CN113004407B - Lag3抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗人LAG3抗体及其应用。所述抗体能阻断细胞表面表达的LAG‑3蛋白与组织相容性复合物II的相互作用，并且在体外细胞功能实验中，显示出刺激细胞因子产生的生物学功能活性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域。具体地，涉及抗人LAG3抗体及其应用。
背景技术
淋巴细胞活化基因-3或LAG-3(也称作CD223)是一种调节T细胞稳态、增殖和活化的负共刺激受体(Sierro S等人(2010)，Expert Opin.Ther.Targets，15：91-101)，属于I型跨膜免疫球蛋白超基因家族成员。1990年Triebel成功克隆了LAG-3基因(Triebel等人(1990)J.Exp.Med.171：1393-1405)，在两年后证明了LAG-3蛋白是组织相容性复合物MHCII的配体蛋白(Baixeras等人(1992)J.Exp.Med.176：327-337)，与CD4蛋白相比，LAG3与MHCII的结合亲和力高两倍，且结合位点不同(Huard B等人(1997)，Proc Nat Acad Sci USA，94：5744-9)。LAG-3蛋白的编码基因位于第12号染色体上，在结构和遗传上与CD4分子相关。LAG-3蛋白通常在活化T细胞(Huard等人(1994)Immunogenetics 39：213)，记忆CD4+和CD8+T细胞，调节型T细胞(Huang等人(2004)Immunity 21：503-513；Camisaschi等人(2010)J.Immunol.184：6545-655l；Gagliani等人(2013)Nat.Med.19：739-746)，NK细胞和浆细胞样树突细胞DCs(Workman等人(2009)J.Immunol.182：1885-1891)上有表达。LAG-3作为免疫检查点负调控蛋白，能负调控CD4+和CD8+T细胞的增殖和活性。在慢病毒感染过程中，与PD-1一起，共同介导CD8+T细胞的免疫耐受。LAG-3分子在活化的CD4+CD25+调节型T细胞上选择性上调，通过与DC细胞表面的MHC II型分子结合，抑制DC细胞成熟，产生免疫耐受。
鉴于LAG-3在下调免疫反应方面的重要性，通过开发阻断LAG-3蛋白与MHCII型分子相互作用的抗LAG-3抗体，从而用于肿瘤免疫治疗。
本文公开了与LAG-3蛋白高亲和力和特异性结合的抗人LAG-3抗体，该系列抗体能阻断细胞表面表达的LAG-3蛋白与组织相容性复合物II的相互作用，并且在体外细胞功能实验中，显示出刺激细胞因子产生的生物学功能活性。
发明内容
本发明涉及以下几个方面：
1.抗人LAG3的抗体或其抗原结合片段，其特征在于包含选自以下各项组成的组的重链CDR1-3和轻链CDR1-3：
(1)HCDR1：由SEQ ID NO：86的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO：87的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO：88的序列表示；
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2.上述1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：
(1)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：6所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：7所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(2)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：11所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(3)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：14所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：15所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(4)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：18所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：19所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(5)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：22所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：23所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(6)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：27所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(7)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：30所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：31所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(8)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：34所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：35所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(9)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：38所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：39所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(10)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：42所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：43所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(11)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：46所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：47所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(12)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：50所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：51所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(13)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：54所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：55所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(14)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEq