JP5413544B1 - 酵素処理工程を含むレクチンを用いた抗原検出方法 - Google Patents

Abstract

レクチンを用いた糖鎖の検出系において、簡便な手法（簡易な構成）により、レクチンによる対象抗原上の糖鎖の検出感度および定量性を向上させることができる抗原の検出方法、ならびに検出キットを提供する。
本発明の抗原の検出方法は、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを用いて、検体中の前記特定の糖鎖を有する抗原を検出する方法であって、前記レクチンを検体に接触させる第１工程と、前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を、検体に接触させる第２工程と、前記第１工程および第２工程の後に、前記レクチンと結合した前記抗原を検出する第４工程とを有する抗原の検出方法である。

Description

本発明は、レクチンを用いた抗原検出方法に関する。より詳しくは、検体を酵素処理する工程を含む、レクチンを用いた高感度・低ノイズである抗原検出方法に関する。

生体の生命機能を担う主役であるタンパク質が、細胞社会の中において秩序正しく機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が極めて重要な役割を担っている。生体内の殆どのタンパク質は糖鎖による修飾を受けており、タンパク質に付加した糖鎖がウイルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになってきた。

同じアミノ酸配列のタンパク質（同一名称のタンパク質）であっても、修飾されている糖鎖は多種多様であり、タンパク質を産生する細胞の状態によってその糖鎖構造は異なることが知られている。

このような糖鎖の変化と疾病との関係性についても明らかになってきており、例えば、特許文献１、非特許文献１に開示されるようなαフェトプロテイン（ＡＦＰ）糖鎖分画測定による肝癌の鑑別方法、特許文献２に開示されるような前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖鎖分画測定による前立腺癌の鑑別方法、非特許文献２、３に開示されるような癌胎児性抗原（ＣＥＡ）糖鎖分画測定による腺癌の鑑別方法などに応用されている。

糖タンパク質上の糖鎖の特異的検出にはレクチンと呼ばれる糖鎖を特異的に認識・結合・架橋する能力を持つタンパク質が広く利用されている。それは、糖鎖に対する抗体が非常に作製しにくく入手が困難であるためである。

レクチンは安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能である。しかし、レクチンは抗体よりも結合活性が低い、特異性が低いなどの問題がある。

例えば、ノダフジレクチン（ＷＦＡ）ではメインの結合糖鎖としてＮ−アセチルガラクトサミンが知られているが、わずかにガラクトースとも結合することで、反応系内にガラクトース残基が存在すると非特異的に反応してしまうことになる。

このような特徴を持つレクチンを用いて、特定のタンパク質上の糖鎖を簡便に定量解析する方法として、タンパク質に対する抗体とレクチンを用いたサンドイッチアッセイがある。

しかし、この手法は対象タンパク質がある程度精製されている場合には有効であるが、通常の疾病診断において検体として用いられる血液や尿等の、測定対象以外の糖タンパク質や糖脂質といった夾雑物が大量に含まれる系では感度、定量性において著しく性能が落ち解析が非常に困難であった。そのため対象たんぱくの血清中の含有濃度が著しく高い（数μg/mL程度）限られた項目でしか、血清診断等に利用されていない。

夾雑物の影響を低減するための施策として、抗体を固定化した支持体表面への血清夾雑物の吸着を抑制するブロッキング剤の検討（特許文献３）、非特異物質をあらかじめ吸着させる吸収剤の添加（特許文献４、５）、支持体に吸着してしまった分子を効率よく除去できる洗浄液の検討（特許文献３）が行われている。

ここで、ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等が知られており、そのほかには合成高分子材料を用いたものもある。非特異物質の吸収剤は、抗原抗体反応を阻害する分子やノイズの原因となる分子を結合させて反応系の中から取り除くことができる分子であり、グリコサミノグリカン、ヘパリン等、高分子、糖鎖複合体などが用いられることがある。洗浄液としては液の組成検討が行われており、塩強度、各種界面活性剤の効果を検討している例も報告されている（特許文献３）。

しかし、これらバックグラウンド低減施策では、検出レクチンを用いた定量解析では劇的な効果が認められる例は極めて少なく、また対象に適したブロッキング剤の探索のため、検討に非常に工数がかかることも問題である。

特開昭61-292062号公報 国際公開WO2010/090264号公報 特開2010-127827号公報 特開2009-53195号公報 特開2010-60293号公報

Sugar Chains of Human Cord Serum α-Fetoprotein: Characteristics of N-linked Sugar Chains of Glycoproteins Produced in Human Liver and Hepatocellular Carcinomas, K. Yamashita et al., Cancer Res., 53, 1 (1993) Carbohydrate Structures of Nonspecific Cross-reacting Antigen-2, a Glycoprotein Purified from Meconium as an Antigen Cross-reacting with Anticarcinoembryonic Antigen Antibody, K. Yamashita et al., Biol. Chem., 264, 17873 (1989) Structural Studies of the Carbohydrate Moieties of Carcinoembryonic Antigens, K. Yamashita et al., Cancer Res., 47, 3451 (1987)

本発明は、レクチンを用いた抗原の検出系において、簡便な手法（簡易な構成）により、レクチンによる対象抗原上の糖鎖の検出感度および定量性を向上させることができる抗原の検出方法、ならびに検出キットを提供することである。

本発明者らは、前記問題を解決するために鋭意検討した結果、レクチンを用いた測定系における高いバックグラウンド（ノイズ）の要因は、検出に用いるレクチンが糖鎖認識性にある程度幅を持っているために、ブロッキング剤等による公知の処理方法を用いたとしても一定量発生する、支持体、抗原に結合する分子（抗体等）等に非特異的に結合した、検出対象以外の糖タンパク質や糖脂質にも結合してしまうことにあることを見出した。この新たな知見に基づき、本発明者らは目的とする糖鎖を除く少なくとも１種の糖鎖を加水分解酵素で切断することにより、バックグラウンドの低減および感度の上昇が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明の一側面では、上記の課題のうち少なくとも一つを実現するために、本発明は以下の事項を包含する。

