JP2007097580A - Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ−１ ２７-３５ (ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ)を特異的に認識するＴＣＲβ鎖及びその遺伝子等を提供することにある。
【解決手段】患者から末梢血単核細胞を採取し、低濃度のＩＬ−２存在下、ＭＡＲＴ−１ Ａ２ペプチドでパルスされた樹状細胞を１：１０〜１：４０の割合で加え２回刺激した。細胞障害性Ｔ細胞の割合をさらに上げるため、そのセルラインにさらにＭＡＲＴ−１ Ａ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞を１：１０の割合で加えて刺激した。ＭＡＲＴ−１ Ａ２テトラマー特異的な細胞障害性Ｔ細胞のクローニングは、ＴＣＲβ鎖特異的な抗体を基にしてモノクローナル抗体を使った細胞障害性Ｔ細胞のMagnetic activated cell sortingにより行い、ＴＣＲβ鎖のＤＮＡシークエンスを解析し、新規なＭＡＲＴ−１を特異的に認識するＴＣＲβ鎖を同定した。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質、並びにＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子、該遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質発現ベクター、及び該発現ベクターが導入された形質転換体に関する。

悪性黒色腫は、インターロイキン２などを用いた免疫療法が比較的有効な癌である（例えば、非特許文献１参照）が、生体内における抗腫瘍効果には、腫瘍細胞に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）が重要であることが示されている（例えば、非特許文献２参照）。免疫療法後、腫瘍反応性Ｔ細胞が活性化され、Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（T cell receptor：ＴＣＲ）が、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子によって腫瘍細胞表面に提示される腫瘍細胞タンパク質が分解されてできたペプチド（腫瘍抗原）を認識し、腫瘍細胞を傷害する。更に各種サイトカインを分泌し、マクロファージ等の他の免疫細胞をも誘導活性化し、生体内で腫瘍拒絶を起こすと考えられている。腫瘍反応性Ｔ細胞には自己腫瘍細胞のみならず、ＨＬＡを共有する他の患者からの腫瘍細胞にも反応するような共通腫瘍抗原を認識する場合と、自己腫瘍細胞しか反応しない固有抗原を認識する場合がある。

ヒト腫瘍細胞に対する免疫応答機構を解明して、新しい免疫療法を開発するためには、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞が認識する腫瘍抗原を同定することが重要である。腫瘍反応性Ｔ細胞が樹立されている場合には、その反応性を利用した機能的ｃＤＮＡ発現クローニング法を用い、悪性黒色腫抗原の単離が可能である。例えば、転移メラノーマ患者からの腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞株とを用いて、メラノーマの予防、診断及び治療に用いることができる悪性黒色腫抗原を単離することが可能であり（例えば、特許文献１参照）、その一つＭＡＲＴ−１は同様な方法によって単離、同定されたものである。現在までに代表的なものとして、上記ＭＡＲＴ−１やｇｐ１００のような色素細胞（メラノサイト）組織特異的タンパク質、各種腫瘍と正常組織では精巣に発現が認められるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ等のＣＴ抗原（Cancer-Testis抗原）、腫瘍細胞の遺伝子異常により産生されるβカテニン、ＣＤＫ４（cyclin dependent kinase 4）、ｐ１５、ＧｎＴ−Ｖ等の変異ペプチド抗原が単離されている（例えば、非特許文献３参照）。

Ｔ細胞はＴ細胞レセプターによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し(ＭＨＣクラスＩ拘束性)、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞はＭＨＣクラスII分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスII拘束性）とされている。また、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現しているが、ＭＨＣクラスII分子は限られた一部の細胞しか発現していない。このためＴｈ細胞はＭＨＣクラスII分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞などとは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞や感染細胞などには直接結合することができない。しかし遺伝子操作によってＭＨＣクラスＩ拘束性とされるＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入したＭＨＣクラスII拘束性とされるＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が、対応抗原をパルスしたＡＰＣとＣＤ８非依存的に反応して活性化されることができ、対応抗原に結合できるＴ細胞レセプターを発現していることが示された。また、非特異的な抗腫瘍活性をもつ末梢血リンパ球に腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入することにより、特異的に腫瘍を傷害することができることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。