ID NO：58所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：58所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：59所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(15)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：62所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：63所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(16)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：66所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：67所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(17)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：70所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：71所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(18)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：74所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：75所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；
(19)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：78所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：79所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列；或
(20)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：82所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：83所示的序列具有至少60％，70％，80％，85％，优选至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列。
3.上述1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，优选来自人IgG或IgM，更优选IgG4，优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.84所示的序列，所述轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.85所示的序列。
4.上述1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab，svFv，Fab′，dAb，F(ab′)2，Fv或Fab/c。
5.上述1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
6.编码上述1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
7.上述6所述的多核苷酸，其选自SEQ ID NO：4和5；SEQ ID NO：8和9；SEQ ID NO：12和13；SEQ ID NO：16和17；SEQ ID NO：20和21；SEQ ID NO：24和25；SEQ ID NO：28和29；SEQ ID NO：32和33；SEQ ID NO：36和37；SEQ ID NO：40和41；SEQ ID NO：44和45；SEQ IDNO：48和49；SEQ ID NO：52和53；SEQ ID NO：56和57；SEQ ID NO：60和61；SEQ ID NO：64和65；SEQ ID NO：68和69；SEQ ID NO：72和73；SEQ ID NO：76和77；或SEQ ID NO：80和81。
8.药物组合物，其包含上述1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.上述1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断治疗肿瘤疾病或在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断治疗肿瘤疾病的药物中的用途，优选地，所述肿瘤是表达LAG3的肿瘤，优选癌症，或在制备用于调节免疫反应的药物中的用途，优选调节免疫反应为刺激IL-2或IFN gamma分泌。
10.上述8所述的药物组合物或权利要求9所述所述的用途，所述药物组合物或所述药物为适于注射的形式，优选是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
如本发明中所使用的，术语“轻链”包括全长轻链和其具有可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
如本发明中所使用的，术语“重链”包括全长重链和其具有可变区序列来赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端，并且CH结构域在羧基末端，CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
如本发明中所使用的，术语“Fab片段”由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
如本发明中所使用的，术语“Fc”区含有两个包含抗体的CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
如本发明中所使用的，术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(其含有VH结构域和CH1结构域以及还有CH1与CH2结构域之间的区域的部分)，以便可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
如本发明中所使用的，术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
如本发明中所使用的，术语“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
如本发明中所使用的，术语“Fd”片段意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
如本发明中所使用的，术语“dAb”片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))由VH结构域组成。
如本发明中所使用的，术语“Fab/c”片段是免疫球蛋白经胃蛋白酶消化形成的抗体裂解中间产物，其兼有Fab和Fc区的优点，即具有扩散能力强，体内代谢清除慢的特点，并能保持高度亲和力(刘建军，《细胞与分子免疫学杂志》，1989(4)：29-29)。
