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JP5691036B2 - 骨鉱化作用を増加するための組成物および方法 - Google Patents

骨鉱化作用を増加するための組成物および方法 Download PDF

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Description

（技術分野）
本発明は、一般的に、化学薬品および製薬方法に関し、そして、より具体的には、骨の鉱物含有量の増加に適切な方法および組成物に関する。このような組成物および方法は、例えば、骨減少症、骨粗しょう症、骨折および他の障害（骨の低い鉱物密度がこの疾患の特徴である）を含む多種多様な状態を処置するために利用され得る。
（発明の背景）
骨質量に対する変化の２または３の明確なフェーズが、個体の生涯にわたって起こる（Ｒｉｇｇｓ、Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１５４：６３−７７，１９９１を参照のこと）。第１のフェーズは男性および女性の両方において起こり、そして骨質量のピークに達するまで進行する。この第１のフェーズは、軟骨内の成長板の直線的な成長および骨膜の付着の速度による橈骨の成長を通して達成される。第２のフェーズは、約３０歳で海綿質（椎骨および骨盤のように平らな骨）について、そして約４０歳で皮質骨（例えば、肢において見出される長骨）について始まり、老齢まで継続する。この期は、ゆっくりとした骨の減少によって特徴付けられ、そして男性および女性の両方において起こる。女性においては、第３の骨減少期もまた起こり、おそらく閉経後のエストロゲンの欠乏による。この期の間だけで、女性は、さらに皮質骨から１０％、および小柱画分から２５％の骨質量を減少し得る（Ｒｉｇｇｓ、前出、を参照のこと）。
骨鉱物含有量の減少は、多種多様な状態によって引き起こされ得、そして有意な医学上の問題となり得る。例えば、骨粗しょう症は、ヒトにおいて身体を衰弱させる疾患であり、骨格の骨質量および鉱物密度の著しい減少、罹患した個体を骨折させる骨の微小構築の分解および対応する骨の脆弱性および感受性の増加を含む骨の構造上の劣化によって特徴付けられる。ヒトにおける骨粗しょう症は、臨床的な骨減少症（標準偏差より大きいが、若年成人の骨の平均値未満である２．５未満の標準偏差の骨の鉱物密度）、米国において約２５００万人の人々に見出される状態によって進行する。米国の別の７００〜８００万人の患者が、臨床的な骨減少症を有すると診断されている（２．５の標準偏差より大きな骨鉱物含有量が、成熟した若年成人の標準偏差を下回るものとして定義される）。骨粗しょう症は、ヘルスケアシステムにおいて最も高価な疾患の１つであり、米国において毎年何百億ドルもの費用となっている。ヘルスケア関連の費用に加えて、長期間の在宅看護および労働日の損失が、この疾患の財政的および社会的な費用に加えられる。世界的に約７５００万人が骨粗しょう症の危険にある。
人口母集団における骨粗しょう症の頻度は、年齢と共に増加し、そしてコーカサス人の間では、女性において優勢である（米国において８０％の骨粗しょう症患者のプールを含む）。老齢において骨格骨を骨折させる脆弱性および感受性の増加は、この集団における偶発的な転倒のより高い危険性によって悪化する。骨粗しょう症に関係する１５０万を上回る骨折が、毎年米国で報告される。骨折した股関節部、手首、および椎骨は、共通して最も一般的な骨粗しょう症に関連する損傷である。特に、股関節骨折は、患者にとって非常に厄介であり、そして高価であり、そして女性にとっては、高い割合の死亡率および罹患率に関連する。
骨粗しょう症は、骨質量の減少による骨折の危険性の増加として定義されているが、実質的に成人の骨密度を増加し得る、現在利用可能な骨格障害のための処置は存在しない。全ての医者の間で、成人の骨密度、特に、骨減少症および骨粗しょう症の危険性にある手首、脊柱および股関節の骨における密度を増加し得る薬物が必要であるという強い認識がある。
現在の骨粗しょう症を防止するためのストラテジーは、個体に対していくつかの利点を提供し得るが、この疾患の回復を保証し得ない。これらのストラテジーは、高齢の始まりにおける物理的活性（特に、重量維持活性（ｗｅｉｇｈｔ−ｂｅａｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ））を調節すること、食物中の十分なカルシウムを含有すること、およびアルコールまたはタバコを含む製品の消費の回避することを含む。臨床的な骨減少症または骨粗しょう症を有する患者にとって、現在の全ての治療的な薬物およびストラテジーは、骨の吸収のプロセスを阻害することによって、さらなる骨質量の損失を低下させる（定常的に生じる骨の天然の成分の再構築プロセス）ように指向される。
例えば、エストロゲンは、現在では骨の減少を遅らせるために処方されている。しかし、患者に対する任意の長期の利点があるか否か、そして７５歳を上回る患者において多少なりとも任意の効果があるか否かといういくつかの議論がある。さらに、エストロゲンの使用は、乳癌および子宮内膜癌の危険性が増大すると考えられている。
ビタミンＤと共に、またはビタミンＤなしでの食餌性カルシウムの高い用量もまた、閉経後の女性のために提案された。しかし、カルシウムの高い用量は、しばしば不快な胃腸管系の副作用を有し得、そして血清および尿中のカルシウムレベルが持続的にモニターされなければならない（ＫｈｏｓｌａおよびＲｉｇｓｓ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８−９８２，１９９５を参照のこと）。
示唆されている他の療法としては、カルシトニン、ビホスホネート、タンパク同化ステロイド、およびフッ化ナトリウムが挙げられる。しかし、このような療法は、その使用法を妨げ得る望ましくない副作用（例えば、カルシトニンおよびステロイドは、吐気を引き起こし、かつ免疫反応を引き起こし得、ビスホスホネートおよびフッ化ナトリウムは、骨密度がＫ浄土に増加したとしても、骨折の修復を阻害し得る）を有する（ＫｈｏｓｌａおよびＲｉｇｓｓ参照のこと、前出）。
現状では行われない治療計画としては、新しい骨質量の成長を刺激するかまたは増強する薬物が挙げられる。本発明は、骨鉱化作用を増大させ、るために利用され得、従って、骨質量を増大させるが望ましい広範な種々の状態を処置するために利用され得る、組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、他の、関連する利点を提供する。
（発明の要旨）
上述のように、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規のクラスまたはファミリー、ならびに骨鉱物量および骨鉱物密度量を増大させる化合物を選択するためのアッセイ、骨鉱物量および骨鉱物密度量を増大させる化合物ならびに広範な種々の状態の処置または予防においてこのような化合物を利用するための方法を提供する。
本発明の１つの局面において、単離された核酸分子が提供され、ここで上記核酸分子は、以下：（ａ）配列番号１、５、７、９、１１、１３、または１５を含む単離された核酸分子またはその相補的な配列；（ｂ）高度にストリンジェンシーな条件下で（ａ）の核酸分子へ特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に従うＴＧＦ‐β結合タンパク質をコードする単離された核酸分子、から成る群より選択される。本発明の関連した局面において、単離された核酸分子は、上記の同定された配列の１つの一部のみへのハイブリダイゼーションに基づいて提供される（例えば、（ａ）に関しては、ハイブリダイゼーションは、配列番号１のヌクレオチド、１５６〜５３９、または５５５〜６８７より選択される少なくとも２０、２５、５０、または１００のヌクレオチドのプローブに対するものであり得る。）。容易に明らかなように、ハイブリダイゼーションに利用される必要なストリンジェンシーは、プローブの大きさに基づいて変化し得る。例えば、２５マーのプローブについて高度にストリンジェンシーな条件としては以下が挙げられる：６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’）、６×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０（ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ） ｐ−４０）を４５℃にて一晩、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いての４５〜５０℃での２回の洗浄。低度にストリンジェンシーな条件下の１００マーのプローブについては、適切な条件としては、以下が挙げられ得る：５×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、および０．５％ＳＤＳで４２〜５０℃一晩、続いて、２×ＳＳＰＥ（または２×ＳＳＣ）／０．１％ＳＤＳを用いる、４２〜５０℃での２回の洗浄。
本発明の関連した局面において、配列番号１、５、７、９、１１、１３または１５に対して、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムを利用する相同性の５０％レベル、６０％レベル、７５％レベル、８０％レベル、９０％レベル、９５％レベル、または９８％レベルで、相同性を有する単離された核酸分子が、提供される。例えば、このような単離された分子の代表的例としては、配列番号２、６、１０、１２、１４、または１６を含むタンパク質をコードする核酸分子、あるいはＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを利用する相同性の５０％レベル、６０％レベル、７５％レベル、８０％レベル、９０％レベル、９５％レベル、または９８％レベルのレベルで、これらの配列に対する相同性を有する核酸分子が挙げられる。
単離された核酸分子は、代表的に１００ｋｂ未満の大きさであり、そして特定の実施形態において、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、またはさらに５ｋｂ未満の大きさである。さらに、他の実施形態において、単離された核酸分子は、他の無関係な核酸分子の「ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）」（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号ＡＣ００３０９８およびＥＭＢ 番号ＡＱ１７１５４６において記載されるようなサブクローンＢＡＣ）において存在しない。しかし、単離された核酸分子は、関連した分子のライブラリーにおいて見出され得る（例えば、米国特許第５，８３７，４５８号；同第５，８３０，７２１号；および同第５，８１１，２３８号に記載されるようなシャッフリングに関して）。最後に、本明細書中に記載される単離された核酸分子は、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、またはＳＣＧＦをコードする核酸分子（米国特許第５，７８０，２６３号）を含まない。
上述の核酸分子を含むクローニングベクターおよび上述の核酸分子の１つに作動可能にに連結されたプロモーター（例えば、制御配列）を含む発現ベクターもまた、本発明によって提供される。適切なプロモーターの代表例としては、組織特異的プロモーター、およびウイルスベースのプロモーター（例えば、ＣＭＶ Ｉ−Ｅ、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＭｕＬＶ ＬＴＲのようなＣＭＶベースのプロモーター）が挙げられる。発現ベクターはまた、ウイルスに基づくか、または由来であり得る（例えば、「ウイルスベクター」）。ウイルスベクターの代表的な例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。上述のベクターのいずれかを含むか、または含有する宿主細胞（例えば、ヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウス起源の宿主細胞を含む）もまた、提供される。
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−β結合タンパク質を産生する方法が、提供され、この方法は、ＴＧＦ−β結合タンパク質を産生するのに十分な条件下または時間でベクターを含む上述の宿主細胞を培養する工程を包含する。さらなる実施形態において、この方法によって産生されるタンパク質は、（例えば、カラムクロマトグラフィー、アフィニティー精製などにより）さらに生成され得る。それ故、上述の核酸分子（例えば、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，または１６）によってコードされる単離されたタンパク質は、本出願の開示を考えれば、容易に産生され得る。
上記のタンパク質、またはそれらのフラグメントが、融合タンパク質として産出され得る、ということもまた留意されるべきである。例えば，一つの局面において、第一のポリぺプチドセグメント（上記の核酸分子によりコードされるＴＧＦ−β結合タンパク質を含む）、または少なくとも１０、２０、３０、５０、もしくは１００アミノ酸長である第一のポリぺプチドセグメントの一部、および第二のポリぺプチドセグメント（非−ＴＧＦ−β結合タンパク質を含む）を含む融合タンパク質が、提供される。特定の実施形態では、この第二のポリぺプチドは、精製または認識に適したタグ（例えば、多重アニオン性アミノ酸残基を含むポリぺプチド（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと））、マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼ）、または毒性分子（例えば、リシン）、であり得る。
本発明の別の局面では、上記のクラスのＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、ヒトＢＥＥＲ）に特異的に結合し得る抗体が、提供される。種々の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体（例えば、ヒトまたはマウス起源）であり得る。さらなる実施形態では、抗体は抗体全体の結合特性を保持する抗体のフラグメントである（例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、またはＦｖフラグメント、もしくはＣＤＲさえも）。また上記の抗体を産生または発現する能力がある、ハイブリドーマおよびその他の細胞も提供される。
本発明の関連する局面では、ＴＧＦ−β結合タンパク質を検出する方法が提供され、そしてこの方法は、上記の抗体を、この抗体がＴＧＦ−β結合タンパク質に結合することを可能にするために十分な条件下および時間でインキュベートする工程、および結合を検出する工程、を包含する。種々の実施形態では、抗体は、洗浄または分離を容易にするために固体支持体に結合され得、そして／または標識され得る（例えば、酵素、蛍光性タンパク質、および放射性同位体からなる群から選択されるマーカーを用いて）。
本発明のその他の局面では、単離されたオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、もしくは１８による核酸分子、またはそれらの補体に、高ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする。さらなる実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６をコードする配列において見出され得る。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、２０、３０、５０、または１００ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、酵素、蛍光性分子、または放射性同位体）で標識される。また、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする上記の核酸分子の全てまたは一部を特異的に増幅し得るプライマーが提供される。本明細書中で使用される場合、用語「特異的に増幅する」とは、上記のＴＧＦ−β結合タンパク質を増幅するプライマーのことをいうと理解されるべきであり、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えばＤａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＧｒｅｍｌｉｎまたはＳＣＧＦ（米国特許第５，７８０．２６３号）のような）を増幅するプライマーではない。
本発明の関連する局面では、ＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子を検出するための方法が提供され、この方法は、上記のオリゴヌクレオチドを高ストリンジェントな条件下でインキュベートする工程、およびこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、標識され得、そして／または固体支持体に結合し得る。
本発明のその他の局面では、上記のＴＧＦ−β結合タンパク質の一つをコードするＲＮＡ（例えば、配列番号２、６，８，１０，１２、１４、または１６）を切断し得るリボザイムが提供される。このようなリボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ（２’−Ｏ−メチル−リボ核酸を含む）、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート結合を有する核酸）またはそれらの混合物からなり得る。これらのリボザイムをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）およびそのリボザイムを発現または産生し得るベクターもまた提供される。ベクターの代表的な例としては、プラスミド、レトロトランスポゾン、コスミド、およびウイルスベースのベクター（例えば、少なくとも部分的にレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ関連ウイルスから生成されるウイルスベクター）、が挙げられる。また、これらのベクターを含む宿主細胞（例えば、ヒト、イヌ、ラット、またはマウス細胞）も提供される。特定の実施形態では、この宿主細胞は、ベクターで安定に形質転換され得る。
本発明のさらなる局面において、リボザイムを、合成的にか、またはインビトロもしくはインビボの転写によるいずれかで産生するための方法が提供される。さらなる実施形態において、こうして産生されたリボザイムは、さらに精製され得、そして／または薬学的組成物（例えば、薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤を伴う、リボザイムまたはリボザイムをコードする核酸分子）に処方され得る。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体または本明細書中に記載されたその他の選択された分子は、薬学的組成物に処方され得る。
本発明の他の局面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１５に従う核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、またはそれに対する補体を含んで提供され、そして上記オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載するようなＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、ヒトＢＥＥＲ）の発現を阻害する。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１００、７５、または６０ヌクレオチド長未満である。容易に明白であるように、オリゴヌクレオチドは１つ以上の核酸アナログ、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸から構成され得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の結合（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇｅｒ）結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合、および複素環式糖間結合のような共有結合を含む）、により改変され得る。キメラオリゴヌクレオチドの１つの代表的な例が、米国特許第５，９８９，９１２号において提供される。
本発明のさらに別の局面において、骨鉱化作用を増加させるための方法が提供され、その方法は、上述のような有効量のリボザイムを温血性動物に導入する工程を包含する。関連する局面において、このような方法は、本明細書中に記載のような有効量の核酸分子またはベクターを患者内に導入する工程を包含し、その核酸分子またはベクターは、所望のリボザイムを、リボザイムを産生するための核酸分子の転写に好ましい条件下で産生することが可能である。
本発明の他の局面において、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。１つの実施形態において、動物はヒトではないという条件で、トランスジェニック動物が提供され、その生殖細胞および体細胞は、遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結される上述のようなＴＧＦ−β結合タンパク質をコードする核酸分子を含み、その遺伝子は、動物、またはその動物の祖先に、胚段階で、導入される。他の実施形態において、動物はヒトではないという条件で、トランスジェニックノックアウト動物が提供され、その生殖細胞および体細胞が、核酸分子（本明細書中に記載するようにＴＧＦ結合タンパク質をコードする）にハイブリダイズする内因性核酸分子の少なくとも１つの対立遺伝子の破壊を含む動物を含み、ここでその破壊は、破壊のない動物と比較して、上記対立遺伝子からのメッセンジャーＲＮＡの転写を防止する。種々な実施形態において、破壊は核酸の欠失、置換または挿入である。他の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、またはイヌである。
本発明のさらなる局面において、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子発現の検出のために、キットが提供され、そのキットには核酸分子を含むコンテナを含む。ここで、その核酸分子は以下からなる群から選択される：（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む核酸分子；（ｃ）少なくとも１５、２０、３０、５０、７５、または１００ヌクレオチド長の（ａ）または（ｂ）のフラグメントである核酸分子。また、ＴＧＦ−β結合−タンパク質の検出のためのキットが提供され、そのキットには、本明細書中に記載される１つのＴＧＦ−β結合タンパク質抗体を含むコンテナを含む。
例えば、本発明の１つの局面において、選択された分子が骨鉱物含有量を増加させることが可能か否かを決定するための方法が提供され、その方法は（ａ）１つ以上の候補分子を、請求項１に記載の核酸分子によりコードされたＴＧＦ−β−結合−タンパク質、およびＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバー（例えば、ＢＭＰ５または６）と混合する工程、（ｂ）その候補分子が、ＴＧＦ−βファミリーメンバーのシグナル伝達を変えるか否か、またはＴＧＦ−β結合−タンパク質のＴＧＦ−βファミリーメンバーへの結合を変えるか否かを決定する工程を包含する。特定の実施形態において、その分子は、間葉細胞分化の正の調節因子として機能するようにＴＧＦ−βの能力を変える。本発明のこの局面において、候補分子は、シグナル伝達もしくは結合を減少させる（例えば、阻害する）か、または増加させる（例えば、高める）ことにより、シグナル伝達、もしくは結合を変え得る。
さらに別の局面において、選択された分子が骨鉱物含有量を増加させることが可能であるか否かを決定するための方法が提供され、その方法は、選択された分子が、ＴＧＦ−β結合−タンパク質の、骨またはそのアナログへの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。骨またはそのアナログの代表的な例は、ヒドロキシアパタイトおよび生検から得られた主要な人骨のサンプルを含む。
上述に列挙された方法の特定の実施形態において、選択された分子は分子の混合物中に含まれ、そしてその方法はさらに、アッセイにおいて機能的な１つ以上の分子を単離する工程を包含し得る。さらに他の実施形態においては、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質が固体支持体に結合され、そしてそのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合が測定されるか、またはＴＧＦ−β結合タンパク質が固体支持体に結合され、そしてＴＧＦ−βタンパク質の結合が測定される。
上記のような方法を利用して、広範に種々の分子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのタンパク質への結合を阻害することにより骨鉱物含有量を増加させるその能力についてアッセイされ得る。このような分子の代表的な例は、タンパク質またはペプチド、有機分子、および核酸分子を含む。
本発明の他の関連する局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、治療的に有効な量の本明細書中に列挙されるアッセイにより同定される分子を、温血動物に投与する工程を包含する。別の局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、治療的に有効な量の、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）への結合を阻害する分子を、温血動物に投与する工程を包含する。適切な分子の代表的な例としては、アンチセンス分子、リボザイム、リボザイム遺伝子、および抗体（例えば、ヒト化抗体）が挙げられ、これらは、ＴＧＦ−β結合タンパク質の活性を特異的に認識し、そして変化させる。
本発明の別の局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、（ａ）骨に移動する（ｈｏｍｅ ｔｏ）細胞に、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリータンパク質および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）への結合を阻害する分子の発現を指向するベクターを導入する工程、および（ｂ）このベクター含有細胞を温血動物に投与する工程、を包含する。本明細書中で利用される場合、末梢の投与の後、細胞が骨マトリックス中に局在化する場合に、細胞は「骨に移動する（ｈｏｍｅ ｔｏ ｂｏｎｅ）」ことが理解されるべきである。１つの実施形態においては、このような方法は、導入する工程の前に、骨に移動する骨の骨髄から細胞を単離する工程をさらに包含する。さらなる実施形態においては、骨に移動する細胞は、ＣＤ３４＋細胞および骨芽細胞からなる群から選択される。
本発明の他の局面においては、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質への結合を阻害する分子が提供される（好ましくは単離される）。
さらなる実施形態においては、この分子は、組成物として提供され得、そして骨吸収のインヒビターをさらに含み得る。このようなインヒビターの代表的な例としては、カルシトニン、エストロゲン、ビスホスホネート、抗吸収活性を有する成長因子およびタモキシフェンが挙げられる。
上記の治療的状況において利用され得る分子の代表的な例としては、例えば、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンス分子、および／または抗体（例えば、ヒト化抗体）が挙げられる。このような分子は、本明細書中に記載されるようなＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーメンバーのシグナル伝達または結合を、変化させるため、アンタゴナイズするため、またはアゴナイズするために使用される、これらの選択に依存し得る。
本発明の種々の実施形態においては、上記の分子および処置方法または予防方法は、骨粗鬆症、骨軟化症、歯周病、壊血病、クッシング病、骨折などの状態ならびに四肢不動化およびステロイドの使用に起因する状態において利用され得る。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面の参照により明らかになる。さらに、特定の手順または構成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記述する種々の参考文献が本明細書中に記載され、そして従って、それらは、その全体が参考として援用される。
