CN112574312B

CN112574312B - 一组ox40单克隆抗体及其医药用途

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Publication number: CN112574312B
Application number: CN202011610223.1A
Authority: CN
Inventors: 陈均勇; 孙自勇; 邱均专; 李忠良; 周漫; 王振生; 孙锴; 孙键; 区日山
Original assignee: Dongda Biotechnology Suzhou Co ltd
Current assignee: Dongda Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112574312A

Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域；具体涉及一组抗OX40受体的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在激活人体T淋巴细胞方面有优异效果的抗OX40单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造。所述抗体在制备应用于激活和调节OX40的作用、水平以及显著增强机体免疫力的相关药物，尤其是治疗癌症相关药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一组OX40单克隆抗体及其医药用途

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗和分子免疫学领域，涉及OX40抗体及其用途。具体地，本发明涉及到多种OX40单克隆抗体。

技术背景

OX40(也称为CD134、ACT35或TNFRSF4)属于TNFR超家族成员，是一个分子量为50kD的糖蛋白，由细胞质尾区、跨膜区和胞外区组成。OX40在非活化的初始T细胞中基本无表达，但在活化T细胞中高表达(Paterson,et al., (1987),Mol.Immunol.24:1281–90；Mallett,et al.,(1990),EMBO J.9:1063–8； Calderhead,et al.,(1993),J.Immunol.151:5261–71)。OX40配体(OX40L)是一种 34kD的II型膜蛋白，以三聚体的形式表达于抗原提呈细胞(Stuber,et al., (1995),Immunity 2:507–21；Ohshima,et al.,(1997),J. Immunol.159:3838–48；Al-Shamkhani,et al.,(1997),J.Biol.Chem.272:5275-5282)。OX40基因敲除小鼠经抗原刺激后，其CD4和CD8 T细胞增殖减少，并产生缺陷型免疫记忆反应，表明内源性OX40在T细胞免疫调节中十分重要 (Kopf,et al.,(1999),Immunity 11:699–708；Redmond,et al.,(2009),Crit.Rev. Immunol.29:187–201；Croft,et al.,(2010),Annu.Rev.Immunol.28:57–78)。

OX40是T细胞增殖和生存所必需，缺失OX40的T细胞在分裂时和分裂后均不能有效存活，这主要是由于抗凋亡Bcl-2家族成员表达水平下降而引起 (Rogers,et al.,(2001),Immunity 15:445-455；Gramaglia,et al.,(2000),J.Immunol. 165:3043-3050)。利用天然配体(OX40L)或激活性抗体，结合T细胞表面的 OX40受体，可以激活多个信号通路，包括转录因子Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B(NF-kB)及活化T细胞转录因子(NFAT)，从而增强多个蛋白分子的表达，如存活蛋白、细胞周期蛋白A、周期蛋白依赖性激酶、Bcl-2抗凋亡分子等，并在抗原刺激后增加多种效应T细胞亚群的存活率和细胞增殖(Rogers,et al.,(2001),Immunity.15:445-455；Song,et al,(2005), Immunity.22:621-31；Sun,et al.,(2018),Cell Death&Disease 9:616-628；Croft,et al.,(2010),Annu.Rev.Immunol.28:57-78)。OX40L-OX40信号传递可以调节T细胞、抗原提呈细胞、NK细胞和NKT细胞的细胞因子分泌，并调节细胞因子受体传导通路的信号转导(Gramaglia,et al.,(1998),J.Immunol.161:6510–17；Diana, et al.,(2009),Immunity.30:289-99；Ohshima,et al.,(1997),J.Immunol. 159:3838–48)。

OX40信号通路影响调节性T细胞(Treg)的产生及功能。Treg可以通过分泌免疫抑制性细胞因子而抑制效应T细胞的生物学功能，如转化生长因子-β(TGF-β) 和白介素10(IL-10)。OX40信号可以抑制1型调节T细胞产生IL-10，抑制 ICOS⁺IL-10⁺Treg细胞增殖，抑制TGF-β及抗原驱动的初始CD4⁺T转变至 CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞，同时阻断天然Treg的抑制性功能(Voo,et al., (2013),J.Immunol.191:3641-50；So,et al.,(2007),J.Immunol.179:1427–1430；Vu, et al.,(2007),Blood 110:2501–2510)。但在一些特定情况下，如缺乏γ干扰素 (IFN-γ)和白介素4(IL-4)时，OX40可以显著刺激Treg细胞增殖，表明OX40 可双向调节Treg细胞，主要取决于细胞周围的炎症环境(Ruby,et al.,(2009),J.Immunol.183:4853；Baeyens,et al.,(2015),J.Immunol.194:999-1010)。