如本发明中所使用的，术语“单链抗体”是其中重链与轻链可变区通过柔性接头连接来形成单条多肽链(其形成抗原结合区)的Fv分子(参见，例如，Bird等人，Science.242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：5879-5883(1988))。
如本发明中所使用的，术语“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向不止一种抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。
如本发明中所使用的，术语“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体是分别具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可通过多种方法产生，包括，但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
如本发明中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的框架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
如本发明中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中使用的，术语“相似性”或“序列相似性”、“同一性”是指两个或更多个蛋白质或多肽分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列测定的。“百分比同一性”意指被比较的分子中的氨基酸之间的相同残基的百分比，并且可基于待比较的最小的分子的大小来计算。为了进行这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的缺口(如果有的话)。当用于多肽时，术语″大体上的同一性″，是指两个肽序列，当例如使用程序GAP或BESTFIT，利用程序提供的缺省缺口权重，进行最佳对齐时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，至少90％或95％的序列同一性，和至少97％、98％或99％的序列同一性。在某些情况下，不相同的残基位点相异在于保守氨基酸置换。″保守氨基酸置换″是这样的置换，即其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或正在水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下，可上调百分比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见例如Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族羟基侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸：2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸：3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺：4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸：5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸：6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，保守氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、苏氨酸-丝氨酸、赖氨酸-精氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选择地，保守置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)(通过引用合并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
附图说明
图1：LAG3单克隆抗体与CHO细胞的结合测定。
图2：LAG3单克隆抗体与CHO-hLAG3的结合测定，其中图2A为LAG3-96、LAG3-188、LAG3-283、LAG3-285以及relatlimab与细胞的结合测定；图2B为LAG3-172、LAG3-268以及relatlimab与细胞的结合测定。
图3：LAG3单克隆抗体与CHO-cynoLAG3的结合测定，其中图3A为LAG3-96、LAG3-188、LAG3-283、LAG3-285以及relatlimab与细胞的结合测定；图3B为LAG3-172、LAG3-268以及relatlimab与细胞的结合测定。
图4：LAG3单克隆抗体与PHA-活化的hPBMC的结合测定，其中图4A为LAG3-96、LAG3-188、LAG3-283、LAG3-285以及relatlimab与细胞的结合测定；图4B为LAG3-172、LAG3-268以及relatlimab与细胞的结合测定。
图5：结合表位竞争性分析，其中图5A为先加入对照抗体与膜表达人LAG3结合后，再加入抗人LAG3抗体，检测抗体与膜表达人LAG3的竞争结合情况；图5B为先加入抗人LAG3抗体与膜表达人LAG3结合后，再加入对照抗体，检测抗体与膜表达人LAG3的竞争结合情况
图6：通过LAG3抗体阻断Raji-MHCII-hLAG3，其中图6A为抗体与人LAG3蛋白结合后，再加入Raji细胞，检测抗人LAG3抗体的阻断效果；图6B为抗体与Raii细胞先孵育，再检测抗体与人LAG3蛋白的结合
图7：LAG3抗体的体外Jurkat-hLAG3-Raii生物测定。
图8：SEB活化的hPBMC生物测定，其它图8A为供者一来源的活化PBMC，单独使用抗人LAG3抗体；图8B为供者一来源的活化PBMC，抗人LAG3抗体和固定浓度的抗人PD-1抗体联用；图8C为供者一来源的活化PBMC，固定浓度的人LAG3抗体和不同浓度抗人PD-1抗体的联用；图8D为供者二来源的活化PBMC，单独使用抗人LAG3抗体；图8E为供者二来源的活化PBMC，抗人LAG3抗体和固定浓度的抗人PD-1抗体联用；图8F为供者二来源的活化PBMC，固定浓度的人LAG3抗体和不同浓度的抗人PD-1抗体的联用。
图9：SEB活化的PBMC生物测定，其中图9A为供者一来源的活化PBMC，单独使用抗人LAG3抗体；图9B为供者一来源的活化PBMC，抗人LAG3抗体和固定浓度的抗人PD-1抗体联用；图9C为供者一来源的活化PBMC，固定浓度的人LAG3抗体和不同浓度抗人PD-1抗体的联用；图9D为供者二来源的活化PBMC，单独使用抗人LAG3抗体；图9E为供者二来源的活化PBMC，抗人LAG3抗体和固定浓度的抗人PD-1抗体联用；图9F为供者二来源的活化PBMC，固定浓度的人LAG3抗体和不同浓度抗人PD-1抗体的联用。
图10：体外T-DC MLR生物测定，其中图10A为IL-2的分泌表达；图10B为干扰素γ的分泌。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗人LAG3抗体的产生
1.1免疫原
采用重组人LAG3融合蛋白作为免疫原，用于产生人LAG3抗体。在免疫过程中，采用携带his标签的人LAG3胞外结构域融合蛋白hLAG3-his(Acrobiosystem，Cat.LA3-H5222，在下面实施例中，也称为“人LAG3重组蛋白”)作为免疫原。
1.2免疫流程
采用常用的小鼠杂交瘤体系产生抗人LAG3鼠单抗。过程如下，将重组人LAG3重组蛋白(即hLAG3-his)1.2mg/ml与弗氏完全佐剂(Sigma，Cat.F5881)等体积混合，得到的油状乳液，以0.2ml的剂量皮下施给6周龄雌性BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心雌性)背部位点。第一次免疫14天后，采用重组人LAG3重组蛋白与弗氏不完全佐剂(Sigma，Cat.F5506)等体积混合后，腹腔增强免疫，加强免疫至4针后，采集尾血进行效价检测，待效价达到既定滴度，进行脾脏融合。