図１は、ヒトＤａｎ；ヒトＧｒｅｍｌｉｎ；ヒトＣｅｒｂｅｒｕｓおよびヒトＢｅｅｒのアミノ酸配列を比較する略図である。矢印は、システイン骨格を示す。 図２は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子（特に、ヒトＢｅｅｒ遺伝子）の発現のための種々のヒト組織の調査により得られた結果の要約である。半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順が、全ＲＮＡより合成された第一鎖ｃＤＮＡ由来の遺伝子の一部を増幅させるために、使用された（実施例２Ａにおいてより詳細に記載される）。 図３は、マウスＢｅｅｒ転写物に対して相補的なｃＲＮＡプローブを用いる、マウス胚切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションにより得られた結果の要約である（実施例２Ｂにおいてより詳細に記載される）。パネルＡは１０．５ｄｐｃ胚の横断面である。パネルＢは、１２．５ｄｐｃ胚の矢状切片であり、そしてパネルＣおよびＤは、１５．５ｄｐｃ胚の矢状切片である。 図４は、ウエスタンブロット分析により、３つの異なるポリクロナール抗体のこれらのそれぞれの抗原に対する特異性を図示する（実施例４においてより詳細に記載される）。図４Ａは、抗Ｈ．Ｂｅｅｒ抗体の、Ｈ．ＤａｎまたはＨ．Ｇｒｅｍｌｉｎではなく、Ｈ．Ｂｅｅｒ抗原に対する特異的な反応性を示す。図４Ｂは、抗Ｈ．Ｇｒｅｍｌｉｎ抗体の、Ｈ．ＢｅｅｒまたはＨ．Ｄａｎではなく、Ｈ．Ｇｒｅｍｌｉｎ抗原に対する反応性を示す。図４Ｃは、抗Ｈ．Ｄａｎ抗体の、Ｈ．ＢｅｅｒまたはＨ．ＧｒｅｍｌｉｎではなくＨ．Ｄａｎに対する反応性を示す。 図５は、ウエスタンブロット分析による、ＴＧＦ−β結合タンパク質（Ｂｅｅｒ）の、ＢＭＰ−４ではなく、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６に対する選択性を図示する（実施例５においてより詳細に記載される）。 図６は、ＴＧＦ−β結合タンパク質（Ｂｅｅｒ）とＢＭＰ−５との間のイオン相互作用が、１５〜３０ｎＭの範囲の解離定数を有することを示す。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示し、そして列挙すること、および本明細書中以下で用いられる略語を定義することは、本発明を理解するのに役立ち得る。
「分子」は、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナー、所望の結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸分子、およびＰＮＡのような核酸アナログ）；ならびに有機化合物または無機化合物を含むと理解されるべきである。
「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の公知あるいは新規なメンバー（これらはまた骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）を含むと理解されるべきである。
「ＴＧＦ−βレセプター」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）の特定のメンバーに特異的なレセプターをいうと理解されるべきである。
「ＴＧＦ−β結合タンパク質」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）の特定のメンバーまたはメンバーのサブセットに特異的な結合親和性を有するタンパク質をいうと理解されるべきである。ＴＧＦ−β結合タンパク質の特定の例としては、配列番号１、５、７、９、１１、１３および１５でコードされるタンパク質が挙げられる。
「ＴＧＦ−β結合タンパク質の、ＴＧＦ−βファミリータンパク質および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）への結合」の阻害は、ＴＧＦ−βをＴＧＦ結合タンパク質への結合から取り除くことまたはＴＧＦ−βをＴＧＦ結合タンパク質への結合から妨げることにより、ＴＧＦ−βまたは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の活性化を可能にするか、あるいは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含むＴＧＦ−βファミリーメンバーの、それぞれのレセプターへの結合を可能にする、分子をいうと理解されるべきである。例えば、このような阻害は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特定のメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子により達成され得る。
「ベクター」は、所望のタンパク質の発現を指向し得る集合体をいう。ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結される転写プロモーターエレメントを含まねばならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）または２つの組み合せ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、および１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択された宿主細胞および使用されたベクターに依存して、他の遺伝的エレメント（例えば、複製起点）、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転移の誘導を与える配列および選択マーカーはまた、本明細書に記載されたベクターに組み込まれ得る。
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれない核酸分子である。例えば、真核生物細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＴＧＦ結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれない、化学合成された核酸分子である。単離された核酸分子はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または少なくとも核酸アナログの一部を含むものであり得る。
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然にそのポリペプチドと結合した他のタンパク質性不純物のような細胞成分を本質的に夾雑しない、ポリペプチドである。特定の実施形態において、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一バンドとして名目上現れる場合、特定のタンパク質調製物は、単離されたポリペプチドを含む。有機分子に関する場合、「単離された」は、当該分野で周知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して、化合物が９０％より大きい純度であることを意味する。
「硬化狭窄症（ｓｃｌｅｒｏｓｔｅｏｓｉｓ）」硬化狭窄症は、Ｈａｎｓｅｎ（１９６７）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．、Ｓｋｌｅｒｏｓｔｅｏｓｅ．Ｉｎ：Ｏｐｉｔｚ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．，Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ． Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ｐｕｂ．）６ １９６７．３５１−３５５頁）によって、ｖａｎ Ｂｕｃｈｅｍ皮膚骨化過剰症（ｈｙｐｅｒｏｓｔｏｓｉｓ ｃｏｒｔｉｃａｌｉｓ ｇｅｎｅｒａｌｉｓａｔａ）と類似するが、おそらく骨変化の放射線学的外観ならびに多くの場合に示指と中指との非対照皮膚合指症の存在において異なる障害に適用される用語である。この状態において、顎は異常に四角い外観を有する。
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの可変性の重鎖および可変性の軽鎖からヒト可変ドメインへ転移されている、組換えタンパク質である。
本明細書で用いられるように、「抗体フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのような抗体の一部である。構造に関係なく、抗体フラグメントはインタクト抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質モノクローナル抗体フラグメントは、ＴＧＦ−β結合タンパク質のエピトープと結合する。
用語「抗体フラグメント」はまた、任意の合成タンパク質、または遺伝子的に操作したタンパク質を含み、これは、特異的な抗原に結合し、複合体を形成することにより、抗体のような作用をする。例えば、抗体フラグメントとしては、Ｌ鎖可変部分からなる単離されたフラグメント、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、Ｌ可変領域およびＨ可変領域が、ペプチドリンカーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。
「検出可能な標識」は、抗体の部分に結合体化し、診断に有用である分子を産生し得る分子または原子である。検出可能な標識の例としては、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光性剤、常磁性イオン、酵素、および他のマーカー部分が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「免疫複合体」は、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体、または抗体フラグメント、および検出可能な標識を含む分子である。免疫複合体は、結合前と結合後のＴＧＦ−β結合タンパク質の結合能が、おおよそ同様であるか、またはわずかにのみ減少する。
略語：ＴＧＦ−β−「トランスフォーミング増殖因子−β」；ＴＧＦ−βＢＰ−「トランスフォーミング増殖因子−β結合タンパク質」（代表的なＴＧＦ−βＢＰは、「Ｈ．Ｂｅｅｒ」と呼ばれる）；ＢＭＰ−「骨形成タンパク質」；ＰＣＲ−「ポリメラーゼ連鎖反応」；ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＮＡをまず逆転写酵素（ＲＴ）を用いることで第１段階でＤＮＡに最初に転写するＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ−ＲＮＡ配列をＤＮＡ形態にコピーすることにより作製される任意のＤＮＡ。
上記したように、本発明は、新規のクラスのＴＧＦ−β結合タンパク質、ならびに温血動物における骨鉱物含量を増加するための方法および組成物を提供する。簡潔に、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーの新規のメンバーをコードする遺伝子における変異は、正常な個体よりも１〜４倍高い骨鉱物含量により特徴付けられたまれな状態（硬化狭窄症）を生じるという思わぬ発見に基づく。従って、以下でより詳細に議論されるように、この発見は、アッセイの発達をもたらした。このアッセイは、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）へのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子、ならびに温血動物（例えば、ヒトを含む）の骨鉱物含量を増加するこのような分子を利用する方法を選択するために利用され得る。
（硬化狭窄症として知られる疾患の議論）
硬化狭窄症は、Ｈａｎｓｅｎ（１９６７）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｋｌｅｒｏｓｔｅｏｓｅ．Ｉｎ：Ｏｐｉｔｚ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｆ．，Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ Ｋｉｎｄｅｒｈｅｉｌｋｕｎｄｅ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ｐｕｂ．）６ １９６７．３５１−３５５頁）によって汎発性皮質過骨症に類似であるが、骨の変化の放射線学的な外見および多くの場合、指標および中指の非対称性皮膚合指症（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｙｎｄａｃｔｙｌｙ）の存在がおそらく異なる傷害に適用された用語である。
硬化狭窄症は現在、常染色体半劣性障害として公知であり、これは、成体において広く骨の多発性硬化性病変によって特徴付けられる。この状態は、進行性である。硬化狭窄症はまた、発達的な局面を有し、これは、合指症（２本以上の指がお互いに融合する）に関連する。この硬化狭窄症症候群は、高い身長に関連し、そして多くの罹患した個体は６フィート以上の高さに達する。ホモ接合体の骨鉱物含量は、正常の個体の１〜６倍以上であり得、そして鉱物密度は、正常値（例えば、病気に罹患していない兄弟姉妹から）の１〜４倍以上であり得る。
この硬化狭窄症症候群は、南アフリカにおけるオランダ系アフリカ人において主に起こる。アフリカ人集団におけるおおよそ１４０人に１人の個体が、変異遺伝子（ヘテロ接合体）のキャリアである。この変異は、１００％の表現率である。病理学（合指症または頭蓋過成長）に関連しないヘテロ接合体における骨鉱物密度の上昇の事例報告がある。
現時点で、硬化狭窄症における下垂体視床下部軸（ｐｉｔｕｔｉｔａｒｙ−ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ａｘｉｓ）の異常性はないようである。特に、成長ホルモンおよびコルチゾンの過産生はないようである。さらに、性ホルモンレベルは、罹患した個体において正常である。しかし、骨代謝回転マーカー（骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、１型プロコラーゲンＣ’プロペプチド（ＰＩＣＰ）、および全アルカリホスファターゼ；（Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｒｈｅｕ．７：２４３，１９９５を参照のこと））は、疾患に関連する過剰骨芽細胞活性を示すが、骨再吸収のマーカー（ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿のハイドロキシプロリン、血漿酒石酸耐性ホスファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリシン（Ｃｏｍｉｅｒ（前出）を参照のこと））により測定されるわずかに漸増する骨芽細胞活性に対して正常であることを示す。
硬化狭窄症は、罹患した個体の寿命の間、骨格の至るところの骨の頻繁な蓄積により特徴付けられる。ホモ接合体において、骨鉱物の頻繁な蓄積は、機械的レセプターの非存在である骨格の領域（頭蓋、下顎、頭蓋）において骨の過成長をもたらす。硬化狭窄症を有するホモ接合体において、頭蓋の骨の過成長は、頭蓋の加圧をもたらし、脳幹での過剰な静水圧のために最終的に死に至る。骨格の全てのほかの部分において、全身性の硬化症および広汎性の硬化症がある。長骨の皮質領域は、骨強度の実質的な増加を生じることで非常に肥厚化する。小柱の結合は厚さが増加し、小柱骨の強度を次々に増加する。硬化性の骨は、Ｘ−線で異常に不透明に見える。
実施例１において、より詳細に記載されるように、硬化狭窄症症候群の原因となるまれな遺伝的変異は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーの新規のメンバー（この代表的な例は、「Ｈ．Ｂｅｅｒ」と呼ばれる）をコードするヒト第１７染色体の領域に位置している。以下により詳細に記載されるように、この発見に基づき、骨鉱化作用の機構は、より十分に理解され、骨鉱化作用を上昇する分子のアッセイの開発、および骨鉱物含量を上昇するこのような分子の使用、および広範な多くの疾患の処置または予防における使用を可能にする。
（ＴＧＦ−βスーパーファミリー）
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通配列エレメントおよび（２次および３次レベルの両方で）構造的なモチーフを共有する種々の成長因子を含む。このタンパク質ファミリーは、多数の種々の細胞型における広い範囲の生物学的応答を発揮することが公知である。これらの多くは、それらが含まれる成体において（例えば、創傷治癒および骨修復ならびに骨再構築において、および免疫系の調節において）パターン形成および組織の特異化における胚の発達の間の重要な機能を有する。３つのＴＧＦ−βのものに加えて、スーパーファミリーは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、成長および分化因子（ＧＤＦ）、およびグリア誘導神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）を含む。主要な分類は、特定のタンパク質を一般的なサブファミリーに入れる一般的な配列特性を通じて確立される。サブファミリー内のさらなる層別化は、小さいグループのメンバーの間の、より厳密な配列保存のために可能である。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７に関するような特定の場合において、これは、小さいグループのメンバーの間の７５％のアミノ酸相同性程度の高さであり得る。この同一性のレベルは、単一の代表的な配列が、大きなファミリーの他のメンバーから、それを分けるサブグループの鍵となる生化学的なエレメントを例示することを可能にする。
ＴＧＦ‐βは、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプターのヘテロオリゴマーの複合体の形成を誘導することによりシグナル伝達する。ＴＧＦ−β２の結晶構造は、決定されている。ＴＧＦ−β２モノマーの一般的な折り畳みは、３つのジスルフィド架橋により形成される安定な、緻密なシステイン節様構造を含む。１つのジスルフィド架橋により安定化される２量体化は、逆平行である。
ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、内因性のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するレセプターに結合することにより、それらの細胞作用を開始する。このレセプターのファミリーは、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプターと示される２つのサブファミリーからなる。ＴＧＦ−βファミリーの各々のメンバーは、Ｉ型レセプターおよびＩＩ型レセプター（その両方が、シグナル伝達に必要とされる）の特徴的な組み合わせに結合する。ＴＧＦ−βレセプターの活性化の現在のモデルにおいて、ＴＧＦ−βは、活性化されたキナーゼとのオリゴマーの形態における細胞膜に生じるＩＩ型レセプター（ＴｂＲ−ＩＩ）に初めに結合する。その後、ＴｂＲ−ＩＩの非存在下ではリガンドに結合できないＩ型レセプター（ＴｂＲ−Ｉ）は、複合体に補充される。次いでＴｂＲ−ＩＩは、膜近傍の領域のグリシンおよびセリン残基の豊富なドメイン（ＧＳドメイン）においてＴｂＲ−Ｉを主にリン酸化し、それによってＴｂＲ−Ｉを活性化する。
これまでに、７つのＩ型レセプターおよび５つのＩＩ型レセプターが、同定されている。
（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ヒトにおける骨鉱物密度を決定する際の鍵となる調節タンパク質である）
骨形成の理解における主な進歩は、インビボでの軟骨および骨の分化を調節する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（骨原性タンパク質（ＯＰ）としても公知）の同定であった。ＢＭＰ／ＯＰは、軟骨の形成、軟骨の肥大およびカルシウム沈着、血管の湿潤、骨芽細胞の分化、および骨の形成を含む事象のカスケードを介して軟骨内の骨の分化を誘導する。上記のように、ＢＭＰ／ＯＰ（ＢＭＰ ２−１４および骨原タンパク質１および骨原タンパク質２であるＯＰ−１およびＯＰ−２）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰ／ＯＰサブファミリーのメンバーの間の著しい進化的保存は、それらが動物の正常な発達および機能に重要であることを示す。さらに、ＢＭＰ／ＯＰの複数の形態の存在は、この明白な重複性の生物学的な関連性についての重要な疑問を生じる。胎性後（ｐｏｓｔｆｅｔａｌ）の軟骨形成および骨形成に加えて、ＢＭＰ／ＯＰは、骨格発生（頭蓋顔面組織および歯組織の発達を含む）および胚の発達および腎臓を含む実質の器官の形成の複数の役割を果たす。自然は、特定化した組織および器官の発生を提供するために随行する共通の（およびわずかな）分子機構に依存することが今や理解される。ＢＭＰ／ＯＰスーパーファミリーは、高度に保存されたカルボキシ末端領域内のアミノ酸モチーフにわずかなバリエーションを有する分子アイソフォームを分散する複数の特定化した機能をプログラムする際の天然の節減の的確な例である。
（ＢＭＰ拮抗作用）
ＢＭＰおよびアクチビンサブファミリーは、有意な翻訳後調節に供される。複雑な細胞外制御系が存在し、そのために、高い親和性のアンタゴニストが合成および搬出され、引き続いて混合物の生物学的活性を分裂するためのＢＭＰまたはアクチビンと選択的に複合体化する（Ｗ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ（１９９９）ＴＩＧ １５（１）３−６）。多数のこれらの天然のアンタゴニストが同定されており、そして配列の開散性に基づくと、それらは主要な配列保存の欠如のために、独立的に進化したようである。今までのところ、このタンパク質の分類における構造的な研究は、なされていない。これらのアンタゴニストの研究は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を相互作用および中和するための明確な優先度が目立つ。さらに、阻害の機構は、異なるアンタゴニストについて異なるようである（Ｓ．ｌｅｍｕｒａら、（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５ ９３３７−９３４２）。
（新規ＴＧＦ−β結合タンパク質）
（１．ＴＧＦ−β結合タンパク質についての背景）
上記に記載したように、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規のクラスを提供する。それは、ヒトＤＡＮ、ヒトグレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、およびヒトケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、ならびにＳＣＧＦ（米国特許第５，７８０，２６３号）と比較した場合、ほとんど同一のシステイン（ジスルフィド）骨格を保有するが、ヌクレオチドレベル（背景の情報として、一般的にＨｓｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｅｉｍｏｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｈａｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．，「Ｔｈｅ Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｒｅｍｌｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ＢＭＰ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １： ６７３〜６８３，１９８８を参照のこと）においてはほとんど相同性がない。
ＴＧＦ−β結合タンパク質の新規のクラスの１つの代表的な実施例は、配列番号１、５、９、１１、１３および１５に開示される。結合タンパク質のこのクラスの代表的なメンバーはまた、ＴＧＦ−β結合タンパク質の改変体を含むことを理解されるべきである（例えば、配列番号５および７）。本明細書中で利用されるように、「ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子」とは、配列番号２、１０、１２、１４または１６の改変であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいう。そのような改変体には、天然に存在する多型、またはＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の対立遺伝子改変体、およびこれらアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換を含む合成遺伝子が挙げられる。ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子のさらなる改変体の形態は、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、その遺伝子が、ストリンジェントな条件下で配列番号１、５、７、９、１１、１３、または１５のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、システイン骨格を有するタンパク質をコードするはずである。
代わりとして、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、配列の比較によって同定され得る。本明細書中に使用される場合、最大限に一致するように整列したとき、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同じであるならば、２つのアミノ酸配列は、「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、最大限に一致するように整列したとき、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同じ場合、２つのヌクレオチド配列は、「１００％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により生産されるＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォーマティクス計算パッケージソフト（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ）に含まれるソフトウェアプログラムような標準的ソフトウェアプログラムを使用して行われ得る。最適な整列を決定することによる２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、ＰｅｒｕｓｋｉおよびＰｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９７７）、Ｗｕら（編）、「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２３〜１５１頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）ならびにＢｉｓｈｏｐ（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと）。
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質は、配列番号２、６、１０、１２、１４、または１６と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有し、そして好ましくは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超える同一性を有するはずである。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体は、配列番号１、５、９、１１、１３または１５と少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有することによって同定され得る。さらに、本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子改変体が配列番号１と７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超える同一性を有することを意図する。ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子または改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質を同定するために使用される特定の方法に関係なく、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子にコードされる改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質またはポリペプチドは、例えば、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーに結合する能力、および／またはそのシグナル伝達を阻害する能力、あるいは抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合する能力によって、機能的に特徴づけられ得る。
本発明は、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントを含む。本発明の文脈内において、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の「機能的フラグメント」とは、（１）上記の機能的活性を有するか、または（２）抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合する、いずれかのＴＧＦ−β結合タンパク質のポリペプチドの一部分をコードする核酸分子をいう。例えば、本明細書中に記載されるＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントは、配列番号１、５、９、１１、１３または１５のヌクレオチド配列の一部分を含む。
（２．ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の単離）
結合タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、配列番号１に基づくポリヌクレオチドプローブを用いたヒトのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングによって得られ得る。
