JP5616782B2 - 免疫増強機能を有する抗体 - Google Patents

Description

本発明は、免疫を増強する新規抗体に関する。更には、当該抗体を用いた医薬等の用途に関する。

免疫系は、外部の異物や病原体等から人体を保護する重要な機能であるが、その機構が阻害されたり、機能しなくなると、様々な障害が現れたり、重篤な疾病に罹患しやすくなるといった問題が生じる。

例えばアレルギーや自己免疫疾患は、本来免疫寛容されるべき対象に対する過剰な免疫反応により生じている。

また、このような過剰免疫反応とは反対に、がんの成長・増殖・転移過程では腫瘍細胞が免疫を抑制し、腫瘍に対して免疫を機能させなくする（いわゆる腫瘍免疫）仕組み、すなわち「免疫抑制機能」を有しており、これによりがんは増殖・転移を繰り返す。

このような免疫を抑制させる機構については、近年多くの研究がなされており、徐々にその機構が解明されてきている。
このメカニズム解明の中でも、特に近年注目されているのが、がん組織周辺の「免疫抑制」状態の解除方法に関するものである。

がん組織は、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＰＧＥ２等の免疫抑制物質を産生することで、がん組織周辺での免疫機能を低下させ、がん組織が自己の免疫細胞により攻撃されることを回避していると考えられている。
そこで、この免疫抑制状態を解除することにより、また、免疫機能を向上させることにより、がんの治療も向上すると考えられ、様々な研究がなされてきている。

この免疫抑制を担う細胞群としては、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞等が主に挙げられ、レギュラトリーＴ細胞（以下、「Ｔｒｅｇ」ということもある）として知られている。このＴｒｅｇには、天然型Ｔｒｅｇ（ｎａｔｕｒａｌ Ｔｒｅｇ、以下「ｎＴｒｅｇ」ということもある）と、誘導型Ｔｒｅｇ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｒｅｇ、以下「ｉＴｒｅｇ」ということもある）とに大別される。

ｎＴｒｅｇは主に胸腺で分化し、末梢血単核球中に約５％存在する細胞である。例えばアレルギーや自己免疫疾患等は通常このｎＴｒｅｇが働くことにより、回避する仕組みとなっている。

一方のｉＴｒｅｇは二次リンパ組織（末梢組織）で分化し、がん組織周辺など特定の環境にのみ存在するＴｒｅｇであると推定され、がん組織周辺ではこのｉＴｒｅｇが作用して免疫抑制状態を引き起こしていると考えられていて、がん治療方法の研究のひとつとしてこれらに対する抗体や、これら細胞を認識するマーカー等の探索が始められている。

このようなＴｒｅｇによる免疫抑制を解除する方法としては例えば、（１）抗ＣＤ２５抗体単独もしくはジフテリア毒素などと結合させたものを用いる方法（非特許文献１）、（２）抗ＧＩＴＲ抗体を用いる方法（非特許文献２）、（３）抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いる（非特許文献３）、等という方法が挙げられる。

しかしながら、上記（１）の方法では、ＣＤ２５陽性細胞を全て取り除くことになり、ＣＤ２５陽性細胞は活性化を担う細胞でもあるため、Ｔｒｅｇが除去されると同時にＴｒｅｇ以外の活性化したリンパ球も排除されてしまう。また、（２）の方法では、マウスでの有効な治療成績は残されているものの（非特許文献２）、人間での有効データはまだ明確なものが得られていない。（３）の抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた方法では、メラノーマに対しては一定の効果があるものの（非特許文献３）、その他のがん種での効果はいまだ不明である。
他方、特許文献１には、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に関連するタンパク質として、ＦＬＪ３２０２８タンパク質が単離され、このタンパク質がＢ細胞慢性リンパ球性白血病の診断マーカーとなり得ること、また、このタンパク質に対する抗体がＢ細胞慢性リンパ球性白血病の診断に用いられることも記載されている。しかしかしながら、特許文献１には、ＦＬＪ３２０２８タンパク質とＴｒｅｇとの関係については全く何ら記載されていない。また、特許文献２には、Ｔｒｅｇの細胞表面には４型葉酸受容体が高発現しており、この受容体をマーカーとして、この受容体に対する抗体を用いて、Ｔｒｅｇを検出できることが記載されている。しかしながら、特許文献２には、ＦＬＪ３２０２８タンパク質とＴｒｅｇとの関係については全く何ら記載されていない。

国際公開第ＷＯ２００４／１１０３６９号パンフレット 特開２００６−３０４７４０号公報 Dannull J,et al., J Clin Invest. 2005 Dec;115(12):3623-33. Shimizu J, et al.,Nature Immunology 3,135-142(01 Feb 2002) Phan GQ,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100.372

このように、がんの治療においてはｉＴｒｅｇを除去することがその治療において有効であると考えられているものの、その具体的な方法はまだ確立していない。
従って、本発明の課題は、Ｔｒｅｇを特異的に除去することが可能な抗体及びその利用を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を克服するため、当該Ｔｒｅｇ特異的な標識となりうる分子がないかを検証し、ＦＬＪ３２０２８が、Ｔｒｅｇ、とりわけｉＴｒｅｇ表面特異的に発現している分子であることを解明した。さらにこの分子に対するモノクローナル抗体を得たことにより、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の［１］から［１９］に関する。
［１］．膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８を認識する抗体であって、かつ、レギュラトリーＴ細胞に特異的に結合する抗体；
［２］．レギュラトリーＴ細胞表面に特異的に発現している膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８に結合する上記［１］に記載の抗体；
［３］．レギュラトリーＴ細胞が、誘導型レギュラトリーＴ細胞である上記［１］または［２］に記載の抗体；
［４］．誘導型レギュラトリーＴ細胞の前駆細胞から誘導型レギュラトリーＴ細胞への分化を阻害する上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の抗体；
［５］．抗体がモノクローナル抗体である上記［１］乃至［４］のいずれかに記載の抗体；
［６］．モノクローナル抗体が、ブダペスト条約に基づき国際寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１１００が付与されたハイブリドーマから産生される上記［５］に記載の抗体；

［７］．上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の抗体に、レギュラトリーＴ細胞を結合させて、レギュラトリーＴ細胞を除去する、レギュラトリーＴ細胞の除去方法；
［８］．レギュラトリーＴ細胞が、誘導型レギュラトリーＴ細胞である上記［７］に記載の除去方法；
［９］．上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の抗体を具備するレギュラトリーＴ細胞除去装置；
［１０］．レギュラトリーＴ細胞が、誘導型レギュラトリーＴ細胞である上記［９］に記載の除去装置；
［１１］．上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の抗体を含む医薬；
［１２］．レギュラトリーＴ細胞による免疫抑制を解除するための上記［１１］に記載の医薬；
［１３］．レギュラトリーＴ細胞により増殖が抑制された細胞を増殖させるための上記［１１］または［１２］に記載の医薬；
［１４］．免疫機能を増強させるための上記［１１］乃至［１３］のいずれかに記載の医薬；
［１５］．レギュラトリーＴ細胞が、誘導型Ｔ細胞である上記［１１］乃至［１４］のいずれかに記載の医薬；

［１６］．膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質またはその断片からなるレギュラトリーＴ細胞検出用マーカー；
［１７］．レギュラトリーＴ細胞が誘導型レギュラトリーＴ細胞である上記［１６］に記載のレギュラトリーＴ細胞検出用マーカー；
［１８］．その細胞表面上に膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現が疑われる被験細胞と、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体とを接触させ、該被験細胞表面上の膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現を検出することを含む、該被験細胞中におけるレギュラトリーＴ細胞の検出方法；および
［１９］．レギュラトリーＴ細胞が誘導型レギュラトリーＴ細胞である上記［１８］に記載の検出方法。