1.3杂交瘤细胞的制备
将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按照1∶10细胞数量比例混合，转移至50ml离心管中，用RPMI 1640基础培养基洗涤一次。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1ml 50％PEG1500融合。融合1min后，加入15ml RPMIl640基础培养基终止细胞融合。1000rpm离心5min，弃上清。用50ml RPMI1640筛选培养基轻轻混悬，平分于96孔板中，共10块，50μl/孔，37℃、5％CO2细胞培养箱静置培养。培养至第六天，更换HT培养基(含HT的RPMI1640完全培养基)两次。
1.4抗人LAG3抗体的检测
用0.05M碳酸缓冲液稀释携带人Fc标签的人LAG3重组蛋白(Acrobiosystem，Cat.LA3-H5255)至终浓度为2μg/ml，按100μl/孔加入96孔ELISA检测板中，37℃孵育2h或2-4℃包被过夜。弃上清，按200μl/孔加入封闭液(1xPBS+1％BSA)，37℃封闭1h。重组融合后第7天，按100μl/孔加入细胞上清，37℃静置孵育30min。用1xPBS洗涤3次。按100μl/孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG(sigma A0168-1ML)，37℃静置孵育30min，用1xPBS洗涤3次后，进行显色反应。
1.5亚克隆的筛选
挑选OD450≥1的融合子，采用有限稀释法进行克隆化，至少2次。采用1.4进行检测。所得的阳性亚克隆经体外培养进行保种和表达。
1.6抗人LAG3抗体的表达和纯化
待产生抗人LAG3抗体的克隆生长至汇合率至80％时，将细胞吹落，1000rpm离心5min后，用30ml含5％FBS的SFM完全培养基重悬细胞，并转移至150ml SF摇瓶中，37℃，8％CO2，120rpm培养2-3天。当细胞密度达到5x105/ml时，1000rpm离心5min，用50ml无血清的SFM基础培养基重悬细胞，并转移至250ml SF摇瓶中，37℃，8％CO2，120rpm培养4-5天，9000rpm离心20min，收集上清进行纯化。纯化采用ProA亲和层析。过程如下，使用AKTA avant 150层析设备，用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX，GE)，加载样品至层析柱，使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱，随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc，pH＝3.4)洗脱目标蛋白，收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris，pH8.0)，中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定，一般加入10％洗脱体积量。
1.7抗人LAG3抗体浓度的测定
样品使用Biotek-Epoch-Take-3进行浓度测定，利用A280方法检测抗体浓度，即以消光系数E.C.＝1.37，光程＝0.05mm(Take-3板不同孔光程有细微差异，会自动校正)，通过设备检测样品吸光值，按照Lambert-Beer 1aw计算待测抗体的浓度。样品浓度过低则需要进行超滤浓缩，使用超滤浓缩管(
Ultra-15 Centrifugal Filter Devices，30kD)按照说明书提供的通用操作方法，将样品浓度浓缩至＞0.5mg/ml；收集浓缩端样品，0.22um无菌枕头滤器除菌过滤(利百特，PES，0.22um，直径13mm)。
1.8抗人LAG3抗体亚型的鉴定
用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释携带人Fc标签重组人LAG3重组蛋白(Acrobiosystem，Cat.LA3-H5255)，使其终浓度为2μg/mL。按100μl/孔加入96孔ELISA检测板中，37℃孵育2小时或4℃过夜。弃上清，按200μl/孔加入封闭液(1xPBS+1％BSA)，37℃封闭1h。用含1％BSA的1xPBS稀释抗体至1μg/ml，按100μl/孔加入抗人LAG3抗体，37℃孵育30分钟。用1xPBS洗涤3次。按100μl/孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG(sigma A0168-1ML)、HRP标记的羊抗鼠IgG2a(thermo fisher M32207)、HRP标记的羊抗鼠IgG1(thermo fisher PA1-74421)、HRP标记的羊抗鼠IgG2b(thermo fisher M32407)、HRP标记的羊抗鼠IgG3(thermofisher M32607)、HRP标记的羊抗鼠IgM(thermo fisher 31440)，37℃静置孵育30min，用1xPBS洗涤3次后，进行显色反应。
实施例2抗人LAG3抗体序列鉴定和嵌合抗体的构建
2.1抗人LAG3抗体序列的鉴定
选取抗人LAG3鼠单抗进行序列分析。方法如下，使用RNA提取试剂盒MagExtractor-RNA-(Toyobo，Cat.NPK-201F)，从5x106个鼠杂交瘤细胞中提取获得总RNA。通过5’RACE方法流程，采用SMARTer RACE 5’Kit试剂盒(Takara Bio，Cat.634858)，获得cDNA序列。使用5’RACE通用引物和3’鼠特异性保守区引物，扩展出抗体可变区序列，并将含可变区序列的PCR克隆序列连接到pcDNA3.4TMA载体上(GibcoTMpcDNATM3.4TOPOTMTA CloningKit，Fisher scientific，Cat.A14697)，转染大肠杆菌E.coli DH5 d感受态细胞(NEB，Cat.C29871)。采用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN，Cat.DP117)抽提质粒，然后进行序列测序(Thermofisher公司)。
根据kabat编号系统，其中20株抗人LAG3抗体的核苷酸序列如表1所示，氨基酸序列如表2所示，如下：
表1抗人LAG3抗体的核苷酸序列
表2抗人LAG3抗体的氨基酸序列
2.2抗人LAG3人鼠嵌合抗体的构建和表达
采用标准重组DNA技术构建全长的人鼠嵌合抗体序列。步棸如下，采用叠加PCR技术，将抗人LAG3抗体的重链可变区嫁接到人IgG4恒定区(氨基酸序列SEQ ID N0.84)，将抗人LAG3抗体的轻链可变区嫁接到人Kappa恒定区上(氨基酸序列SEQ ID N0.85)上，克隆PCR产物连接到载体pcDNA3.4上，通过PEI介导的瞬时转染技术，以Expi293细胞(ThermoFisherScientific，Cat.A14635)为宿主细胞，表达抗人LAG3抗体，收获的细胞上清通过ProA亲和层析技术进行纯化，纯化后的样品经超滤浓缩管(
Ultra-15Centrifugal FilterDevices，30kD)浓缩至＞0.5mg/ml；收集浓缩端样品，0.22um无菌枕头滤器除菌过滤(科百特，PES，0.22um，直径13mm)，整个过程控制样品内毒素≤1.0EU/mg。
实施例3抗人LAG3抗体的结合活性
选取6株抗人LAG3抗体进行结合活性的评价，该6株抗体为LAG3-96，LAG3-172，LAG3-188，LAG3-268，LAG3-283和LAG3-285。
3.1稳定表达全长人LAG3、猕猴LAG3和小鼠LAG3的中国仓鼠细胞的结合活性