例えば、ｃＤＮＡライブラリーの調製における第１段階は、当業者に周知の方法を用いてＲＮＡを単離することである。一般的に、ＲＮＡ単離技術は、細胞を破壊するための方法、ＲＮａｓｅにより指向されるＲＮＡの分解を阻害する手段、ならびにＲＮＡをＤＮＡ、タンパク質および多糖雑夾雑物から分離する手段を提供しなければならない。例えば、総ＲＮＡは、液体窒素中で組織を凍結すること、細胞を溶解するために乳鉢および乳棒を用いて凍結した組織を砕くこと、タンパク質を除去するためにフェノール／クロロホルムの溶液を用いて砕いた組織を抽出すること、および塩化リチウムを用いた選択的沈降によって残っている不純物からＲＮＡを分離することによって単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版、４−１〜４−６頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５）［「Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）」］；Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３−４１頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）［「Ｗｕ（１９９７）」］を参照のこと）。
あるいは、総ＲＮＡは、砕いた組織からグアニジニウムイソチオシアネートを用いて抽出すること、有機溶媒を用いて抽出すること、そして分画遠心分離を用いて夾雑物からＲＮＡを分離することによって単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）４−１〜４−６頁；Ｗｕ（１９９７）３３−４１頁を参照のこと）。
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ（Ａ）+ＲＮＡは、総ＲＮＡ調製物から単離されなければならない。ポリ（Ａ）+ＲＮＡは、総ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーの標準的技術を用いることによって単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）４−１１〜４−１２頁を参照のこと）。
２本鎖ｃＤＮＡ分子は、ポリ（Ａ）+ＲＮＡから当業者に周知の技術を用いて合成される（例えば、Ｗｕ（１９９７）４１−４６頁を参照のこと）。さらに、市販されているキットは、２本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能である。
ＴＧＦ−β結合タンパク質ｃＤＮＡクローンを得るための基礎的なアプローチは、ＴＧＦ結合タンパク質特異的ｃＤＮＡ分子が富化された差引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーを構築することによって改変され得る。差引きライブラリーを構築するための技術は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｒｇｅｎｔ、「示差的に発現した遺伝子の単離」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：４２３、１９８７、およびＷｕら（編）、「差引きおよび完全な発現ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９−６５頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）を参照のこと）。
種々のクローニングベクターが、ｃＤＮＡライブラリーの構築に適切である。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、λｇｔ１０ベクター（例えば、Ｈｕｙｎｈら、「λｇｔ１０およびλｇｔ１１中のｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング」 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 第Ｉ巻、Ｇｌｏｖｅｒ（編）４９頁（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８５）；Ｗｕ（１９９７）４７−５２頁を参照のこと）のようなバクテリオファージ由来のベクター中に調製され得る。
あるいは、２本鎖ｃＤＮＡ分子は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），ＬａｍｂｄａＧＥＭ−４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）または他の市販されるベクターのようなプラスミドベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られ得る。
クローン化されたｃＤＮＡ分子を増幅するために、ｃＤＮＡライブラリーを、標準の技術を用いて原核生物宿主中に挿入する。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られ得るコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５細胞に導入され得る。
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーは、当該分野で周知の手段によって調製され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）５−１〜５−６頁；Ｗｕ（１９９７）３０７−３２７頁を参照のこと）。ゲノムＤＮＡは、界面活性剤サルコシルを用いて組織を溶解すること、プロテイナーゼＫを用いて溶解物を消化すること、遠心分離によって溶解物から不溶性破片を除去すること、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈澱させること、そして塩化セシウム密度勾配において再懸濁したＤＮＡを精製することによって単離され得る。
ゲノムライブラリーの産生に適切なＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡのランダム剪断（ｒａｎｄｏｍ ｓｈｅａｒｉｎｇ）によってかまたは制限エンドヌクレアーゼを用いたゲノムＤＮＡの部分消化によって得られ得る。ゲノムＤＮＡフラグメントは、従来の技術（例えば、適切な末端を提供するための制限酵素消化の使用、ＤＮＡ分子の所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理の使用および適切なリガーゼを用いた連結）に従って、バクテリオファージまたはコスミドベクターのようなベクター中に挿入され得る。そのような操作についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）５−１〜５−６頁；Ｗｕ（１９９７）３０７−３２７頁を参照のこと）。
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書中に記載されるように、ヒトＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られ得る。ＰＣＲを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法が、例えば、Ｙｕら、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、２１１〜２１５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）により提供される。さらに、関連遺伝子を単離するためのＰＣＲの使用についての技術が、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎ、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、３１７〜３３７頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）により、記載される。
あるいは、ヒトゲノムライブラリーは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）のような商業的供給源およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得られ得る。
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを含むライブラリーは、標準的な方法を使用して、配列番号１に基づく１つ以上のポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、６−１〜６−１１頁を参照のこと）。
以下で記載のように産生される抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体もまた、ｃＤＮＡライブラリー由来のＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ配列を単離するために使用され得る。例えば、この抗体は、λｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得るか、またはこの抗体は、ハイブリッド選択および翻訳に続く免疫スクリーニングのために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、６−１２〜６−１６頁；Ｍａｒｇｏｌｉｓら、「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ λ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｂｅｓ」ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１〜１４頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。
ＴＧＦ−β結合タンパク質ｃＤＮＡまたはＴＧＦ−β結合タンパク質ゲノムフラグメントの配列は、標準的方法を使用して決定され得る。さらに、ＴＧＦ−β結合タンパク質プロモーターまたは調節エレメントを含むゲノムフラグメントの同定は、欠失分析のような十分に確立された技術を使用して達成され得る（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）を参照のこと）。
代替として、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子が、相互のプライミング長オリゴヌクレオチド（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｐｒｉｍｉｎｇ ｌｏｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）および本明細書中に記載されるヌクレオチド配列を使用してＤＮＡ分子を合成することにより得られ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）８−８〜８−９頁を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応を使用する確立された技術は、少なくとも２キロベースの長さのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１、１９９３；Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２６６、１９９３；Ｄｉｌｌｏｎら、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｈｉｔｅ（編）、２６３〜２６８頁、（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３）；Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．４：２９９、１９９５）。
（３，ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の産生）
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子は、上記の手順を使用して、配列番号１、５、９、１１、１３、または１５に基づくヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブを用いて、種々のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得られ得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子改変体もまた、合成的に構築され得る。例えば、配列番号２、６、８、１０、１２、１４、または１６のアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が、考案され得る。すなわち、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸が、アルキルアミノ酸に置換され、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列における芳香族アミノ酸が、芳香族アミノ酸に置換され、ＴＧＦ−β結合タンパク質配列における硫黄含有アミノ酸が、硫黄含有アミノ酸に置換され、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸が、ヒドロキシ含有アミノ酸に置換され、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列における酸性アミノ酸が、酸性アミノ酸に置換され、ＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列における塩基性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に置換され、またはＴＧＦ−β結合タンパク質アミノ酸配列における二塩基性モノカルボキシアミノ酸が、二塩基性モノカルボキシアミノ酸に置換される、配列番号２、６、８、１０、１２、１４または１６の１つ以上のアミノ酸置換を含む改変体が得られ得る。
一般的なアミノ酸の中で、例えば、「保存的アミノ酸置換」が、各々の以下の群：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン内のアミノ酸間の置換により示される。このような置換を作製することにおいて、可能である場合、図１中で概説されるシステイン骨格を維持することは重要である。
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子における保存的アミノ酸変化が、配列番号１において列挙されるヌクレオチドをヌクレオチドに置換することにより、導入され得る。このような「保存的アミノ酸」改変体は、例えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、リンカースキャニング（ｌｉｎｋｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる変異誘発などにより得られ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）８−１０〜８−２２頁；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編）、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９１）を参照のこと）。このような改変体の機能的能力は、標準的方法（例えば、本明細書中に記載されるアッセイ）を用いて決定され得る。あるいは、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドは、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に特異的に結合する能力により同定され得る。
核酸分子の慣習的な、欠失分析は、ＴＧＦ−β結合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸分子の「機能的フラグメント」を得るために、行われ得る。例示のように、配列番号１のヌクレオチド配列を有しているＤＮＡ分子は、一連のネステ化された（ｎｅｓｔｅｄ）欠失を得るために、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで消化され得る。次いで、このフラグメントは、発現ベクターの適切なリーディングフレームに挿入され、そしてこの発現されたポリペプチドは、単離され、そして活性についてまたは抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化に対する１つの代替は、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用して、欠失または停止コドンを導入し、所望のフラグメントの産生を特定することである。あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成され得る。
タンパク質の機能分析のための標準の技術は、例えば、Ｔｒｅｕｔｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０：１１３，１９９３；Ｃｏｎｔｅｎｔら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｎｔｅｌｌ（編）６５−７２頁（Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）；Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ，「Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，第１巻，Ｂｏｙｎｔｏｎら、（編）１６９−１９９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）；Ｃｏｕｍａｉｌｌｅａｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９２７０，１９９５；Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５２９１，１９９５；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１２９５，１９９５；およびＭｅｉｓｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３０：１，１９９６によって記載される。
本発明はまた、保存的なアミノ酸変化を有するＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントを意図する。
ＴＧＦ−β結合タンパク質改変体遺伝子は、上記のような配列番号１、５、９、１１、１３または１５、および２、６、１０、１２、１４または１６のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造に基づいて同定され得る。構造に基づいて改変体遺伝子を同定するための代替的なアプローチは、潜在的な改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子をコードしている核酸分子が、配列番号１，５，９，１１，１３、または１５のヌクレオチド配列、あるいは長さが少なくとも１５または２０ヌクレオチドのそれらの配列の部分を有する核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るか否かを決定することである。例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のように、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質配列を有する核酸分子は、配列番号１由来の配列を有する核酸分子のフラグメントと、例えば、５５〜６０℃で一晩インキュベートされた５×ＳＳＲＥ（１×ＳＳＲＥ＝１８０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）、５×デンハート溶液（１００×デンハート＝２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、２％（ｗ／ｖ）フィコール、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン）および０．５％ＳＤＳ）を含む緩衝液中で結合し得る。高ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション後の洗浄は、０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）中、または０．５×ＳＳＰＥ中で５５〜６０℃にて代表的に行われる。
改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子の特定のヌクレオチド配列に関わらず、この遺伝子は、その機能的活性により、またはその抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合する能力により特徴付けられ得るポリペプチドをコードする。より具体的には、改変体ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子は、少なくとも５０％、および好ましくは６０％、７０％、８０％または９０％を超える、本明細書中に記載されるヒトＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を示すポリペプチドをコードする。
（４．培養細胞におけるＴＧＦ−β結合タンパク質の産生）
ＴＧＦ−β結合タンパク質遺伝子を発現させるために、そのポリペプチドをコードしている核酸分子は、発現ベクター中の転写発現を制御する調節配列に対して作動可能に連結されなければならず、次いで、宿主細胞中へ導入されなければならない。プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列に加えて、発現ベクターは、この発現ベクターを保有する細胞の選択に関して適切な翻訳調節配列およびマーカー遺伝子を含み得る。
真核細胞における外来性タンパク質の産生に対して適切である発現ベクターは、（１）細菌宿主において発現ベクターの増殖および選択を提供する、細胞複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物のＤＮＡエレメント、（２）転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡエレメント（例えば、プロモーター）、および（３）転写終結／ポリアデニル化配列のような転写のプロセシングを制御するＤＮＡエレメントを代表的に含む。
本発明のＴＧＦ−β結合タンパク質は、哺乳細胞動物において好ましくは発現される。哺乳動物宿主細胞の例としては、アフリカミドリザルの腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト胎児腎細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、ベビー（ｂａｂｙ）ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）およびマウス胎仔細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）が挙げられる。
哺乳動物宿主について、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス供給源（例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）由来であり得、この調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子（例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子およびメタロチオネイン遺伝子）から得られ得る。
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を指向するに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターとしては、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３、１９８２）、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ ３１：３５５、１９８２）、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４、１９８１）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７７７、１９８２）、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１、１９８０）、およびマウス乳癌ウイルスプロモーター（一般的に、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１６３−１８１頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）を参照のこと）が挙げられる。
あるいは、原核生物プロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）は、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合に、哺乳動物細胞におけるＴＧＦβ結合タンパク質の遺伝子発現を制御するために用いられ得る（Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９、１９９０；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５、１９９１）。
ＴＧＦβ結合タンパク質の遺伝子はまた、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞において、発現され得る。原核生物宿主において、ＴＧＦβ結合タンパク質のポリペプチドを発現するために用いられ得る適切なプロモーターは、当業者に周知であり、そしてＴ４ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｓｐ６ポリメラーゼおよびＴ７ポリメラーゼ、バクテリオファージλのＰRプロモーターおよびＰLプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐｌａｃＳｐｒプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを認識し得るプロモーターを含む。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７、１９８７、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、第４版（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ １９８７）、およびＡｕｓｂｅｌら（１９９５）によって概説されている。
好ましい原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの適切な株としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ’、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１およびＥＲ１６４７（例えば、Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９１）を参照のこと）が挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓの適切な株としては、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０およびＢ１７０（例えば、Ｈａｒｄｙ、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ」 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照のこと）が挙げられる。
原核生物宿主におけるタンパク質の発現のための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１５頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｗａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１３７頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． １９９５）；およびＧｅｏｒｇｉｏｕ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ」 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１０１頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． １９９６）を参照のこと）。
