要であり、各アダプターは考えうる全ての末端に適応するように縮重塩基を使って合成される。バッファー交換および試料精製ならびに所望であれば表面における直接増幅のための捕捉が可能なように、環状化されない鎖の上に内部ビオチン（708）を持つアダプターを製造することができる。
突然変異間の介在配列は配列決定する必要がなく、システムの配列決定容量を低下させるので、ゲノム由来の試料を研究する際には、これを除去する。配列複雑度の削減は、酵素認識部位から離れた点でDNAを切断するIIs型酵素によって達成される。そうする場合、切断部位とその結果生じるオーバーハングは、全ての塩基変異の組み合わせになるだろう。使用することができる酵素として、MmeI（2塩基の3'オーバーハングを持つ20塩基）およびEco P15I（25塩基と2塩基の5'オーバーハング）が挙げられる。アダプターは約50bp長で、ローリングサークル増幅を開始するための配列を提供すると共に、サークル形成用のスタッファー（stuffer）配列ならびにIIs型制限エンドヌクレアーゼの認識部位（715）を提供する。アダプターをフラグメントに連結し終えたら、DNAをIIs型制限酵素で消化（720）して、アダプターに取付けられたままの突然変異部位を含有する配列20〜25塩基分を除いて、全て放出させる。
次に、過剰のフラグメントDNAを除去するために、アダプター付きのDNAフラグメントをストレプトアビジン支持体に取付ける。ミスマッチ切断末端に連結しなかった過剰のアダプターもストレプトアビジン固形支持体に結合するだろう。IIs型酵素によって生成した新しい縮重末端は、ここで、第2のアダプターに、第2アダプターの一方の鎖のリン酸化によって連結することができる。他方の鎖はリン酸化されず、3'末端がジデオキシヌクレオチドでブロックされる。形成された構造は基本的に、二つの異なるアダプターの間に捕捉された関心対象のゲノムフラグメントである。この構造からサークルを生成させるには、単に、例えば制限部位（722）および（724）での消化によって付着末端を形成させた後、分子内ライゲーションを行うことなどにより、分子の両端を一つにして連結するだけでよい。この事象は効率よく起こるはずだが、別の分子の末端がその分子の他方の末端で連結して、各ユニット分子の二量体分子またはそれ以上の多量体を生成させる可能性もある。これを最小限に抑えるための一方法は、分子内ライゲーションだけが有利になるように希釈条件下でライゲーションを行ってから、その後のステップのために試料を再濃縮することである。分子間ライゲーションを起こさずにサークル形成の効率を最大にするためのもう一つの戦略は、表面上の過剰なアダプターをブロックすることである。これは、ラムダエキソヌクレアーゼを使って下側の鎖を消化することによって、達成することができる。第2のアダプターが既に取付けられているなら、それは消化から保護されるだろう。なぜなら、利用できる5'リン酸基がないからである。第1アダプターだけを表面に取付けると、5'リン酸基が露出されて、アダプターの下側の鎖が分解を受ける。これにより、過剰の第1アダプターが表面から失われることになる。
ラムダエキソヌクレアーゼ処理後、第1アダプターの上側の鎖の5'末端を、第2アダプターの3'末端へのライゲーションに向けて準備する。これは、分子の再環状化がライゲーションと共に起こりうるように、アダプターに制限酵素部位を導入することによって達成することができる。環状分子中に捕捉されたDNAの増幅がローリングサークル増幅によって進行すると、サークルの長い線状コンカテマーコピーが形成される。伸長がビオチンの5'側で始まると、サークルおよび新たに合成された鎖が、溶液中に放出される。表面上の相補的オリゴヌクレオチドは凝集の原因となり、下流での応用にとって十分な結合をもたらす。一方の鎖は閉じたサークルであり、テンプレートとして働く。露出した3'末端を持つ他方の鎖は、開始プライマーとして働き、伸長される。
方法II．図8に図解するこの方法は、上述の手法に似ていて、以下の点が変更されている：1）バッファー交換および試料精製のための捕捉が可能なように、環状化されない鎖の上に3'ビオチン（808）を持つアダプターを製造することができる。2）上述した10kbヘテロ二重鎖フラグメントの配列複雑度の削減を、例えば制限部位（810）（812）および（814）による4塩基切断制限酵素を使って行う。一つの反応に2個または3個の酵素を使用すると、ゲノムフラグメントサイズを約100塩基まで縮小することができるだろう。アダプター-DNAフラグメントは、過剰なフラグメントDNAを除去するために、ストレプトアビジン支持体に取付けることができる。ミスマッチ切断された末端に連結しなかった過剰なアダプターも、ストレプトアビジン固形支持体に結合するだろう。次に、ビオチン化およびリン酸化された鎖を、ラムダエキソヌクレアーゼで除去することができる。このラムダエキソヌクレアーゼは、5'末端から分解させるが、リン酸化されていない鎖は無傷のまま残す。ここで、この構造からサークルを生成させるには、分子の両端を一つにし、それらを連結して、サークルを形成させる必要がある。上述のようにブリッジングオリゴヌクレオチドを使ってサークルを形成させるために、いくつかのアプローチを利用することができる。ターミナルトランスフェクラーゼで3'末端にポリクレオチドを付加することにより、ブリッジオリゴヌクレオチド（818）の半分をそこにハイブリダイズさせるための配列を作りだすことができる（ポリAテール（816）として示す）。残りの半分はアダプター中の配列に結合することになる。あるいは、エキソヌクレアーゼによる一方の鎖の除去後にブリッジをそこにハイブリダイズさせるための配列になるようなアダプターを、エキソヌクレアーゼの添加前に、4塩基切断因子によって生成される末端に付加することもできる。この選択手法の重要な一面は、環状化および増幅のための鎖を選択できることである。これにより、元の突然変異を持つ鎖（5'オーバーハングに由来）だけが増幅され、アダプターに由来する鎖は増幅されないことが、保証される。もし3'陥凹鎖が増幅されると、アダプターからのミスマッチが、突然変異部位またはその近傍に、偽の塩基コールを生成しうる。環状分子中に捕捉されたDNAの増幅がローリングサークル増幅によって進行すると、サークルの線状コンカテマーコピーが形成される。
ミスマッチに由来するサークルの他の応用例．ミスマッチに由来する小さい環状DNA分子は、PCRなどの他の手段によって増幅することができる。一般的なプライマー結合部位をアダプター配列中に組み込むことができる。増幅した材料は、Sangerシークエンシングまたはアレイベースのシークエンシングなどといった方法による突然変異検出に使用することができる。
cDNAの無細胞クローン選択．伝統的なクローニング方法には、細菌がプラスミド複製による配列を排除する傾向を持つことや、個々のcDNA分子のクローンを作成するには時間の掛かる試薬集約的なプロトコールが必要であることなど、いくつかの短所がある。線状一本鎖は、閉じて環状型になっているDNA分子の増幅によって作製することができる。これらの大きなコンカテマー状の線状型は単分子から生じ、細菌コロニーを拾ってcDNA含有プラスミドを回収するのとほぼ同じ方法で単一の反応チャンバに分離すれば、効率の良い単離されたターゲットとしてPCRに役立ちうる。本発明者らは、このアプローチを、細胞に基づくクローン選択ステップを通す必要のないcDNAクローン選択手段として開発するつもりである。この手法の第1ステップでは、cDNAの3'末端のポリdT配列に結合させるためのポリdA配列を持つ、5'末端に対する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを連結する。このオリゴヌクレオチドは、T4 DNAリガーゼを使って2つの末端を連結し、サークルを形成させることを可能にするブリッジとして働く。
反応の第2ステップは、プライマーまたはブリッジングオリゴヌクレオチドを使って、φ29ポリメラーゼなどの鎖置換ポリメラーゼに、サークルのコンカテマーを生成させることである。次に、長い線状分子を希釈し、1536ウェルプレートに、単分子を含むウェルを選択することができるようにアレイする。ウェルの約10％が1分子を含有することを保証するために、約90％は分子を含まないものとして犠牲にする必要があるだろう。陽性であるウェルを検出するために、ターゲット中のユニバーサル配列を認識するデンドリマーをハイブリダイズさせて、ターゲット1分子あたり10K〜100Kの色素分子を生じさせる。過剰なデンドリマーを、ビオチン化捕捉オリゴへのハイブリダイゼーションによって除去する。ウェルを蛍光プレートリーダーで解析し、DNAの存在をスコアリングする。次に、陽性ウェルを再アレイすることにより、さらなる増幅のために、完備したウェルを持つプレートへとクローンを統合する。
スプライス変異体検出およびエクソンプロファイリング
ここに記載する工程は、何千もの遺伝子およびそれらのスプライス変異体の発現レベルを同定および定量するためのランダムDNAアレイと「スマート（smart）」プローブプールに基づく。真核生物では、一次転写物が転写複合体から現われるにつれて、スプライソソームが、一次転写物上のスプライス部位と相互作用して、イントロンを切り出す（例えばManiatisら, Nature, 418: 236-243 (2002)）。しかし、スプライス部位配列を改変する突然変異またはスプライソソームとスプライス部位の相互作用に影響を及ぼす外部因子のせいで、選択的スプライス部位または潜在的スプライス部位が選択されて、異なるエクソンセットを持つmRNAによってコードされるタンパク質変異体の発現をもたらすということが起こりうる。大規模ESTシークエンシングプロジェクトで得られたcDNA配列の調査により、50％を超える遺伝子が既知のスプライス変異体を持つことが示された。マイクロアレイに基づくアプローチを使った最近の研究では、75％もの遺伝子が選択的スプライシングを受ると見積られた（例えばJohnsonら, Science, 302: 2141-2144 (2003)）。
選択的スプライシングによって生じるタンパク質の多様性は、高等真核生物における生物学的過程の複雑さの一因になっている可能性がある。また、このことから、変異型タンパク質の異常発現が疾患の病理発生の原因になりうることも考えられる。実際、選択的スプライシングは、成長ホルモン欠乏症、パーキンソン病、嚢胞性線維症および筋緊張性ジストロフィーのようなさまざまな疾患に関連することがわかっている（例えばGarcia-Blancoら, Nature Biotechnology, 22: 535-546 (2004)）。新規なスプライス変異体を単離し、特徴づけるのは困難であるため、がんにおけるスプライス変異体の役割を暗示する証拠は、氷山の一角に過ぎないのかもしれない。mRNAのスプライシングパターンを迅速かつ確実に特徴づけることができるツールを入手することができれば、がんおよび疾患発生全般における選択的スプライシングの役割を解明するのに役立つだろう。
一態様として、本発明の方法は、以下に挙げるステップによるスプライス変異体の大規模測定を可能にする。（a）ターゲットmRNAまたは全mRNAから完全長第1鎖cDNAを調製する。（b）生成した完全長（または全）第1鎖cDNA分子を、アダプター配列の組み込みによって環状化する。（c）アダプター配列に相補的なプライマーを使って、cDNAサークルのローリングサークル複製（RCR）を行うことにより、最初のcDNAを100コピー以上含むコンカテマーを形成させる。（d）アダプター配列の一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで被覆されたガラス表面に、RCRで作製した「cDNAボール」を取付けることにより、ランダムアレイを調製する。高度なサブミクロンパターニングが施された表面の場合、1mm2に100万〜1000万のcDNAスポットを設けることができる。この取付けは分子過程であり、個々の「cDNAボール」またはコンカテマーをロボットでスポッティングする必要はないことに注意されたい。（e）試料生物/組織中の1000以上のターゲット遺伝子〜全ての既知遺伝子に含まれる10,000以上のエクソンを全て試験するために、4096の6マーおよび1024の標識5マーの既製ユニバーサルライブラリーから出発して、高度なコンピュータプログラムと簡単なロボットピペッターとを使って、約200の6マーおよび20の5マーの40〜80プールを作成する。（f）各サイクルのアレイ画像を生成させるための高感度10メガピクセルCCD検出器を持つ自動化された顕微鏡様の機器を使って、4〜8時間の工程において、40〜80サイクルで全てのプローブプールを、同じランダムアレイにハイブリダイズ/連結させる。（g）コンピュータプログラムを使って、スポットシグナル強度解析を行うことにより、どのcDNAがどのスポット上にあるかを同定すると共に、予想されるエクソンのいずれかが、解析した遺伝子のいずれかに、欠けているかどうかを同定する。アレイにおける出現数を計数することにより、各スプライス変異体について正確な発現レベルを得る。
標識mRNA/cDNAとハイブリダイズさせた現行の発現アレイを使って、ただ単に、転写された遺伝子の集団全体にわたる、エクソン使用の比率に関する情報、またはスプライシング事象の定量を得る代りに、このシステムでは、一つの転写物についてエクソンパターンの完全な解析が得られる。その感度の上限では、何百という他の細胞のうちの1細胞にしか存在しないmRNAタイプの単分子まで、詳細に解析することができる。これは、癌細胞の早期診断にユニークな可能性をもたらす。選択的cDNA調製物と、標準的な384ウェルフォーマットの「ランダムアレイのアレイ」と、ユニバーサルな短いプローブの「スマート」プールとの組み合わせは、例えば選択した試料中の少数遺伝子の深い解析、または多数の試料における、より全般的な解析、または小数試料中の多数の遺伝子の解析など、アッセイの設計に著しい自由度を与える。解析は、1）各特異的スプライス変異体の検出、2）野生型mRNAおよび選択的スプライシングを受けたmRNAの発現の定量を、同時にもたらす。ヘテロ接合性の喪失およびランダムアレイ上の単スポット上の同じ転写物における二つの遺伝子からのエクソンの二つのサブセットの存在により、遺伝子欠失および遺伝子転座の検出に基づいて、総体的な染色体変化をモニターするために使用することもできる。このアッセイの例外的な容量と情報量は、極めて少量のmRNAからの簡単な試料調製、全て既製の実証された試薬類（ユニバーサル標識および非標識プローブのライブラリーならびに最終的には全てのヒトおよびモデル生物遺伝子について開発されるであろうプライマー/アダプターを含む）に基づく完全に自動化されたアッセイと結びつけて考えられる。ここに提案するスプライス変異体プロファイリング工程は、個々の完全長cDNAクローンのハイスループットシークエンシングと等価であり、rSBHスループットは、4〜8時間のアッセイで100万cDNA分子のプロファイリングに達することができる。このシステムは、疾患の出現および進行中に起こるさまざまなスプライス変異体の発現レベルの変化をモニターするための強力なツールになるだろう。新規スプライス変異体の発見を可能にすること、または既知のスプライス変異体ががんの進行をモニターするための生体マーカーとして役立つことを実証することもできる。選択的スプライス変異体の役割および治療ターゲットとしてのそれらの考えうる用途をさらに理解するための手段を提供することもできる。この低コストなハイスループットアッセイの万能性および柔軟性は、がん研究および診断薬ならびに他の全ての生物医学分野において、大きな商業的機会をもたらす。この高容量システムはサービス提供ラボまたはサービス提供会社にとって理想的である。
インビトロ転写用テンプレートの調製．エクソン配列を、プラスミドpBluescriptなどのベクターのマルチクローニング部位（MCS）にクローニングする。プローブプールの有用性を実証する目的には、連続した完全長配列をクローニングする必要はなく、適正なタンパク質コーディングフレームを維持する必要もない。1kbより短い遺伝子の場合は、完全長配列用の遺伝子特異的オリゴを使って、PCR産物をcDNAから生成させる。それより長い遺伝子の場合は、エクソンの連続するブロックに対応する約500bpを含むPCR産物を生成させ、pBluescriptのMCS中の適当なクローニング部位にクローニングすることによって、それらのフラグメントを順序づける。これは、選択的スプライス変異体をクローニングするためのアプローチでもある。というのも、望ましい変異体は、PCRに使用されるcDNAソース中に存在しないかもしれないからである。
MCSの最後の部位を使って、細胞mRNAのポリAテールを真似るために、40個のAからなるストリングを挿入する。これは、ポリAテールが後述する試料調製ステップと干渉するかもしれないという可能性を考慮に入れるためだが、ポリdAテールは、上述のゲノムフラグメントの試料調製物に組み込まれるので、これが問題になるとは思われない。T7 RNAポリメラーゼを使って、ランオフ転写物を生成させ、生成したRNAを標準的な方法で精製する。
アレーイング用試料の調製。プローブプールは特定遺伝子用に設計されるので、それら特定遺伝子だけについて、cDNAを調製する。逆転写酵素反応をプライミングするために、遺伝子特異的プライマーを使用する。したがって1000の遺伝子には、1000のプライマーを使用する。逆転写のためのプラミング部位の位置は、注意深く選択する。というのも、＞2kbのcDNAの合成が高い効率で起こると期待することは、合理的でないからである。最後のエクソンがコーディング配列の末端と長い3'非翻訳領域とからなることは、非常によくあることである。例えばCD44の場合、完全長mRNAは約5.7kbであるが、3'UTRは3kbから構成され、コーディング領域は2.2kbしかない。したがって、逆転写プライマー部位の論理的な位置は、通常は、コーディング配列の末端のすぐ下流である。一部のスプライス変異体では、選択的エクソンがしばしばブロックとして一つにクラスター化して、変動領域を生じる。テネイシンC変異体（8.5kb）の場合、最も一般的なアイソフォームは、8追加エクソンのブロックを持ち、この領域におけるエクソン使用には変動があることを示唆する証拠がある。したがって、テネイシンCの場合、プライマーはこの領域のすぐ下流に置かれるだろう。＞2kbの長さを持つcDNAの合成に関わる問題ゆえに、長い遺伝子については、複数のプライマーを使ってエクソンを2kbのブロックに分割する必要があるかもしれない。
逆転写反応は、市販のシステム、例えばInvitrogen（カリフォルニア州カールズバッド）のSuperScript IIIシステムや、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）のStrataScriptシステムを使って行うことができる。一本鎖cDNA分子を作製したら、残りの手順には、上述のように、アダプター配列の付加、分子の環状化およびRCRが含まれる。cDNAの5'末端は、基本的に、逆転写を開始させるために使用した遺伝子特異的プライマーが組み込まれたものである。逆転写プライミングオリゴの5'末端上に7塩基ユニバーサルタグを組み込むことにより、生成するcDNAは全て、同じ7塩基配列を5'末端に持つことになる。従って、縮重塩基を持つテンプレートオリゴヌクレオチドを使わなくても、アダプター配列とユニバーサルタグの両方に相補的な単一のテンプレートオリゴヌクレオチドを使って、ターゲット分子の全てにアダプターを連結することができる。通常は不明確なcDNAの3'末端（mRNAの5'末端）については、ゲノムフラグメントのランダム配列末端のように処理することができる。ポリAテールを付加する同様の方法が適用されるだろう。したがって、サークル閉環反応も、同じものを使用することができる。
逆転写酵素は、時期尚早に終結して、切断型cDNAを生成しやすい。著しく切断されたcDNAは、おそらく、遺伝子割当てに結びつくほど十分なプローブ結合部位を持たず、したがって解析されないだろう。完全長に近いが完全長ではないcDNA分子は、5'エクソンを欠くスプライス変異体として現われうる。そのような変異体を裏付ける補強証拠が配列データベースから得られないのであれば、それらは無視されうる。そのような問題を避ける方法は、完全長cDNA（または望ましい3'末端を持つもの）だけを、サークル閉環反応に適合するものとして選択することである。そうすれば、切断型分子は環状化されず、複製もされないだろう。まず、ライゲーションをブロックするために、ジデオキシ-シトシン残基を全てのcDNAの3'末端に付加することができ、次に所望の配列をターゲットとするミスマッチオリゴを使って、新しい3'末端を、T4エンドヌクレアーゼVIIを使って酵素ミスマッチ切断によって生成させることができる。新しい3'末端を持つcDNAは、続いてポリdAテールを付加し、環状化および複製の標準的プロトコールに付すことができる。
エクソンフラグメントのコンカテマーの複製およびアッセイは、上述のように、コンビナトリアルSBHを使って行うことができる。この技法で用いる5マーおよび6マープローブを選択するために、以下のステップのアルゴリズムを使用することができる。
ステップ1：1000〜2000の最も短いエクソン（全部で約20〜50kb）を選択し、1024個の利用可能な標識5マーのそれぞれについて、マッチする配列を見つける。平均すると、各5マーは、20kbに20回出現するだろうが、一部は50回以上または100回以上出現しうる。最も頻度の高い5マーを選択することにより、最も多数の短いエクソンが、単一の標識プローブで検出されるだろう。目標は、1サイクルあたり約50〜100個の短いエクソン（500エクソンの10％〜20％）を検出することである。したがって、10個未満の標識プローブおよび50〜100個の非標識6マーで十分だろう。少数の標識プローブが好ましい。なぜなら、それにより、総蛍光バックグラウンドが最小限になるからである。
ステップ2．選択した10個の5マーに相補的な1000個の遺伝子全てにおける全ての部位に隣接する全ての6マーを見つける。平均して、各2kb遺伝子にそのような部位が20存在するだろう。部位の総数は約20,000になり、例えば各6マーは平均して5回出現するだろう。6マーをヒット頻度で分類する。最も頻繁なものは20ヒット以上を持ちうる。例えばそのような6マーは、10個の標識プローブと組み合わせることにより、20遺伝子を検出するだろう。したがって、500遺伝子のそれぞれについて一つのプローブペアを得るには、最低25個の6マープローブが必要だろう。現実的には、100〜200個の6マーが必要になりうる。
6マーおよび5マープローブの既製のライブライーを使用するコンビナトリアルSBHの利点ゆえに、確立されたピペッティングロボティクスを使って、1プールにつき約200プローブを含む40のプローブプールが容易に調製される。生成する情報は、1エクソンあたり3つを上回るプローブを持つことに等しいので、1セットの1000遺伝子に要求される30,000の長いエクソン特異的プローブが、8000の5マーおよび6マーの使用で効果的に置き換えられる。
エクソンプロファイリング．エクソンのプロファイリングは、遺伝子同定段階およびエクソン同定段階という二段階で行うことができる。遺伝子同定段階では、アレイ上の各コンカテマーを、ある特定遺伝子とユニークに結びつけることができる。理論的には、以下のスキームを使えば、1000個の遺伝子を同定するのに、10のプローブプールまたはハイブリダイゼーションサイクルで十分だろう。各遺伝子にユニークな二進コードを割り当てる。したがって、二進数字の数は、8遺伝子の場合は3数字、1024遺伝子の場合は10数字というように、遺伝子の総数に依存する。各プローブプールは、二進コードの数字に対応するように設計され、1遺伝子につき1ヒットだけで、それらの遺伝子の半分のユニークな組み合わせをヒットするようなプローブを含有するだろう。したがって、各ハイブリダイゼーションサイクルにつき、遺伝子のユニークな半分は、その数字に関して1を記録し、残りの半分は0を記録するだろう。10個のプローブプールを使った10回のハイブリダイゼーションサイクルにより、アレイ上のコンカテマーの全てに1000のユニークな遺伝子を割り当てるのに十分な、1024のユニークな二進コードが生成する。同定データに冗長性を与えるために、15〜20サイクルが使用されるだろう。20サイクルを使用した場合、100万のユニークな二進コードが得られ、失われたエクソンまたは遺伝子欠失によるシグナルの喪失を説明するのに十分な情報が存在するはずである。またこれは、平均で、各遺伝子につき10データポイント（それぞれ500データポイントの20サイクルは、合計10,000データポイントをあたえる）または1エクソンにつき1陽性プローブペアを持つことに等しくなるだろう。20サイクル後のこの時点で、このシステムは、アンプリオット（ampliot）に100万のユニークな遺伝子アイデンティティを割り当てる能力を持つ。したがって、アンプリオットの遺伝子アイデンティティを数えることにより、与えられた任意の試料中の全ての遺伝子の発現レベルを定量的に決定すること（ただしスプライス変異体のサブタイピングではない）ができる。
各アンプリオットを遺伝子割当てと結びつけた後、エクソン同定段階では、そのエクソンパターンがプロファイリングされる。エクソン同定段階では、遺伝子の全てまたは大半において、1遺伝子につき1つのエクソンが、1回のハイブリダイゼーションサイクルで試験される。ほとんどの場合、10〜20回のエクソン同定サイクルで十分なはずである。したがって、20回のエクソン同定サイクルの場合、各遺伝子中の10エクソンのそれぞれについて2プローブの情報が得られるだろう。20を超えるエクソンを持つ遺伝子の場合、1遺伝子につき2エクソンを同じサイクルでプローブすることができるような方法を開発することができる。一つの可能性は、色の異なる複数の蛍光体を使用することであり、もう一つの可能性は、異なるライゲーションプローブペアの差別的なハイブリッド安定性を利用することである。
結論として、合計約40回のアッセイサイクルにより、各スポットにおける遺伝子アイデンティテイを取得し、10,000エクソンのそれぞれについて、選択的スプライシングまたは染色体欠失による失われたエクソンの正確な同定をもたらすのに十分な情報冗長性で、3つのマッチングプローブペアを提供するのに十分な情報が与えられるだろう。
ランダムアレイ支持体としてのガラスカバースリップ：
誘導体化プロトコール
この実施例では、DNAコンカテマーを配置するための支持体として使用されるガラスカバースリップを製造する。以下の材料を使用する：
Millipore DI水
2.5mLの3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン（Gelest）
1.6グラムのp-フェニレンジイソチオシアネート（Acros Organics/fisher）
210グラムのKOH（VWR）
エタノール（VWR）
メタノール（VWR）
ピリジン（VWR）
N,N-ジメチルホルムアミド（VWR）
アセトン（VWR）
装置
100c乾燥器
磁気撹拌プレート
2インチ×0.5インチ磁気撹拌子 1
4リットルNuncビーカー 2
4インチ×8インチ×4インチ硝子容器 7
1リットルメスシリンダー
100mLメスシリンダー 1
実験用天秤 1
Metzlerはかり 1
大秤量皿 1
小秤量皿 1
厚手ニトリル手袋 1対
大ロート 1対
1mLピペットマン（フィルターチップ付き）
Nalgene撹拌子 1
気密容器（タッパーウェア） 1