OX40表达于肿瘤浸润T细胞，包括FOXP3⁺Treg细胞，因OX40可显著增强CD4⁺T和CD8⁺T细胞的生物学活性，并消除Treg细胞的功能，故OX40可以作为一个潜在免疫调节靶点用于治疗癌症。临床前研究表明，使用OX40激动剂 (包括抗OX40单克隆抗体和OX40L-Fc融合蛋白)处理荷瘤动物会引起大部分动物肿瘤的消退(Redmond,et al.,(2009),Crit.Rev.Immunol.29:187–201；Gough, et al.,(2010),J.Immunother.33:798–809；Morris,et al.,(2001),Breast Cancer Res. Treat.67:71–80；Ali,et al.,(2004),Vaccine 22:3585–3594；Piconese,et al.,(2008),J. Exp.Med.205:825–39)。OX40激动剂的疗效可能受到多种因素影响，包括肿瘤负荷、肿瘤内在免疫原性，以及肿瘤生长的组织部位(Kjaergaard,et al.,(2000), Cancer Res.60:5514–5521)。虽然OX40抗体疗法在携带较小体积肿瘤的小鼠身上显示出很强的作用，但对于较大肿瘤或肿瘤转移的情况却差强人意。因此，尝试多种联合治疗以克服OX40抗体单独使用的不足。据报道，将OX40抗体与精氨酸酶抑制剂联合治疗，可诱导更有效的CD4⁺T和CD8⁺T细胞反应而使得肿瘤消退(Gough,et al.,(2012),Immunology 136:437-447)。使用抗OX40和抗CTLA-4 抗体的联合疗法可以使得具有弱免疫原性TRAMP-C1抗原的前列腺癌症模型以及具有高免疫原性MCA-205抗原的肉瘤模型的动物存活率显著提高(Redmond, et al.,(2014),Cancer ImmunolRes.2:142–153)。

目前已有多种类型的抗OX40分子用于转移性癌症临床试验。根据首个 OX40抗体的临床数据，虽然该分子的生物活性较强，但其临床抗肿瘤效果并不十分显著。因此，目前仍有必要开发新型有效的OX40抗体药物以用于肿瘤免疫治疗。

发明内容

本发明通过杂交瘤技术获得了一组具有优异激活功能的抗OX40单克隆抗体，并成功对其进行了人源化改造。这些抗体可调节OX40通路并通过交联反应进一步激活机体免疫细胞，且部分抗体能够阻断OX40配体与OX40受体的相互作用，并在动物模型中显示出比阳性对照抗体具有更强的抗肿瘤活性。所述抗体在制备用于调节OX40水平药物、激活机体T淋巴细胞药物、治疗癌症相关药物方面有着巨大应用前景。

本发明提供的鼠源或人源化OX40抗体或功能性片段，其包括了重链序列和轻链序列。抗人OX40鼠源抗体，重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列信息如下：3D9重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2；3C9 重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4；1G4重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：5、6；15A7重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7、8；17C1重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9、10；1A2重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：11、12；3F5重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQID NO：13、14；9G7重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：15、16。以上抗体重链、轻链的CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列信息如下：3D9重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：17、18、19，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20、21、22；3C9重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：23、24、25，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：26、27、28；1G4重链 CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：29、30、31，其轻链CDR1、 CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：32、33、34；15A7重链CDR1、CDR2、 CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：35、36、37，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：38、39、40；17C1重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：41、42、43，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：44、45、46；1A2重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为 SEQ ID NO：47、48、49，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO： 50、51、52；3F5重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：53、54、 55，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：56、57、58；9G7 重链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：59、60、61，其轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO：62、63、64。

进一步，抗人OX40抗体或片段经过改造后，成为人源化抗体。

抗人OX40人源化抗体3C9重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：65，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：66；人源化抗体3F5重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：67，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：68；人源化抗体15A7重链可变区氨基酸序列为SEQID NO：69；其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：70；人源化抗体1A2重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：71，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：72。

