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ES2639020T3 - Composiciones y métodos para incrementar la mineralización de la substancia ósea - Google Patents

Composiciones y métodos para incrementar la mineralización de la substancia ósea Download PDF

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ES2639020T3
ES2639020T3 ES10008049.8T ES10008049T ES2639020T3 ES 2639020 T3 ES2639020 T3 ES 2639020T3 ES 10008049 T ES10008049 T ES 10008049T ES 2639020 T3 ES2639020 T3 ES 2639020T3
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ES
Spain
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antibody
fragment
tgf
protein
beta
Prior art date
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Application number
ES10008049.8T
Other languages
English (en)
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Mary E. Brunkow
David J. Galas
Brian Kovacevich
John T. Mulligan
Bryan W. Paeper
Jeffrey Van Ness
David G. Winkler
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Original Assignee
UCB SA
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se unen a una proteína codificada por el SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para incrementar la mineralización de la substancia ósea
Campo técnico 5
La presente invención se refiere en general a productos y métodos farmacéuticos, y, más concretamente, a composiciones adecuados para incrementar el contenido mineral del hueso. Tales composiciones pueden ser utilizados para tratar una amplia variedad de afecciones, incluyendo por ejemplo, osteopenia, osteoporosis, fracturas y otros trastornos en los cuales la densidad mineral del hueso es un sello de la 10 enfermedad.
Antecedentes de la invención
A lo largo de la vida se pueden producir dos o tres fases distintas de cambios para la masa ósea de un 15 individuo (ver Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991). La primera fase se produce tanto en hombres como en mujeres, y prosigue hasta la consecución de una masa ósea pico. Esta primera fase se logra por medio del crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondrales, y del crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstica. La segunda fase comienza alrededor de los 30 años para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y alrededor de los 40 años para el hueso cortical 20 (p.ej., huesos largos encontrados en las extremidades) y continúa durante la edad adulta. Esta fase se caracteriza por una pérdida ósea lenta, y se produce tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, muy probablemente debido a las deficiencias de estrógenos post-menopáusicas. Solo durante esta fase, las mujeres pueden perder un 10% adicional de masa ósea del hueso cortical y un 25% del compartimento trabecular (ver Riggs, supra). 25
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La pérdida de contenido mineral del hueso puede estar causada por una amplia variedad de afecciones, y puede producir problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en humanos caracterizada por descensos marcados de masa de hueso esquelético y densidad mineral, deterioro estructural del hueso incluyendo la degeneración de la microarquitectura ósea y los 30 correspondientes incrementos de la fragilidad del hueso y la susceptibilidad a la fractura en los individuos afectados. La osteoporosis en humanos está precedida de osteopenia clínica (densidad mineral del hueso que es mayor de una desviación típica pero menor de 2,5 desviaciones típicas por debajo del valor medio para hueso adulto joven), un estado encontrado en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Otros 7-8 millones de pacientes en los Estados Unidos han sido diagnosticados de 35 osteoporosis clínica (definida como un contenido mineral del hueso mayor de 2,5 desviaciones típicas por debajo de la del hueso adulto joven maduro). La osteoporosis es una de las enfermedades más costosas para el sistema sanitario, costando decenas de millardos de dólares anualmente en los Estados Unidos. Además de los costes relacionados con el cuidado de la salud, el cuidado residencial a largo plazo y la pérdida de días de trabajo son añadidos a los costes financieros y sociales de esta enfermedad. En todo 40 el mundo aproximadamente 75 millones de personas están en riesgo de osteoporosis.
La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad, y entre los Caucásicos es predominante en las mujeres (que comprenden el 80% de la reserva de pacientes con osteoporosis en los Estados Unidos). El aumento de fragilidad y susceptibilidad a la fractura del hueso esquelético en las 45 personas de edad se agrava por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Se ha informado sobre más de 1,5 millones de fracturas óseas relacionadas con la osteoporosis en los Estados Unidos cada año. Las caderas, muñecas, y vértebras fracturadas están entre las lesiones más comunes asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y costosas para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con elevadas tasas de mortalidad y 50 morbilidad.
Aunque la osteoporosis ha sido definida como un incremento del riesgo de fractura debido a un descenso de la masa ósea, ninguno de los tratamientos disponibles en la actualidad para los trastornos óseos puede incrementar sustancialmente la densidad ósea de los adultos. Existe la percepción entre todos los 55 médicos de que se necesitan fármacos que puedan incrementar la densidad ósea en adultos, particularmente en los huesos de la muñeca, la columna vertebral y la cadera que están en riesgo de osteopenia y osteoporosis.
Las estrategias actuales para la prevención de la osteoporosis pueden ofrecer algún beneficio pero no 60 pueden asegurar la resolución de la enfermedad. Entre estas estrategias se incluyen la actividad física moderada (particularmente en actividades de soporte de pesos) con el inicio de la edad avanzada, incluyendo calcio adecuado en la dieta, y evitando el consumo de productos que contienen alcohol o tabaco. Para los pacientes que presentan osteopenia clínica u osteoporosis, todos los fármacos terapéuticos y estrategias actuales están dirigidos a reducir adicionalmente la pérdida de masa ósea 65 inhibiendo el proceso de absorción ósea, un componente natural del proceso de remodelación ósea que se produce constitutivamente.
Por ejemplo, ahora se están prescribiendo estrógenos para retardar la pérdida de hueso. No obstante, hay cierta controversia sobre si existe un beneficio a largo plazo para los pacientes y si existe algún efecto en todos los pacientes de más de 75 años de edad. Por otra parte, se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama o endometrio.
5
También se han sugerido dosis elevadas de calcio en la dieta, con o sin vitamina D para mujeres post-menopáusicas. No obstante, a menudo las dosis elevadas de calcio tienen efectos secundarios gastrointestinales desagradables, y los niveles de calcio en suero deben ser controlados continuamente (ver Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995).
10
Entre otros agentes terapéuticos que han sido sugeridos se incluyen calcitonina, bifosfonatos, esteroides anabólicos y fluoruro de boro. Tales agentes terapéuticos sin embargo, tienen efectos secundarios no deseables (p.ej., la calcitonina y los esteroides pueden causar náuseas y provocar una reacción inmunitaria, los bifosfonatos y el fluoruro de sodio pueden inhibir la reparación de las fracturas, incluso aunque la densidad ósea aumente moderadamente) que pueden evitar su uso (ver Khosla y Riggs, 15 supra).
Ninguna estrategia terapéutica puesta en práctica en la actualidad implica un fármaco que estimule o intensifique el crecimiento de nueva masa ósea. La presente invención proporciona composiciones que pueden ser utilizadas para incrementar la mineralización ósea, y de este modo pueden ser utilizadas para 20 tratar una amplia variedad de afecciones en las que se desea incrementar la masa ósea. Adicionalmente, la presente invención proporciona otras ventajas relacionadas.
Compendio de la invención
25
Como se ha indicado más arriba, la presente proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a una proteína codificada por el SEQ ID NO. 1.
Dentro de un aspecto de la presente descripción, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas, en donde dichas moléculas de ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste en: 30
(a) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende los ID de secuencia NO: 1, 5, 7, 9, 11, 13, o 15, o una secuencia complemetaria de los mismos;
(b) una molécula de ácido nucleico aislda que hibrida específicamente con la molécula de ácido nucleico de (a) en condiciones muy restrictivas; y
(c) un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de unión a TGF-beta de acuerdo con (a) o 35 (b);
Dentro de los aspectos relacionados de la presente descripción, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas basadas en la hibridación a una porción solamente de una de las secuencias identificadas antes (p.ej., para (a) la hibridación puede ser con una sonda de al menos 20, 25, 50 o 100 40 nucleótidos seleccionados entre los nucleótidos 156 a 539 o 555 a 687 del ID de secuencia NO. 1). Como debe resultar fácilmente evidente, las condiciones restrictivas necesarias que se van a utilizar para la hibridación pueden variar basándose en el tamaño de la sonda. Por ejemplo, para una sonda de 25-meros entre las condiciones muy restrictivas se podrían incluir Tris 60 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 5x solución de Denhardt, 6x SSC, N-laurilsarcosina al 0,1% (p/v), NP-40 al 0,5% (p/v) (nonidet P-40) durante la noche a 45 45 grados centígrados, seguido de dos lavados con 0,2x SSC/SDS al 0,1% a 45-50 grados. Para una sonda de 100-meros en condiciones poco restrictivas, entre las condiciones adecuadas se podrían incluir las siguientes: 5x SSPE, 5x Denhardt y SDS al 0,5% durante la noche a 42-50 grados, seguido de dos lavados con 2x SSPE (o 2x SSC)/SDS al 0,1% a 42-50 grados.
50
Dentro de aspectos relacionados de la presente descripción, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen homología con los ID de Secuencia Núm. 1, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, a un nivel de homología del 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% o 98% utilizando un algoritmo de Wibur-Lipman. Entre los ejemplos representativos de tales moléculas de ácido nucleico aisladas se incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende los ID de Secuencia Núm. 2, 6, 55 10, 12, 14, o 16, o tienen homología con estas secuencias a un nivel del 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, o 98% de nivel de homología utilizando un algoritmo de Lipman-Pearson.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas tienen típicamente un tamaño de menos de 100 kb, y en ciertas realizaciones, menos de 50 kb, 25 kb, 10 kb, o incluso 5 kb de tamaño. Adicionalmente, las moléculas de 60 ácido nucleico aisladas, en otras realizaciones, no existen en una "genoteca" de otras moléculas de ácido nucleico no relacionado (p.ej., un subclon BAC tal como se describe en el Núm. de Acceso de GenBank AC003098 y el Núm. EMB AQ171546). No obstante, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden ser encontradas en genotecas de moléculas relacionadas (p.ej., para transposición genética, tal como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.837.458, 5.830.721; y 5.811.238). Finalmente, las 65 moléculas de ácido nucleico aisladas como se describen en la presente memoria no incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican Dan, Cerberus, Gremlin, o SCGF (Patente de los Estados Unidos Núm.
5.780.263).
También son proporcionados por la presente descripción vectores de clonación que contienen las moléculas de ácido nucleico indicadas antes, y vectores de expresión que comprenden un promotor (p.ej., una secuencia reguladora) conectada operablemente a una de las moléculas de ácido nucleico indicada 5 antes. Entre los ejemplos representativos de los promotores adecuados se incluyen promotores específicos de tejidos, y promotores basados en virus (p.ej., promotores basados en CMV tales como 1-E de CMV, el promotor temprano de SV40, y LTR de MuLV). Los vectores de expresión también pueden estar basados en, o derivados de virus (p.ej., un "vector viral"). Entre los ejemplos representativos de los vectores virales se incluyen los vectores virales del herpes simplex, los vectores adenovirales, los 10 vectores virales asociados con adenovirus y los vectores retrovirales. También son proporcionadas por la descripción células anfitrionas que contienen cualquiera de los vectores indicados antes (incluyendo por ejemplo, células anfitrionas de origen humano, de mono, de perro, de rata, o de ratón).
En otros aspectos de la presente descripción, se proporcionan métodos de producción de proteínas de 15 unión a TGF-beta, que comprenden la etapa de cultivar la célula anfitriona anteriormente mencionada que contiene el vector en unas condiciones y durante un tiempo suficiente para producir la proteína de unión a TGF-beta. En realizaciones adicionales de la descripción, la proteína producida mediante estos métodos puede ser purificada adicionalmente (p.ej., mediante cromatografía en columna, purificación de afinidad, y similares). Por tanto, las proteínas aisladas que son codificadas por las moléculas de ácido nucleico 20 indicadas antes (p.ej., Secuencias de ID Núm. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16) pueden ser fácilmente producidas dada la descripción de la solicitud sujeto.
También se debe observar que las proteínas mencionadas antes, o fragmentos de las mismas, pueden ser producidas como proteínas de fusión. Por ejemplo, en un aspecto de la descripción se proporcionan 25 proteínas de fusión que comprenden un primer segmento polipeptídico de una proteína de unión a TGF-beta codificada por una molécula de ácido nucleico como se ha descrito antes, o una porción de la misma de al menos 10, 20, 30, 50, o 100 aminoácidos de longitud, y un segundo segmento polipeptídico que comprende una proteína que no es de unión a TGF-beta. El segundo polipéptido puede ser una etiqueta adecuada para la purificación o el reconocimiento (p.ej., un polipéptido que comprende múltiples restos 30 aminoácido aniónicos - ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.851.341), un marcador (p.ej., la proteína verde fluorescente, o la fosfatasa alcalina), o una molécula tóxica (p.ej., ricina).
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de los mismos que son capaces de unirse específicamente a una proteína codificada por el SEQ ID NO. 1. 35
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal (p.ej. de origen humano o murino). En realizaciones adicionales el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo que conserva las características de unión de un anticuerpo completo (p.ej., un fragmento F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, o Fv, o incluso una CDR). Asimismo se proporcionan hibridomas y otras células 40 que son capaces de producir o expresar los anticuerpos anteriormente mencionados.
En aspectos relacionados de la invención, se proporcionan métodos que detectan una proteína de unión a TGF-beta, que comprenden las etapas de incubar un anticuerpo como se ha descrito antes en unas condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicho anticuerpo se una a una proteína de 45 unión a TGF-beta, y detectar la unión. En varias realizaciones el anticuerpo puede ser unido a un soporte sólido para facilitar el lavado o la separación, y/o marcado (p.ej., con un marcador seleccionado del grupo formado por las enzimas, las proteínas fluorescentes, y los radioisótopos).
En otros aspectos de la presente descripción, se proporcionan oligonucleótidos aislados que hibridan con 50 una molécula de ácido nucleico de acuerdo con los ID de Secuencia NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 0 18 o su complemento, en condiciones muy restrictivas. En realizaciones adicionales de la descripción, el oligonucleótido puede ser encontrado en la secuencia que codifica los ID de Secuencia NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16. En ciertas realizaciones de la descripción, el oligonucleótido tiene una longitud de al menos 15, 20, 30, 50, o 100 nucleótidos. En realizaciones adicionales de la descripción, el oligonucleótido está 55 marcado con otra molécula (p.ej., una enzima, molécula fluorescente, o radioisótopo). Asimismo se proporcionan por la descripción, cebadores que son capaces de amplificar específicamente toda o una porción de las moléculas de ácido nucleico mencionadas antes que codifican proteínas de unión de TGF-beta. Según se utiliza en la presente memoria, se debe entender que el término "amplificar específicamente" hace referencia a cebadores que amplifican las proteínas de unión a TGF-betas 60 mencionadas antes, y no otras proteínas de unión a TGF-beta tales como Dan, Cerberus, Gremlin, o SCGF (patente de los Estados Unidos Núm. 5.780.263).
En aspectos relacionados de la presente descripción, se proporcionan métodos para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a TGF-beta, que comprende las etapas de 65 incubar un oligonucleótido como se ha descrito antes en condiciones muy restrictivas, y detectar la hibridación de dicho oligonucleótido. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido puede estar marcado y/o
unido a un soporte sólido.
En otros aspectos de la presente descripción, se proporcionan ribozimas que son capaces de escindir ARN que codifica una de las proteínas de unión a TGF-beta (p.ej. ID de Secuencia NO. 2, 6, 8, 10, 12, 14, o 16). Tales ribozimas pueden estar compuestas por ADN, ARN (incluyendo ácidos 2'-O-5 metilrribonucleicos), análogos de ácido nucleico (p.ej., ácidos nucleicos que tienen enlaces fosforotioato) o mezclas de los mismos. Asimismo se proporcionan por la descripción moléculas de ácido nucleico (p.ej., ADN o ADNc) que codifican estas ribozimas, y vectores que son capaces de expresar o producir las ribozimas. Entre los ejemplos representativos de los vectores se incluyen plásmidos, retrotransposones, cósmidos, y vectores basados en virus (p.ej., vectores virales generados al menos en parte a partir de un 10 retrovirus, adenovirus, o virus adeno-asociado). También se proporcionan por la descripción células anfitrionas (p.ej., células humanas, de perro, de rata o de ratón) que contienen estos vectores. En ciertas realizaciones, la célula anfitriona puede ser transformada establemente con el vector.
En aspectos adicionales de la descripción, se proporcionan métodos para producir ribozimas o bien 15 sintéticamente, o bien mediante transcripción in vitro o in vivo. En realizaciones adicionales de la descripción, las ribozimas así producidas pueden ser purificadas adicionalmente y/o formuladas en composiciones farmacéuticas (p.ej., la ribozima o la molécula de ácido nucleico que codifica la ribozima junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable). De un modo similar, los oligonucleótidos antisentido y los anticuerpos u otras moléculas seleccionadas descritas en la presente memoria pueden 20 ser formuladas en composiciones farmacéuticas.
En otros aspectos de la presente descripción, se proporcionan oligonucleótidos antisentido que comprenden una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con los SEC ID Núm. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, o 15, o el complemento de esta, y donde dicho oligonucleótido 25 inhibe la expresión de la proteína de unión a TGF-beta como se describe en la presente memoria (p.ej., BEER humana). En diversos aspectos, el oligonucleótido tiene una longitud de 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 50 nucleótidos. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene menos de 100, 75 o 60 nucleótidos de longitud. Como debe resultar fácilmente evidente, el oligonucleótido puede constar de uno o más análogos de ácido nucleico, ácidos ribonucleicos, o ácidos desoxirribonucleicos. Adicionalmente, el oligonucleótido puede ser 30 modificado por uno o más enlaces, incluyendo por ejemplo, enlaces covalentes tales como un enlace fosforotioato, un enlace fosfotriéster, un enlace metilfosfonato, un enlace metilen(imino), un enlace morfolino, un enlace amido, un enlace poliamido, un enlace interazúcar alquílico de cadena corta, un enlace interazúcar cicloalquílico, un enlace interazúcar heteroatómico de cadena corta y un enlace interazúcar heterocíclico. Un ejemplo representativo de un oligonucleótido quimérico es proporcionado en 35 la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.989.912.
En otro aspecto más de la presente descripción, se proporcionan métodos para incrementar la mineralización ósea, que comprenden introducir en un animal de sangre caliente una cantidad eficaz de la ribozima en el animal. En aspectos relacionados, tales métodos comprenden la etapa de introducir en un 40 paciente una cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleico o vector descritos en la presente memoria que es capaz de producir la ribozima deseada, en condiciones que favorecen la transcripción de la molécula de ácido nucleico para producir la ribozima.
En otros aspectos de la descripción se proporcionan animales no humanos, transgénicos. En una 45 realización de la descripción se proporciona un animal transgénico cuyas células germinales y células somáticas contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a TGF-beta donde el acido nucleico es una molecula de acido nucleico que comprende la SEC ID Núm. 1, 3, 5, 9, 11, 13 o 15 antes que está conectada operablemente a un promotor efectivo para la expresión del gen, siendo introducido el gen en el animal, o ancestro del animal, en una fase embrionaria, con la condición de 50 que dicho animal no sea humano. En otras realizaciones, se proporcionan animales modificados genéticamente transgénicos, que comprenden un animal cuyas células germinales y células somáticas comprenden una desorganización de al menos un alelo de una molécula de ácido nucleico endógena que hibrida con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a TGF-beta donde el acido nucleico endógeno es un acido nucleico que comprende la SEC IND NO. 1, 5, 9, 11, 13 or 15, donde la 55 desorganización evita la transcripción del ARN mensajero a partir de dicho alelo en comparación con un animal sin la desorganización, con la condición de que el animal no sea un humano. En varias realizaciones, la desorganización es una deleción, sustitución o inserción en el ácido nucleico. En otras realizaciones el animal transgénico es un ratón, rata, oveja, cerdo o perro.
60
En aspectos adicionales de la descripción, se proporcionan kits para la detección de la expresión de la proteína de unión a TGF-beta, que comprenden un recipiente que comprende una molécula de ácido nucleico, donde la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo formado por (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de los SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a); 65 (c) una molécula de ácido nucleico que es un fragmento de (a) o (b) de al menos 15, 20, 30, 50, 75, o 100 nucleótidos de longitud. Asimismo son proporcionados por la invención kits para la detección de una
proteína de unión a TGF-beta que comprenden un recipiente que comprende uno de los anticuerpos para la proteína de unión a TGF-beta descritos en la presente memoria.
Por ejemplo, en un aspecto de la presente descripción se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, que comprenden las 5 etapas de (a) mezclar una o más moléculas candidato con la proteína de unión a TGF-beta codificada por la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 y un miembro seleccionado de la familia de proteínas del TGF-beta (p.ej., BMP 5 o 6), (b) determinar si la molécula candidato altera la señalización del miembro de la familia del TGF-beta, altera o unión de la proteína de unión a TGF-beta al miembro de la familia del TGF-beta. En ciertas realizaciones de la descripción, la molécula altera la capacidad de TGF-10 beta para funcionar como regulador positivo de la diferenciación de las células del mesénquima. En este aspecto de la presente descripción, la molécula o las moléculas candidato pueden alterar la señalización o la unión, por ejemplo, disminuyendo (p.ej., inhibiendo), o incrementando (p.ej., intensificando) la señalización o la unión.
