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KR101606302B1 - 당단백질의 측정 방법, 간질환의 검사 방법, 당단백질 정량용 시약 및 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질 - Google Patents

당단백질의 측정 방법, 간질환의 검사 방법, 당단백질 정량용 시약 및 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질 Download PDF

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KR101606302B1
KR101606302B1 KR1020147013581A KR20147013581A KR101606302B1 KR 101606302 B1 KR101606302 B1 KR 101606302B1 KR 1020147013581 A KR1020147013581 A KR 1020147013581A KR 20147013581 A KR20147013581 A KR 20147013581A KR 101606302 B1 KR101606302 B1 KR 101606302B1
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유즈루 이케하라
아츠시 구노
마키 소가베
야스히토 다나카
마사시 미조카미
기요아키 이토
슌스케 마츠바라
?스케 마츠바라
치카유키 츠루노
요우이치 다카하마
다카시 가가와
신야 나가이
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고쿠리츠켄큐카이하츠호진 상교기쥬츠 소고켄큐쇼
공립대학법인 나고야 시립대학
독립행정법인 국립국제의료연구 센터
시스멕스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 종래보다도 높은 정밀도로 간질환을 검출할 수 있는 당쇄 마커 당단백질의 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또, 본 발명은 종래보다 높은 정밀도로 간질환을 검출할 수 있는 간질환의 검사 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또, 본 발명은 상기 측정 방법에서 이용하는 당단백질 정량용 시약을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 간질환의 진행에 따른 간질환 병태를 구별할 수 있는 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질을 제공하는 것을 과제로 한다. 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP) 및 Mac-2-binding protein(M2BP)으로부터 선택되는 적어도 하나의 당단백질의 측정 방법으로서, 당단백질이 AGP인 경우에는 AOL 및 MAL로부터 선택되는 제1 렉틴에 결합하는 AGP를 측정하고, 당단백질이 M2BP인 경우에는 WFA, BPL, AAL, RCA120 및 TJAII로부터 선택되는 제2 렉틴에 결합하는 M2BP를 측정하는 당단백질의 측정 방법이 제공된다.

Description

당단백질의 측정 방법, 간질환의 검사 방법, 당단백질 정량용 시약 및 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질{METHOD FOR MEASUREMENT OF GLYCOPROTEIN, METHOD FOR DETECTION OF HEPATIC DISEASES, REAGENT FOR QUANTIFICATION OF GLYCOPROTEIN, AND SUGAR CHAIN MARKER GLYCOPROTEIN AS MEASURE OF DISEASE CONDITIONS OF HEPATIC DISEASES}
본 발명은 alpha-1-acid glycoprotein(AGP) 및 Mac-2-binding protein(M2BP)로부터 선택되는 적어도 하나의 당단백질의 측정 방법, AGP 및 M2BP로부터 선택되는 적어도 하나의 당단백질을 이용한 간질환의 검사 방법, 및 당쇄의 차이에 의해 간세포암 및 염증·섬유화라고 하는 배경 간의 상태를 검출할 수 있는 당쇄 마커 당단백질에 관한 것이다.
간장암은 간장에서 발생하는 원발성 간암과 전이성 간암으로 크게 나눌 수 있고, 원발성 간암의 90%가 간세포암이라고 알려져 있다.
간세포암 환자는 기초 질환으로서 C형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스에 감염되어 있는 경우가 많고, 급성 바이러스성 간염으로부터 만성 바이러스성 간염, 간경변으로 진행하여 바이러스성 간염으로 이환한 후, 장기간 경과 후 처음으로 암화하는 경우가 많다. 간경변에서는 염증과 재생을 반복함으로써 정상적인 간세포가 감소하여 섬유 조직으로 구성되는 장기로 변화한다. 예를 들면, C형 간염 환자는 일본에서만도 300만명, 중국이나 아프리카에서는 1,000만 이상이라고도 말해지고 있다. 또, B형·C형 간염 환자의 경우 만성 간염으로부터의 발암률은 만성 간염 경도(F1)에서는 연율 0.8%, 만성 간염 중등도(中度)(F2)에서는 연율 0.9%이지만, 만성 간염 중도(重度)(F3)가 되면 연율 3.5%가 되고, 또한 간경변(F4)으로부터 암으로 되는 확률은 연율 7%까지도 상승한다(도 1, 도 2). 또 간질환은 병태의 진행에 수반하여, 우선 만성 간염에서 기능이 소실하기 시작하여 간경변에서 병적 구조가 나타나고, 간장의 섬유화가 진행되는 등, 조직상이 변화한다(도 3).