［１］特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを用いて、検体中の前記特定の糖鎖を有する抗原を検出する方法であって、
前記レクチンを検体に接触させる第１工程と、
前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を、検体に接触させる第２工程と、
前記第１工程および第２工程の後に、前記レクチンと結合した前記抗原を検出する第４工程と
を有する抗原の検出方法。

［２］特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを含む試薬と、
前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を含む試薬と、
前記特定の糖鎖を有する抗原と結合する分子を含む試薬と
を含む特定の糖鎖を有する抗原の検出用キット。

本発明の課題を解決するための手段の概念図の一例を図１に示す。なお、図中において、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンは、特定の糖鎖（４６ｃ）および特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合可能な糖鎖（４６ｄ）の両方の糖鎖を認識する。例えば、ＰＳＡ抗原では、ＷＦＡレクチンを用いる場合、特定の糖鎖（４６ｃ）がＮ-アセチル-D-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合可能な糖鎖（４６ｄ）がガラクトース（Ｇａｌ）にあたる。

本発明によれば、レクチンを用いた抗原の検出系において、簡便な手法（簡易な構成）により、測定系のバックグラウンドの上昇を抑え、レクチンによる対象抗原上の糖鎖の検出感度および定量性を向上させることができる抗原の検出方法、ならびに検出キットを提供することができる。

また、サンドイッチアッセイ系で酵素を試薬に含有させるだけで上記効果が得られるため、簡便な手法（簡易な構成）であり、診断シーンでの適用にも有効である。

図１は、レクチンによる抗原検出におけるバックグラウンド発生メカニズム（図１a）および本発明のバックグラウンドの低減および感度上昇手段（図１b）の一例を示した概念図である。 図２は、検体に加水分解酵素およびレクチンを接触させた後、検体を抗体が固相化された支持体と接触させる、本発明の方法の一形態を示した概念図である。 図３は、検体に加水分解酵素を接触させた後、検体を抗体が固相化された支持体と接触させ、その後レクチンと接触させる、本発明の方法の一形態を示した概念図である。 図４は、検体を抗体が固相化された支持体と接触させ、検体に加水分解酵素を接触させ、その後レクチンと接触させる、本発明の方法の一形態を示した概念図である。 図５は、本発明の特定のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図である。 図６は、図５の定量測定装置の部分拡大図である。 図７は、検出対象抗原（アナライト）４６を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。 図８は、蛍光標識化レクチン４８を送液した後のセンサ部３８を模式的に表す拡大模式図である。

以下、本発明の検出方法、検出用キットについて説明する。
なお、本明細書において「レクチン」とは、特定の糖鎖を特異的に認識して結合するタンパク質を意味する。本明細書において「抗原」とは、レクチンによって認識される糖鎖を有する、タンパク（糖鎖タンパク）または脂質（糖鎖脂質）等を含む、レクチンにより認識および結合され得る分子を意味する。本明細書における「検出方法」は、定性的測定方法のみならず、定量的測定方法（定量方法）を当然に含む。

≪本発明に用いられるレクチン・加水分解酵素等≫
本発明の方法には、レクチン、標識体、加水分解酵素、抗原に結合する分子、検出対象抗原（アナライト）を含む検体を用いる。また、さらに抗原に結合する分子を固定化するための支持体を用いることができる。以下各要素について詳細に説明する。

＜レクチン＞
本発明の方法に用いるレクチンとしては、検出しようとする抗原が有する特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを用いる。

前記レクチンとしては、動植物，真菌，細菌，ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」；真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」，多細胞動物に広く存在し、「セレクチン」，「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」；動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」；植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」およびこれと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」；リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６−リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」；グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」；免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」などが挙げられる。

その他のレクチンとしては、ＡＣＡ（センニンコクレクチン），ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン），ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン），ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン），ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン），ＥＣＡ（デイゴマメレクチン），ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン），ＧＮＡ（ユキノハナレクチン），ＧＳＬ Ｉ（グリフォニアマメレクチン），ＧＳＬ ＩＩ（グリフォニアマメレクチン），ＨＨＬ（アマリリスレクチン），ジャカリン（ジャックフルーツレクチン），ＬＢＡ（リママメレクチン），ＬＣＡ（レンズマメレクチン），ＬＥＬ（トマトレクチン），ＬＴＬ（ロータスマメレクチン），ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン），ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン），ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン），ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン），ＰＮＡ（ピーナッツレクチン），ＰＳＡ（エンドウレクチン），ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン），ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン），ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン）ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン），ＳＢＡ（ダイズレクチン），ＳＪＡ（エンジュレクチン），ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン），ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン），ＳＴＬ（ジャガイモレクチン），ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン），ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン），ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン），ＵＥＡ Ｉ（ハリエニシダレクチン），ＶＦＡ（ソラマメレクチン），ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン），ＷＦＡ（ノダフジレクチン），ＷＧＡ（パンコムギレクチン）などを挙げることができる。

＜標識体＞
本発明の方法においては、特定の糖鎖を有する抗原に結合した前記レクチンを検出するために、標識体を用いる。標識体はレクチンと結合させ、標識化レクチンとして用いる。

標識体としては、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。

蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケア バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の有機蛍光色素が挙げられる。

また、Eu、Tb等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばATBTA-Eu³⁺）、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（DsRed）またはAllophycocyanin（APC；LyoFlogen（登録商標））等に代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子等も、蛍光色素として挙げられる。

なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Cy5やAlexa Fluor 647など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。

放射性物質としては、ラジオアイソトープ(³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹Iなど）が挙げられる。