大メスシリンダーを使ってエタノール950mlを計量し、4リットルNuncビーカーに加える。小メスシリンダーでDI水50mlを計量し、同じnuncビーカーに入れる。KOHペレット210グラムを実験用天秤の秤量皿に秤取る。ビーカーに撹拌子およびKOHペレットを加える。ビーカーを撹拌プレートに置き、KOHが完全に溶解するまで低速で撹拌する。KOHを溶解している間に、予洗したガラス容器6個を配置する。容器2〜5を上端から1/2インチまでDI水で満たす（約800ml）。容器6を上端から1/2インチまでアセトンで満たす。溶解したKOH溶液を容器1に上端から1/2インチまで注意深く注ぎ込む。ラックに収納したカバースリップを容器1に入れて3分間待ち、容器1からラックを取り出し、容器2〜5で、それぞれの容器にラックを最低15秒間は放置することによって洗浄する。ラックを容器6に短時間沈める。ラックを取りのけておき、容器1および2の溶液を、塩基性廃液容器に、大ロートと厚手ニトリル手袋を使って捨て、実験器具を清掃し、乾燥する。清浄な乾燥ガラス容器7個を配置する。容器1にアセトン775mlを加える。容器1にDI水2.5mlを加える。容器1をピペットチップで20秒間撹拌する。新しいピペットチップを使って、3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン2.5mlを容器1に加える。ピペットチップを使って10秒間撹拌する。カバースリップのラック5個を全て、容器に浸漬する。容器1をポリプロピレン製のフタで覆う。45分間待つ。反応完了の15分前に、容器2〜4をアセトンで上端から1/2インチまで満たし、容器5を水で上端から1/2インチまで満たす。容器6をアセトンで上端から1/2インチまで満たす。反応が完了（45分間）したら、カバースリップラック1〜5を容器1から容器2に移し、15秒間待つ。これを容器6まで繰り返す。ラックを空の容器7に入れ、100c乾燥器に入れる。1時間待つ。ガラス容器7個を配置する。ラックを乾燥器から取り出した後、Meltzerはかりを使って、p-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）1.6グラムを小秤量皿に秤取る。洗浄した1リットルメスシリンダーにジメチルホルムアミド720mlを注ぎ込み、ピリジンで800mlまで満たす。この溶液を、清浄な硝子容器に50％注ぎ込んだ後、それをシリンダーに戻すことによって混合する（1回繰返す）。この溶液で容器1を上端から1/2インチまで満たす。PDCを秤量皿から容器1に加える。撹拌子を使って容器を混合する。溶解しようとしないPDC塊を押し砕き、再び撹拌する。この時点でカバースリップラックはもう冷めているはずである。5つのラックすべてを容器1に入れる。ポリプロピレン製のフタで覆う。2時間待つ。反応完了の10分前に、容器2および3をメタノールで上端から1/2インチまで満たす。容器4および5をアセトンで上端から1/2インチまで満たす。容器6を65％アセトン35％水で上端から1/2インチまで満たす。容器7をアセトンで満たす。ラックを順次、全ての容器に移し、それぞれの移動の間、15秒間待つ。ラックを容器7から取り出し、容器1〜7の内容物を、有機廃液槽に捨てる。ラックを容器7に移し、乾燥器で15分間乾燥する。乾燥したラックを気密容器に入れる。この時点で取付けの準備ができている。
大腸菌ゲノムDNAからのRCR産物の調製およびガラスカバースリップへの配置
大腸菌ゲノムDNA（32μg）（Sigma Chemical Co）をDnaseI（Epicentre）0.16Uを使って37℃で10分間断片化した後、95℃で10分間熱失活させた。アガロースゲル電気泳動で確認したところ、反応産物は平均サイズ200bpで分布していた。反応産物が所要のサイズ分布を満たさない場合は、新しい酵素を加えて、それらをさらに消化した。ゲノムDNAの最終濃度は200ng/μlだった。
Dnase消化したDNA（26ng/μl）を、New England Biolabs（NEB）のターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（0.66U/μl）と、NEBが供給する反応バッファー中で反応させた。この反応はdATP（2mM）を含有し、37℃で30分間行った後、70℃で10分間熱失活させた。次に、DNA試料を95℃に5分間加熱してから、氷で急冷した。
次に、まず、65塩基オリゴヌクレオチド（TATCATCTACTGCACTGACCGGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGGGTCACATTAACGGAC）（配列番号8）と第2のオリゴヌクレオチド（NNNNNNNGTCCGTTAATGTGAC3'2'3'ddC）（配列番号9）とのハイブリッドを65マーの3'末端で形成させること（この際、7つの「N」はオーバーハングを形成する）により、ゲノムDNAの5'末端に、合成DNAアダプターを連結した。短い方のオリゴは、ゲノムフラグメントの5'末端に65マーを連結するためのスプリントとして役立つだろう。このスプリント分子は、その5'末端が、ゲノムDNAの5'末端にあるさまざまな塩基にハイブリダイズする7つの縮重塩基からなっている。1200pmolのアダプターを1200pmolのスプリントとを、52μl中、95℃から室温まで1時間かけて、ゆっくりハイブリダイズさせることにより、アダプターハイブリッドを形成させた。
T4 DNAリガーゼ（0.3U/μl）を、ゲノムDNA（17ng/μl）およびアダプター-スプリント（0.5μM）と、NEBが供給する1×リガーゼ反応バッファー中で混合した。ライゲーションを15℃で30分間、20℃で30分間進行させた後、70℃で10分間失活させた。次に、第2のスプリント分子（AGATGATATTTTTTTT3'2'3'ddC）（配列番号10）（0.6μM）を反応に加え、その混合物にリガーゼバッファーおよびT4 DNAリガーゼ（0.3U/μl）を追加した。反応を15℃で30分間、次に20℃で30分間進行させてから、70℃で10分間失活させた。
次に、ライゲーション混合物を、エキソヌクレアーゼI（NEB）（1U/μl）で、37℃で60分間処理した後、80℃で20分間失活させた。
ローリングサークル複製は、NEBが供給する反応バッファー中、BSA（0.1μg/μl）、0.2mM各dNTP、開始プライマー（TCAGCTTCCTTTTGTCTTCCTAAC）（配列番号11）2fmol/μl、エキソヌクレアーゼで処理したゲノムDNAのライゲーション24pg/μl、およびφ29ポリメラーゼ（0.2U/μl）を使って行った。反応を30℃で1時間行った後、70℃で10分間熱失活させた。
カバースリップの表面にまずアミン修飾オリゴヌクレオチドを取付けることにより、カバースリップの表面にRCR反応産物を取付けた。0.1μM NaHCO3中で捕捉プローブ（[AMINOC6][SP-C18][SP-C18]GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG）（配列番号12）（50μM）をDITC誘導体化カバースリップに加え、40℃で約30分間乾燥させた。カバースリップをDDI水で15分間すすぎ、乾燥した。次に、RCR反応産物（4.5μl）を0.5μlの20×SSPEと混合し、スライドの中心に加えた。試料を風乾し、取付けられていない物質を3×SSPE中で10分間洗い落とした後、DDI水で短時間洗浄した。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。
RCR反応産物を、一本鎖80マー合成DNAターゲット（NNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNATCGTNCAAACGTCAGTCCANGAATCNAGATCCACTTAGANTAAAAAAAAAAAA）（配列番号13）から、上述のように、ただしTDTによるポリA付加を行わずに形成させた。このRCR反応は推定12.6fmol/μlのターゲット分子を含有した。反応産物（5μl）を、20μlの総反応体積で、SSPE（2×）およびSDS（0.3％）と混合した。0.1μM NaHCO3を使って50μMの溶液中で沈着させた捕捉プローブ（[AMINOC6][SP-C18][SP-C18]GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG）の列を表面上に乾燥させたカバースリップに、試料を適用して、湿潤チャンバ中に30分間放置した。次に、その溶液を3×SSPE中で10分間洗い落としてから、水中で短時間洗浄した。
さまざまな反応構成要素を、それらがRCR産物形成に及ぼす影響について調べた。RCR反応にはφ29を0.2U/μlの最終濃度で加えるよりも、0.1U/μlの最終濃度で加えた方が、検出プローブハイブリダイゼーション後の強度が大きいRCR産物をより高い比率で生成することがわかった。開始プライマーは推定ターゲット濃度に対して10〜100倍のモル比で添加することが最適であることもわかった。伸長時間を長くすると、より強い蛍光シグナルが得られるが、より発散したコンカテマーを生じる傾向があった。現在の取付けプロトコールでは、2時間の伸長時間により、RCR産物の形態への有害な影響を最小限に抑えつつ、1時間のインキュベーションと比較して強化されたシグナルが得られた。
合成およびゲノムターゲットの推定濃度を、RCR反応中、0.1から0.25fmol/μlに下げることによって、RCR産物のさらなる最適化が達成された。これは、典型的には、取付けに方法1を使用することにより、明確でユニークなPCR産物を、顕微鏡スライドの表面にもたらす。より高濃度のターゲット（例えば＞5fmol/μl）がRCR反応中に存在しうる合成ターゲットの場合は、RCR産物を方法2で取付けることができる。取付け方法1．RCR反応産物（4.5μl）を0.5μlの20×SSPEと混合し、スライドの中央に加えた。試料を風乾し、取付けられていない材料を3×SSPE中で10分間洗い落としてから、DDI水中で短時間洗浄した。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡上で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。取付け方法2．RCR反応産物（1μl）を50μlの3×SSPEと混合し、捕捉プローブが取付けられているカバースリップの中央に加えた。SDS（0.3％）を添加すると、誘導体化された表面にではなく、捕捉プローブへの特異的な取付けが促進されることがわかった。試料を室温で30分間インキュベートし、取付けられていない材料を、3×SSPE中で10分間洗い落とした後、DDI水中で短時間洗い落とした。次に、スライドを乾燥してから、顕微鏡上で組み立てた。取付けられたRCR産物を、アダプターの一領域に相補的な11マーTAMRA標識プローブをハイブリダイズさせることにより、可視化した。上記のプロトコールにより、2〜4平方ミクロンあたり約1RCR産物というRCR産物密度が得られる。得られたカバースリップの代表的な画像を図3に示す。
蛍光標識プローブを使ったRCR産物の識別
炭疽菌（Bacillus anthracis）およびペスト菌（Yersinia pestis）の診断領域に由来するPCR産物を一本鎖DNAに変換し、ユニバーサルアダプターに取付けた。次に、それら二つの試料を混合し、RCRを使って一緒に複製し、ガラス表面上にランダムアレイとして沈着させた。図4に図解するように、アンプリコン特異的プローブによる逐次的ハイブリダイゼーションにより、アレイ上の各スポットが上記二つの配列のどちらか一方にユニークに対応すること、およびそれらをそのプローブと特異的に結びつけうることが示された。この結果は、RCR反応によって生成する約100〜1000コピーのDNAフラグメントを持つサブミクロンサイズのDNAコンカテマー中に存在するDNAを同定する際の感受性および特異性を示している。炭疽菌由来の155bpアンプリコン配列およびペスト菌由来の275bpアンプリコン配列を、プライマーペアのうち一方のプライマーをリン酸化したPCRプライマーを使って、標準的なPCR技術で増幅した。リン酸化された鎖をラムダエキソヌクレアーゼで分解することにより、一本鎖型のPCR産物を生成させた。次に、一本鎖産物をユニバーサルプアダプターに連結することができるように、T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼを使って、残った鎖の5'末端をリン酸化した。ターゲットの5'末端とユニバーサルアダプターの3'末端とに相補的なテンプレートオリゴヌクレオチドの助けを借りて、ユニバーサルアダプターをターゲット分子の5'末端に、T4 DNAリガーゼを使って連結した。次に、アダプターを連結したターゲットを、アダプターとターゲットの3'末端とに相補的な塩基を持つブリッジングオリゴヌクレオチドを使って環状化した。エキソヌクレアーゼIを使った処理により、線状DNA分子を除去した。一本鎖試料を混合し、ブリッジングオリゴヌクレオチドを開始プライマーとして、環状化したアダプター-ターゲット分子をφ29ポリマーゼで複製することにより、RCR産物（DNAコンカテマー）を生成させた。
アミン修飾オリゴヌクレオチドの取付けに備えてカバースリップを準備するために、カバースリップをまずカリウム/エタノール溶液中で洗浄した後、すすいで、乾燥した。次に、それらを3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン、アセトン、および水の溶液で45分間処理し、100℃の乾燥器で1時間キュアした。最終ステップとして、カバースリップをp-フェニレンジイソチオシアネート（PDC）、ピリジン、およびジメチルホルムアミドの溶液で、2時間処理した。捕捉オリゴヌクレオチド（配列5'-GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG-3'）（配列番号14）はユニバーサルアダプター配列に相補的であり、5'末端がアミン基および2つのC-18リンカーで修飾される。取付けのために、0.1M NaHCO3中10μMの捕捉オリゴ10μlを、誘導体化したカバースリップの中央にスポットし、70℃で10分間乾燥し、水ですすいだ。DNAコンカテマーのアレイを作るために、DNAコンカテマーを含有するRCR反応液を3×SSPEで10倍に希釈し、次に、そのうちの20μlを、カバースリープ表面上の固定化捕捉オリゴヌクレオチド全体に、水分飽和チャンバ中で30分間、沈着させた。次に、DNAコンカテマーを含むカバースリップを反応チャンバに組み入れ、2mLの3×SSPEですすいだ。炭疽菌およびペスト菌に由来するアレイ化ターゲットコンカテマー分子を、TAMRA標識オリゴマー：プローブBrPrb3（配列：5'-CATTAACGGAC-3'（配列番号15）、ユニバーサルアダプター配列に特異的に相補的）、プローブBa3（配列：5'-TGAGCGATTCG-3'（配列番号16）、Ba3アンプリコン配列に特異的に相補的）、プローブYp3（配列：5'-GGTGTCATGGA-3'、Yp3アンプリコン配列に特異的に相補的）で、順次プローブした。プローブは、室温の3×SSPE中、0.1μMの濃度で20分間、アレイにハイブリダイズさせた。過剰なプローブを2mlの3×SSPEで洗い落とした。画像をTIRF顕微鏡で撮影した。次に、1mlの3×SSPEを使って80℃で5分間、プローブを剥がすことにより、次のハイブリダイゼーションに備えて、アレイ化ターゲット分子を準備した。
図4に示すように、3つのプローブの逐次ハイブリダイゼーションから得えられる画像をオーバーレイすることにより、アダプタープローブとハイブリダイズしたアレイ化分子の大半は、アンプリコン1プローブ（例えば図4の「A」）またはアンプリコン2プローブ（例えば図4の「B」）のどちらか一方にだけハイブリダイズし、両方にハイブリダイズするものは極めて少ないことがわかる。この特異的ハイブリダイゼーションパターンは、アレイ上の各スポットが1タイプの配列（炭疽菌アンプリコンまたはペスト菌アンプリコンのどちらか）だけを含有することを実証している。
縮重塩基を含有する合成80マーオリゴヌクレオチドから作製されたアレイ化コンカテマーにおける塩基位置のデコーディング
縮重塩基を含有する合成オリゴヌクレオチドの個々の分子は4つの部分集団に分割することができ、それぞれは、その特定位置に、A、C、GまたはT塩基を持ちうる。この合成DNAから作製されるコンカテマーのアレイは、スポットの約25％が、それぞれの塩基を持ちうる。図5に示すように、それら4つの塩基に特異的なプローブペアの、4回にわたる連続的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより、これらのコンカテマーの部分集団をうまく同定できるということを実証した。5'リン酸化3'TAMRA標識ペンタマーオリゴヌクレオチドを、4つのヘキサマーオリゴヌクレオチドの一つとペアにした。これら4つのライゲーションプローブペアのそれぞれは、A、C、GまたはT含有型ターゲットのいずれか一つにハイブリダイズするはずである。大半のターゲットについて3より高い識別スコアが得られたことから、ナノボールターゲット間の一塩基の相違を同定できることが実証された。識別スコアは、最も高いスポットスコアを、同じスポットの他の3つの塩基特異的シグナルの平均で割ったものである。アッセイ条件（バッファー組成、全ての構成要素の濃度、サイクル中の各ステップの時間および温度）を調節することにより、シグナル対バックグラウンドおよび完全マッチ対ミスマッチ比が高くなると期待される。これは、6マープローブのスポット型アレイで行った類似のライゲーションアッセイによって実証された。この場合、完全マッチ/バックグラウンド比は約50、平均完全マッ対/ミスマッチ比は30だった。これらの結果はさらに、連続的プローブサイクルの数を増やすか、1サイクルにつき異なる色素で標識された4つ以上のプローブを使用することによって、コンカテマー中に存在するDNAの部分配列または完全配列を決定できることも実証している。合成オリゴヌクレオチド（T1A：5'-NNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNATCGTNCAAACGTCAGTCCANGAATCNAGATCCACTTAGANTAAAAAAAAAAAA-3'）（配列番号13）は、位置32に縮重塩基を含有している。ユニバーサルアダプターをこのオリゴヌクレオチドに連結し、そのアダプター-T1A DNAを、上述のように環状化した。このターゲットでのローリングサークル複製（RCR）反応を使って作製したDNAコンカテマーを、ランダムアレイ上にアレイした。このランダムアレイ上の各スポットは、一分子のT1Aに由来するタンデムに複製されたコピーに相当するので、アレイされた特定スポット中のDNAは、T1Aの位置32に対応する位置にA、またはC、またはG、またはTのいずれか一つを含有するだろう。これらの部分集団を同定するために、4つの塩基のそれぞれに特異的な4つのライゲーションプローブセットを使用した。CAAACという配列を持つ、T1Aの位置33〜37に対応する5'リン酸化3'TAMRA標識ペンタマーオリゴヌクレオチド（プローブT1A9b）を、位置27〜32に対応する以下のヘキサマーオリゴヌクレオチドの一つとペアにした：ACTGTA（プローブT1A9a）、ACTGTC（プローブT1A10a）、ACTGTG（プローブT1A11a）、ACTGTT（プローブT1A12a）。これら4つのライゲーションプローブペアのそれぞれは、A、C、GまたはT含有型T1Aのいずれか一つにハイブリダイズするはずである。各ハイブリダイゼーションサイクルについて、T4 DNAリガーゼを含有するライゲーション/ハイブリダイゼーションバッファー中、20℃で5分間、プローブをアレイと共にインキュベートした。過剰のプローブを20℃で洗い落とし、TIRF顕微鏡で画像を撮影した。次のハイブリダイゼーションの準備をするために、結合しているプローブを剥がした。
全てのスポットの位置を確定するためにアダプター特異的なプローブ（BrPrb3）をアレイにハイブリダイズさせた。次に、上記4つのライゲーションプローブペアを、0.4μMで、アレイに順次ハイブリダイズさせることにより、図5に4つのスポットについて図示するように、塩基を同定した。スポットの大半が4つのライゲーションプローブペアの一つだけと関連づけられること、したがってT1Aの位置32にある塩基の性質を特異的に決定できることは、明らかである。
合成80マーオリゴヌクレオチドの末端にある二つの縮重塩基のデコーディング
上記の合成オリゴヌクレオチドは、ランダムなゲノムDNA末端を真似て、5'末端に8個の縮重塩基を含有している。このオリゴヌクレオチドから作製されるコンカテマーは、アダプター配列のすぐ隣に置かれたこれら8つの縮重塩基を持ちうる。既知のアダプター配列に隣接する未知の2塩基を配列決定することが実行可能であることを実証するために、アダプターの3'末端にハイブリダイズさせるための特異的配列を持つ12マーオリゴヌクレオチド（UK0-12配列5'-ACATTAACGGAC-3'）（配列番号17）をアンカーとして使用し、BBNNNNNNの形をした16個のTAMRA標識オリゴヌクレオチドを、配列読み取りプローブとして使用した。各ハイブリダイゼーションサイクルにつき、0.2μMのUK0-12アンカープローブおよび0.4μMのBBNNNNNNプローブを、T4 DNAリガーゼを含有するライゲーション/ハイブリダイゼーションバッファー中、20℃で10分間、アレイと共にインキュベートした。過剰のプローブを20℃で洗い落とし、TIRF顕微鏡で画像を撮影した。次のハイブリダイゼーションの準備をするために、結合しているプローブを剥がした。BBNNNNNNプローブセットのサブセット（すなわちBBの代りにGA、GC、GGおよびGT）を使って、図6に示すように、これら4つのプローブの一つに特異的に結合するターゲットから作製されたコンカテマーアレイ上のスポットを、20を超える平均完全マッチ/ミスマッチ比で、同定することができた。
定義
本明細書で使用する核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語は、その分野の標準的な専門書および教科書（例えばKornbergおよびBaker「DNA Replication」第2版（W.H. Freeman、ニューヨーク、1992）；Lehninger「Biochemistry」第2版（Worth Publishers、ニューヨーク、1975）；StrachanおよびRead「Human Molecular Genetics」第2版（Wiley-Liss、ニューヨーク、1999)；Eckstein編「Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach」（Oxford University Press、ニューヨーク、1991)；Gait編「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード、1984）など）のものに従う。
「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物を意味する。すなわち、これは、一つ以上の出発配列から複製されるポリヌクレオチド（通常は二本鎖）の集団である。一つ以上の出発配列は、同じ配列の一つ以上のコピーであってもよいし、異なる配列の混合物であってもよい。アンプリコンは、その産物が一つ以上のターゲット核酸の多数の複製物であるような種々の増幅反応によって生成されうる。一般に、アンプリコンを生成する増幅反応は、反応物（ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）の塩基対形成が、反応産物の生成に必要な相補鎖をテンプレートポリヌクレオチド中に持つという点で、「テンプレート駆動型（template-driven）」である。一態様として、テンプレート駆動型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長、または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチドライゲーションである。そのような反応には、参照により本明細書に組み入れられる以下の文献に開示されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、線形ポリメラーゼ反応、NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、ローリングサークル増幅などがあるが、これらに限るわけではない：Mullisらの米国特許第4,683,195号；同第4,965,188号；同第4,683,202号；同第4,800,159号（PCR）；Gelfandらの米国特許第5,210,015号（「taqman」プローブを使ったリアルタイムPCR）；Wittwerらの米国特許第6,174,670号；Kacianらの米国特許第5,399,491号（「NASBA」）；Lizardiの米国特許第5,854,033号；青野らの特開平4-262799（ローリングサークル増幅）など。一態様として、本発明のアンプリコンは、PCRによって生成される。増幅反応の進行と同時に反応産物を検出することができるような検出ケミストリーを利用できるのであれば、増幅反応は「リアルタイム」増幅（例えばLeoneら, Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155 (1998)などの参考文献に記述されている後述の「リアルタイムPCR」または「リアルタイムNASBA」）であってもよい。本明細書において「増幅する」という用語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、反応を実行するのに必要な反応物（これには、例えば反応中にpHを選択したレベルに維持するための緩衝剤、塩類、補因子、補集剤などが含まれうるが、それらに限るわけではない）を全て含有する溶液を意味する。
「相補的または実質上相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸間（例えば、二本鎖DNA分子の二つの鎖の間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間など）で起こるハイブリダイゼーションもしくは塩基対形成または二重鎖の形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、AとT（もしくはAとU）またはCとGである。二つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、適当なヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失を加えて最適に整列して比較した時に、一方の鎖のヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80％、通常は少なくとも90％〜95％、より好ましくは約98〜100％と対を形成するのであれば、実質上相補的であるという。あるいは、RNAまたはDNA鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイズする場合には、実質的相補性が存在する。典型的には、少なくとも14〜25ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約65％の相補性、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％の相補性がある場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こるだろう。参照により本明細書に組み入れられるM. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)を参照されたい。
「二重鎖」は、完全にまたは部分的に相補的であって、Watson-Crick型の塩基対形成を起こして安定な複合体を形成する、少なくとも二つのオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドを意味する。「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、安定な二重鎖の形成を表すために、可換的に使用される。二重鎖に関して「完全にマッチした」とは、二重鎖を構成しているポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中のすべてのヌクレオチドが他方の鎖中のヌクレオチドとWatson-Crick塩基対形成を起こすような形で、互いに二本鎖構造を形成することを意味する。「二重鎖」という用語は、使用しうるヌクレオシド類似体、例えばデオキシイノシン、2-アミノプリン塩基を持つヌクレオシド、PNAなどの対形成を包含する。2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間の二重鎖中の「ミスマッチ」とは、その二重鎖中の一対のヌクレオチドがWatson-Crick結合を起こせないことを意味する。
ゲノムまたはターゲットポリヌクレクレオチドに関して「遺伝子座」または「座」とは、ゲノムまたはターゲットポリヌクレオチドの連続した小領域またはセグメントを意味する。本明細書にいう遺伝子座または座は、ミトコンドリアDNAを含むゲノムにおけるヌクレオチド、遺伝子、もしくは遺伝子の一部の位置を指すか、またはそれがある遺伝子内にあるかどうか、もしくはある遺伝子と関連するかどうかとはかかわりなく、ゲノム配列の任意の連続部分を指しうる。一態様として、遺伝子座は、ミトコンドリアDNAを含むゲノム配列の任意の部分（単一のヌクレオチドから数百（例えば100〜300）ヌクレオチド長のセグメントまで）を指す。
「遺伝子変異体」は、遺伝子座における一つ以上のヌクレオチドの置換、逆位、挿入、もしくは欠失、またはある遺伝子座から別の遺伝子座へのDNAの転座を意味する。一態様として、遺伝子変異体は、ある個体集団中に存在しうる、ある遺伝子座における選択的ヌクレオチド配列であって、その集団の他のメンバーと比較してヌクレオチド置換、挿入、および欠失を含むものを意味する。もう一つの態様として、ある遺伝子座における挿入または欠失は、もう一つの個体集団における同じ座と比較して、そのような座における1〜10ヌクレオチドの付加または不在を含む。