15
En otro aspecto más de la siguiente descripción, se proporcionan los métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, comprendiendo la etapa de determinar si una molécula seleccionada inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta al hueso, o un análogo de la misma. Entre los ejemplos representativos de hueso o de los análogos del mismo se incluyen hidroxiapatita y muestras de hueso humano primario obtenidas mediante biopsia. 20
En ciertas realizaciones de los métodos citados antes, de la descripción, la molécula seleccionada está contenida en una mezcla de moléculas y los métodos pueden comprender adicionalmente la etapa de aislar una o más moléculas que son funcionales en el análisis. En otras realizaciones más de la descripción, la familia de proteínas del TGF-beta está unida a un soporte sólido y se mide la unión de la 25 proteína de unión a TGF-beta o las proteínas de unión a TGF-beta están unidas a un soporte sólido y se mide la unión de las proteínas de unión a TGF-beta.
Utilizando métodos tales como los divulgados antes, se pueden analizar una amplia variedad de moléculas en cuanto a su capacidad para incrementar el contenido mineral del hueso inhibiendo la unión 30 de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de las proteínas de TGF-beta. Entre los ejemplos representativos de tales moléculas se incluyen proteínas o péptidos, moléculas orgánicas, y moléculas de ácido nucleico.
En otros aspectos relacionados la descripción se proporcionan métodos para aumentar el contenido 35 mineral del hueso en un animal de sangre caliente, que comprende la etapa de administrar a un animal de sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula identificada a partir de los análisis citados en la presente memoria. Se describen métodos para aumetar el contenido mineral de hueso en un animal de sangre caliente, que comprende la etapa de administrar a un animal de sangre caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta 40 a la superfamilia de proteínas de TGF-beta incluyendo la superfamilia de proteínas de TGF-beta, incluyendo las proteínas morfogénicas óseas (BMP). Los ejemplos representativos de las moléculas adecuadas incluyen moléculas antisentido, ribozimas, genes de ribozimas y anticuerpos (p.ej., un anticuerpo humanizado) que reconocen específicamente y alteran la actividad de la proteína de unión a TGF-beta. 45
Se describen métodos para aumentr el contenido mineral de hueso en un animal de sangre caliente, que comprenden las etapas de (a) introducir en las células que anidan en el hueso un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de proteínas del TGF-beta y proteínas morfogénicas del hueso (BMP), y (b) administrar las células que 50 contienen el vector a un animal de sangre caliente. Según se utiliza en la presente memoria, se debe entender que las "células anidan en el hueso" si localizan la matriz del hueso después de la administración periférica. Tales métodos pueden comprender adicionalmente, antes de la etapa de introducción, el aislamiento de células de la médula del hueso que anidan en el hueso. Las células que anidan en el hueso se pueden seleccionar del grupo formado por las células CD34+ y los osteoblastos. 55
En otros aspectos de la presente descripción, se proporcionan moléculas (preferiblemente aisladas) que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a la súper-familia de proteínas del TGF-beta.
Las moléculas pueden ser proporcionadas en forma de una composición, y pueden comprender 60 adicionalmente un inhibidor de la resorción ósea. Entre los ejemplos representativos de tales inhibidores se incluyen calcitonina, estrógeno, un bisfosfonato, un factor de crecimiento que tenga actividad anti-resorción y tamoxifeno.
Entre los ejemplos representativos de las moléculas que pueden ser utilizadas en los contextos 65 terapéuticos anteriormente mencionados se incluyen, anticuerpos (p.ej., anticuerpos humanizados). Tales moléculas pueden ser utilizadas, dependiendo de su selección, para alterar, ejercer un efecto antagónico
o ejercer un efecto agonístico de la señalización o la unión de un miembro de la familia de proteínas de unión a TGF-beta como se ha descrito en la presente memoria.
Las moléculas y los métodos de tratamiento o prevención descritos anteriormente pueden ser utilizados en afecciones tales como osteoporosis, osteomalasia, enfermedad periodontal, escorbuto, enfermedad de 5 Cushing, fractura de huesos y afecciones debidas a la inmovilización de miembros y uso de esteroides.
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Además, se muestran en la presente memoria diversas referencias que describen con más detalle ciertos procedimientos o composiciones (p.ej., plásmidos, etc.), y por lo tanto se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. 10
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración esquemática que compara la secuencia de aminoácidos de Dan Humana; Gremlin Humana; Cerberus Humana y Beer Humana. Las flechas indican el esqueleto de 15 Cisteína.
La Figura 2 resume los resultados obtenidos partir de la inspección de una variedad de tejidos humanos para la expresión de un gen de la proteína de unión a TGF-beta, específicamente, el gen Beer Humano. Se utilizó un procedimiento de transcripción Inversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa semi-cuantitativo (RT-PCR) para amplificar una porción del gen de ADNc de la primera 20 hebra sintetizada a partir del ARN total (descrito con más detalle en el EJEMPLO 2A).
La Figura 3 resume los resultados obtenidos a partir del ARN la hibridación in situ de secciones de embrión de ratón, utilizando una sonda de ARNc que es complementaria al transcrito Beer de ratón (descrito con más detalle en el EJEMPLO 2B). El panel A es una sección transversal de embriones de 10,5 dpc. El panel B es una sección sagital de embriones de 12,5 dpc y los paneles C y D son 25 secciones sagitales de embriones de 15,5 dpc.
La Figura 4 ilustra, mediante análisis de transferencia western, la especificidad de tres anticuerpos policlonales diferentes para sus respectivos antígenos (descrito con más detalle en el EJEMPLO 4). La Figura 4A muestra la reactividad específica de un anticuerpo anti-H. Beer para el antígeno H. Beer, pero no H. Dan o H. Gremlin. La Figura 4B muestra la reactividad de un anticuerpo anti-H. 30 Gremlin para el antígeno H. Gremlin, pero no H. Beer o H. Dan. La Figura 4C muestra la reactividad de un anticuerpo anti-H. Dan para H. Dan, pero no para H. Beer o H. Gremlin.
La Figura 5 ilustra, mediante análisis de transferencia western, la selectividad de la proteína de unión a TGF-beta, Beer, para BMP-5 y BMP-6, pero no BMP-4 (descrito con más detalle en el EJEMPLO 5). 35
La Figura 6 demuestra que la interacción iónica entre la proteína de unión a TGF-beta, Beer, y BMP-5 tiene una constante de disociación en el intervalo de 15-30 nM.
Descripción detalladea de la invención
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Definiciones
Antes de exponer la invención con detalle, puede servir de ayuda para la comprensión de la misma mostrar las definiciones de ciertos términos y enumerar y definir las abreviaturas que se utilizarán más adelante. 45
Se debe entender que "molécula" incluye proteínas o péptidos (p.ej., anticuerpos, pares de unión recombinantes, péptidos con una afinidad de unión deseada), ácidos nucleicos (p.ej., ADN, ARN, moléculas de ácido nucleico quiméricas, y análogos de ácidos nucleicos tales como PNA); y compuestos orgánicos e inorgánicos. 50
Se debe entender que "TGF-beta" incluye cualquier miembro conocido o novedoso de la súper-familia del TGF-beta, lo que también incluye las proteínas morfogénicas del hueso (BMP).
Se debe entender que "receptor del TGF-beta" hace referencia al receptor específico para un miembro 55 concreto de la super-familia del TGF-beta (incluyendo las proteínas morfogénicas del hueso (BMP)).
Se debe entender que "proteína de unión a TGF-beta" hace referencia a una proteína con una afinidad de unión específica para un miembro concreto o subgrupo de miembros de la super-familia del TGF-beta (incluyendo las proteínas morfogénicas del hueso (BMP)). Entre los ejemplos específicos de las proteínas 60 de unión a TGF-beta se incluyen las proteínas codificadas por los ID de Secuencia Núm. 1, 5, 7, 9, 11, 13 y 15.
Se debe entender que "la unión de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de proteínas del TGF-beta y las proteínas morfogénicas del hueso (BMP)" hace referencia a moléculas que permiten la activación de 65 TGF-beta o proteínas morfogénicas del hueso (BMP), o permiten la unión de miembros de la familia del TGF-beta incluyendo las proteínas morfogénicas del hueso (BMP) a sus respectivos receptores,
separando o evitando la unión del TGF-beta con la proteína de unión a TGF-beta. Semejante inhibición puede ser completada, por ejemplo, mediante moléculas que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a miembros específicos de la súper-familia del TGF-beta.
"Vector" hace referencia a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la proteína deseada. El 5 vector debe incluir elementos promotores transcripcionales que estén conectados operablemente al gen o los genes de interés. El vector puede constar de ácidos desoxirribonucleicos ("ADN"), ácidos ribonucleicos ("ARN"), o una combinación de los dos (p.ej. quimérico de ADN-ARN). Opcionalmente, el vector puede incluir una secuencia de poliadenilación, uno o más sitios de restricción, así como uno o más marcadores seleccionables tales como neomicina-fosfotransferasa o higromicina-fosfotransferasa. Adicionalmente, 10 dependiendo de la célula anfitriona elegida y del vector empleado, también se pueden incorporar otros elementos genéticos tales como un origen de replicación, sitios de restricción de ácidos nucleicos adicionales, intensificadores, secuencias que confieran inducibilidad de transcripción, y también se pueden incorporar marcadores seleccionables en los vectores descritos en la presente memoria.
15
Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica una proteína de unión a TGF que ha sido separada del ADN genómico de una célula eucariótica es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma del organismo. La molécula de ácido nucleico aislada 20 puede ser de ADN genómico, ADNc, ARN, o constar de al menos una parte de análogos de ácido nucleico.
Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. En ciertas realizaciones, una separación de proteínas concreta contiene un 25 polipéptido aislado si éste aparece nominalmente como una única banda sobre el gel de SDS-PAGE con tinción de Azul Coomassie. "Aislado" cuando se refiere a moléculas orgánicas significa que los compuestos son puros en más del 90 por ciento utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica (p.ej., RMN, punto de fusión).
30
"Esclerosteosis". Esclerosteosis es un término que fue aplicado por Hansen (1967) (Hansen, H.G., Sklerosteose. En: Opitz, H., Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlín: Springer (pub.) 6 1967. págs. 351-355) a un trastorno similar a hiperostosis cortical generalizada de van Buchem pero posiblemente difiriendo en la apariencia radiológica de los cambios del hueso y en la presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos índice y medio en muchos casos. La mandíbula tiene una 35 apariencia inusualmente cuadrada en esta afección.
Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las cuales las regiones determinantes de la complementariedad de ratón de los anticuerpos monoclonales han sido transferidas de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. 40
Según se utiliza en la presente memoria, un "fragmento de anticuerpo" es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', y similar. Sin tener en cuenta la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de un anticuerpo monoclonal para la proteína de unión a TGF-beta se une con un epítopo de la proteína de 45 unión a TGF-beta.
El término "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o diseñada genéticamente que actúa como un anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen fragmentos aislados que constan 50 de la región variable de la cadena ligera, fragmentos "Fv" que constan de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, moléculas polipeptídicas de una única cadena recombinante en las cuales las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico ("proteínas sFv"), y unidades de reconocimiento mínimas que constan de los restos aminoácido que imitan la región hipervariable. 55
Una "marca detectable" es una molécula o átomo que puede ser conjugada con un radical de un anticuerpo para producir una molécula útil para las diagnosis. Entre los ejemplos de las marcas se incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, enzimas, y otros radicales marcadores. 60
Según se utiliza en la presente memoria, un "producto inmunoconjugado" es una molécula que comprende un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta, o un fragmento de anticuerpo, y una marca detectable. Un producto inmunoconjugado tiene más o menos la misma capacidad, o una capacidad solo ligeramente reducida para unirse a la proteína de unión a TGF-beta después de la conjugación que antes 65 de la conjugación.
Abreviaturas: TGF-beta - "Factor de Crecimiento Transformante-beta"; TGF-bBP - "Proteína de unión al Factor de Crecimiento Transformante-beta" (una TGF-bBP representativa se denomina "H. Beer"); BMP - "proteína morfogénica del hueso"; PCR - "reacción en cadena de la polimerasa"; RT-PCR - procedimiento de PCR en el cual el ARN es transcrito primero a ADN en la primera etapa utilizando la transcriptasa inversa (RT); ADNc - cualquier ADN elaborado copiando una secuencia de ARN en forma de ADN. 5
Como se ha indicado antes, la presente descripción proporciona una clase novedosa de proteínas de unión a TGF-beta, así como medicamentos y composiciones para incrementar el contenido mineral del hueso en animales de sangre caliente. Brevemente, las presentes descripciones se basan en el descubrimiento inesperado de que una mutación en el gen que codifica un miembro novedoso de la 10 familia de las proteínas de unión a TGF-beta produce una rara afección (esclerosteosis) caracterizada por contenidos minerales de los huesos que son una a cuatro veces superiores que en individuos normales. De este modo, como se discute con más detalle más abajo este descubrimiento ha conducido al desarrollo de análisis que pueden ser utilizados para seleccionar moléculas que inhiben la unión de la proteína del unión a TGF-beta a la familia de proteínas del TGF-beta y las proteínas morfogénica del 15 hueso (BMP), y tales moléculas para su uso para incrementar el contenido de material óseo de animales de sangre caliente (incluyendo por ejemplo, seres humanos).
Estudio de la enfermedad conocida como esclerosteosis
20
Esclerosteosis es un término que fue aplicado por Hansen (1967) (Hansen, H.G., Sklerosteose. Opitz, H., Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlín: Springer (pub.) 6 1967. págs. 351-355) a un trastorno similar a la hiperostosis cortical generalizada de van Buchem pero posiblemente difiriendo en la apariencia radiológica de los cambios del hueso y en la presencia de sindactilia cutánea asimétrica de los dedos índice y medio en muchos casos. 25
Se sabe ahora que la esclerosteosis es una alteración semi-dominante autosómica que está caracterizada por lesiones escleróticas ampliamente diseminadas del hueso en el adulto. La afección es progresiva. La esclerosteosis también tiene un aspecto evolutivo que está asociado con la sindactilia (dos o más dedos están juntos). El Síndrome de Esclerosteosis está asociado con una gran estatura y muchos individuos 30 afectados alcanzan una altura de uno con ochenta y tres metros (seis pies) o más. El contenido mineral del hueso de los homozigotos puede ser de 1 a 6 veces por encima de los individuos normales y la densidad mineral del hueso puede ser de 1 a 4 veces por encima de los valores normales (p.ej., de hermanos no gemelos).
35
El Síndrome de Esclerosteosis se produce principalmente en Afrikaaners de descendencia Alemana en Sudáfrica. Aproximadamente 1/140 individuos de la población Afrikaaner son portadores del gen mutado (heterozigotos). La mutación muestra una penetrancia del 100%. Existen informes anecdóticos de aumento de la densidad mineral del huso en heterozigotos con patologías no asociadas (sindactilia o sobrecrecimiento de la cabeza ósea). 40
En la actualidad parece que no hay anomalía del eje de la pituitaria-hipotálamo en la Esclerosteosis. En particular, no parece haber sobre-producción de la hormona del crecimiento ni de la cortisona. Además, los niveles de hormonas sexuales son normales en los individuos afectados. No obstante, los marcadores de recambio óseo (fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido C' de 45 procolágeno de tipo I (PICP), y fosfatasa alcalina total, (ver Comier, C., Curr. Opin. In Rheu. 7:243, 1995) indican que existe actividad hiperosteoblástica asociada con la enfermedad pero que hay una actividad osteoclástica normal a débilmente disminuida medida mediante marcadores de resorción ósea (piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes al ácido en plasma y galactosilhidroxilisina (ver Coomier, supra)). 50
La esclerosteosis se caracteriza por el depósito continuo de hueso a lo largo de todo el esqueleto durante la vida de los individuos afectados. En homozigotos el depósito continuo de mineral del hueso conduce a un sobrecrecimiento del hueso en las áreas del esqueleto en las que hay una ausencia de mecanorreceptores (cabeza ósea, mandíbula, cráneo). En homozigotos con Esclerosteosis, el 55 sobrecrecimiento de los huesos de la cabeza ósea conduce a una compresión craneal y eventualmente a la muerte debido a una presión hidrostática excesiva sobre el tallo encefálico. En todas las demás partes del esqueleto existe una esclerosis generalizada y difusa. Las áreas corticales de los huesos largos están enormemente engrosadas dando como resultado un incremento sustancial en la resistencia del hueso. Las conexiones trabeculares tienen un grosor incrementado que a su vez aumenta la fuerza del hueso 60 trabecular. Los huesos escleróticos aparecen normalmente opacos a los rayos x.
Como se describe con más detalle en el Ejemplo 1, la rara mutación genética que es responsable del Síndrome de Esclerosteosis ha sido localizada hacia la región del cromosoma humano 17 que codifica un miembros novedoso de la familia de las proteínas de unión a TGF-beta (un ejemplo representativo del 65 cual es denominado "H. Beer"). Como se describe con más detalle más abajo, basándose en este descubrimiento, el mecanismo de mineralización ósea se comprende más completamente, permitiendo el
desarrollo de análisis para moléculas que incrementan la mineralización ósea, y el uso de tales moléculas para incrementar el contenido mineral del hueso, y en el tratamiento o la prevención de un amplio número de enfermedades.
Superfamilia de TGF-beta 5
La súper-familia del Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF-beta) contiene una variedad de factores de crecimiento que comparten elementos de la secuencia comunes y unidades estructurales (a los niveles tanto secundarios como terciarios). Se sabe que esta familia de proteínas ejerce un amplio espectro de respuestas biológicas sobre una gran variedad de tipos celulares. Muchas de ellas tienen 10 importantes funciones durante el desarrollo embrionario en la formación del patrón y la especificación de tejidos; en adultos, están implicadas, p.ej., en la curación de heridas y la reparación ósea y la remodelación ósea, y en la modulación del sistema inmunitario. Además de los tres TGF-beta, en la súper-familia se incluyen las Proteínas Morfogénicas del Hueso (BMP), Activinas, Inhibinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDF), y Factores Neurotróficos Derivados de la Glía. La clasificación 15 primaria es establecida por medio de rasgos de la secuencia general que vinculan una proteína específica a una sub-familia general. La estratificación adicional dentro de la sub-familia es posible debido a una conservación de la secuencia más estricta entre los miembros de un grupo más pequeño. En ciertos casos, tales como BMP-5, BMP-6 y BMP-7, esta puede ser tan elevada como el 75 por ciento de homología de aminoácidos entre los miembros del grupo más pequeño. Este nivel de identidad permite 20 que una única secuencia representativa ilustre los elementos bioquímicos clave del sub-grupo que la separa de los otros miembros de la familia más grande.
El TGF-beta señala induciendo la formación de complejos hetero-oligoméricos de los receptores tipo I y de tipo II. La estructura cristalina del TGF-beta2 ha sido determinada. El plegado general del monómero de 25 TGF-beta2 contiene una estructura de tipo nudo de cisteína, compacto, estable formado por tres puentes disulfuro. La dimerización, estabilizada por un puente disulfuro, es antiparalela.
Los miembros de la familia del TGF-beta inician su acción celular uniéndose a receptores con una actividad serina/treonina quinasa intrínseca. Esta familia de receptores consta de dos subfamilias, 30 denominadas receptores de tipo I de tipo II. Cada miembro de la familia del TGF-beta se une a una combinación característica de receptores de tipo I y de tipo II, ambos los cuales son necesarios para la señalización. En el modelo actual para la activación del TGF-beta, el TGF-beta se une primero al receptor de tipo II (TbR-II), que aparece en la membrana celular en una forma oligomérica con quinasa activada. Después de eso, el receptor de tipo I (TbR-I), que no puede unirse al ligando en ausencia de TbR-II, es 35 reclutado en el complejo. Después TbR-II fosforila TbR-I predominantemente en un dominio rico en restos glicina y serina (dominio GS) en la región de la yuxtamembrana, y de ese modo activa TbR-I.
Hasta ahora se han identificado siete receptores de tipo I y cinco receptores de tipo II.
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Las proteínas morfogénicas de hueso (BMP) son proteínas reguladoras clave en la determinación de la densidad mineral del hueso en seres humanos
Un avance principal en la comprensión de la formación de hueso fue la identificación de las proteínas morfogénicas del hueso (BMP), también conocidas como proteínas osteogénicas (OP), que regulan la 45 diferenciación del cartílago y el hueso in vivo. Las BMP/OP inducen la diferenciación del hueso endocondral por medio de una cascada de eventos que incluyen la formación de cartílago, la hipertrofia y la calcificación del cartílago, la invasión vascular, la diferenciación de osteoblastos, y la formación de hueso. Como se ha descrito antes, las BMP/OP (BMP 2-14, y proteínas osteogénicas 1 y 2, OP-1 y OP-2) son miembros de la súper-familia del TGF-beta. La sorprendente conservación evolutiva entre los 50 miembros de la sub-familia de BMP/OP sugiere que son críticos en el desarrollo y la función normal de los animales. Por otra parte, la presencia de múltiples formas de BMP/OP plantea una cuestión importante acerca de la relevancia biológica de esta aparente redundancia. Además de la condrogénesis y la osteogénesis post-fetal, las BMP/OP juegan múltiples papeles en la esqueletogénesis (incluyendo el desarrollo de los tejidos craneofaciales y dentales) y en el desarrollo embriónico y a organogénesis de los 55 órganos parenquimatosos, incluyendo el riñón. Se sabe ahora que la naturaleza cuenta con mecanismos moleculares comunes (y escasos) adaptados para proporcionar la emergencia de tejidos y órganos especializados. La súper-familia de BMP/OP es un elegante ejemplo de parsimonia natural en la programación de múltiples funciones especializadas que despliegan isoformas moleculares con una variación minoritaria en las unidades de aminoácidos dentro de regiones carboxi terminales altamente 60 conservadas.