＜加水分解酵素＞
本発明の方法に用いる加水分解酵素としては、前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を用いる。前記加水分解酵素としては、前記酵素活性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、国際酵素委員会の酵素分類におけるＥ.Ｃ.３.２.１に分類される糖加水分解酵素が挙げられ、より具体的には、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ等が好適に挙げられる。

〔ガラクトシダーゼ〕
本発明に用いることのできるガラクトシダーゼは、ガラクトースのβ1-4および/またはβ1-3結合を切断することができるものであるならば、特に限定されることはない。血清中の糖タンパク質あるいは糖脂質は非還元末端にガラクトース残基を有するものが含まれており、例えば、ＴＪＡ-ＩＩ、ＷＦＡ、ＳＢＡ等のレクチンにてβ-N-アセチルガラクトサミン残基を検出しようとした場合にノイズとなり感度低下につながるが、ガラクトースのβ1-4および/またはβ1-3結合を切断することで血清中のN-アセチルガラクトサミンの検出感度が向上することになる。ガラクトースの結合にはα1-3,β1-3,β1-4等があるが、本発明に用いることのできるガラクトシダーゼはβ1-4結合のみを切断するものでもよく、β1-4を含むいくつかの結合を切断するものでもよい。

哺乳動物もガラクトシダーゼを有しているが、植物、細菌、および病原虫由来のガラクトシダーゼの研究が進んでいる。ガラクトシダーゼとしては、Bacteroides fragilis、Xanthomonas manihotis、ＨＣＶ由来のガラクトシダーゼが知られているが、これらのうちガラクトースのβ1-4結合を切断することができるガラクトシダーゼとして、Bacteroides fragilis由来のガラクトシダーゼを挙げることができる。

〔マンノシダーゼ〕
本発明に用いることのできるマンノシダーゼは、マンノースのα1-2、α1-3および/またはα1-6結合を切断することができるものであるならば、特に限定されることはない。マンノシダーゼは哺乳類にも存在するが、植物、細菌、および酵母由来のマンノシダーゼの研究が進んでいる。マンノシダーゼとしては、タチナタマメ、Xanthomonas manihotis、アフリカマイマイ（Achatina fulica）由来のマンノシダーゼが知られている。

〔フコシダーゼ〕
本発明に用いることのできるフコシダーゼは、フコースのα1-6結合を切断することができるものであるならば、特に限定されることはない。フコシダーゼは哺乳類を含む動物、植物、細菌、酵母等に広く存在するが、例えば、アーモンド、ウシ腎臓、Elizabethkingia miricola、Xanthomonas manihotis由来のフコシダーゼが知られている。

＜抗原と結合する分子（リガンド）＞
本発明の抗原と結合する分子（以下「リガンド」ともいう。）としては、検出対象抗原（アナライト）を特異的に認識して結合し、かつ、レクチンによる糖鎖認識を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド等を用いることができる。これらのうちでも、本発明においては、抗体が好適に用いられる。

なお、本発明において「抗体」は、完全抗体のみならず任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆａｂ'₂、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体を含む。

＜検出対象抗原（アナライト）＞
検出対象抗原（以下「アナライト」ともいう。）としては、レクチンにより認識される特定の糖鎖を有し、かつ、抗原に結合する分子により特異的に認識され結合し得る分子または分子断片であればよい。

このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）；タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等）；アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）；糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等）；脂質；またはこれらの修飾分子、複合体などを挙げることができる。これらの中でも、アナライトとしてタンパク質（糖タンパク質）および脂質（糖脂質）が好ましく、タンパク質（糖タンパク質）がより好ましい。

タンパク質としては、例えば、がん抗原／腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどを挙げることができる。より具体的には、例えば、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡなどのがん抗原／腫瘍マーカーを好適に挙げることができる。

＜検出対象抗原（アナライト）を含む検体＞
本発明の検出方法に用いる被検試料は、前記検出対象抗原（アナライト）を含む検体である。アナライトを含む検体には、アナライトを現実に含む検体に加え、アナライトを含む可能性がある検体も包含される。アナライトを含む検体としては、アナライトを含む生体試料もしくは生体由来試料、またはアナライトを含む可能性のある生体試料もしくは生体由来試料を挙げることができる。生体試料および生体由来試料としては例えば血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織、もしくは器官、またはそれらの調製物（例えば、生検標本）等を挙げることができる。本発明の検出方法に用いる被検試料としては、血液、血清または血漿が好ましい。

前記血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液などの液性の試料は、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、または器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液でホモジェナイズして、懸濁液またはその上清を、そのまま、またはさらに希釈して使用することができる。

＜検出対象抗原、レクチン、加水分解酵素の組合せ＞
上記本発明に係る、特定の糖鎖を有する抗原（検出対象抗原）、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチン、および、前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素の組合せの具体例を表１に示した。

表１に示す以外にも、がん抗原／腫瘍マーカーなどの検出対象抗原、試料中にそれとともに含まれやすい検出対象抗原以外の糖タンパク質や糖脂質、それぞれが有する糖鎖の種類を考慮しながら、前者が有する糖鎖に結合しやすいレクチンや、そのレクチンが同時に結合するおそれのある後者が有する糖鎖を切断する糖加水分解酵素を適宜選択し、組み合わせて用いることが可能である。

なお、抗原と結合する分子として抗体を用いる場合、抗体は各抗原特異的抗体を用いることが適切である。例えば、ヒトＰＳＡを抗原とする場合には、抗ヒトＰＳＡ抗体を用いればよい。

＜支持体＞
本発明の検出方法においては、抗原に結合する分子を固定化する支持体を用いることができる。支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（96穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。なお、支持体は固相体とも称され、プレート等の平面状の支持体を基板ともいう。

抗原と結合する分子と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。

なお、抗原と結合する分子を支持体と結合させることを固相化といい、抗原と結合する分子と結合した支持体を固相化体ともいう。

≪本発明の検出方法≫
＜検出方法に含まれる工程＞
本発明の検出方法は、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを用いて、検体中の前記特定の糖鎖を有する抗原を検出する方法であって、以下の工程を含む。