他方、Ｔ細胞表面に存在する膜表面タンパク質であり、抗原認識を担うＴ細胞レセプターには、α鎖・β鎖から成るヘテロ二量体とγ鎖・δ鎖から成るヘテロ二量体の二種類が同定されている。Ｔ細胞レセプター遺伝子は免疫グロブリン遺伝子と同様に、可変領域（Ｖ：variable）、多様性領域（Ｄ：diversity）、結合領域（Ｊ：joining）からなり分子の多様性を生じるＶドメインと、細胞外定常領域、膜貫通領域、細胞内領域を含む定常領域（Ｃ：constant）からなるＣドメインにより構成されている。これらのアミノ酸配列はＴ細胞ごとに異なっていることから、Ｔ細胞レセプターは抗原認識分子であると同時に個々のＴ細胞の目印にもなっている。このＴ細胞レセプターの多様性は後天的なＴ細胞レセプター遺伝子の再構成によって生みだされており、Ｔ細胞レセプターβ，δ鎖はＶ−Ｄ−Ｊを、Ｔ細胞レセプターα，γ鎖はＶ−Ｊを再構成することが知られている。

Ｔ細胞の初期分化は、Ｂ細胞と同様にＴ細胞レセプターのα鎖及びβ鎖遺伝子の再構成と密接に関わっている。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子の再構成はＤＮ−Ｔ細胞（double negative：ＣＤ４⁻８⁻）の段階で開始され、β鎖遺伝子の再構成に成功した細胞はβ鎖タンパク質と代替α鎖（ｐｒｅＴα）の複合体、つまりプレＴ細胞レセプターを細胞表面に発現する。そして、ＣＤ４及びＣＤ８分子の発現が誘導され、ＤＰ−Ｔ細胞（double positive：ＣＤ４⁺８⁺）へと移行し、ＤＰとなったＴ細胞は、次にＴ細胞レセプターのα鎖遺伝子の再構成に成功した細胞のみが、Ｔ細胞レセプターを表面に発現できることが知られている。

Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子構成に関しては、ヒトゲノム遺伝子配列情報データベースによれば、Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子は約３０種類の亜族（遺伝子自体は約７０種）からなるＶ遺伝子、２種類のＤ遺伝子、１４種類のＪ遺伝子、２種類のＣ遺伝子によって構成され、Ｖβ中に２つの可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２）が存在することも知られている。これらの中からＶβ、Ｄβ、Ｊβが各１つずつ選ばれて結合し、Ｔ細胞レセプターβ鎖をコードするＤＮＡが構成されている。この際、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβの結合部にはランダムな塩基の挿入や欠失が起こり、無限に近い多様性が生みだされている。このＶβ−Ｄβ−Ｊβの結合部位は、ＣＤＲ３（相補性決定領域３：third complementarity determining region）、結合部（junctional）領域と呼ばれ、Ｔ細胞レセプターの中で最も多型性に富む部分であり、塩基の挿入・欠失が起こるため、各遺伝子構成が同じであっても連結部分も含めて同一配列になることは極めて稀である。

特表平１０−５０５４８１号公報 JAMA 271, 907, 1994 Microbiol.Immunol. 42, 803, 1998 Immunol Res 16, 313, 1997 J.Immunol.,171:3287-3295, 2003

Ｔ細胞レパートリーの多様性は、Ｔ細胞間での多様な抗原認識能と密接に関係していることから、Ｔ細胞の機能，免疫応答，免疫機能を考える上でＴ細胞レセプターレパートリーの機能解明を行うことは極めて重要である。最近、癌，自己免疫疾患，アレルギー疾患等において、患部局所に存在するＴ細胞のＴ細胞レセプターレパートリー解析の研究が進められ、疾患特異的なＴ細胞が解明されつつある。しかし、そのＴ細胞上のＴ細胞レセプター分子が、どのような働きをしているか、ということは、Ｔ細胞レセプター分子の単離が困難であること等の問題があり、まだその詳細が明らかにされるに至っていない。本発明の課題は、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ−１ ２７-３５ (ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ：以下、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドと称する。）を特異的に認識するＴ細胞レセプターβ鎖及びその遺伝子を提供することにある。