Antagonismo de BMP
Las sub-familias de las BMP y la Activina están sujetas a una regulación post-traduccional significativa. 65 Existe un sistema de control extracelular intrincado, por medio del cual se sintetiza y se exporta un antagonista de elevada afinidad, y con posterioridad forma complejos selectivamente con las BMP o las
activinas para desorganizar su actividad biológica (W.C. Smith (1999) TIG 15(1) 3-6). Han sido identificados algunos de estos antagonistas naturales, y basándose en la divergencia de la secuencia parecen haber evolucionado independientemente debido a la carencia de conservación de la secuencia primaria. No ha habido un trabajo estructural hasta la fecha sobre esta clase de proteínas. Los estudios de estos antagonistas han destacado una clara diferencia para interaccionar y neutralizar BMP-2 y BMP-4. 5 Además, el mecanismo de inhibición parece diferir para los diferentes antagonistas (S. Iemura et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 9337-9342).
Proteínas de unión a TGF-beta novedosas
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1. Antecedente re: proteínas de unión a TGF-beta
Como se ha observado antes, la presente descripción proporciona un clase novedosa de proteínas de unión a TGF-beta que posee un armazón de cisteína (disulfuro) casi idéntico cuando se comparaba con DAN Humana, Gremlin Humana, y Cerberus Humana, y SCGF (Patente de los estados Unidos Núm. 15 5.780.263) pero no posee casi homología a nivel de nucleótidos (para la información antecedente, ver generalmente Hsu, D.R., Economides, A.N., Wang, X., Eimon, P.M., Harland, R.M., "The Xenopus Dorsalizing Factor Gremlin Identifies a Novel Family of Secreted Proteins that Antagonize BMP Activities", Molecular Cell 1:673-683, 1998).
20
Un ejemplo representativo de la clase novedosa de proteínas de unión a TGF-beta se describe en los ID de Secuencia Núm. 1, 5, 9, 11, 13, y 15. Se debe entender que los miembros representativos de esta clase de proteínas de unión incluyen variantes de la proteína de unión a TGF-beta (p.ej., los ID de Secuencia Núm. 5 y 7). Según se utiliza en la presente memoria, un "gen variante de la proteína de unión a TGF-beta" hace referencia a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una 25 secuencia de aminoácidos que es una modificación de los ID de Secuencia Núm. 2, 10, 12, 14 o 16. Entre tales variantes se incluyen los polimorfismos de origen natural o las variantes alélicas de los genes de la proteína de unión a TGF-beta, así como genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de estas secuencias de aminoácidos. Las formas variantes adicionales de un gen de la proteína de unión a TGF-beta son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de 30 las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria. Los genes variantes de la proteína de unión a TGF-beta pueden ser identificados determinando si los genes hibridan con una molécula de ácido nucleico que tenga la secuencia de nucleótidos de los ID de Secuencia Núm. 1, 5, 7, 9, 11, 13, o 15 en condiciones restrictivas. Además, los genes variantes de la proteína de unión a TGF-beta deben codificar una proteína que tenga un esqueleto de cisteína. 35
Como alternativa, se pueden identificar genes variantes de la proteína de unión a TGF-beta mediante comparación de la secuencia. Según se utiliza en la presente memoria, dos secuencias de aminoácidos tienen una "identidad de secuencia del 100%" si los restos aminoácido de las dos secuencias de aminoácidos son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia. De un modo similar, dos 40 secuencias de nucleótidos tienen una "identidad de secuencia del 100%" si los restos nucleotídicos de las dos secuencias de nucleótidos son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia. Las comparaciones de la secuencia se pueden realizar utilizando programas de soporte lógico normalizados tales como los incluidos en la Suite de computación bioinformática LASERGENE, que es producida por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de 45 aminoácidos mediante la determinación del alineamiento óptimo son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press. Inc. 1997), Wu y col, (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2ª Edición (Academic Press, Inc. 50 1998)).
Una proteína de unión a TGF-beta variante debe tener al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50% con los ID de Secuencia Núm. 2, 6, 10, 12, 14, o 16 y preferiblemente, una identidad de más del 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%. Alternativamente, las variantes de la proteína de 55 unión a TGF-beta pueden ser identificadas por tener una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos el 70% con los ID de Secuencia Núm. 1, 5, 9, 11, 13 o 15. Por otra parte, la presente descripción contempla las variantes del gen de la proteína de unión a TGF-beta que tienen una identidad de más del 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% con el SEQ ID NO. 1. Sin hacer caso del método concreto utilizado para identificar un gen variante de una proteína de unión a TGF-beta o una proteína de unión a TGF-beta, una 60 proteína de unión a TGF-beta variante o un polipéptido codificado por un gen de la proteína de unión a TGF-beta variante puede ser caracterizado funcionalmente, por ejemplo, mediante su capacidad para unirse a y/o inhibir la señalización de un miembro seleccionado de la familia de proteínas del TGF-beta, o mediante su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo de una proteína de unión a TGF-beta. 65
En la presente descripción se incluyen fragmentos funcionales de los genes de las proteínas de unión a
TGF-beta. En el contexto de esta descripción, un "fragmento funcional" de un gen de una proteína de unión a TGF-beta hace referencia a una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido de la proteína de unión a TGF-beta que o bien posee (1) la actividad funcional indicada antes, o bien (2) se une específicamente con un anticuerpo de una proteína de unión a TGF-beta. Por ejemplo, un fragmento funcional de un gen de una proteína de unión a TGF-beta descrito en la presente memoria 5 comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Núm: 1, 5, 9, 11, 13, o 15.
2. Aislamiento del gen de la proteína de unión a TGF-beta
Se pueden obtener moléculas de ADN que codifican un gen de una proteína de unión rastreando una 10 genoteca deADNc o genómico humano utilizando sondas polinucleotídicas basadas, por ejemplo, en la SEC ID NO: 1.
Por ejemplo, la primera etapa en la preparación de una genoteca deADNc es aislar el ARN utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. En general, las técnicas de aislamiento de ARN 15 deben proporcionar un método para romper las células, un medio para inhibir la degradación de ARN dirigida por la ARNasa, y un método para separar el ARN del ADN, la proteína y los polisacáridos contaminantes. Por ejemplo, se puede aislar el ARN total congelando el tejido en nitrógeno líquido, triturando el tejido congelado con un mortero y una mano de mortero para lisar las células, extrayendo el tejido triturado con una solución de fenol/cloroformo para separar las proteínas, y separando el ARN de 20 las impurezas restantes mediante precipitación selectiva con cloruro de litio (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Edición, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41] (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]).
25
Alternativamente, el ARN total puede ser aislado extrayendo el tejido triturado con isotiocianato de guanidinio, extrayendo con disolventes orgánicos, y separando el ARN de los contaminantes utilizando la centrifugación diferencial (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-6; Wu (1997) en las páginas 33-41).
30
Con el fin de construir una genoteca deADNc, se debe aislar ARN poli(A)+ de la preparación de ARN total. El ARN poli(A)+ puede ser aislado del ARN total utilizando la técnica normalizada de la cromatografía en oligo(dT)-celulosa (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-11 a 4-12).
Las moléculas de ADNc de doble hebra son sintetizadas a partir de ARN poli(A)+ utilizando mecanismos 35 bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Wu (1997) en las páginas 41-46). Por otra parte, se pueden utilizar kits asequibles comercialmente para sintetizar moléculas de ADNc de doble hebra. Por ejemplo, tales kits son asequibles de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, California), Promega Corporation (Madison, Wisconsin) y Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California). 40
El enfoque básico para obtener clones de ADNc de la proteína de unión a TGF-beta puede ser modificado construyendo una genoteca deADNc sustraída que esté enriquecido en moléculas de ADNc específicas de la proteína de unión a TGF. Los mecanismos para construir genotecas sustraidas son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sargent, "Isolation of Differentially Expressed Genes" en 45 Meth. Enzymol. 152:423, 1987, y Wu et al., (eds.) "Construction and Screening of Substracted and Complete Expression cDNA Libraries", en Methods in Gene Biotechnology, páginas 29-65 (CRC Press, Inc. 1997)).
Diversos vectores de clonación son apropiados para la construcción de una genoteca deADNc. Por 50 ejemplo, se puede preparar una genoteca deADNc en un vector derivado de bacteriófagos, tal como un vector gt10 (ver, por ejemplo, Huynh et al., "Construction and Screening cDNA in gt10 and gt11", en DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.) página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52).
55
Alternativamente, se pueden insertar moléculas de ADNc de doble hebra en un vector plasmídico, tal como un vector pBluescript (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, California), LambdaGEM-4 (Promega Corp.; Madison, Wisconsin) u otros vectores asequibles comercialmente. Los vectores de clonación adecuados también pueden ser obtenidos de la American Type Culture Collection (Rockville, Maryland).
Con el fin de amplificar las moléculas de ADNc clonadas, la genoteca deADNc es insertada en un anfitrión 60 procariótico, utilizando mecanismos normalizados. Por ejemplo, se puede introducir una genoteca deADNc en células E. coli DH5 competentes, que pueden ser obtenidas de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, Maryland).
Se puede preparar una genoteca de ADN genómico humano por métodos bien conocidos en la técnica 65 (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327). Se puede aislar ADN genómico lisando tejido con el detergente Sarkosyl, digiriendo el producto lisado con
proteinasa K, aclarando los restos insolubles del producto lisado mediante centrifugación, precipitando el ácido nucleico del producto lisado utilizando isopropanol, y purificando el ADN resuspendido en un gradiente de densidad de cloruro de cesio.
Los fragmentos de ADN que son adecuados para la producción de un genoteca genómica pueden ser 5 obtenidos sometiendo a cizalla al azar el ADN genómico o mediante digestión parcial del ADN genómico con endonucleasas de restricción. Los fragmentos de ADN genómico pueden ser insertados en un vector, tal como un vector bacteriófago o cosmídico, de acuerdo con los mecanismos convencionales, tal como el uso de la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el uso del tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada de moléculas de ADN, y la ligadura con 10 ligasa apropiadas. Los mecanismos para semejante manipulación son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen de la proteína de unión a TGF-beta también pueden ser obtenidas utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos 15 que tengan secuencias de nucleótidos del gen de la proteína de unión a TGF-beta humano, como se describe en la presente memoria. Los métodos generales para rastrear genotecas con PCR son proporcionados por ejemplo, por Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.) páginas 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Por otra parte, describen mecanismos para 20 utilizar la PCR para aislar genes relacionados, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 317-337 (Humana Press, Inc. 1993).
25
Alternativamente, se pueden obtener genotecas genómicas humanas de fuentes comerciales tales como Research Genetics (Huntsville, AL) y American Type Culture Collection (Rockville, Maryland).
Se puede rastrear una genoteca que contiene ADNc o clones genómicos con una o más sondas polinucleotídicas basadas en el SEC ID NÚM: 1, utilizando métodos normalizados (ver, por ejemplo, 30 Ausubel (1995) en las páginas 6-1 a 6-11).
Los anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta, producidos como se describe más abajo, también pueden ser utilizados para aislar secuencias de ADN que codifican los genes de la proteína de unión a TGF-beta de las genotecas de ADNc. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser utilizados para rastrear 35 genotecas de expresión de gt11, o se pueden utilizar los anticuerpos para el inmunorescrutinio después de la selección y la traducción de híbridos (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-12 a 6-16; Margolis et al., "Screening  expression libraries with antibody and protein probes", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al., (eds.) páginas 1-14 (Oxford University Press 1995)).
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La secuencia de un ADNc de una proteína de unión a TGF-beta o de un fragmento genómico de la proteína de unión a TGF-beta puede ser determinada utilizando métodos normalizados. Por otra parte, la identificación de fragmentos genómicos que contienen un promotor o un elemento regulador de la proteína de unión a TGF-beta puede ser lograda utilizando mecanismos bien establecidos, tales como análisis de deleción (ver, generalmente, Ausubel (1995)). 45
Como alternativa, se puede obtener un gen de una proteína de unión a TGF-beta sintetizando moléculas de ADN utilizando oligonucleótidos largos mutuamente cebadores y secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (ver, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Los mecanismos establecidos que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar 50 moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dilton et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc., 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995). 55
3. Producción de genes de la proteína de unión a TGF-beta
Se pueden obtener moléculas de ácido nucleico que codifican genes de proteína de unión a TGF-beta variantes rastreando diversas genotecas de ADNc o genómico con sondas oligonucleotídicas que tienen 60 secuencias de nucleótidos basadas en los SEC ID NO: 1, 5, 9, 11, 13, o 15, utilizando los procedimientos descritos antes. Las variantes del gen de la proteína de unión a TGF-beta también pueden ser construidas sintéticamente. Por ejemplo, se puede idear una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga un cambio de aminoácido conservativo, en comparación con la secuencia de aminoácidos de los SEC ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14, o 16. Esto es, se pueden obtener variantes que contengan una o más 65 sustituciones de aminoácidos de los SEC ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 14 o 16, en las cuales un aminoácido alquílico está sustituido por un aminoácido alquílico en una secuencia de aminoácidos de la proteína de
unión a TGF-beta, un aminoácido aromático está sustituido por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta, un aminoácido que contiene azufre es sustituido por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta, un aminoácido que contiene hidroxi es sustituido por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta, un aminoácido ácido es 5 sustituido por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta, un aminoácido alcalino es sustituido por un aminoácido alcalino en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta, o un aminoácido monocarboxílico dibásico es sustituido por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a TGF-beta.
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Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" es ilustrada por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparragina, y (6) lisina, arginina e histidina. Al realizar tales sustituciones, es importante, cuando sea posible mantener el esqueleto de cisteína esbozado en la Figura 1. 15
Los cambios de aminoácidos conservativos en el gen de la proteína de unión a TGF-beta pueden ser introducidos sustituyendo nucleótidos por los nucleótidos citados en el SEC ID NO: 1. Tales "variantes de aminoácido conservativo" pueden ser obtenidas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, y similar (ver Ausubel (1995) en las páginas 8-10 a 8-22, y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A 20 Practical Approach (IRL Press 1991)). La capacidad funcional de tales variantes puede ser determinada utilizando un método normalizado, tal como el análisis descrito en la presente memoria. Alternativamente, un polipéptido de la proteína de unión a TGF-beta variante puede ser identificado mediante la capacidad de unirse específicamente a anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta.
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Se pueden realizar análisis de deleción rutinarios de moléculas de ácido nucleico para obtener "fragmentos funcionales" de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la proteína de unión a TGF-beta. Como ilustración, se pueden digerir moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos del SEC ID NO: 1 con la nucleasa Bal31 para obtener una serie de deleciones encajadas. Después los fragmentos son insertados en vectores de expresión en un marco de lectura apropiado, y los 30 polipéptidos expresados son aislados y sometidos a ensayo en cuanto a su actividad, o en cuanto a la capacidad de unirse a anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta. Una alternativa a la digestión con exonucleasa es la utilización de la mutagénesis dirigida al oligonucleótido para introducir deleciones o codones de terminación para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, se pueden sintetizar fragmentos concretos de un gen de la proteína del unión a TGF-beta utilizando la 35 reacción en cadena de la polimerasa.
Los mecanismos normalizados para el análisis funcional de las proteína son descritos, por ejemplo, por Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Content et al., "Espression and preliminay deletion analysis of the 42 kea 2-5A synthesise induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, 40 Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation, Vol. I, Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270-29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295, 1995; y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1, 1996. 45
La presente descripción también contempla fragmentos funcionales de un gen de la proteína de unión a TGF-beta que tienen cambios de aminoácidos conservativos.
Un gen variante de la proteína de unión a TGF-beta puede ser identificado basándose en la estructura 50 determinando el nivel de identidad con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los SEC ID NO: 1, 5, 9, 11, 13, o 15 y 2, 6, 10, 12, 14, o 16, como se ha discutido antes. Un enfoque alternativo para identificar un gen variante basándose en la estructura consiste en determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen de la proteína de unión a TGF-beta variantes puede hibridar en condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEC ID NO: 55 1, 5, 9, 11, 13, o 15, o una porción de la misma de una longitud de al menos 15 o 20 nucleótidos. Como ilustración de las condiciones de hibridación restrictivas, se puede unir una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de la proteína de unión a TGF-beta variante con un fragmento de una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de la SEC ID NO: 1 en un tampón que contenga, por ejemplo, 5xSSPE (1xSSPE = cloruro de sodio 180 mM, fosfato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,7), 5xsolución 60 de Denhardt (100xDenhardt = seralbúmina bovina al 2% (p/v), Ficoll al 2% (p/v), polivinilpirrolidona al 2% (p/v) y SDS al 0,5% incubado durante la noche a 55-60C. Los lavados post-hibridación con una alta restricción se realizan típicamente en 0,5xSSC (1xSSC = cloruro de sodio 150 mM, citrato de sodio 15 mM) o en 0,5xSSPE a 55-60C.
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Con independencia de la secuencia de nucleótidos concreta de un gen de la proteína de unión a TGF-beta variante, el gen codifica un polipéptido que puede ser caracterizado por su actividad funcional, o por la
capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta. Más específicamente, los genes de la proteína de unión a TGF-beta variantes codifican polipéptidos que muestran al menos un 50%, y preferiblemente, más del 60, 70, 80 o 90% de la actividad de los polipéptidos codificados por el gen de la proteína de unión a TGF-beta humano descrito en la presente memoria. 5
4. Producción de la proteína de unión a TGF-beta en Células Cultivadas
Para expresar un gen de una proteína de unión a TGF-beta, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe ser conectada operablemente a secuencias reguladoras que controlan la expresión 10 transcripcional en un vector de expresión y después introducida en una célula anfitriona. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores e intensificadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencia reguladoras de la traducción y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que portan el vector de expresión.
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Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína foránea en células eucarióticas contienen típicamente (1) elementos de ADN procariótico que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un anfitrión bacteriano; (2) elementos de ADN eucariótico que controlan el inicio de la transcripción, tal como un promotor, y (3) elementos de ADN que controlan la 20 maduración de los transcritos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación.
Las proteínas de unión a TGF-beta de la presente descripción son expresadas preferiblemente en células de mamífero. Entre los ejemplos de las células anfitrionas de mamífero se incluyen células de riñón de 25 mono verde Africano (Vero; ATCC CRL 1587, células de riñón embriónico humano ((293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21; ATCC CRL 8544), células de riñón caninas (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster Chino (CHO-K1; ATCC CCL61), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células 30 embriónicas de ratóns (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para un anfitrión mamífero, las señales reguladoras de la transcripción y la traducción pueden derivar de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de simios, o similar, en los cuales las señales reguladoras están asociadas con un gen concreto que tiene un elevado nivel de expresión. 35 Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales también pueden ser obtenidas de genes de mamíferos, tales como los genes de actina, colágeno, miosina, y metalotioneína.
Entre las secuencias reguladoras transcripcionales se incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN. Entre los promotores eucarióticos adecuados se incluyen el promotor del 40 gen de la metalotioneína I de ratón [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. I:273,1982], el promotor TK del Herpes virus [McKnight, Cell 31:355, 1982], el promotor temprano de SV40 [Benoist et al., Nature 290:304,1981], el promotor del virus del Sarcoma de Rous [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:6777, 1982], el promotor de citomegalovirus [Foecking et al., Gene 45, 101, 1980], y el promotor del virus del tumor mamario de ratón (ver, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in 45 Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Alternativamente, se puede utilizar un promotor procariótico, tal como el promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T3 para controlar la expresión del gen de la proteína de unión a TGF-beta en células de 50 mamífero si el promotor procariótico está regulado por un promotor eucariótico (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485, 1991).
Los genes de la proteína de unión a TGF-beta también pueden ser expresados en células bacterianas, de levadura, de insectos o de plantas. Los promotores adecuados que pueden ser utilizados para expresar 55 los polipéptidos de la proteína de unión a TGF-beta en un anfitrión procariótico son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas de T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PI del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, del choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, y lacZ de E. coli, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de 60 pBR322, y el promotor CAT del gen de la cloramfenicol acetil transferasa. Los promotores procarióticos han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed. (Benjamin Cummins 1987), y por Ausubel et al., (1995).
Entre los anfitriones procarióticos preferidos se incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Entre las cepas 65 adecuadas de E. coli se incluyen BL21(DE3), BL2(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4, DH5, DH51, DH51F', DH51MCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38,RR1,
Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (ver, por ejemplo, Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Entre las cepas adecuadas de Bacillus subtilis se incluyen BR151, YB886, M1119, M1120, y B170 (ver, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (Ed.) (IRL Press 1985)).