（１）前記レクチンを検体に接触させる第１工程（「レクチン結合工程」）、
（２）前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、前記レクチンが結合可能な少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を、検体に接触させる第２工程（「糖鎖切断工程」）、および、
（４）前記第１工程および第２工程の後に行われる、前記レクチンと結合した前記抗原を検出する第４工程（「検出工程」）。

本発明の検出方法は、さらに以下の工程を含むことができる。
（３）前記第４工程の前に行われる、前記抗原と結合する分子が固定化された支持体に検体を接触させる第３工程（「抗原捕捉工程」）。

＜工程が実施される順番（工程順）＞
本発明の方法における前記工程の実施の順番は、検出工程（第４工程）が最後に行われるものであればよい。また、レクチン結合工程（第１工程）および糖鎖切断工程（第２工程）は、同時に行うこともできる。具体的には、以下のような工程の実施順を好ましく挙げることができる。なお、「第１工程＋第２工程」は第１工程と第２工程を同時に行うことを表し、「→」はその左側の工程を実施後、右側の工程を実施することを意味する。例えば、「（第１工程＋第２工程）→第３工程→第４工程」は、第１工程と第２工程を同時に行った後に、第３工程を行い、その後さらに第４工程を行うことを表す。

（本発明の工程順）
（１）（第１工程＋第２工程）→第４工程
（２）第１工程→第２工程→第４工程
（３）第２工程→第１工程→第４工程
（４）（第１工程＋第２工程）→第３工程→第４工程
（５）第１工程→第２工程→第３工程→第４工程
（６）第２工程→第１工程→第３工程→第４工程
（７）第１工程→第３工程→第２工程→第４工程
（８）第２工程→第３工程→第１工程→第４工程
（９）第３工程→（第１工程＋第２工程）→第４工程
（１０）第３工程→第１工程→第２工程→第４工程
（１１）第３工程→第２工程→第１工程→第４工程

図２〜図４にこれらの工程順の一部について概念図を示した。図２は上記（４）、図３は上記（８）、図４は上記（１１）の工程順に相当する概念図である。なお、各図中において、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンは、特定の糖鎖（４６ｃ）および特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合可能な糖鎖（４６ｄ）の両方の糖鎖を認識する。例えば、ＰＳＡ抗原では、ＷＦＡレクチンを用いる場合、特定の糖鎖（４６ｃ）がＮ-アセチル-D-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合可能な糖鎖（４６ｄ）がガラクトース（Ｇａｌ）にあたる。

第３工程を含まない本発明の工程の実施方法としては、例えば、抗原に結合する分子として、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）試薬のドナー蛍光体を標識した抗体を、レクチンを標識する標識体としてＦＲＥＴ試薬のアクセプター蛍光体を用いる方法があげられる。この場合、抗原に結合する分子（抗体）に検出対象以外の糖タンパク質や糖脂質が非特異的に結合し、バックグラウンド上昇の原因となる。したがって、第１工程、第２工程および第４工程を含む本発明の検出方法により、上昇したバックグラウンドを低減させることが可能であり、本発明の効果を得ることができる。

本発明の工程としては、第３工程（抗原捕捉工程）を含むことが、検出感度上昇の観点から好ましい。
全工程中における第２工程（糖鎖切断工程）の実施の順番としては、（Ａ）第３工程（抗原捕捉工程）を実施後に、支持体上で第２工程を行う場合と、（Ｂ）それ以外の場合（抗原捕捉工程の前に糖鎖切断工程を行う、または、抗原捕捉工程を実施しない。）に大きく分けることができる。

（Ａ）では検体を、抗原と結合する分子（抗体等）が固相化（固定化）されている支持体と先に接触させる。検体を接触させた支持体には、非特異的に血清糖タンパク質や糖脂質が吸着している。これに、特定の糖鎖以外の糖鎖を切断することができる酵素を添加することで、支持体および抗原と結合する分子上の非特異的に結合した糖タンパク質や糖脂質から特定糖鎖以外の糖鎖を切断除去することができる。これにより、レクチンを添加した際の高いバックグラウンドは抑制される。

（Ｂ）ではアナライトを含む可能性のある試料を希釈せずに、または適当な緩衝液で希釈し、そしてその試料に特定の糖鎖以外の糖鎖を切断することができる酵素を添加する。これにより、抗原が含まれる検体中の他のタンパク質からノイズ成分となる糖鎖を除去することができ、特異性および感度が向上する。

多量の夾雑物中で酵素処理を行う（Ｂ）に比べ、支持体および抗原と結合する分子に吸着した夾雑物のみを処理する（Ａ）のほうがノイズ除去の効果が高く、より好ましい。
また、第２工程（糖鎖切断工程）は、第１工程（レクチン結合工程）の前に行う方が、好ましい。これは、レクチンが結合後にその糖鎖を切断する場合、立体障害等のために、切断効率が落ち、バックグラウンドが上昇するためである。

本発明の方法は、従来のバックグラウンド抑制方法と組み合わせて行うこともでき、組合せることでより高いバックグラウンド抑制効果が期待できる。

＜各工程の詳細＞
以下に各工程の詳細について説明する。

〔１．第１工程（レクチン結合工程）〕
第１工程は、特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを、特定の糖鎖を有する抗原に結合させる工程である。ここで用いるレクチンの量、反応液中の濃度、反応時間、反応条件は、用いるレクチンによって適宜調整すればよい。

〔２．第２工程（糖鎖切断工程）〕
第２工程は、前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を検体に接触させ、前記特定の糖鎖を除く少なくとも１種の糖鎖を切断する工程である。ここで用いる糖加水分解酵素の量、反応液中の濃度、反応時間、反応条件は、用いる糖加水分解酵素によって適宜調整すればよい。