「ハイブリダイゼーション」は、二つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程を指す。「ハイブリダイゼーション」という用語は、三本鎖ハイブリダイゼーションも指しうる。その結果生じる（通常は）二本鎖のポリヌクレオチドが「ハイブリッド」または「二重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約1M未満の塩濃度、より一般的には約500mM未満、約200mM未満の塩濃度を含むだろう。「ハイブリダイゼーションバッファー」は、5×SSPEなどの緩衝塩溶液である。ハイブリダイゼーション温度は、5℃という低温であってもよいが、典型的には22℃より高く、さらに典型的には約30℃より高く、好ましくは約37℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常はストリンジェントな条件、すなわちプローブがそのターゲットサブ配列にハイブリダイズするような条件で行われる。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況が異なればストリンジェントな条件も異なる。長いフラグメントほど、特異的ハイブリダイゼーションには、高いハイブリダイゼーション温度を必要とする。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度などといった他の因子もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼしうるので、いずれか一つのみの絶対値よりもパラメータの組み合わせの方が重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHにおけるその具体的配列についてのTmを約5℃下回るように選択される。代表的なストリンジェント条件には、少なくとも0.01M〜1M以下のNaイオン濃度（または他の塩）、pH7.0〜8.3、および少なくとも25℃の温度が含まれる。例えば、5×SSPE（750mM NaCl、50mMリン酸Na、5mM EDTA、pH7.4）および25〜30℃の温度という条件は、アレル特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えばSambrook, FritscheおよびManiatis「Molecular Cloning A laboratory Manual」（第2版、Cold Spring Harbor Press (1989)）およびAnderson「Nucleic Acid Hybridization」（第1版、BIOS Scientific Publishers Limited (1999)）を参照されたい（これらの参考文献は、上述のあらゆる目的に関して、その全てが、参照により本明細書に組み入れられる）。「特異的に〜にハイブリダイズする」または「〜に特異的にハイブリダイズする」などの表現は、あるヌクレオチド配列または配列群が複雑な（例えば全細胞）DNAまたはRNA混合物中に存在する場合に、ある分子が、ストリンジェントな条件下で、その特定ヌクレオチド配列または配列群に、実質的に、またはもっぱらそれだけに、結合、二重鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
「ライゲーション」は、テンプレート駆動型の反応において、二つ以上の核酸（例えばオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド）の末端間に、共有結合を形成することを意味する。結合の性質は多種多様であることができ、ライゲーションは酵素的または化学的に行うことができる。本明細書にいうライゲーションは、通常は、酵素的に行われて、あるオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの5'炭素と、もう一つのオリゴヌクレオチドの3'炭素との間に、リン酸ジエステル結合を形成する。さまざまなテンプレート駆動型ライゲーション反応が、以下の参考文献に記述されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる：Whitelyらの米国特許第4,883,750号；Letsingerらの米国特許第5,476,930号；Fungらの米国特許第5,593,826号；Koolの米国特許第5,426,180号；Landegrenらの米国特許第5,871,921号；XuおよびKool, Nucleic Acids Research, 27: 875-881 (1999)；Higginsら, Methods in Enzymology, 68: 50-71 (1979)；Englerら, The Enzymes, 15: 3-29 (1982)；ならびにNamsaraevの米国特許出願公開第2004/0110213号。酵素的ライゲーションは、通常は、使用するそのリガーゼに必要な二価カチオン、補酵素などを全て含有する緩衝塩類溶液であるリガーゼバッファー中で行われる。
「マイクロアレイ」または「アレイ」とは、核酸を含有する部位のアレイを保持する表面（通常は平面状または実質的に平面状の表面）を持つ固相支持体であって、アレイの各メンバー部位が、固定化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの同一コピーを含み、空間的に明確であり、アレイの他のメンバー部位とはオーバーラップしないようになっているもの、すなわち、部位が空間的に不連続であるものを指す。場合によっては、マイクロアレイの部位は、不連続であるだけでなく、相隔てられていてもよい。すなわち、異なる部位は境界を共有するのではなく、通常は核酸が結合していない部位間領域によって、隔てられる。空間的に明確なハイブリダイゼーション部位はさらに、その位置およびその固定化オリゴヌクレオチドのアイデンティティが既知であるか、または例えばその使用前に、予め決定されるという点で、「アドレス可能」であってもよい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが一本鎖であり、固相支持体に、通常は5'末端または3'末端によって共有結合される。別の態様では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、固相支持体に、例えばビオチン-ストレプトアビジン結合、共有結合された捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションなどによって、非共有結合的に取付けられる。従来のマイクロアレイ技術は、以下の参考文献に概説されている：Schena編「Microarrays: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード、2000）；Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2: 404-410 (1998)；Nature Genetics Supplement, 21: 1-60 (1999)。本明細書にいう「ランダムアレイ」または「ランダムマイクロアレイ」は、空間的にアドレスされない空間的に不連続なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域を持つマイクロアレイを指す。すなわち、取付けられたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアイデンティティは、少なくとも最初はその位置から識別することができないが、アレイ上で特定の作業（例えば配列決定、デコーディングプローブのハイブリダイゼーションなど）を行うことによって決定することができる。ランダムマイクロアレイは、しばしば、マイクロビーズの平面的アレイから形成される（例えばBrennerら, Nature Biotechnology, 18: 630-634 (2000)；Tulleyらの米国特許第6,133,043号；Stuelpnagelらの米国特許第6,396,995号；Cheeらの米国特許第6,544,732号など）。
「ミスマッチ」は、Watson-Crick塩基対G-CおよびA-T以外の、塩基A、T（またはRNAの場合はU）、G、およびCの任意の二つの間の塩基対を意味する。考えうる8つのミスマッチは、A-A、T-T、G-G、C-C、T-G、C-A、T-C、およびA-Gである。
「突然変異」および「多形」は、ヌクレオチド配列が基準DNA配列または野生型配列または正常組織配列とは一つ以上の塩基の挿入および/または欠失によって異なっているDNA分子（例えば遺伝子）を表すために、通常はある程度可換的に用いられる。文脈によっては、突然変異が、ある生物にとって病的であるかどうかとはかかわりなく、任意の塩基変化であると理解されるのに対して、多形は、通常、直接的な病理学的帰結を伴わない塩基変化であると理解されるという点で、Cotton（「Mutation Detection」Oxford University Press、オックスフォード、1997）の用法に従う。
本明細書にいう「ヌクレオシド」には、2'-デオキシ型および2'-ヒドロキシル型を含む天然ヌクレオシド、例えばKornbergおよびBaker「DNA Replication」第2版（Freeman、サンフランシスコ、1992）に記述されているものが包含される。ヌクレオシドに関して、「類似体」には、例えばScheit「Nucleotide Analogs」（John Wiley、ニューヨーク、1980）；UhlmanおよびPeyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)などに記述されている修飾塩基部分および/または修飾糖部分を持つ合成ヌクレオシドが含まれる。ただし、それらは、特異的ハイブリダイゼーションが可能であるものとする。そのような類似体には、結合特性を強化する、複雑度を下げる、特異性を増加させるなどの目的で設計された合成ヌクレオシドが含まれる。強化されたハイブリダイゼーション特性またはヌクレアーゼ耐性を持つ類似体を含むポリヌクレオチドは、UhlmanおよびPeyman（前掲）；Crookeら, Exp. Opin. Ther. Patents, 6: 855-870 (1996)；Mesmaekerら, Current Opinion in Structual Biology, 5: 343-355 (1995)などに記述されている。二重鎖安定性を強化する能力を持つポリヌクレオチドの代表的タイプには、オリゴヌクレオチドN3'→P5'ホスホロアミデート（本明細書では「アミデート」という）、ペプチド核酸（本明細書では「PNA」という）、オリゴ-2'-O-アルキルリボヌクレオチド、C-5プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックト核酸（LNA）などの化合物が含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドは市販されているか、あるいは文献記載の方法を使って合成することができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長によって特定のDNA配列をインビトロ増幅するための反応を意味する。言い換えると、PCRは、プライマー結合部位に挟まれたターゲット核酸のコピーまたは複製物を数多く作製するための反応であって、以下に挙げるステップの一回以上の繰返しを含む：（i）ターゲット核酸を変性するステップ、（ii）プライマー結合部位にプライマーをアニールさせるステップ、および（iii）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長するステップ。通例、反応は、サーマルサイクラー装置中で、各ステップに最適化された異なる温度を循環する。具体的温度、各ステップにおける継続時間、ステップ間の変化速度は、例えば次に挙げる文献からもわかるように、当業者によく知られる多くの因子に依存する：McPhersonら編「PCR: A Practical Approach」および「PCR2: A Practical Approach」（IRL Press、オックスフォード、それぞれ1991および1995）。例えば、Taq DNAポリメラーゼを使用する通常のPCRでは、二本鎖ターゲット核酸を＞90℃の温度で変性し、50〜75℃の範囲の温度でプライマーをアニールさせ、72〜78℃の範囲の温度でプライマーを伸長することができる。「PCR」という用語は、例えば、限定するわけではないが、RT-PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量PCR、マルチプレックスPCRなどといった、派生形の反応も包含する。反応液量は数百ナノリットル（例えば200nL）から数百μL（例えば200μL）までの範囲にわたる。「逆転写PCR」または「RT-PCR」は、ターゲットRNAを相補一本鎖DNAに変換する逆転写反応が先行して行われた後、増幅が行われるPCRである（例えばTecottらの米国特許第5,168,038号、この特許は参照により本明細書に組み入れられる）。「リアルタイムPCR」は、反応の進行と同時に反応産物（すなわちアンプリコン）の量がモニターされるPCRである。リアルタイムPCRには多くの形態があり、それらは主として、反応産物のモニタリングに使用される検出ケミストリーが異なる（例えばGelfandらの米国特許第5,210,015号（「taqman」）；Wittwerらの米国特許第6,174,670号および同第6,569,627号（インターカレーティング色素）；Tyagiらの米国特許第5,925,517号（分子ビーコン）；これらの特許は参照により本明細書に組み入れられる）。リアルタイムPCR用の検出ケミストリーは、Mackayら, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)に概説されており、この参考文献も参照により本明細書に組み入れられる。「ネステッドPCR」は、第1PCRのアンプリコンが、新しいプライマーセット（そのうち少なくとも一方は最初のアンプリコンの内部位置に結合するもの）を用いる第2PCR用の試料になるという、二段階PCRを意味する。ネステッド増幅反応に関して本明細書にいう「初期プライマー」とは、第1アンプリコンを生成させるために使用するプライマーを意味し、「二次プライマー」とは、第2（またはネステッド）アンプリコンを生成させるために使用する一つ以上のプライマーを意味する。「マルチプレックスPCR」は、複数のターゲット配列（または単一のターゲット配列と一つ以上の基準配列）が同じ反応混合物中で同時に行われるPCRを意味する（例えばBernardら, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999)（二色リアルタイムPCR））。通常は、増幅される各配列ごとに、異なるプライマーセットを使用する。「定量PCR」は、試料または標本における一つ以上の特定ターゲット配列の存在量を測定するために設計されたPCRを意味する。定量PCRには、そのようなターゲット配列の絶対的定量と相対的定量の両方が含まれる。定量的測定は、一つ以上の基準配列を使ってなされ、その基準配列はターゲット配列とは別個に、またはターゲット配列と一緒に、アッセイされうる。基準配列は、試料または標本にとって内在性または外因性であることができ、後者の場合は一つ以上の競合的テンプレートを含みうる。典型的な内在性基準配列には、以下に挙げる遺伝子の転写物のセグメントがある：β-アクチン、GAPDH、β2-ミクログロブリン、リボソームRNAなど。定量PCRの技法は、以下に挙げる参考文献（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に例示されるように、当業者には周知である：Freemanら, Biotechniques, 26: 112-126 (1999)；Becker-Andreら, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989)；Zimmermanら, Biotechniques, 21: 268-279 (1996)；Diviaccoら, Gene, 122: 3013-3020 (1992)；Becker-Andreら, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989)など。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は可換的に用いられ、それぞれに、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。本明細書で使用するこれらの用語は二本鎖型も指しうる。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、モノマー間相互作用の規則的パターン（例えばWatson-Crick型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対形成など）を介して天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することにより、二重鎖型または三重鎖型を形成する能力を持つ。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間結合は天然の結合であってよいし、その類似体（例えば天然類似体または非天然類似体）であってもよい。非天然類似体として、例えばPNA、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、蛍光体またはハプテンなどのラベルの取付けを可能にする連結基を含有する塩基を挙げることができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、酵素的処理、例えばポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなどを必要とする場合はいつでも、そのような場合のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、どの位置にも、または一部の位置には、ヌクレオシド間結合、糖部分、または塩基の一定の類似体を、そのような類似体が酵素反応に適合しない場合に、含有しないことは、当業者には理解されるだろう。ポリヌクレオチドは典型的には、数モノマー単位（例えば5〜40、この場合、それらは通常、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）から、数千モノマー単位までのサイズを持つ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが文字（大文字または小文字）の配列（例えば「ATGCCTG」など）によって表される場合はいつでも、別段の表示がない限り、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に向かって5'→3'の順であること、そしてまた、「A」がデオキシアデノシンを表し、「C」がデオキシシチジンを表し、「G」がデオキシグアノシンを表し、「T」がチミジンを表し、「I」がデオキシイノシンを表し、「U」がウリジンを表すことは言うまでもない。別段の注記がない限り、用語法および原子番号付け規約は、StrachanおよびRead「Human Molecular Genetics 2」（Wiley-Liss、ニューヨーク、1999）に開示されているものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって連結された4つの天然ヌクレオシド（例えば、DNAの場合はデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、RNAの場合はそのリボース相当物）を含む。しかしそれらは、非天然ヌクレオチド類似体（例えば修飾された塩基、糖、またはヌクレオシド間結合を含むもの）を含んでもよい。酵素が、その活性にとって、例えば一本鎖DNA、RNA/DNA二重鎖など、特定のオリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質要求性を持つことは、当業者には明白であるので、オリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質に関して適当な組成を選択することは、とりわけ専門書、例えばSambrookら「Molecular Cloning」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク、1989）などの参考文献の手引きがあれば、当業者の知識で十分に対応することができる。
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートとの二重鎖を形成したときに、核酸合成の開始点としての役割を果たし、伸長された二重鎖が形成されるようにその3'末端からテンプレートに沿って伸長される能力を持つ、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長過程で付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはDNAポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、9〜40ヌクレオチドの範囲、または場合によって14〜36ヌクレオチドの範囲の長さを持つ。
「リードアウト（readout）」は、測定および/または検出される一つまたは複数のパラメータであって、数字または値に変換することができるものを意味する。文脈により、リードアウトは、収集または記録されたそのようなデータの実際の数値表現を指しうる。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度シグナルのリードアウトは、マイクロアレイの各ハイブリダイゼーション部位で生じるシグナルの位置および蛍光強度である。したがってそのようなリードアウトは、さまざまな方法で、例えばマイクロアレイの画像、数表などとして、記録または保存することができる。
「固形支持体」「支持体」および「固相支持体」は可換的に使用され、剛体または半剛体表面を一つまたは複数持つ材料または材料群を指す。多くの実施形態では、固形支持体の少なくとも一つの表面が実質的に平坦であるだろうが、一部の実施形態では、異なる化合物のための合成領域を、例えばウェル、隆起領域、ピン、エッチングされたトレンチなどによって、物理的に分離することが望ましいこともあるだろう。他の実施形態によれば、固形支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成をとるだろう。マイクロアレイは通常、少なくとも一つの平面的固相支持体、例えばガラス製顕微鏡スライドなどを含む。
DNAの「基準配列」または「基準集団」とは、基準DNA集団と試験DNA集団の相補鎖間で起こるヘテロ二重鎖の形成によって、DNAまたはRNAの試験集団（または「試験DNA配列」もしくは「試験DNA集団」）と比較される、個々のDNA配列またはDNA（またはそこから誘導されるRNA）の収集物を指す。完全にマッチしたヘテロ二重鎖が形成される場合は、基準集団と試験集団の各メンバーは同一であり、そうでない場合、それらは互いの変異体である。典型的には、基準集団のメンバーのヌクレオチド配列は既知であり、その配列は、典型的には、Genbank、Emblなどの配列データベースに記載されている。一態様として、DNAの基準集団は、既知細胞タイプまたは組織ソース由来のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含みうる。例えば、DNAの基準集団は、健常個体の組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含み、DNAの試験集団は、罹患個体の同じ組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを含みうる。DNAの基準集団は、個々のポリヌクレオチド、cDNA、遺伝子またはそのエクソンを組み合わせた収集物、例えば既知p53変異体の全てまたはサブセットをコードする遺伝子またはエクソン、シグナル伝達経路の遺伝子を含んでもよい。
ある分子の、もう一つの分子への結合（例えばプローブに対する標識ターゲット配列の結合）に関して「特異的」または「特異性」とは、それら二分子の間の認識、接触、および安定な複合体の形成と、それに加えて、その分子の他の分子との認識、接触、または複合体形成が実質的に少ないこととを意味する。一態様として、第2分子に対する第1分子の結合に関して「特異的」とは、第1分子が、ある反応または試料中の別の分子を認識し、その分子と複合体を形成する限りにおいて、それが第2分子との複合体を最も多数形成することを意味する。好ましくは、この最も多数とは、少なくとも50パーセントである。一般に、特異的結合事象に関与する分子は、その表面上または空洞中に、互いに結合する分子間の特異的認識をもたらす部分を持つ。特異的結合の例には、抗体-抗原相互作用、酵素-基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチド間の二重鎖または三重鎖の形成、受容体-リガンド相互作用などがある。特異性または特異的結合に関して本明細書にいう「接触」とは、例えばファンデルワールス力、水素結合、塩基スタッキング相互作用、イオン相互作用および疎水相互作用などの弱い非共有結合的化学相互作用がそれらの分子の相互作用を支配するのに十分なほど二つの分子が近くにあることを意味する。
本明細書で使用する「Tm」という用語は「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離した状態になる温度である。当技術分野では核酸のTmを算出するための等式がいくつかよく知られている。標準的な参考文献に示されているように、核酸が1M NaClの水性溶液中にある場合、Tm値の簡単な推定値は、式：Tm＝81.5＋0.41（％G＋C）によって算出されうる（例えばAndersonおよびYoung「Quantitative Filter Hybridization, in Nucelic Acid Hybridization」(1985)を参照されたい）。他の参考文献（例えばAllawi, H.T.およびSantaLucia, J., Jr., Biochemistry 36, 10581-94 (1997)）には、配列特徴だけでなく構造特徴および環境特徴を考慮してTmを算出する代替計算方法が記載されている。
「試料」は、通常、生物学的ソース、環境ソース、医学的ソース、または患者ソースから得られたある量の材料であって、ターゲット核酸の検出、測定、または標識が求められるものを意味する。一方において、これは、標本または培養物（例えば微生物学的培養物）を包含するものとする。他方において、これは、生物学的試料および環境試料をどちらも包含するものとする。試料は、合成起源の標本を含みうる。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）の体液、固形物（例えば糞便）または組織、ならびに液状および固形の食品および飼料製品および成分、例えば乳製品、野菜、肉および肉副産物、および廃棄物でありうる。生物学的試料は、患者から採取された材料、例えば限定するわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液、針吸引物などを含みうる。生物学的試料は、さまざまな科の家畜、ならびに野生動物、例えば限定するわけではないが、有蹄類、熊、魚、齧歯類などの動物の全てから得ることができる。環境試料は、表層物質、土壌、水および産業試料などの環境材料、ならびに食品および乳製品を加工するための設備、器具、装置、用具、使い捨て品および非使い捨て品を含みうる。これらの例が本発明に適用可能な試料タイプを限定するとみなしてはならない。
上記の教示内容は、本発明を例示するためのものであって、本発明の請求項の範囲がそれらの詳細によって限定されることはない。本発明の好ましい例示的実施形態を記述したが、そこに本発明から逸脱することなくさまざまな改変および変更を加えうることは当業者には明白であり、本発明の真の趣旨および範囲に含まれるそのような改変および変更は全て、本願請求項に包含されるものとする。