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Los métodos para expresar proteínas en anfitriones procarióticos son bien conocidos para los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.) página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, 10 Inc. 1995); y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).ç
El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz de introducir genes de la proteína de unión a TGF-beta clonada en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados están basados en el virus de la 15 polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV), y contienen promotores bien conocidos tales como el promotor 70 de la proteína del choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor del gen temprano inmediato (ie-1) y el promotor 39K temprano retardado de Autographa californica, el promotor p10 de baculovirus, y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Entre las células anfitrionas e insecto adecuadas se incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular de ovario de 20 pulpa de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, y Sf21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila. Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus son proporcionadas por Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", en Methods in Molecular Biology, Volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Prees, Inc. 1991), por Patel et al., "The 25 baculovirus expression system", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al., (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), y por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). 30
Entre los promotores para la expresión en levaduras se incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato quinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa), y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levaduras y son asequibles fácilmente. Entre estos vectores se incluyen vectores basados en YIp, tales como YIp5, 35 vectores YRp, tales como YRp17, vectores YEp tales como YEp13 y vectores YCp, tales como YCp19. Un experto en la técnica apreciará que hay una amplia variedad de vectores adecuados para la expresión en células de levadura.
Los vectores de expresión también pueden ser introducidos en protoplastos de plantas, tejidos vegetales 40 intactos, o células vegetales aisladas. Los métodos generales para cultivar tejidos vegetales son proporcionados, por ejemplo, por Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
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Un vector de expresión puede ser introducido en células anfitrionas utilizando una variedad de mecanismos normalizados incluyendo la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por liposomas, el reparto mediado por microproyectiles, la electroporación, y similares. Preferiblemente, las células transfectadas son seleccionadas y propagadas para proporcionar células anfitrionas recombinantes que comprendan el vector de expresión integrado establemente en el genoma de la célula 50 anfitriona. Las técnicas para introducir vectores en células eucarióticas y las técnicas para seleccionar tales transformantes estables utilizando un marcador seleccionable dominante son descritas, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991). Los métodos para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insectos, y vegetales también son proporcionados por Ausubel (1995). 55
Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína foránea producida por un sistema celular de mamífero son proporcionados por ejemplo, por Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en "Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Los mecanismos normalizados para recuperar la proteína producida por un 60 sistema bacteriano son proporcionados, por ejemplo, por Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los métodos establecidos para el aislamiento de proteínas recombinante a partir de un sistema de baculovirus son descritos por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995). 65
Más generalmente, la proteína de unión a TGF-beta puede ser aislada mediante mecanismos
normalizados, tales como la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaños, la cromatografía de intercambio iónico, la HPLC y similares. Se pueden idear variaciones adicionales en el aislamiento y la purificación de la proteína de unión a TGF-beta por parte de aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta, obtenidos como se describe más abajo, para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad. 5
5. Producción de Anticuerpos para las proteínas de unión a TGF-beta
Los anticuerpos para la proteína de unión a TGF-beta pueden ser obtenidos, por ejemplo, utilizando el producto de una expresión como antígeno. Los anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta 10 particularmente útiles se "unen específicamente" con la proteína de unión a TGF-beta de los SEC ID Núm. 2, 6, 10, 12, 14, o 16, pero no a otras proteínas de unión a TGF-beta tales como Dan, Cerberus, SCGF, o Gremlin. Los anticuerpos de la presente invención (incluyendo los fragmentos de los mismos) son monoclonal. El anticuerpo puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, y puede ser por ejemplo un anticuerpo IgG, por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, o IgA. Puede ser de origen 15 animal, por ejemplo de mamífero, y puede ser por ejemplo un anticuerpo de ratón, de rata, humano o de otro primate. Cuando se desea el anticuerpo puede ser un anticuerpo internalizante.
Los anticuerpos policlonales para la proteína de unión a TGF-beta recombinante pueden ser preparados utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Green et al. 20 "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995)). Aunque los anticuerpos policlonales se originan típicamente en animales tales como ratas, ratones, conejos, cabras, u ovejas, un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF 25 de la presente invención también puede derivar de un anticuerpo de primate sub-humano. Los mecanismos generales para originar anticuerpos útiles para el diagnóstico y la terapia en babuinos fueron encontrados, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicación de patente internacional Núm. WO 91/11465 (1991), y en Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990.
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El anticuerpo debe comprender al menos un dominio de la región variable. El dominio de la región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una secuencia de aminoácidos hipervariable responsable de la unión al antígeno embebido en una secuencia marco. En términos generales el dominio de la región variable (V) puede ser cualquier ordenación adecuada de dominios variables de la cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. 35 De este modo por ejemplo el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL donde estos sean capaces de unirse independientemente con una afinidad aceptable. Alternativamente el dominio de la región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL, o VL-VL en los cuales las cadenas VH y VL están asociadas no covalentemente (abreviado en adelante como FV). Cuando se desea, no obstante, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente o bien directamente, por ejemplo por 40 medio de un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un ligador, por ejemplo un ligador peptídico, para formar un dominio de cadena sencilla (abreviado en adelante como scFV).
El dominio de la región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión diseñada del mismo. Por versión diseñada se quiere significar un dominio de la región variable que ha 45 sido creado utilizando mecanismos de diseño de ADN recombinante. Entre tales versiones diseñadas se incluyen aquellas creadas por ejemplo a partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Entre los ejemplos concretos de este tipo se incluyen aquellos dominios de la región variable diseñados que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un anticuerpo y el resto 50 del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de la región variable puede estar anclado covalentemente en un aminoácido C-terminal a al menos otro dominio del anticuerpo o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo cuando un dominio VH está presente en el dominio de la región variable este puede estar conectado a un dominio 55 CH1 de la inmunoglobulina o un fragmento del mismo. De un modo similar un dominio VL puede estar conectado a un dominio CK o un fragmento del mismo. De este modo por ejemplo el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en el que el dominio de unión al antígeno contiene dominios VH y VL asociados conectados en sus extremos C a un dominio CH1 y CK respectivamente. El dominio CH1 puede ser prolongado con aminoácido adicionales, por ejemplo para proporcionar un dominio de la región bisagra 60 como el encontrado en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como los dominios CH2 y CH3 del anticuerpo.
Otra forma de fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden ser 65 obtenidos construyendo genes que codifiquen la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes son preparados, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región
variable a partir de ARN de células productoras de anticuerpos (ver, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods en Enzimology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge Universisty Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), 5 página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Anticuerpos monoclonales para su uso en la invención pueden ser preparados mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión celular Fragmentos, pueden ser derivados de allí utilizando cualquier mecanismo químico normalizado adecuado p.ej., reducción o escisión enzimática y/o digestión, 10 por ejemplo mediante tratamiento con pepsina.
Más específicamente, los anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta monoclonales pueden ser generados utilizando una variedad de técnicas. Los anticuerpos monoclonales de roedor para antígenos específicos pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (ver, por 15 ejemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; y Coligan et al. (eds.) Current Protocols in Immunology, 1:2.5-1.2.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expresed in E. coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al., (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).
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En resumen, se pueden obtener anticuerpos monoclonales inyectando en ratones una composición que comprende un producto génico de la proteína de unión a TGF-beta, verificando la presencia de producción de anticuerpo mediante la separación de una muestra de suero, separación del bazo para obtener B-linfocitos, fusión de los B-linfocitos con células de mieloma para producir hibridomas, clonación de los hibridomas, selección de clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivo de los clones 25 que producen los anticuerpos para el antígeno, y aislamiento de lo anticuerpos de los cultivos de hibridoma.
Además, un anticuerpo anti-proteína de unión a TGF-beta de la presente invención puede derivar de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos son obtenidos a partir de ratones 30 transgénicos que han sido diseñados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una sensibilización antigénica. En esta técnica, se introducen elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embriónicas que contienen desorganizaciones redireccionadas de los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera endógenas. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los 35 ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas de escrutinio de anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; y Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994.
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Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de mecanismos bien establecidos. Entre tales mecanismos de aislamiento se incluyen la cromatografía de afinidad con Proteína A-Sepharose, la cromatografía de exclusión pro tamaños, y la cromatografía de intercambio iónico (ver, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular 45 Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Human Press, Inc. 1992)).
Para usos concretos, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos anti-proteína de unión a TGF-beta. Tales fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos mediante digestión con 50 pepsina o papaína de los anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Como ilustración, se pueden producir fragmentos de anticuerpo mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede ser escindido adicionalmente utilizando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' de 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede ser realizada utilizando un grupo bloqueador para los grupos sulfhidrilo que 55 resultan de la escisión de los enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática en la que se utiliza pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos son descritos por ejemplo, por Goldenberg, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., en Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967), y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 60 2.10-2.10.4.
También se pueden utilizar otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera monovalentes, escisión adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, con tal que los fragmentos se unan al 65 antígeno que sea reconocido por el anticuerpo intacto.
Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo recombinante o diseñado genéticamente obtenido mediante el uso mecanismos de ADN recombinante que implican la manipulación y la re-expresión del ADN que codifica las regiones variable y/o constante del anticuerpo. Semejante ADN es conocido y/o es fácilmente asequible de genotecas de ADN incluyendo por ejemplo genotecas de anticuerpos de fagos (ver Chiswell, D.J. y McCafferty, J. Tibtech. 10 80-84 (1992)) o se puede sintetizar cuando se desee. Los 5 procedimientos de la biología molecular y/o la química normalizados pueden ser utilizados para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear restos cisteína, para modificar, añadir o suprimir otros aminoácidos o dominios según se desee.
A partir de en la presente memoria, uno o más vectores de expresión replicables que contengan el ADN y 10 pueden ser preparados y utilizados para transformar una línea celular apropiada, p.ej. una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una línea bacteriana, p.ej. de E. coli, en la cual tendrá lugar la producción del anticuerpo. Con el fin de obtener una transcripción y una traducción eficaz, una secuencia de ADN de cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, concretamente un promotor y una secuencia líder conectada operablemente a la secuencia de dominio variable. Los 15 métodos concretos para producir anticuerpos de esta manera son generalmente bien conocidos y utilizados rutinariamente. Por ejemplo, describen procedimientos de la biología molecular básicos Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); la secuenciación del ADN se puede realizar como describen Sanger et al. (PNAS 74, 5463, (1977)) y el manual de secuenciación plc de Amersham International; y la mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo según el método de 20 Kramer et al. (Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)) y el manual Anglian Biotechnology Ltd. Adicionalmente, existen numerosas publicaciones, que detallan técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante la manipulación del ADN, la creación de vectores de expresión y la transformación de células apropiadas, por ejemplo como revisan Mountain A y Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, UK) y en la Memoria de la Patente 25 Internacional Núm. WO 91/09967.
Cuando se desea, el anticuerpo según la invención puede tener una o más moléculas efectoras o informadoras ancladas a él y la invención se amplía a tales proteínas modificadas. Las moléculas efectoras o informadoras pueden estar ancladas al anticuerpo a través de cualquier cadena lateral de 30 aminoácido disponible, aminoácido amino terminal o, cuando esté presente un grupo funcional carbohidrato localizado en el anticuerpo, siempre que, por supuesto, este no afecte adversamente a las propiedades de unión y a la utilidad eventual de la molécula. Entre los grupos funcionales concretos se incluyen, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo, carboxilo o aldehído libre. El anclaje del anticuerpo y la molécula o las moléculas efectoras y/o informadoras puede ser logrado vía tales grupos y 35 un grupo funcional apropiado en las moléculas efectoras o informadoras. La conexión puede ser directa o indirecta, por medio de grupo espaciadores o formadores de puentes.
Entre las moléculas efectoras se incluyen, por ejemplo, agentes antineoplásicos, toxinas (tales como toxinas farmacéuticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas p.ej. ricina 40 y fragmentos de la misma), proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p.ej., ADN, ARN y fragmentos de los mismos, polímeros de origen natural y sintético p.ej. polisacáridos y polímeros de polialquileno tales como poli(etilenglicol) y derivados del mismo, radionúclidos, concretamente radioyoduro, y metales quelantes. Entre los grupos informadores adecuados se incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes o compuestos que pueden ser 45 detectados mediante espectroscopía de RMN o ESR.
Entre los agentes antineoplásicos concretos se incluyen agentes citotóxicos y cistostáticos, por ejemplo, agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (p.ej., clorambucil, melfalan, mecloretamina, ciclofosfamida, o mostaza de uracilo) y los derivados de los mismos, trietilenfosforamida, 50 trietilentiofosforamida, busulfan, o cisplatino; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (p.ej. sulfato de bleomicina), doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicinas (p.ej. mitomicina C), actinomicinas (p.ej. dactinomicinas), plicamicina, calicamicina y derivados de la misma, o esperamicina y derivados de la misma, inhibidores mitóticos, tales como etoposido, vincristina o 55 vinblastina y derivados de los mismos, alcaloides, tales como elipticina; polioles tales como taxicina-I o taxicina-II, hormonas tales como andrógenos (p.ej. dromostanolona o testolactona), progestinas (p.ej. acetato de megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (p.ej., difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (p.ej. tamoxifeno); antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como hidroxiurea, hidrazinas, tales como procarbazina, o imidazoles, 60 tales como dacarbazina.
Son grupos efectores particularmente útiles la calicamicina y los derivados de la misma (ver por ejemplo las Memorias de Patente Surafricanas Núm. 85/8794, 88(8127 y 90/2839).
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Entre los metales quelados se incluyen quelatos de metales di- o tri-positivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Entre los ejemplos concretos de tales metales se incluyen tecnecio (Tc),
renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general el metal es preferiblemente un radionúclido. Entre los radionúclidos concretos se incluyen Tc99m, Re186, Co58, Co60, Cu67, Au195, Au199, Au110, Pb203, Bi206, Bi207, In111, Ga67, Ga68, Y88, Y90, Tb160, Gd153 y Sc47.
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El metal quelado puede ser por ejemplo uno de los tipos de metal quelado anteriores con cualquier agente quelante polidentado adecuado, por ejemplo poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres, (p.ej. éteres corona y derivados de los mismos), poliamidas, porfirinas, y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de agente quelante dependerá del metal que se use. Un grupo particularmente útil de 10 agentes quelantes en los productos conjugados según la invención, no obstante, son las poliaminas acíclicas y cíclicas, especialmente los ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo el ácido dietilen-triaminopentaacético y derivados de los mismos, y aminas macrocíclicas, p.ej., derivados tri-aza y tetra-aza cíclicos (por ejemplo como se describe en la Memoria de la Patente Internacional Núm. WO 92/22583); y poliamidas, especialmente desferrioxiamina y derivados de la misma. 15
De este modo por ejemplo cuando se desee utilizar un grupo tiol en el anticuerpo como punto de anclaje esto puede ser logrado por medio de una reacción con un grupo reactivo con tiol presente en la molécula efectora o informadora. Entre los ejemplos de tales grupos se incluyen un ácido o éster a-halocarboxílico, p.ej., yodoacetamida, una imida, p.ej., maleimida, una vinilsulfona, o un disulfuro. Estos y otros 20 procedimientos de unión adecuados se describen generalmente y más concretamente en las Memorias de Patente Internacional Núm. WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 y WO 89/01476.
Análisis para seleccionar moléculas que incrementn la densidad ósea
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Como se ha discutido antes, la presente descripción proporciona métodos para seleccionar y/o aislar compuestos que son capaces de incrementar la densidad ósea. Por ejemplo, en un aspecto de la presente descripción se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, que comprende las etapas de (a) mezclar una molécula seleccionada con proteína de unión a TGF-beta y un miembro seleccionado de la familia de proteínas 30 TGF-beta, (b) determinar si la molécula seleccionada estimula la señalización por la familia de proteínas del TGF-beta, o inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de proteínas del TGF-beta. En ciertas realizaciones de la descripción, la molécula intensifica la capacidad del TGF-beta para funcionar como regulador positivo de la diferenciación de las células del mesénquima.
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En otros aspectos de la descripción, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, comprendiendo las etapas de (a) exponer una molécula seleccionada a células que expresen la proteína de unión a TGF-beta y (b) determinar si la expresión (o actividad) de la proteína de unión a TGF-beta de dichas células expuestas disminuye, y determinar a partir de allí si el compuesto es capaz de incrementar el contenido mineral del 40 hueso. En una realización de la descripción las células son seleccionadas del grupo formado por hueso humano normal transformado espontáneamente o no transformado de biopsias óseas y osteoblastos de hueso parietal de rata. Semejantes métodos pueden ser completados en una variedad de formatos de análisis incluyendo, por ejemplo, la Inmunoelectroforesis Contracorriente (CIEP), los Radio-inmunoanálisis, las Radioinmunoprecipitaciones, los Análisis de Absorción con Enzima Ligada (ELISA), y 45 los análisis sandwich (ver, las Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.376.110 y 4.486.530, ver también Antibodies: A Laboratory Manual, supra).
Las realizaciones representativas de tales análisis son proporcionadas más abajo en los Ejemplos 5 y 6. En resumen, un miembro de la familia de la súper-familia de TGF-beta o una proteína de unión de TGF-50 beta se une primero a una fase sólida, seguido de la adición de una molécula candidato. El miembro de la familia marcado de la súper-familia del TGF-beta o la proteína de unión a TGF-beta es añadido después al análisis, la fase sólida lavada, y la cantidad de miembro de la súper-familia de TGF-beta unido o marcado o de proteína de unión a TGF-beta del soporte sólido es determinada. Las moléculas que son adecuadas para su uso en el aumento del contenido mineral del hueso como se describe en la presente memoria son 55 aquellas moléculas que disminuyen la unión de proteína de unión a TGF-beta a un miembro o miembros de la súper-familia del TGF-beta de una manera estadísticamente significativa. Obviamente, los análisis adecuados para su uso en la presente descripción no deben estar limitados a las realizaciones descritas en los Ejemplos 2 y 3. En particular, se pueden alterar numerosos parámetros, por ejemplo uniendo el TGF-beta a una fase sólida, o eliminando completamente la fase sólida. 60
En otros aspectos de la descripción, se proporcionan métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, que comprende las etapas de (a) exponer una molécula seleccionada a células que expresan el TGF-beta y (b) determinar si la actividad de TGF-beta a partir de dichas células expuestas es alterada, y determinar a partir de allí si el compuesto es 65 capaz de incrementar el contenido mineral del hueso. De un modo similar a los métodos descritos antes, se pueden utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar los cambios de expresión de la proteína
de unión a TGF-beta debidos a un compuesto de ensayo seleccionado.
Por ejemplo, en un aspecto de la presente descripción se proporcionan métodos para determinar su una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, que comprenden las etapas de (a) mezclar una molécula seleccionada con proteína de unión a TGF-beta y un miembro 5 seleccionado de la familia de proteínas de TGF-beta, (b) determinar si la molécula seleccionada sobre-regula la señalización de la familia de proteínas del TGF-beta, o inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a la familia de proteínas del TGF-beta. En ciertas realizaciones de la descripción, la molécula intensifica la capacidad del TGF-beta para funcionar como regulador positivo de la diferenciación de las células del mesénquima. 10
De un modo similar a los métodos descritos antes, se puede utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar la estimulación de TGF-beta debida a un compuesto de ensayo seleccionado. Uno de tales métodos representativos se proporciona más abajo en el Ejemplo 6 (ver también Durham et al., Endo, 136:1374-1380. 15
En otros aspectos más de la presente descripción, se proporcionan los métodos para determinar si una molécula seleccionada es capaz de incrementar el contenido mineral del hueso, comprendiendo la etapa de determinar si una molécula seleccionada inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta al hueso, o un análogo del mismo. Según se utiliza en la presente memoria, se debe entender que el hueso o los 20 análogos del mismo hacen referencia a hidroxiapatita o una superficie compuesta por una forma en polvo de hueso, hueso triturado o hueso intacto. De un modo similar a los métodos descritos antes, se pueden utilizar una amplia variedad de métodos para evaluar la inhibición de la localización de la proteína de unión a TGF-beta en la matriz ósea. Uno de tales métodos representativos se proporciona más abajo en el Ejemplo 7. 25
Se debe observar que mientras los métodos citados en la presente memoria pueden hacer referencia al análisis de una molécula de ensayo individual, la presente descripción no debe estar limitada a ellos. En particular, la molécula seleccionada puede estar contenida en una mezcla de compuestos. Por tanto, los métodos citados pueden comprender adicionalmente la etapa de aislar una molécula que inhiba la unión 30 de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta.
Moléculas candidato
Se pueden analizar una amplia variedad de moléculas en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de la 35 proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia de TGF-beta. Entre los ejemplos representativos que se discuten con más detalle más abajo, se incluyen moléculas orgánicas, proteínas o péptidos, y moléculas de ácido nucleico. Aunque debe ser evidente a partir del estudio de más abajo que las moléculas candidato descritas en la presente memoria pueden ser utilizadas en los análisis descritos en la presente memoria, debe ser fácilmente evidente que tales moléculas también pueden ser utilizadas en 40 una variedad de entornos de diagnóstico y terapéuticos.
1. Moléculas Orgánicas
Se pueden analizar numerosas moléculas orgánicas en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de la 45 proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta.
Por ejemplo, en una realización de la descripción se pueden seleccionar moléculas orgánicas adecuadas o bien a partir de una genoteca química, donde los agentes químicos son analizados individualmente, o bien a partir de genotecas químicas combinatorias en los que se analizan múltiples compuestos de una 50 vez, después se descifran para determinar y aislar la mayor parte de los compuestos activos.