バキュロウイルス系は、クローニングされたＴＧＦβ結合タンパク質の遺伝子を、昆虫細胞に導入するための効率的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づいており、そしてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス極初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−ｌ）および遅延型（ｄｅｌａｙｅｄ）初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１０プロモーター、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーターのような周知のプロモーターを含む。適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａサナギ卵巣細胞株（例えば、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥおよびＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞由来の細胞株が挙げられる。バキュロウイルス系において組換えタンパク質を産生するための確立された技術は、Ｂａｉｌｅｙら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７巻：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｕｒｒａｙ（編）、１４７−１６８頁（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ． １９９１）、Ｐａｔｅｌら、「Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」 ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、２０５−２４４頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５） １６−３７から１６−５７頁、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）およびＬｕｃｋｎｏｗ「Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１８３−２１８頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供される。
酵母における発現のためのプロモーターとしては、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）など由来のプロモーターが挙げられる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、そして容易に入手可能である。これらのベクターとしては、ＹＩｐを基にしたベクター（例えば、ＹＩｐ５）、ＹＲｐベクター（例えば、ＹＲｐ１７）、ＹＥｐベクター（例えば、ＹＥｐ１３）およびＹＣｐベクター（例えば、ＹＣｐ１９）が挙げられる。当業者は、酵母細胞における発現のための広範な種々の適切なベクターが存在することを理解する。
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、インタクトな植物組織、または単離された植物細胞に導入され得る。植物組織を培養する一般的な方法が、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｃｋら（編）６７−８８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９３）において、Ｍｉｋｉら、「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」により提供される。
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性送達、エレクトロポレーションなどを含む種々の標準的な技術を使用して宿主細胞へ導入され得る。好ましくは、宿主細胞ゲノム内に安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供するために、トランスフェクトされた細胞を選択し、そして増殖する。真核生物細胞にベクターを導入するための技術および優性の選択マーカーを使用してそのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）およびＭｕｒｒａｙ（編）により記載される（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９１）。細菌、酵母、昆虫および植物細胞へ発現ベクターを導入するための方法もまた、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）によって提供される。
哺乳動物細胞系により産生される外来のタンパク質を発現させ、そして回収するための一般的な方法は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）１６３頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）におけるＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」により提供される。細菌系により産生されたタンパク質を回収するための標準的な技術は、例えば、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、５９−９２頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）におけるＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ」により提供される。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）により記載される。
より一般的には、ＴＧＦ−β結合タンパク質は、標準的な技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）によって、単離され得る。ＴＧＦ−β結合タンパク質の単離および精製におけるさらなるバリエーションが、当業者によって考案され得る。例えば、以下に記載されるように得られた抗ＴＧＦβ結合タンパク質抗体を使用して、イムノアフィニティー精製によって多量のタンパク質を単離し得る。
（５．ＴＧＦβ結合タンパク質に対する抗体の産生）
ＴＧＦ−β結合タンパク質に対する抗体が、例えば抗原として発現ベクターの産物を使用して、得られ得る。特に有用な抗−ＴＧＦβ結合タンパク質抗体は、配列番号２、６、１０、１２、１４、または１６のＴＧＦ−β結合タンパク質と「特異的に結合」するが、他のＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、Ｄａｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＳＣＧＦ、またはＧｒｅｍｌｉｎ）とは結合しない。本発明の抗体（そのフラグメントおよび誘導体を含む）は、ポリクローナルであり得るか、または特にモノクローナル抗体であり得る。抗体は、任意の免疫グロブリンクラスに属し得、そして例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ1；ＩｇＧ2；ＩｇＧ3；ＩｇＧ4；ＩｇＥ；ＩｇＭ；またはＩｇＡ抗体であり得る。抗体は、動物（例えば、哺乳動物起源）の抗体であり得、そして例えばマウス、ラット、ヒトまたは他の霊長類の抗体であり得る。所望される場合、その抗体は内部（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｉｎｇ）抗体であり得る。
組換えＴＧＦ−β結合タンパク質に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を使用して調製され得る（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）１−５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）におけるＧｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ」；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、１５頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）におけるＷｉｌｌｉａｍｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を参照のこと）。ポリクローナル抗体は、動物（例えは、ラット、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒツジ）内で代表的に惹起されるが、本発明の抗ＴＧＦβ結合タンパク質抗体はまた、類人猿抗体に由来し得る。ヒヒにおける診断的および治療的に有用な抗体を惹起するための一般的な技術が、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）において、およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０ １９９０において、見出され得る。
この抗体は、少なくとも可変領域ドメインを含むべきである。この可変領域ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり得、一般的に、フレームワーク配列内に包理され、抗原結合を担う少なくとも一つの超可変アミノ酸配列を含む。大まかに言えば、この可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖（ＶH）および／または軽鎖（ＶL）可変ドメインの任意の適切な配列であり得る。従って、例えば、このＶ領域ドメインは、モノマーであり得、そして受容可能な親和性を有し、独立して抗原に結合し得るＶHまたはＶLドメインであり得る。あるいは、このＶ領域ドメインは、ダイマーであり得、そしてＶH−ＶH、ＶH−ＶL、またはＶL−ＶLのダイマーを含み得、ここでＶHおよびＶL鎖は、非共有結合的に会合される（本明細書中以後ＦVとして省略される）。しかし、所望される場合、この鎖は、例えば、直接、２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介してか、またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介してのいずれかで共有結合されて、単鎖ドメインを形成し得る（本明細書中以後ｓｃＦVとして省略される）。
可変性領域ドメインは、任意の天然に存在する可変性ドメインであり得るか、またはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンとは、組換えＤＮＡ操作技術を使用して作製された可変性領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、天然の抗体のアミノ酸配列中の挿入、欠失もしくは変更、または天然の抗体のアミノ酸配列に対する挿入、欠失もしくは変更によって、その天然の抗体の可変性領域から作製されたバージョンが挙げられる。この型の特定の例としては、１つの抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、および必要に応じて、１つ以上のフレームワークアミノ酸、ならびに第２の抗体由来の可変性領域ドメインの残りを含む、操作された可変性領域ドメインが挙げられる。
可変性領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸で、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに共有結合され得る。従って、例えば、ＶHドメインがこの可変性領域ドメインに存在する場合、これは、免疫グロブリンＣH１ドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶLドメインは、ＣKドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。この点において、例えば、この抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、この抗原結合ドメインは、それぞれ、ＣＨ１ドメインおよびＣKドメインに対してＣ末端で共有的に連結する、関連するＶHドメインおよびＶLドメインを含む。このＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ鎖で伸長されて、例えば、Ｆａｂ’フラグメント中に見出されるようなヒンジ領域ドメインを提供し得るか、またはさらなるドメイン（例えば、抗体ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を提供し得る。
抗体フラグメントの別の形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製されて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変性領域を合成する（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６、１９９１；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、１６６頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；およびＷａｒｄら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｔｈら（編）１３７頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照のこと）。
本発明における使用のための抗体は、一般に、モノクローナル（従来の免疫法および細胞融合手順により調製される）であり得、そしてフラグメントの場合においては、任意の適切な標準的化学（例えば、還元もしくは酵素的切断および／または消化技術（例えば、ペプシンを用いる処理による））を使用して、それらから誘導され得る。
より詳細には、モノクローナル抗ＴＧＦβ結合タンパク質抗体は、種々の技術を使用して生成され得る。特定の抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって得られ得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５；およびＣｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１：２．５．１〜２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）［「Ｃｏｌｉｇａｎ」］；Ｐｉｃｋｓｌｅｙら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ」、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、９３頁（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５を参照のこと）。
簡潔には、モノクローナル抗体は、ＴＧＦβ結合タンパク質遺伝子産物を含む組成物を用いてマウスに注射すること、血清サンプルを取り出すことによって抗体生成物の存在を確認すること、脾臓を取り出してＢリンパ球を得ること、このＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成すること、このハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対して抗体を生成する陽性クローンを選択すること、この抗原に対する抗体を生成するこのクローンを培養すること、およびこのハイブリドーマ培養物からこの抗体を単離することによって、得られ得る。
さらに、本発明の抗ＴＧＦβ結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来し得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原性チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生成するように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖位置およびヒト軽鎖位置のエレメントは、内因性重鎖位置および軽鎖位置の標的された破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの株に導入される。このトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成し得、そしてこのマウスを使用して、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４によって記載される。
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。このような単離技術としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１〜２．７．１２頁および２．９．１〜２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１０巻、７９〜１０４頁（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２）を参照のこと）。
特定の用途のために、抗ＴＧＦ−β結合タンパク質抗体のフラグメントを調製することが、所望され得る。このような抗体フラグメントは、例えば、この抗体のタンパク質分解性加水分解により得られ得る。抗体フラグメントは、従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化によって、得られ得る。例示として、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素切断によって生成され得、Ｆ（ａｂ’）2と呼ばれる５Ｓのフラグメントと提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断され得、３．５Ｓの一価Ｆａｂ’フラグメントを提供し得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基についてのブロック基を使用して実施され得る。代替法として、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０、１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９、１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）、ならびにＣｏｌｉｇａｎ、２．８．１〜２．８．１０頁および２．１０〜２．１０．４によって、記載されている。
抗体を切断する他の方法（例えば、重鎖を切断して一価の軽鎖フラグメントおよび重鎖フラグメントを形成すること、フラグメントのさらなる切断、あるいは他の酵素技術、化学技術、または遺伝子技術）もまた、そのフラグメントが、インタクトな抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
あるいは、この抗体は、組換えＤＮＡ技術（抗体可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの、操作および再発現を含む）の使用によって得られた、組換え抗体または操作された抗体であり得る。このようなＤＮＡは、公知であり、そして／またはＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリー（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔｉｂｅｃｈ．１０、８０〜８４（１９９２）を参照のこと）を含む）から容易に入手可能であるか、あるいは所望される場合は、合成され得る。標準的な分子生物学手順および／または化学手順が、このＤＮＡを配列決定および操作するために使用され得、例えば、コドンを導入してシステイン残基を作製しても、所望の他のアミノ酸もしくはドメインを、改変しても、付加しても、欠失させてもよい。
ここから、このＤＮＡを含む１つ以上の複製可能な発現ベクターが、調製され得、そしてこの抗体の生成が生じる適切な細胞株（例えば、非骨髄腫生成細胞株（例えば、マウスＮＳＯ株）または細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）株）を形質転換するために使用され得る。有効な転写および翻訳を得るために、各ベクター中のこのＤＮＡ配列は、その可変ドメインの配列に作動可能に連結された、適切な調節配列（特に、プロモーター配列およびリーダー配列）を含むべきである。この様式で抗体を生成するための好ましい方法は、一般的に周知であり、そして慣用的に使用されている。例えば、基本的分子生物学手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）により記載されている；ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ ７４、５４６３（１９９７））およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されるように実施され得る；部位特異的変異誘発は、Ｋｒａｍｅｒらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１（１９８４））およびＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ ｈａｎｄｂｏｏｋに従って実行され得る。さらに、ＤＮＡの操作による抗体の調製、発現ベクターの作製、および適切な細胞の形質転換（例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ＡおよびＡｄａｉｒ，Ｊ Ｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ編、第１０巻、第１章、１９９２、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）、ならびに国際特許明細書ＷＯ９１／０９９６７に概説されるようなもの）に適切な技術を詳述した、多数の刊行物が存在する。
所望される場合、本発明に従う抗体は、その抗体に結合した、１つ以上エフェクター分子またはレポーター分子を有し得る。そして本発明は、このような改変型タンパク質まで広がる。このエフェクター分子またはレポーター分子は、この抗体に位置する利用可能な任意のアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、または存在する場合は炭化水素官能基を介して、抗体に結合し得るが、ただし、常に、これが、この分子の結合特性および最終的有用性に不利に影響しない場合に限る。特定の官能基としては、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、またはアルデヒド基が挙げられる。この抗体とエフェクター分子および／またはレポーター分子との結合は、このような基およびこのエフェクター分子またはレポーター分子中の適切な官能基を介して達成され得る。この結合は、直接的であっても間接的であっても、間隔を空ける基を介しても架橋基を介してもよい。
エフェクター分子としては、例えば、抗腫瘍性因子、毒素（例えば、細菌起源または植物起源の、酵素的に活性な毒素、およびそのフラグメント（例えば、リシンおよびそのフラグメント））、生物学的に活性なタンパク質（例えば、酵素）、核酸およびそれらのフラグメント（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのフラグメント）、天然に存在するポリマーおよび合成ポリマー（例えば、多糖ポリマーおよびポリアルキレンポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール））ならびにそれらの誘導体、放射性核種（特に、放射性ヨウ化物）、およびキレート金属が、挙げられる。適切なレポーター基としては、キレート金属、蛍光化合物、あるいはＮＭＲ分光法またはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が、挙げられる。
特定の抗腫瘍性因子としては、細胞傷害性因子および細胞分裂抑制因子が挙げられ、例えば、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、またはウラシルマスタード）およびその誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸またはフルオロクエン酸）；抗生物質（例えば、ブレオマイシン（例えば、硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、プリカマイシン、カリカエマイシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｙｃｉｎ）およびその誘導体、またはエスペラマイシンおよびその誘導体）；有糸分裂インヒビター（例えば、エトポシド、ビンクリスチンまたはビンブラスチン、およびそれらの誘導体）；アルカロイド（例えば、エリプチシン）；ポリオール（例えば、タキシシン（ｔａｘｉｃｉｎ）−Ｉまたはタキシシン−ＩＩ）；ホルモン（例えば、アンドロゲン（例えば、ドロモスタノロンまたはテストラクトン）、プロゲスチン（例えば、酢酸メゲストロールまたは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジメチルスチルベストロール二リン酸、ポリエストラジオールリン酸またはエストラムスチンリン酸）または抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン））；アントラキノン（例えば、ミトザントロン）；尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；ヒドラジン（例えば、プロカルバジン）；あるいはイミダゾール（例えば、ダカルバジン）である。
特に有用なエフェクターグループは、カリーチェミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｉｃｉｎ）およびその誘導体である（例えば、南アフリカ特許出願番号第８５／８７９４号、同第８８／８１２７号および同第９０／２８３９号を参照のこと）。
キレート化金属としては、２〜８（両端含む）の配位数を有する二陽性（ｄｉｐｏｓｉｔｉｖｅ）または三陽性（ｔｒｉｐｏｓｉｔｉｖｅ）のキレートが挙げられる。このような金属の特定の例としては、以下が挙げられる：テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）。一般的には、金属は、好ましくは、放射性核種である。特定の放射性核種としては、以下が挙げられる：99mＴｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、67Ｃｕ、195Ａｕ、199Ａｕ、110Ａｇ、203Ｐｂ、206Ｂｉ、207Ｂｉ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、88Ｙ、90Ｙ、160Ｔｂ、153Ｇｄ、および47Ｓｃ。
キレート化金属は、例えば、任意の適切な多座キレート剤（例えば、非環式もしくは環式ポリアミン、ポリエーテル（例えば、クラウンエーテルおよびその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；および炭素環式誘導体）でキレート化された上記の型の金属のうちの１つであり得る。
一般的には、キレート剤の型は、使用における金属に依存する。しかし、本発明に従う結合体におけるキレート剤の１つの特に有用な基は、非環式および環式ポリアミン、特に、ポリアミノカルボン酸、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体、ならびに大環状アミン、例えば、環式トリアザおよびテトラアザ誘導体（例えば、国際特許出願ＷＯ９２／２２５８３に記載されるような）；ならびにポリアミド、特に、デスフェリオキサミンおよびその誘導体である。
従って、例えば、接続点として抗体におけるチオール基を使用することが所望される場合、これは、エフェクターまたはレポーター分子に存在するチオール反応性基との反応を通じて達成され得る。このような基の例としては、ａ−ハロカルボン酸またはエステル（ａ−ｈａｌｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｒ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ヨードアセトアミド）、イミド（例えば、マレイミド）、ビニルスルホンまたはジスルフィドが挙げられる。これらおよび他の適切な架橋手順は、概略的かつより詳細に、国際特許出願ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ９０／０９１１９５およびＷＯ８９／０１４７６に記載される。
（骨密度を増加する分子を選択するためのアッセイ）
上記のように、本発明は、骨密度を増加し得る化合物を選択し、そして／または単離するための方法を提供する。例えば、本発明の１つの局面において、選択された分子が、骨鉱物含量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）選択された分子を、ＴＧＦ−β結合タンパク質および選択された数のＴＧＦ−βファミリーのタンパク質と混合する工程、（ｂ）選択された分子が、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質によるシグナル伝達を刺激するか否か、またはＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのタンパク質への結合を阻害するか否かを決定する工程。特定の実施形態において、この分子は、ＴＧＦ−βの、間葉細胞分化の陽性レギュレーターとして機能する能力を増強する。