本発明の抗体は、ｉＴｒｅｇ表面に発現しているＦＬＪ３２０２８を認識するため、がん組織周辺で発生しているｉＴｒｅｇをターゲットとして、その機能を抑止することが可能となる。すなわち、がん組織周辺の免疫抑制状態を解除し、免疫機能を増強すること等が可能である。更には、本発明の抗体は、誘導型レギュラトリーＴ細胞の前駆細胞から誘導型レギュラトリーＴ細胞への分化を阻害することができる。
以上のことから、本発明の抗体を、免疫増強剤やがん治療剤として治療に用いることにより、あるいは免疫細胞療法によるがん治療を行う際に用いる細胞培養時に用いることにより、効果的ながん治療を提供することが可能となる。

図１は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞由来ｃＤＮＡをテンプレートにしＦＬＪ３２０２８分子に対するリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。 図２は、ＣＨＯ細胞へＦＬＪ３２０２８分子をコードするプラスミドベクター又はコントロールベクターを一過性に発現させ、抗ＦＬＪ３２０２８抗体の抗原特異性を確認した図である。 図３は、抗ＦＬＪ３２０２８抗体に磁気ビーズを付着させ、その複合体をヒトＰＢＭＣに反応させ、ＦＬＪ３２０２８分子を除去後に抗ＣＤ３抗体によって細胞増殖を測定した図である。 図４は、図３と同様の処理をしたＰＢＭＣをＫ５６２と１：１で混合した際の細胞障害活性を示す図である 図５は、図３と同様の処理をしたＰＢＭＣを回収し、ＰＭＡ及びｉｏｎｏｍｙｃｉｎ再処理を行った後に細胞内ＩＦＮ−γ産生をＦＡＣＳ解析した図である。 図６は、ヒトＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体で刺激する際、プレートに抗ＦＬＪ３２０２８抗体を固相化又は培地中に抗ＦＬＪ３２０２８抗体を添加して細胞増殖を測定した図である。 図７は、ヒトＣＤ４⁻ＣＤ２５⁻細胞をｉＴｒｅｇへ誘導する条件で培養し、６〜７日後に各抗体でＦＡＣＳ解析した解析のグラフである。 図８は、アロＭＬＲ時にｉＴｒｅｇを添加する際に、コントロール抗体添加又は抗ＦＬＪ３２０２８抗体添加を行い免疫抑制解除の割合を示すグラフである。 図９は、ｉＴｒｅｇを誘導する際に、本発明の抗体を添加して培養した際の、得られた細胞のＦｏｘＰ３の発現強度を示すグラフである。 図１０は、ｉＴｒｅｇを誘導する際に、本発明の抗体を添加して培養し、得られた細胞とエフェクター細胞と腫瘍細胞を共培養した際の、エフェクター細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。 図１１は、誘導後ｉＴｒｅｇに本発明の抗体を添加して培養し、得られた細胞とエフェクター細胞と腫瘍細胞を共培養した際の、エフェクター細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。 図１２は、Ｕ９３７を移植した免疫不全マウスに本抗体を投与した場合の、腫瘍体積の変化を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態を説明する。

ＦＬＪ３２０２８に対する抗体
まず、本発明にかかる、ＦＬＪ３２０２８分子に対する抗体（以下、「本発明の抗体」ということもある）について説明する。
本発明の抗体は、Ｔｒｅｇの表面分子であるＦＬＪ３２０２８を認識する抗体であり、Ｔｒｅｇ、とりわけ誘導型Ｔｒｅｇを認識し、誘導型Ｔｒｅｇに特異的に結合することができる。
本発明の抗体は、上記ＦＬＪ３２０２８分子を認識する抗体である。上述の通り、ＦＬＪ３２０２８はＴｒｅｇ特異的に発現しているため、本発明の抗体は、Ｔｒｅｇと特異的に結合するという特性を有する。

本発明の抗体は、クローン化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよく、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプやサブクラス、抗体の産生方法は問わない。また、抗体を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の修飾物、抗体そのものの修飾物、２種類の抗体を結合させたキメラ抗体、ヒト化抗体等も包含する。また、本発明の抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、特に、モノクローナル抗体であることが好ましい。

ＦＬＪ３２０２８は分子量約２０ｋＤａの公知の蛋白質であり、一回膜貫通型のトランスメンブレンプロテイン１５４（ＴＭＥＭ１５４）、ＨＧＮＣ ＩＤ２６４８９として同定されている。ただし、リガンドは今のところ見出されていない。ＧｅｎＢａｎｋにはＡＫ０５６５９０として登録されている（Nat. Genet.36(1)、40-45(2004)）。ＦＬＪ３２０２８タンパク質をコードする遺伝子は配列表の配列番号１に示したとおりであり、ＦＬＪ３２０２８タンパク質のコード遺伝子は、１番目から５５２番目まである。ＦＬＪ３２０２８タンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示したとおりである。細胞膜外の部分は、２３番目から７５番目まであると推測される。今回本発明者らにより、当該分子がＴｒｅｇ上、特にｉＴｒｅｇ上に発現していることを見出し、その抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いてこのｉＴｒｅｇを効果的に除去できるようにして本発明を完成したものである。

具体的には、ＦＬＪ３２０２８分子は、末梢血細胞中からレギュラトリーＴ細胞の細胞群を選択し、そこから、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻及びヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）を除去することにより、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞を得、その細胞表面に発現しているタンパク質を解析することにより得ることができる。
この場合、従来公知の方法を適宜使用することができ、ＳＡＧＥ法、遺伝子ディファレンシャルディスプレイ法などが挙げられるが、例えばサブトラクション法を用いることにより、好適に分子を同定することができる。

サブトラクション法として具体的には、レギュラトリーＴ細胞と思われる亜細胞群（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）、そこから遺伝子差し引きを行うＴｈ１、Ｔｈ２細胞群の調製を健常人末梢血単核球から行い、その後夫々の細胞からＲＮＡ、ｃＤＮＡの調製を行い、ハイブリダイズすることで遺伝子サブトラクションを行う。
上記サブトラクションにより得られるＴｒｅｇ特異的ｃＤＮＡ断片をＴＡクローニング用ベクターへ挿入し、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定する。明らかになった塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴサーチを行うことで、Ｔｒｅｇ特異的に発現している分子を同定することが可能となる。

本発明の抗体は、従来公知の技術をもって適宜作製することが可能である。例えば、ＦＬＪ３２０２８抗原タンパクを動物に免疫して、その血清を得てもよく、また、例えば、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を用いて細胞融合を行ってハイブリドーマを用いて産生させてもよいし、抗体のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡを用いて、遺伝子工学を用いる製造法等によって製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に準じた方法、即ち、マウス、ラット等の動物を免疫原で免疫し、次いで免疫した動物のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリドーマの中から本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株を選択することにより得ることができる。

マウス、ラット等の動物を免疫する免疫原は様々なものを用いることができる。例えばＦＬＪ３２０２８タンパク質又はそのペプチド断片、ＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子又はその断片を導入したベクター、ｉＴｒｅｇ細胞、ＦＬＪ３２０２８を発現するトランスフェクタント等が挙げられる。ペプチド断片を使用する場合、細胞膜外のぺプチド部分で免疫することが好ましい。以下に一例として、ＦＬＪ３２０２８をコードするｃＤＮＡにより免疫を行う方法について詳説する。

ヒト末梢血リンパ球からｃＤＮＡを作製し、それを鋳型として遺伝子特異的プライマーを用いて遺伝子の全長を増幅し、哺乳類発現ベクターに挿入することで、ＦＬＪ３２０２８のクローニングを行うことができる。全長の配列をベクターに導入することにより、免疫動物にＤＮＡ免疫を行った際にＦＬＪ３２０２８は正しく立体構造を構成し、細胞膜表面に発現する。そのため、ＦＬＪ３２０２８の細胞膜外に出ている立体構造を認識する抗体を得ることが可能となる。