Entre los ejemplos representativos de tales genotecas químicas combinatorias se incluyen los descritos por Agrafiotis et al., "System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties", Patente de los Estados Unidos Núm. 5.463.564; Armstrong, R.W., "Synthesis of combinatorial 55 arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses", WO 95/02566; Baldwin, J.J. et al., "Sulfonamide derivatives and their use", WO 95/24186; Baldwin, J.J. et al., "Combinatorial dihydrobenzopyran library", WO 95/30642; Brenner, S., "New kit for preparing combinatorial libraries", WO 95/16918; Chenera, B. et al., "Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds", WO 95/16712; Ellman, J.A., "Solid phase and combinatorial synthesis of 60 benzodiazepine compounds on a solid support", Patente de los Estados Unidos Núm. 5.288.514; Felder, E. et al., "Novel combinatorial compound libraries", WO 95/16209; Lerner, R. et al., "Encoded combinatorial chemical libraries", WO 93/20242; Pavia, M.R. et al., "A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library", WO 95/04277; Summerton, J.E. y D.D. Weller, "Morpholino-subunit combinatorial library and method", Patente 65 de los Estados Unidos Núm. 5.506.337; Holmes, C., "Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones, Metathiazonones, and Derivatives therof", WO 96/00148; Phillips, G.B. y G.P. Wei, "Solid-
phase Synthesis of Benzimidazoles", Tet. Letters 37:4887-90, 1996; Ruhland, B. et al., "Solid-supported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse -Lactams", J. Amer. Chem. Soc. 111:253-4, 1996; Look, G.C. et al., "The Indentification of Cyclooxigenase-I Inhibitors form 4-Thiazolidonone Combinatorial Libraries", Bioorg. and Med. Chem. Letters 6:707-12, 1996.
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2. Proteínas y Péptidos
Del mismo modo se pueden utilizar una amplia gama de proteínas y péptidos como moléculas candidato para inhibidores de la unión de la proteína de unión a un miembro de la familia del TGF-beta.
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a. Genotecas Peptídicas Combinatorias
Las moléculas peptídicas que son supuestos inhibidores de la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta pueden ser obtenidas a través del escrutinio de genotecas peptídicas combinatorias. Tales genotecas pueden ser preparadas por un experto en la técnica (ver p.ej., 15 Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.528.266 y 4.359.535, y Publicación del Tratado de Cooperación de Patentes Núm. WO 92/15679, WO 92/15677, WO 90/07862, WO 90/02809, o adquiridos de fuentes asequibles comercialmente (p.ej. New England Biolabs Ph.D.® Phage Display Peptide Library Kit).
b. Anticuerpos 20
Los anticuerpos que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta puede ser fácilmente preparada dada la descripción proporcionada en la presente memoria. En el contexto de la presente descripción, se entiende que los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos anti-idiotípicos y fragmentos de anticuerpos (p.ej., 25 Fab, y F(ab')2, regiones variables Fv, o regiones determinantes de la complementariedad). Como se ha estudiado antes, se entiende que los anticuerpos son específicos contra la proteína de unión a TGF-beta, o contra un miembro de la familia del TGF-beta específico, si se unen con una Ka mayor o igual a 107 M, preferiblemente mayor o igual a 108 M-1, y no se unen a otras proteínas de unión a TGF-beta, o, se unen con una Ka menor o igual a 106 M-1. Además, los anticuerpos de la presente descripción deben bloquear o 30 inhibir la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia de unión a TGF-beta.
La afinidad de un anticuerpo monoclonal o un patrón de unión; así como la inhibición de la unión se pueden determinar fácilmente por un experto normal en la técnica (ver, Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949). 35
En resumen, los anticuerpos monoclonales pueden ser generados fácilmente por un experto en la técnica a partir de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, diversas aves, conejos, ratones o ratas. Típicamente, la proteína de unión a TGF-beta o un péptido único de la misma de 13-20 aminoácidos (conjugado preferiblemente con hemocianina de lapa ojo de cerradura mediante 40 entrecruzamiento con glutaraldehído) es utilizada para inmunizar al animal a través de inyecciones intraperitoneales, intramusculares, intraoculares, o subcutáneas, junto con un coadyuvante tal como el coadyuvante completo o incompleto de Freund. Después de varias inmunizaciones de refuerzo, se recogen las muestras de suero y se someten a ensayo en cuanto a la reactividad con la proteína o péptido. Los antisueros policlonales particularmente preferidos darán una señal en uno de estos análisis 45 que es al menos tres veces mayor que el fondo. Una vez que el título del animal ha alcanzado una meseta en términos su reactividad con la proteína, se pueden obtener fácilmente cantidades mayores de antisueros o bien mediante tomas de sangre semanales, o bien mediante exanguinación del animal.
Los anticuerpos monoclonales también pueden ser generados fácilmente utilizando mecanismos 50 convencionales (ver las Patentes de los Estados Unidos Núm. RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439, y 4.411.993, que se incorporan a la presente memoria como referencia; ver también Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kenett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, que también se incorporan a la presente memoria como referencia). 55
En resumen, en una realización se inmuniza un sujeto animal tal como una rata o ratón con la proteína de unión a TGF-beta o una porción de la misma como se ha descrito antes. La proteínas puede ser mezclada con un coadyuvante tal como coadyuvante completo o incompleto de Freund con el fin de incrementar la respuesta inmune resultante. Entre una y tres semanas después de la inmunización inicial el animal puede 60 ser inmunizado de nuevo con otra inmunización de refuerzo, y sometido a ensayo en cuanto a la reactividad con la proteína utilizando los análisis descritos antes. Una vez que el animal ha alcanzado una meseta en su reactividad con la proteína inyectada, éste se sacrifica, y los órganos que contienen un gran número de células B tales como el bazo y los nódulos linfáticos se cosechan.
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Las células que se obtienen del animal inmunizado pueden ser inmortalizadas mediante infección con un virus tal como el virus de Epstein-Barr (EBV) (ver Glasky and Reading, Hybridoma 8(4):377-389, 1989).
Alternativamente, en una realización preferida, las suspensiones del bazo y/o los nódulos linfáticos cosechados son fusionadas con una célula de mieloma adecuada con el fin de crear un "hibridoma" que secrete anticuerpo monoclonal. Entre las líneas de mieloma adecuadas se incluye, por ejemplo, NS-1 (ATCC Núm. TIB 18), y P3X63 - Ag 8.653 (ATCC Núm. CRL 1580).
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Tras la fusión, las células son colocadas en placas para el cultivo de tejidos conteniendo un medio adecuado, tal como RPMI 1640, o DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), así como ingredientes adicionales, tales como suero bovino fetal (FBS, es decir, de Hyclone, Logan, Utah, o JRH Biosciences). Adicionalmente, el medio debe contener un reactivo que permita selectivamente el crecimiento de células de bazo y mieloma fusionadas tales como HAT 10 (hipoxantina, aminopterina, y timidina) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Después de aproximadamente siete días, las células fusionadas resultantes o hibridomas pueden ser rastreados con el fin de determinar la presencia de anticuerpos que sean reactivos contra la proteína de unión a TGF-beta (dependiendo del antígeno utilizado), y que bloqueen o inhiban la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta. 15
Se pueden utilizar una amplia variedad de análisis para determinar la presencia de anticuerpos que sean reactivos contra las proteínas de la presente invención, incluyendo por ejemplo la inmunoelectroforesis contracorriente, los radioinmunoanálisis, las radioinmunoprecipitaciones, los análisis de absorción con enzima ligada (ELISA), los análisis de transferencia puntual, las transferencias Western, la 20 inmunoprecipitación, los análisis de inhibición o competitivos, y los análisis sandwich (ver las Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.376.110 y 4.486.530; ver también Antibodies: A Laboratory manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Tras numerosas diluciones y re-análisis clónicas, se puede aislar un hibridoma que produzca anticuerpos reactivos contra la proteína deseada.
Asimismo se pueden utilizar otras técnicas para construir anticuerpos monoclonales (ver William D. Huse 25 et al., "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281, Diciembre de 1989; ver también L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, Agosto de 1989; ver también Michelle Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to 30 Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9, Enero 1990). Estas referencias describen un sistema comercial asequible de Stratagene (La Jolla, California) que permite la producción de anticuerpos por medio de mecanismos de recombinación. En resumen, el ARNm es aislado de una población de células B, y utilizado para crear genotecas de expresión de ADNc de immunoglobulinas de cadena pesada y ligera en los vectores ImmunoZap(H) e ImmunoZap(L). Estos vectores pueden ser rastreados 35 individualmente o expresados simultáneamente para formar fragmentos Fab o anticuerpos (ver Huse et al., supra; ver también Sastry et al., supra). Las placas positivas pueden ser convertidas con posterioridad en un plásmido no lítico que permita un elevado nivel de expresión de los fragmentos de anticuerpo monoclonal a partir de E. coli.
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De un modo similar, también se pueden construir porciones o fragmentos, tales como fragmentos Fab y Fv, de anticuerpos utilizando mecanismos de digestión enzimática o de recombinación de ADN convencionales para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo que se une específicamente. En una realización, los genes que codifican la región variable de un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de interés son ampliados utilizando cebadores nucleotídicos para la 45 región variable. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto normal en la técnica, o pueden ser adquiridos de fuentes asequibles comercialmente. Stratagene (La Jolla) vende cebadores para regiones variables de ratón y de humano incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL y CL. Estos cebadores pueden ser utilizados para amplificar las regiones variables de la cadena pesada o ligera, que pueden ser insertadas después en vectores tales como ImmunoZAP® H o 50 ImmunoZAP® L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden ser introducidos después en E. coli, levaduras, o sistemas de expresión basados en mamíferos. Utilizando estos mecanismos, se pueden producir grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla conteniendo una fusión de los dominios VH y VL (ver Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Además, semejantes técnicas pueden ser utilizadas para cambiar un anticuerpo "de ratón" por un anticuerpo "humano", sin alterar la especificidad de unión del 55 anticuerpo.
Una vez que se han obtenido anticuerpos adecuados, éstos pueden ser aislados o purificados por medio de muchos mecanismos bien conocidos por los expertos normales en la técnica (ver Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Entre los 60 mecanismos adecuados se incluyen columnas de afinidad de péptidos o proteínas, HPLC o RP-HPLC, purificación en columnas de proteína A o proteína G, o cualquier combinación de estos mecanismos.
c. Proteínas de unión a TGF-beta mutantes
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Como se describe en la presente memoria y más abajo en los Ejemplos (p.ej., Ejemplos 8 y 9), las versiones alteradas de la proteína de unión a TGF-beta que compiten con la capacidad de la proteína de
unión a TGF-beta nativa para bloquear la actividad de un miembro de la familia de l TGF-beta concreto deben conducir a un incremento de la densidad ósea. De este modo, los mutantes de la proteína de unión a TGF-beta que se unen al miembro de la familia del TGF-beta pero no inhiben la función del miembro de la familia del TGF-beta satisfarían el criterio. Las versiones mutantes deben competir eficazmente con las funciones inhibidoras endógenas de la proteína de unión a TGF-beta. 5
d. Producción de proteínas
Aunque en la presente memoria se proporcionan varios genes (o porciones de los mismos), se debe entender que en el contexto de la presente descripción, la referencia a uno o más de estos genes incluye 10 los derivados de los genes que son sustancialmente similares a los genes (y, cuando sea apropiado, las proteínas (incluyendo péptidos y polipéptidos) que están codificadas por los genes y sus derivados). Según se utiliza en la presente memoria, se cree que una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente similar" si: (a) la secuencia de nucleótidos está derivada de la región codificante de los genes descritos antes e incluye, por ejemplo, porciones de la secuencia o variaciones alélicas de las secuencias 15 comentadas antes, o alternativamente, codifica una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta, (b) la secuencia de nucleótidos es susceptible de hibridación con las secuencias de nucleótidos de la presente invención en condiciones moderadamente restrictivas, altamente restrictivas o muy restrictivas (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); o (c) las secuencias de ADN son 20 degeneradas como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (a) o (b). Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria incluye secuencias tanto complementarias como no complementarias, siempre que las secuencias satisfagan de otro modo los criterios expuestos en la presente memoria. En el contexto de la presente descripción, unas condiciones altamente restrictivas representan condiciones de hibridación normalizadas (p.ej., 5XSSPE, SDS al 0,5% 25 a 65C, o equivalente).
La estructura de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria puede ser pronosticada a partir de los productos de la traducción primarios utilizando la función de trazado del carácter hidrófobo, por ejemplo, de P/C Gene o Intelligenetics Suite (Intelligenetics, 30 Mountain View, California), o de acuerdo con los métodos descritos por Kyte y Doolittle (J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982).
Las proteínas de la presente descripción pueden ser preparadas en forma de sales ácidas o alcalinas, o en forma neutra. Además, se pueden modificar los restos aminoácido individuales mediante oxidación o 35 reducción. Además, se pueden realizar diversas sustituciones, deleciones, o adiciones en las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico, cuyo efecto neto es conservar o intensificar o reducir adicionalmente la actividad biológica de la proteína mutante o de tipo natural. Por otra parte, debido a la degeneración del código genético, por ejemplo, puede haber una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos. 40
Entre otros derivados de las proteínas descritas en la presente memoria se incluyen los productos conjugados de las proteínas junto con otras proteínas o polipéptidos. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la síntesis de proteínas de fusión N-terminales o C-terminales que pueden ser añadidas para facilitar la purificación o identificación de proteínas (ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.851.341, 45 ver también, Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Alternativamente, se pueden construir proteínas de fusión tales como Flag/proteína de unión a TGF-beta con el fin de ayudar a la identificación, expresión y análisis de la proteína.
Las proteínas de la presente descripción pueden ser construidas utilizando una amplia variedad de 50 mecanismos descritos en la presente memoria. Adicionalmente, se pueden introducir mutaciones en loci concretos sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligadura a fragmentos que contienen una secuencia natural. Tras la ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución, o deleción deseada. 55
Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis de sitio específico (o de segmento específico) dirigidas al oligonucleótido para proporcionar un gen alterado que tenga codones concretos alterados según la sustitución, deleción, o inserción requerida. Los métodos ejemplares de elaboración de las alteraciones mostradas antes son descritas por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al., (Gene 60 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero 1985, 12-19); Smith et al., (Genetic Engineering; Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y Sambrook et al., (supra). Los derivados por deleción o truncamiento de proteínas (p.ej. una porción extracelular soluble) también pueden ser construidos utilizando sitios para endonucleasas de restricción convenientes adyacentes a la deleción deseada. Después de la restricción, los salientes pueden ser rellenados, y el ADN religado. Los métodos ejemplares de elaboración de 65 alteraciones mostrados antes son descritos por Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Las mutaciones que se realizan en las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción conservan preferiblemente el marco de lectura de las secuencias codificantes. Además, las mutaciones no crearán preferiblemente regiones complementarias que hibriden para producir estructuras de ARNm secundarias, tales como bucles u horquillas, que afectarían adversamente a la traducción de ARNm. Aunque se puede pre-determinar el sitio de la mutación, no es necesario que la naturaleza de la mutación sea pre-5 determinada per se. Por ejemplo, con el fin de seleccionar características óptimas de los mutantes en un sitio dado, se puede realizar una mutagénesis al azar en el codón diana y los mutantes expresados rastreados en cuanto a una actividad biológica indicativa. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en loci concretos sintetizando oligonucleótidos que contengan una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan la ligadura a fragmentos de la secuencia natural. Tras la 10 ligadura, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución, o deleción de aminoácidos deseada.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de la presente descripción también pueden ser construidas utilizando mecanismos de mutagénesis por PCR, mutagénesis química (Drinkwater y 15 Klinedinst, PNAS 83:34022-3406, 1986), mediante la incorporación errónea de un nucleótido forzada (p.ej., Liao y Wise Gene 88:107-111, 1990), o mediante el uso de oligonucleótidos mutagenizados al azar (Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989).
La presente descripción también proporciona la manipulación y la expresión de los genes descritos antes 20 cultivando células anfitrionas que contienen un vector capaz de expresar los genes descritos antes. Entre tales vectores o constructos de vectores se incluyen moléculas de ácido nucleico derivadas de ADNc o sintéticas que codifican la proteína deseada, que están conectadas operablemente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados. Los elementos reguladores adecuados pueden estar derivados de una variedad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, virales, de mamífero, 25 de insecto, o vegetales. La selección de los elementos reguladores apropiados depende de una de las células anfitrionas seleccionadas, y puede ser completada fácilmente por un experto normal en la técnica. Entre los ejemplos de los elementos reguladores se incluyen: un promotor y un intensificador transcripcionales o una secuencia de unión a la ARN polimerasa, un terminador transcripcional, y una secuencia de unión al ribosoma, incluyendo una señal de inicio de la traducción. 30
Las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas descritas antes pueden ser fácilmente expresadas por una amplia variedad de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, incluyendo células bacterianas, de mamífero, levaduras u otros hongos, virales, de insecto, o vegetales. Los métodos para transformar o transfectar tales células para expresar el ADN foráneo son bien 35 conocidos en la técnica (ver, p.ej., Itakura et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.704.362; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978; Murray et al., Patente de los Estados Unidos Núm.4.801.542; Upshall et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.935.349; Hagen et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.784.950; Axel et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.399.216; Goeddel et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.766.075; y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory 40 Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; para células vegetales ver Czako y Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994; y Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992).
Entre las células anfitrionas bacterianas adecuadas para llevar a cabo la presente invención se incluyen E. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, 45 y Staphylococcus, así como muchas otras especies bacterianas bien conocidas por un experto normal en la técnica. Entre los ejemplos representativos de las células anfitrionas bacterianas se incluyen DH5α (Stratagene, La Jolla, California).
Los vectores de expresión bacteriana comprenden preferiblemente un promotor que funcione en la célula 50 anfitriona, uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, y un origen de replicación bacteriano. Entre los promotores representativos se incluye la -lactamasa (penicilinasa) y el sistema promotor de la lactosa (ver Chang et al., Nature 275:615, 1978), el promotor de la ARN polimerasa de T7 (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) el promotor lambda (Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990), el promotor trp (Nichols y Yanofsky, Meth. In Enzymology 101::155, 1983) y el promotor tac (Russell et al., Gene 20:231, 55 1982). Entre los marcadores seleccionables representativos se incluyen diversos marcadores de resistencia a antibióticos tales como los genes de resistencia a kanamicina o ampicilina. Muchos plásmidos adecuados para transformar células anfitrionas son bien conocidos en la técnica, incluyendo entre otros, pBR322 (ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), los plásmidos de pUC pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (ver Messing, Meth. in Enzimology 101:20-77, 1983 y Vieira y Messing, Gene 19:259-268, 1982), 60 y pNH8A, pNH16a, pNH18a, y Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, California).
Entre las células anfitrionas de levaduras y hongos adecuadas para llevar a cabo la presente invención se incluyen, entre otros, Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, los géneros Pichia o Kluyveromyces y diversas especies del género Aspergillus (McKnight et al., Patente de los Estados 65 Unidos Núm. 4.935.349). Entre los vectores de expresión adecuados para las levaduras y hongos se incluyen, entre otros, YCp50 (ATCC Núm. 37419) para levaduras, y el vector de clonación de amdS pV3
(Turnbull, Bio/Technology 7:169, 1989), YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-108, 1978) y derivados de los mismos.
Entre los promotores preferidos para su uso en levaduras se incluyen los promotores de genes glicolíticos 5 de levaduras (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-934, 1982) o genes de la alcohol deshidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., (eds.), pág. 355, Plenum Nueva York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol, 101:192-201, 1983). Entre los ejemplos útiles de los promotores de hongos se incluyen aquellos derivados de los genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tales como el promotor adh3 10 (McKnight et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985). Las unidades de expresión también pueden incluir un terminador transcripcional. Un ejemplo de un terminador adecuado es el terminador adh3 (McKnight et al., ibid., 1985).
Como con los vectores bacterianos, los vectores de levadura incluirán generalmente un marcador 15 seleccionable, que puede ser uno de los numerosos genes que muestran un fenotipo dominante para el cual existe un análisis fenotípico para permitir la selección de los transformantes. Los marcadores seleccionables preferidos son aquellos que complementan la auxotrofia de la célula anfitriona, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten a una célula utilizar fuentes de carbono específicas, e incluyen leu2 (Broach et al., ibid.), ura3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979), o his3 (Struhl et al., ibid.). Otro 20 marcador seleccionable adecuado es el gen cat, que confiere resistencia al cloramfenicol a células de levadura.
Las técnicas para transformar hongos son bien conocidas en la literatura, y han sido descritas, por ejemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978), Yelton et al. 25 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984), y Russell (Nature 301:167-169, 1983). El genotipo de la célula anfitriona puede contener un defecto genético que sea complementado por el marcador seleccionable presente en el vector de expresión. La elección de un anfitrión y un marcador seleccionable concretos está dentro del nivel del experto normal en la técnica.