例えば、Bacteroides fragilis由来のガラクトシダーゼを用いる場合、２〜１０００ｍＵ、好ましくは２０〜１００ｍＵのガラクトシダーゼを用いることにより、血清糖タンパク質、糖脂質のガラクトースのβ１-４結合を切断することができる。

ガラクトシダーゼの処理（反応）時間は、通常、１０分〜２４時間であり、好ましくは、３０分〜１時間が好ましい。また、反応温度は、２５℃〜４０℃が好ましい。
また、例えば、タチナタマメ由来のマンノシダーゼを用いる場合、２〜１０００ｍＵ、好ましくは２０〜１００ｍＵのマンノシダーゼを用いることにより、血清糖タンパク質、糖脂質のマンノースの結合を切断することができる。

マンノシダーゼの処理（反応）時間は、通常、１０分〜２４時間であり、３０分〜１時間が好ましい。また、反応温度は２５℃〜４０℃が好ましい。
〔３．第３工程（抗原捕捉工程）〕
第３工程は、特定の糖鎖を有する抗原を、支持体（基板等）に固定化された、抗原と結合する分子と結合させる工程である。反応時間、反応温度等の反応条件は、用いる抗原および抗原と結合する分子に応じて、適宜調整すればよい。

〔４．第４工程（検出工程）〕
第４工程は、レクチンに結合した標識体を測定することによってレクチンを検出し、さらにレクチンが結合した検出対象抗原を検出する工程である。

（測定方法）
本発明の検出工程において用いられる検出方法としては、上記標識体を測定できるものであれば、特に限定されず、それぞれの標識物質に適した当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、放射性物質により標識されたレクチンを検出する場合には、液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。蛍光色素により標識されたレクチンを検出する場合には、ルミノメーター、ＳＰＦＳ測定器等により検出することができる。酵素で標識されたレクチンを検出する場合は、標識された酵素に対応した基質を加えた後に、酵素による基質の化学的変化、例えば、発色、蛍光、化学発光等を測定することにより検出することができる。

〔表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS）法〕
本発明の検出方法に用いる測定法として、ＳＰＦＳが好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。

<ＳＰＦＳ用測定部材>
ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる、流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。

センサチップは、基本的に、金属薄膜の裏面に励起光を導入するための透明支持体と、当該透明支持体上に形成された、表面プラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された、アナライトをセンサ表面に捕捉するための反応層とを含み、さらに必要に応じて、金属薄膜と反応層の間に形成された、蛍光体が金属薄膜に近接しすぎることにより起こる蛍光の金属消光を防止するためのスペーサ層を含んでいてもよい。

反応層が形成されている部位が測定領域に相当する。流路またはウェルの底面全域に反応層を形成して測定領域としてもよいし、底面の一部のみに（必要であれば所望のパターニングで）反応層を形成して測定領域としてもよい。測定領域の面積は、一般的にレーザー光として照射される励起光の照射面積を考慮しながら調整することができる。たとえば、励起光のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、上記アッセイエリアは通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有するものとなるよう設計される。

ＳＰＦＳのシステムを、密閉流路を通じて各種の溶液を送液する「流路型」とする場合、センサチップの上に、流路を形成するための穴のあいた「フローセル」を積載し、必要に応じてさらにその上に、上記フローセルの穴に対応する位置に送液導入口および送液排出口のあいた「天板」を積載し、これらを密着させて固定するようにして、測定部材を構築する。上記フローセルの穴に対応する位置のセンサチップ表面が、流路の底面をなし、そこに測定領域が形成される。流路型の場合、たとえばポンプやチューブを含む送液手段を用いて、各種の液体を送液導入口から流路内に送液して送液排出口から排出することができ、必要に応じて往復型、循環型の送液を行うこともできる。送液速度や送液（循環）時間などの条件は、試料の量や試料中のアナライトの濃度、流路ないしウェルのサイズや反応層の態様（固相化リガンドの密度等）、ポンプの性能等を考慮しながら、適宜調整することができる。

一方、ＳＰＦＳのシステムを、上記流路よりも広い空間に各種の溶液を貯留させる「ウェル型」とする場合、センサチップの上に、ウェルを形成するための貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。ウェル型の場合、たとえばピペット状の部材を用いて、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。

上記フローセルは、たとえばシート状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製とすることができる。上記天板は、測定領域から発せられる蛍光を測定できるよう透明性を有する材料で作製され、たとえばプレート状のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製とすることができる。あるいは、フローセルおよび天板を、成形加工やフォトリソグラフィにより所望の形状にしたプラスチック製とすることも可能である。

センサチップ上にフローセルまたはウェル部材を密着させて固定する手段は特に限定されるものではなく、一般的には物理的に上下から圧力をかけるようにすればよく、必要であれば、透明支持体と同じ光屈折率を有する接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いてもよい。

<ＳＰＦＳ用測定装置>
本発明に係る測定法は、一般的なＳＰＦＳ用測定装置を使用して実施することができる。ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。

より具体的な態様は、例えば、特開２０１０―１４５２７２号公報、特開２０１１−８０９３５号公報、特開２００８−１０２１１７号公報、特許第３５６２９１２号公報など、各種の文献を参照することができる。

以下、より詳細なＳＰＦＳ用測定装置の構成例について説明する。
１．定量測定装置の構成
図５は、本発明のアナライトの定量測定方法を説明する定量測定装置の概略を模式的に示す概略図、図６は、図５の定量測定装置の部分拡大図である。

図５、６に示すように、本発明の定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４とを有するセンサチップ１６を備えており、このセンサチップ１６は、定量測定装置１０のセンサチップ装填部１８に装填されている。

また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図5に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属膜１４に向かって照射されるようになっている。

また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。

また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図５に示すように、入射光２２が金属膜１４によって反射された金属膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。

なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属膜反射光２４を受光するように構成されている。

なお、センサチップ１６、光源２０、受光手段２６によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。
また、センサチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。

なお、センサチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。
なお、センサチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。