ＦＬＪ３２０２８に対する特異的なモノクローナル抗体の作製
免疫動物（例えば、マウス）に同定したＦＬＪ３２０２８分子の免疫を行う。ＦＬＪ３２０２８分子をコードする遺伝子配列を挿入したベクターと金コロイド等の免疫賦活剤の混合物を、Ｂａｌｂ／ｃマウス、雌８〜１０週齢に遺伝子銃で導入し、約２〜３ヶ月飼育する。ＦＬＪ３２０２８に対する抗体価の上昇は以下の手順により確認できる。
１）適当な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に当該遺伝子挿入ベクターを導入し、ＦＬＪ３２０２８を一過的に発現させた細胞を作製する。
２）免疫動物から採取した血清（ＦＬＪ３２０２８に対するポリクローナル抗体を含んでいる）と混合する。
３）蛍光標識した抗マウスポリクローナル抗体（二次抗体）を用いてＦＣＭ解析を行う。
上記のように、ＦＬＪ３２０２８を一過性発現させた細胞を用いて、抗体価を確認することにより、ＦＬＪ３２０２８の細胞膜外に出ている立体構造を認識する抗体が得られているかを確認することができる。
抗体価の強い上昇が確認された後、免疫動物はＦＬＪ３２０２８を一過的に発現させた細胞（例えばＣＨＯ細胞）を腹腔内に注射し、最終免疫を行う。最終免疫の３〜５日後、免疫動物の脾臓細胞を取り出して、ミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００など）を用いて融合し、ハイブリドーマを作製する。作製したハイブリドーマ細胞株群の中から目的のＦＬＪ３２０２８に対する抗体を産生しているハイブリドーマは、ＦＬＪ３２０２８を一過的に発現させた細胞とハイブリドーマ培養上清を混合した後、蛍光標識した抗ポリクローナルマウス抗体（二次抗体）を用いてＦＣＭ解析を行うことで選択することができる。

このようにして得られたハイブリドーマの一株を、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＦＬＪ３２０２８−４１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成２０年３月６日に国内寄託した（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５２２）。また、平成２１年２月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管した（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１１００）。このハイブリドーマを用いることにより、本発明のモノクローナル抗体を容易に得ることができる。

このようにして得られた本発明の抗体は、Ｔｒｅｇ表面、とりわけ、ｉＴｒｅｇ表面に発現しているＦＬＪ３２０２８を特異的に認識するため、これにより血中や腫瘍組織周辺に存在していると考えられるｉＴｒｅｇと特異的に結合して除去することが可能である。

本発明の抗体を用いることにより、例えば免疫細胞療法に用いる培養のための細胞については、培養前に存在するＴｒｅｇを除去することで、細胞増殖能を向上させることが可能であるし、がん等の組織周辺に投与することで組織周辺で発生している免疫抑制解除を行うことも可能となる。

Ｔｒｅｇ除去方法およびＴｒｅｇ除去装置
本発明のＴｒｅｇ除去方法およびＴｒｅｇ除去装置は、例えば、本発明の抗体と、ビーズなどの高分子化合物とを結合させ、それをカラム等に充填することにより、血中から効果的にＴｒｅｇを取り除くものである。

ここでいう高分子化合物としては、体液と接触しても溶解せず、血球成分と接触しても害を及ぼさない毒性の低いポリマーから選ばれ、例えばポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、アクリル系樹脂、ポリアミド系樹脂、フェノキシ樹脂、ウレタン樹脂、フッ素系樹脂、シリコン系樹脂、セルロース系樹脂、キチン、キトサン、アガロース、デキストラン等があげられる。また、これらの高分子材料を単独で用いてもよいし、これらの共重合体、複合体あるいは混合物から構成されていてもよい。

具体的な構成例としては、例えばビーズを用い、本発明の抗体を結合させたものをカラムに充填することで、そこに血液を通すことによりＴｒｅｇを除去させる、というようなものがあげられる。

本発明の抗体とこれら高分子化合物の結合は化学結合により固定されるが、化学結合としては、共有結合、イオン結合、疎水結合などがあり、中でも固定が十分に可能であることから、共有結合が好ましい。この共有結合で固定するためには、これら高分子化合物は適当な官能基を持っていることが好ましく、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基、グリシジル基、イソシアナート基、ハロゲン基などを有していることが好ましい。中でも例えばトシル基やエポキシ基等が好適に用いられる。

これら本発明の抗体と高分子化合物をカラムに充填するときの形状は特に限定されるものではなく、例えば、ビーズのほか、フィルム、繊維、中空糸、ゲルなどがあげられる。

本発明の抗体の上記高分子化合物への固定化量としては、本発明の抗体が少なすぎると除去効果が不十分となる恐れがあり、多すぎると抗体同士が重なり合って互いに立体障害となる恐れがあるため、高分子化合物１ｇあたり１ｐｍｏｌ〜１０ｍｏｌの範囲で固定化することが好ましい。

このように構成された、本発明のＴｒｅｇ除去方法およびＴｒｅｇ除去装置は、効率よくＴｒｅｇを除去することできる。
具体的には、例えば採取した血液を通した後に、免疫細胞療法用の細胞培養のために用いれば、Ｔｒｅｇを除去してあるため、培養効率も向上するし、例えば透析のように、患者血液やその他の体液を体外で循環させるときに、本発明の除去方法を採用し、あるいは除去装置を通すようにして患者体内に戻すようにすれば、Ｔｒｅｇを除去した血液により、患者の免疫機能を向上させることが可能となり、治療効率も向上することとなる。

本発明の抗体を含む医薬
本発明の医薬は、本発明の抗体を含むことを特徴とする。本発明の抗体を用いてＴｒｅｇを事前に細胞群から除去することで、以下のような効果が期待できる。

１）細胞培養中の阻害因子がなくなるので、細胞増殖率を向上させることが可能となる。すなわち、Ｔｒｅｇにより増殖が抑制された細胞、例えば、リンパ球、サイトカイン産生細胞などの細胞の増殖を向上させる細胞増殖機能を発揮することができる。
２）免疫機能が低下している患者体内に投与することで、全体的な免疫機能が向上し、それにより、様々な疾病治療の効果をあげることが可能となり、全体的な免疫向上機能を発揮することができる。
３）がんなどの疾病ではその疾病組織周辺において免疫抑制状態が発生しているため、その抑制状態を解除することにより、がん治療の効果が向上することができ、がんにおける免疫抑制解除機能を発揮することができる。特に、本発明の抗体は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞などの前駆細胞からｉＴｒｅｇへの分化を抑制し、免疫抑制効果を解除できる。

上記の通り、１）の機能は、特に患者本人の細胞を用いて治療を行う免疫細胞療法に適当であり、２）の機能は、幅広く対象として使用可能であるが、特に感染症などによる免疫機能低下の阻止・治療効果の向上が望め、３）の機能については上述の通り、がん治療に効果的なものとなる。

これら上述した効果については、本発明の医薬単独で使用した場合でも十分期待できるものであるが、従来それぞれに用いられている薬剤・医薬との併用ももちろんその相乗効果が望めるものである。

具体的には、例えば本発明の抗体を細胞増殖前の血液に添加して培養したり、本発明の抗体を患部組織周辺に接触させることにより、効率よくＴｒｅｇを除去することができる。

例えば、上述の１）のような細胞増殖機能向上を目的として使用する場合は、免疫細胞療法で用いられる患者自身の細胞を培養する際に、例えば患者から採血した際にその血液に添加してＴｒｅｇを除去してもよいし、あるいは細胞培養工程の初期に添加してから培養を開始してもよい。本発明の抗体の添加量は、その添加方法や添加時期によって変動し得るが、通常は、１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。