本発明の他の局面において、選択された分子が、骨鉱物含量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞に、選択された分子を曝露する工程、および（ｂ）この曝露された細胞からのＴＧＦ−β結合タンパク質の発現（または活性）が減少するか否かを決定し、そこから、この化合物が、骨鉱物含量を増加し得るか否かを決定する工程。１つの実施形態において、細胞は、骨の生検からの自発的に形質転換されたかまたは形質転換されていない正常なヒトの骨、およびラットの頭頂骨の骨芽細胞からなる群より選択される。このような方法は、広範な種々のアッセイ形式において達成され得、このアッセイ形式としては、例えば、以下が挙げられる：対向免疫電気泳動（Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、阻害もしくは競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（前出）もまた参照のこと）。
このようなアッセイの代表的な実施形態は、以下の実施例５および６に提供される。簡潔には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのファミリーメンバーまたはＴＧＦ−β結合タンパク質は、まず、固相に結合され、続いて、候補分子に添加される。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの標識されたファミリーメンバーまたはＴＧＦ−β結合タンパク質は、次いで、このアッセイに添加され、この固相が洗浄され、そして固体支持体上の結合もしくは標識されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーまたはＴＧＦ−β結合タンパク質の量が決定される。本明細書中に記載されるような骨鉱物含量の増加における使用に適切な分子は、統計学的に有意な様式で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー（単数または複数）へのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を減少する分子である。明らかに、本発明内の使用に適切なアッセイは、実施例２および３に記載される実施形態に限定されるべきではない。特に、多数のパラメーターが、例えば、ＴＧＦ−βを固相に結合することによって、または固相の全体的な排除によって、変更され得る。
本発明の他の局面において、選択された分子が、骨鉱物含量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＴＧＦ−βを発現する細胞に選択された分子を曝露する工程、および（ｂ）この曝露された細胞からのＴＧＦ−βの活性が変更されるか否かを決定し、そこから、この化合物が、骨鉱物含量を増加し得るか否かを決定する工程。上記の方法と同様に、広範な種々の方法が利用されて、選択された試験化合物に起因する、ＴＧＦ−β結合タンパク質の発現の変化を評価し得る。
例えば、本発明の１つの局面では、選択された分子が、骨鉱物含量を増加させ得るか否かを決定するための方法が提供されて、この方法は、（ａ）選択された分子を、ＴＧＦ−β結合タンパク質およびＴＧＦ−βファミリーのタンパク質のうちの選択されたメンバーと混合する工程、（ｂ）選択された分子が、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質のシグナル伝達を上方調節するかまたはＴＧＦ−β結合タンパク質がＴＧＦ−βファミリーのタンパク質に結合するのを阻害するかを決定する工程を包含する。特定の実施形態では、この分子は、ＴＧＦ−βが、間葉（ｍｅｃｈｅｍｃｈｙｍａｌ）細胞分化の正の調節因子として機能する能力を増強する。
上記の方法と同様に、広範な種々の方法を利用して、選択された試験化合物に起因するＴＧＦ−βの刺激を評価し得る。１つのこのような代表的方法は、以下の実施例６に提供される（Ｄｕｒｈａｍら，Ｅｎｄｏ．１３６：１３７４−１３８０もまた参照のこと）。
本発明のなお他の局面では、選択された分子が、骨鉱物含量を増加させ得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、選択された分子が、ＴＧＦ−β結合タンパク質の骨またはそのアナログへの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。本明細書中で利用される場合、骨またはそのアナログとは、ヒドロキシアパタイト、または粉末形態の骨、挫滅された骨もしくはインタクトな骨から構成される表面をいうことが理解されるべきである。上記の方法と同様に、広範な種々の方法を利用して、骨マトリックスに対するＴＧＦ−β結合タンパク質局在化の阻害を評価し得る。１つのこのような代表的方法は、以下の実施例７に提供される。
本明細書中に記載した方法は、個々の試験分子の分析を言及し得るが、本発明は、そのように限定されないべきであることに留意すべきである。特に、選択された分子は、化合物の混合物中に含まれ得る。それゆえ、記載した方法は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子を単離する工程をさらに包含し得る。
（候補分子）
広範な種々の分子は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する能力についてアッセイされ得る。以下でより詳細に考察される代表的例としては、有機分子、タンパク質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。本明細書中に記載の候補分子が、本明細書中に記載のアッセイにおいて利用され得ることは以下の考察から明らかであるべきであるが、このような分子もまた、種々の診断設定および治療設定において利用され得ることもまら容易に明らかであるべきである。
（１．有機分子）
多数の有機分子が、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する能力についてアッセイされ得る。
例えば、本発明の１つの実施形態では、有機分子は、化学ライブラリー（ここで、化学物質が個々にアッセイされる）またはコンビナトリアル化学ライブラリー（ここで複数の化合物が一度にアッセイされる）のいずれかから選択され得、次いで逆重畳されて、最も活性な化合物を決定および単離し得る。
る。
このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表例としては、以下によって記載されるコンビナトリアル化学ライブラリーが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら，「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」，ＷＯ ９５／０２５６６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら，「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」，ＷＯ ９５／２４１８６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら，「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ ｌｉｂｒａｒｙ」，ＷＯ ９５／３０６４２；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，「Ｎｅｗ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，ＷＯ ９５／１６９１８；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ら，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」，ＷＯ ９５／１６７１２；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ」，米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら，「Ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，ＷＯ ９５／１６２０９；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら，「Ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，ＷＯ ９３／２０２４２；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ら，「Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｂｒａｒｙ」，ＷＯ ９５／０４２７７；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＤ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ，「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」，米国特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ， Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」，ＷＯ ９６／００１４８；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ，「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：４８８７−９０，１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ら，「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ」，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−４，１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら，「Ｔｈｅ Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ４−Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，Ｂｉｏｏｒｇ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ．６：７０７−１２，１９９６。
（２．タンパク質およびペプチド）
広範な範囲のタンパク質およびペプチドが、同様に、ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合のインヒビターのための候補分子として利用され得る。
（ａ．コンビナトリアルペプチドライブラリー）
ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合の推定インヒビターであるペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製され得るか（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号および同第４，３５９，５３５号、ならびに特許協力条約公報番号ＷＯ９２／１５６７７、ＷＯ９２／１５６７７、ＷＯ９０／０７８６２、ＷＯ９０／０２８０９を参照のこと）、または市販の供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．TMＰｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ）から購入され得るかのいずれかであり得る。
（ｂ．抗体）
ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する抗体は、本明細書中に提供される開示を考慮して容易に調製され得る。本発明の状況内では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ可変領域、または相補決定領域）を含むことが理解される。上記で議論されるように、抗体は、１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上、のＫａにて結合し、そして他のＴＧＦ−β結合タンパク質に結合しないか、または１０６Ｍ−１以下のＫａにて結合する場合に、ＴＧＦ−β結合タンパク質に対して、または特定のＴＧＦ−βファミリメンバーに対して特異的であることが理解される。さらに、本発明の抗体は、ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合をブロックするか、または阻害する。
モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０〜６７２、１９４９）。
簡潔には、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウスまたはラット）から、当業者によって容易に作製され得る。代表的には、ＴＧＦ−β結合タンパク質または１３〜２０アミノ酸のその独特なペプチド（好ましくは、グルタルアルデヒドでの架橋によってキーホールリンペットヘモシアニンに結合体化されている）は、この動物を、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注射、または皮下注射を通じて、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）とともに、免疫するために利用される。数回のブースター免疫の後に、血清のサンプルが回収され、そしてタンパク質またはペプチドに対する反応性について試験される。特に好ましいポリクローナル抗血清は、バックグランドよりも少なくとも３倍のシグナルを、これらのアッセイのうちの１つにて生じる。一旦、この動物の力価が、タンパク質へのその反応性に関してプラトーに達すると、より多量の抗血清が、週ごとの採血によって、または動物を瀉血させることによって、容易に得られ得る。
モノクローナル抗体はまた、従来の技術（米国特許再発行第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号（これらは、本明細書中に参考として援用される；また、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ、およびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８（これらもまた、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）を使用して、容易に生成され得る。
簡潔には、１つの実施形態では、被験動物（例えば、ラットまたはマウス）は、上記のように、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはその部分により免疫される。このタンパク質は、得られる免疫応答を増大させるために、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）と混合され得る。初回免疫後の１週間と３週間との間に、動物が、別のブースター免疫により再免疫され得、そして上記のアッセイを利用してこのタンパク質に対する反応性について試験され得る。一旦、動物が、注射されたタンパク質に対するその反応性においてプラトーに達した場合に、この動物は屠殺され、そして多数のＢ細胞を含む器官（例えば、脾臓およびリンパ節）が、収集される。
免疫された動物から得られる細胞は、ウイルス（例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））（ＧｌａｓｋｙおよびＲｅａｄｉｎｇ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８（４）：３７７〜３８９、１９８９）による感染によって不死化され得る。あるいは、好ましい実施形態において、収集された脾臓および／またはリンパ節の細胞懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」を作製するために、適切な骨髄腫細胞と融合される。適切な骨髄腫細胞株としては、例えば、ＮＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ １８）、およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５８０）が挙げられる。
融合後、細胞を、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ））、およびさらなる成分（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、すなわち、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵｔａｈまたはＪＲＨ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含む培養プレートに配置し得る。さらに、この培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のような融合した脾臓細胞および骨髄腫細胞の増殖を選択的に可能にする試薬を含むべきである。約７日後、得られた融合細胞、すなわちハイブリドーマを、ＴＧＦ−β結合タンパク質（使用した抗原に依存する）に対して反応性であり、そしてＴＧＦ−βファミリーメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合をブロックまたは阻害する抗体の存在を決定するためにスクリーニングし得る。
広範に種々のアッセイを利用して、本発明のタンパク質に対して反応性の抗体の存在を決定し得る（例えば、向流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウェスタンブロット、免疫沈降、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイを含む（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８もまた参照のこと））。いくつかのクローン希釈および再アッセイの後、所望のタンパク質に対して反応性の抗体を精製するハイブリドーマを単離し得る。
他の技術もまた利用して、モノクローナル抗体を構築し得る（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９年１２月を参照のこと；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−５７３２，１９８９年８月もまた参照のこと；Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９、１９９０年１月もまた参照のこと）。これらの参考文献は、組換え技術を通じて抗体の生成を可能にするＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能な市販の系を記載する。簡潔には、ｍＲＮＡは、Ｂ細胞集団から単離され、そしてこれを利用して、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）ベクターおよびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクター中に重鎖および軽鎖の免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリー作製する。これらのベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、または同時発現されて、Ｆａｂフラグメントまたは抗体を形成する（Ｈｕｓｅら（前出）；Ｓａｓｔｒｙら（前出）を参照のこと）。陽性のプラークを、引き続いて、Ｅ．ｃｏｌｉからモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶解性プラスミドに転換し得る。
同様に、抗体の一部またはフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦｖフラグメント）もまた、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むために、従来の酵素消化または組換えＤＮＡ技術を利用して構築し得る。１つの実施形態において、目的のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマに由来する、可変性領域をコードする遺伝子を、可変領域についてのヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。これらのプライマーは、当業者により合成され得るか、または市販の供給元から購入し得る。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、特に、ＶHa、ＶHb、ＶHc、ＶHd、ＣH1、ＶLおよびＣL領域についてのプライマーを含む、マウスおよびヒト可変領域についてのプライマーを販売している。これらのプライマーを利用して、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し得る。次いで、この領域は、それぞれ、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰTMＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰTMＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなベクターに挿入され得る。次いで、これらのベクターは、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳動物がベースの系に導入され得る。これらの技術を利用して、大量の単鎖タンパク質（ＶHおよびＶLのドメインの融合物を含む）を生成し得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８を参照のこと）。さらに、このような技術を利用して、抗体の結合特異性を変化させることなく、「マウス」抗体を「ヒト」抗体に変化させ得る。
一旦適切な抗体が得られると、それらは、当業者に周知の多くの技術（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）により単離または精製され得る。適切な技術としては、ペプチドまたはタンパク質のアフィニティーカラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの精製、あるいはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
（ｃ．変異ＴＧＦ−β結合タンパク質）
本明細書中および以下の実施例（例えば、実施例８および９）に記載されるように、特定のＴＧＦ−βファミリーメンバーの活性をブロックするネイティブなＴＧＦ−β結合タンパク質の能力と競合する、改変バージョンのＴＧＦ−β結合タンパク質は、骨密度の増加を導くはずである。従って、ＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合するが、ＴＧＦ−βファミリーメンバーの機能を阻害しないＴＧＦ−β結合タンパク質の変異体が基準を満たす。変異バージョンは、ＴＧＦ−β結合タンパク質の内因性阻害機能と効率的に競合するに違いない。
（ｄ．タンパク質の産生）
種々の遺伝子（または、それらの部分）が本明細書中に提供されるが、本発明の状況下で、これらの遺伝子の１以上に対する言及が、それらの遺伝子に実質的に類似する遺伝子の誘導体（および、適切な場合、それらの遺伝子またはそれらの誘導体によってコードされるタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む））を包含することが、理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列は、以下の場合に「実質的に類似」するとみなされる：（ａ）そのヌクレオチド配列が、上記の遺伝子のコード領域に由来し、そして例えば、上記で議論された配列または配列の対立遺伝子改変の部分を有するか、あるいは、ＴＧＦ−β結合タンパク質のＴＧＦ−βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子をコードする；（ｂ）そのヌクレオチド配列が、中程度、高度または非常に高度なストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）の下で、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る；あるいは（ｃ）そのＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）において定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮重する。さらに、本明細書中で開示される核酸分子は、それらの配列が、他で本明細書中に示される基準を満たす限り、相補的配列または非相補的配列の両方を含む。本発明の状況下で、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ中、６５℃、あるいはその等価条件）を意味する。
本明細書中に記載される核酸分子によってコードされるタンパク質の構造は、例えば、Ｐ／Ｃ ＧｅｎｅまたはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の疎水性プロット機能を使用して、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２）に記載の方法に従って、一次翻訳産物から予測され得る。
本発明のタンパク質は、酸性塩または塩基性塩の形態、あるいは中性形態で調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得る。さらに、種々の置換、欠失または付加が、アミノ酸配列または核酸配列に対して作製され得、これらの正味の効果は、変異体タンパク質または野生型タンパク質の生物学的活性を、維持すること、あるいはさらに増強または減少することである。さらに、例えば、遺伝コードにおける縮重に起因して、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列において、かなりのバリエーションが存在し得る。
本明細書中に開示されるタンパク質の他の誘導体は、そのタンパク質の他のタンパク質またはポリペプチドとの結合体を含む。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を容易にするために付加され得る、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと。Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８もまた参照のこと）。あるいは、Ｆｌａｇ／ＴＧＦ−β結合タンパク質のような融合タンパク質が、タンパク質の同定、発現および分析において補助するために構築され得る。
本発明のタンパク質は、本明細書中に記載される広範に種々の技術を使用して構築され得る。さらに、変異は、変異体配列（これは、ネイティブ配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位によって隣接される）を含むオリゴヌクレオチドの合成によって特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、この得られた再構築した配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する誘導体をコードする。
あるいは、オリゴヌクレオチド指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順を使用して、必要とされる置換、欠失または挿入に従って改変された特定のコドンを有する、改変された遺伝子が提供され得る。上記に示される改変を作製する例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月、１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって開示される。タンパク質の欠失誘導体または短縮型誘導体（例えば、可溶性細胞外部分）はまた、その所望の欠失に隣接する好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって構築され得る。制限処理に続いて、突出を充填し得、そしてそのＤＮＡを再連結し得る。上記に示される改変を作製する例示的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）によって開示される。
本発明の核酸分子において作製される変異は、好ましくは、そのコード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、この変異は、好ましくは、ハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳に不利に影響するｍＲＮＡの二次構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生じ得る、相補的領域を作製しない。変異部位は、予め決定され得るが、変異の性質は、それ自体が予め決定されるべき必要はない。例えば、所定の部位で、変異体の最適な特徴について選択するために、ランダム変異誘発をその標的コドンで実行し得、そしてその発現された変異体を、示される生物学的活性についてスクリーニングし得る。あるいは、変異は、変異体配列（これは、ネイティブ配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位によって隣接される）を含むオリゴヌクレオチドの合成によって特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、この得られた再構築した配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する誘導体をコードする。