Ｔ細胞レセプター分子が、Ｔ細胞を介する免疫応答および免疫機構に重要な役割を果たしていることから、これら免疫応答および免疫機構の解析には、個々のＴ細胞レセプター分子を得ることが必要である。しかし、膜表面タンパク質を細胞から精製すると、１０¹⁰個の細胞からせいぜい１０μｇ程度しか得られない。しかも、Ｔ細胞レセプターの多様性により、一種類のＴ細胞レセプターを分取するためには、それぞれのＴ細胞レセプターを持つＴ細胞株を樹立し、その各々からＴ細胞レセプターを単離することが必須となる。しかし、Ｔ細胞のＴ細胞レセプターレパートリーは１０¹⁰種類にも及んでおり、１０¹⁰種のＴ細胞株を樹立することは、実質的に極めて困難である。

ＭＡＲＴ−１はメラノーマに発現する癌抗原であり、ペプチドワクチンによる治療を受けている転移性のメラノーマ患者において、抗原抗体反応を強く誘導するものである。ＭＡＲＴ−１はＨＬＡ−Ａ２限局的な抗原決定部位を持っており（ＭＡＲＴ−１ ２７−３５：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ＭＡＲＴ−１ ＨＬＡ−Ａ２テトラマー染色により、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の発現頻度が明らかになった。本発明者らは、樹状細胞に基づくＭＡＲＴ−１特異的な細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法を構築し、ＨＬＡ０２０１のケース７例においてＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー染色を使用してそれらの特徴付を行った。患者から末梢血単核細胞を採取し、低濃度のＩＬ２存在下、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされた樹状細胞を１：１０〜１：４０の割合で加え２回刺激した。細胞障害性Ｔ細胞の割合をさらに上げるため、そのセルラインにさらにＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞を１：１０の割合で加えて刺激した。刺激培養されたＴ細胞の総数は、培養前に比較して２つのケースで増え、４つのケースで減少した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞の割合は、刺激前は０．１％だったところ、樹状細胞による刺激後には１．３％、さらにＴ２細胞刺激後では３０％に増加した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞の絶対数は、樹状細胞刺激前とＴ２細胞刺激後では、４６倍から６１９倍の範囲に増加した。ＭＡＲＴ−１特異的な細胞障害性Ｔ細胞系列を用いた細胞障害性Ｔ細胞のアッセイは、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞やＨＬＡ Ａ０２０１陽性メラノーマ細胞に対し、そのテトラマー陽性な細胞障害性Ｔ細胞の発生頻度に応じた強力な殺傷能力の発現を示した。精製されたＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞における、ＣＤＲ３フラグメントサイズ解析を用いたＴ細胞受容体のレパートリー解析は、ＴＣＲＶｂ１３とＴＣＲＶｂ１６が５例中３例使われていた。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー特異的な細胞障害性Ｔ細胞のクローニングは、Ｔ細胞レセプターβ鎖特異的な抗体を基にしてモノクローナル抗体を使った細胞障害性Ｔ細胞のMagnetic activated cell sortingにより行い、Ｔ細胞レセプターβ鎖のＤＮＡシークエンスを解析し、新規なＭＡＲＴ−１を特異的に認識するＴ細胞レセプターβ鎖を同定した。本発明は、上記知見に基づき完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子や、（２）上記（１）記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターや、（３）上記（２）記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体や、（４）組換えベクターが導入されたリンパ球である上記（３）記載の形質転換体や、（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質や、（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識する抗体や、（７）配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするメラノーマ治療用組成物に関する。