表达载体，包含上述抗体的核酸分子。

药物组合物，其包含上述的抗体或其功能片段，以及药用载体。

上述的抗体或其功能性片段，核酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物在制备OX40免疫功能药物的用途。

本专利采用哺乳动物细胞表达系统制备重组的OX40受体蛋白作为抗原，免疫小鼠后，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞进行多次克隆及筛选，得到多个单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株可以分泌产生与OX40受体特异性结合的单克隆抗体(图1、图3)，这些单克隆抗体激动剂活性主要依赖于FcγRII(CD32)介导的交联反应，从而激活核因子 NF-kB信号通路(图2)、增强CD3抗体(OKT3)诱导的Jurkat细胞分泌细胞因子IL-2(图5)、促进人CD4⁺T细胞分泌细胞因子IL-2和IFN-γ(图6)，其中部分单克隆抗体能够有效阻断OX40L与OX40受体结合(图4)，预示部分抗体可能同时存在拮抗功能，并可用于将来的OX40拮抗剂研究。进一步地，通过RT-PCR (ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链式反应)克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接方法 (complementarity-determiningregions graft,CDR-graft)构建人源化抗体。体外功能实验表明，人源化OX40抗体能特异性结合OX40受体蛋白(图7、图9)。这些抗体可以通过FcγRIIB(CD32B)介导的交联作用，激活核因子NF-κB信号通路(图8)、增强CD3抗体(OKT3)诱导的Jurkat细胞分泌细胞因子IL-2(图 10)、促进人CD4⁺T细胞分泌细胞因子(图11)。动物试验结果表明，本专利中的 OX40人源化抗体具有比阳性对照抗体更强的抗肿瘤活性(图12)，阳性对照抗体 BMS-986178的序列来自BMS的专利US20170306035，阳性对照抗体 Vonlerolizumab的序列来自Genentech的专利US20160355597,阳性对照抗体 Hu3738的序列来自AbbVie的专利US20180346593A1。

附图说明

图1：用ELSIA方法测定OX40杂交瘤抗体与OX40-hFc蛋白结合的EC50；

图2：用报告基因(Gene Reporter)方法测定与CD32A交联的OX40杂交瘤抗体激活Jurkat-OX40细胞NF-κB信号的EC50；

图3：用FACS方法测定OX40杂交瘤抗体与Jurkat-OX40细胞结合的EC50；

图4：用FACS方法测定OX40杂交瘤抗体阻断OX40L与Jurkat-OX40细胞结合的IC50；

图5：用ELISA方法测定与CD32A交联的OX40杂交瘤抗体刺激 Jurkat-OX40细胞分泌IL-2；

图6A-6B：用ELISA方法测定Fc交联的OX40杂交瘤抗体刺激人CD4+T 细胞分泌IL-2和IFN-γ；

图7：用ELSIA方法测定人源化OX40抗体与OX40-mFc蛋白结合的EC50；

图8：用报告基因方法测定与CD32B交联的人源化OX40抗体激活 Jurkat-OX40细胞NF-κB信号的EC50；

图9：用FACS方法测定人源化OX40抗体与Jurkat-OX40细胞结合的EC50；

图10：用ELSIA方法测定与CD32B交联的人源化OX40抗体刺激 Jurkat-OX40细胞分泌IL-2；

图11：用ELSIA方法测定Fc交联的人源化OX40抗体刺激人CD4+T细胞分泌IL-2；

图12：OX40单克隆抗体显著抑制人源化OX40小鼠模型中MC38肿瘤的生长。

具体实施方式

实施例1

产生抗OX40单克隆抗体

用人源OX40的胞外区与小鼠Fc融合蛋白(OX40-ECD-mFc)作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat.No.:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8 周龄Balb/c小鼠(购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，抗原免疫量为50 μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat.No.: F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。三次免疫后测定小鼠血清效价，融合前3天通过腹腔注射进行一次加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat.No.: 7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1比例混合，将融合的细胞加入到96孔板中(1X10⁵个/孔)，每孔含有0.1mL的1X HAT(Invitrogen,Cat.No.:21060-017)培养基。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat.No.:11067-030) 培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜HT培养基。第9 天收取上清液进行ELISA和报告基因(Gene Reporter)实验检测。