また、構成としては本発明の抗体単独でもよいし、その他のサイトカインや薬剤などを適宜選択・組み合わせて使用してもよい。

本発明の医薬を治療に用いる場合も、単独で用いても、その他の医薬と併用することも可能であり、例えば、抗がん剤との併用や、免疫細胞療法で用いられる細胞・細胞ワクチンとの併用が可能である。

抗がん剤を用いたがん治療の場合、抗がん剤によりがん組織が攻撃されてそれによりがんが縮小することを目指すものであるが、副作用によっては、患者本来が持つ免疫機能も損なわれてしまうことも多い。そのような場合、本発明の医薬を併用することにより、免疫機能を改善し、抗がん剤の治療効果と合わせた相乗効果が期待できる。すなわち、本発明の医薬により組織周辺の免疫抑制を解除し、更には周辺に存在する免疫担当細胞の活性化も促進することが可能となるため、その治療効果も向上する。
また、抗がん剤の種類としては、種々併用可能であり、特定のものに限定はされない。

上述した２）や３）の用途で用いる場合、本発明の抗体と細胞障害活性のある物質（例えば、抗がん作用のある物質）とを結合させて用いることで、投与された抗体がＴｒｅｇに特異的に結合し、抗体に結合した細胞障害活性を有する物質がＴｒｅｇに作用し、Ｔｒｅｇを特異的に除去することができる。このような方法をとることによって、体内の免疫抑制を解除し、免疫機能を改善し、併用している治療の効果の向上が見込まれる。

また、免疫細胞療法における併用では、やはり免疫抑制状態となったがん組織周辺では、培養された細胞がうまく機能できないこともあるため、本発明のがん治療剤を併用することで、その治療効果を向上させることが可能である。

併用する免疫細胞療法としては、ＬＡＫ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞など様々なものと併用可能である。

本発明の医薬の用量としては、使用方法にもよるが、単独使用であっても、併用であっても、おおよそ０．０００１〜３０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよく、この程度の量であれば、その治療効率を向上させることが可能である。

本薬剤を投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下、リンパ節等へ注射することができる。また、病変部に直接注入してもよく、例えば内視鏡的または経皮的に直接穿針して投与することもできる。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよく、例えばがん栄養血管に選択的に挿入された動脈カテーテルを経由して投与することができる。

投与時期としては、事前に免疫機能を高めるため抗がん剤などの医薬や免疫細胞療法による培養細胞の投与日前に投与したり、医薬／細胞投与当日（同時投与）、あるいは医薬／細胞投与日の間に投与する、といった方法が可能である。

また、投与間隔としては、２週間に一度（細胞投与と同時）程度であれば効果の持続が望めるが、それ以外にも、疾病や併用する医薬に合わせて、毎週一度や毎月一度、といった間隔で投与してもよい。

膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質またはその断片からなるレギュラトリーＴ細胞検出用マーカー
本発明のレギュラトリーＴ細胞検出用マーカーについて説明する。
本発明のレギュラトリーＴ細胞検出用マーカーは膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質またはその断片からなるマーカーである。ＦＬＪ３２０２８はレギュラトリーＴ細胞に特異的に発現するため、ＦＬＪ３２０２８またはその断片はレギュラトリーＴ細胞のマーカーとして機能する。ＦＬＪ３２０２８の断片としては、細胞膜外のぺプチド部分が好ましい。本発明のマーカーは、レギュラトリーＴ細胞検出のために用いることができる。

レギュラトリーＴ細胞の検出方法
その細胞表面上に膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現が疑われる被験細胞と、本発明の抗体とを接触させ、該被験細胞表面上の膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現を検出することにより、該被験細胞中におけるレギュラトリーＴ細胞を検出することができる。例えば、ＦＬＪ３２０２８に特異的に結合するモノクローナル抗体に蛍光色素を付着させ、がん患者の末梢血と混合し、該モノクローナル抗体と膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８と結合させ、フローサイトメータ等で測定することによりサンプル中のレギュラトリーＴ細胞を検出することができる。本発明のレギュラトリーＴ細胞の検出方法は、例えば本発明の医薬と免疫細胞療法との併用において、本発明の医薬の投与前に患者血液中のマーカーを測定し、レギュラトリーＴ細胞を検出する事で、治療に必要なモノクローナル抗体の量を決定する指標となり得るものである。

以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものでないことは言うまでもない。

実施例１
誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）マーカーとしてのＦＬＪ３２０２８の同定
ｉＴｒｅｇ表面特異的に発現している分子の同定を行うため、下記の通り細胞の調製を行った後、遺伝子サブトラクション法で当該分子の同定を行った。

＜細胞の調製＞
まず、実験に用いる各Ｔｒｅｇ及びＴｈ１，Ｔｈ２の調製を行った。
培養に用いる培地としては、Ｔｈ１、Ｔｈ２細胞を誘導する際は完全培地を用いた。
完全培地の組成としては以下のとおりである。
ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社製）ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ １０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，ＩＮＣ社製）
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（インビトロジェン社製）
５×１０^−５Ｍ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（インビトロジェン社製）
２×１０^−５Ｍ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）
１×１０^−５Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（インビトロジェン社製）
１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（インビトロジェン社製）
１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／１００ｍｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）

また、健常人全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離は全血をＬｙｍｐｈｏ ｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｐｏｃ ＡＳ社製）に重層し、遠心（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ４３０ｇ，３０ｍｉｎ，ＲＴ （遠心機；ＫＵＢＯＴＡ５９１０））することで得た。

次に、ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ社製）によりＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４⁻Ｔ細胞を調製した。
まずＰＢＭＣにＣＤ４マイクロビーズを反応させ、ＣＤ４^＋分画、ＣＤ４⁻分画に分ける。ＣＤ４^＋分画を、ＣＤ４５ＲＡビーズ又はＣＤ２５ビーズと反応させることでＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋分画を得た。
すなわち、ポジティブフラクションからＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋（ナイーブＴ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋を得、ネガティブフラクションからＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻（メモリーＴ細胞）及び ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻を得た。

ここで、ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋は抗原刺激を受けていないナイーブＴ細胞であり、後述の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と反応させることでＴｈ１又はＴｈ２へ誘導させる。
次いでＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋分画はＴｒｅｇとして使用するもので、フローサイトメータでその発現を確認後Ｉｓｏｇｅｎ試薬に溶解した（ＲＮＡ調製へ）。

ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋分画はナイーブＴ細胞からＴｈ１又はＴｈ２への誘導を行った。
Ｔｈ１又はＴｈ２の誘導では、ＡＰＣとしてＣＤ４⁻フラクションに２５μｇ／ｍｌのマイトマイシン（和光純薬工業社製）を加えて３７℃で３０分間反応させた後培地で４回洗浄した。

このようにして得られたＴｈ１、Ｔｈ２用ＡＰＣを用いてそれぞれを誘導した。
ナイーブＴ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）をＴｈ１誘導条件又は、Ｔｈ２誘導条件で培養し、エフェクターＴｈ１又はＴｈ２を誘導した。

Ｔｈ１：ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞（１×１０^６）＋ＡＰＣｓ（２×１０^６）＋ｐｌａｔｅ ｃｏａｔｅｄ５μｇ／ｍｌＣＤ３抗体（２Ｃ１１； ＢＤファーミンジェン社製）＋５μｇ／ｍｌＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２； ＢＤファーミンジェン社製）＋５μｇ／ｍｌ抗ＩＬ−４抗体（ＭＰ４−２５Ｄ２； ＢＤファーミンジェン社製）＋２．５ｎｇ／ｍｌｒＩＬ−１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｋ ＥＣ ＬＴＤ社製）＋１０Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２（ＢＤファーミンジェン社製）
上記Ｔｈ１は論文；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ａｕｇ ５；１６９（４）：１８９３−９０３．を参照して誘導した、