本発明によると、メラノーマにおけるＴ細胞の機能，免疫応答，免疫機能を解明する上で有用である。また、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子を利用した遺伝子治療や養子免疫療法により、メラノーマを治療しうる可能性がある。

本発明の遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列、好ましくは５’側端部のＡＴＧの上流側に６塩基（ＧＣＡＧＣＣ）が付加された塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子であり、本発明の発現ベクターは、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターであり、本発明の形質転換体は、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体、好ましくは形質転換ヒト細胞であり、本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質であり、本発明の抗体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識記する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。

本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示される塩基配列又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の各情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。

本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現しているＴ細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。

また、本発明のタンパク質をマーカータンパク質やペプチドタグと結合させることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつ前記本発明のタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されないが、動物細胞において発現しうるものが好ましい。本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。

動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。

本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入された宿主細胞であれば特に制限されないが、リンパ球が好ましく、中でもナイーブＴ細胞が好ましい。特に、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球、好ましくは、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるメラノーマ治療用組成物として有用である。養子免疫療法等免疫治療剤に用いる場合は、形質転換Ｔ細胞クローンを精製することが好ましく、その手法としては、リン酸緩衝液等に混合して遠心する方法、分離剤を用いた比重遠心法などを用いることができる。メラノーマ治療用組成物の投与量は、１回あたり形質転換リンパ球として１０⁶〜１０¹²個の細胞が好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、形質転換リンパ球をヒト血清アルブミンを０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００ccとするのが好ましく、この液量に前記の形質転換リンパ球が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上とすることができる。

本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、メラノーマの診断や本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。

本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質として、ヒトＴ細胞由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を例に挙げてマウス由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖マウスモノクローナル抗体の作製方法を説明する。

上記抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体は、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。

抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現したＴ細胞を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。

また、本発明の上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。

また上記本発明の抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例１における実験概要は、メラノーマ患者（ＨＬＡ−Ａ２陽性）リンパ球→メラノーマ抗原ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理した樹状細胞の作製→樹状細胞刺激によるＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞の誘導→Auto MACS法によるＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマーによるＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬの純化→ＲＮＡ抽出→逆転写反応→ＰＣＲによるＴ細胞レセプター遺伝子の増幅→ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ (ＡＢＩ３１００) を用いたＤＮＡ断片解析（Ｔ細胞レセプター遺伝子の同定）→ＰＣＲによる蛋白コード領域の増幅とクローニング→ＡＢＩ３１００による塩基配列の決定である。

国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られたメラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に５種類の腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本研究では、ＨＬＡ-Ａ２陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ−１ ２７-３５ (ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３)にて処理した樹状細胞を用いて数回刺激を行った。 誘導されたＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＣＴＬ細胞は、ＰＥ−ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマーにて染色し、定量的な評価を行った。テトラマー染色陽性のＣＴＬ細胞の比率は、３８％であり、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的な細胞障害活性を示した。磁気ビーズ細胞分離装置（Auto-magnet cell sorting system）を用いて、ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞を純化した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性細胞の樹状細胞刺激後とＭＡＣＳ法による純化後について解析を行ったところ、陽性細胞は９６％であった（図１）。これらのＣＴＬ細胞は、次のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のレパトワ解析に利用された。

分離細胞からtotal ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴ細胞レセプターレパトワ解析により発現Ｔ細胞レセプターの遺伝子分類を行い、解析結果に基づいてＴ細胞レセプター蛋白コード領域遺伝子をクローニングした。樹状細胞による刺激前のリンパ球を用いた解析結果を図２、樹状細胞による刺激後及びテトラマー陽性細胞の純化後のＣＴＬ細胞を用いた解析結果図３に示す。樹状細胞による刺激の前後では、Ｔ細胞レセプターの遺伝子発現に関して、明らかな収束性が認められた。