また、受光手段２６および光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。

また、本実施例のセンサチップ１６では、金属膜１４の上面１４ａに流路３６が形成されている。この流路３６の一部には、検出対象抗原（アナライト）と特異的に結合する分子（リガンド）が固相化されたセンサ部３８が設けられている。

≪検出用キット≫
本発明の検出用キットは、上記本発明の検出方法に使用されるものである。本発明の検出用キットは、
（１）特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを含む試薬、
（２）前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を含む試薬、および
（３）前記特定の糖鎖を有する抗原と結合する分子を含む試薬、
を含む。

また、本発明の検出用キットは、さらに、
（４）本発明に係る検出方法が指示として記載された使用説明書、および／または
（５）レクチン標識化試薬
を含んでいてもよい。

キットに含まれる使用説明書（４）は、本発明の方法を実施するために、本発明に係る検出方法のいずれかが、指示として記載された使用説明書である。使用説明書の具体的態様は上記情報を適切に伝達できるものであればよい。例えば、紙片、キットの包装、キットの構成物のラベル等に印刷されているものでよく、ディスケット、ＣＤ等コンピューターで読み取り可能な媒体中に記録されているものでもよい。

キットに含まれるレクチン標識化試薬（５）は、レクチンを標識化する際に用いる試薬であり、標識体と、レクチンと標識体を結合させる試薬を通常含むものである。

≪応用例≫
本発明の方法は、疾病の診断に用いることができる。例えば、検出対象抗原（アナライト）がＰＳＡの場合、本発明の検出方法により定量された、患者由来の生体試料中のＰＳＡ量から、前立腺癌の診断をすることが可能である。他にも、アナライトがＡＦＰの場合は肝細胞癌を、ＣＥＡの場合は消化管を中心とした癌の診断をすることが可能である。

以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明はこれにより限定されるものではない。

（定量測定装置の構成）
以下の実施例においては、測定装置として、上記ＳＰＦＳ測定装置を自作して使用した。当該ＳＰＦＳ測定装置は、上記定量測定装置１０と同様の構成である。

なお、上記構成のうち、光源２０として、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用いており、光源２０と誘電体部材１２との間には、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。

また、誘電体部材１２としては、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを用い、この誘電体部材１２の上部に、後述する、プラズモン励起センサを固定することによって、センサチップ１６を構成する。

また、センサチップ１６の上部には、集光レンズとして対物レンズを備え、光検出手段３２としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた。

（プラズモン励起センサの作製）
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ １０）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。

このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭ膜を形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

高さ０．５ｍｍの流路となる溝を有し、溝の両端に貫通穴を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを、ＳＡＭ膜の表面が流路の内側となるように溝をＳＡＭ膜に対向させて基板上に配置し、流路の外側のＰＤＭＳ製シート上部から圧着して、ビスでＰＤＭＳ製シート（流路３６）とプラズモン励起センサとを固定した。

（抗体の固相化）
［調製例１］
〔抗ＰＳＡ抗体固相化ＳＡＭ膜（基板）〕
上記のとおりプラズモン励起センサを接続した外部流路に、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、ペリスタポンプによって、室温（２５℃）、流速５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。

続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ送液し、２０分間循環させた後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ.７９、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ膜上に当該抗体を固相化し、抗ＰＳＡ抗体固相化ＳＡＭ膜を調製した。

なお、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
各種プール血清サンプルを送液する前のセンサ部３８には、図７に示すように、上記のような抗体（リガンド４４）が形成された状態となっている。

［調製例２］
〔抗ＡＦＰ抗体固相化ＳＡＭ膜（基板）〕
抗ＰＳＡ抗体の代わりに、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を用いた他は、調製例１と同様にして、抗ＡＦＰ抗体固相化ＳＡＭ膜を調製した。

（標識レクチンの作製）
［作製例１］
〔蛍光標識ＷＦＡレクチン〕
蛍光標識ＷＦＡレクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）を利用して作製した。ＷＦＡレクチン（Ｌ-１３５０、Ｖｅｃｔｏｒ社）１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定し標識レクチン濃度を定量した。

［作製例２］
〔蛍光標識ＬＣＡレクチン〕
蛍光標識ＬＣＡレクチンを、蛍光物質ラベリングキットを利用して作製した。レクチンとして、ＬＣＡレクチン（Ｌ-１０４０、Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いた他は、作製例１と同様にして蛍光標識ＬＣＡレクチンを得た。

＜血清検体中のＰＳＡの測定＞
［実施例１］
（血清検体中のＰＳＡの測定（１））
各検体をガラクトシダーゼで酵素処理した後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させ、その後、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させた。より詳しくは以下の通りに行った。

５種のＰＳＡフリープールヒト血清（正常ヒトプール血清、コージンバイオ社）および、各種ＰＳＡフリープール血清にＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞培養株）培養上清をＰＳＡ濃度５０ｐｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプル５つの合計１０サンプルを作製し、ＰＢＳにて２倍希釈することで測定サンプルとした。なお、前記ＰＳＡフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ＰＳＡ濃度が０．０１ｎｇ/ｍＬ以下であることをＥＬＩＳＡにて確認した血清を用いた。

測定サンプル０．１ｍＬにBacteroides fragilis由来のガラクトシダーゼを終濃度５０ｍＵになるように添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、蛍光標識プローブ４８として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識したＷＦＡレクチンの溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、室温で１時間反応させた。ガラクトシダーゼ処理、レクチン反応を行った測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガラクトシダーゼ処理を除いた工程で測定サンプルの調製も実施し、同様にＳＰＦＳ測定を実施した。なお、図８に、標識化レクチンを送液した後のセンサ部を模式的に表す拡大模式図を示した。

測定サンプルを上記方法により調製・測定した結果を以下の表２に示す。表２の結果は実測値である。ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