Ｔｈ２： ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞（１×１０^６）＋ＡＰＣｓ（２×１０^６）＋１ｍｇ／ｍｌ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ（シグマ・アルドリッチ社製）＋１０μｇ／ｍｌＰＨＡ（シグマ・アルドリッチ社製）＋２ｎｇ／ｍｌＩＬ−１２抗体（Ｃ８．６， ＢＤファーミンジェン社製）＋２０ｎｇ／ｍｌｒＩＬ−４（ＢＤファーミンジェン社製）＋１０Ｕｍｌ ｒＩＬ−２
Ｔｈ２は論文：Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５Ｆｅｂ；９９（２）：１６０−７．を参照して誘導した。

＜Ｔｈ１，２の確認＞
次に、誘導したＴｈ１、Ｔｈ２細胞にＰＭＡ，Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎによるマイトジェン刺激を行い、Ｔｈ１特有のＩＦＮ−γ産生、Ｔｈ２特有のＩＬ−４産生を細胞内染色することで所望の細胞であることを確認した。

まず、Ｔｈ１，２細胞に４０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（シグマ・アルドリッチ社製），４ｎｇ／ｍｌ Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（シグマ・アルドリッチ社製）を加え４時間培養した。反応の終了前２時間時に２μＭ Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（シグマ・アルドリッチ社製）を加えた。

反応後、細胞を回収しＩｎｔｒａＰｒｅｐ（ベックマン・コールター社製）により固定、膜透過処理を行った。

次にヒトＰＥ−ＩＦＮ−γ抗体（４５．１５，ベックマン・コールター社製）及びヒトＦＩＴＣ−ＩＬ４抗体（４Ｄ９，ベックマン・コールター社製）により染色を行った
その後、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ（ベックマン・コールター社製）により測定し、Ｔｈ１細胞ではＩＦＮ−γが、Ｔｈ２細胞ではＩＬ−４が産生されていることを確認した。

＜サブトラクション＞
ＲＮＡ調製、ｃＤＮＡ合成及び遺伝子サブトラクションに用いた試薬
まずサブトラクションに用いる各細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２）のＲＮＡをＣｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｓｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ（和光純薬工業社製）を用いて、以下のプロトコルにて調製した。

細胞をＩｓｏｇｅｎに懸濁し、クロロホルムを加えボルテックスにかけた後、１４０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃条件で遠心分離した。
次に遠心分離した上清に２−プロパノールを加え、１４０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ，４℃条件で遠心分離した。その後ペレットに７０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃遠心分離を行い、ペレットをＤＥＰＣ ｗａｔｅｒに溶解した。

次に、Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＳＭＡＲＴＴＭ ＰＣＲ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、下記プロトコルによりｃＤＮＡを合成した。
それぞれの細胞から得られたＲＮＡの３’側にＣＤＳプライマーをハイブリダイズし、リバーストランスクリプターゼでｃＤＮＡに結合させた。その後５’ＰＣＲプライマーＩＩＡ，アドバンテージポリメラーゼによりロングディスタンスＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を回収、ｃＤＮＡを得た。

次に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞に特異的な膜貫通分子を同定する目的で記載の遺伝子サブトラクションを行った。
概要を模式すると、以下のとおりとなる。
（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞）−（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞，Ｔｈ１、Ｔｈ２）

サブトラクションは、クロンテックＰＣＲ−セレクト（ＴＭ） ｃＤＮＡサブトラクションキットインストラクション（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社製）を用いて行った。プロトコルはＰＣＴ−セレクト（ＴＭ） ｃＤＮＡサブトラクションキットに添付されたユーザーマニュアルに従って行い、これによりＴｒｅｇに優位に発現する遺伝子産物を取得した。

サブトラクションにより得られる遺伝子産物は、サブクローニング用ベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにライゲーションしシークエンスすることでその配列を決定した。

＜クローニング＞
サブトラクションで得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）へトランスフォームした。そのＤＨ５αをＡＭＰ（アンピシリン、明治製菓社製）、Ｘ−ｇａｌ（シグマ・アルドリッチ社製）、ＩＰＴＧ（シグマ・アルドリッチ社製）セレクションＬＢプレートに蒔いた。３７℃で一晩培養した後、プレート上にできたコロニーのうち、ホワイトコロニーを選別し、Ｔ７プライマーとＳＰ６プライマーを用いたコロニーＰＣＲを行い、挿入断片を増幅した。

上記ＰＣＲ産物である増幅断片をＭｉｃｒｏｃｏｎ−ＰＣＲ（ミリポア社製）により精製した後、それを鋳型としてＴ７プライマー又はＳＰ６プライマーを用いてシークエンス反応を行った。ＰＣＲ産物は３００クローン得られ、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴサーチを行って遺伝子名を同定した。

サブトラクションで得られた３００クローンについて、ＢＬＡＳＴサーチ又はタンパク質の構造を予測するＷｅｂサイト（例えば、ＳＯＳＵＩやＨｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）により膜タンパク質と予測されるクローンを選択したところ３０クローンであった。３０クローンについてリアルタイムＰＣＲを行い、レギュラトリーＴ細胞にｍＲＮＡレベルで優位に発現している分子を調べた結果、８クローンが選択された。それらクローンのひとつであるＦＬＪ３２０２８のリアルタイムＰＣＲの結果を図１に示す。ＦＬＪ３２０２８はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞に比べ、Ｔｒｅｇに優位に発現していたため、Ｔｒｅｇのマーカーとして研究を進めることとした。

ＦＬＪ３２０２８遺伝子のクローニング
健常人抹消血リンパ球から抽出したＲＮＡから作製したｃＤＮＡ断片を鋳型として使用し、ヒトＦＬＪ３２０２８遺伝子断片（開始コドンから終止コドンまでの全長の遺伝子）をＰＣＲ法により増幅した。プライマーの配列は、下記２種類のＤＮＡオリゴマーを合成して使用した。下記プライマー塩基配列における下線部は、ベクター挿入するための制限酵素サイトの配列Ｈｉｎ ｄＩＩＩ（ＦＬＪ３２０２８ Ｆ）及びＸｂａ Ｉ（ＦＬＪ３２０２８ Ｒ）を示す。
プライマーＦＬＪ３２０２８ Ｆ： ５’−ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧ−３’
プライマーＦＬＪ３２０２８ Ｒ： ５’−ＣＣＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＧ−３’
ＰＣＲは、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９４℃で２分間置いた後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒を１サイクルとして３５サイクル繰り返させる反応条件で行った。前記ＰＣＲ法で特異的に増幅されたＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、切り出して、制限酵素Ｈｉｎ ｄＩＩＩ及びＸｂａ Ｉ処理した。同様に、プラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素処理し、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ及びＸｂａ Ｉ部位にＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＦＬＪ３２０２８を得た。

実施例２
ＦＬＪ３２０２８に対するモノクローナル抗体の作製：ハイブリドーマの作製
ＦＬＪ３２０２８の遺伝子断片（開始コドンから終止コドンまでの全長の配列：配列表の配列番号１における、１番目から５５２番目までの遺伝子）をタグ付の哺乳動物発現ベクターに組込む。構築した遺伝子構築物が設計した通りに細胞表面に発現されるかどうかについて免疫実施前にハムスター由来ＣＨＯ細胞を用いて検証した。すなわち、構築した遺伝子構築物を該ＣＨＯ細胞に一過性発現導入した。