암 치료에 있어서는 암의 조기 발견이 중요하고, 간세포암의 경우에도 조기의 암 발견이 치료, 수술 후 예후에 크게 영향을 주고 있다. 간절제 치료에 의한 5년 생존율은 Ⅰ기이면 80%, Ⅳ기에서는 38%에 지나지 않는다.
간암 마커로는 현재까지 α-페토프로테인(AFP)이나 protein induced by Vitamin K absence or antagonist-Ⅱ(PIVKA-Ⅱ)가 알려져 있지만(특허문헌 1 및 특허문헌 2), 그 특이성, 감도 모두 충분하지는 않다. 그 때문에, 현재는 간암 조기 발견을 위한 검진은 간암 마커와 초음파 검사, 컴퓨터 단층촬영(CT), 핵자기 공명 화상법(MRI) 등 화상 검사에 의해 수행되고 있다.
또, 비특허문헌 1에는 혈청 중의 푸코실화 AGP를 AAL 렉틴을 이용해 측정하여 간경변을 검출하는 시도가 기재되어 있다. 그러나, 비특허문헌 1 기재의 기술은 그 표 2에 기재된 결과로부터 이해되는 바와 같이, 감도가 66% 정도임에도 불구하고 특이도가 87% 정도이고, 정진율(正診率) 77% 정도이기 때문에 간질환 검출 성능의 관점에서 만족할 수 있는 것은 아니다.
또, 비특허문헌 2에는 정상인, 급성 간염 환자, 만성 간염 환자, 간경변 환자 및 간세포암 환자의 혈청 중의 아시알로 AGP를 RCA 렉틴을 이용한 면역크로마토그래피에 의해 측정하여 각 간질환을 양성 판별할 수 있는지 여부의 실험을 수행한 경우가 기재되어 있다. 그러나, 비특허문헌 2 기재의 기술은 그 표 2에 기재된 결과로부터 이해되는 바와 같이, 간경변에 주목하면 그 감도는 88% 정도이기는 하지만 만성 간염 환자에서의 의양성률이 63%로 되어 버려, 간질환 검출 성능의 관점에서 만족할 수 있는 것은 아니었다.
일본 특개평 10-26622호 일본 특개평8-184594호
Ingvar Ryden 등, Diagnostic Accuracy of α1-Acid Glycoprotein Fucosylation for Liver Cirrhosis in Patients Undergoing Hepatic Biopsy, Clinical Chemistry 48:12, 2195-2201 (2002) Eun Young Lee 등, Development of a rapid, immunochromatographic strip test for serum asialo α1-acid glycoprotein in patients with hepatic disease, Journal of Immunological Methods 308 (2006) 116-123
본 발명은 종래보다도 높은 정밀도로 간질환을 검출할 수 있는 당쇄 마커 당단백질의 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또, 본 발명은 종래보다도 높은 정밀도로 간질환을 검출할 수 있는 간질환의 검사 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또, 본 발명은 상기 측정 방법에 이용하는 당단백질 정량용 시약을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 간질환의 진행에 따른 간질환 병태를 구별할 수 있는 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질을 제공하는 것을 과제로 한다.