30
Los protocolos para la transformación de levaduras son bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Por ejemplo, se puede completar fácilmente o bien la preparación de esferoplastos de levadura con ADN (ver Hinnen et al., PNAS USA 75:1929, 1978) o mediante tratamiento con sales alcalinas tales como LiCl (ver Itoh et al., J. Bacteriology 153:163, 1983). La transformación de hongos también se puede llevar a cabo utilizando polietilenglicol como describen Cullen et al., (Bio/Technology 5:369,1987). 35
Entre los vectores virales se incluyen aquellos que comprenden un promotor que dirige la expresión de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una proteína deseada como se ha descrito antes. Se puede utilizar una amplia variedad de promotores en el contexto de la presente invención, incluyendo por ejemplo, promotores tales como MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR, promotores adenovirales 40 (Ohno et al., Science 265:781-784, 1994), el promotor/intensificador de la fosfotransferasa de neomicina, el promotor del parvovirus tardío (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), el promotor TK del Herpes, el promotor de SV40, el intensificador/promotor del gen IIa de la metalotioneína, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus, y el promotor tardío inmediato de citomegalovirus. En las realizaciones particularmente preferidas de la descripción, el promotor es un promotor específico del tejido 45 (ver, p.ej., WO 91/02805; EP 0.415.731; y WO 90/07936). Entre los ejemplos representativos de los promotores específicos de tejidos adecuados se incluyen el promotor de la enolasa específica neural, el promotor del factor de crecimiento beta derivado de plaquetas, el promotor de la proteína morfogénica del hueso, el promotor de la alfa1-quimerina humana, el promotor de la sinapsina I y el promotor de la sinapsina II. Además de los promotores indicados antes, se pueden utilizar otros promotores específicos 50 de virus (p.ej., promotores retrovirales, (incluyendo los indicados antes, así como otros tales como los promotores del HIV), promotores específicos de la hepatitis, el herpes (p.ej., EBV), y bacterianos, fúngicos o parasíticos (p.ej., malaria) con el fin de elegir como diana una célula o tejido específico que esté infectado con un virus, bacteria, hongo o parásito.
55
Entre las células de mamífero adecuadas para llevar a cabo la presente descripción se incluyen, entre otros COS, CHO, SaOS, osteosarcomas, KS483, MG-63, osteoblastos primarios, y estroma de médula ósea de humano o mamífero. Entre los vectores de expresión en mamíferos para su uso en la realización de la presente descripción se incluirán un promotor capaz e dirigir la transcripción de un gen clonado o un ADNc. Entre los promotores preferidos se incluyen promotores virales y promotores celulares. Entre los 60 promotores específicos del hueso se incluyen la sialo-proteína ósea y el promotor de la osteocalcina. Entre los promotores virales se incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985), el promotor tardío inmediato de citomegalovirus, el promotor de SV40 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, metalotioneína-1, adenovirus E1a. Entre los promotores celulares se incluyen el promotor de la metalotioneína-1 de ratón (Palmiter et 65 al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.579.821), un promotor VK de ratón (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983; Grant et al., Nucl. Acids Res. 15:5496, 1987) y un promotor VH de
ratón (Loh et al., Cell 33:85-93, 1983). La elección del promotor dependerá, al menos en parte, del nivel de expresión deseado o de la línea celular receptora que vaya a ser transfectada.
Tales vectores de expresión también pueden contener un grupo de sitios de empalme de ARN localizados aguas abajo del promotor y aguas arriba de la secuencia de ADN que codifica el péptido o la proteína de 5 interés. Los sitios de empalme de ARN preferidos pueden ser obtenidos a partir de adenovirus y/o genes de inmunoglobulina. También se encuentra contenida en el vector de expresión una señal de poliadenilación localizada aguas abajo de la secuencia codificante de interés. Entre las señales de poliadenilación adecuadas se incluyen las señales de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región E1B de Adenovirus 5 y el terminador del 10 gen de la hormona de crecimiento humana (De Noto et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981). Los vectores de expresión pueden incluir una secuencia líder viral no codificante, tal como el líder tripartito de Adenovirus 2, localizado entre el promotor y los sitios de empalme del ARN. Entre los vectores preferidos se pueden incluir también secuencias intensificadoras, tales como el intensificador de SV40. Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias que codifican los ARN Va de adenovirus. Los vectores de 15 expresión adecuados pueden ser obtenidos a partir de fuentes comerciales (p.ej., Stragene, La Jolla, California).
Los constructos vectores que comprenden secuencias de ADN clonadas pueden ser introducidos en células de mamífero, por ejemplo, mediante transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 20 14:725; Corsar y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham y Vand der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), o transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987). Para identificar células que tengan integrado establemente el ADNc clonado, generalmente se introduce un marcador seleccionable en las células junto con el gen o el ADNc de interés. Entre los 25 marcadores seleccionables preferidos para su uso en células de mamífero cultivadas se incluyen los genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Los marcadores seleccionables amplificables preferidos son el gen DHFR y el gen de resistencia a la neomicina. Los marcadores seleccionables son revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, 30 Stoneham, Massachusetts.
Las células de mamífero que contienen un vector adecuado se dejan crecer durante un período de tiempo, típicamente 1-2 días, para empezar a expresar la secuencia o las secuencias de ADN de interés. La selección del fármaco es aplicada después para seleccionar el crecimiento de las células que están 35 expresando el marcador seleccionable de una manera estable. Para las células que han sido transfectadas con un marcador amplificable, seleccionable se puede incrementar la concentración de fármaco por etapas para seleccionar el número de copias de las secuencias aumentado de las secuencias clonadas, incrementando de ese modo los niveles de expresión. Las células que expresan las secuencias introducidas son seleccionadas y rastreadas en cuanto a la producción de la proteína de interés en la 40 forma deseada o al nivel deseado. Las células que satisfacen estos criterios pueden ser clonadas después y aumentadas a escala para la producción.
Los protocolos para la transfección de células de mamífero son bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Entre los métodos representativos se incluyen la transfección con fosfato de calcio, la 45 electroporación, la lipofección, la transfección mediada por fusión retroviral, adenoviral y de protoplastos (ver Sambrook et al., supra). Asimismo pueden ser absorbidos constructos vectores desnudos por las células musculares u otras células adecuadas después de la inyección en el músculo de un mamífero (u otro animal).
50
Numerosas células anfitrionas de insecto conocidas en la técnica pueden resultar útiles en la presente descripción, a la luz de la memoria sujeto. Por ejemplo, el uso de baculovirus como vectores para expresar secuencias de ADN heterólogo en células de insecto ha sido revisado por Atkinson et al. (Pestic. Sci. 28:215-224, 1990).
55
Numerosas células anfitrionas vegetales conocidas en la técnica pueden asimismo resultar útiles en la presente descripción a la luz de la memoria sujeto. Por ejemplo, el uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al. (J. Biosci. (Bangadore) 11:47-58, 1987).
60
En aspectos relacionados de la presente descripción, las proteínas de la presente descripción pueden ser expresadas en un animal transgénico cuyas células germinales y células somáticas contienen un gen que codifica la proteína deseada y que están conectadas operablemente a un promotor eficaz para la expresión del gen. Alternativamente, de una manera similar se puede preparar animales transgénicos que carezcan del gen deseado (p.ej., ratones con un gen desactivado). Semejantes transgénicos pueden ser 65 preparados en una variedad de animales no humanos, incluyendo ratones, ratas, conejos, ovejas, perros, cabras y cerdos (ver Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985, Palmiter et al., Science 222:809-814,
1983, Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985, Palmiter y Brinster, Cell 41:343-345, 1985, y Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.175.383, 5.087.751, 4.736.866, 5.387.742, 5.347.075, 5.221.778, y 5.175.384). Brevemente, un vector de expresión, incluyendo una molécula de ácido nucleico que va a ser expresada junto con secuencias para el control de la expresión situadas adecuadamente, es introducido en pronúcleos de huevos fertilizados, por ejemplo, mediante microinyección. La integración del 5 ADN inyectado es detectada mediante análisis de transferencia de ADN desde las muestras de tejido. Se prefiere que el ADN introducido sea incorporado a la línea germinal del animal de manera que pase a la progenie del animal. La expresión específica de tejidos puede ser lograda por medio del uso de un promotor específico de tejidos, o por medio del uso de un promotor inducible, tal como el gen promotor de la metalotioneína (Palmiter et al., 1983, ibid.), que permita la expresión regulada del transgen. 10
Las proteínas pueden ser aisladas, entre otros métodos, cultivando sistemas anfitriones y vectores adecuados para producir los productos de traducción recombinantes de la presente invención. Los sobrenadantes de tales líneas celulares, o las inclusiones de proteína o las células completas en las que la proteína es excretada al sobrenadante, pueden ser preparados después mediante una variedad de 15 procedimientos de purificación con el fin de aislar las proteínas deseadas. Por ejemplo, el sobrenadante puede ser concentrado primero utilizando filtros de concentración de proteínas asequibles comercialmente, tales como una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la concentración, el producto concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación adecuada tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-proteína unido a un soporte adecuado. Alternativamente, se pueden 20 emplear resinas de intercambio aniónico o catiónico con el fin de purificar la proteína. Como alternativa adicional, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) para purificar adicionalmente la proteína. Otros métodos de aislamiento de las proteína de la presente descripción son bien conocidos por los expertos en la técnica.
25
Se cree que una proteína está "aislada" en el contexto de la presente descripción si no se detecta otra proteína (no deseada) conforme al análisis de SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie. En otras realizaciones, de la descripción, la proteína deseada puede ser aislada de manera que no se detecte otra proteína (no deseada) conforme al análisis de SDS-PAGE seguido de tinción con plata.
30
3. Moléculas de Acido Nucleico
En otros aspectos de la descripción, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que son capaces de inhibir la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta. Por ejemplo, en una realización de la descripción se proporcionan moléculas oligonucleotídicas antisentido que inhiben 35 específicamente la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la proteína de unión a TGF-beta (ver generalmente, Hirashima et al., en Molecular Biology of ARN: New Perspectives (M. Inouye y B.S. Dudock, eds., 1987 Academic Press, San Diego, pág. 401); Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S. Cohen, ed., 1989 MacMillan Press, Londres); Stein y Cheng, Science 261:1004-1012, 1993; WO 95/10607; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.359.051; WO 92/06693; y EP-A2-612844). 40 Brevemente, tales moléculas son construidas de manera que sean complementarias, y sean capaces de formar pares de bases de Watson-Crick, con una región de secuencia de ARNm de la proteína de unión a TGF-beta transcrita. El ácido de doble hebra resultante interfiere en la posterior maduración del ARNm, evitando de ese modo la síntesis de proteínas (ver Ejemplo 10).
45
En otros aspectos de la descripción se proporcionan ribozimas que son capaces de inhibir la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta. Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que "ribozimas" incluya moléculas de ARN que contengan secuencias antisentido para el reconocimiento específico, y una actividad enzimática de escisión del ARN. La hebra catalítica escinde un sitio específico en un ARN diana a una concentración mayor de la estequiométrica. Se pueden 50 utilizar una amplia variedad de ribozimas en el contexto de la presente descripción, incluyendo por ejemplo, la ribozima cabeza de martillo (por ejemplo, como describen Forster y Symons, Cell 48:211-220, 1987; Haseloff y Gerlach, Nature 328:596-600, 1988; Walbot y Bruening, Nature 334:196, 1988; Haseloff y Gerlach, Nature 334:585, 1988); la ribozima en horquilla (por ejemplo, como describen Haseloff et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.254.678, expedida el 19 de Octubre de 1993, y Hempel et al., 55 Solicitud de Patente Europea Núm. 0.360.257, publicada el 26 de Marzo de 1990); y ribozimas basadas en el ARN ribosomal de Tetrahymena (ver Cech et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.987.071). Las ribozimas de la presente descripción constan típicamente de ARN, pero también pueden estar compuestas por ADN, análogos de ácido nucleico (p.ej., fosforotioatos), o quiméricos de los mismos (p.ej., ADN/ARN/ARN). 60
4. Marcas
El producto génico o cualquiera de las moléculas candidato descritas antes y más abajo, pueden estar marcadas con una variedad de compuestos, incluyendo por ejemplo, moléculas fluorescentes, toxinas, y 65 radionúclidos. Entre los ejemplos representativos de moléculas fluorescentes se incluyen fluoresceína, proteínas Phycobili, tales como ficoeritrina, rodamina, rojo Texas y luciferasa. Entre los ejemplos
representativos de las toxinas se incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, proteína antiviral de Phytolacca americana ("pokeweed"), tritina, toxina de Sigella, y exotoxina A de Pseudomonas. Entre los ejemplos representativos de los radionúclidos se incluyen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89,Ru-97, Tc-99m, Ph-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 y Bi-212. Además, los anticuerpos descritos antes también pueden ser marcados o 5 conjugados con un pareja de un par de unión al ligando. Entre los ejemplos representativos se incluyen avidina-biotina, y riboflavina-proteína de unión a riboflavina.
Los métodos para conjugar o marcar las moléculas descritas en la presente memoria con las marcas representativas mostradas antes pueden ser fácilmente completados por un experto normal en la técnica 10 (ver Trichothecene Antibody Conjugate, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.744.981; Antibody Conjugate, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.106.951; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.018.884; Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.897.255; y Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.988.496; ver también 15 Inman, Methods In Enzymlogy, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jackoby y Wilchek (eds.), Academic Press, Nueva York, pág. 30, 1974; ver también Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications", Anal. Biochem. 171:1-32, 1988).
Composiciones farmacéuticas 20
Como se ha observado antes, la presente descripción también proporciona una variedad de composiciones farmacéuticas, que comprenden una de las moléculas descritas antes que inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta junto con un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable, excipientes o diluyentes. Generalmente, tales portadores 25 pueden ser no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Normalmente, la preparación de tales composiciones abarca combinar el agente terapéutico con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. La solución 30 salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seralbúmina no específica son diluyentes apropiados ejemplares.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser preparadas para su administración mediante una variedad de rutas diferentes. Además, las composiciones farmacéuticas 35 pueden ser colocadas en recipientes, junto con material de envasado que proporcione instrucciones referentes al uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, semejantes instrucciones incluirán una expresión tangible describiendo la concentración de reactivo, así como ciertas realizaciones, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (p.ej., agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica. 40
Tratamiento
La presente invención también proporciona el incremento del contenido mineral y la densidad mineral del hueso. En resumen, numerosas afecciones dan como resultado la pérdida de contenido mineral del 45 hueso, incluyendo por ejemplo, las enfermedades, la predisposición genética, los accidentes que producen la pérdida de uso de un hueso (p.ej. debido a una fractura), los agentes terapéuticos que afectan a la resorción ósea, o que eliminan células formadoras de hueso y el envejecimiento normal. Por medio del uso de las moléculas descritas en la presente memoria que inhiben la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta se pueden tratar o prevenir tales afecciones. 50 Según se utiliza en la presente memoria, se debe entender que el contenido mineral del hueso ha aumentado, si el contenido mineral del hueso ha aumentado de una manera estadísticamente significativa (p.ej., mayor de media desviación estándar), en un sitio seleccionado.
Una amplia variedad de afecciones que dan como resultado la pérdida de contenido mineral del hueso 55 pueden ser tratadas con las moléculas descritas en la presente memoria. Los pacientes con tales afecciones pueden ser identificados a través de la diagnosis clínica utilizando mecanismos bien conocidos (ver, p.ej., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.). Entre los ejemplos representativos de las enfermedades que pueden ser tratadas se incluyen las displasias, en las que existe un crecimiento o desarrollo anormal del hueso. Entre los ejemplos representativos de tales afecciones se incluyen 60 acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, enfermedad de Marfan, exostosis hereditaria múltiple, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoikilosis, lesiones escleróticas, fracturas, enfermedad periodontal, pseudoartrosis y osteomielitis piogénica.
65
Entre otras afecciones que pueden ser tratadas o evitadas se incluyen una amplia variedad de causas de osteopenia (es decir, una afección que ocasiona una desviación estándar mayor de uno de contenido
mineral o densidad del hueso por debajo del contenido mineral esquelético pico en la juventud). Entre los ejemplos representativos de tales afecciones se incluyen los estados anémicos, las afecciones causadas por esteroides, las afecciones causadas por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia en calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia y osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad crónica del hígado, senectud, estado post-menopáusico, oligomenorrea, 5 amenorrea, embarazo, diabetes melitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o desuso, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria y osteomalacia.
En un aspecto de la presente descripción proporciona, se puede incrementar el contenido mineral o la 10 densidad de hueso administrando a un animal de sanger caliente una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que inhibe la unión de la proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta. Entre los ejemplos de los animales de sangre caliente que se pueden tratar se incluyen tanto vertebrados como mamíferos, incluyendo por ejemplo, caballos, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas y ratones. Entre los ejemplos representativos de las moléculas terapéuticas se incluyen ribozimas, 15 genes de ribozimas, oligonucleótidos antisentido y anticuerpos (p.ej., anticuerpos humanizados).
En otros aspectos de la presente descripción se proporcionan métodos para incrementar la densidad de hueso que comprende la etapa de introducir en las células que anidan en el hueso un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de una proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la 20 familia del TGF-beta, y administrar las células que contienen el vector a un animal de sangre caliente. Brevemente, las células que anidan en el hueso pueden ser obtenidas directamente a partir del hueso de pacientes (p.ej., células obtenidas a partir de médula ósea tales como CD34+, osteoblastos, osteocitos, y similares), a partir de sangre periférica, o a partir de cultivos.
25
Un vector que dirige la expresión de una molécula que inhibe la unión de una proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta es introducido en las células. Entre los ejemplos representativos de los vectores adecuados se incluyen vectores virales tales como vectores virales del herpes (p.ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.288.641), vectores adenovirales (p.ej., WO 94/26914, WO 93/9191; Kolls et al., PNAS 91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24):11498-502, 1993; 30 Guzman et al., Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5(2):130-134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5):372-378, 1992; y Levrero et al., Gene 101(2):195-202, 1991), vectores virales adenoasociados (WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993), vectores de baculovirus, vectores de parvovirus 35 (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), vectores de poxvirus (Panicali y Paoletti, PNAS 79:4927-4931, 1982; y Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2):653-660, 1993), y retrovirus (p.ej., EP 0.415.731; WO 90/07936; WO 91/0285; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.219.740; WO 93/11239; WO 93/10218). Del mismo modo se pueden construir vectores virales que contengan una mezcla de elementos diferentes (p.ej., promotores, secuencias de la 40 envuelta y similares) de diferentes virus, o fuentes no virales. En varias realizaciones, se puede utilizar o bien el propio vector viral, o bien una partícula viral que contenga el vector viral en los métodos y composiciones descritos más abajo.
En otras realizaciones de la descripción , las moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula que 45 inhibe la unión de una proteína de unión a TGF-beta a un miembro de la familia del TGF-beta por sí mismas pueden ser administradas mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, la administración a asialomucoide (ASOR) conjugado con complejos de poli-L-lisina ADN (Cistano et al., PNAS 92122-92126, 1993), ADN unido a adenovirus muerto (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2):147-154, 1992), introducción mediada por citofectina (DMRIE-DOPE, Vical, California), inyección de ADN directa 50 (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); ligandos de ADN (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989); lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989); liposomas (Pickering et al., Circ. 89(1):13-21, 1994; y Wang et al., PNAS 84:7851-7855, 1987); bombardeo con microproyectiles (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991); y liberación directa de ácido nucleicos que codifican la propia proteína ya sea sola (Vile y Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993) o utilizando complejos de PEG-ácido 55 nucleico.
Entre los ejemplos representativos de las moléculas que pueden ser expresadas por los vectores de la presente descripción se incluyen ribozimas y moléculas antisentido, cada uno de las cuales se ha discutido con más detalle antes. 60
La determinación del contenido mineral del hueso incrementado puede ser resuelta directamente por medio del uso de los rayos x (p.ej., Dual Energy X-ray Absorptometry o "DEXA"), o mediante inferencia a través de marcadores de recambio óseo (fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, procolágeno de tipo 1, propéptido C' (PICP), y fosfatasa alcalina total; ver Comier, C., Curr. Opin. In Rheu. 65 7:243, 1995), o marcadores de resorción ósea (piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas tartrato-resistentes del plasma y galactosilhidroxilisina; ver Comier, supra). La
cantidad de masa ósea puede ser calculada a partir de los pesos corporales, o utilizando otros métodos (ver Guiness-Hey, Metab. Bone Dis. And Rel. Res. 5:177-181, 1984).
Como resultará evidente para un experto en la técnica, la cantidad y la frecuencia de la administración dependerán, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que esté 5 siendo tratada, de la respuesta deseada, de la condición del paciente, etcétera. Típicamente, las composiciones pueden ser administradas mediante una variedad de técnicas, como se ha indicado antes.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación.
Ejemplos 10
Ejemplos 1
Mapas de esclerosteosis para el brazo largo del cromosoma 17 humano
15
El cartografiado genético del defecto responsable de la esclerosteosis en humanos localizó el gen responsable de este trastorno en la región del cromosoma 17 humano que codifica un miembro novedoso de la familia de la proteína de unión a TGF-beta. En la esclerosteosis, el hueso esquelético presenta un incremento sustancial en la densidad mineral en relación con la de los individuos no afectados. El hueso de la cabeza también presenta un sobrecrecimiento. Los pacientes con esclerosteosis son generalmente 20 sanos aunque pueden mostrar grados variables de sindactilia al nacer y grados variables de compresión craneal y compresión nerviosa en el cráneo.