ガラクトシダーゼ処理を行った測定サンプルは、未処理サンプルと比較して、ＰＳＡフリープール血清の値（バックグラウンド）が３/５程度に低下していることを確認した。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが２．０２であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは２．４１に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

［実施例２］
（血清検体中のＰＳＡの測定（２））
各検体をガラクトシダーゼで酵素処理した後、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させ、その後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させた。より詳しくは以下の通りに行った。

５種のＰＳＡフリープール血清および、各種ＰＳＡフリープール血清にＬＮＣａＰ培養上清をＰＳＡ濃度５０ｐｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプル５つの合計１０サンプルを作製し、ＰＢＳにて２倍希釈することで測定サンプルとした。測定サンプルにBacteroides fragilis由来のガラクトシダーゼを終濃度５０ｍＵになるように添加し、３７℃で１時間反応させた。ガラクトシダーゼ処理を行った測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。反応後、蛍光標識プローブ４８として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を標識したＷＦＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。再びＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガラクトシダーゼ処理を除いた工程で測定サンプルの調製も実施し、ＳＰＦＳ測定を実施した。

測定サンプルを上記方法により測定した結果を以下の表３に示す。表３の結果は実測値である。ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

ガラクトシダーゼ処理を行った測定サンプルは、未処理サンプルと比較して、PSAフリープール血清のシグナル値（バックグラウンド）が１/３程度に低下していることを確認した。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが２．６４であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは５．５１に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

［実施例３］
（血清検体中のＰＳＡの測定（３））
次に、基板上で酵素処理を行う手法についても方法を説明する。

各検体を抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させた後、ガラクトシダーゼで酵素処理し、その後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）と接触させた。より詳しくは以下の通りに行った。

５種のＰＳＡフリープール血清および、各種ＰＳＡフリープール血清にＬＮＣａＰ培養上清をＰＳＡ濃度５０ｐｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプル５つの合計１０サンプルを作製し、ＰＢＳにて２倍希釈することで測定サンプルとした。各種プール血清サンプル溶液10種を、流路に０．1ｍＬ添加し、２０分間循環送液させた。続いて、Bacteroides fragilis由来のガラクトシダーゼを５０ｍＵを含有する溶液あるいはＰＢＳ（−）を０．１ｍＬ添加し、２０分間循環送液させた。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して流速２００μＬ／分にて、５分間洗浄した。洗浄後、蛍光標識プローブ４８として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を標識したＷＦＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を0.1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して流速２００μＬ／分にて、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。ガラクトシダーゼ処理を除いた工程でもＳＰＦＳ測定を実施した。

結果を表４に示す。表４の結果は実測値である。ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

基板上にてガラクトシダーゼ処理を行った測定検体は、未処理検体と比較して、PSAフリープール血清の値（バックグラウンド）が１/４程度に低下していることを確認した。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＰＳＡ添加血清のシグナル値／対応するＰＳＡフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが３．５０であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは１２．９９に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

以上、実施例１〜３において示されたように、測定系に生じていた血清成分による非特異結合シグナルは血清糖タンパク質上のガラクトースを切断することで抑制することが可能であり、ＰＳＡ上のＧａｌＮＡｃ糖鎖構造を特異的に検出する感度が向上することが確認できた。

また、実施例２と実施例３を比較した結果、酵素による処理は血清タンパク質が大量に含まれている溶液中で作用させるよりも、ある程度対象を絞った抗体固定化基板上にて処理が行われた方が、効果が高いことが確認できた。

＜血清検体中のＡＦＰの測定＞
以上、実施例１〜３では、ＰＳＡを検出対象として試験を実施したが、同様の試験を、ＡＦＰを検出対象として実施した。以下に実施例４〜６として示す。実施例４〜６においては、陰性対照検体として５種のＡＦＰフリープール血清を、陽性対象検体として当該各ＡＦＰフリープール血清に、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３用コントロールＬ（商品名、和光純薬株式会社製、Ｌ３＝２０％、ＡＦＰ濃度２００ｎｇ／ｍＬ）をＡＦＰ濃度１．０ｎｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプル５つの合計１０サンプルを作製して用いた。なお、前記ＡＦＰフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ＥＬＩＳＡにてＡＦＰ濃度が０．０１ｎｇ/ｍＬ以下であることを確認した血清を用いた。

［実施例４］
（血清検体中のＡＦＰの測定（１））
各検体をマンノシダーゼで酵素処理した後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させ、その後、抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させた。

より詳しくは、実施例１において、ガラクトシダーゼに代えてタチナタマメ由来のマンノシダーゼ（ＧＫＸ−５０１０、Ｐｒｏｚｙｍｅ社）を、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例１と同様に行った。

測定サンプルを上記方法により調製・測定した結果を以下の表５に示す。表５の結果は実測値である。ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

マンノシダーゼ処理を行った測定サンプルはほぼすべての未処理サンプルよりＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が３/４程度に低下していることを確認した。その時のＡＦＰ-Ｌ３添加血清を測定した場合の値はほとんど差がないことも確認できた。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが４．１８であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは５．１４に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

［実施例５］
（血清検体中のＡＦＰの測定（２））
各検体をマンノシダーゼで酵素処理した後、抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させ、その後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させた。

より詳しくは、実施例２において、ガラクトシダーゼに代えてタチナタマメ由来のマンノシダーゼ（ＧＫＸ−５０１０、Ｐｒｏｚｙｍｅ社）を、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例２と同様に行った。

測定サンプルを上記方法により測定した結果を以下の表６に示す。表６の結果は実測値である。ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

マンノシダーゼ処理を行った測定サンプルはほぼすべての未処理サンプルよりＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が１/２程度に低下していることを確認した。その時のＡＦＰ-Ｌ３添加血清を測定した場合の値はほとんど差がないことも確認できた。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが６．４３であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは１１．８４に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