この導入したＣＨＯ細胞をＣＯ_２インキュベータに２４時間培養して、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析に用いた。
ＦＣＭ解析する際、上記の導入遺伝子に付加しているタグに対する抗体としてＭｙｃを遺伝子導入した培養細胞が入っている培養溶液に加え、３０分間静置した。その後、タグを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。本発明で構築した遺伝子構築物が細胞表面に発現していることを確認した。

次に、上記遺伝子構築物をＢａｌｂ／ｃマウス、雌６〜８週齢６匹に対して遺伝子銃を用いて導入し、約２〜３ヶ月飼育した。
その後、免疫した動物より採集した血清、すなわちポリクローナル抗体の解析に、ヒトＦＬＪ３２０２８遺伝子を導入した上記ＣＨＯ細胞を用いた。
すなわち、タグをつけたｖｖ８／ＦＬＪ３２０２８構築物をＣＨＯ細胞に一過性発現導入し、導入したＣＨＯ細胞をＣＯ_２インキュベータに２４時間培養して、ＦＣＭ解析に用いた。

ＦＣＭ解析する際、上記の導入遺伝子で免疫動物より採集した血清（ポリクローナル抗体）をｖｖ８／ＦＬＪ３２０２８導入した培養細胞が入っている培養溶液に加え、３０分間静置した。その後、免疫動物の免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。

ヒトＦＬＪ３２０２８遺伝子導入細胞を認識する強い特異抗体を産生している動物を解剖し、脾臓細胞を取り出しＳＰ２／０マウスミエローマ細胞とそれぞれ４×１０^７、１×１０^８個ずつをポリエチレングリコールにより融合した。融合から７〜１０日後、ハイブリドーマ細胞株の中から、ヒトＦＬＪ３２０２８の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を選抜する手段として、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用い、ヒトＦＬＪ３２０２８遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を用い、ｖｖ８／ＦＬＪ３２０２８構築物をＣＨＯ細胞に一過性発現導入した（トランスフェクト）。導入した哺乳細胞をＣＯ_２インキュベータに２４時間培養して、ＦＣＭ解析に用いた。

ＦＣＭ解析する際、各ハイブリドーマの培養上清の一部をｖｖ８／ＦＬＪ３２０２８導入した培養細胞が入っている培養溶液に加え、３０分間静置した。その後、マウスの免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。

その結果、抗ＦＬＪ３２０２８抗体を産生するハイブリドーマを1クローン得た。このハイブリドーマをＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＦＬＪ３２０２８−４１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成２０年３月６日に国内寄託した（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５２２）。また、平成２１年２月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管した（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１１００）。

抗ヒトＦＬＪ３２０２８抗体を産生するハイブリドーマの特異抗体大量生産として、樹立したハイブリドーマ細胞をヌードマウス１匹あたり１×１０^６〜１×１０^７のハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した。ハイブリドーマの増殖により、ヌードマウスの腹腔内に腹水が貯留する。腹水を回収し、ＧＥ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製用樹脂を充填したカラムで腹水より高純度のイムノグロブリンを回収した。以後の解析はこの精製したモノクローナル抗体を用いて、実施した。

実施例３
抗体の確認：当該抗体がＦＬＪ３２０２８を認識することの検証
実施例２で得たＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子を用い、プラスミド（ｐＲＣ−ｃｍｖベクター、インビトロジェン社製）に該ＦＬＪ３２０２８分子をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（ｐＲＣ−ＦＬＪ３２０２８）４μｇを５×１０^５個のＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。具体的には、ＤＮＡプラスミド４μｇをｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）１０μｌと混合し、ＣＨＯ細胞へ添加した。４時間後、培地を交換し２４〜４８時間後にＣＨＯ細胞を回収しＦＡＣＳ解析した。

上記トランスフェクタントと実施例２で得られたＦＬＪ３２０２８ハイブリドーマ上清１００μｌと抗マウスＩｇＧ１ ２μｌとを結合させたものを４℃で反応させ、ＦＡＣＳでその反応を解析した。また、比較として、ＦＬＪ３２０２８とは無関係なタンパクをコードするＤＮＡプラスミド（ｍｏｃｋ）をＣＨＯ細胞に組み込んだトランスフェクタントと上記上清＋抗マウスＩｇＧ１とを反応させ、その反応についてもＦＡＣＳ解析を行った。図２にその結果を示す。

図２はＦＬＪ３２０２８トランスフェクタント及びｍｏｃｋトランスフェクタントと、抗ＦＬＪ３２０２８抗体との反応を示すＦＡＣＳ解析のグラフである。図２によれば、ＦＬＪ３２０２８トランスフェクタントと、上記実施例で得られた上清とが反応していることが示されている。これにより、当該抗体がＦＬＪ３２０２８を認識する抗体であることが示された。

実施例４
当該抗体を用いたＴｒｅｇの除去および除去したときの効果（抗体＋マグネットビーズでの除去効果）
本発明の抗体によるＴｒｅｇ除去効果を調べるため、血中のＴｒｅｇを本発明の抗体を用いて除去して細胞培養を行い、その細胞増殖の程度を測定した。

＜細胞の調製＞
試験に用いた末梢血単核球は、上記実施例同様に、健常人ドナーから３０〜５０ｍｌヘパリン採血を行い、全血を等量ＲＰＭＩ１６４０培地に希釈した後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐに重層し、さらに１５００ｒｐｍ、室温で遠心してＰＢＭＣを得た。

＜抗体ビーズの作製＞
使用する磁気ビーズとして、エポキシ基活性化ビーズＭ４５０及びトシル基活性化ビーズＭ４５０（ダイナルビーズＭ４５０エポキシ、及びダイナルビーズＭ４５０トシル ベリタス社製）を用い、本発明の抗体及び比較用の抗体結合ビーズとして、以下の６種類の抗体結合ビーズを作製した。エポキシとトシル２種類を用いた理由は、抗体の種類によって効率よく結合する磁気ビーズが異なるためである。

エポキシ基活性化コントロールＩｇＧ１
トシル基活性化コントロールＩｇＧ１
エポキシ基活性化抗ＣＤ２５抗体（ＩｇＧ１）
トシル基活性化抗ＣＤ２５抗体（ＩｇＧ１）
エポキシ基活性化抗ＦＬＪ３２０２８抗体（ＩｇＧ１）
トシル基活性化抗ＦＬＪ３２０２８抗体（ＩｇＧ１）

上記抗体結合ビーズの作製方法としては、各ビーズ２×１０^７個とコントロール、抗ＣＤ２５又は抗ＦＬＪ３２０２８抗体５０μｇを、３７℃、２時間の条件で混合し、結合ビーズを得た。

＜Ｔｒｅｇ除去機能の解析＞
上記の通り作製したビーズを用いて、下記の通り解析を行った。
上記採血・分離により得た健常人ＰＢＭＣ３０〜５０ｍｌを７５ｃｍ^２フラスコ（スミロン社製）で、３７℃、２時間の条件で培養し、主に単球細胞などの付着細胞を取り除いた。
上述の通り前処理したＰＢＭＣを除去なし群及び上記６種類のビーズとの共培養群用に１ｍｌに分けて、それぞれにビーズを５０μｌずつ混合し、４℃冷蔵庫において３０分間振盪器でインキュベートした。

ついで、それぞれの試験管からダイナル社専用磁石により磁気ビーズ−抗体複合体に付着した細胞を除去し、残ったＰＢＭＣそれぞれについて抗ＣＤ３抗体で刺激し、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）による細胞増殖測定を行った。
このＷＳＴ−１測定は、生存細胞中だけに活性があるミトコンドリア中のコハク酸塩テトラゾリウム還元酵素によってＷＳＴ−１がホルマザン色素へ分解されるため、その色素変化により、細胞増殖を測定するものである。