El análisis de conexión del defecto del gen asociado con la esclerosteosis fue realizado aplicando el método del cartografiado por homozigosidad a muestras de ADN recogidas de 24 familias de Afrikaaner 25 de Suráfrica en las cuales se producía la enfermedad. (Sheffield et al., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. "Identification of a Badet-Biedl syndrome locus on chromosome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping"). La población Afrikaaner de Suráfrica es generalmente homogénea; la población desciende de un pequeño número de fundadores que colonizaron el área hace varios siglos, y ha estado aislada por barreras geográficas y sociales desde su fundación. La 30 esclerosteosis es rara en todo el mundo fuera de la comunidad Afrikaaner, lo que sugiere que se encontraba presente una mutación en el gen en la población fundadora y ha aumentado de número junto con el crecimiento de la población. El uso del cartografiado de homozigosidad se basa en la suposición de que es probable que los marcadores del cartografiado del ADN adyacentes a un mutación recesiva sean homozigotos en los individuos afectados de familias consanguíneas y en poblaciones aisladas. 35
Se seleccionó un grupo de 371 marcadores microsatélites (Research Genetics, Set 6) de los cromosomas autosómicos para tipificar reservas de ADN de muestras de pacientes con esclerosteosis. Las muestras de ADN para este análisis procedían de 29 pacientes con esclerosteosis de 24 familias, 59 miembros de familias no afectadas y un grupo de individuos de control no emparentados de la misma población. Las 40 reservas constaban de 4-6 individuos, individuos afectados, individuos afectados de familias consanguíneas, padres y hermanos no afectados, o controles no emparentados. En las reservas de individuos no relacionados y en la mayor parte de las reservas con individuos afectados o miembros de la familia, los análisis de los marcadores demostraron numerosos tamaños de alelos para cada marcador. Un marcador, D17S1299, mostraba una indicación de homozigosidad: una banda en algunas de las 45 reservas de individuos afectados.
Las 24 familias con esclerosteosis fueron tipificadas con un total de 19 marcadores en la región D17S1299 (en 17q12-q21). Los individuos afectados de cada familia demostraron ser homozigotos en esta región, y 25 de los 29 individuos eran homozigotos para un haplotipo central; cada uno tenía los mismos alelos 50 entre D17S1787 y D17S930. Los otros cuatro individuos tenían un cromosoma que se emparejaba con este haplotipo y un segundo que no. En suma, los datos sugerían de modo convincente que esta región de 3 megabases contenía la mutación de la esclerosteosis. El análisis de la secuencia de la mayor parte de los exones de esta región de 3 megabases identificaba una mutación terminadora en la secuencia codificante de la proteína de unión a TGF novedosa (mutación C>T en la posición 117 del SEQ ID NO. 1 55 da como resultado un codón de terminación). Se demostró que esta mutación era única para los pacientes con esclerosteosis y los portadores de los descendientes de Afrikaaner. La identidad del gen fue confirmada adicionalmente identificando una mutación en su intrón (mutación A>T en la posición +3 del intrón) que da como resultado una maduración del ARNm inapropiada en un paciente no emparentado, individual con esclerosteosis diagnosticada. 60
Ejemplo 2
Especificidad de tejidos de la expresión del gen de la proteína de unión a TGF-beta
65
A. Expresión del Gen Beer Humano mediante RT-PCR
Se preparó un ADNc de primera hebra a partir de las siguientes muestras de ARN total utilizando un kit asequible comercialmente ("Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis", Life Technologies, Rockville, MD): cerebro humano, hígado humano, bazo humano, timo humano, placenta humana, músculo esquelético humano, tiroides humano, pituitaria humana, osteoblastos humanos (NHOst de Clonetics Corp., San Diego, CA), línea celular de osteosarcoma humano (Saos-2, ATCC# HTB-85), 5 hueso humano, médula ósea humana, cartílago humano, hueso de mono Vervet, Saccharomyces cerevisiae y monocitos de sangre periférica humana. Todas las muestras de ARN fueron adquiridas de una fuente comercial (Clontech, Palo Alto, CA), excepto las siguientes que fueron preparadas por la empresa: osteoblasto humano, línea celular de osteosarcoma humano, hueso humano, cartílago humano y hueso de mono Vervet. Estas muestras de ARN preparadas en la empresa fueron preparadas utilizando 10 un kit asequible comercialmente ("TRI Reagent", Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH).
La PCR fue realizada sobre estas muestras, y adicionalmente sobre una muestra genómica como control. El oligonucleótido Beer efector tenía la secuencia 5'-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEC ID NO: 19). El cebador oligonucleotídico Beer antisentido tenía la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' 15 (SEC ID NO: 20). Además, se realizó la PCR utilizando cebadores para el gen de la beta-actina humana, como control. El cebador oligonucleotídico de la beta-actina-efector tenía la secuencia 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA CC-3' (SEC ID NO: 21). El cebador oligonucleotídico de la beta-actina antisentido tenía la secuencia 5'-GAAGT CCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEC ID NO: 22). La PCR se realizó utilizando condiciones normalizadas en reacciones de 25 l, con una temperatura de hibridación de 61 20 grados Celsius. Se llevaron a cabo 32 ciclos de PCR con los cebadores Beer y veinticuatro ciclos con los cebadores de la beta-actina.
Tras la amplificación, se analizaron 12 l de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Ver Figura 2A. 25
B. Hibridación In-situ de ARN de Secciones Embrionarias de Ratón:
El ADNc Beer de ratón completo (Secuencia de ID Núm: 11) fue clonado en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en las direcciones antisentido y efectora utilizando el protocolo del fabricante. Los 30 transcritos efector y antisentido de ARNc marcado con S35-alfa-GTP fueron sintetizados utilizando reactivos de transcripción in vitro suministrados por Ambion, Inc. (Austin, TX). La hibridación in situ fue realizada de acuerdo con los protocolos de Lyons et al. (J. Cell Biol. 111:2427-2436, 1990).
La sonda de ARNc Beer de ratón detectaba un mensaje específico expresado en el tubo neural, los 35 blastemas, los vasos sanguíneos y los cartílagos de osificación de los embriones de ratón en desarrollo. El Panel A de la Figura 3 muestra expresión en la cresta ectodérmica apical (aer en sus siglas en inglés) del blastema (l en sus siglas en inglés), los vasos sanguíneos (bv en sus siglas en inglés) y el tubo neural (nt en sus siglas en inglés). El panel B muestra la expresión en el 4º ventrículo del cerebro (4). El Panel C muestra la expresión en la mandíbula (ma), en las vértebras cervicales (cv), el hueso occipital (oc), el 40 paladar (pa) y los vasos sanguíneos (bv). El panel D muestra la expresión en las costillas (r) y en la válvula del corazón (va). El panel A es una sección transversal de embrión de 10,5 dpc. El panel B es una sección sagital de embrión de 12,5 dpc y los paneles C y D son secciones sagitales de embriones de 15,5 dpc. Ba= arco branquial, h=corazón, te=telencéfalo (prosencéfalo), b=cerebro, f=masa frontal, g=intestino, j=mandíbula, li=hígado, lu=pulmón, ot=vesícula ótica, ao=, sc=médula espinal, skm=músculo esquelético, 45 na=seno nasal, th=timo, to=lengua, fl=miembro anterior, di=diafragma.
Ejemplo 3
Expresión y purificación de proteína beer recombinante 50
A. Expresión en células COS-1:
La secuencia de ADN que codifica la proteína Beer humana completa fue amplificada utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos para PCR. El cebador oligonucleotídico 5' tenía la secuencia 5'-55 AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (SEC ID NO: 23) y contenía un sitio para la enzima de restricción HindIII (en negrita) seguido de 19 nucleótidos del gen Beer empezando 6 pares de bases antes del presunto codón de iniciación amino terminal (ATG). El cebador oligonucleotídico 3' tenía la secuencia 5'-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCT TGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3' (SEC ID NO: 24) y contenía un sitio para la enzima de restricción HindIII (en negrita) seguido de un codón de terminación 60 complementario inverso (CTA) seguido del complemento inverso del epítopo FALG (subrayado, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) flanqueado por el complemento inverso de nucleótidos que codifican los 5 aminoácidos carboxi terminales de Beer. El producto de la PCR fue clonado con TA ("Original TA Cloning Kit", Invitrogen, Carlsbad, CA) y los clones individuales fueron rastreados mediante secuenciación del ADN. Un clon de secuencia verificada fue digerido después por HindIII y purificado sobre gel de agarosa 65 al 1,5% utilizando reactivos asequibles comercialmente ("Qiaquick Gel Extraction Kit", Qiagen Inc., Valencia, CA). Este fragmento fue ligado después al plásmido pcDNA3.1 tratado con fosfatasa, digerido
con HindIII y cultivado en placa sobre placas LB con 100 g/ml de ampicilina. Las colonias que portaban el recombinante deseado en la orientación apropiada fueron identificados mediante escrutinio basado en PCR, utilizando un cebador 5' correspondiente al sitio promotor/cebador de T7 en pcDNA3.1 y un cebador 3' con la secuencia 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEC ID NO: 25) que corresponde al complemento inverso de la secuencia BEER interna. La secuencia del fragmento clonado fue confirmada 5 mediante secuenciación del ADN.
Se utilizaron células COS-1 (ATCC #CRL-1650) para la transfección. Se transfectaron 50 g del plásmido de expresión pcDNA-Beer-Flag utilizando un kit asequible comercialmente siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante ("DEAE-Dextran Transfection Kit", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El 10 medio final tras la transfección era DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) conteniendo Suero Bovino Fetal al 0,1%. Al cabo de 4 días de cultivo, el medio se separó. La expresión de BEER recombinante fue analizada mediante SDS-PAGE y Transferencia Western utilizando anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). La purificación de la proteína BEER recombinante se realizó utilizando una columna de afinidad M2 anti-FLAG ("Mammalian Transient Expression System", Sigma-Aldrich Co., 15 St. Louis, MO). El perfil de la columna fue analizado vía SDS-PAGE y Transferencia Western utilizando anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG.
B. Expresión en células de insecto SF9
20
La secuencia del gen Beer humano fue amplificada utilizando la PCR con condiciones normalizadas y los siguientes cebadores:
Cebador efector: 5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAAT-GAT-3' (SEC ID NO: 26)
Cebador antisentido: 5'-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCTA 25
GGCGTTCTCCAGCTCGGC-3' (SEC ID NO: 27)
El ADNc resultante contenía la región codificante de Beer con dos modificaciones. La señal de secreción N-terminal se había eliminado y la etiqueta del epítopo FLAG (Sigma) estaba fusionada en marco con el extremo C-terminal del inserto. Se añadieron los sitios de clonación BamHI y HindIII y el gen fue 30 subclonado en el vector pMelBac (Invitrogen) para la transferencia a un vector baculoviral utilizando métodos normalizados.
Los baculovirus recombinantes que expresaban la proteína Beer fueron elaborados utilizando el kit de transfección Ba-N-blue (Invitrogen) y purificados según las instrucciones de los fabricantes. 35
Las células SF9 (Invitrogen) fueron mantenidas en medio TNM_FH (Invitrogen) conteniendo suero de ternera fetal al 10%. Para la expresión de la proteína, los cultivos de SF9 en matraces con extensor de centrifugación ("Spinner") a una MOI de más de 10. Las muestras de los medios y de las células fueron tomadas diariamente durante cinco días, y la expresión de Beer fue controlada mediante transferencia 40 Western utilizando anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG (Sigma) o antisuero policlonal de conejo anti-Beer.
Al cabo de cinco días las células SF9 infectadas con baculovirus fueron recogidas mediante centrifugación y la proteína asociada a las células fue extraída del sedimento celular utilizando un tampón de extracción 45 de elevada contenido de sal (NaCl 1,5 M, Tris 50 mM pH 7,5). El extracto (20 ml por 300 ml de cultivo) fue aclarado mediante centrifugación, sometido a diálisis tres veces frente a cuatro litros de solución salina tamponada con Tris (NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5), y aclarado de nuevo mediante centrifugación. Esta fracción con elevado contenido de sal fue aplicada a Hitrap Heparin (Pharmacia: 5 ml de volumen de lecho), lavada extensamente con solución salina tamponada con HEPES (HEPES 25 mM 7,5, NaCl 150 50 mM) y las proteínas unidas se hicieron eluir con un gradiente de NaCl 150 mM a NaCl 1200 mM. La elución de Beer fue observada a un NaCl aproximadamente 800 mM. Las fracciones que contenían Beer fueron suplementadas con glicerol al 10% y DTT 1 mM y congeladas a -80C.
Ejemplo 4 55
Preparación y ensayo de anticuerpos policlonales para Beer, Gremlin, y Dan
A. Preparación de antígeno
60
Las secuencias de ADN de Beer humana, Gremlin humana, y Dan humana fueron amplificadas utilizando métodos de PCR normalizados con los siguientes cebadores oligonucleotídicos:
Beer H
Efector: 5'-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3' (SEC ID NO: 28) 65
Antisentido: 5'-AGCATAAGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3' (SEC ID NO: 29)
Gremlin H.
Efector: 5'-GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3' (SEC ID NO: 30)
Antisentido: 5'-AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA-3' (SEC ID NO: 31)
5
Dan H.
Efector: 5'-ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3' (SEC ID NO: 32)
Antisentido: 5'-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTTCC-3' (SEC ID NO: 33)
En cada caso los cebadores enumerados amplificaban la región codificante completa menos la secuencia 10 señal de secreción. Entre estos se incluyen los sitios de restricción para la subclonación en el vector de expresión bacteriano pQE-30 (Qiagen Inc., Valencia) en los sitios BamHI/HindIII para Beer y Gremlin, y en los sitios SacI/HindIII para Dan. pQE30 contiene una secuencia codificante para la etiqueta 6x His en el extremo 5' de la región de clonación. Los constructos completados fueron transformados en E. coli cepa M-15/pRep (Qiagen Inc.) y los clones individuales fueron verificados por secuenciación. La expresión de la 15 proteína en M-15/pRep y la purificación (unión de la etiqueta de afinidad 6xHis a Ni-NTA acoplado con Sepharose) fueron realizadas como describen los fabricantes (Qiagen, The QIAexpressionist).
La proteína Beer derivada de E. coli fue recuperada en una cantidad significativa utilizando la solubilización en guanidina 6M y sometida a diálisis a 2-4M para evitar la precipitación durante el 20 almacenamiento. Las proteínas Gremlin y Dan fueron recuperadas en una cantidad superior con solubilización en guanidina 6M y una concentración de guanidina post-purificación de 0,5M.
B. Producción y ensayo de anticuerpos policlonales
25
Se produjeron anticuerpos policlonales para cada uno de los tres antígenos en anfitriones como conejo y pollo utilizando los protocolos normalizados (R & R Antibody, Stanwood, WA; protocolo normalizado para inmunización de conejo y recuperación de antisuero; Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, 1992. 11.37-11.41. Contributors Helen M. Cooper and Yvonne Paterson; el suero de pollo fue generado con Strategic Biosolutions Ramona, CA). 30
El antisuero de conejo y la fracción IgY de huevo de pollo fueron rastreados en cuanto a la actividad vía transferencia Western. Cada uno de los tres antígenos fue separado mediante PAGE y transferido a nitrocelulosa de 0,45 m (Novex, San Diego, CA). La membrana fue cortada en tiras conteniendo cada tira aproximadamente 75 ng de antígeno. Las tiras fueron bloqueadas en Blottig Grade Block al 3% (Bio-Rad 35 Laboratories, Hercules, CA) y lavadas 3 veces en 1X solución salina tamponada con Tris (TBS)/tampón Tween al 0,02%. El anticuerpo primario (tomas de sangre pre-inmunización, antisuero de conejo o IgY de huevo de pollo en diluciones que oscilaban de 1:100 a 1:10.000 en tampón de bloqueo) fue incubado con las tiras durante una hora con un balanceo suave. Una segunda serie de tres lavados 1X TBS/TWEEN al 0,02% estuvo seguida de una incubación de una hora con el anticuerpo secundario (anti-conejo de burro 40 conjugado con peroxidasa, Amersham Life Science, Piscataway, NJ; o anti-polli de burro conjugado con peroxidasa, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Se realizó un ciclo final de 3X lavados de 1X TBS/TWEEN al 0,02% y las tiras fueron desarrolladas con Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania).
45
C. Ensayo de reactividad cruzada con anticuerpo:
Siguiendo el protocolo descrito en la sección anterior, se incubaron tiras de Beer, Gremlin o Dan con diluciones (1:5000 y 1:10.000) de sus respectivos antisueros de conejo o IgY de huevo de pollo así como antisuero o Igy de huevo de pollo (diluciones 1:1000 y 1:5000) elaborados para los dos antígenos 50 restantes. Los niveles incrementados de anticuerpos que no se emparejaban fueron realizados para detectar la unión de baja afinidad por los anticuerpos que pueden ser observados solamente a una concentración elevada. El protocolo y la duración del desarrollo son los mismos para los tres eventos de unión utilizando el protocolo descrito antes. No se observaba reactividad cruzada con el antígeno para ninguno de los antígenos sometidos a ensayo. 55
Ejemplo 5
Interacción de Beer con proteínas de la superfamilia de TGF-beta
60
La interacción de Beer con las proteínas de diferentes ramas filogenéticas de la súper-familia del TGF- fue estudiada utilizando métodos de inmunoprecipitación. Se obtuvieron TGF-1, TGF-2, TGF-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y GDNF a partir de fuentes comerciales (R & D systems; Minneapolis, MN). Un protocolo representativo es el siguiente. Se sometió a diálisis Beer parcialmente purificada en solución salina tamponada con HEPES (HEPES 25 mM 7,5, NaCl 150 mM). Las inmunoprecipitaciones fueron 65 realizadas en 300 l de tampón IP (NaCl 150 mM, Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, -mercaptoetanol 1,4 mM, triton X-100 al 0,5%, y glicerol al 10%). Se aplicaron 30 ng de proteína BMP-5 humana recombinante
(R & D systems) a 15 l de matriz de afinidad FLAG (Sigma, St. Louis MO)) en presencia y ausencia de 500 ng de Beer marcada con el epítopo FLAG. Las proteínas fueron incubadas durante 4 horas @ 4C y después las proteínas asociadas con la matriz de afinidad fueron lavadas cinco veces en tampón IP (1 ml por lavado). Las proteínas unidas se hicieron eluir de la matriz de afinidad en 60 microlitros de 1X tampón de muestra SDS PAGE. La proteínas fueron resueltas mediante SDS PAGE y la Beer asociada con BMP-5 5 fue detectada mediante transferencia Western utilizando antisuero anti-BMP-5 (Research Diagnostics, Inc.) (ver la Figura 5).
Análisis de Unión al Ligando Beer
10
La proteína FLAG-Beer (20 ng) es añadida a 100 l de PBS/BSA al 0,2% y adsorbida en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos previamente recubierta con anticuerpo monoclonal anti-FLAG (Sigma; St Louis MO) y bloqueada con BSA en PBS al 10%. Esto se realiza a la temperatura ambiente durante 60 minutos. Esta solución de proteína se separa y los pocillos se lavan para separar la proteína no unida. Se añade BMP-5 a cada pocillo a concentraciones que oscilan de 10 pM a 500 nM en PBS/BSA 15 al 0,2% y se incuba durante 2 horas a la temperatura ambiente. La solución de unión se separa y la placa se lava tres veces con volúmenes de 200 l de PBS/BSA al 0,2%. Los niveles e BMP-5 son detectados utilizando anti-suero BMP-5 vía ELISA (F.M. Ausubel et al. (1998) Current Protocols in Mol. Biol. Vol. 2 11.2.1-11.2.22). La unión específica se calcula sustrayendo la unión no específica de la unión total y se analiza mediante el programa LIGAND (Munson y Podbard, Anal. Biochem., 107, pág. 220-239, (1980). 20
En una variación de este método, se diseña Beer y se expresa como una proteína de fusión con Fc human. Del mismo modo el BMP ligando se diseña y se expresa como una fusión con Fc de ratón. Estas proteínas son incubadas juntas y el análisis es realizado como describe Mellor et al. utilizando la detección de fluorescencia de resolución con el tiempo (G.W. Mellor et al., J. of Biomol Screening, 3(2) 91-99, 1998).
25
Ejemplo 6
Análisis de escrutinio para la inhibición de la unión de la proteína de unión a TGF-beta a miembros de la familia de TGF-beta
30
El análisis descrito antes se repite con dos excepciones. Primero, la concentración de BMP se mantiene fija a la Kd determinada previamente. Segundo, se añade una colección de candidatos antagonistas a una concentración fijada(20 M en el caso de las colecciones de moléculas orgánicas pequeñas y 1 M en estudios con anticuerpo). Entre estas moléculas candidato (antagonistas) de la unión a la proteína de unión de TGF-beta se incluyen compuestos orgánicos derivados de colecciones comerciales o internas 35 que representan diversas estructuras químicas. Estos compuestos son preparados en forma de soluciones de partida en DMSO y son añadidas a pocillos de análisis a < 1% del volumen final en condiciones de análisis normalizadas. Estas son incubadas durante 2 horas a la temperatura ambiente con BMP y Beer, la solución es separada y el BMP unido es cuantificado como se ha descrito. Los agentes que inhiben el 40% de la unión a BMP observada en ausencia de compuesto o anticuerpo son 40 considerados antagonistas de esta interacción. Estos son evaluados adicionalmente como inhibidores potenciales basándose en estudios de titulación para determinar sus constantes d inhibición y su influencia sobre la afinidad de unión de la proteína de unión a TGF-beta. Asimismo se pueden llevar a cabo análisis de control de la especificidad comparables para establecer el perfil de selectividad para el antagonista identificado a través de estudios en los que se utilizan análisis dependientes de la acción del 45 ligando BMP (p.ej., estudio de competición BMP/receptor de BMP).