Ｔ細胞レセプターレパトワ解析の結果に基づいて４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）に対応するプライマー（配列番号４−８）を用いてＰＣＲ増幅を行い（図４）、各増幅断片の塩基配列を解析した。レパトワ解析では４種類の遺伝子の使用が示されたが、塩基配列の解析により単一の遺伝子に由来することが明らかになった（図５）。解析の結果、このＴ細胞レセプターのＶ遺伝子はＢＶ３（新統一名称ＴＲＢＶ２８、以下こちらの統一名称を使用）であり、他の３種類のプライマーはこの遺伝子に交叉反応して増幅を生じていたことが判明した。

ＴＲＢＶ２８遺伝子に対応するセンスプライマー（配列番号９）とＴＲＢＣ１（Ｃ遺伝子）に対応するアンチセンスプライマー（配列番号１０）を用いて、本Ｔ細胞レセプター遺伝子蛋白コード領域全域（配列番号１）の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした（図６）。塩基配列決定の結果、Ｔ細胞レセプター遺伝子の構成はＴＲＢＶ２８^＊０１―ＴＲＢＤ１―ＴＲＢＪ１−５^＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、Ｖ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、ＩＭＧＴ^※１の公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果を図６に示す。また、Ｔ細胞レセプター遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩ^※２の相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（２７１−４５０、１８０塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。

本研究に使用したプライマーの配列は、Ｔ細胞レセプターレパトワ解析ではJeffry R. Currier and Mary Ann Robinsonが成書Current Protocols in Immunology^※３ に記載したものを使用し、蛋白コード領域のクローニングでは、公開データベース（ＮＣＢＩ）に収載されるゲノム配列にもとづいた。
※１ ImMunoGeneTics:1125985409921_0
※２ National Center for Biotechnology Information:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
※３ Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al. ed. (2000) 10.28.1-10.28.24. John Wiley & Sons, Inc.

実施例１で得られたＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。ここで、ナイーブＴ細胞とは、胸腺での分化後、抗原にまだ遭遇していないＴ細胞のことである。

まず、抗ＣＤ３抗体での刺激によるＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のナイーブＴ細胞の増殖に与える影響を２種類の培地について検討した。ＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ）＋５％ヒト血清（Cambrex）培地、あるいはＰＲＭＩ１６４０＋５％ヒト血清培地に、抗ヒトＣＤ３抗体を各濃度（０、１、２、５、１０μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ）にて添加し、ナイーブＴ細胞（臨床試験に登録されたメラノーマ患者由来）を５日間培養した後、培養液のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を吸光光度計（Narge Nunc International社製）で測定した。結果を図７に示す。その結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のナイーブＴ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体の濃度依存的に刺激され増殖することが確認された。また、ＧＴ−Ｔ５０３培地は、既存のＲＰＭＩ１６４０培地に比較して良好な増殖支持効果があることから、今回の実験で用いることとした。

次に、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体のＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞増殖に対する効果を検討した。ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のメラノーマ患者由来のナイーブＴ細胞をＧＴ−Ｔ５０３＋５％ヒト血清培地に懸濁し、あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体単独（５μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ２８抗体単独（２μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen）又は抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）との併用にて２時間コーティングを行った７５ｃｍ^２フラスコに、上記のリンパ球を２ｘ１０^６／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養した後、培養液のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を、吸光光度計で測定した。結果を図８に示す。その結果、抗ヒトＣＤ２８抗体は、最終濃度１μｇ／ｍｌで抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ）との併用によりナイーブＴ細胞の増殖刺激効果を促進することを確認した。

さらに、上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたナイーブＴ細胞を回収し、Human T cell Nucleofector kit（Amaxa）を用いて、取扱い説明書に従い当該Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置，Amaxa）による遺伝子導入を行った。まず、５×１０^６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ｍｏｃｋ（４μｇ）、ＧＦＰ発現プラスミド（２μｇ）、及びＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミド（２μｇ又は４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ｍｏｃｋとして使用したベクターはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子を切り出したものを、Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミドは、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作成し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD）にてＧＦＰおよびＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。結果を図９に示す。その結果、エレクトロポレーション法によりＧＦＰ遺伝子はナイーブＴ細胞全体の５４．７％に効率良く導入された。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子は、投与量４μｇでリンパ球全体の３５．６％に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の５１．５％に導入発現が確認された。

ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１９９２）に対する、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を評価した。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞としては、前記エレクトロポレーションによりＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミドを２μｇ又は４μｇ導入した細胞を使用した。また、Ｔ２細胞は、ヒトＴ／Ｂ細胞のハイブリッドであるＴ１細胞（不死化したリンパ芽球細胞）からＨＬＡ−Ａ２を発現するクローンを選別して取られた細胞である。該Ｔ２細胞をＰＢＳ＋１％ヒト血清アルブミン溶液に懸濁し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。該ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞１×１０^５個を、同数の前記Ｔ細胞レセプターβ鎖を発現したナイーブＴ細胞と共に混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞に対する、前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。

その結果、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターを発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞は、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドで処理したＴ２細胞特異的にＩＦＮ−γ産生を示した。（図１０）。

さらに、各種培養メラノーマ細胞に対する、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性についても評価した。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞１×１０^５個と同数の、ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＭＡＲＴ１陽性メラノーマ細胞（Ｃ３２：ＡＴＣＣ社製）、ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＭＡＲＴ１陰性メラノーマ細胞（ＲＰＭＩ：ＡＴＣＣ社製）、ＨＬＡ−Ａ１１陽性かつＭＡＲＴ１陽性メラノーマ細胞の３種メラノーマ培養細胞と混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、メラノーマ細胞に対する前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。

その結果、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターを発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陽性で、かつＭＡＲＴ１陽性のメラノーマ細胞Ｃ３２に対して、特異的なＩＦＮ−γ産生を示したが、ＭＡＲＴ１陰性のメラノーマ細胞ＲＰＭＩやＨＬＡ−Ａ１１陽性のメラノーマ細胞に対して、特異的なＩＦＮ−γ産生を示さなかった。この結果、メラノーマ細胞Ｃ３２は腫瘍特異的な細胞障害活性を有することが示唆された（図１１）。

今回ＤＮＡクローニングに成功したＭＲＡＴ１−Ａ２ペプチド特異的Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞への遺伝子導入により機能的なＴ細胞レセプターを発現しうることが確認され、ＨＬＡ−Ａ２陽性でかつＭＡＲＴ１を発現する標的細胞に特異的な細胞障害活性を担うことが明らかになった。

樹状細胞刺激後とＭＡＣＳ法による純化後の解析結果を示す図である。 樹状細胞による刺激前のリンパ球を用いた解析結果を示す図である。 樹状細胞による刺激後及びテトラマー陽性細胞の純化後のＣＴＬ細胞を用いた解析結果を示す図である。 ４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）増幅断片の電気泳動像を示す図である。 ４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）増幅断片塩基配列のアラインメントを示す図である。 ＴＲＢＶ２８遺伝子に対応するセンスプライマーとＴＲＢＣ１（Ｃ遺伝子）に対応するアンチセンスプライマーの塩基配列及びＶ−Ｄ−Ｊ接合部構成の解析結果を示す図である。 ＧＴ−Ｔ５０３培地の、ＣＤ３抗体によるＴ細胞の増殖への影響を示す図である。（○）はＲＰＭＩ１６４０＋５％ＨＳ、（●）はＧＴ−Ｔ５０３＋５％ＨＳを示す。 各抗ＣＤ抗体のリンパ球増殖に対する効果を示す図である。 増殖刺激されたリンパ球におけるＧＦＰおよびＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の導入効率をフローサイトメトリーにて検討した結果を示す図である。 ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞を標的細胞とした、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を、ＩＮＦ−γを指標として評価した結果である。 各種メラノーマ細胞を標的細胞とした、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を、ＩＮＦ−γを指標として評価した結果である。

Claims (7)

1. 配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子。
2. 請求項１記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクター。
3. 請求項２記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体。
4. 組換えベクターが導入されたリンパ球である請求項３記載の形質転換体。
5. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質。
6. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識する抗体。
7. 配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするメラノーマ治療用組成物。