上記ビーズ除去が終わり、２〜３日間抗ＣＤ３刺激を受けた各ＰＢＭＣ２００μｌにＷＳＴ−１を１０μｌ添加後、３０分放置および９０分放置し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
図３に本測定の結果を示す。図３に示すとおり、無処理、コントロールと比較して、ＦＬＪ３２０２８抗体でＴｒｅｇを除去することにより、細胞増殖が増強されることが示された。

＜細胞障害活性試験＞
また、ビーズ操作後のＰＢＭＣを用いて、がん細胞に対する細胞障害活性及び細胞内ＩＦＮ−γの産生量を解析した。
まず細胞障害活性については、がん細胞株であるＫ５６２をターゲットとして、ターゲット：培養細胞＝１：１の割合で混合し、その障害活性を調べた。
Ｋ５６２細胞株（ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養し、３〜４日おきに継代培養した。

これらの細胞を回収し後ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製、１０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを加えた後、３７℃で４０分間静置した。その後、エフェクター細胞であるＰＢＭＣと１：１の割合で混合し（９６ｗｅｌｌプレート（スミロン社製）、最終液量１５０μｌ、２×１０^４）、５％ＣＯ_２存在下３７℃で４時間反応させた。４時間後、テラスキャンにより細胞障害活性を測定した。

また細胞内ＩＦＮ−γの割合については、各群ＰＢＭＣを培養３日後に回収し、ＰＭＡ（４０ｎｇ／ｍｌ、シグマ社製）及びｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（４μｇ／ｍｌ、シグマ社製）で４時間再刺激した。これらの細胞におけるＣＤ４又はＣＤ８陽性細胞についてＩＦＮ−γ産生をＦＡＣＳ解析した。

これら測定の結果を図４、５に示す。
図４はビーズ除去後の各細胞群における細胞傷害活性を示すグラフである。図に示すとおり、細胞傷害活性は、本発明の抗体を結合したビーズで処理した群が一番高い活性を示した。
図５は各細胞群のＩＦＮ−γ産生の割合を示すグラフである。この図でも、本発明の抗体を結合したビーズで処理した群が一番高い産生量を示している。

以上の通り、本発明の抗体で処理した（Ｔｒｅｇを除去した）リンパ球は、その増殖率も向上し、さらにその機能も向上することが示された。

実施例５
当該抗体を培養液中に添加して細胞を培養した場合の効果
次に、本発明の抗体を細胞増殖過程で常時存在させることで、どの程度細胞阻害要因であるＴｒｅｇを除去し、細胞増殖を増強させる効果があるかどうかについて調べた。

＜ＦＬＪ３２０２８抗体等の固相化した場合の試験＞
まず、本試験に用いる抗体を培養容器に固相化した。
抗ＦＬＪ３２０２８抗体及び、ネガティブコントロールとしてＩｇＧ１を用いた。
まず、９６ｗｅｌｌプレート（スミロン社製）に、抗マウスヤギＩｇＧポリクローナル抗体５μｇ／ｍｌ（シグマ社）（ＰＢＳ）を入れ、３７℃で２時間置いて、固相化した。（この工程により、次に固相化する試験用の抗体の力価を上げることができるため、よりわかりやすい結果を得ることが可能になる。）

ついで、抗ＣＤ３抗体（別名オルソクローン、ヤンセンファーマ社製）、及び抗ＦＬＪ３２０２８抗体、コントロールＩｇＧ１、抗ＧＩＴＲ抗体をそれぞれ個別に５μｇ／ｍｌずつ上記ポリクローナル抗体を固相化したプレートに入れ固相化した（３７℃、２時間、ＣＯ２インキュベータ内）。

固相化した各容器に健常人ドナーより得たＰＢＭＣ（方法は上述の実施例と同様）３×１０^４個播種し、３７℃、ＣＯ_２インキュベータで３日間培養後にＷＳＴ−１ １０μｌを添加後、３０分及び９０分放置したものの吸光度を測定した。

＜ＦＬＪ３２０２８抗体等を培地に添加した場合の試験＞
上記固相化試験同様に、抗マウスヤギポリクローナル抗体は事前に容器に固相化した。
このポリクローナル抗体を固相化した容器に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＦＬＪ３２０２８抗体、コントロールＩｇＧ１、それぞれ５μｇ／ｍｌを、１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ１６４０培地添加と同時に入れ、更にＰＢＭＣ２×１０^４個とＷＳＴ−１を上記固相化試験と同様に添加し、３０分及び９０分放置したものの吸光度を測定した。
以上の試験の結果を図６に示す。

図６に示すとおり固相化した場合でも常時添加した場合でも、コントロール抗体に比べ、本発明の抗体（抗ＦＬＪ３２０２８抗体）により、細胞増殖の度合いが促進、すなわち細胞増殖抑制が解除されていることが示された。

実施例６
ｉＴｒｅｇの選別（染色による選別）
次に、Ｔｒｅｇでも、特にがん組織周辺で発生していると考えられている誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）における本発明の抗体の効果を見るため、まずｉＴｒｅｇを取得することとした。

抗ＣＤ３抗体（オルソクローン、５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（ＢＤファーミンジェン社製、５μｇ／ｍｌ）を２４ｗｅｌｌプレート（スミロン社製）に固相化した。次に、上記実施例と同様に、健常人から採血し、そこからＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻画分を分離した（ｎＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋画分細胞）の除去）。

この画分のＴ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞）５×１０^５個を上記固相化処理した２４ｗｅｌｌプレートに蒔き培養を行った。
培地の組成は、１０％ＦＣＳ ＲＭＰＩ１６４０培地に、ｒＩＬ−２（６０Ｕ／ｍｌ）、ｒＩＬ−９（４２Ｕ／ｍｌ）、ｒＩＬ−１５（１ｎｇ／ｍｌ）、ｒＴＧＦ−β１（３２Ｕ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１２抗体（２０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加えたものを使用した。培養３日後に、上記固相化プレートから細胞を分離し、同じ培地・容器を用いてさらに３〜４日培養した。

上記培地にて培養を開始してから６〜７日目の細胞を回収し、この培養細胞表面を抗ＦＬＪ３２０２８抗体で染色し、細胞を１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、サポニンを含む界面活性剤処理し、抗ＦｏｘＰ３抗体１０μＬと４℃で３０分反応させ、その後細胞をＦＡＣＳにて解析した。

この解析結果を図７に示す。図に示す通り、Ｔｒｅｇマーカーとして最も有用と考えられているＦｏｘＰ３の陽性画分にはＦＬＪ３２０２８の発現が認められ、これにより、このＦＬＪ３２０２８陽性画分をｉＴｒｅｇと判断し、その後の研究においてｉＴｒｅｇとして選別して、用いることとした。

実施例７
得られたｉＴｒｅｇと本発明の抗体とを用いて培養を行った場合の培養効果
上記実施例６にて選別したｉＴｒｅｇと本発明の抗体、抗ＦＬＪ３２０２８抗体を用いて、アロ（他家）リンパ球の混合実験（ＭＬＲ）を行った。
混合実験に用いたリンパ球はＨＬＡタイプが異なる二名の健常人より得た。ｉＴｒｅｇを誘導したリンパ球提供者と同一健常人からリンパ球を採取し（ドナーＡリンパ球とする）、ＣＦＳＥラベルした。ＣＦＳＥは細胞が１回増殖するについれその蛍光強度が半減していく性質を持つ。このＣＦＳＥラベルリンパ球にＨＬＡタイプが異なるリンパ球（ドナーＢリンパ球とする）をＭＭＣ（マイトマイシン）処理（３０μｇ／ｍｌ、３７℃、３０分）して、ドナーＡリンパ球：ドナーＢリンパ球＝１：１の割合で混合した（ＭＬＲ）。