Claims (16)

  1. 不連続な相隔たる領域の規則的アレイを有する平面状の表面を持つ支持体であって、各不連続な相隔たる領域は、０．２μｍ２〜１μｍ２の範囲の面積を持ち、かつそこに取付けられた反応性官能基を含有するものである、支持体；および
    その表面に取付けられた複数の単分子、ここで各単分子は、
    （ｉ）ユニークな官能基および複数の取付け官能基を含む、高分子構造と、
    （ｉｉ）取付け部分を持つ少なくとも一つの分析物とを含み、
    取付け部分を持つ分析物は核酸であり、
    高分子構造のユニークな官能基は、分析物である核酸の取付け部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
    分析物である核酸の取付け部分と高分子構造のユニークな官能基は、結合を形成し、
    各高分子構造は、ユニークな官能基、および複数の取付け官能基を含み、
    単分子は、高分子構造の取付け官能基と不連続な相隔たる領域の反応性官能基との間の相互作用によって表面に取付けられ、
    かつ、分析物が、ユニークな官能基と分析物の取付け部分との間の結合によって高分子構造に取付けられるようになっているものである；
    を含む単分子のアレイであって、
    前記不連続な相隔たる領域のそれぞれが、前記高分子構造を含まない領域間間隙によって取り囲まれ；
    不連続な相隔たる領域はそれぞれ、単一の高分子構造の捕捉しか許さない面積を持ち；かつ
    複数の単分子が、不連続な相隔たる領域上に、その不連続な相隔たる領域の少なくとも過半数が単分子を一つだけ含有するように、ランダムに配置される、アレイ。
  2. 前記不連続な相隔たる領域が前記支持体中のウェルであり、そのウェルがそれぞれ、前記不連続な相隔たる領域の面積に等しいかそれより小さい面積を持つ開口部を有する、請求項１に記載のアレイ。
  3. 前記不連続な相隔たる領域がそれぞれ０．１〜２０μｍの範囲の最近接距離を持ち、前記高分子構造が線状ポリヌクレオチドである、請求項１に記載のアレイ。
  4. 前記最近接距離が０．３〜３μｍの範囲にある、請求項３に記載のアレイ。
  5. 全ての前記不連続な相隔たる領域に単分子が取付けられている、請求項４に記載のアレイ。
  6. 前記高分子構造が線状ポリヌクレオチドである、請求項４に記載のアレイ。
  7. 前記不連続な相隔たる領域が、前記平面状の表面に、直線的パターンで配置され、各不連続な相隔たる領域が、０．１〜１０μｍの直径を持つ円によって囲まれる面積を持つ、請求項４に記載のアレイ。
  8. 前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項４に記載のアレイ。
  9. 前記ユニークな官能基が第１オリゴヌクレオチドであり、前記取付け部分が、第１オリゴヌクレオチドに相補的な配列を持つ第２オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアレイ。
  10. 前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項９に記載のアレイ。
  11. 単分子アレイを構築するためのキットであって、
    不連続な相隔たる領域の規則的アレイを有する平面状の表面を持つ支持体であって、各不連続な相隔たる領域は、０．２μｍ ２ 〜１μｍ ２ の範囲の面積を持ち、かつそこに取付けられた反応性官能基を含有するものである、支持体；および
    それぞれがユニークな官能基と複数の取付け官能基とを持つ複数の高分子構造であって、表面上にランダムに取付けることができる高分子構造を含み、ここで、
    高分子構造のユニークな官能基は、分析物の取付け部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
    分析物は核酸であり、
    その取付けは、一つ以上の反応性官能基と一つ以上の取付け官能基との反応によって形成される一つ以上の結合によって形成され；かつ
    ユニークな官能基は、分析物上の官能基と選択的に反応して、単分子アレイを形成させる能力を持つものである、
    キット。
  12. 前記不連続な相隔たる領域が、０．１〜２０μｍの範囲の最近接距離を持つ規則的アレイを形成する、請求項１１に記載のキット。
  13. 高分子構造が、反応性官能基と共有結合を形成する取付け官能基を介して、表面への単分子の多価取付けをもたらす、請求項１に記載のアレイ。
  14. 高分子構造が、反応性官能基と非共有結合を形成する取付け官能基を介して、表面への単分子の多価取付けをもたらす、請求項１に記載のアレイ。
  15. 不連続な相隔たる領域の形状がほぼ円形または正方形であり、その結果、それらのサイズを単一の長さ寸法で示すことができ、かつそのような領域のサイズが、１２５ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲、または２００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲にあり、かつ不連続な相隔たる領域の形状がほぼ円形の場合には単一の長さ寸法が直径であり、あるいは不連続な相隔たる領域の形状がほぼ正方形である場合には単一の長さ寸法が１辺の長さである、請求項１に記載のアレイ。
  16. 規則的アレイが直線的パターンを含む、請求項１に記載のアレイ。
JP2011132349A 2005-06-15 2011-06-14 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ Active JP5965108B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69077105P 2005-06-15 2005-06-15
US60/690,771 2005-06-15
US72511605P 2005-10-07 2005-10-07
US60/725,116 2005-10-07
US77641506P 2006-02-24 2006-02-24
US60/776,415 2006-02-24