为评价抗人LAG3抗体与人LAG3、猕猴LAG3和小鼠LAG3的结合活性，筛选并构建稳定表达人LAG3全长蛋白(Genbank No.NP_002277，SEQ ID N0.1)，猕猴LAG3(Macacamulatta LAG3 pa23-5，SEQ ID N0.2)和小鼠LAG3(Genbank No.NP_032505，SEQ ID N0.3)的中国仓鼠CHO稳定细胞株(分别表示为CHO-hLAG3，CHO-mLAG3和CHO-cynoLAG3)。抗人LAG3抗体的结合活性评价，流程如下。用1xFCM缓冲液(1xPBS+3％BSA)重悬CHO稳定细胞株至2x106/ml，按100μl/孔加入到96孔V底板中。用1xFCM缓冲液稀释抗人LAG3抗体至浓度为20μg/ml。按100μl/孔加入到细胞中，冰上静置孵育30min后，250xg离心5min后，吸弃上清。用1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入用1xFCM缓冲液稀释的PE标记的羊抗人Fc荧光二抗(稀释倍数为1∶500)(Biolegend，Cat.409304)，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，加入1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1xPBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，cytoFLEX)进行检测。
如图1所示，6株抗LAG3抗体与CHO空细胞没有非特异性结合，且与膜表达的鼠LAG3蛋白没有交叉反应，而与CHO-hLAG3和CHO-cynoLAG3的结合活性与BMS relatlimab(百时美施贵宝公司，为IgG4亚型)相当。
3.2稳定表达人LAG3的CHO-hLAG3的结合活性EC50
为表征抗人LAG3抗体与人LAG3的结合亲和力，用1xFCM缓冲液(1xPBS+3％BSA)将抗人LAG3抗体进行3倍倍比稀释，起始浓度为100μg/ml，然后与CHO-hLAG3稳定细胞株共孵育。具体实验流程同2.1。
如图2所示(A和B)，除LAG3-285与CHO-hIAG3结合活性较弱外，其他5株抗人LAG3抗体的结合活性与BMSrelatlimab相当。
3.3稳定表达猕猴LAG3的CHO-cynoLAG3的结合活性EC50
为表征抗人LAG3抗体与猕猴LAG3的结合亲和力，用1xFCM缓冲液(1xPBS+3％BSA)将抗人LAG3抗体进行3倍倍比稀释，起始浓度为100μg/ml，然后与CHO-cynoLAG3稳定细胞株共孵育。具体实验流程同2.1。
如图3所示(A和B)，6株抗人LAG3抗体与稳定表达在CHO上的猕猴LAG3的结合活性好于BMS relatlimab。
3.4活化健康人PBMC的结合活性
采用人淋巴细胞分离液LymphoprepTM(Axis-Shield，Cat.07851)从健康人外周血中分离得到外周血淋巴细胞PBMC。用含10％FBS的X-VIVO 15完全培养基(Lonza，Cat.04-418Q)重悬健康人PBMC，并调整细胞密度至1x106/ml，37℃5％CO2细胞培养箱中静置2h后，加入终浓度为1μg/ml植物血凝素PHA-L(Sigma，Cat.L4144)，混合均匀后连续刺激3天。取出细胞悬液，250xg离心5min后，吸弃上清，用1xFCM缓冲液(1xPBS+3％BSA)调整细胞密度至2x106/ml，按100μl/孔分于96孔V型板中。用1xFCM缓冲液(1xPBS+3％BSA)3倍倍比稀释的抗人LAG3抗体，其起始浓度为100μg/ml，按100μl/孔加入到细胞中，冰上孵育30min后，250xg离心5min后，吸弃上清。用1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入用1xFCM缓冲液稀释的PE标记的羊抗人Fc荧光二抗(稀释倍数为1∶500)(Biolegend，Cat.409304)，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，加入1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1xPBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，cytoFLEX)进行检测。
如图4所示(A和B)，除LAG3-285与活化后健康人PBMC的结合活性较弱外，其他5株抗人LAG3抗体的结合活性与BMS relatlimab相当。
3.5人LAG3的结合动力学KD分析
采用MD ForteBIO QKe平台进行抗人LAG3抗体与人LAG3的结合动力学常数分析。实验方法如下，用平衡缓冲液(1xPBS+0.02％吐温20)稀释携带his标签的人LAG3胞外区重组蛋白hLAG3-his(Acrobiosystem，Cat.LA3-H5222)至终浓度为4μg/ml。用平衡缓冲液(1xPBS+0.02％吐温20)2倍倍比稀释抗人LAG3抗体，起始浓度为200nM，共7个浓度。待anti-Penta-HIS生物传感器(ForteBIO，Cat.18-5122)充分水化后，先固化hLAG3-his重组蛋白120秒，平衡90秒后，与抗人LAG3抗体结合，其中结合时间为300秒，解离时间为600秒。整个反应在25℃，1000rpm条件下进行。最后用Octet分析软件进行曲线拟合，获得抗人LAG3抗体的结合动力学常数KD。
如表2所示，6株抗人LA3抗体与人LAG3重组蛋白的结合动力学常数均在pM级别。
表2：
| 抗体名称 | KD，x10<sup>-10</sup>(M) |
| LAG3-96 | ＜0.01 |
| LAG3-172 | ＜0.01 |
| LAG3-188 | 2.87 |
| LAG3-268 | 0.056 |
| LAG3-283 | 1.88 |
| LAG3-285 | 0.28 |
| relatlimab | 3.68 |
实施例4抗人LAG3抗体的表位分析
4.1epitope binning采用MD ForteBIO QKe平台进行抗人LAG3抗体的表位竞争分析。实验方法如下，用平衡缓冲液(1xPBS+0.02％吐温20)稀释携带his标签的人LAG3胞外区重组蛋白hLAG3-his(Acrobiosystem，Cat.LA3-H5222)至终浓度为3μg/ml。用平衡缓冲液(1xPBS+0.02％吐温20)稀释抗人LAG3抗体，其终浓度为30μg/ml。待anti-Penta-HIS生物传感器(ForteBIO，Cat.18-5122)充分水化后，先固化hLAG3-his重组蛋白180秒，平衡30秒后，再固化抗人LAG3抗体180秒，平衡30秒后，再与抗人LAG3抗体结合其中结合时间为180秒。整个反应在25℃，1000rpm条件下进行。最后用Octet分析软件进行epitope binning分析。
实验结果发现，6株抗人LAG3抗体与BMS relatlimab表位均不同，其中，LAG3-188和LAG3-285分别为独立抗原结合表位，LAG3-96、LAG3-172、LAG3-268和LAG3-283存在表位竞争。
4.2流式分析细胞水平的抗体表位竞争