实施例2

用人源OX40的胞外区与人Fc融合蛋白(OX40-hFc)筛选杂交瘤。用50μL 浓度为2μg/mL的OX40-hFc包被96孔ELISA板(Corning,Cat.No.:9018)，室温过夜；用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液 (PBS+2％BSA)室温孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤ELISA板3次；加入杂交瘤上清液，室温孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL的10000倍稀释的HRP 偶联羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat.No.:31432)，室温避光孵育1小时，洗涤3 次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat.No.:ES-002)，室温孵育显色2 分钟，每孔加入100μL的2N H₂SO₄终止显色反应，用酶标仪(Tecan Spark) 读取各孔OD450数值。

采用报告基因(Gene Reporter)法筛选由FcγRIIA(CD32A)介导的交联反应而引起细胞转录因子NF-kB活化的阳性杂交瘤抗体。取50μL在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清或纯化的杂交瘤抗体与25μL的Jurkat-OX40细胞 (4X10⁴个/孔)混合，加至96孔半区平底板，再加入25μL的293T-CD32A细胞(2.5X10⁴个/孔)，混匀后置于37℃培养箱中孵育4小时。每孔加入25μL预热的Bright-Glo溶液(Promega,Cat.No.:E2620)，室温避光静置3分钟，用酶标仪(Tecan Spark)测定各样品孔冷光(Luminescence)信号值。

在96孔U底细胞板中，加入50μL在上述检测中呈阳性的杂交瘤上清或纯化的杂交瘤抗体与50μL Jurkat-OX40细胞混合(2X10⁵个/孔)，4℃孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+3％FCS)洗涤并离心两次，加入经400倍稀释的PE标记羊抗鼠二抗(Biolegend，Cat.No.:405307)，4℃避光孵育30分钟，用FACS缓冲液洗涤并离心两次，用BD Accuri C6流式细胞仪检测细胞在PE通道信号值。

采用竞争FACS法检测杂交瘤抗体阻断OX40L与OX40受体结合的活性。将杂交瘤上清或纯化的抗体与Jurkat-OX40细胞(2X10⁵个/孔)在96孔U底细胞板中4℃孵育1小时，再加入终浓度为1μg/mL生物素标记的OX40L，混匀后置于4℃孵育1小时，离心后用FACS缓冲液洗涤两次，加入400倍稀释的 PE标记的抗生物素二抗(Biolegend,Cat.No.:409004)，4℃避光孵育30分钟，用FACS缓冲液洗涤并离心两次，用BD Accuri C6流式细胞仪检测细胞在PE 通道信号值。

实施例3

采用有限稀释法，对上述Reporter报告基因检测中的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，随后再重复采用ELISA和Reporter方法进行检测筛选，获得阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤细胞置于50mL无血清培养基中(Invitrogen,Cat. No.:12045-076)培养8-9天后，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore,Cat.No.:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鲎试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测纯化的抗体样品的内毒素含量。用报告基因方法检测对促转录因子 NF-κB活化的能力，采用ELISA和FACS检测纯化的抗体样品与OX40的结合能力，用FACS检测抗体阻断OX40L与OX40结合活性，具体方法参考实施例 2。具体结果见表1-4和图1-4。

表1.用ELSIA检测OX40杂交瘤抗体与OX40-hFc蛋白结合作用

表2.用报告基因法测定与CD32A交联的OX40杂交瘤抗体对Jurkat细胞的激活作用

表3.用FACS测定OX40杂交瘤抗体和人OX40的结合作用

表4.用FACS测定OX40杂交瘤抗体对OX40L与OX40结合的阻断作用

实施例4

与CD32A交联的OX40杂交瘤抗体促进Jurkat-OX40细胞分泌IL-2的检测

将纯化的OX40抗体进行梯度稀释，在96孔U底细胞板中加入25μL抗体稀释液，加入50μL Jurkat-OX40细胞(1×10⁵细胞/孔)、经丝裂霉素处理的25μL 293T-FcγRIIA(CD32A)细胞(2.5×10⁴个/孔)以及50μL 293T-OKT3细胞(2×10⁴个/孔)，混匀后置于37℃培养箱中孵育48小时。收集细胞上清液，用IL-2ELISA 试剂盒(R&D Systems,Cat.No.:DY202)检测细胞上清液中IL-2浓度。如图5 所示，OX40抗体通过CD32A交联后显著增强OKT3引起的Jurkat-OX40细胞分泌IL-2。