Ejemplo 7
Inhibición de la localización de la proteína de unión a TGF-beta a la matriza del hueso 50
La evaluación de la inhibición de la localización en la matriz del hueso (hidroxiapatita) se realiza utilizando modificaciones del método de Nicolas (Nicolas, V. Calcif Tissue Int. 57:206, 1995). Brevemente, la proteína de unión a TGF-beta marcada con I125 es preparada como describe Nicolas (supra). La hidroxiapatita es añadida a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos equipada con una 55 membrana de filtración de polipropileno (Polyfiltronic, Weymouth MA). La proteína de unión a TGF-beta es añadida a albúmina al 0,2% en tampón PBS. Los pocillos que contienen la matriz son lavados 3 veces con este tampón. La proteína de unión a TGF-beta adsorbida se hace eluir utilizando NaOH 0,3M y se cuantifica.
60
La identificación del inhibidor de lleva a cabo por medio de la incubación de la proteína de unión a TGF-beta con moléculas de ensayo y aplicando la mezcla a la matriz como se ha descrito antes. La matriz se lava 3 veces con albúmina al 0,2% en tampón PBS. La proteína de unión a TGF-beta adsorbida se hace eluir utilizando NaOh 0,3M y se cuantifica. Los agentes que inhiben el 40% de la unión de la proteína de unión a TGF-beta observada en ausencia de compuesto o anticuerpo son considerados inhibidores de la 65 localización ósea. Estos inhibidores se caracterizan adicionalmente por los estudios dosis-respuesta para determinar sus constantes de inhibición y su influencia sobre la afinidad de unión de la proteína de unión a
TGF-beta.
Ejemplo 8
Construcción de mutantes de la proteína de unión a TGF-beta 5
A. Mutagénesis
Un ADNc de la proteína de unión a TGF-beta completo en pBluescript SK sirve como molde para la mutagénesis. En resumen, los cebadores apropiados (ver el estudio proporcionado en la presente 10 memoria) son utilizados para generar el fragmento de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando la polimerasa Vent DNA (New England Biolabs, Beverly, MA). La reacción en cadena de la polimerasa se hace funcionar durante 23 ciclos en tampones proporcionados por el fabricante utilizando una temperatura hibridación de 57C. El producto es expuesto después a dos enzimas de restricción y tras el aislamiento utilizando electroforesis en gel de agarosa, ligado de nuevo en 15 pRBP4-503 del cual se ha separado la secuencia de emparejamiento mediante digestión enzimática. La integridad del mutante es verificada mediante secuenciación del ADN.
B. Expresión en Células de Mamífero y Aislamiento de la Proteína de unión a TGF-beta mutante:
20
Los ADNc de la proteína de unión a TGF-beta mutante son transferidos al vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 descrito en el Ejemplo 3. Después de verificar la secuencia, los constructos resultantes son transfectados en células COS-1, y la proteína secretada es purificada como se describe en el EJEMPLO 3.
25
Ejemplo 9
Modelos animales
Generación de ratones transgénicos que expresan en exceso el gen Beer 30
El clon BAC de ~200 kilobases (kb) 15G5, aislado dla genoteca de ADN genómico de ratón CTIB (distribuido por Research Genetics, Huntsville, AL) fue utilizado para determinar la secuencia completa del gen Beer de ratón y sus regiones limítrofes 5' y 3'. Un fragmento SalI de 41 kb, conteniendo el cuerpo del gen completo, más ~17 kb de la secuencia limítrofe 5' y ~20 kb de la secuencia limítrofe 3' fue subclonado 35 en el sitio BamHI del vector cosmídico SuperCos1 (Stratagene, La Jolla, CA) y propagado en la cepa DH101B de E. coli. De este constructo cosmídico, un fragmento de restricción MluI-AvlII de 35 kb (Secuencia Núm. 6), incluyendo el gen Beer de ratón completo, así como la secuencia limítrofe de 17 kb y de 14 kb 5' y 3', respectivamente, fue purificado después en gel, utilizando medios convencionales, y utilizado para la microinyección en zigotos de ratón (DNX Transgenics; Patente de los Estados Unidos 40 Núm. 4.873.191). Los animales fundadores en los que el fragmento de ADN clonado había sido integrado al azar en el genoma fueron obtenidos a una frecuencia del 5-30% de las crías que nacen vivas. La presencia del transgen fue determinada realizando el análisis de transferencia Southern del ADN genómico extraído de una pequeña cantidad de tejido de ratón, tal como la punta de una cola. El ADN fue extraído utilizando el siguiente protocolo: el tejido fue digerido durante la noche a 55C en tampón de lisis 45 conteniendo NaCl 200 mM, Tris 100 mM pH 8,5, EDTA 5 mM, SDS al 0,2% y 0,5 mg/ml de Proteinasa K. Al día siguiente, el ADN fue extraído una vez con fenol/cloroformo (50:50), una vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y precipitado con etanol. Tras la re-suspensión en TE (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1,5 mM), 8-10 g de cada muestra de ADN fueron digeridos con una endonucleasa de restricción, tal como EcoRI, sometidos a electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nailon cargada, tal como 50 HybondN+ (Amersham, Arlington Heigths, IL). El filtro resultante fue hibridado después con un fragmento marcado radiactivamente de ADN derivado del locus del gen Beer de ratón, y susceptible de reconocer tanto un fragmento del locus del gen endógeno como un fragmento de un tamaño diferente derivado del transgen. Los animales fundadores fueron criados hasta ratones no transgénicos normales para generar un número suficiente de progenie transgénica y no transgénica en la cual determinar los efectos de la 55 sobre-expresión del gen Beer. Para estos estudios, animales de diversas edades (por ejemplo, 1, día, 3 semanas, 6 semanas,4 meses) son sometidos a numerosos análisis diferentes diseñados para averiguar la formación esquelética grosera, la densidad mineral del hueso, el contenido mineral del hueso, la actividad de osteoclastos y osteoblastos, el grado de osificación endocondral, la formación de cartílago, etc. La actividad transcripcional del transgen puede ser determinada extrayendo el ARN de diversos 60 tejidos, y utilizando un análisis de RT-PCR que obtenga ventaja de los polimorfismos de nucleótidos individuales entre la cepa de ratón de la cual deriva el transgen (129Sv/J) y la cepa de ratones utilizada para la microinyección de ADN [(C57BL5/J x SJL/J)F2].
Modelos animales II 65
Desorganización del gen Beer de ratón mediante recombinación homóloga
La recombinación homóloga en células madre (ES) embriónicas puede ser utilizada para inactivar el gen Beer endógeno de ratón y generar con posterioridad animales que porten la mutación con pérdida de función. Un gen informador, tal como el gen de la -galactosidasa de E. coli, fue diseñado en el vector de redireccionamiento de manera que su expresión estuviera controlada por el promotor del gen Beer 5 endógeno y la señal de iniciación de la traducción. De este modo, los patrones espaciales y temporales de la expresión del gen Beer pueden ser determinados en animales que portan un alelo elegido como diana.
El vector de redireccionamiento fue construido clonando primero la casete del gen resistente a la neomicina (neo) dirigido por el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) seleccionable por fármaco de 10 pGT-N29 (New England Biolabs, Beverly, MA) en el vector de clonación pSP72 (Promega, Madson, WI). Se utilizó la PCR para flanquear la casete PGKneo con sitios P1 1oxP de bacteriófago, que son los sitios de reconocimiento para la recombinasa P1 Cre (Hoess et al., PNAS USA, 79:3398,1982). Esto permite la posterior eliminación del marcador de resistencia a neo en las células ES redireccionadas en animales derivados con células ES (Patente de los Estados Unidos 4.959.317). Los cebadores de la PCR estaban 15 comprendidos por una secuencia de 34 nucleótidos (ntd) loxP, 15-25 ntd complementarios a los extremos 5' y 3' de la casete PGKneo, así como sitios para el reconocimiento por la enzima de restricción (BamHI en el cebador efector y EcoRI en el cebador anti-sentido) para la clonación en pSP72. La secuencia del cebador efector era 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGA TTCGAGGGGCCCCT-3' (SEC ID NO: 34); la secuencia del cebador anti-sentido era 5'-20 AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGT ATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAG TCAGCTTCTGA-3' (SEC ID NO: 35).
La siguiente etapa fue clonar un fragmento de XhoI-HindIII de 3,6 kb, conteniendo el gen de la -galactosidasa de E. coli y la señal de poliadenilación de SV40 de pSV (Clontech, Palo Alto, CA) en el 25 plásmido pSP72-PGKneo. El "brazo corto" de la homología del locus del gen Beer de ratón fue generado amplificando un fragmento del clon BAC 15G5. El extremo 3' del fragmento coincidía con el sitio de inicio de la traducción del gen Beer, y el cebador anti-sentido utilizado en la PCR también incluía 30 ntd complementarios al extremo 5' del gen de la -galatosidasa de manera que su región codificante pudiera ser fusionada con el sitio de iniciación de Beer en marco. El enfoque escogido para introducir el "brazo 30 corto" en el plásmido pSP72-gal-PGKneo fue linealizar el plásmido en un sitio aguas arriba del gen -gal y después co-transformar este fragmento con el producto de la PCR del "brazo corto" y seleccionar los plásmidos en los cuales estaba integrado el producto de la PCR mediante recombinación homóloga. El cebador efector para la amplificación del "brazo corto" incluía 30 ntd complementarios al vector pSP72 para permitir este evento de recombinación. La secuencia del cebador efector era 5'-35 ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAA GCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3' (SEC ID NO: 36) y la secuencia del cebador anti-sentido era 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTA ATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3' (SEC ID NO: 37).
El "brazo largo" del locus del gen Beer fue generado amplificando un fragmento de 6,1 kb del clon BAC 40 15G5 con cebadores que también introducían los sitios para las enzimas de restricción de corte poco común ("rare-cutting") SgrAI, FseI, AscI y PacI. Específicamente, la secuencia del cebador efector era 5'-ATTACCACCGGTGACACCC GCTTCCTGACAG-3' (SEC ID NO: 38); la secuencia del cebador efector era 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCC GGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3' (SEC ID NO: 39). El producto de la PCR resultante fue clonado en el vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) 45 como una etapa intermedia.
El constructo de redireccionamiento al gen Beer de ratón también incluía un segundo marcador seleccionable, el gen de la timidina quinasa del virus herpes simplex 1 (HSVTK) bajo el control del elemento de la larga repetición terminal del virus del sarcoma de Rous (RSV LTR). La expresión de este 50 gen vuelve las células de mamífero sensibles (e inviables) al ganciclovir, es por lo tanto un modo conveniente de seleccionar frente a células resistentes a la neomicina en las cuales ha sido integrado el constructo mediante un evento no homólogo (Patente de los Estados Unidos 5.464.764). La casete RSVLTR-HSVTK fue amplificada de pSP1337 utilizando los cebadores que permiten la posterior clonación en los sitios FseI y AscI del "brazo largo"-plásmido vector TA. Para esta PCR, la secuencia del cebador 55 efector era 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGG AATTCAAGA TCTGA-3' (SEC ID NO: 40); la secuencia del cebador antisentido era 5'-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCC AGCT-3' (SEC ID NO: 41).
La etapa final en la construcción del vector de redireccionamiento implicaba la clonación del fragmento SgrI-AscI de 8,8 kb que contenía el "brazo largo" y el gen RSVLTR-HSVTK en los sitios SgrAI y AscI del 60 plásmido pSP72-"brazo corto"-gal-PGK neo. Este vector redireccionado fue linealizado mediante digestión o bien con AscI o PacI antes de la electroporación en células ES.
Ejemplo 10
65
Inactivación de Beer mediada por antisentido
Se preparan oligonucleótidos antisentido de 17 nucleótidos en un formato solapante, de tal manera que el
extremo 5' del primer oligonucleótido se solape con el AUG de inicio de la traducción del transcrito Beer, y los extremos 5' de los sucesivos oligonucleótidos se produzcan en incrementos de 5 nucleótidos moviéndose en dirección 5' (hasta 50 nucleótidos más allá), en relación con el AUG de Beer. Se diseñan los correspondientes oligonucleótidos de control y se preparan utilizando composiciones de bases equivalentes pero redistribuidas en la secuencia para inhibir cualquier hibridación significativa para el 5 ARNm codificante. La liberación del reactivo para el sistema de ensayo celular se lleva a cabo a través de un reparto de lípidos catiónicos (P.L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). Se añaden 2 g de oligonucleótido antisentido a 100 l de medio con el suero reducido (medio con suero reducido Opti-MEM 1; Life Technologies Gaithersburg MD) y este se mezcla con reactivo Lipofectin (6 l) (Life Technologies, Gaithersburg MD) en los 100 l de medio con suero reducido. Estos se mezclan, se permite 10 que formen complejos durante 30 minutos a la temperatura ambiente y la mezcla se añade a células MC3T3E21 o KS483 sembradas previamente. Estas células se cultivan y el ARNm se recupera. El ARNm de Beer se controla utilizando RT-PCR junto con cebadores específicos de Beer. Además, se recogen los pocillos experimentales separados y los niveles de proteína se caracterizan por medio de métodos de transferencia western descritos en el Ejemplo 4. Las células son cosechadas, resuspendidas en tampón 15 de lisis (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM, SDS al 1%) y la proteína soluble se recoge. Este material se aplica a SDS PAGE en un gradiente desnaturalizante al 10=20). Las proteínas separadas son transferidas a nitrocelulosa y la transferencia western es realizada como antes utilizando los reactivos anticuerpo descritos. Paralelamente, se añaden los oligonucleótidos de control a cultivos idénticos y se repiten las condiciones experimentales. El descenso en los niveles de ARNm o proteína Beer se considera 20 significativo si el tratamiento con el oligonucleótido antisentido da como resultado un cambio del 50% en cualquier caso comparado con el oligonucleótido con las mismas bases orientadas de manera azarosa ("scrambled") de control. Esta metodología permite la inactivación selectiva del gen y la posterior caracterización del fenotipo de los nódulos mineralizados en el modelo de cultivo de tejidos.
25
SECUENCIAS
ID de Secuencia Núm. 1: ADNc de BEER Humano (región codificante completa más UTR 5' y 3')
ID de Secuencia Núm. 2: Proteína BEER Humana (secuencia completa)
ID de Secuencia Núm. 3: Proteína BEER Humana conteniendo mutación terminadora de Esclerosteosis
5
ID de Secuencia Núm. 4: Proteína BEER Humana Truncada de Esclerosteosis
5
ID de Secuencia Núm. 5: ADNc de BEER Humano que codifica la Variante de la Proteína (V10I)
ID de Secuencia Núm. 6: Variante de la Proteína BEER Humana (V10I)
ID de Secuencia Núm. 7: ADNc Beer Humano que codifica la Proteína Variante (P38R)
5
ID de Secuencia Núm. 8: Variante de la Proteína BEER Humana (P38R)
5
ID de Secuencia Núm. 9: ADNc de BEER de Vervet (región codificante completa)
ID de Secuencia Núm. 10: Proteína BEER de Vervet (secuencia codificante completa) 10
ID de Secuencia Núm. 11: ADNc de BEER de Ratón (región codificante completa)
15
ID de Secuencia Núm. 12: Proteína BEER de Ratón (secuencia completa)
5
ID de Secuencia Núm. 13: ADNc de BEER de Rata (región codificante completa más UTR 5')
10
ID de Secuencia Núm. 14: Proteína BEER de Rata (secuencia completa)
5
ID de Secuencia Núm. 15: ADNc de BEER Bovina (región codificante parcial)
10
ID de Secuencia Núm. 16: Proteína BEER Bovina (secuencia parcial -- secuencia señal perdida y últimos 6 restos)
15
ID de Secuencia Núm. 17: Fragmento de Restricción MliI-AvlII utilizado para elaborar transgen de Beer de ratón
20
ID de Secuencia Núm. 18: Secuencia Genómica de BEER Humana (Este gen tiene dos exones, en las posiciones 161-427 y 3186-5219)
5

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se unen a una proteína codificada por el SEQ ID NO: 1.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en donde la proteína codificada es la del SEQ ID NO: 5 2.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo o fragmento se unen a dicha proteína cuando son expresados por células de insecto.
    10
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o fragmento se unen a dicha proteína cuando son expresados utilizando un sistema de baculovirus en células Sf9.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo o fragmento se unen a dicha proteína cuando son expresados por células de mamífero. 15
  6. 6. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo o fragmento se unen a dicha proteína cuando son expresados por células de riñón embrionario humano u osteoblastos primarios.
  7. 7. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 6, en donde las células de riñón embrionario humano son 20 células 293-HEK.
  8. 8. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se unen a una proteína que tiene una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 2 y que aumentan el contenido mineral del hueso.
    25
  9. 9. El fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, o Fv.
  10. 10. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que son monoclonales.
    30
  11. 11. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 10, que son murinos o humanos.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que están humanizados.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que son policlonales. 35
  14. 14. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que son un anticuerpo o fragmento de la clase IgG.
  15. 15. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 14, en donde la clase de IgG es IgG2 o IgG4. 40
  16. 16. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el anticuerpo o fragmento son un anticuerpo o fragmento IgE, IgM o IgA.
  17. 17. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que están conjugados 45 con una molécula efectora o informadora.
  18. 18. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo o fragmento están conjugados con un polímero.
    50
  19. 19. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo o fragmento están conjugados con polietilenglicol.
  20. 20. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 55
  21. 21. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 20.
  22. 22. Una célula que produce un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
    60
  23. 23. La célula de acuerdo con la reivindicación 22, que es un hibridoma.
  24. 24. Un método para producir un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal como se define en la reivindicación 10, comprendiendo el método:
    65
    (i) inmunizar una rata o ratón con una proteína codificada por el SEQ ID NO: 1 o una porción de la misma;
    (ii) sacrificar la rata o ratón y recoger el bazo y/o los gánglios linfáticos de la rata o ratón; y
    (iii) fusionar las suspensiones de células de bazo o gánglio linfático con células de mieloma para generar hibridomas.
  25. 25. El método de la reivindicación 24, en donde el método comprende adicionalmente escrutar los 5 hibridomas para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo contra dicha proteína.
  26. 26. El método de la reivindicación 24, en donde el ratón ha sido modificado genéticamente para producir anticuerpos humanos.
    10
  27. 27. Un método para producir un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende aislar y purificar el anticuerpo o fragmento de un hibridoma como se define en la reivindicación 23, o preparar uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica las regiones variable y/o constante del anticuerpo y transformar una línea celular apropiada en la que tiene lugar la producción del anticuerpo. 15
  28. 28. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para su uso en un método para incrementar la mineralización ósea en un animal de sangre caliente.
  29. 29. El anticuerpo o fragmento para el uso de la reivindicación 28, en donde el animal de sangre caliente 20 tiene osteopenia o fractura ósea.
  30. 30. El anticuerpo o fragmento para el uso de la reivindicación 29, donde la osteopenia está causada por un estado anémico, esteroides, heparina, un trastorno de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteoporosis idiopática, osteopenia y osteoporosis congénitas, alcoholismo, 25 enfermedad crónica del hígado, senectud, estado post-menopáusico, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes melitus, hipertiroidismo, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o desuso, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional transitoria u osteomalacia.
    30
  31. 31. El anticuerpo o fragmento para el uso de la reivindicación 28, en donde el animal tiene osteoporosis.
  32. 32. El anticuerpo o fragmento para el uso de la reivindicación 28, en donde el animal el animal tiene acondroplasia.
    35
  33. 33. El anticuerpo o fragmento para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde el animal de sangre caliente es un ser humano.
  34. 34. Una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables. 40
  35. 35. Un método in vitro para detectar una proteína codificada por el SEQ ID NO: 1, que comprende incubar un anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a194 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que dicho anticuerpo o fragmento se unan a dicha proteína, y detectar dicha unión. 45
  36. 36. El método de la reivindicación 35, en donde dicho anticuerpo o fragmento están unidos a un soporte sólido.
  37. 37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde dicho anticuerpo o fragmento están 50 marcados.
  38. 38. El método de la reivindicación 37, en donde dicho anticuerpo o fragmento están marcados con un marcador seleccionado entre una enzima, una proteína fluorescente y un radioisótopo.
    55
  39. 39. Un kit para la detección de una proteína codificada por el SEQ ID NO: 1, que comprende un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
  40. 40. El uso de un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la fabricación de un medicamento para incrementar la mineralización ósea en un mamífero de sangre 60 caliente.
  41. 41. El uso de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el mamífero tiene osteopenia o fractura ósea.
  42. 42. El uso de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el mamífero tiene osteoporosis. 65
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