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008516994A Division JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2006-06-13 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014030924A Division JP2014138597A (ja) 2005-06-15 2014-02-20 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP2016082087A Division JP2016174608A (ja) 2005-06-15 2016-04-15 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2011234723A JP2011234723A (ja) 2011-11-24
JP5965108B2 true JP5965108B2 (ja) 2016-08-03

Family

ID=37571035

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008516994A Active JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2006-06-13 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP2011132349A Active JP5965108B2 (ja) 2005-06-15 2011-06-14 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP2014030924A Pending JP2014138597A (ja) 2005-06-15 2014-02-20 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP2016082087A Pending JP2016174608A (ja) 2005-06-15 2016-04-15 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008516994A Active JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2006-06-13 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014030924A Pending JP2014138597A (ja) 2005-06-15 2014-02-20 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
JP2016082087A Pending JP2016174608A (ja) 2005-06-15 2016-04-15 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ

Country Status (11)

Country Link
US (29) US8445194B2 (ja)
EP (7) EP3492602A1 (ja)
JP (4) JP5331476B2 (ja)
CN (1) CN101466847B (ja)
AU (1) AU2006259565B2 (ja)
CA (2) CA2611671C (ja)
DK (4) DK2620510T4 (ja)
HK (1) HK1209795A1 (ja)
IL (2) IL188142A (ja)
SG (1) SG162795A1 (ja)
WO (2) WO2006138257A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10351909B2 (en) 2005-06-15 2019-07-16 Complete Genomics, Inc. DNA sequencing from high density DNA arrays using asynchronous reactions