このアロＭＬＲにおいて、ｉＴｒｅｇをｉＴｒｅｇ：ドナーＡリンパ球＝１：１、又は１：１０の割合で混合し、最終細胞数２×１０^５を４８ｗｅｌｌプレート（スミロン社製）に蒔き、ｉＴｒｅｇの抑制アッセイを行った。この際、コントロールＩｇＧ１抗体又は抗ＦＬＪ３２０２８抗体２μｇ／ｍｌ添加し、培地として１０％ＦＣＳＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、４日間培養を行った。

培養４日後に培養細胞を回収し、ＣＦＳＥラベルしたリンパ球の分裂回数をＦＡＣＳ解析した。
図８に本試験の結果を示す。図に示す通り、本発明の抗体を添加して培養することにより、コントロールでは抑制されていたドナーＡリンパ球の細胞増殖が回復していることがわかった。

実施例８
ｉＴｒｅｇ誘導時に抗ＦＬＪ３２０２８抗体を添加して培養した際のＦｏｘＰ３の発現およびその抑制効果への影響
健常人採血を行い、実施例６と同様にＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を取得した。実施例６に記載の培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、ｒＩＬ−２、ｒＩＬ−９、ｒＩＬ−１５、ｒＴＧＦ−β１、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体）を用いて、１×１０^６個ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を培養し、ｉＴｒｅｇを誘導した。その際、（１）コントロールＩｇＧ１（５０μｇ／ｍｌ）、（２）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（１μｇ／ｍｌ）、（３）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（１０μｇ／ｍｌ）、（４）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（５０μｇ／ｍｌ）となるように抗体を添加した４条件で培養した。７日後に細胞を回収し、フローサイトメータによってＣＤ２５／ＦｏｘＰ３の発現を測定した。また、同じ健常人から取得したＰＢＭＣｓから抗ＣＤ３抗体、ｒＩＬ−２を用いて誘導したＣＤ３−ＬＡＫ細胞と、Ｕ９３７を感作させたＰＢＭＣｓをそれぞれエフェクター細胞として、Ｕ９３７を標的細胞として、エフェクター細胞：Ｕ９３７＝１：１又は１０：１となるように共培養し、細胞傷害活性を測定した。その際、前述の培養で得られた（１）から（４）のｉＴｒｅｇをエフェクター細胞の１／１０の割合となるように添加し、エフェクター細胞の細胞傷害活性に対し、（１）から（４）の細胞がどのような影響を示すか測定した。

それぞれの結果を図９、図１０に示す。コントロールＩｇＧ１添加群のＦｏｘＰ３発現強度を１とすると、抗ＦＬＪ３２０２８抗体添加群のＦｏｘＰ３発現強度は、抗体の濃度依存的に減少していた（図９）。このことから本発明の抗体はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞からｉＴｒｅｇへの分化を抑制する効果があることが明らかとなった。また、コントロールＩｇＧ１を添加して培養したｉＴｒｅｇはＰＢＭＣｓの細胞傷害活性を抑制していたが、抗ＦＬＪ３２０２８抗体を添加して培養したｉＴｒｅｇでは抑制が解除されており、その作用は抗ＦＬＪ３２０２８抗体濃度に依存していた。このことから、本発明の抗体はｉＴｒｅｇの分化を抑制し、免疫抑制効果を解除できることが明らかとなった。

実施例９
ｉＴｒｅｇ誘導後に抗ＦＬＪ３２０２８抗体を添加した際の細胞傷害活性への影響
実施例６と同様に健常人のＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを誘導した。その後、（１）コントロールＩｇＧ１（５０μｇ／ｍｌ）、（２）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（１μｇ／ｍｌ）、（３）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（１０μｇ／ｍｌ）、（４）抗ＦＬＪ３２０２８抗体（５０μｇ／ｍｌ）となるように抗体を添加した４条件で２日間培養した。同じ健常人ドナーのＰＢＭＣｓからＣＤ３−ＬＡＫを誘導し、Ｕ９３７を標的細胞として、ＣＤ３−ＬＡＫ：Ｕ９３７＝１：１又は１０：１となるように共培養し、細胞傷害活性を測定した。その際、前述した４条件の培養で得られたｉＴｒｅｇをぞれぞれＣＤ３−ＬＡＫの１／１０の割合で添加した。結果を図１１に示す。どの群にも差は見られず、ｉＴｒｅｇを誘導後に抗ＦＬＪ３２０２８抗体を添加しても、ｉＴｒｅｇの免疫抑制能には影響はないことが示唆された。

実施例１０
免疫不全マウスを用いた抗ＦＬＪ３２０２８抗体の抗腫瘍免疫に対する影響
免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）はＴ、Ｂ細胞は存在せず、ＮＫ細胞は存在するがその機能が失われているマウスである。免疫不全マウスに健常人由来２×１０^７個ヒトＰＢＭＣｓを腹腔内投与し、その７日後に１×１０^６個のＵ９３７を皮下移植した。対象マウスを抗体を静脈注射する日程、量により以下の２群に分けた（各群５匹）。
（１）Ｕ９３７移植後２、４、６、８日目にコントロールＩｇＧ１（５０μｇ／ｍｌ）を静脈注射した群
（２）Ｕ９３７移植後２、４、６、８日目に抗ＦＬＪ３２０２８抗体（５０μｇ／ｍｌ）を静脈注射した群
Ｕ９３７の腫瘍体積を測定すると、（２）の２、４、６、８日目に抗ＦＬＪ３２０２８抗体を投与した群が最も腫瘍体積が抑制されていた。このことから本発明の抗体は体内に投与した場合に、腫瘍の増加を抑制することが明らかとなった。

以上説明したように、本発明の抗体は誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）を特異的に認識するという特性を有する。更には、本発明の抗体は、誘導型レギュラトリーＴ細胞の前駆細胞から誘導型レギュラトリーＴ細胞への分化を阻害することができる。このような特性を利用して、本発明の抗体は、がん組織などで生じている免疫抑制状態を効率よく解除する等様々な用途に有用に用いることができる。

Claims (12)

1. ブダペスト条約に基づき国際寄託されたハイブリドーマ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１００）から産生され、膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８を認識する抗体であって、かつ、レギュラトリーＴ細胞に特異的に結合する抗体。
2. 請求項１に記載の抗体に、レギュラトリーＴ細胞を結合させて、レギュラトリーＴ細胞を除去する、レギュラトリーＴ細胞の除去方法。
3. レギュラトリーＴ細胞が、誘導型レギュラトリーＴ細胞である請求項２に記載の除去方法。
4. 請求項１に記載の抗体を具備するレギュラトリーＴ細胞除去装置。
5. レギュラトリーＴ細胞が、誘導型レギュラトリーＴ細胞である請求項４に記載の除去装置。
6. 請求項１に記載の抗体を含む医薬。
7. レギュラトリーＴ細胞による免疫抑制を解除するための請求項６に記載の医薬。
8. レギュラトリーＴ細胞により増殖が抑制された細胞を増殖させるための請求項６または７に記載の医薬。
9. 免疫機能を増強させるための請求項６乃至８のいずれか一項に記載の医薬。
10. レギュラトリーＴ細胞が、誘導型Ｔ細胞である請求項６乃至９のいずれか一項に記載の医薬。
11. その細胞表面上に膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現が疑われる被験細胞と、請求項１に記載の抗体とを接触させ、該被験細胞表面上の膜貫通分子ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現を検出することを含む、該被験細胞中におけるレギュラトリーＴ細胞の検出方法。
12. レギュラトリーＴ細胞が誘導型レギュラトリーＴ細胞である請求項１１に記載の検出方法。

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