用1xFCM缓冲液(1xFBS+3％BSA)稀释抗LAG3抗体，其中第一抗体包括BMSrelatlimab-CH1(mIgG1亚型，是用鼠mIgG1重链恒定区和kappa轻链恒定区替代relatlimab抗体的恒定区，该抗体由Expi293细胞瞬时转染表达生产)、mIgG1同型对照抗体(Biolegend，Cat.401411)，其浓度为10μg/ml，第二种抗体包括6株抗人LAG3抗体、BMSrelatlimab(hIgG4亚型)和hIgG4同型对照抗体(Biolegend，Cat.403702)，其浓度为1μg/ml。用1xFCM缓冲液重悬CHO-hLAG3稳定细胞株，调整细胞密度为2x106/ml，按100μl/孔分于96孔板中。250xg离心5min后，吸弃上清，加入第一种抗体100μl，冰上孵育30min后，加入第二种抗体100μl，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清。用1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入用1xFCM缓冲液稀释的PE标记的羊抗人Fc荧光二抗(稀释倍数为1∶500)(Biolegend，Cat.409304)，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，加入1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1xPBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，cytoFLEX)进行检测。反之，第一种抗体包括6株抗人LAG3抗体、BMS relatlimab(hIgG4亚型)和hIgG4同型对照抗体，其浓度为10μg/ml，第二种抗体包括relatlimab-CH1(mIgG1亚型)、mIgG1同型对照抗体，其浓度为1μg/ml。荧光二抗为PE标记的羊抗鼠Fc荧光二抗(稀释倍数为1：500)(Biolegend，Cat.405307)。
如图5所示(A和B)，6株抗人LAG3抗体的抗原结合表位与BMS对标抗体均不同，不存在竞争关系。
实施例5抗人LAG3抗体介导的配体阻断实验
淋巴细胞表面表达的LAG3蛋白通过与组织相容性复合物分子MHCII结合，从而抑制淋巴细胞的刺激活性。对阻断型抗人LAG3抗体进行评价，实验方法如下：用1xFCM缓冲液3倍倍比稀释抗人LAG3抗体，起始浓度为100μg/ml。用1xFCM缓冲液稀释重组人LAG3-mFc蛋白(Acrobiosystem，Cat.LA3-H52Aa)至浓度为20μg/ml。用1xFCM缓冲液重悬Raji细胞(来自北京中科院动物园)至1x106/ml细胞密度，按100μl/孔均分于96孔V底板中。采用如下2种模式进行实验，(1)按100μl/孔将抗体加入到Raji细胞中，冰上孵育30min后，按100μl/孔加入重组人LAG3-mFc蛋白，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，用1xFCM洗涤1次后，按100μl/孔加入用1xFCM缓冲液稀释的PE标记的羊抗鼠Fc荧光二抗(稀释倍数为1∶500)(Biolegend，Cat.405307)，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，加入1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1xPBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，cytoFLEX)进行检测。(2)按100μl/孔加入重组人LAG3-mFc蛋白，冰上孵育30min，然后，按100μl/孔将抗体加入到Raji细胞，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，用1xFCM洗涤1次后，按100μl/孔加入用1xFCM缓冲液稀释的PE标记的羊抗鼠Fc荧光二抗(稀释倍数为l：500)(Biolegend，Cat.405307)，冰上孵育30min。250xg离心5min后，吸弃上清，加入1xFCM洗涤2次后，按100μl/孔加入1xPBS重悬细胞，采用流式细胞仪(Beckman，cytoFLEX)进行检测。
如图6所示(A和B)，相对方法(2)，方法(1)抗人LAG3抗体表现出更好的阻断活性。其中，LAG3-172、LAG3-188和LAG3-268显示出更好的阻断活性。
实施例6抗人LAG3抗体的体外活性表征
6.1Jurkat-hLAG3和Raji共孵育体系中刺激IL-2的产生
由于Jurkat细胞不表达内源性的人LAG3蛋白，因此，利用常规方法，通过慢病毒包装体系构建稳定表达人LAG3蛋白(NCBI Reference Sequence：NP_002277.4)的Jurkat细胞(ATCC YB-ATCC-2237)，即Jurkat-hLAG3稳定细胞株。实验当天，用含10％FBS的RPMIl640完全培养基重悬Raji细胞至5x106/ml，加入2.5μg/ml丝裂霉素c(Selleck，Cat.S8146)，37℃处理30min后，用完全培养基洗涤2遍后，用完全培养基重悬Raji细胞。同时，用完全培养基重悬Jurkat-hLAG3细胞。按1∶5比例将Jurkat-hLAG3和Raji细胞混匀，其中Raji细胞密度为2x104/孔。按150μl/孔将混合细胞分装于96孔平底板中。用完全培养基3倍倍比稀释抗人LAG3抗体，起始浓度为40μg/ml，按50μl/孔吸取抗体至.Jurkat-hLAG3和Raji混合细胞中，混匀后，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养1天。吸取上清，采用IL-2Human UncoatedELISAKit(eBioscience，Cat.88-7025)检测 IL-2的表达。
结果如图7所示，6株抗LAG3抗体中，Lag3-188和LAG3-285显示出较好刺激IL-2表达的活性。
6.2SEB活化健康人PBMC体系中刺激IL-2和IFN gamma的产生
采用超抗原SEB活化健康人PBMC方法刺激IL-2和IFN gamma的产生。实验采用人淋巴细胞分离液LymphoprepTM(Axis-Shield，Cat.07851)从健康人外周血中分离得到外周血淋巴细胞PBMC。用含10％FBS的X-VIVO 15完全培养基(Lonza，Cat.04-418Q)重悬健康人PBMC，转移至T75细胞培养瓶中，37℃5％CO2细胞培养箱中静置过夜。次日，用X-VIV015完全培养基稀释健康人PBMC至细胞密度为1x106/ml，同时加入0.15μg/ml葡萄球菌肠毒素SEB(toxin technology，Cat.BT202)，混匀后，按100μl/孔分装于96孔平板中。加入待检抗体，混匀后，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3天。吸取上清，采用IL-2 Human Uncoated ELISAKit(eBioscience，Cat.88-7025-88)和Human IFN gamma Uncoated ELISA Kit(eBioscience，Cat.88-7316-88)检测IL-2和IFN gamma的表达。抗体配制如下，共3组。(1)抗人LAG3抗体单用，用X-VIVO15完全培养基稀释抗人LAG3抗体至终浓度为10μg/ml；(2)抗人LAG3抗体和抗人PD1抗体(Opdivo，百时美施贵宝)联用，其中固定抗人PD1抗体浓度终浓度为0.1μg/ml，抗人LAG3抗体终浓度为10、2和0.4μg/ml；(3)抗人LAG3抗体和抗人PD1抗体联用，其中固定抗人LAG3抗体浓度终浓度为10μg/ml，抗人PD1抗体浓度为1、0.2、0.04、0.008和0.0016μg/ml。
实验结果如图8A、8D、9A和9D所示，单用抗人LAG3抗体时，LAG3-188在诱导SEB活化的健康人PBMC产生IL-2和IFN gamma表现出更好的活性；如图8B、8E、9B和9E所示，固定抗人PD1抗体Opdivo 0.1μg/ml，联用不同浓度抗人LAG3抗体时，LAG3-188和LAG3-285表现出较好的细胞因子分泌刺激活性；如图8C、8F、9C和9F所示，固定抗人LAG3抗体浓度为10μg/ml，联用不同浓度的抗人PDl抗体Opdivo时，LAG3-188、LAG3-283和LAG3-285表现出较好的刺激细胞因子分泌的活性。
6.3 T-DC异体混合淋巴反应体系中刺激IL-2和IFN gamma的产生