本発明のタンパク質をコードする核酸分子はまた、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６，１９８６）の技術を使用して、強制的ヌクレオチド誤組み込み（ｆｏｒｃｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１，１９９０）によって、またはランダム変異誘発させたオリゴヌクレオチド（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７，１９８９）の使用によって構築され得る。
本発明はまた、上記の遺伝子を発現し得るベクターを含む宿主細胞を培養することによって上記の遺伝子の操作および発現を提供する。このようなベクターおよびベクター構築物は、所望のタンパク質をコードする、合成またはｃＤＮＡ由来であるいずれかの核酸分子を含み、核酸分子は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。適切な調節エレメントは、種々の供給源に由来し得、これは、細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳動物遺伝子、昆虫遺伝子、または植物遺伝子を含む。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして容易に当業者によって達成され得る。調節エレメントの例には：転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、ならびにリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。
上記の任意のタンパク質をコードする核酸分子は、広範な種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞によって容易に発現され得、これらには、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、ウイルス細胞、昆虫細胞、または植物細胞が挙げられる。外来性のＤＮＡを発現するためにこのような細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−１０７１、１９９４；ならびにＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。
本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の様々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例には、ＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で、１つ以上の選択可能な表現型マーカーおよび細菌の複製起点を機能させるプロモーターを含む。代表的なプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８を参照のこと）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロモーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５、１９８３）およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ２０：２３１、１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーには、種々の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドが当該分野で周知であり、これらには、中でも、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７、１９８３、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８、１９８２を参照のこと）、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。
本発明を実行するために適切な酵母および真菌宿主細胞には、中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の様々な種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）が挙げられる。酵母および真菌についての適切な発現ベクターには、中でも、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ番号３７４１９）（酵母について）、ａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９：１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ ８：１２１−１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４−１０８、１９７８）およびこれらの誘導体が挙げられる。
酵母における使用のための好ましいプロモーターには、酵母の解糖遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｉ：４１９−４３４、１９８２）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２０１、１９８３）が挙げられる。真菌ベクターのための有用なプロモーターの例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ解糖遺伝子由来のプロモーター（例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２０９３−２０９９、１９８５））が挙げられる。発現ユニットはまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書、１９８５）である。
細菌ベクターを用いる場合、酵母ベクターは、一般的に、選択マーカーを含み、これは、優性な表現型を示す任意の数の遺伝子のうちの１つであり得、その表現型は、表現型アッセイがそのために存在して、形質転換体が選択されることを可能にするものである。好ましい選択マーカーは、宿主細胞栄養要求性を相補するか、抗生物質耐性を提供するか、または特定の炭素源を細胞に利用可能にするものであり、そしてｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら、同書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ８：１７、１９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）を含む。別の適切な選択マーカーは、ｃａｔ遺伝子であり、これは酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与する。
真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−１６９、１９８３）によって記載されてきた。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって相補される遺伝子の欠損を含み得る。特定の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベル内にある。
酵母の形質転換のためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを有する酵母のスフェロプラストの調製（Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）によるか、またはＬｉＣｌのようなアルカリ塩での処理（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３、１９８３を参照のこと）によるかのいずれかで、容易に達成され得る。真菌の形質転換もまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９、１９８７）によって記載のように、ポリエチレングリコールを用いて実施され得る。
ウイルス性ベクターとしては、上記のような、所望のタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターが含まれる。広範な種々のプロモーターが、本発明の状況において使用され得、これには例えば、以下が挙げられる：ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、フレンドＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ヘルペスＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子のエンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス極初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス極後期プロモーター。本発明の特に好ましい実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ ９１／０２８０５；ＥＰ ０，４１５，７３１；およびＷＯ ９０／０７９３６を参照のこと）である。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられる：神経特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子βプロモーター、骨形成因子プロモーター、ヒトα１−キマエリン（ｃｈｉｍａｅｒｉｎ）プロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンＩＩプロモーター。上述のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上述のプロモーター、およびＨＩＶプロモーターのような他のプロモーターを含む））、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌、または寄生生物（例えば、マラリア）に特異的なプロモーターが、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染した特定の細胞または組織を標的化するために、利用され得る。
本発明を実施するのに適切な哺乳動物細胞としては、特に、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａＯＳ、骨肉腫、ＫＳ４８３、ＭＧ−６３、初代骨芽細胞、およびヒトまたは哺乳動物の骨随間質が挙げられる。本発明を実施する際に使用するための哺乳動物発現ベクターとしては、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、ウイルス性プロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。骨特異的プロモーターとしては、骨シアロタンパク質およびオステオカルシンのプロモーターが挙げられる。ウイルス性プロモーターとしては、以下が挙げられる：サイトメガロウイルス極初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）、サイトメガロウイルス極後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイルス Ｅ１ａ。細胞性プロモーターとしては、以下が挙げられる：マウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）、マウスＶκプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−７０４５、１９８３；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８７）、およびマウスＶHプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３、１９８３）。プロモーターの選択は、少なくとも一部、所望される発現レベルまたはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存する。
このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流、そして目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列から上流に位置付けられたＲＮＡスプライス部位のセットを含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリンの遺伝子から入手され得る。発現ベクターには、目的のコード配列の下流に位置付けられたポリアデニル化シグナルもまた含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとしては、以下が挙げられる：ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同上）、アデノウイルス５ Ｅ１Ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０、１９８１）。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置付けられた、非コード性ウイルス性リーダー配列（例えば、アデノウイルス２三連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー）を含み得る。好ましいベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列を含み得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含み得る。適切な発現ベクターは、商業的供給業者（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手され得る。
クローン化されたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８：ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８７）によって、培養哺乳動物細胞に導入され得る。クローン化ＤＮＡを安定に組込んだ細胞を同定するために、一般的に、選択マーカーを、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入する。培養哺乳動物細胞における使用に好ましい選択マーカーとしては、薬物（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（これを、本明細書中で参考として援用する））によって、概説される。
適切なベクターを含む哺乳動物細胞を、目的のＤＮＡ配列の発現を開始させるために、一定期間（代表的には、１〜２日間）増殖させる。次いで、薬物選択を適用して、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖を選択する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされた細胞に対しては、薬物濃度を段階的な様式で増加させて、増加したコピー数のクローン化配列（それにより、発現レベルを増加させている）を選択し得る。導入された配列を発現する細胞を、所望の形態または所望のレベルでの目的のタンパク質の産生について、選択およびスクリーニングする。次いで、これらの判断基準を満たす細胞を、産生のためにクローン化し得、そしてスケールアップし得る。
哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコルは、当業者に周知である。例示的な方法としては、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクチン、レトロウイルス、アデノウイルス、およびプロトプラスト融合媒介トランスフェクションが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。裸のベクター構築物はまた、哺乳動物（または他の動物）の筋肉への注入後に、筋肉細胞または他の適切な細胞により取込まれる。
当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞はまた、この明細書を考慮に入れれば、本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞において異種ＤＮＡ配列を発現するためのベクターとして、バキュロウイルスの使用が、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４，１９９０）により総説されている。
当該分野で公知の多数の植物宿主細胞はまた、この明細書を考慮に入れれば、本発明において有用であり得る。例えば、植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用が、Ｓｉｎｋａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７）により総説されている。
本発明の関連する局面において、本発明のタンパク質は、トランスジェニック動物（この動物の生殖細胞および体細胞は、所望のタンパク質をコードし、かつ遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結される遺伝子を含む）において発現される。あるいは、類似の様式において、トランスジェニック動物は、所望の遺伝子を欠損するように調製され得る（例えば、ノックアウトマウス）。このようなトランスジェニック体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタを含む、種々の非ヒト動物において調製され得る（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３，１９８５、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：８０９−９１４，１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，１９８５、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ、Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５，１９８５、および米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５，３８４号を参照のこと）。簡単には、発現ベクター（適切に位置付けられた発現制御配列と共に発現される核酸を含む）は、受精した卵の前核中に（例えば、マイクロインジェクションにより）導入される。注入されたＤＮＡの組み込みは、組織サンプル由来のＤＮＡのブロット分析により検出される。導入されたＤＮＡが、動物の生殖系列中に組み込まれ、その結果動物の子孫に継代されることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用を介してか、または導入遺伝子の制御された発現を可能にする、誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、同書））の使用を介して達成され得る。
タンパク質は、他にも方法はあるが、本発明の組換え翻訳産物を産生する適切な宿主系およびベクター系を培養する工程により単離され得る。このような細胞株由来の上清、またはタンパク質が、上清に分泌されないタンパク質封入体もしくは細胞全体は、次いで、所望のタンパク質を単離するために種々の精製手順により処理され得る。例えば、上清は、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎユニット）を用いて濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物は、例えば、適切な支持体に結合した抗タンパク質抗体のような適切な精製マトリクスにアプライされ得る。あるいは、アニオン交換樹脂、またはカチオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために用いられ得る。さらなる代替法として、１つ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、タンパク質をさらに精製するために用いられ得る。本発明のタンパク質を単離する他の方法は、当業者に周知である。
他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後のクーマシーブルー染色により検出されない場合、タンパク質は、本発明の状況において「精製されて」いるとみなされる。他の実施形態において、所望のタンパク質は、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後の銀染色により検出されないように単離される。
（３．核酸分子）
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対する、ＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害し得る、核酸分子が提供される。例えば、１つの実施形態において、ＴＧＦ−β結合タンパク質の核酸配列の発現を特異的に阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子が提供される（一般に、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ：Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ編、１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１０１２，１９９３；ＷＯ ９５／１０６０７；米国特許第５，３５９，０５１号；ＷＯ ９２／０６６９３；およびＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと）。簡単には、このような分子は、それらが、転写されるＴＧＦ−β結合タンパク質のｍＲＮＡ配列の領域に相補的であり、かつこの領域とワトソン−クリック塩基対を形成し得るように、構築され得る。得られた二重鎖核酸は、ｍＲＮＡの引き続くプロセシングを妨害し、それによりタンパク質合成を防ぐ（実施例１０を参照のこと）。
本発明の他の局面において、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対する、ＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害し得る、リボザイムが提供される。本明細書中で用いられる場合、「リボザイム」は、特定の認識のためのアンチセンス配列、およびＲＮＡ切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことが意図される。触媒鎖は、化学量論的な濃度よりも多く、標的ＲＮＡ中の特定の部位を切断する。広範な種々のリボザイムは、本発明の状況において利用され得、これらのリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２２０，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６−６００，１９８８；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：１９６，１９８８；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５，１９８８によって記載される）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，２５４，６７８号（１９９３年１０月１９日発行）およびＨｅｍｐｅｌら、欧州特許公開第０ ３６０ ２５７号（１９９０年３月２６日公開）によって記載される）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボゾームＲＮＡベースのリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）が挙げられる。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡから構成されるが、これはまた、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）から構成され得る。
（４．標識）
上記および以下に記載の遺伝子産物または任意の候補分子は、種々の化合物（例えば、蛍光分子、毒素および放射性核種）で標識され得る。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセイン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質（例えば、フィコエリトリン）、ローダミン、Ｔｅｘａｓレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的例としてはリシン、アブリンジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａが挙げられる。放射性核種の代表的な例としてはＣｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、ｌｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、ＡＵ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに、上記の抗体はまた、標識され得るか、またはリガンド結合対の１つのパートナーに結合体化され得る。代表的な例としてはアビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
上記の代表的標識を用いて、本明細書において記載された分子を結合体化または標識化する方法は、当業者により容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第４，７４４，９８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許第４，８９７，２５５号；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；Ｉｎｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３０頁、１９７４も参照のこと；またＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１〜３２、１９８８も参照のこと）。
（薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、種々の薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する上記の分子の１つを含む。一般に、このようなキャリアは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して毒性であってはならない。普通は、このような組成物の調製物は、以下との治療剤の組み合わせを必要とする：緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロースまたはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンならびに他の安定化剤および賦形剤。中性の緩衝液化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、代表的な適切な希釈剤である。
さらに、本発明の薬学的組成物は、種々の希釈経路による投与のために調製され得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に関する説明書を提供する包装材料とともに容器内に配置され得る。一般に、このような説明書は、試薬濃度を記載する明白な表現を含み、そして特定の形態内に、薬学的組成物の再構成に必要であり得る、関連する量の賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＢＳ）を含む。
（処理の方法）
本発明はまた、骨の鉱物含量および鉱物密度を増加させるための方法を提供する。手短には、多くの状態が骨鉱物含量の損失を生じる。この状態としては、例えば、疾患、遺伝素因、骨の使用の不足をまねく（例えば、骨折による）事故、骨再吸収に影響するか、または骨形成細胞を殺傷する治療、および正常な加齢が挙げられる。ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質結合の結合を阻害する、本明細書で記載の分子の使用を通じて、このような条件は処置または予防され得る。本明細書において利用されるように、骨鉱物含量が、選択された部位で、統計的に有意な様式で（例えば、１／２標準偏差より大きく）増加された場合、骨鉱物含量が増加されたことが理解されるべきである。
骨鉱物含量の損失を生じる広範な種々の状態が、本明細書で記載の分子で処置され得る。このような状態を有する患者は、周知の技術を利用して臨床的診断を通じて同定され得る（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃを参照のこと）。処置され得る疾患の代表的な例としては、異形成（これには骨の異常な成長または発達が存在する）が挙げられる。このような状態の代表的な例としては、軟骨無形成症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性形成異常、ゴーシェ病、低リン酸くる病（ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ ｒｉｃｋｅｔｓ）、マルファン病、多発性遺伝性エクソトース（ｅｘｏｔｏｓｅｓ）、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、オステオポイキリー、硬化性病変（ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ）、骨折、歯周疾患、偽関節および化膿性骨髄炎が挙げられる。