OX40杂交瘤抗体Fc交联后对人CD4⁺T细胞分泌IL-2和IFN-γ的促进作用

在50mL无菌离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare,Cat.No.:17-1440-03)，然后加入等体积的健康供体血液稀释液(V_抗凝血 : V_PBS ＝ 1 : 1)，室温1500 rpm离心30分钟。样品在离心管中分成四层，从上至下分别为血浆层，白细胞层，淋巴细胞分离液和红、粒细胞层。将中间的白细胞层收集到新的离心管中，加入10倍体积的洗涤缓冲液(PBS+3％FBS)混匀洗涤，于1500rpm、4℃离心10分钟，重复洗涤2次，用洗涤缓冲液重悬细胞并计数。

细胞计数后，利用人CD4⁺T细胞分离磁珠试剂盒(Miltenyi,Cat.No.: 130-096-533)分选并富集人CD4⁺T细胞。收集分离得到的PBMC，加入合适体积的洗涤缓冲液(40μL/10⁷细胞)重悬细胞，以及合适体积的生物素标记的抗体混合物(10μL/10⁷细胞)，混匀后4℃孵育10分钟。加入洗涤缓冲液(30μL/10⁷细胞)和偶联了抗生物素抗体的磁珠(20μL/10⁷细胞)，混匀后4℃孵育10分钟。将LS分离柱放置在免疫磁珠分离器中，加入3mL洗涤液洗涤LS分离柱。将细胞磁珠悬液加至LS分离柱上端，加入3mL洗涤缓冲液洗涤，共3次。收集流出液即为CD4⁺T细胞，加入合适体积的洗涤缓冲液离心。细胞计数，用完全培养基(RPMI1640+10％FBS)重悬人CD4⁺T细胞后立即进行实验，或将CD4⁺T 细胞冻存至液氮备用。

用50μL Goat anti-mFc抗体(终浓度：2μg/mL)包被96孔板(Corning， Cat.No.:9018)，无菌室温过夜，用无菌PBS洗涤3次，吸尽液体。用完全培养基调整CD4⁺T细胞浓度，每孔加入100μL的CD4⁺T细胞、50μL的OX40抗体稀释液(起始浓度为10μg/mL，10倍梯度稀释)、50μL CD3抗体溶液(终浓度： 80ng/mL)，混匀后将96孔细胞板置于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养48小时、 72小时。收集细胞培养上清液，用IL-2ELISA试剂盒(R&D Systems,Cat.No.: DY202)检测培养48小时的细胞上清中IL-2浓度。用IFN-γELISA试剂盒(R&DSystems,Cat.No.:DY285)检测培养72小时的细胞上清中IFN-γ浓度。结果如图 6所示，OX40抗体在Fc交联后显著促进人CD4⁺T细胞分泌IL-2和IFN-γ。

实施例 5

OX40 抗体可变区基因的克隆

用TRIzon(Cwbiotech,Cat.No.:CW0580)裂解OX40单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat.No.: CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough,etal.(1993),Eur.J.Immunology.23:206-211； Strebe,et al.(2010),AntibodyEngineering 1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a感受态细胞，涂板并置 37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。抗体重链和轻链的可变区和CDR的氨基酸序列见表5-1。

表5-1.OX40抗体序列编号1-64

实施例6

人源化OX40抗体3C9、3F5、15A7、1A2的构建和制备

采用互补决定区嫁接法来进行OX40抗体的人源化。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源抗体3C9、3F5、15A7、1A2的轻、重链可变区同源性最高的人胚系抗体(germlineantibody)序列。3C9抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV2-28*01，重链可变区人源化选取IGHV1-2*02。3F5抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV1-17*01，重链可变区人源化选取IGHV3-7*01。15A7 抗体轻链人源化选取IGKV1-5*01，重链人源化选取IGHV4-59*01。1A2抗体轻链人源化选取IGKV3-11*01，重链人源化选取IGHV2-5*09。保留鼠源抗体的CDR 区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。其次，建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体结构模型中的每个不同氨基酸位点，如果在框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR 区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。根据结构模拟，将人源化抗体框架区的部分氨基酸回复突变为鼠源序列。