［実施例６］
（血清検体中のＡＦＰの測定（３））
次に、基板上で酵素処理を行う手法についても方法を説明する。

各検体を抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）と反応させた後、マンノシダーゼで酵素処理し、その後、蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）と接触させた。
より詳しくは、実施例３において、ガラクトシダーゼに代えてタチナタマメ由来のマンノシダーゼ（ＧＫＸ−５０１０、Ｐｒｏｚｙｍｅ社）を、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例１）に代えて蛍光標識ＬＣＡレクチン（作製例２）を、抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）に代えて抗ＡＦＰ抗体を固相化した基板（調製例２）を用いた他は、実施例３と同様に行った。

結果を以下の表７に示す。表７の結果は実測値である。ＡＦＰ添加血清のシグナル値はＡＦＰ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。

基板上にてマンノシダーゼ処理を行った測定サンプルはほぼすべての未処理サンプルよりＡＦＰフリープール血清の値（バックグラウンド）が２/５程度に低下していることを確認した。

また、５検体のＳ/Ｎ比（ＡＦＰ−Ｌ３添加血清のシグナル値／対応するＡＦＰフリー血清のシグナル値）の平均値は、未処理サンプルが８．１１であったのに対し、ガラクトシダーゼ処理サンプルでは１９．３１に上昇し、検出感度が上昇することが明らかとなった。

以上、実施例４〜６において示されたように、測定系に生じていた血清成分による非特異結合シグナルは血清糖タンパク質上のマンノースを切断することで抑制することが可能であり、ＡＦＰ上のフコース糖鎖構造を特異的に検出する感度が向上することが確認できた。

また、実施例５と実施例６を比較した結果、酵素による処理は血清タンパク質が大量に含まれている溶液中で作用させるよりも、ある程度対象を絞った抗体固定化基板上にて処理が行われた方が、効果が高いことが確認できた。

上記実施例では、ＳＰＦＳ測定装置において、各種溶液を循環送液する態様を例として説明したが、必ずしも循環させる必要はなく、一方向に送液し続ける態様や、両方向に往復送液する態様、あるいは、所定量の溶液を送液した後、所定時間滞留させる態様など、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。

１０ 定量測定装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面
１２ｂ 側面
１２ｃ 側面
１４ 金属膜
１４ａ 上面
１６ センサチップ
１８ センサチップ装填部
２０ 光源
２２ 入射光
２４ 金属膜反射光
２６ 受光手段
２８ ＳＰＲ測定部
３０ 蛍光
３２ 光検出手段
３４ ＳＰＦＳ測定部
３６ 微細流路
３８ センサ部
４０ 定量演算手段
４４ 抗原に結合する分子（リガンド）
４６ 検出対象抗原（アナライト）
４６ａ 特定の糖鎖を有する抗原
４６ｂ 特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合しない糖鎖
４６ｃ 特定の糖鎖
４６ｄ 特定の糖鎖を除く、かつ、レクチンが結合可能な糖鎖
４８ 蛍光標識レクチン（プローブ）
５０ 血清中の血清非特異吸着糖タンパク質
５０ａ 糖鎖を有するタンパク質
５１ 末端糖鎖を酵素で切断された血清非特異吸着糖タンパク質
５２ 血清中の非特異吸着糖脂質
５２ａ 糖鎖を有する脂質
５３ 末端糖鎖を酵素で切断された非特異吸着糖脂質
６０ 特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチン
６１ 標識体
７０ 糖加水分解酵素
８０ 支持体
８１ 反応系

Claims (15)

1. 特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを用いて、検体中の前記特定の糖鎖を有する抗原を検出する方法であって、
   前記レクチンを検体に接触させる第１工程と、
   前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を、検体に接触させる第２工程と、
   前記第１工程および第２工程の後に、前記レクチンと結合した前記抗原を検出する第４工程と
   を有する抗原の検出方法。
2. 前記第４工程の前に、さらに、前記抗原と結合する分子が固定化された支持体に検体を接触させる第３工程を有する、請求項１に記載の抗原の検出方法。
3. 前記第３工程を、前記第１工程および前記第２工程の前に行う、請求項２に記載の抗原の検出方法。
4. 前記第１工程および前記第２工程を、前記第３工程の前に行う、請求項２に記載の抗原の検出方法。
5. 前記第１工程と前記第２工程を同時に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
6. 前記第１工程を、前記第２工程の前に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
7. 前記第２工程を、前記第１工程の前に行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
8. 前記第３工程を、前記第１工程の後かつ前記第２工程の前に行う、請求項２に記載の抗原の検出方法。
9. 前記第３工程を、前記第２工程の後かつ前記第１工程の前に行う、請求項２に記載の抗原の検出方法。
10. 前記抗原が前立腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）であり、前記レクチンがノダフジレクチン（WFA）であり、前記糖加水分解酵素がガラクトシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
11. 前記抗原が前立腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）であり、前記レクチンがダイズレクチン（SBA）であり、前記糖加水分解酵素がガラクトシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
12. 前記抗原が前立腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）であり、前記レクチンがキカラスウリレクチン（TJA-II）であり、前記糖加水分解酵素がフコシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
13. 前記抗原がα-フェトプロテイン（AFP）であり、前記レクチンがレンズマメレクチン（LCA）であり、前記糖加水分解酵素がマンノシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
14. 前記抗原が癌胎児性抗原（CEA）であり、前記レクチンがキカラスウリレクチン（TJA-I）であり、前記糖加水分解酵素がガラクトシダーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原の検出方法。
15. 特定の糖鎖を含む複数種の糖鎖と結合するレクチンを含む試薬と、
    前記複数種の糖鎖のうち前記特定の糖鎖を除く、かつ、前記レクチンが結合可能な、少なくとも１種の糖鎖を切断可能な糖加水分解酵素を含む試薬と、
    前記特定の糖鎖を有する抗原と結合する分子を含む試薬と
    を含む特定の糖鎖を有する抗原の検出用キット。

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