処置または予防され得る他の状態としては、広範な種々の原因のオステオペニア（すなわち、若年期のピークの骨格鉱物含量より骨鉱物含量または骨鉱物密度の１標準偏差より大きく下回る状態）が挙げられる。このような状態の代表的な例としては、貧血状態、ステロイドにより生じる状態、ヘパリンにより生じる状態、骨髄障害、壊血病、栄養失調、カルシウム欠乏、特発性骨粗しょう症、先天性オステオペニアまたは骨粗しょう症、アルコール症、慢性肝疾患、老化、閉経後状態、希発月経、無月経、妊娠、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、クッシング病、先端巨大症、性機能低下症、不動化または非活動性、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、一過性局所性骨粗しょう症および骨軟化症。
本発明の１つの局面において、骨鉱物含量または骨鉱物密度は、ＴＧＦ−βファミリーメンバーへのＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子の治療上有効量の、温血動物への投与により増加され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスを含む）の両方が挙げられる。治療用分子の代表的な例としては、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体（例えば、ヒト化抗体）が挙げられる。
本発明の他の局面において、骨密度を増加するための方法が提供され、この方法は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子の発現に関するベクターを骨に帰する細胞内に導入する工程、およびベクター含有細胞を温血動物に投与する工程、を包含する。簡略すると、骨に帰する細胞は、患者の骨（例えば、ＣＤ３４＋、骨芽細胞、骨細胞などのような骨髄から得られる細胞）、末梢血液または培養物から直接得られ得る。
ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子の発現に関するベクターは、細胞内に導入される。適切なベクターの代表的な例としては、以下のようなウイルスベクターが挙げられる：ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ ９３／９１９１；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（６）：２８３８−４８、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７、１９９３；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５（２）：２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９、１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０：１２８７−１２９１、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８、１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ １０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ関連ウイルスベクター（ＷＯ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウィルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ ７９：４９２７−４９３１、１９８２；およびＯｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０、１９９３）、ならびにレトロウイルス（例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８５、ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８）。異なるウイルスまたは非ウイルス供給源由来の異なる要素（例えば、プロモーター、エンベロープ配列など）の混合物を含むウイルスベクターも同様に構築され得る。種々の実施形態において、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかは、以下に記載される方法および組成物に利用され得る。
本発明の他の実施形態において、ＴＧＦ−βファミリー自体のメンバーに対するＴＧＦ−β結合タンパク質の結合を阻害する分子をコードする核酸分子は、以下に挙げられる種々の技術によって投与され得る：例えば、ポリ−Ｌ−リシンＤＮＡ複合体で結合されたアシアロオソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら、ＰＮＡＳ ９２１２２−９２１２６、１９９３）、殺傷されたアデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、１９９２）、サイトフェクチン−媒介導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、直接ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８、１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７、１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｃｉｒｃ．８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ ８４：７８５１−７８５５、１９８７）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０、１９９１）；および単独で（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３）またはＰＥＧ−核酸複合体を利用して、タンパク質自体をコードする核酸の直接送達。
本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例として、リボザイムおよびアンチセンス分子が挙げられ、これらの各々は上記でより詳細に議論される。
増加した骨鉱物含量の決定は、Ｘ線（例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定（Ｘ−ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｏｍｅｔｒｙ）すなわち「ＤＥＸＡ」）の使用によって直接的に、あるいは骨ターンオーバーマーカー（骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、１型プロコラーゲンＣ’プロペプチド（ＰＩＣＰ）、および全アルカリホスファターゼ；Ｃｏｍｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｒｈｅｕ．７：２４３，１９９５）を通した推論、または骨再吸収のマーカー（ピリジノリン、デオキシピリジノリン、Ｎ−テロペプチド、尿ヒドロキシプロリン、血漿酒石酸塩耐性酸ホスファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリシン；Ｃｏｍｉｅｒ，前出を参照のこと）を通した推論によって、決定され得る。骨質量の量はまた、体重から、または他の方法を利用して計算され得る（Ｇｕｉｎｎｅｓｓ−Ｈｅｙ，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ Ｄｉｓ．ａｎｄ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．５：１７７−１８１，１９８４を参照のこと）。
当業者にとって明らかなように、投与の量および頻度は、当然のことながら、処置される指標の性質および重篤度、所望される応答、患者の状態などの因子に依存する。典型的には、組成物は上記のように種々の技術によって投与され得る。
以下の実施例は、例示の目的で提供されるが、限定の目的ではない。
（実施例１）
（ヒト第１７染色体のロングアームに対する硬化狭窄症マップ）
ヒトの硬化狭窄症に対して重大な欠失の遺伝マッピングは、新規なＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリーメンバーをコードするヒト第１７染色体の領域に、この障害に対して重大な遺伝子を局在化した。硬化狭窄症において、骨格骨は、非羅患の個体の鉱物密度に対して鉱物密度の実質的増加を示す。頭部の骨は同様に過成長を示す。硬化狭窄症患者は、一般に健康であるが、それらは生まれつき合指の可変度および頭蓋骨の頭蓋圧縮および神経圧縮の可変度を示し得る。
硬化狭窄症と関連した遺伝子欠失の連結分析は、疾患が生じる２４の南アフリカＡｆｒｉｋａａｎｅｒ ファミリーから収集されたＤＮＡサンプルに同型接合性マッピング法を適用することによって行われた。（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：１３３１−１３３５．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ３ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｍａｐｐｉｎｎｇ」）。南アフリカのＡｆｒｉｋａａｎｅｒ集団は、遺伝的に同種である；この集団は数世紀前にその領域に植民した少数の先祖の子孫であり、そしてそれはその創始以来、地理的および社会的障害によって孤立されてきた。硬化狭窄症は、Ａｆｒｉｋａａｎｅｒ群集の外側のどの世界においても稀であり、このことは遺伝子の変異がこの先祖集団に存在し、この集団の増加と共に数が増加したことを示唆する。同型接合性マッピングの使用は、劣性変異に隣接したＤＮＡマッピングマーカーが血族ファミリーおよび孤立された集団由来の影響された個体において同型接合性であり得るという仮説に基づく。
常染色体由来の３７１マイクロサテライトマーカーのセット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｓｅｔ ６）を、硬化狭窄症の患者サンプル由来のＤＮＡのプールを分類するために選択した。この分析のためのＤＮＡサンプルは、２４ファミリー中の２９名の硬化狭窄症患者、５９の羅患していないファミリーメンバー、および同一の集団由来の無関係のコントロール個体のセットに由来する。プールは、４〜６個の個体（羅患した個体、血縁家族、親および羅患していない兄弟由来の羅患した個体、または無関係のコントロールのいずれか）から構成される。無関係の個体のプール、および羅患した個体またはファミリーメンバーを含むプールのほとんどにおいて、マーカーの分析は、いくつかの対立遺伝子は各マーカーの大きさに合わせて分けられることを示した。１つのマーカー、Ｄ１７Ｓ１２９９は、ホモ接合性の指標、すなわち羅患した個体のいくつかのプールにおける１つのバンドを示した。
２４個全ての硬化狭窄症ファミリーを、Ｄ１７Ｓ１２９９の領域（１７ｑ１２−ｑ２１）において全部で１９のマーカーで分類した。全てのファミリー由来の羅患個体は、この領域においてホモ接合性であり、そして２９個の個体のうち２５個体はコアハプロタイプについてホモ接合性であり；それらは、各々、Ｄ１７Ｓ１７８７とＤ１７Ｓ９３０との間に同一の対立遺伝子を有することを示した。他の４個体は、このハプロタイプに適合した１つの染色体、およびこのハプロタイプに適合していない第２の染色体を有した。つまり、このデータは、この３メガベース領域は硬化狭窄変異を含むことを示唆した。この３メガベース領域におけるほとんどのエキソンの配列分析は、新規のＴＧＦ−データ結合タンパク質コード配列におけるナンセンス変異を同定した（配列番号１の位置１１７におけるＣ＞Ｔ変異は、終止コドンを生じる）。この変異は、硬化狭窄症患者およびアフリカーナーのキャリアに独特であることが示された。この遺伝子の同一性は、そのイントロンにおける変異（そのイントロンの位置＋３におけるＡ＞Ｔ変異）を同定することによってさらに確認され、この変異は、硬化狭窄症と診断された一人の無関係の患者において、不適切なｍＲＮＡプロセシングを生じた。
（実施例２）
（ＴＧＦβ結合タンパク質遺伝子発現の組織特異性）
（Ａ．ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＢｅｅｒ遺伝子の発現）
第１鎖ｃＤＮＡを、市販のキット（「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、以下の全ＲＮＡサンプルから調製した：ヒト脳、ヒト肝臓、ヒト脾臓、ヒト胸腺、ヒト胎盤、ヒト骨格筋、ヒト甲状腺、ヒト下垂体、ヒト骨芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ製のＮＨＯｓｔ）、ヒト骨肉腫細胞株（Ｓａｏｓ−２，ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８５）、ヒト骨、ヒト骨髄、ヒト軟骨、ベルベットモンキー骨、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびヒト末梢血単核細胞。全てのＲＮＡサンプルは、社内で調製した以下のものを除いて、市販の供給源（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した：ヒト骨芽細胞、ヒト骨肉腫細胞株、ヒト骨、ヒト軟骨およびベルベットモンキー骨。これらの社内ＲＮＡサンプルは、市販のキット（「ＴＲＩ試薬」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して調製した。
これらのサンプル、およびさらにコントロールとしてヒトゲノムサンプルを用いて、ＰＣＲを行った。センスＢｅｅｒオリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）を有した。アンチセンスＢｅｅｒオリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）を有した。さらに、ヒトβ−アクチン遺伝子についてのプライマーをコントロールとして使用して、ＰＣＲを行った。センスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２１）を有した。アンチセンスβ−アクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号２２）を有した。２５μｌ反応物において、６１℃のアニーリング温度の標準的な条件を使用して、ＰＣＲを行った。Ｂｅｅｒプライマーを用いて３２サイクルのＰＣＲを行い、そしてβ−アクチンプライマーを用いて２４サイクルを行った。
増幅した後、各反応物の１２μｌを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって、分析した。図２Ａを参照のこと。
（Ｂ．マウス胚切片のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション）
全長マウスＢｅｅｒ ｃＤＮＡ（配列番号１１）を、製造業者のプロトコルを使用して、アンチセンスおよびセンス方向で、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。35Ｓ−α−ＧＴＰ−標識ｃＲＮＡセンスおよびアンチセンス転写物を、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）により供給されるインビトロ転写試薬を使用して合成した。Ｌｙｏｎｓら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：２４２７〜２４３６，１９９０）のプロトコルに従って、インサイチュハイブリダイザーションを行った。
マウスＢｅｅｒ ｃＲＮＡプローブは、発生中のマウス胚の神経管、肢芽、血管および骨化軟骨において発現した特異的なメッセージを検出した。図３のパネルＡは、肢芽（ｌ）、血管（ｂｖ）および神経管（ｎｔ）の外胚葉隆線（ａｅｒ）における発現を示す。パネルＢは、下顎骨（ｍａ）、頸椎（ｃｖ）、後頭骨（ｏｃ）、口蓋（ｐａ）および血管（ｂｖ）における発現を示す。パネルＤは、肋骨（ｒ）および心臓弁（ｖａ）における発現を示す。パネルＡは、１０．５ｄｐｃの胚の横断面である。パネルＢは、１２．５ｄｐｃの胚の矢状切片であり、そしてパネルＣおよびＤは、１５．５ｄｐｃの胚の矢状切片である。
ｂａ＝鰓弓、ｈ＝心臓、ｔｅ＝終脳（前脳）、ｂ＝脳、ｆ＝前頭鼻骨塊、ｇ＝腸、ｈ＝心臓、ｊ＝顎、ｌｉ＝肝臓、ｌｕ＝肺、ｏｔ＝耳胞、ａｏ＝、ｓｃ＝脊髄、ｓｋｍ＝骨格筋、ｎｓ＝鼻洞、ｔｈ＝胸腺、ｔｏ＝舌、ｆｌ＝前肢、ｄｉ＝横隔膜。
（実施例３）
（組換えＢＥＥＲタンパク質の発現および精製）
（Ａ．ＣＯＳ−１細胞中での発現：）
全長ヒトＢｅｅｒタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、以下のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
Figure 0005691036
 を有し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ボールド）を含み、推定アミノ末端開始コドン（ＡＴＧ）の前の６塩基対で開始する１９ヌクレオチドのＢｅｅｒ遺伝子が続く。３’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
Figure 0005691036
 を有し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ボールド）を含み、逆相補性停止コドン（ＣＴＡ）が続き、Ｂｅｅｒのカルボキシ末端５アミノ酸をコードするヌクレオチドの逆相補性によって隣接されるＦＬＡＧエピトープの逆相補性（下線、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が続く。ＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングし（「Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」、Ｉｎｖｉｔｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、個々のクローンをＤＮＡ配列決定によってスクリーニングした。次いで、配列確定クローンを、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、市販の試薬（「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して１．５％アガロースゲルで精製した。次いで、このフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを有する、ＨｉｎｄＩＩＩ消化され、ホスファターゼ処理されたｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）プラスミドに連結した。ＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉを、形質転換し、ＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上にプレートした。適切な配向の所望の組換え体を有するコロニーを、ｐｃＤＮＡ３．１のＴ７プロモーター／プライミング部位に対応する５’プライマーおよび内部ＢＥＥＲ配列の逆相補体に対応する配列５’−ＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２５）を有する３'プライマーを使用するＰＣＲベースのスクリーニングによって同定した。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５０）をトランスフェクションのために使用した。５０μｇの発現プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｂｅｅｒ−Ｆｌａｇを、製造業者によって提供されるプロトコールに従って市販のキット（「ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションに続く最終培地は、０．１％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であった。培養の４日後、培地を除去した。組換えＢＥＥＲの発現は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。組換えＢＥＥＲタンパク質の精製を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーカラム（「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して実施した。カラムプロフィールを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。
Ｂ．ＳＦ９昆虫細胞での発現： ヒトＢｅｅｒ遺伝子配列を、標準的な条件下で以下のプライマーを使用してＰＣＲを用いて増幅した：
Figure 0005691036
 得られたｃＤＮＡは、２つの改変を有するＢｅｅｒのコード領域を含んだ。Ｎ末端分泌シグナルを除去し、そしてＦＬＡＧエピトープタグ（Ｓｉｇｍａ）を挿入物のＣ末端へインフレームで融合した。ＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を付加し、この遺伝子を、標準的な方法を使用して、バキュロウイルス発現ベクターに移すためにｐＭｅｌＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｎｇｅｎ）にサブクローニングした。
組換えバキュロウイルス発現Ｂｅｅｒタンパク質を、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行い、製造業者に指示に従って精製した。
ＳＦ９細胞（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を、１０％ウシ胎仔血清を含むＴＮＦ ＦＨ培地（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で維持した。タンパク質発現について、スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）フラスコ中のＳＦ９培養物を、１０より大きいＭＯＩで感染させた。培地および細胞のサンプルを、５日間毎日取り、そしてＢｅｅｒ発現を抗ＦｌＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗Ｂｅｅｒウサギポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロットによってモニターした。
五日後、バキュロウイルス感染ＳＦ９細胞を遠心分離によって収穫し、そして細胞関連タンパク質を高塩（ｈｉｇｈｔ ｓａｌｔ）抽出緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５）を使用して細胞ペレットから抽出した。抽出物（３００ｍｌ培養物当たり２０ｍｌ）を、遠心分離によって清澄化し、４ｌのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５）に対して３回透析し、再び遠心分離によって清澄化した。この高塩画分を、Ｈｉｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；５ｍｌベッド体積に適用し、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で広範に洗浄し、結合したタンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〜１２００ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出した。Ｂｅｅｒ溶出は、約８００ｍＭ ＮａＣｌで観察された。Ｂｅｅｒ含有画分を、１０％グリセロールおよび１ ｍＭ ＤＴＴに追加し、−８０℃で凍結させた。
（実施例４）
（ＢＥＥＲ、ＧＲＥＭＬＩＮおよびＤＡＮに対するポリクローナル抗体の調製および試験）
（Ａ．抗原の調製：）
ヒトＢｅｅｒ、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ、およびヒトＤａｎのＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる標準的なＰＣＲ方法を使用して増幅した：
Figure 0005691036
 各場合において、列挙したプライマーは、コード領域の分泌シグナル配列を除いた全体を増幅した。これらは、ＢｅｅｒおよびＧｒｅｍｌｉｎについてはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの部位に、そしてＤａｎについてはＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの部位に、細菌発現ベクターｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）へのサブクローニングのための制限部位を含む。ｐＱＥ３０は、６ｘＨｉｓタグのコード配列を、このクローニング領域の５’末端に含む。完成した構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｍ−１５／ｐＲｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ）に形質転換し、そして個々のクローンを配列決定により検証した。Ｍ−１５／ｐＲｅｐにおけるタンパク質発現および精製（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合されたＮｉ−ＮＴＡに結合する６ｘＨｉｓアフィニティータグ）を、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ）により記載されるように実施した。
Ｅ．ｃｏｌｉ誘導Ｂｅｅｒタンパク質を、６Ｍグアニジンへの可溶化を使用して有意な量で回収し、そして２〜４Ｍに透析して、貯蔵中の沈殿を防止した。ＧｒｅｍｌｉｎおよびＤａｎタンパク質を、６Ｍグアニジンへの可溶化によってより高い量で回収し、そして精製後、グアニジン濃度を０．５Ｍにした。
（Ｂ．ポリクローナル抗体の産生および試験：）
これら３つの抗原の各々に対するポリクローナル抗体を、ウサギおよびニワトリの宿主において、標準的なプロトコル（Ｒ＆Ｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｔａｎｗｏｏｄ、ＷＡ；ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｒａｂｂｉｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｒａ ｒｅｃｏｖｅｒｙ；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｉｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２版．１９９２．１１．３７〜１１．４１．Ｈｅｌｅｎ Ｍ．ＣｏｏｐｅｒおよびＹｖｏｎｎｅ Ｐａｔｅｒｓｏｎ寄稿；ニワトリ抗血清は、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｒａｎｏｍａ、ＣＡを用いて生成した）を使用して産生した。
ウサギ抗血清および鶏卵Ｉｇｙ画分を、ウェスタンブロットによって活性に関してスクリーニングした。これら３つの抗原の各々をＰＡＧＥにより分離し、そして０．４５μｍのニトロセルロース（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に移した。この膜を各小片が約７５ｎｇの抗原を含むように小片に切断した。これらの小片を３％Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）中でブロックし、そして１×Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）／０．０２％ＴＷＥＥＮ緩衝液中で３回洗浄した。一次抗体（ブロッキング緩衝液中１：１００〜１：１０，０００の範囲の希釈物中の予備免疫出血、ウサギ抗血清または鶏卵ＩｇＹ）を、その小片と共に、穏やかに振動させながら１時間インキュベートした。１×ＴＢＳ／０．０２％ＴＷＥＥＮでの３回の洗浄のうちの第２回目に続いて、二次抗体（ペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ウサギ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；またはペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ニワトリ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と１時間インキュベートした。１×ＴＢＳ／０．０２％ＴＷＥＥＮでの３回の洗浄のうちの最終サイクルを実施し、そして小片をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて現像した。
（Ｃ．抗体交叉反応性試験：）