Families Citing this family (629)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US6858413B2 (en) 2000-12-13 2005-02-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
AU2002252279B2 (en) 2001-03-09 2005-05-12 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of RNA sequences
US8105771B2 (en) * 2003-02-26 2012-01-31 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US8536661B1 (en) 2004-06-25 2013-09-17 University Of Hawaii Biosensor chip sensor protection methods
US20090264299A1 (en) * 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
ATE557105T1 (de) 2005-06-23 2012-05-15 Keygene Nv Strategien für eine hohe durchsatzidentifikation und erkennung von polymorphismen
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
US10316364B2 (en) * 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
AU2006295556B2 (en) 2005-09-29 2012-07-05 Keygene N.V. High throughput screening of mutagenized populations
CA2624896C (en) * 2005-10-07 2017-11-07 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
US7960104B2 (en) * 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007120208A2 (en) * 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
ES2391837T3 (es) 2005-12-22 2012-11-30 Keygene N.V. Método para la detección de polimorfismos basados en AFLP de alto rendimiento
EP1994180A4 (en) * 2006-02-24 2009-11-25 Callida Genomics Inc GENOME SEQUENCING ON DNA ARRAYS WITH HIGH THROUGHPUT
CN1876840A (zh) * 2006-04-26 2006-12-13 东南大学 一种多拷贝的单分子核酸阵列芯片
US7910354B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20080221832A1 (en) * 2006-11-09 2008-09-11 Complete Genomics, Inc. Methods for computing positional base probabilities using experminentals base value distributions
US20090111705A1 (en) * 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
US7629125B2 (en) * 2006-11-16 2009-12-08 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US20080242560A1 (en) * 2006-11-21 2008-10-02 Gunderson Kevin L Methods for generating amplified nucleic acid arrays
WO2008063135A1 (en) 2006-11-24 2008-05-29 Agency For Science, Technology And Research Apparatus for processing a sample in a liquid droplet and method of using the same
US9874501B2 (en) 2006-11-24 2018-01-23 Curiox Biosystems Pte Ltd. Use of chemically patterned substrate for liquid handling, chemical and biological reactions
US11339430B2 (en) 2007-07-10 2022-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
US20230076823A1 (en) * 2007-01-26 2023-03-09 Illumina, Inc. Independently removable nucleic acid sequencing system and method
US20090053690A1 (en) * 2007-02-02 2009-02-26 California Institute Of Technology Surface chemistry and deposition techniques
US20080194416A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sigma Aldrich Detection of mature small rna molecules
WO2008121384A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Source tagging and normalization of dna for parallel dna sequencing, and direct measurement of mutation rates using the same
EP2164985A4 (en) * 2007-06-01 2014-05-14 454 Life Sciences Corp SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE
WO2008157640A2 (en) * 2007-06-18 2008-12-24 Illumina, Inc. Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates
DE102007034967A1 (de) 2007-07-26 2009-01-29 Plansee Se Brennstoffzelle und Verfahren zu deren Herstellung
US8759077B2 (en) 2007-08-28 2014-06-24 Lightspeed Genomics, Inc. Apparatus for selective excitation of microparticles
US8222040B2 (en) * 2007-08-28 2012-07-17 Lightspeed Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles
US20090061424A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Sigma-Aldrich Company Universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations
ITBO20070627A1 (it) * 2007-09-14 2009-03-15 Twof Inc Metodo per la preparazione di dna microarray con sonde ad alta densita' lineare
EP2203566A4 (en) * 2007-09-28 2011-02-09 Pacific Biosciences California ERROR-FREE DNA AMPLIFICATION FOR CLONAL SEQUENCING
US8278047B2 (en) 2007-10-01 2012-10-02 Nabsys, Inc. Biopolymer sequencing by hybridization of probes to form ternary complexes and variable range alignment
WO2009052214A2 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
US8617811B2 (en) 2008-01-28 2013-12-31 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US7901890B2 (en) * 2007-11-05 2011-03-08 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
US7897344B2 (en) * 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8415099B2 (en) * 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US8518640B2 (en) * 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
SG185935A1 (en) 2007-10-30 2012-12-28 Complete Genomics Inc Apparatus for high throughput sequencing of nucleic acids
US7988918B2 (en) 2007-11-01 2011-08-02 Complete Genomics, Inc. Structures for enhanced detection of fluorescence
US10725020B2 (en) 2007-11-14 2020-07-28 Curiox Biosystems Pte Ltd. High throughput miniaturized assay system and methods
WO2013114217A1 (en) * 2012-02-05 2013-08-08 Curiox Biosystems Pte Ltd. Array plates and methods for making and using same
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US9551026B2 (en) 2007-12-03 2017-01-24 Complete Genomincs, Inc. Method for nucleic acid detection using voltage enhancement
AU2008335362B2 (en) * 2007-12-05 2013-07-25 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
DK2610351T3 (en) * 2007-12-05 2015-09-28 Complete Genomics Inc Base efficient provision of sequencing reactions
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US20090171640A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 Microsoft Corporation Population sequencing using short read technologies
WO2009094583A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-30 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
US20090270273A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Complete Genomics, Inc. Array structures for nucleic acid detection
CN102076851A (zh) 2008-05-02 2011-05-25 Epi中心科技公司 Rna的选择性的5′连接标记
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
TWI460602B (zh) * 2008-05-16 2014-11-11 Counsyl Inc 廣用的懷孕前篩檢裝置
EP2982437B1 (en) 2008-06-25 2017-12-06 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US9650668B2 (en) 2008-09-03 2017-05-16 Nabsys 2.0 Llc Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels
CN102186989B (zh) 2008-09-03 2021-06-29 纳伯塞斯2.0有限责任公司 用于流体通道中生物分子和其它分析物的电压感测的纵向移位纳米级电极的使用
US8262879B2 (en) 2008-09-03 2012-09-11 Nabsys, Inc. Devices and methods for determining the length of biopolymers and distances between probes bound thereto
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
DK3272879T3 (da) 2008-10-24 2019-08-26 Epicentre Tech Corporation Transposonendesammensætninger og fremgangsmåder til modificering af nukleinsyrer
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
GB2483810B (en) 2008-11-07 2012-09-05 Sequenta Inc Methods for correlating clonotypes with diseases in a population
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8691510B2 (en) 2008-11-07 2014-04-08 Sequenta, Inc. Sequence analysis of complex amplicons
ES2568509T3 (es) 2009-01-15 2016-04-29 Adaptive Biotechnologies Corporation Perfilado de la inmunidad adaptativa y métodos para la generación de anticuerpos monoclonales
US8738296B2 (en) * 2009-02-03 2014-05-27 Complete Genomics, Inc. Indexing a reference sequence for oligomer sequence mapping
US8615365B2 (en) * 2009-02-03 2013-12-24 Complete Genomics, Inc. Oligomer sequences mapping
WO2010091024A1 (en) * 2009-02-03 2010-08-12 Complete Genomics, Inc. Oligomer sequences mapping
US8455260B2 (en) 2009-03-27 2013-06-04 Massachusetts Institute Of Technology Tagged-fragment map assembly
EP2430441B1 (en) 2009-04-29 2018-06-13 Complete Genomics, Inc. Method and system for calling variations in a sample polynucleotide sequence with respect to a reference polynucleotide sequence
US20130296189A1 (en) * 2009-05-08 2013-11-07 Suzhou Institute of Nano-tech and Nano-bionics, Chinese Academy of Sciences Probes utilizing universal tags, a kit comprising the same and detection methods
US8246799B2 (en) 2009-05-28 2012-08-21 Nabsys, Inc. Devices and methods for analyzing biomolecules and probes bound thereto
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
DK2443236T3 (en) 2009-06-15 2015-08-17 Complete Genomics Inc Methods and compositions for sequencing by long fragment reading
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
KR20140146180A (ko) 2009-06-25 2014-12-24 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 적응 면역의 측정방법
KR20110018763A (ko) * 2009-08-18 2011-02-24 삼성전자주식회사 표적 물질을 기판에 고정하는 방법 및 장치
US8298767B2 (en) 2009-08-20 2012-10-30 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
US10385391B2 (en) * 2009-09-22 2019-08-20 President And Fellows Of Harvard College Entangled mate sequencing
CA2774252C (en) 2009-09-30 2020-04-14 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA2779606A1 (en) * 2009-11-10 2011-05-19 Nestec S.A. Heart aging biomarkers and methods of use
US9023769B2 (en) 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
US9217144B2 (en) 2010-01-07 2015-12-22 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
EP3460458B1 (en) 2010-02-19 2021-08-11 Pacific Biosciences of California, Inc. A method for nucleic acid sequencing
WO2011112465A1 (en) 2010-03-06 2011-09-15 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses for detecting optical signals from a sample
US9465228B2 (en) 2010-03-19 2016-10-11 Optical Biosystems, Inc. Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns
US8502867B2 (en) 2010-03-19 2013-08-06 Lightspeed Genomics, Inc. Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
PL2556171T3 (pl) 2010-04-05 2016-04-29 Prognosys Biosciences Inc Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie
US8774494B2 (en) * 2010-04-30 2014-07-08 Complete Genomics, Inc. Method and system for accurate alignment and registration of array for DNA sequencing
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA2798758C (en) 2010-05-18 2019-05-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2952590B1 (en) 2010-06-11 2017-07-26 Life Technologies Corporation Alternative nucleotide flows in sequencing-by-synthesis methods
WO2011159942A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
US20120001646A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for testing isfet arrays
CN109449171A (zh) 2010-06-30 2019-03-08 生命科技公司 用于检测和测量化学反应和化合物的晶体管电路
AU2011226767B1 (en) 2010-06-30 2011-11-10 Life Technologies Corporation Ion-sensing charge-accumulation circuits and methods
US11307166B2 (en) 2010-07-01 2022-04-19 Life Technologies Corporation Column ADC
WO2012006222A1 (en) 2010-07-03 2012-01-12 Life Technologies Corporation Chemically sensitive sensor with lightly doped drains
BR112013000552B8 (pt) * 2010-07-09 2023-01-17 Cergentis B V Estratégias de sequenciamento de região de interesse genômica em 3d
US9878328B2 (en) 2010-07-23 2018-01-30 Curiox Biosystems Pte Ltd. Apparatus and method for multiple reactions in small volumes
WO2012024574A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 The Regents Of The University Of California Small molecule arrays and methods for making and using them
US9880089B2 (en) 2010-08-31 2018-01-30 Complete Genomics, Inc. High-density devices with synchronous tracks for quad-cell based alignment correction
US9671344B2 (en) 2010-08-31 2017-06-06 Complete Genomics, Inc. High-density biochemical array chips with asynchronous tracks for alignment correction by moiré averaging
FR2964391B1 (fr) * 2010-09-03 2014-04-11 Centre Nat Rech Scient Biopuces pour l'analyse de la dynamique de molecules d'acide nucleique
US9618475B2 (en) 2010-09-15 2017-04-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
CN105911126B (zh) 2010-09-24 2018-12-18 生命科技公司 匹配的晶体管对电路
US8715933B2 (en) 2010-09-27 2014-05-06 Nabsys, Inc. Assay methods using nicking endonucleases
US8725422B2 (en) 2010-10-13 2014-05-13 Complete Genomics, Inc. Methods for estimating genome-wide copy number variations
WO2012058096A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2640849B1 (en) 2010-11-16 2016-04-06 Nabsys 2.0 LLC Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes
AU2011348100B2 (en) 2010-12-22 2016-08-25 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US9594870B2 (en) 2010-12-29 2017-03-14 Life Technologies Corporation Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations
EP3582224A1 (en) 2010-12-30 2019-12-18 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
WO2012092515A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
US20130060482A1 (en) 2010-12-30 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
ES2687761T3 (es) * 2011-01-31 2018-10-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Métodos de identificación de múltiples epítopos en células
CN103443338B (zh) 2011-02-02 2017-09-22 华盛顿大学商业化中心 大规模平行邻接作图
JP6153874B2 (ja) 2011-02-09 2017-06-28 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法
WO2012109574A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Nabsys, Inc. Assay methods using dna binding proteins
EP3366782B1 (en) 2011-04-08 2021-03-10 Life Technologies Corporation Phase-protecting reagent flow orderings for use in sequencing-by-synthesis
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CN103843001B (zh) * 2011-04-14 2017-06-09 考利达基因组股份有限公司 复杂核酸序列数据的处理和分析
US8778848B2 (en) 2011-06-09 2014-07-15 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
EP3624124B1 (en) 2011-08-18 2023-11-22 Life Technologies Corporation Systems for making base calls in nucleic acid sequencing
US9679103B2 (en) 2011-08-25 2017-06-13 Complete Genomics, Inc. Phasing of heterozygous loci to determine genomic haplotypes
US10704164B2 (en) 2011-08-31 2020-07-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification
US20150087537A1 (en) 2011-08-31 2015-03-26 Life Technologies Corporation Methods, Systems, Computer Readable Media, and Kits for Sample Identification
US9725765B2 (en) 2011-09-09 2017-08-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for obtaining a sequence
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
PT3290528T (pt) 2011-09-23 2019-10-14 Illumina Inc Métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico
US10378051B2 (en) 2011-09-29 2019-08-13 Illumina Cambridge Limited Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
AU2012328662B2 (en) 2011-10-28 2015-12-17 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP2774978B1 (en) * 2011-10-31 2019-05-15 Hitachi High-Technologies Corporation Nucleic acid amplification method
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
US9970984B2 (en) 2011-12-01 2018-05-15 Life Technologies Corporation Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array
CA2858070C (en) 2011-12-09 2018-07-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
EP2605001A1 (en) * 2011-12-15 2013-06-19 Hain Lifescience GmbH A device and method for optically measuring fluorescence of nucleic acids in test samples and use of the device and method
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
EP2794928B1 (en) 2011-12-22 2019-02-20 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US8747748B2 (en) 2012-01-19 2014-06-10 Life Technologies Corporation Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface
US8821798B2 (en) 2012-01-19 2014-09-02 Life Technologies Corporation Titanium nitride as sensing layer for microwell structure
US9864846B2 (en) 2012-01-31 2018-01-09 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
US9515676B2 (en) 2012-01-31 2016-12-06 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
JP6012767B2 (ja) 2012-02-07 2016-10-25 ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー 基板、ペプチドアレイ、および方法
US20130217023A1 (en) * 2012-02-22 2013-08-22 454 Life Sciences Corporation System And Method For Generation And Use Of Compact Clonally Amplified Products
ES2662128T3 (es) 2012-03-05 2018-04-05 Adaptive Biotechnologies Corporation Determinación de cadenas de receptor inmunitario emparejadas a partir de la frecuencia de subunidades coincidentes
JP6509723B2 (ja) * 2012-03-13 2019-05-08 スウィフト バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 核酸ポリメラーゼによる基質ポリヌクレオチドの大きさ制御されたホモポリマーテーリングのための方法および組成物
CN104302400B (zh) 2012-03-16 2017-03-01 生命技术公司 用于容纳生物样品的系统和方法
US9803239B2 (en) * 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
ES2949570T3 (es) 2012-04-03 2023-09-29 Illumina Inc Cabezal integrado de lectura optoelectrónica y cartucho de fluidos útiles para la secuenciación de ácidos nucleicos
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
WO2013166517A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Complete Genomics, Inc. Methods for determining absolute genome-wide copy number variations of complex tumors
HUE029357T2 (en) 2012-05-08 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions
US9646132B2 (en) 2012-05-11 2017-05-09 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
US9052963B2 (en) 2012-05-21 2015-06-09 International Business Machines Corporation Cloud computing data center machine monitor and control
US8786331B2 (en) 2012-05-29 2014-07-22 Life Technologies Corporation System for reducing noise in a chemical sensor array
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
US9488823B2 (en) 2012-06-07 2016-11-08 Complete Genomics, Inc. Techniques for scanned illumination
US9628676B2 (en) 2012-06-07 2017-04-18 Complete Genomics, Inc. Imaging systems with movable scan mirrors
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
WO2014008635A1 (zh) * 2012-07-11 2014-01-16 北京贝瑞和康生物技术有限公司 片断dna检测方法、片断dna检测试剂盒及其应用
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CN113528634A (zh) 2012-08-14 2021-10-22 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
EP2885626B1 (en) 2012-08-20 2020-03-04 Illumina, Inc. An integrated detection, flow cell and photonics (dfp) device
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
EP3974564A1 (en) * 2012-09-28 2022-03-30 Vibrant Holdings, LLC Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
AU2013327423B2 (en) 2012-10-01 2017-06-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
US10329608B2 (en) 2012-10-10 2019-06-25 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
CN104955959B (zh) * 2012-11-02 2020-04-17 生命技术公司 用于增强pcr特异性的新颖组合物、方法和试剂盒
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
US10378053B2 (en) 2017-03-17 2019-08-13 Apton Biosystems, Inc. Sequencing and high resolution imaging
US10829816B2 (en) * 2012-11-19 2020-11-10 Apton Biosystems, Inc. Methods of analyte detection
RU2670133C2 (ru) 2012-11-19 2018-10-18 Аптон Биосистемс, Инк. Цифровой анализ молекулярных анализируемых веществ с использованием одномолекулярного обнаружения
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014093676A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 10X Technologies, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9914966B1 (en) 2012-12-20 2018-03-13 Nabsys 2.0 Llc Apparatus and methods for analysis of biomolecules using high frequency alternating current excitation
US9080968B2 (en) 2013-01-04 2015-07-14 Life Technologies Corporation Methods and systems for point of use removal of sacrificial material
US9841398B2 (en) 2013-01-08 2017-12-12 Life Technologies Corporation Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
WO2014113557A1 (en) 2013-01-18 2014-07-24 Nabsys, Inc. Enhanced probe binding
US8962366B2 (en) 2013-01-28 2015-02-24 Life Technologies Corporation Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors
JP6466855B2 (ja) 2013-02-01 2019-02-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ゲノムアセンブリ及びハプロタイプフェージングの方法
US9411930B2 (en) 2013-02-01 2016-08-09 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
CN104969065A (zh) * 2013-02-07 2015-10-07 皇家飞利浦有限公司 核苷酸序列的处理
EP2954104B1 (en) 2013-02-08 2020-09-16 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
CA2901029C (en) 2013-02-15 2020-06-16 John J. Rajasekaran Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
CA2898453C (en) 2013-03-13 2021-07-27 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
ES2724824T3 (es) 2013-03-13 2019-09-16 Illumina Inc Métodos para la secuenciación de ácidos nucleicos
US8841217B1 (en) 2013-03-13 2014-09-23 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
US8963216B2 (en) 2013-03-13 2015-02-24 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface
US20140296080A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Life Technologies Corporation Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood
WO2014142981A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Enzyme-linked nucleotides
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
EP2972281B1 (en) 2013-03-15 2023-07-26 Life Technologies Corporation Chemical device with thin conductive element
US9835585B2 (en) 2013-03-15 2017-12-05 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
EP2972279B1 (en) 2013-03-15 2021-10-06 Life Technologies Corporation Chemical sensors with consistent sensor surface areas
US9116117B2 (en) 2013-03-15 2015-08-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall sensor surface
CN105452483B (zh) * 2013-03-15 2019-01-11 适应生物技术公司 复杂基因集合中的独特标记的重排适应性免疫受体基因
US9890425B2 (en) 2013-03-15 2018-02-13 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for detection of genomic copy number changes
WO2014149780A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with consistent sensor surface areas
EP2986741B1 (en) 2013-04-17 2019-07-24 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
US20140336063A1 (en) 2013-05-09 2014-11-13 Life Technologies Corporation Windowed Sequencing
MY197877A (en) 2013-06-04 2023-07-22 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
US10458942B2 (en) 2013-06-10 2019-10-29 Life Technologies Corporation Chemical sensor array having multiple sensors per well
CN105849275B (zh) 2013-06-25 2020-03-17 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
HUE041318T2 (hu) 2013-07-01 2019-05-28 Illumina Inc Katalizátormentes felület-funkcionalizálás és polimer-ojtás
WO2015002789A1 (en) 2013-07-03 2015-01-08 Illumina, Inc. Sequencing by orthogonal synthesis
US9557318B2 (en) 2013-07-09 2017-01-31 Curiox Biosystems Pte Ltd. Array plates for washing samples
US9926597B2 (en) 2013-07-26 2018-03-27 Life Technologies Corporation Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same
KR102122632B1 (ko) 2013-08-05 2020-06-16 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
DK3030645T3 (da) 2013-08-08 2023-01-30 Illumina Inc Fluidsystem til levering af reagenser til en flowcelle
AU2014308691A1 (en) 2013-08-22 2016-04-07 Apton Biosystems, Inc. Digital analysis of molecular analytes using electrical methods
CN105637099B (zh) 2013-08-23 2020-05-19 深圳华大智造科技有限公司 使用短读段的长片段从头组装
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
KR20160081896A (ko) 2013-08-30 2016-07-08 일루미나, 인코포레이티드 친수성 또는 다양한-친수성 표면 상에서의 액적의 조작
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
WO2015051338A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Life Technologies Corporation Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry
ES2885191T3 (es) 2013-10-17 2021-12-13 Illumina Inc Métodos y composiciones para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos
AU2014364180B2 (en) 2013-12-09 2021-03-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
CN110411998B (zh) 2013-12-10 2022-06-07 伊鲁米那股份有限公司 用于生物或化学分析的生物传感器及其制造方法
KR102379877B1 (ko) 2013-12-11 2022-03-30 아큐라젠 홀딩스 리미티드 희귀 서열 변이를 검출하기 위한 조성물 및 방법
US11286519B2 (en) 2013-12-11 2022-03-29 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
US11859246B2 (en) 2013-12-11 2024-01-02 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
WO2017062863A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for enrichment of amplification products
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
WO2015095226A2 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Illumina, Inc. Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples
JP2015139373A (ja) * 2014-01-27 2015-08-03 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子分析デバイス、及び生体分子分析装置
EP3114240B1 (en) 2014-03-05 2019-07-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
WO2015148219A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Clarient Diagnostic Services, Inc. Accurate detection of rare genetic variants in next generation sequencing
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
JP6726659B2 (ja) 2014-04-10 2020-07-22 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 試薬をカプセル化およびパーティション化するための流体デバイス、システム、および方法、ならびにそれらの応用
EP3134541B1 (en) 2014-04-21 2020-08-19 Natera, Inc. Detecting copy number variations (cnv) of chromosomal segments in cancer
WO2015168541A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Synthetic Genomics, Inc. Tamper-resistant assembly for securing valuable material
SG10201809312QA (en) 2014-05-16 2018-11-29 Illumina Inc Nucleic acid synthesis techniques
US20180173846A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
US10829814B2 (en) 2014-06-19 2020-11-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for single cell genomics
US20150376700A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
JP2017526046A (ja) 2014-06-26 2017-09-07 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 核酸配列アセンブルのプロセス及びシステム
CA2953374A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
DK3169805T5 (en) 2014-07-15 2018-12-03 Illumina Inc Biochemically activated electronic device
US20160032281A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Fei Company Functionalized grids for locating and imaging biological specimens and methods of using the same
US10526641B2 (en) 2014-08-01 2020-01-07 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
US9982250B2 (en) 2014-08-21 2018-05-29 Illumina Cambridge Limited Reversible surface functionalization
EP3187584B1 (en) * 2014-08-26 2021-02-24 Japan Science and Technology Agency Method for non-enzymatic combination of nucleic acid chains
CN107002121B (zh) 2014-09-18 2020-11-13 亿明达股份有限公司 用于分析核酸测序数据的方法和系统
US10676787B2 (en) 2014-10-13 2020-06-09 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling
KR102643955B1 (ko) 2014-10-17 2024-03-07 일루미나 케임브리지 리미티드 근접 보존 전위
MX2017005267A (es) 2014-10-29 2017-07-26 10X Genomics Inc Metodos y composiciones para la secuenciacion de acidos nucleicos seleccionados como diana.
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
KR102462849B1 (ko) 2014-10-31 2022-11-02 일루미나 케임브리지 리미티드 신규한 폴리머 및 dna 코폴리머 코팅
ES2768762T3 (es) 2014-11-05 2020-06-23 Illumina Cambridge Ltd Reducción del daño al ADN durante la preparación de muestras y secuenciación usando agentes quelantes sideróforos
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10900065B2 (en) 2014-11-14 2021-01-26 University Of Washington Methods and kits for labeling cellular molecules
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
CN107124888B (zh) * 2014-11-21 2021-08-06 深圳华大智造科技股份有限公司 鼓泡状接头元件和使用其构建测序文库的方法
JP6805140B2 (ja) * 2014-11-21 2020-12-23 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 平行プロセシングシステムおよび生物配列データの高度にスケーラブルな解析の方法
WO2016086029A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
PT3234187T (pt) 2014-12-15 2021-05-26 Illumina Inc Método para colocação de moleculas de alvo unico num substrato
WO2016100521A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
EP3234576B1 (en) 2014-12-18 2023-11-22 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with transmitter configuration
US10077472B2 (en) 2014-12-18 2018-09-18 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with power management
SG11201705615UA (en) 2015-01-12 2017-08-30 10X Genomics Inc Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
CA2968417A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
US10908083B2 (en) * 2015-02-02 2021-02-02 Hitachi High-Tech Corporation Multicolor fluorescence analysis device
CA2975855A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
CA2976786A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Complete Genomics, Inc. Dna sequencing using controlled strand displacement
JP6777966B2 (ja) 2015-02-17 2020-10-28 ダブテイル ゲノミクス エルエルシー 核酸配列アセンブリ
CN115651972A (zh) 2015-02-24 2023-01-31 10X 基因组学有限公司 用于靶向核酸序列覆盖的方法
CA2976580A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
ES2890776T3 (es) 2015-03-13 2022-01-24 Life Technologies Corp Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño
US9976174B2 (en) 2015-03-24 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis
US11807896B2 (en) 2015-03-26 2023-11-07 Dovetail Genomics, Llc Physical linkage preservation in DNA storage
WO2016161273A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
CA2982146A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
WO2016183029A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Illumina, Inc. Platform for discovery and analysis of therapeutic agents
DK3294906T3 (en) 2015-05-11 2024-08-05 Natera Inc Methods for determining ploidy
US10978174B2 (en) 2015-05-14 2021-04-13 Life Technologies Corporation Barcode sequences, and related systems and methods
DK3302804T3 (da) 2015-05-29 2022-09-26 Illumina Inc Prøveholder og analysesystem til udførelse af specifikke reaktioner
US10545139B2 (en) 2015-06-16 2020-01-28 Curiox Biosystems Pte Ltd. Methods and devices for performing biological assays using magnetic components
CN107924121B (zh) 2015-07-07 2021-06-08 亿明达股份有限公司 经由纳米压印的选择性表面图案化
US20180207920A1 (en) 2015-07-17 2018-07-26 Illumina, Inc. Polymer sheets for sequencing applications
IL255445B (en) 2015-07-30 2022-07-01 Illumina Inc Orthogonal deblocking of nucleotides
WO2017034868A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Illumina, Inc. In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays
EP3344389B1 (en) 2015-09-02 2020-06-10 Illumina Cambridge Limited Method of fixing defects in a hydrophobic surface of a droplet actuator
EA201890763A1 (ru) 2015-09-18 2018-08-31 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантных олигонуклеиновых кислот и их синтез
US11512347B2 (en) 2015-09-22 2022-11-29 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
CN108368542B (zh) 2015-10-19 2022-04-08 多弗泰尔基因组学有限责任公司 用于基因组组装、单元型定相以及独立于靶标的核酸检测的方法
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US10253352B2 (en) 2015-11-17 2019-04-09 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
CN115920796A (zh) 2015-12-01 2023-04-07 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
CN108699505A (zh) * 2015-12-03 2018-10-23 安可济控股有限公司 用于形成连接产物的方法和组合物
SG10202108763UA (en) 2015-12-04 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
JP2019508669A (ja) 2016-01-11 2019-03-28 イラミーナ インコーポレーテッド マイクロフルオロメータ、流体システム、およびフローセルラッチクランプモジュールを有する検出装置
CN108779491B (zh) 2016-02-11 2021-03-09 10X基因组学有限公司 用于全基因组序列数据的从头组装的系统、方法和介质
KR102744506B1 (ko) 2016-02-23 2024-12-18 더브테일 제노믹스 엘엘씨 게놈 어셈블리를 위한 페이징된 판독 세트의 생성 및 반수체형 페이징
JP6584986B2 (ja) 2016-03-18 2019-10-02 株式会社東芝 核酸検出方法
CA3016360A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Ucl Business Plc Methods for lung cancer detection
AU2017257624B2 (en) 2016-04-25 2023-05-25 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US10619205B2 (en) 2016-05-06 2020-04-14 Life Technologies Corporation Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods
AU2017263810B2 (en) 2016-05-13 2023-08-17 Dovetail Genomics Llc Recovering long-range linkage information from preserved samples
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
EP3458586B1 (en) 2016-05-16 2022-12-28 Accuragen Holdings Limited Method of improved sequencing by strand identification
WO2017201198A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Illumina, Inc. Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces
EP3465506B1 (en) 2016-06-01 2024-04-03 Life Technologies Corporation Methods and systems for designing gene panels
JP6889769B2 (ja) * 2016-07-18 2021-06-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 核酸配列決定の非対称な鋳型および非対称な方法
WO2018035170A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 Accuragen Holdings Limited Compositions and methods for detecting rare sequence variants
EP3500672A4 (en) 2016-08-22 2020-05-20 Twist Bioscience Corporation NOVO SYNTHESIZED NUCLEIC ACID BANKS
GB2570412A (en) 2016-08-31 2019-07-24 Harvard College Methods of generating libraries of nucleic acid sequences for detection via fluorescent in situ sequencing
EP4428536A3 (en) 2016-08-31 2024-12-04 President and Fellows of Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
KR102217487B1 (ko) 2016-09-21 2021-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 기반 데이터 저장
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
EP4439045A3 (en) 2016-10-14 2024-11-27 Illumina, Inc. Cartridge assembly
CA3041645C (en) 2016-10-24 2021-11-02 Geneinfosec, Inc. Concealing information present within nucleic acids
TW202409547A (zh) 2016-11-03 2024-03-01 大陸商深圳華大智造科技有限公司 用於生物或化學分析的生物感測器以及製造其的方法
CN110168648A (zh) 2016-11-16 2019-08-23 伊路米纳有限公司 序列变异识别的验证方法和系统
WO2018102759A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Ignite Biosciences, Inc. Methods of assaying proteins
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CA3047128A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
BR112019013715B1 (pt) 2017-01-04 2021-08-24 Bgi Shenzhen Métodos para detectar incorporação de um 3?-o-desoxirribonucleotídeo terminador reversível, para realizar uma reação de sequenciamento por síntese, para realizar sequenciamento por síntese de desoxirribonucleotídeo na extremidade 3? de um produto de extensão de iniciador e para sequenciamento de um ácido nucleico, arranjo de dna, e, kit
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CN110382710B (zh) 2017-01-24 2024-10-01 瓦斯特根公司 构建核酸分子拷贝的方法
CN110214186B (zh) 2017-01-30 2023-11-24 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US12264411B2 (en) 2017-01-30 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US11492666B2 (en) 2017-02-15 2022-11-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
WO2018156792A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
WO2018170169A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
US11255793B2 (en) 2017-03-20 2022-02-22 Mgi Tech Co., Ltd. Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same comprising a plurality of wells formed by a metal or metal oxide layer
EP3607087A4 (en) 2017-04-04 2020-12-30 Omniome, Inc. FLUIDIC APPARATUS AND USEFUL METHODS FOR CHEMICAL AND BIOLOGICAL REACTIONS
CN118558386A (zh) 2017-04-05 2024-08-30 科睿思生物科技(私人)有限公司 用于清洗阵列板上的样品的方法、设备和装置
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
CN110870018B (zh) 2017-05-19 2024-11-22 10X基因组学有限公司 用于分析数据集的系统和方法
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2018218250A2 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
EP3445876B1 (en) 2017-05-26 2023-07-05 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
WO2018231872A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
JP6991504B2 (ja) * 2017-07-13 2022-01-12 国立研究開発法人産業技術総合研究所 目的物質検出装置及び目的物質検出方法
US11241692B2 (en) 2017-08-01 2022-02-08 Mgi Tech Co., Ltd. Gene sequencing reaction device, gene sequencing system, and gene sequencing reaction method
CN111182972B (zh) 2017-08-15 2022-03-08 欧姆尼奥姆股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
JP7295092B2 (ja) 2017-08-18 2023-06-20 ノーティラス・サブシディアリー・インコーポレイテッド 結合試薬を選択する方法
US11125748B2 (en) * 2017-09-01 2021-09-21 University Of British Columbia Method for organizing individual molecules on a patterned substrate and structures assembled thereby
EP3681906A4 (en) 2017-09-11 2021-06-09 Twist Bioscience Corporation GPCR-BINDING PROTEINS AND THEIR SYNTHESIS
CN118045644A (zh) 2017-09-19 2024-05-17 深圳华大智造科技股份有限公司 晶片级测序流通池制造
CA3076367A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 University Of Washington In situ combinatorial labeling of cellular molecules
GB2566986A (en) 2017-09-29 2019-04-03 Evonetix Ltd Error detection during hybridisation of target double-stranded nucleic acid
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
EP3995590A1 (en) 2017-10-11 2022-05-11 MGI Tech Co., Ltd. Method for improving loading and stability of nucleic acid
MX2019014690A (es) 2017-10-16 2020-02-07 Illumina Inc Tecnicas basadas en aprendizaje profundo para el entrenamiento de redes neuronales convolucionales profundas.
KR102317911B1 (ko) 2017-10-16 2021-10-26 일루미나, 인코포레이티드 심층 학습 기반 스플라이스 부위 분류
AU2018353136B2 (en) 2017-10-19 2022-05-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows
US10894242B2 (en) 2017-10-20 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP4241882A3 (en) 2017-10-27 2023-12-06 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
CN111051523B (zh) 2017-11-15 2024-03-19 10X基因组学有限公司 功能化凝胶珠
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
US12084720B2 (en) 2017-12-14 2024-09-10 Natera, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
EP3728631A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing nucleic acid molecules from one or more cells
MX2020006803A (es) 2017-12-29 2020-10-28 Nautilus Biotechnology Inc Estrategias de descodificacion para identificacion de proteinas.
EP3731959A4 (en) 2017-12-29 2021-10-13 Clear Labs Inc. AUTOMATED PRIMING AND LIBRARY LOADER
SG11202006460SA (en) 2018-01-04 2020-08-28 Twist Bioscience Corp Dna-based digital information storage
US11561196B2 (en) 2018-01-08 2023-01-24 Illumina, Inc. Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection
KR102239487B1 (ko) 2018-01-08 2021-04-14 일루미나, 인코포레이티드 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석
KR102273717B1 (ko) 2018-01-15 2021-07-06 일루미나, 인코포레이티드 심층 학습 기반 변이체 분류자
WO2019152539A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Optical Biosystems, Inc. Method for detecting particles using structured illumination
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
WO2019169028A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
US11203782B2 (en) 2018-03-29 2021-12-21 Accuragen Holdings Limited Compositions and methods comprising asymmetric barcoding
JP7348603B2 (ja) * 2018-04-02 2023-09-21 エニュメラ・モレキュラー・インコーポレイテッド 核酸分子を計数するための方法、システム、および組成物
SG11202009478PA (en) 2018-04-02 2020-10-29 Dropworks Inc Systems and methods for serial flow emulsion processes
JP7438966B2 (ja) * 2018-04-04 2024-02-27 ノーティラス・サブシディアリー・インコーポレイテッド ナノアレイおよびマイクロアレイを製造する方法
CN112262218B (zh) 2018-04-06 2024-11-08 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
US20190318806A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant Classifier Based on Deep Neural Networks
EP3781714A1 (en) 2018-04-14 2021-02-24 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna
CN108444966A (zh) * 2018-04-16 2018-08-24 成都博奥晶芯生物科技有限公司 一种激光微阵列芯片扫描仪的浓度梯度荧光校准片
EP3782158A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
EP4234718A3 (en) 2018-04-26 2023-11-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
CN112639094B (zh) 2018-05-08 2025-03-18 深圳华大智造科技股份有限公司 用于测序、单体型分型和组装的基于单管珠粒的dna共条形码化
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
WO2019222688A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Illumina, Inc. High-throughput single-cell sequencing with reduced amplification bias
CN118957038A (zh) 2018-05-18 2024-11-15 特韦斯特生物科学公司 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法
JP2021525078A (ja) 2018-05-31 2021-09-24 オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． 核酸配列決定におけるシグナル対ノイズの増加
KR102507415B1 (ko) 2018-06-04 2023-03-07 일루미나, 인코포레이티드 고속 대량 단일 세포 전사체 라이브러리 그리고 이의 제조 및 사용 방법
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
WO2019241290A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Accuragen Holdings Limited Methods and compositions for forming ligation products
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
JP2020000197A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 キヤノン株式会社 計数方法、濃度測定装置及び濃度測定システム
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
NL2021377B1 (en) 2018-07-03 2020-01-08 Illumina Inc Interposer with first and second adhesive layers
CN112654713A (zh) * 2018-07-05 2021-04-13 安可济控股有限公司 用于数字聚合酶链反应的组合物和方法
US12073922B2 (en) 2018-07-11 2024-08-27 Illumina, Inc. Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs)
WO2020023362A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Omniome, Inc. Serial formation of ternary complex species
US12188014B1 (en) 2018-07-25 2025-01-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for nucleic acid processing using blocking agents
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
EP3836967A4 (en) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PROCESSING OR ANALYSIS
US12163179B2 (en) 2018-08-03 2024-12-10 10X Gemomics, Inc. Methods and systems to minimize barcode exchange
US12065688B2 (en) 2018-08-20 2024-08-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for cellular processing
WO2020041148A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CN113677806A (zh) 2018-09-19 2021-11-19 雅普顿生物系统公司 密集聚集的分析物层和检测方法
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
KR102165734B1 (ko) 2018-10-15 2020-10-14 일루미나, 인코포레이티드 심층 컨볼루션 신경망을 사전 훈련시키기 위한 심층 학습 기반 기술
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
US10876148B2 (en) 2018-11-14 2020-12-29 Element Biosciences, Inc. De novo surface preparation and uses thereof
US20200149095A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-14 Element Biosciences, Inc. Low binding supports for improved solid-phase dna hybridization and amplification
WO2020102766A2 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Element Biosciences, Inc. Methods for generating circular nucleic acid molecules
TWI853851B (zh) 2018-11-15 2024-09-01 中國商深圳華大智造科技有限公司 微流體裝置與其製備方法
US20240011086A1 (en) 2018-11-15 2024-01-11 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
US11993865B2 (en) 2018-11-20 2024-05-28 Nautilus Subsidiary, Inc. Selection of affinity reagents
TWI838429B (zh) 2018-12-01 2024-04-11 中國商深圳華大智造科技有限公司 改善生物傳感器的光收集效率的方法和結構
GB2578528B (en) 2018-12-04 2021-02-24 Omniome Inc Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays
US20220025447A1 (en) 2018-12-10 2022-01-27 10X Genomics, Inc. Generating spatial arrays with gradients
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
PL3899037T3 (pl) 2018-12-19 2024-04-08 Illumina, Inc. Sposoby poprawy priorytetu klonalności klastrów polinukleotydowych
US11041199B2 (en) 2018-12-20 2021-06-22 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US12169198B2 (en) 2019-01-08 2024-12-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for sample analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
EP3918088B1 (en) 2019-01-29 2024-03-13 MGI Tech Co., Ltd. High coverage stlfr
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020167574A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Omniome, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
CN113613787B (zh) 2019-02-20 2023-06-13 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US11492727B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
SG11202109283UA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
US20220033805A1 (en) 2019-03-01 2022-02-03 Sanjay Srivatsan High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using
WO2020180813A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 Qiagen Sciences, Llc Compositions and methods for adaptor design and nucleic acid library construction for rolony-based sequencing
SG11202111242PA (en) 2019-03-11 2021-11-29 10X Genomics Inc Systems and methods for processing optically tagged beads
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
WO2020191387A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
US11783917B2 (en) 2019-03-21 2023-10-10 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based base calling
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
EP3947718A4 (en) 2019-04-02 2022-12-21 Enumera Molecular, Inc. METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES
CN112888791A (zh) 2019-04-29 2021-06-01 伊鲁米那股份有限公司 通过快速温育和核酸富集来鉴定和分析微生物样本
US11423306B2 (en) 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
AU2020276115A1 (en) 2019-05-16 2021-01-07 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2020252186A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Omniome, Inc. Calibrated focus sensing
CN114729342A (zh) 2019-06-21 2022-07-08 特韦斯特生物科学公司 基于条形码的核酸序列装配
KR20220027867A (ko) * 2019-06-27 2022-03-08 지머젠 인코포레이티드 물질 및 실험기구 이송의 효율적인 경로를 구현하는 실험실 자동화 시스템
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
US12235262B1 (en) 2019-09-09 2025-02-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for single cell protein analysis
WO2021050717A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 The Regents Of The University Of California Immune cell sequencing methods
TW202124406A (zh) 2019-09-10 2021-07-01 美商歐姆尼歐美公司 核苷酸之可逆修飾
CA3155630A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
JP2022548309A (ja) 2019-09-23 2022-11-17 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｃｒｔｈ２のバリアント核酸ライブラリー
CN114599795A (zh) 2019-10-18 2022-06-07 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对核酸加帽的方法和组合物
US12157124B2 (en) 2019-11-06 2024-12-03 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
EP4055185A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
US12163189B2 (en) 2019-11-27 2024-12-10 University Of Washington Method for preparation and high-throughput microbial single-cell RNA sequencing of bacteria
WO2021119201A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Enumerix, Inc. Methods and systems for three-dimensional lightsheet imaging
CN114008199A (zh) 2019-12-19 2022-02-01 伊路敏纳公司 高通量单细胞文库及其制备和使用方法
US20210189483A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 Mgi Tech Co. Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
EP4081656A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
EP4424843A3 (en) 2019-12-23 2024-09-25 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
WO2021158511A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Omniome, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US12129516B2 (en) 2020-02-07 2024-10-29 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
IL295560A (en) 2020-02-20 2022-10-01 Illumina Inc Artificial intelligence-based many-to-many base calling
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
AU2021230282A1 (en) 2020-03-03 2022-09-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for sequencing double stranded nucleic acids
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
EP4121559A4 (en) * 2020-03-18 2024-03-27 Pacific Biosciences of California, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR DETECTING DENSE ANALYTES
US20240002928A1 (en) * 2020-04-21 2024-01-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. High-throughput nucleic acid sequencing with single-molecule-sensor arrays
EP4139485B1 (en) 2020-04-22 2023-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
CN115836135A (zh) 2020-05-05 2023-03-21 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
AU2021275128A1 (en) * 2020-05-20 2023-01-19 Element Biosciences, Inc. Methods for paired-end sequencing library preparation
EP4153776B1 (en) 2020-05-22 2025-03-05 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
ES2989052T3 (es) 2020-05-22 2024-11-25 10X Genomics Inc Medición espacio-temporal simultánea de la expresión génica y la actividad celular
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US12265079B1 (en) 2020-06-02 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles
WO2021247568A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Spatial trancriptomics for antigen-receptors
EP4025692A2 (en) 2020-06-02 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
WO2021252375A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 The Broad Institute, Inc. Single cell combinatorial indexing from amplified nucleic acids
EP4421186A3 (en) 2020-06-08 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
EP4164796A4 (en) 2020-06-10 2024-03-06 10x Genomics, Inc. LIQUID DISPENSING METHOD
EP4165207B1 (en) 2020-06-10 2024-09-25 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
GB202010691D0 (en) * 2020-07-10 2020-08-26 Vidya Holdings Ltd Improvements in or relating to an apparatus for imaging
CN116097360A (zh) 2020-07-17 2023-05-09 密执安大学评议会 用于组织样品中核酸的局部检测的材料和方法
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11200446B1 (en) 2020-08-31 2021-12-14 Element Biosciences, Inc. Single-pass primary analysis
US20230351619A1 (en) 2020-09-18 2023-11-02 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US12084715B1 (en) 2020-11-05 2024-09-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for reducing artifactual antisense products
AU2021378290A1 (en) 2020-11-11 2023-06-29 Nautilus Subsidiary, Inc. Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
KR20230142832A (ko) 2021-01-08 2023-10-11 셀라노메, 인크. 생물학적 샘플을 분석하기 위한 디바이스 및 방법
ES2989523T3 (es) 2021-02-19 2024-11-26 10X Genomics Inc Método de uso de un dispositivo modular de soporte para ensayos
CN117015617B (zh) 2021-02-23 2025-04-04 10X基因组学有限公司 基于探针的核酸和蛋白质分析
EP4301499A4 (en) 2021-03-05 2025-01-22 Enumerix Inc SYSTEMS AND METHODS FOR GENERATING DROPLETS AND PERFORMING DIGITAL ANALYSES
US11505796B2 (en) 2021-03-11 2022-11-22 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for biomolecule retention
WO2022197754A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina Software, Inc. Neural network parameter quantization for base calling
EP4301870B1 (en) 2021-03-18 2025-01-15 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
CA3210451A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Illumina Cambridge Limited Methods for improving nucleic acid cluster clonality
JP7592535B2 (ja) 2021-03-30 2024-12-02 出光興産株式会社 潤滑油基油及び潤滑油組成物
EP4305196B1 (en) 2021-04-14 2025-04-02 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
US12217829B2 (en) 2021-04-15 2025-02-04 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based analysis of protein three-dimensional (3D) structures
US12176070B2 (en) * 2021-04-19 2024-12-24 University Of Utah Research Foundation Systems and methods for facilitating rapid genome sequence analysis
EP4347879B1 (en) 2021-06-03 2025-02-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
EP4352286A1 (en) * 2021-06-11 2024-04-17 Cellanome, Inc. Systems and methods for analyzing biological samples
EP4355476A1 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Illumina, Inc. Hydrogel-free surface functionalization for sequencing
US11427855B1 (en) 2021-06-17 2022-08-30 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
US20230027409A1 (en) 2021-07-13 2023-01-26 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
EP4373958A1 (en) 2021-07-23 2024-05-29 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
EP4381095A1 (en) * 2021-08-03 2024-06-12 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
US12252745B2 (en) 2021-09-02 2025-03-18 Enumerix, Inc. Detection and digital quantitation of multiple targets
AU2022371198A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
WO2023091592A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Dovetail Genomics, Llc Dendrimers for genomic analysis methods and compositions
AU2022402132A1 (en) 2021-11-30 2024-05-30 Nautilus Subsidiary, Inc. Particle-based isolation of proteins and other analytes
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
WO2023107719A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Element Biosciences, Inc. Primary analysis in next generation sequencing
EP4453246A1 (en) 2021-12-20 2024-10-30 Enumerix, Inc. Detection and digital quantitation of multiple targets
EP4441711A1 (en) 2021-12-20 2024-10-09 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
US20240294967A1 (en) 2022-01-20 2024-09-05 Illumina, Inc. Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
KR20250004634A (ko) 2022-04-07 2025-01-08 일루미나, 인코포레이티드 변경된 시티딘 데아미나제 및 사용 방법
WO2024015962A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Blocked asymmetric hairpin adaptors
US20240053333A1 (en) 2022-08-03 2024-02-15 Nautilus Subsidiary, Inc. Chemical modification of antibodies and functional fragments thereof
AU2023325054A1 (en) 2022-08-15 2025-02-27 Element Biosciences, Inc. Methods for preparing nucleic acid nanostructures using compaction oligonucleotides
WO2024072614A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Polypeptide capture, in situ fragmentation and identification
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
CN115409174B (zh) * 2022-11-01 2023-03-31 之江实验室 一种基于dram存内计算的碱基序列过滤方法与装置
US20240209419A1 (en) 2022-12-14 2024-06-27 Illumina, Inc. Systems and Methods for Capture and Enrichment of Clustered Beads on Flow Cell Substrates
US20240241110A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Nautilus Subsidiary, Inc. Characterization of glycans and glycoconjugates
US20240417720A1 (en) 2023-06-14 2024-12-19 Nautilus Subsidiary, Inc. Making and using structured nucleic acid particles
WO2024263696A1 (en) 2023-06-21 2024-12-26 Nautilus Subsidiary, Inc. Compositions and methods for improving affinity reagent avidity
WO2025010160A1 (en) 2023-07-06 2025-01-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for stabilizing concatemers
WO2025043159A1 (en) 2023-08-24 2025-02-27 Nautilus Subsidiary, Inc. Compositions and methods for detecting binding interactions under equilibrium or non-equilibrium conditions
WO2025072800A2 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Illumina, Inc. Altered cytidine deaminases and methods of use