피험자에 의해 채취된 시료에 포함되는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP) 및 Mac-2-binding protein(M2BP)으로부터 선택되는 적어도 하나의 당단백질의 측정 방법으로서, 당단백질이 AGP인 경우에는 AOL 및 MAL로부터 선택되는 제1 렉틴에 결합하는 AGP를 측정하고, 당단백질이 M2BP인 경우에는 WFA, BPL, AAL, RCA120 및 TJAII로부터 선택되는 제2 렉틴에 결합하는 M2BP를 측정하는 당단백질의 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 측정 방법에 의해 높은 신뢰성으로 간경변 등의 간질환의 검사를 수행하는 것이 가능한 당쇄 마커 당단백질을 간편하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질에 의해 기존의 마커보다도 정진율이 높고, 또한 미량의 혈청에 의해 검사가 가능해지며, 간섬유화 진전 모니터링이 가능해져 병태 진전의 파악이 가능하게 될 뿐만 아니라, 인터페론을 비롯한 항바이러스 요법 후의 간섬유화나 염증의 개선을 평가할 수 있다.
도 1은 C형 간염 감염으로부터 간세포암으로 이르기까지의 시간 경과와 간 상태의 변화를 보여주는 도면이다.
도 2는 만성 간염으로부터의 간세포암 발암률을 보여주는 도면이다.
도 3은 간경변의 간세포암 발암률을 보여주는 도면이다.
도 4는 배경 간조직의 변화와 발암과의 관계를 보여주는 도면이다.
도 5는 감염으로부터 발암에 이르기까지의 간의 구조 변화를 보여주는 도면이다.
도 6은 간의 상태 변화와 진단 치료 스킴(scheme)과의 관계를 보여주는 도면이다.
도 7은 렉틴 마이크로어레이를 기축으로 한 바이오 마커 후보 분자의 검증 실험 순서를 나타내는 도면이다.
도 8은 간질환 병태 지표 마커 당단백질의 하나인 α1 산성 당단백질(AGP)에 대하여, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이에 의해 비교 당쇄 해석을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9는 간질환 병태 지표 마커 당단백질의 하나인 90K/Mac-2 Binding Protein(M2BP)에 대하여, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이에 의해 비교 당쇄 해석을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10은 간장의 섬유화 진전과 AGP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의해 얻어진 렉틴 신호 강도의 변화의 상관을 보여주는 도면이다.
도 11은 간질환 병태 지표 당쇄 마커인 AGP의 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이 해석에 의한 간경변의 검출 스킴을 나타내는 도면이다.
도 12는 간장의 섬유화 진전을 모니터링할 수 있는 마커로서 AGP를 이용한 인터페론의 치료 효과 판정을 보여주는 도면이다.
도 13은 제1 신속 측정 방법에서 DSA를 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 14는 제1 신속 측정 방법에서 MAL을 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 15는 제1 신속 측정 방법에서 AOL을 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 16은 제1 신속 측정 방법에서 시판 검체에 대해 MAL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 17은 제1 신속 측정 방법에서 시판 검체에 대해 AOL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 18은 렉틴 어레이법에서 시판 검체에 대한 MAL에 의한 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 19는 렉틴 어레이법에서 시판 검체에 대한 AOL에 의한 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 20은 제2 신속 측정 방법에서 DSA를 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 21은 제2 신속 측정 방법에서 MAL을 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 22는 제2 신속 측정 방법에서 AOL을 이용한 경우의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 23은 제2 신속 측정 방법에서 시판 검체에 대해 MAL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 24는 제2 신속 측정 방법에서 시판 검체에 대해 AOL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 25는 제2 신속 측정 방법에서 임상 검체에 대해 MAL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 26은 제2 신속 측정 방법에서 임상 검체에 대해 AOL을 이용한 경우의 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 27은 렉틴 어레이법에서 임상 검체에 대한 MAL에 의한 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 28은 렉틴 어레이법에서 임상 검체에 대한 AOL에 의한 측정 결과를 보여주는 도면이다.
도 29는 HCV 감염 환자 혈청 125 증례분을 대상으로 제2 신속 측정법으로 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 30은 정상인 100 검체분을 대상으로 렉틴 어레이법과 제2 신속 측정법으로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
도 31은 간장의 섬유화 진전과 M2BP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의해 얻어진 렉틴 신호 강도의 변화의 상관을 보여주는 도면이다.