根据结构模拟，将3C9、3F5、15A7、1A2人源化抗体框架区的部分氨基酸回复突变为鼠源序列。3C9抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第67 位Val回复突变为Ala，第69位Met回复突变为Leu，第71位Arg回复突变为 Ser，第73位Thr回复突变为Lys。3C9抗体人源化轻链的第64位Gly回复突变为Ser。3F5抗体人源化重链的第30位Ser回复突变为Gly，第69位Ile回复突变为Thr，第93位Ala回复突变为Val。3F5抗体人源化轻链的第36位Tyr回复突变为Leu，第66位Gly回复突变为Arg，第69位Thr回复突变为Ser，第71 位Phe回复突变为Tyr。15A7抗体人源化重链的第27位Gly回复突变为Tyr，第30位Ser回复突变为Thr，第47位Trp回复突变为Tyr，第48位Ile回复突变为Met，第67位Val回复突变为Ile，第71位Val回复突变为Arg，第78位 Phe回复突变为Tyr。1A2抗体人源化轻链的第46位Leu回复突变为Pro，第47 位Leu回复突变为Trp，第71位Phe回复突变为Tyr。1A2抗体人源化重链的第 30位Ser回复突变为Ala。

3C9人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：65 和SEQID NO：66。3F5人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为 SEQ ID NO：67和SEQID NO：68。15A7人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：69和SEQID NO：70。1A2人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：71和SEQID NO：72。人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列见表5-2.

表5-2.OX40抗体序列编号65-72

合成编码3C9、3F5、15A7、1A2人源化抗体轻链和重链的核酸序列，并插入到表达载体pcDNA3.1。用0.1mg抗体轻链和0.1mg抗体重链表达质粒共转染200mL的293细胞(细胞密度为1×10⁶/mL)，在37℃摇瓶振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体进行活性检测。

实施例7

采用报告基因法测定纯化后的人源化OX40抗体与CD32A或CD32B交联后对NF-κB信号通路的激活作用，用ELISA、FACS检测人源化OX40抗体样品与OX40受体蛋白的结合活性，具体方法参考实施例2。人源化抗体hu3C9、 hu3F5、hu15A7、hu1A2的测定结果见表6-8和图7-9。

表6.用ELSIA检测人源化OX40抗体与OX40-mFc蛋白结合作用

表7.用报告基因测定与CD32B交联的人源化OX40抗体对Jurkat-OX40的激活作用

表8.用FACS测定人源化OX40抗体和人OX40的结合作用

实施例8

人源化OX40抗体交联CD32B后对Jurkat-OX40细胞分泌IL-2的作用。将人源化OX40抗体稀释液、Jurkat-OX40细胞、丝裂霉素处理的293T-CD32B和 293T-OKT3混匀，置于37℃细胞培养箱培养48小时，收集细胞上清液，检测上清液中IL-2的浓度，具体测定方法参考实施例4。结果如图10，人源化OX40 抗体与CD32B交联后可显著促进Jurkat-OX40细胞分泌IL-2。

实施例9

人源化OX40抗体的Fc交联后能够促进人CD4⁺T细胞分泌IL-2。将人源化 OX40抗体稀释液、CD4+T细胞、CD3抗体混匀，加至包被有PBS或Goat anti-hFc、 Goat anti-mFc的96孔板中，置于37℃细胞培养箱培养72小时，收集细胞上清液，检测上清液中的IL-2浓度，具体测定方法参考实施例4。结果如图11所示，人源化OX40抗体经Fc交联后可以显著促进人CD4⁺T细胞分泌IL-2。

实施例10

人源化OX40抗体的亲和力检测。测定方法主要包括如下步骤：以氨基偶联的方式将Protein A固定于CM5芯片上，接着以10μL/min的流速捕获OX40抗体。切换流速到30μL/min，将不同浓度的带组氨酸标签的OX40抗原(100nM, 50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.125nM)依次流经样品通道和参比通道，结合时间为3分钟，解离时间为10分钟，最后用pH2.0的甘氨酸缓冲液再生芯片。OX40抗体与OX40抗原的亲和力结果见表9。此外，为了提高抗体的人源化程度，对3F5抗体CDR区域的部分氨基酸位点进行了突变，包括3F5轻链的第24位Lys突变为Arg，第25位Ser突变为Ala，第55位Asp突变为Gln，第56位 Val突变为Ser，用Biacore测定了突变体与OX40抗原的亲和力(表9)。