通过异体T-DC MLR实验，评价抗人LAG3抗体刺激细胞因子IL-2和IFN gamma的活性。实验流程如下，采用人淋巴细胞分离液LymphoprepTM(Axis-Shield，Cat.07851)从健康人外周血中分离得到外周血淋巴细胞PBMC。其中，供体1的PBMC经人CDl4Microbeads(Miltenyi，Cat.130-050-201)正筛选获得CD14+单核细胞。将单核细胞按照2x106/ml接种于T25培养瓶中，补加细胞因子人GM-CSF和IL-4至终浓度为50ng/ml，连续刺激6天后，补加TNFalpha至终浓度为50ng/ml，继续诱导分化3天获得成熟的DC细胞。供体2的PBMC经EasySepTMHuman T Cell Enrichment Kit(Stemcell，Cat.19051)负筛选获得CD3+T细胞。按照DC∶T细胞比例为1∶10，DC细胞量为2x104/孔，将DC和T细胞混合均匀后分于96孔U型板中，共150μl/孔体系。用X-VIVO 15完全培养基稀释抗人LAG3抗体，按50μl/孔加入到细胞中。共两组实验，(1)单用抗人LAG3抗体，终浓度为10μg/ml；(2)与抗人PD1抗体联用，即抗人PD1抗体Opdivo浓度为0.05μg/ml，抗人LAG3抗体浓度为10μg/ml。混合淋巴实验反应3-5天后，检测细胞上清中IL-2和IFN gamma的表达。
结果如图10A所示，在T-DC异体混合淋巴反应实验中，抗人LAG3抗体单用并没有显示出显著提高细胞因子分泌的效果。当与抗人PD1抗体Opdivo联用时，LAG3-96、LAG3-188、LAG3-283和LAG3-285提高IL-2的分泌效果更好，LAG3-172提高IFN gamma的分泌效果更显著。
Claims (52)
1.抗人LAG3的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗人LAG3的抗体包含选自以下各项组成的组的重链CDR1-3和轻链CDR1-3:
(1) HCDR1：由SEQ ID NO:122的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:123的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:124的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:125的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:126的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:127的序列表示；
(2) HCDR1：由SEQ ID NO:152序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:153的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:154的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:155的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:156的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:157的序列表示；
(3) HCDR1：由SEQ ID NO:164的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:165的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:166的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:167的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:168的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:169的序列表示；
(4) HCDR1：由SEQ ID NO:176的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:177的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:178的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:179的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:180的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:181的序列表示；
(5) HCDR1：由SEQ ID NO:182的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:183的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:184的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:185的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:186的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:187的序列表示；
(6) HCDR1：由SEQ ID NO:188的序列表示；HCDR2：由SEQ ID NO:189的序列表示；HCDR3：由SEQ ID NO:190的序列表示；
LCDR1：由SEQ ID NO:191的序列表示；LCDR2：由SEQ ID NO:192的序列表示；LCDR3：由SEQ ID NO:193的序列表示。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：
（1）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:30所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:31所示的序列具有至少60%序列同一性的序列；
（2）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:50所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:51所示的序列具有至少60%序列同一性的序列；
（3）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:58所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:59所示的序列具有至少60%序列同一性的序列；
（4）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:66所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:67所示的序列具有至少60%序列同一性的序列；
（5）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:70所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:71所示的序列具有至少60%序列同一性的序列；
（6）重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:74所示的序列具有至少60%序列同一性的序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO:75所示的序列具有至少60%序列同一性的序列。
3.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少70%序列同一性。
4.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少80%序列同一性。