Family Cites Families (413)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3356882A (en) 1965-10-21 1967-12-05 Ford Motor Co Spark plug having the center electrode sheath with a nickel alloy
US3958144A (en) 1973-10-01 1976-05-18 Franks Harry E Spark plug
JPS5180845A (en) 1975-01-14 1976-07-15 Teijin Ltd 2*22 bisu * 3*55 jiburomu 44 * 22 hidorokishetokishi * fueniru * puropannoyojuhojiho
US4318846A (en) 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
JPS5965108A (ja) 1982-10-06 1984-04-13 Sumikin Kozai Kogyo Kk 鋼製合掌堰堤とその構築方法
US4994373A (en) * 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4719179A (en) 1984-11-30 1988-01-12 Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Six base oligonucleotide linkers and methods for their use
US4883750A (en) 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US5093232A (en) 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4925785A (en) 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5091519A (en) 1986-05-01 1992-02-25 Amoco Corporation Nucleotide compositions with linking groups
US5151507A (en) 1986-07-02 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US4725254A (en) 1986-11-24 1988-02-16 Allied Corporation Method for manufacturing a center electrode for a spark plug
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US4942124A (en) 1987-08-11 1990-07-17 President And Fellows Of Harvard College Multiplex sequencing
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US4886741A (en) 1987-12-09 1989-12-12 Microprobe Corporation Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization
DE3813278A1 (de) 1988-01-12 1989-07-20 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren
US5354657A (en) 1988-01-12 1994-10-11 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5168038A (en) 1988-06-17 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5066580A (en) 1988-08-31 1991-11-19 Becton Dickinson And Company Xanthene dyes that emit to the red of fluorescein
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
DE3836656A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung
US5091302A (en) * 1989-04-27 1992-02-25 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Polymorphism of human platelet membrane glycoprotein iiia and diagnostic and therapeutic applications thereof
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6379895B1 (en) * 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6346413B1 (en) * 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
DE3924454A1 (de) 1989-07-24 1991-02-07 Cornelis P Prof Dr Hollenberg Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips)
JPH03101086A (ja) 1989-09-14 1991-04-25 Ngk Spark Plug Co Ltd 内燃機関用スパークプラグ
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
US5003097A (en) 1989-10-02 1991-03-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the sulfurization of phosphorous groups in compounds
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5166387A (en) 1990-01-12 1992-11-24 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs with thiuram disulfides
US5427930A (en) * 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5073562A (en) 1990-05-10 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Alkoxy-substituted dihydrobenzopyran-2-carboxylic acids and derivatives thereof
US5091320A (en) * 1990-06-15 1992-02-25 Bell Communications Research, Inc. Ellipsometric control of material growth
WO1992001813A1 (en) 1990-07-25 1992-02-06 Syngene, Inc. Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
JP3080178B2 (ja) 1991-02-18 2000-08-21 東洋紡績株式会社 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
JP3085409B2 (ja) 1991-03-29 2000-09-11 東洋紡績株式会社 標的核酸配列の検出方法およびそのための試薬キット
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US6589726B1 (en) * 1991-09-04 2003-07-08 Metrigen, Inc. Method and apparatus for in situ synthesis on a solid support
EP0604552B1 (en) 1991-09-18 1997-02-12 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
ES2299229T3 (es) 1991-09-24 2008-05-16 Keygene N.V. Creadores, kits y series de fragmentos de restriccion usados en la amplificcion selectiva de fragmentos de restriccion.
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
EP1588761A3 (en) 1991-11-22 2005-11-23 Affymetrix, Inc. Method of forming arrays of polymers
US5550215A (en) 1991-11-22 1996-08-27 Holmes; Christopher P. Polymer reversal on solid surfaces
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
EP1382386A3 (en) 1992-02-19 2004-12-01 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US5403708A (en) * 1992-07-06 1995-04-04 Brennan; Thomas M. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acids
GB9214873D0 (en) 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Process for categorising nucleotide sequence populations
US6261808B1 (en) * 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5834202A (en) * 1992-08-04 1998-11-10 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5583211A (en) 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US5593826A (en) 1993-03-22 1997-01-14 Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides
US5491074A (en) 1993-04-01 1996-02-13 Affymax Technologies Nv Association peptides
WO1994024143A1 (en) 1993-04-12 1994-10-27 Northwestern University Method of forming oligonucleotides
US6096880A (en) * 1993-04-15 2000-08-01 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US5714320A (en) * 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
WO1995001365A1 (en) 1993-07-02 1995-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthesis of branched nucleic acids
US5473060A (en) 1993-07-02 1995-12-05 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide clamps having diagnostic applications
CN1128884C (zh) 1993-09-27 2003-11-26 阿奇发展公司 有效进行核酸测序的方法和组合物
US6401267B1 (en) 1993-09-27 2002-06-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
US5472672A (en) 1993-10-22 1995-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for polymer synthesis using arrays
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
EP0730663B1 (en) 1993-10-26 2003-09-24 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5429807A (en) 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
GB2285942A (en) 1994-01-25 1995-08-02 Ford Motor Co Forming an erosion resistant coating on an electrode
US5654419A (en) 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
US6090555A (en) 1997-12-11 2000-07-18 Affymetrix, Inc. Scanned image alignment systems and methods
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
AU2360195A (en) 1994-05-05 1995-11-29 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US7625697B2 (en) 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5641658A (en) * 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US5710000A (en) * 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
US6654505B2 (en) * 1994-10-13 2003-11-25 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
FR2726286B1 (fr) * 1994-10-28 1997-01-17 Genset Sa Procede d'amplification d'acides nucleiques en phase solide et trousse de reactifs utile pour la mise en oeuvre de ce procede
US5744367A (en) 1994-11-10 1998-04-28 Igen International, Inc. Magnetic particle based electrochemiluminescent detection apparatus and method
US5599695A (en) 1995-02-27 1997-02-04 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays using deprotection agents solely in the vapor phase
US5866337A (en) * 1995-03-24 1999-02-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5648245A (en) * 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
CA2219769A1 (en) 1995-05-12 1996-11-14 Novartis Ag Sensor platform and method for the parallel detection of a plurality of analytes using evanescently excited luminescence
US5774305A (en) 1995-06-07 1998-06-30 Seagate Technology, Inc. Head gimbal assembly to reduce slider distortion due to thermal stress
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5675209A (en) 1995-06-19 1997-10-07 Hoskins Manufacturing Company Electrode material for a spark plug
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US20020068357A1 (en) 1995-09-28 2002-06-06 Mathies Richard A. Miniaturized integrated nucleic acid processing and analysis device and method
US6132580A (en) 1995-09-28 2000-10-17 The Regents Of The University Of California Miniature reaction chamber and devices incorporating same
AU7398996A (en) 1995-10-11 1997-04-30 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method
US5658734A (en) 1995-10-17 1997-08-19 International Business Machines Corporation Process for synthesizing chemical compounds
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5854033A (en) * 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
WO1997020948A1 (en) * 1995-12-05 1997-06-12 Koch Joern Erland A cascade nucleic acid amplification reaction
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6660233B1 (en) 1996-01-16 2003-12-09 Beckman Coulter, Inc. Analytical biochemistry system with robotically carried bioarray
WO1997032042A2 (en) * 1996-03-01 1997-09-04 The University Court Of The University Of Dundee Drug trial assay system
US6013440A (en) * 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
US5847162A (en) 1996-06-27 1998-12-08 The Perkin Elmer Corporation 4, 7-Dichlororhodamine dyes
US5800996A (en) 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5851804A (en) * 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
JP2000512744A (ja) 1996-05-16 2000-09-26 アフィメトリックス，インコーポレイテッド 標識材料を検出するシステムおよび方法
ES2243393T3 (es) 1996-06-04 2005-12-01 University Of Utah Research Foundation Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr.
US5869245A (en) * 1996-06-05 1999-02-09 Fox Chase Cancer Center Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
EP0925494B1 (en) 1996-09-04 2001-12-19 Scandinavian Micro Biodevices A/S A micro flow system for particle separation and analysis
WO1998015644A2 (en) * 1996-09-27 1998-04-16 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
DE69720041T2 (de) 1996-11-14 2004-01-08 Affymetrix, Inc., Santa Clara Chemische amplifizierung zur synthese von musterordnungen
US6054100A (en) * 1996-11-18 2000-04-25 Robbins Scientific Corporation Apparatus for multi-well microscale synthesis
US5916750A (en) 1997-01-08 1999-06-29 Biogenex Laboratories Multifunctional linking reagents for synthesis of branched oligomers
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US5994068A (en) 1997-03-11 1999-11-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Nucleic acid indexing
US6327410B1 (en) * 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
WO1998044151A1 (en) 1997-04-01 1998-10-08 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid amplification
US20020055100A1 (en) 1997-04-01 2002-05-09 Kawashima Eric H. Method of nucleic acid sequencing
US5888737A (en) * 1997-04-15 1999-03-30 Lynx Therapeutics, Inc. Adaptor-based sequence analysis
US20040229221A1 (en) 1997-05-08 2004-11-18 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure
US5919626A (en) † 1997-06-06 1999-07-06 Orchid Bio Computer, Inc. Attachment of unmodified nucleic acids to silanized solid phase surfaces
ATE487790T1 (de) † 1997-07-07 2010-11-15 Medical Res Council In-vitro-sortierverfahren
US6124120A (en) 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6511803B1 (en) * 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
CA2305449A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 President & Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
JP2001521753A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 アフィメトリックス インコーポレイテッド 成人臓器及び胎児臓器中の発現プロフィール
US5866473A (en) * 1997-10-31 1999-02-02 Advanced Micro Devices, Inc. Method of manufacturing a polysilicon gate having a dimension below the photolithography limitation
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6087102A (en) 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
US6269846B1 (en) 1998-01-13 2001-08-07 Genetic Microsystems, Inc. Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for deposition of arrays
US6428752B1 (en) 1998-05-14 2002-08-06 Affymetrix, Inc. Cleaning deposit devices that form microarrays and the like
US6287776B1 (en) 1998-02-02 2001-09-11 Signature Bioscience, Inc. Method for detecting and classifying nucleic acid hybridization
CA2320810A1 (en) 1998-02-06 1999-08-12 Affymetrix, Inc. Method of quality control in manufacturing processes
US6136537A (en) 1998-02-23 2000-10-24 Macevicz; Stephen C. Gene expression analysis
JP3944996B2 (ja) 1998-03-05 2007-07-18 株式会社日立製作所 Ｄｎａプローブアレー
US6174687B1 (en) 1999-02-26 2001-01-16 The Burnham Institute Methods of identifying lung homing molecules using membrane dipeptidase
DE19812729A1 (de) 1998-03-24 1999-09-30 Bosch Gmbh Robert Elektromotor, insbesondere mit einem Lüfterrad zur Bildung eines Axial- oder Radiallüfters
CA2325468C (en) * 1998-03-25 2008-11-18 Ulf Landegren Rolling circle replication of padlock probes
US5936324A (en) 1998-03-30 1999-08-10 Genetic Microsystems Inc. Moving magnet scanner
US6004755A (en) * 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6284497B1 (en) * 1998-04-09 2001-09-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid arrays and methods of synthesis
JP4262799B2 (ja) 1998-04-16 2009-05-13 平田機工株式会社 生タイヤ供給方法
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6270831B2 (en) 1998-04-30 2001-08-07 Medquest Products, Inc. Method and apparatus for providing a conductive, amorphous non-stick coating
US6255469B1 (en) * 1998-05-06 2001-07-03 New York University Periodic two and three dimensional nucleic acid structures
US6031078A (en) 1998-06-16 2000-02-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. MTbx protein and nucleic acid molecules and uses therefor
US5980345A (en) 1998-07-13 1999-11-09 Alliedsignal Inc. Spark plug electrode having iridium based sphere and method for manufacturing same
US6316229B1 (en) * 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
GB0002310D0 (en) † 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20040106110A1 (en) * 1998-07-30 2004-06-03 Solexa, Ltd. Preparation of polynucleotide arrays
AU770831B2 (en) 1998-07-30 2004-03-04 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6232067B1 (en) * 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6046039A (en) 1998-08-19 2000-04-04 Battelle Memorial Institute Methods for producing partially digested restriction DNA fragments and for producing a partially modified PCR product
WO2000014282A1 (en) * 1998-09-04 2000-03-16 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
EP1114184A2 (en) * 1998-09-15 2001-07-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
US20020019007A1 (en) * 1998-09-18 2002-02-14 Jensen Wayne A. PCR methods and materials
US6235502B1 (en) * 1998-09-18 2001-05-22 Molecular Staging Inc. Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification
US6326144B1 (en) 1998-09-18 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Biological applications of quantum dots
US6426513B1 (en) 1998-09-18 2002-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble thiol-capped nanocrystals
US6251303B1 (en) 1998-09-18 2001-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble fluorescent nanocrystals
US6610492B1 (en) 1998-10-01 2003-08-26 Variagenics, Inc. Base-modified nucleotides and cleavage of polynucleotides incorporating them
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US7272507B2 (en) * 1999-10-26 2007-09-18 Michael Paul Strathmann Applications of parallel genomic analysis
WO2000040758A2 (en) 1999-01-06 2000-07-13 Hyseq Inc. Enhanced sequencing by hybridization using pools of probes
EP1141384A2 (en) 1999-01-06 2001-10-10 Cornell Research Foundation, Inc. Method for accelerating identification of single nucleotide polymorphisms and alignment of clones in genomic sequencing
GB9901475D0 (en) 1999-01-22 1999-03-17 Pyrosequencing Ab A method of DNA sequencing
US6514768B1 (en) * 1999-01-29 2003-02-04 Surmodics, Inc. Replicable probe array
AU3482200A (en) * 1999-02-02 2000-08-25 Bernhard Palsson Methods for identifying drug targets based on genomic sequence data
DE60041642D1 (de) 1999-03-18 2009-04-09 Complete Genomics As Methoden zur klonierung und herstelung von kettenfragmenten mit lesbarem inhalt an information
US6537755B1 (en) 1999-03-25 2003-03-25 Radoje T. Drmanac Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization
CA2366459A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Affymetrix, Inc. Universal arrays
ATE553219T1 (de) 1999-04-20 2012-04-15 Illumina Inc Erkennung von nukleinsäurereaktionen auf bead- arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US6521428B1 (en) * 1999-04-21 2003-02-18 Genome Technologies, Llc Shot-gun sequencing and amplification without cloning
US6274323B1 (en) 1999-05-07 2001-08-14 Quantum Dot Corporation Method of detecting an analyte in a sample using semiconductor nanocrystals as a detectable label
EP1190233B1 (en) 1999-05-20 2006-08-30 Illumina, Inc. Apparatus for retaining and presenting at least one microsphere array to solutions and/or to optical imaging systems
US6620584B1 (en) * 1999-05-20 2003-09-16 Illumina Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US6573369B2 (en) * 1999-05-21 2003-06-03 Bioforce Nanosciences, Inc. Method and apparatus for solid state molecular analysis
US6326719B1 (en) 1999-06-16 2001-12-04 Alliedsignal Inc. Spark plug shell having a bimetallic ground electrode spark plug incorporating the shell, and method of making same
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
AU6387000A (en) 1999-07-29 2001-02-19 Genzyme Corporation Serial analysis of genetic alterations
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
US6472156B1 (en) * 1999-08-30 2002-10-29 The University Of Utah Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
CA2386791A1 (en) * 1999-10-08 2001-04-19 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
US6297016B1 (en) 1999-10-08 2001-10-02 Applera Corporation Template-dependent ligation with PNA-DNA chimeric probes
US6287778B1 (en) 1999-10-19 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags
EP1234058A2 (en) 1999-11-26 2002-08-28 Curagen Corporation Nucleic acid probe arrays
CA2360342A1 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Molecular Staging Inc. Generation of single-strand circular dna from linear self-annealing segments
WO2001048184A2 (de) † 1999-12-23 2001-07-05 Axaron Bioscience Ag Verfahren zur parallelen sequenzierung eines nukleinsäuregemisches an einer oberfläche
CN1500150A (zh) 1999-12-29 2004-05-26 ��Ĭ���� 在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
US6221603B1 (en) * 2000-02-04 2001-04-24 Molecular Dynamics, Inc. Rolling circle amplification assay for nucleic acid analysis
JP2003521252A (ja) * 2000-02-07 2003-07-15 イルミナ インコーポレイテッド ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
WO2001057268A2 (en) * 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
AU2001241723A1 (en) 2000-02-25 2001-09-03 Affymetrix, Inc. Methods for multi-stage solid phase amplification of nucleic acids
US20020004204A1 (en) 2000-02-29 2002-01-10 O'keefe Matthew T. Microarray substrate with integrated photodetector and methods of use thereof
US6413722B1 (en) * 2000-03-22 2002-07-02 Incyte Genomics, Inc. Polymer coated surfaces for microarray applications
EP2278030B1 (en) * 2000-04-10 2017-05-24 Taxon Biosciences, Inc. Methods for the survey and genetic analysis of populations
AU2001274869A1 (en) 2000-05-20 2001-12-03 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a dna library using positional amplification
EP1286226B1 (en) 2000-05-25 2008-02-27 Fuji Xerox Co., Ltd. Toner and image forming method
DE10027651C2 (de) 2000-06-03 2002-11-28 Bosch Gmbh Robert Elektrode, Verfahren zu deren Herstellung und Zündkerze mit einer derartigen Elektrode
AU2001268468A1 (en) 2000-06-13 2001-12-24 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
JP3930227B2 (ja) * 2000-06-14 2007-06-13 ペンタックス株式会社 磁気式エンコーダおよび磁気式エンコーダを搭載した測量機
JP2002085097A (ja) 2000-09-12 2002-03-26 Hitachi Ltd Ｄｎａ塩基配列決定法
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
AU2002246612B2 (en) 2000-10-24 2007-11-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic DNA
US20020055102A1 (en) * 2000-10-24 2002-05-09 David Stern Apparatus and method for scanning multiple arrays of biological probes
US6576291B2 (en) 2000-12-08 2003-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of nanocrystallites
US20020074920A1 (en) 2000-12-15 2002-06-20 Chiu Randolph Kwok-Kin High efficiency, extended life spark plug having improved firing tips
US6783943B2 (en) * 2000-12-20 2004-08-31 The Regents Of The University Of California Rolling circle amplification detection of RNA and DNA
US20020094536A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-18 Cell Therapeutics, Inc. Methods for making polynucleotide libraries, polynucleotide arrays, and cell libraries for high-throughput genomics analysis
JP2004524525A (ja) 2001-01-30 2004-08-12 ソレックサ リミテッド ポリヌクレオチドアレイの調製
WO2002061143A2 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Ambion, Inc. Comparative analysis of nucleic acids using population tagging
WO2002074988A2 (en) * 2001-03-16 2002-09-26 The Chancellor, Master And Scholars Of The University Of Oxford Arrays and methods of use
JP4171206B2 (ja) 2001-03-16 2008-10-22 株式会社デンソー スパークプラグおよびその製造方法
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
GB0114853D0 (en) * 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Happier Mapping
ATE556845T1 (de) 2001-07-20 2012-05-15 Life Technologies Corp Lumineszierende nanopartikel und ihre herstellung
US7297778B2 (en) 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
CA2453840A1 (en) 2001-07-27 2003-02-13 Mcgill University Isp-1 and ctb-1 genes and uses thereof
US6881579B2 (en) 2001-07-30 2005-04-19 Agilent Technologies, Inc. Sample processing apparatus and methods
GB2378245A (en) 2001-08-03 2003-02-05 Mats Nilsson Nucleic acid amplification method
WO2005040094A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Postech Foundation Novel dendrimer compound and a biochip using the same
US9201067B2 (en) * 2003-03-05 2015-12-01 Posco Size-controlled macromolecule
US6975943B2 (en) * 2001-09-24 2005-12-13 Seqwright, Inc. Clone-array pooled shotgun strategy for nucleic acid sequencing
US6617137B2 (en) 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
GB0126887D0 (en) 2001-11-08 2002-01-02 Univ London Method for producing and identifying soluble protein domains
JP2005509440A (ja) 2001-11-19 2005-04-14 パラレル バイオサイエンス， インコーポレイテッド 多重オリゴヌクレオチド付加および標的増幅
GB2382137A (en) 2001-11-20 2003-05-21 Mats Gullberg Nucleic acid enrichment
US7361310B1 (en) * 2001-11-30 2008-04-22 Northwestern University Direct write nanolithographic deposition of nucleic acids from nanoscopic tips
US7011945B2 (en) * 2001-12-21 2006-03-14 Eastman Kodak Company Random array of micro-spheres for the analysis of nucleic acids
US20040002090A1 (en) 2002-03-05 2004-01-01 Pascal Mayer Methods for detecting genome-wide sequence variations associated with a phenotype
US20040005614A1 (en) 2002-05-17 2004-01-08 Nurith Kurn Methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
DE10224339A1 (de) * 2002-05-29 2003-12-11 Axaron Bioscience Ag Verfahren zur hochparallelen Nukleinsäuresequenzierung
AUPS298102A0 (en) 2002-06-13 2002-07-04 Nucleics Pty Ltd Method for performing chemical reactions
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US7046376B2 (en) 2002-07-05 2006-05-16 Therma-Wave, Inc. Overlay targets with isolated, critical-dimension features and apparatus to measure overlay
TW200403052A (en) 2002-07-17 2004-03-01 Novartis Ag Use of organic compounds
US6747331B2 (en) * 2002-07-17 2004-06-08 International Business Machines Corporation Method and packaging structure for optimizing warpage of flip chip organic packages
WO2004017376A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Miragene, Inc. Integrated system for printing, processing, and imaging protein microarrays
ES2550513T3 (es) † 2002-08-23 2015-11-10 Illumina Cambridge Limited Nucleótidos modificados para secuenciación de polinucleótidos
AU2002348943A1 (en) 2002-09-11 2004-04-30 Moltech Invent S.A. Non-carbon anodes for aluminium electrowinning and other oxidation resistant components with iron oxide-containing coatings
EP1556506A1 (en) 2002-09-19 2005-07-27 The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford Molecular arrays and single molecule detection
EP1551986B1 (en) 2002-09-30 2014-08-27 Affymetrix, Inc. Polynucleotide synthesis and labeling by kinetic sampling ligation
US7459273B2 (en) 2002-10-04 2008-12-02 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
CN1965089A (zh) 2002-10-11 2007-05-16 鹿特丹伊拉兹马斯大学 用于基于pcr的克隆系研究的核酸扩增引物
US20040120861A1 (en) * 2002-10-11 2004-06-24 Affymetrix, Inc. System and method for high-throughput processing of biological probe arrays
US20040086892A1 (en) 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
EP1587940A4 (en) 2002-12-20 2006-06-07 Caliper Life Sciences Inc SINGLE MOLECULAR AMPLIFICATION AND DNA PROOF
US6977153B2 (en) * 2002-12-31 2005-12-20 Qiagen Gmbh Rolling circle amplification of RNA
DE10300599A1 (de) 2003-01-10 2004-07-22 Jörg Dr. Sommer Mehrrumpfiges Schiff mit beweglichen Schwimmkörpern als Wellenkraftwerk
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
EP2261372B1 (en) 2003-01-29 2012-08-22 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
EP1592810A2 (en) 2003-02-12 2005-11-09 Genizon Svenska AB Methods and means for nucleic acid sequencing
US8105771B2 (en) 2003-02-26 2012-01-31 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
DK1604040T3 (da) 2003-03-07 2011-01-24 Rubicon Genomics Inc Amplifikation og analyse af hele genom- og hele transkriptom-biblioteket genereret ved en DNA-polymerisationsproces
FR2852605B1 (fr) 2003-03-18 2012-11-30 Commissariat Energie Atomique Procede de preparation de fragments d'adn et ses applications
EP1616947B1 (en) 2003-03-28 2012-05-09 Japan as represented by Director General of National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities METHOD OF SYNTHESIZING cDNA
WO2004092331A2 (en) * 2003-04-08 2004-10-28 Li-Cor, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
US20050181394A1 (en) 2003-06-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
AU2003263632A1 (en) * 2003-08-19 2005-03-07 Posco Novel dendrimer compound, a biochip using the same and a fabricating method thereof
GB0320337D0 (en) 2003-08-29 2003-10-01 Syrris Ltd A microfluidic system
DE602004026077D1 (de) 2003-09-10 2010-04-29 Althea Technologies Inc Erstellung von expressionsprofilen unter verwendung von mikroarrays
AT501110A1 (de) * 2003-09-16 2006-06-15 Upper Austrian Res Gmbh Arrays zur bindung von molekülen
US8222005B2 (en) * 2003-09-17 2012-07-17 Agency For Science, Technology And Research Method for gene identification signature (GIS) analysis
WO2005029040A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Parallele Biosciences, Inc. System and methods for enhancing signal-to-noise ratios of microarray-based measurements
GB0324456D0 (en) 2003-10-20 2003-11-19 Isis Innovation Parallel DNA sequencing methods
TWM245024U (en) * 2003-10-30 2004-10-01 Tranmax Machinery Co Ltd Airtight structure for air passage of pneumatic tool
WO2005042781A2 (en) 2003-10-31 2005-05-12 Agencourt Personal Genomics Corporation Methods for producing a paired tag from a nucleic acid sequence and methods of use thereof
US7148361B2 (en) 2003-10-31 2006-12-12 North Carolina State University Synthesis of phosphono-substituted porphyrin compounds for attachment to metal oxide surfaces
JP3796607B2 (ja) 2003-10-31 2006-07-12 株式会社リコー 定着装置
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US7854108B2 (en) 2003-12-12 2010-12-21 Vision Robotics Corporation Agricultural robot system and method
US7972994B2 (en) * 2003-12-17 2011-07-05 Glaxosmithkline Llc Methods for synthesis of encoded libraries
US20050136414A1 (en) 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
EP1711591A4 (en) 2003-12-29 2010-04-28 Nugen Technologies Inc METHODS FOR ANALYZING THE STATE OF METHYLATION OF NUCLEIC ACIDS AND METHODS FOR FRAGMENTING, MARKING AND IMMOBILIZING NUCLEIC ACIDS
WO2005065814A1 (en) * 2004-01-07 2005-07-21 Solexa Limited Modified molecular arrays
GB0400584D0 (en) * 2004-01-12 2004-02-11 Solexa Ltd Nucleic acid chacterisation
US7927797B2 (en) 2004-01-28 2011-04-19 454 Life Sciences Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
GB0402895D0 (en) 2004-02-10 2004-03-17 Solexa Ltd Arrayed polynucleotides
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
CA2557841A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 President And Fellows Of Harvard College Polony fluorescent in situ sequencing beads
KR100552706B1 (ko) 2004-03-12 2006-02-20 삼성전자주식회사 핵산 증폭 방법 및 장치
US20050214840A1 (en) 2004-03-23 2005-09-29 Xiangning Chen Restriction enzyme mediated method of multiplex genotyping
GB2413796B (en) * 2004-03-25 2006-03-29 Global Genomics Ab Methods and means for nucleic acid sequencing
CA2562557A1 (en) 2004-04-09 2005-10-27 The Trustees Of Boston University Method for de novo detection of sequences in nucleic acids:target sequencing by fragmentation
US20050260609A1 (en) 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
CA2566806A1 (en) 2004-05-25 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US20070117104A1 (en) 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US7565346B2 (en) 2004-05-31 2009-07-21 International Business Machines Corporation System and method for sequence-based subspace pattern clustering
US20060024711A1 (en) * 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7276720B2 (en) 2004-07-19 2007-10-02 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US20060012793A1 (en) 2004-07-19 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
EP1647600A3 (en) 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
GB0422551D0 (en) 2004-10-11 2004-11-10 Univ Liverpool Labelling and sequencing of nucleic acids
US20060110764A1 (en) † 2004-10-25 2006-05-25 Tom Tang Large-scale parallelized DNA sequencing
JP2008520975A (ja) 2004-11-16 2008-06-19 ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション Ｔｉｒｆ単分子分析および核酸を配列決定する方法
JP2008520682A (ja) 2004-11-17 2008-06-19 ザ ユニヴァーシティー オヴ シカゴ ヒストンデアセチラーゼ阻害剤およびその使用方法
JP2008526877A (ja) 2005-01-05 2008-07-24 エージェンコート パーソナル ジェノミクス 可逆的ヌクレオチドターミネーターおよびその使用
CA2596496A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060223122A1 (en) 2005-03-08 2006-10-05 Agnes Fogo Classifying and predicting glomerulosclerosis using a proteomics approach
US8110196B2 (en) 2005-04-29 2012-02-07 Polytopas LLC Methods and compositions for polytopic vaccination
US20060263789A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
EP3492602A1 (en) 2005-06-15 2019-06-05 Complete Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20090264299A1 (en) 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
CA2616433A1 (en) 2005-07-28 2007-02-01 Helicos Biosciences Corporation Consecutive base single molecule sequencing
JP2009525492A (ja) * 2005-08-01 2009-07-09 一秋 上川 英語音、および他のヨーロッパ言語音の表現方法と発音テクニックのシステム
US20090129980A1 (en) 2005-08-04 2009-05-21 Helicos Biosciences Corporation Multi-Channel Flow Cells
MY143596A (en) 2005-08-11 2011-06-15 Synthetic Genomics Inc In vitro recombination method
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
AU2006295556B2 (en) 2005-09-29 2012-07-05 Keygene N.V. High throughput screening of mutagenized populations
AU2012216376B2 (en) 2005-10-07 2015-08-13 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
AU2013202990B2 (en) 2005-10-07 2015-08-20 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
CA2624896C (en) 2005-10-07 2017-11-07 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
WO2007087310A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
WO2007092538A2 (en) * 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
CA2641851A1 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Eric Hans Vermaas Method for sequencing a polynucleotide template
US8460878B2 (en) * 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for detecting cells and cellular components in small defined volumes
EP1994180A4 (en) 2006-02-24 2009-11-25 Callida Genomics Inc GENOME SEQUENCING ON DNA ARRAYS WITH HIGH THROUGHPUT
CN101460633A (zh) * 2006-03-14 2009-06-17 基尼宗生物科学公司 用于核酸测序的方法和装置
DE102006015433A1 (de) 2006-03-31 2007-10-04 Reuver, Hermannus S.F. Verfahren zur Aufbereitung von Rotschlamm in Böden sowie Anlage zur Durchführung des Verfahrens
US7359610B2 (en) 2006-04-03 2008-04-15 Adc Telecommunications, Inc. Cable manager including nestable radius limiter
US7569979B2 (en) 2006-04-07 2009-08-04 Federal-Mogul World Wide, Inc. Spark plug having spark portion provided with a base material and a protective material
CA2649725A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 Applera Corporation Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US20080003142A1 (en) 2006-05-11 2008-01-03 Link Darren R Microfluidic devices
US7910354B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
JP2010516285A (ja) 2007-01-26 2010-05-20 イルミナ インコーポレイテッド 核酸配列決定システムおよび方法
US8673563B2 (en) 2007-06-08 2014-03-18 Bio-Dixam, Llc Amplification method of methylated or unmethylated nucleic acid
EP2188386A2 (en) 2007-09-17 2010-05-26 Universite De Strasbourg Method for detecting or quantifying a truncating mutation
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
US7901890B2 (en) * 2007-11-05 2011-03-08 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
US7897344B2 (en) * 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
JP2011509095A (ja) 2008-01-09 2011-03-24 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 核酸配列決定のための対をなすタグのライブラリーを製造する方法
US20090298131A1 (en) 2008-02-19 2009-12-03 Intelligent Biosystems, Inc. Non-Emulsion Methods And Masked Biomolecules
KR20110033267A (ko) 2008-07-18 2011-03-30 아이디어페인트, 인코포레이티드 기록 및 소거 가능한 표면을 위한 주변 경화 용매-기반 코팅물
US8407554B2 (en) 2009-02-03 2013-03-26 Complete Genomics, Inc. Method and apparatus for quantification of DNA sequencing quality and construction of a characterizable model system using Reed-Solomon codes
US9524369B2 (en) * 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
US9074246B2 (en) 2010-01-25 2015-07-07 Rd Biosciences, Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
US9506112B2 (en) 2010-02-05 2016-11-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Increasing multiplex level by externalization of passive reference in polymerase chain reactions
EP2363502B1 (en) 2010-03-04 2017-02-15 miacom Diagnostics GmbH Enhanced multiplex FISH
WO2011112465A1 (en) 2010-03-06 2011-09-15 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses for detecting optical signals from a sample
CN102823230B (zh) 2011-01-17 2016-08-24 松下知识产权经营株式会社 摄像装置
CN103843001B (zh) * 2011-04-14 2017-06-09 考利达基因组股份有限公司 复杂核酸序列数据的处理和分析
WO2012162161A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Phthisis Diagnostics Microsporidia detection system and method
US9006630B2 (en) 2012-01-13 2015-04-14 Altasens, Inc. Quality of optically black reference pixels in CMOS iSoCs
CA2874413A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10351909B2 (en) 2005-06-15 2019-07-16 Complete Genomics, Inc. DNA sequencing from high density DNA arrays using asynchronous reactions