表9.用Biacore测定人源化OX40抗体样品与OX40的结合

实施例11

OX40单克隆抗体对OX40人源化小鼠中MC38肿瘤生长的抑制作用

实验使用了MC38小鼠肿瘤模型及OX40人源化的C57BL/6小鼠。选择6 周龄的雌性OX40人源化的C57BL/6小鼠，在其背部右下方皮下接种1×10⁶MC38 肿瘤细胞。肿瘤细胞接种2周后，小鼠被分成6个不同的实验组，每组6只，各组的肿瘤体积平均值相似且肿瘤体积在70-100mm³之间。小鼠接受5mg/kg的抗OX40抗体或同型对照抗体IgG1(阴性对照)给药。抗OX40抗体为人源化 3C9、3F5、15A7(即hu3C9-hIgG1、hu3F5-hIgG1和hu15A7-hIgG1)及杂交瘤抗体1A2(mIgG1)。用BMS-986178和Vonlerolizumab作为阳性对照。小鼠按每周两次腹腔注射给药，抗体剂量为5mg/kg，总治疗时间为2.5周。实验期间，用游标卡尺定期测量肿瘤体积，当小鼠肿瘤溃烂或肿瘤体积超过2000mm³时，对小鼠实施安乐死。与BMS和Roche的阳性对照抗体相比，人源化抗OX40抗体hu3C9-hIgG1、hu3F5-hIgG1、hu15A7-hIgG1、及OX40杂交瘤抗体1A2-mIgG1 均显示出更强的对MC38肿瘤生长的抑制作用(图12)。

以上实施例的结果表明,本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物,在制备调节OX40活性或OX40表达水平的药物、促进OX40激活增强机体免疫力的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞表达IL-2和INF-γ的药物、阻断OX40配体与OX40 受体结合的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东大生物技术（苏州）有限公司

<120> 一组OX40单克隆抗体及其医药用途

<130> 2020

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asn Asn Tyr Lys Ser Gln Val Phe Leu

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Thr Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

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Lys Leu Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9轻链可变区氨基酸序列

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Gln

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9重链可变区氨基酸序列

<400> 3

Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Asp Lys Phe

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Lys Val Lys Ala Thr Leu Ala Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9轻链可变区氨基酸序列

<400> 4

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile

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Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn

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Leu Glu Leu Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys

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<212> PRT

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<223> 1G4重链可变区氨基酸序列

<400> 5

Arg Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

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Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

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Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Ser Glu Ile Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

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Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4轻链可变区氨基酸序列

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Met Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser His Leu Glu Gln

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Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Pro Pro Leu

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7重链可变区氨基酸序列

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

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Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

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Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

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Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 人工

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Pro Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1轻链可变区氨基酸序列

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Val Gly

1 5 10 15

His Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

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Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly

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<223> 1A2重链可变区氨基酸序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Val Gln Pro Ser Gln

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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Thr Ser

20 25 30

Gly Val Ala Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Gln Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Ser Ser Gln Val

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Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

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Cys Ala Arg Met Asp Trp Asp Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Ala Gly Thr

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<212> PRT

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<223> 1A2轻链可变区氨基酸序列

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

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Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

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<213> 人工

<223> 3F5重链可变区氨基酸序列

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ile Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ile Val

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Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5轻链可变区氨基酸序列

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

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Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Arg Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Asp Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr

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<212> PRT

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<223> 9G7重链可变区氨基酸序列

<400> 15

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Asp Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

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Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7轻链可变区氨基酸序列

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Tyr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

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Lys

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<212> PRT

<213> 人工

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9重链CDR2区氨基酸序列

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Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser

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<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9重链CDR3区氨基酸序列

<400> 19

Leu Leu Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 21

Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3D9轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 22

Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Pro Thr

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9重链CDR1区氨基酸序列

<400> 23

Ser Tyr Ile Met His

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9重链CDR2区氨基酸序列

<400> 24

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Asp Lys Phe Lys

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Val

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9重链CDR3区氨基酸序列

<400> 25

Gly Asp Tyr Asp Asp Gly Ala Trp Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 26

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe

1 5 10 15

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 27

Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3C9轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 28

Gly Gln Asn Leu Glu Leu Pro Val Thr

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4重链CDR1区氨基酸序列

<400> 29

Asp Tyr Ser Ile His

1 5

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4重链CDR2区氨基酸序列

<400> 30

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4重链CDR3区氨基酸序列

<400> 31

Val Pro Pro Trp Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 32

Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 33

Tyr Thr Ser Met Leu Lys Ser

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1G4轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 34

Gln Gln Gly Asn Thr Pro Pro Leu Thr

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7重链CDR1区氨基酸序列

<400> 35

Ser Asp Tyr Trp Asn

1 5

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7重链CDR2区氨基酸序列

<400> 36

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7重链CDR3区氨基酸序列

<400> 37

Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 38

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 39

Ser Pro Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<223> 15A7轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 40

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

1 5

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1重链CDR1区氨基酸序列

<400> 41

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1重链CDR2区氨基酸序列

<400> 42

Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Phe Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1重链CDR3区氨基酸序列

<400> 43

Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 44

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 44

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Lys

1 5 10 15

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 45

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 17C1轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 46

Val Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2重链CDR1区氨基酸序列

<400> 47

Thr Ser Gly Val Ala Val Gly

1 5

<210> 48

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2重链CDR2区氨基酸序列

<400> 48

His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Gly

1 5 10 15

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2重链CDR3区氨基酸序列

<400> 49

Met Asp Trp Asp Gly Leu Ala Tyr

1 5

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 50

Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His

1 5 10

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 51

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Thr

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 1A2轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 52

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5重链CDR1区氨基酸序列

<400> 53

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5重链CDR2区氨基酸序列

<400> 54

Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ile Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ile Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5重链CDR3区氨基酸序列

<400> 55

Asp Phe Asp Tyr Arg Phe Ala Tyr

1 5

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 56

Lys Ser Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 57

Ala Ala Ser Ser Leu Asp Val

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 3F5轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 58

Phe Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7重链CDR1区氨基酸序列

<400> 59

Asp Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7重链CDR2区氨基酸序列

<400> 60

Tyr Ile Ser Asn Gly Asp Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7重链CDR3区氨基酸序列

<400> 61

Asp Asp Gly Tyr Ser Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7轻链CDR1区氨基酸序列

<400> 62

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7轻链CDR2区氨基酸序列

<400> 63

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<223> 9G7轻链CDR3区氨基酸序列

<400> 64

Gln Gln His Tyr Tyr Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体3C9重链可变区氨基酸序列

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Arg Tyr Asn Asp Lys Phe

50 55 60

Lys Val Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Asp Gly Ala Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体3C9轻链可变区氨基酸序列

<400> 66

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体3F5重链可变区氨基酸序列

<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ile Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ile Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Asp Phe Asp Tyr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 68

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体3F5轻链可变区氨基酸序列

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Asp Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 69

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体15A7重链可变区氨基酸序列

<400> 69

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体15A7轻链可变区氨基酸序列

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Pro Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体1A2重链可变区氨基酸序列

<400> 71

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Thr Ser

20 25 30

Gly Val Ala Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Asp Trp Asp Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工

<223> 人源化抗体1A2轻链可变区氨基酸序列

<400> 72

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一组OX40单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 35；所述重链的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO： 36；所述重链的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO： 37；所述轻链的CDR1氨基酸序列为SEQ ID NO：38；所述轻链的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO： 39；所述轻链的CDR3的氨基酸序列为SEQID NO： 40。

2.根据权利要求1所述的一组OX40单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO： 7；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO： 8。

3.根据权利要求2所述的一组OX40单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化改造；所述人源化改造后的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：69；所述人源化改造后的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO： 70。

4.权利要求1-3任一项所述的一组OX40单克隆抗体或其抗原结合片段在制备预防、治疗、或辅助治疗结肠肿瘤的药物中的用途。

5.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-3任一项所述的一组OX40单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素和生物素中的一种或多种。

6.权利要求5所述的单克隆抗体偶联物在制备预防、治疗、或辅助治疗结肠肿瘤的药物中的用途。