5.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少85%序列同一性。
6.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少86%序列同一性。
7.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少87%序列同一性。
8.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少88%序列同一性。
9.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少89%序列同一性。
10.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少90%序列同一性。
11.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少91%序列同一性。
12.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少92%序列同一性。
13.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少93%序列同一性。
14.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少94%序列同一性。
15.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少95%序列同一性。
16.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少96%序列同一性。
17.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少97%序列同一性。
18.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少98%序列同一性。
19.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的序列与SEQ IDNO:30、50、58、66、70或74所示的序列具有至少99%序列同一性。
20.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少70%序列同一性。
21.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少80%序列同一性。
22.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少85%序列同一性。
23.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少86%序列同一性。
24.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少87%序列同一性。
25.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少88%序列同一性。
26.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少89%序列同一性。
27.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少90%序列同一性。
28.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少91%序列同一性。
29.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少92%序列同一性。
30.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少93%序列同一性。
31.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少94%序列同一性。
32.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少95%序列同一性。
33.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少96%序列同一性。
34.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少97%序列同一性。
35.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少98%序列同一性。
36.权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO:31、51、59、67、71或75所示的序列具有至少99%序列同一性。
37.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区。
38.权利要求37所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区和轻链恒定区来自人IgG或IgM。
39.权利要求37所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区和轻链恒定区来自IgG4。
40.权利要求37-39任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.84所示的序列，所述轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.85所示的序列。
41.权利要求1-36任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab，scFv，Fab'，F(ab')2，Fv或Fab/c。
42.权利要求1-36任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体。
43.权利要求1-36任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体。
44.编码权利要求1-43任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
45.权利要求44所述的多核苷酸，其选自SEQ ID NO:28和29；SEQ ID NO:48和49；SEQID NO:56和57；SEQ ID NO:64和65；SEQ ID NO:68和69；SEQ ID NO:72和73。
46.药物组合物，其包含权利要求1-43任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
47.权利要求46所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
48.权利要求1-43任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断表达LAG3的肿瘤疾病的药物中的用途，或在制备用于刺激IL-2或IFNgamma分泌的药物中的用途。
49.权利要求48所述的用途，所述肿瘤疾病为癌症。
50.权利要求46或47所述的药物组合物，所述药物组合物为适于注射的形式。
51.权利要求46或47所述的药物组合物，所述药物组合物是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
52.权利要求50所述的药物组合物，所述药物组合物是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
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