Also Published As

Publication number Publication date
US20090311691A1 (en) 2009-12-17
US20130345071A1 (en) 2013-12-26
US20110319281A1 (en) 2011-12-29
DK2620510T3 (en) 2017-01-30
US20090137414A1 (en) 2009-05-28
US20180051333A1 (en) 2018-02-22
EP2463386A3 (en) 2012-08-15
EP2463386A2 (en) 2012-06-13
WO2006138284A2 (en) 2006-12-28
US20240263230A1 (en) 2024-08-08
EP2620510A1 (en) 2013-07-31
EP1907583B2 (en) 2019-10-23
IL188142A (en) 2015-10-29
US20240301486A1 (en) 2024-09-12
US10125392B2 (en) 2018-11-13
CA2611671A1 (en) 2006-12-28
US20130310264A1 (en) 2013-11-21
US20170175184A1 (en) 2017-06-22
US20200392574A1 (en) 2020-12-17
US20070072208A1 (en) 2007-03-29
DK1907583T3 (en) 2017-01-16
CN101466847B (zh) 2014-02-19
EP1907583B1 (en) 2016-10-05
US20170152554A1 (en) 2017-06-01
EP2620510B1 (en) 2016-10-12
DK1907583T4 (da) 2020-01-27
US7709197B2 (en) 2010-05-04
EP1907571A2 (en) 2008-04-09
IL241986A0 (en) 2015-11-30
US20080234136A1 (en) 2008-09-25
EP3257949A1 (en) 2017-12-20
DK1907571T3 (en) 2017-08-21
US20130345068A1 (en) 2013-12-26
SG162795A1 (en) 2010-07-29
US20130345069A1 (en) 2013-12-26
US9650673B2 (en) 2017-05-16
EP2463386B1 (en) 2017-04-12
US8445197B2 (en) 2013-05-21
AU2006259565B2 (en) 2011-01-06
WO2006138257A2 (en) 2006-12-28
US20200399695A1 (en) 2020-12-24
US8445196B2 (en) 2013-05-21
EP1907571B1 (en) 2017-04-26
US11414702B2 (en) 2022-08-16
EP1907583A2 (en) 2008-04-09
US9944984B2 (en) 2018-04-17
US9637784B2 (en) 2017-05-02
US20220411866A1 (en) 2022-12-29
EP1907571A4 (en) 2009-10-21
US20200115748A1 (en) 2020-04-16
CA2611743A1 (en) 2006-12-28
US20130316920A1 (en) 2013-11-28
US20130345070A1 (en) 2013-12-26
EP1907583A4 (en) 2009-11-11
JP5331476B2 (ja) 2013-10-30
US8771958B2 (en) 2014-07-08
JP2009500004A (ja) 2009-01-08
US20220411865A1 (en) 2022-12-29
CN101466847A (zh) 2009-06-24
US8765375B2 (en) 2014-07-01
US8765379B2 (en) 2014-07-01
JP2016174608A (ja) 2016-10-06
JP2014138597A (ja) 2014-07-31
US20070099208A1 (en) 2007-05-03
EP2620510B2 (en) 2020-02-19
US8771957B2 (en) 2014-07-08
CA2611671C (en) 2013-10-08
US20110071053A1 (en) 2011-03-24
US8133719B2 (en) 2012-03-13
US20160017414A1 (en) 2016-01-21
WO2006138257A3 (en) 2008-12-11
CA2611743C (en) 2019-12-31
DK2463386T3 (en) 2017-07-31
EP2865766A1 (en) 2015-04-29
US20150159204A1 (en) 2015-06-11
US20140018246A1 (en) 2014-01-16
US7901891B2 (en) 2011-03-08
US8765382B2 (en) 2014-07-01
IL188142A0 (en) 2008-03-20
HK1209795A1 (en) 2016-04-08
US8673562B2 (en) 2014-03-18
US20140011688A1 (en) 2014-01-09
US20090137404A1 (en) 2009-05-28
US20220162694A1 (en) 2022-05-26
EP3492602A1 (en) 2019-06-05
JP2011234723A (ja) 2011-11-24
DK2620510T4 (da) 2020-03-30
AU2006259565A1 (en) 2006-12-28
US9637785B2 (en) 2017-05-02
US10351909B2 (en) 2019-07-16
WO2006138284A3 (en) 2007-12-13
US8445194B2 (en) 2013-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5965108B2 (ja) 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
US7960104B2 (en) Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
EP2546360A1 (en) Self-assembled single molecule arrays and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130820

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20131119

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20131122

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20131219

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20131225

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140117

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20140120

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140122

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140219

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20140219

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20140902

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20141225

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20150216

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20150410

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160415

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160701

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5965108

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250