上記節に記載のプロトコルに続いて、Ｂｅｅｒ、ＧｒｅｍｌｉｎまたはＤａｎのニトロセルロース小片を、それらのそれぞれのウサギ抗血清または鶏卵ＩｇＹの希釈物（１：５０００および１：１０，０００）ならびに残り２つの抗原に対して作製した抗血清または鶏卵Ｉｇｙ（１：１０００および１：５０００の希釈物）と共にインキュベートした。増加した濃度においてのみ見られ得る、対応しない抗体による低親和性の結合を検出するために、それらの対応しない抗体のレベルを増加して行った。現像のプロトコルおよび持続時間は、上に記載したプロトコルを使用する３つ全ての結合事象に対して同一である。試験したいずれの抗原についても、抗原交叉反応性は観察されなかった。
（実施例５）
（ＢｅｅｒとＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質との相互作用）
Ｂｅｅｒの、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なる系統発生的アーム由来のタンパク質との相互作用を、免疫沈降法を使用して研究した。精製したＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＧＤＮＦを、販売源（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。代表的なプロトコルは、以下の通りである。部分的に精製したＢｅｅｒを、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に透析した。免疫沈降を、３００μｌのＩＰ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．５％ ｔｒｉｔｏｎＸ１００、および１０％グリセロール）中で行った。３０ｎｇの組換えヒトＢＭＰ−５タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５００ｎｇのＦＬＡＧエピトープタグ化Ｂｅｅｒの存在下および非存在下で、１５μｌのＦＬＡＧアフィニティーマトリックス（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）にアプライした。これらのタンパク質を４℃で４時間インキュベートし、次いでアフィニティーマトリックス会合タンパク質をＩＰ緩衝液（１回の洗浄あたり１ｍｌ）中で５回で洗浄した。結合したタンパク質を、６０μｌの１×ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液中でアフィニティーマトリックスから溶出した。これらのタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、そしてＢｅｅｒ会合ＢＭＰ−５を、抗ＢＭＰ−５抗血清（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ）を使用してウェスタンブロットにより検出した（図５を参照のこと）。
（Ｂｅｅｒリガンド結合アッセイ：）
ＦＬＡＧ−Ｂｅｅｒタンパク質（２０ｎｇ）を１００μｌ ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡに添加し、そして予め抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）でコーティングした９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させ、そしてＰＢＳ中１０％ＢＳＡでブロックする。これを、室温で６０分間行う。このタンパク質溶液を除去し、そしてウェルを洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。ＢＭＰ−５を、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中１０ｐＭ〜５００ｎＭの範囲の濃度で各ウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートする。この結合溶液を除去し、そしてプレートを２００μｌ容量のＰＢＳ／０．２％ＢＳＡで３回洗浄する。次いで、ＢＭＰ−５抗血清を使用してＥＬＩＳＡ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第２巻、１１．２．１〜１１．２．２２）によりＢＭＰ−５レベルを検出する。特異的な結合を、全結合から非特異的結合を減算することにより算出し、そしてＬＩＧＡＮＤプログラムにより分析する（ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｄｂａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、２２０〜２３９頁、（１９８０））。
この方法の改変において、Ｂｅｅｒを操作してヒトＦｃ融合タンパク質として発現させる。同様に、リガンドＢＭＰを操作してマウスＦｃ融合物として発現させる。これらのタンパク質を一緒にインキュベートし、そしてアッセイを、Ｍｅｌｌｏｒらにより記載されたように、均一な時間分解蛍光検出（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（Ｇ．Ｗ．Ｍｅｌｌｏｒら、Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、３（２）９１〜９９、１９９８）を使用して、行う。
（実施例６）
（ＴＧＦ−βファミリーメンバーに対するＴＧＦ−β結合−タンパク質結合の阻害についてのスクリーニングアッセイ）
上記のアッセイは、２つの例外を伴い繰り返す。第１に、ＢＭＰの濃度を、以前に決定したＫｄに固定したままにする。第２に、アンタゴニスト候補の収集物を、一定の濃度で添加する（低有機分子収集物の場合２０μＭ、および抗体の研究の場合１μＭ）。ＴＧＦ−β結合−タンパク質結合のこれらの候補分子（アンタゴニスト）は、多様な化学構造を示す市販の収集物または内部の収集物由来の有機化合物を含む。これらの化合物を、ＤＭＳＯ中のストック溶液として調製し、そして標準アッセイ条件下の最終体積の１％以下で、アッセイウェルに添加する。これらを、ＢＭＰおよびＢｅｅｒと共に室温で２時間インキュベートし、この溶液を取り除き、そして結合したＢＭＰを記載のように定量化する。化合物または抗体の非存在下、観察されるＢＭＰ結合の４０％を阻害する薬剤を、この相互作用のアンタゴニストとみなす。これらを、さらに、それらの阻害定数およびＴＧＦ−β結合−タンパク質結合親和性に対するそれらの影響を決定するための滴定研究に基づいて、潜在的なインヒビターとして評価する。比較可能な特異性コントロールアッセイをまた、ＢＭＰリガンド作用に依存するアッセイを使用する研究を通じて、同定したアンタゴニストについての選択性プロフィールを確立するために実施し得る（例えば、ＢＭＰ／ＢＭＰレセプター競争研究）。
（実施例７）
（骨基質へのＴＧＦ−β結合−タンパク質局在化の阻害）
骨基質へ（ヒドロキシアパタイト）の局在化の阻害の評価は、Ｎｉｃｏｌａｓの方法（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｖ．Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ５７：２０６，１９９５）の改良を使用して実施される。簡単に、125Ｉ−標識ＴＧＦ−β結合タンパク質を、Ｎｉｃｏｌａｓ（前出）によって記載されるようにして調製する。ヒドロキシアパタイトを、ポリプロピレン濾過膜（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｎｃ，Ｗｅｙｍｏｕｔｈ ＭＡ）を備えた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。ＴＧＦ−β結合タンパク質を、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンに添加した。基質を含むウェルを、この緩衝液で３回洗浄した。吸着されたＴＧＦ−β結合−タンパク質を、０．３ＭのＮａＯＨを使用して溶出し、そして定量化した。
インヒビターの同定を、試験分子と共にＴＧＦ−β結合−タンパク質をインキュベートし、そしてこの混合物を、上記の基質にアプライすることによって実施した。この基質を、ＰＢＳ緩衝液中の０．２％アルブミンで３回洗浄する。吸着されたＴＧＦ−β結合−タンパク質を、０．３ＭのＮａＯＨを使用して溶出し、そして定量化した。化合物または抗体の非存在下で観察されるＴＧＦ−β結合−タンパク質結合の４０％を阻害する薬剤を、骨局在化インヒビターとみなす。これらのインヒビターを、さらに、それらの阻害定数およびＴＧＦ−β結合−タンパク質結合親和性に対するそれらの影響を決定するための用量応答研究を介して、特徴づける。
（実施例８）
（ＴＧＦ−β結合−タンパク質変異体の構造）
（Ａ．変異誘発）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中の完全長のＴＧＦ−β結合−タンパク質ｃＤＮＡは、変異誘発のテンプレートとして有用である。簡単には、適切なプライマー（上に提供された議論を参照のこと）を利用して、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用するポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）連鎖反応により、ＤＮＡフラグメントを生成する。ポリメラーゼ連鎖反応は、５７℃のアニーリング温度を使用して、製造者により提供される緩衝液中で２３サイクルで実施する。次いで、この産物を、２種の制限酵素に曝露し、そしてアガロースゲル電気泳動を使用して単離した後に、その整合する配列を酵素的消化により取り除いた、ｐＲＢＰ４−５０３に連結した。この変異体の完全性を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
（Ｂ．変異体ＴＧＦ−β結合−タンパク質の哺乳動物細胞発現および単離）
変異体ＴＧＦ−β結合−タンパク質ｃＤＮＡを、実施例３に記載のｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター内に転移する。この配列を確認した後に、生じる構築物を、ＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトし、そして分泌タンパク質を、実施例３に記載されるように精製する。
（実施例９）
（動物モデル−Ｉ）
（Ｂｅｅｒ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製）
ＣＩＢＴマウスゲノムＤＮＡライブラリ−（Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬによって分配された）から単離された約２００キロベース（ｋｂ）のＢＡＣクローン１５Ｇ５を使用して、マウスＢｅｅｒ遺伝子ならびにその５’および３’隣接領域の完全配列を決定した。遺伝子全体、ならびに約１７ｋｂの５’隣接配列および約２０ｋｂの３’隣接配列を含む４１ｋｂ ＳａｌＩフラグメントを、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩコスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ中で増殖させた。次いで、このコスミド構築物から、マウスＢｅｅｒ遺伝子全体、ならびにそれぞれ１７ｋｂおよび１４ｋｂの５’および３’隣接配列を含む３５ｋｂ ＭｌｕＩ−ＡｖｉＩＩ制限フラグメント（配列番号６）を、従来の手段を使用してゲル精製し、そしてマウス接合体の微量注入に使用した（ＤＮＸ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ；米国特許第４，８７３，１９１号）。クローン化したＤＮＡフラグメントがランダムにゲノムに組み込まれた創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ）を、生存新生児の５〜３０％の頻度で得た。トランスジーンの存在を、少量のマウス組織（例えば、尾部の先端）から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施することにより確認した。ＤＮＡを、以下のプロトコールを使用して抽出した：組織を２００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ、および０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝液中、５５℃で一晩消化した。翌日、このＤＮＡをフェノール／クロロホルム（５０：５０）で一回、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で一回抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ）中での再懸濁して、８〜１０μｇの各ＤＮＡサンプルを、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥｃｏＲＩ）で消化し、ゲル電気泳動に供し、そしてＨｙＢｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）のような荷電したナイロン膜に転移させた。次いで、この得られるフィルターに、マウスＢｅｅｒ遺伝子座由来のＤＮＡの放射活性標識フラグメントをハイブリダイズさせ、そして、内因性遺伝子座由来のフラグメントとトランスジーン由来の異なるサイズのフラグメントの両方を認識し得る。創始動物を、Ｂｅｅｒ遺伝子の過剰発現の効果を決定するのに、十分な数のトランスジェニック子孫および非トランスジェニック子孫を生じるために、正常の非トランスジェニックマウスに交配した。これらの研究のために、種々の年齢（例えば、１日、３週間、６週間、４ヶ月）の動物を、全体の骨格形成、骨鉱物密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）、骨鉱物含量（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ）、破骨細胞および骨芽細胞の活性、軟骨内骨化の程度、軟骨形成などを確認するために設計された多数の異なるアッセイに供する。トランスジーン由来の転写活性は、種々の組織由来のＲＮＡを抽出し、そしてトランスジーンが由来するマウス株（１２９Ｓｖ／Ｊ）とＤＮＡ微量注入のために使用されるマウス株［（Ｃ５７ＢＬ５／Ｊ×ＳＪＬ／Ｊ）Ｆ２］との間の一ヌクレオチド多型を利用するＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用することによって決定され得る。
（動物モデル−ＩＩ）
（相同組換えによるマウスＢＥＥＲ遺伝子の破壊）
胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えが、内因性マウスＢｅｅｒ遺伝子を不活性化し、そして引き続いて機能喪失変異（ｌｏｓｓ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を保有する動物を産生するために、使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子が、標的ベクターへ操作され、その結果、その発現が、内因性Ｂｅｅｒ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始シグナルによって制御される。この様式で、Ｂｅｅｒ遺伝子発現の空間的パターンおよび時間的パターンが、標的化対立遺伝子を保有する動物において、決定され得る。
標的ベクターを、薬物選択的ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）カセットをｐＧＴ−Ｎ２９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からクローニングベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｓｏｎ，Ｗｌ）へまずクローニングすることによって構築した。ＰＣＲを、このＰＧＫｎｅｏカセットをバクテリファージＰ１ ｌｏｘＰ部位の側面に位置させるために使用した。これらの部位は、Ｐ１ Ｃｒｅリコンビナーゼについての認識部位である（Ｈｏｅｓｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，７９：３３９８，１９８２）。このことによって、標的化ＥＳ細胞またはＥＳ細胞誘導動物におけるｎｅｏ耐性マーカーを引き続いて除去することが可能となる（米国特許第４，９５９，３１７号）。これらのＰＣＲプライマーは、３４個のヌクレオチド（ｎｔｄ）ｌｏｘＰ配列、このＰＧＫｎｅｏカセットの５’および３’末端に対して相補的な１５〜２５ｎｔｄ、ならびにｐＳＰ７２へのクローニングのための制限酵素認識部位（センスプライマーにおけるＢａｍＨＩおよびアンチセンスプライマーにおけるＥｃｏＲＩ）から構成された。このセンスプライマーの配列は、５’−ＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴ−３’（配列番号３４）であり；このアンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧ ＴＣＡＧＣＴＴＣＴＧＡ−３’（配列番号３５）であった。
次の工程は、３．６ｋｂのＸｈｏｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む）を、ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から、ｐＳＰ７２−ＰＧＫｎｅｏプラスミドへクローニングすることであった。マウスＢｅｅｒ遺伝子座由来の相同性の「ショートアーム」を、ＢＡＣクローン１５Ｇ５由来の２．４ｋｂのフラグメントを増幅することによって産生した。このフラグメントの３’末端は、Ｂｅｅｒ遺伝子の翻訳開始部位と一致し、そしてＰＣＲにおいて使用したアンチセンスプライマーもまた、β−ガラクトシターゼ遺伝子の５’末端と３０ｎｔｄ相補性を含み、その結果、そのコード領域は、Ｂｅｅｒ開始部位にインフレームで融合され得た。「ショートアーム」をｐＳＰ７２−βｇａｌ−ＰＧＫｎｅｏプラスミドへ導入するために採るアプローチは、β−ｇａｌ遺伝子の上流の部位でこのプラスミドを線状化し、次いでこの「ショートアーム」ＰＣＲ産物でこのフラグメントを同時形質転換し、そしてＰＣＲ産物が相同組換えによって組み込まれたプラスミドについて選択することであった。「ショートアーム」増幅のためのセンスプライマーは、この組換え現象を可能にするためのｐＳＰ７２ベクターに対して相補的な３０ｎｔｄを含んだ。このセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号３６）であり、そしてアンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡ ＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号３７）であった。
Ｂｅｅｒ遺伝子座位由来の「ロングアーム」は、ＢＡＣクローン１５Ｇ５由来の６．１ｋｂのフラグメントを、稀な切断（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限酵素部位ＳｇｒＡＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｃｌおよびＰａｃｌもまた導入するプライマーで増幅することによって、産生した。具体的には、このセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３８）であり；このアンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴ ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣＧＴＴＡＡＴＴ−３’（配列番号３９）であった。得られたＰＣＲ産物を、中間工程として、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へクローニングした。
このマウスＢｅｅｒ遺伝子標的構築物はまた、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復エレメント（ＲＳＶ ＬＴＲ）の制御下で、第２の選択マーカー（Ｉ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶＴＫ））を含んだ。この遺伝子の発現は、哺乳動物細胞を、ガンシクロビルに対して感受性（および生存不能）にする；したがって、それは、この構築物が非相同現象によって組み込まれたネオマイシン耐性細胞に対して選択するための簡便な様式である（米国特許第５，４６４，７６４号）。このＲＳＶＬＴＲ−ＨＳＶＴＫカセットを、「ロングアーム」−ＴＡベクタープラスミドのＦｓｅＩ部位およびＡｓｃＩ部位へ引き続いてクローニングすることを可能にするプライマーを使用して、ｐＰＳ１３３７から増幅した。このＰＣＲについて、このセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡ ＴＣＴＧＡ−３’（配列番号４０）であり；このアンチセンスプライマーの配列は、５’−ＡＴＴＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号４１）であった。
標的ベクターの構築における最終工程は、「ロングアーム」およびＲＳＶＬＴＲ−ＨＳＶＴＫ遺伝子を含む８．８ｋｂのＳＧＲＡｌ−ＡｓｃＩフラグメントを、ｐＳＰ７２−「ショートアーム」−βｇａｌ−ＰＧＫｎｅｏプラスミドのＳｇｒＡＩ部位およびＡｓｃＩ部位へクローニングすることを包含する。この標的ベクターを、ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションの前に、ＡｓｃＩまたはＰａｃｌのいずれかでの消化によって直線化した。
（実施例１０）
（アンチセンス−媒介ＢＥＥＲ不活性化）
１７−ヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端がＢｅｅｒ転写の翻訳開始ＡＵＧと重複し、そして連続するオリゴヌクレオチドの５’末端が、ＢｅｅｒＡＵＧに対して５’方向へ（５０ヌクレオチド隔てるまで）５ヌクレオチド増加移動が生じるような様式で、重複形式で調製する。対応するコントロールオリゴヌクレオチドは、等価な塩基組成物を使用して設計および調製されるが、コードｍＲＮＡへのいずれの有意なハイブリダイゼーションをも阻害するために配列において再分配される。試験細胞系への薬剤送達が、カチオン性脂質送達を通して実施される（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３，１９８７）。２ｕｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１００ｕｌの還元血清媒体（Ｏｐｔｉ−ＭｅＭ Ｉ 還元血清媒体；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）へ添加し、そしてこれを、１００ｕｌの還元血清媒体中でリポフェクション薬剤（６ｕｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）と混合する。これらを混合し、３０分間、室温で複合体化させ、そしてこの混合物を、予め播種したＭＣ３Ｔ３Ｅ２１細胞またはＫＳ４８３細胞へ添加する。これらの細胞を培養し、そしてこのｍＲＮＡを回収する。Ｂｅｅｒ ｍＲＮＡを、Ｂｅｅｒ特異的プライマーと組み合わせたＲＴ−ＰＣＲを使用してモニタリングする。さらに、個々の実験ウエルを収集し、そしてタンパク質レベルを、実施例４に記載されるウエスタンブロット方法によって特徴付ける。これらの細胞を収穫し、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中に再懸濁させ、そしてこの可溶性タンパク質を収集する。この物質を、１０〜２０％勾配変性ＳＤＳ ＰＡＧＥへ適用する。これらの単離されたタンパク質をニトロセルロースへ移し、そしてウエスタンブロットを記載した抗体薬剤を使用して上記のように行う。並行して、コントロールオリゴヌクレオチドを、同一のクラスターへ添加し、そして実験操作を繰り返す。Ｂｅｅｒ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、このコントロールスクランブル化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）オリゴヌクレオチドと比較する場合のいずれかで５０％の変化が生じる場合、有意であると考えられる。この方法は、この組織培養モデルにおける鉱化ノジュール（ｎｏｄｕｌｅ）の選択的遺伝子不活性化および引き続く表現型特徴付けを可能にする。
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上述から、本発明の特定の実施形態が、本明細書中で例示の目的のために記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、制限されない。

Claims (26)

  1. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、配列番号２の分泌タンパク質に結合する、単離された抗体であって、該抗体がＩｇＧクラス抗体である、上記抗体。
  2. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、配列番号１によりコードされるタンパク質に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、該抗体がＩｇＧクラス抗体である、上記抗体またはそのフラグメント。
  3. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、昆虫細胞内において配列番号１に示すヌクレオチド配列を発現することによって得られうるタンパク質に結合する、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  4. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、Ｓｆ９細胞内でバキュロ系を用いて配列番号１に示すヌクレオチド配列を発現することによって得られうるタンパク質に結合する、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  5. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、ヒト胎児腎細胞内において配列番号１に示すヌクレオチド配列を発現することによって得られうるタンパク質に結合する、請求項２に記載の抗体またはそのフラグメント。
  6. １０７Ｍ−１以上のＫａ値で、当該タンパク質に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
  7. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 前記モノクローナル抗体がマウス抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体から成る群から選択される、請求項７に記載の抗体。
  9. 前記抗体が抗体フラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記抗体がＦ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦｖからなる群より選択される、請求項９に記載の抗体。
  11. ポリクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
  12. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、配列番号２のポリペプチドに結合する、単離された抗体であって、該抗体がＩｇＧクラス抗体である、上記抗体。
  13. １０７Ｍ−１以上のＫａ値で、配列番号２のポリペプチドに結合する、請求項１２に記載の単離された抗体。
  14. １０６Ｍ−１以上のＫａ値で、ヒト胎児腎細胞において配列番号１を発現させることによって得られうるタンパク質に結合する、単離された抗体であって、該抗体がＩｇＧクラス抗体である、上記抗体。
  15. 前記抗体が、ポリマーに結合している、請求項１４に記載の抗体。
  16. 前記抗体が、ポリエチレングリコールに結合している、請求項１４に記載の抗体。
  17. 前記ＩｇＧクラス抗体が、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、およびＩｇＧ4から成る群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 請求項１〜１７のいずれかに一項に記載の抗体と、レポーターまたはエフェクター分子を含む、融合ポリペプチド。
  19. 配列番号１８に記載の核酸配列からなる単離された核酸分子。
  20. 請求項１９に記載の核酸分子によってコードされる単離されたヒトＢＥＥＲタンパク質。
  21. 請求項２０に記載のヒトＢＥＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体。
  22. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体。
  23. 前記抗体がマウスまたはヒト抗体である、請求項２１または２２に記載の抗体。
  24. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項２１または２２に記載の抗体。
  25. 前記抗体がＦ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦｖからなる群より選択される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
  26. 前記抗体がＩｇＧクラス抗体であって、該ＩｇＧクラス抗体がＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、およびＩｇＧ4から成る群から任意に選択される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
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