도 32는 간세포암 환자 수술 전 수술 후의 혈청 중 M2BP 상의 당쇄 변화를 보여주는 도면이다.
도 33은 WFA 결합성 M2BP를 검출하기 위한 바람직한 형태인 렉틴-항체 샌드위치 ELISA의 모델을 보여주는 도면이다.
도 34는 간장암 환자 수술 후 혈청 중 WFA 결합성 M2BP 양의 경시적 변화를 보여주는 도면이다.
도 35는 ELISA법에 의한 WFA 결합성 M2BP 검출에 있어서, 검체 가열 처리의 유무가 검출 감도에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.
도 36은 제2 신속 측정법에 의한 M2BP의 측정에 있어서, 시료로서 HepG2 배양 세포 상청을 이용한 경우의, WFA를 이용하는 측정계의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
도 37은 제2 신속 측정법에 의한 M2BP의 측정에 있어서, 시료로서 Recombinant Human Galectin-3BP/MAC-2 BP를 이용한 경우의, WFA를 이용하는 측정계의 희석 직선성을 보여주는 도면이다.
1. 만성 간질환의 현상
1-1. 간질환의 병태
B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되면 급성기 염증으로부터 5-15년을 거쳐 만성기 염증으로 진행한다. 특히 만성기로 이행한 C형 간염이 자연히 치유되는 일은 드물고, 간기능의 저하가 진행하여 간경변에 이른다. C형 간염 감염으로부터 간세포암에 이르기까지의 시간 경과와 간 상태의 변화를 도 1에 나타낸다. 만성 간염으로부터 간경변에 이르는 병태를 정의하기 위하여, 간장의 그리손 영역 및 간소엽에 출현하는 섬유성 변화를 병리 형태학적으로 파악하여 경도(F1), 중등도(F2), 중도(F3), 간경변기(F4)로 분류한다. 섬유화의 진전은 간세포암 발암의 위험 상승과 상관되어 있고, 도 2에 나타낸 바와 같이 F1 혹은 F2인 경우 연율 1% 이하인데 대해 F3인 경우에는 연 3-4%로 상승한다. 섬유화의 정도가 보다 진전한 조직상을 확인하여 진단되는 간경변(F4)에서는 도 3에 나타낸 바와 같이 연율 7% 정도의 확률로 간세포암이 출현한다. 따라서 간세포암을 효율적으로 발견하여 치료하기 위해서는 특히 F3 및 F4의 상태에 있는 환자를 간편하게 선별하여 정밀 검사 대상자로서 추적(follow)하는 것이 중요하다.
일본의 B형 및 C형 간염 환자 의료 급부 사업은 오로지 간생검 표본에 대한 병리 조직학적 진단에 의해 결정되는 섬유화의 정도 F1∼F3을 대상으로 한다. 그 한편, F4로 진단되는 경우에는 간경변으로 분류되기 때문에, 인터페론 치료에 대한 B형 및 C형 간염 환자 의료 급부 사업에서는 일부만 조성 대상이 되지만, 만족스러운 치료 성적은 얻을 수 없다.
1-2. 항바이러스 요법에 의한 섬유화 억제의 평가
C형 만성 간염에 대해서는 PEG-IFN+RBV 요법, C형 간경변 대상기에 대해서 인터페론 단독 투여가 적응되고 있다. 한편, B형 간염(만성 간염, 간경변)에 대한 치료로서는 핵산 아날로그(analog)가 주체이며, 염증이나 섬유화 평가 마커는 필수라고 생각된다. 특히, 혈청 바이오 마커는 진단·평가 목적으로 폭넓게 임상 응용되는 것이 기대된다.
1-3. 간세포암
간세포 발암에는 B형 간염 바이러스 혹은 C형 간염 바이러스 감염에 의한 미생물학적 인자와 환경 인자가 크게 상호작용한다고 생각되고 있다. 일본에 있어서, 간세포암 환자의 약 9할은 B형 혹은 C형 간염 바이러스의 감염 기왕이 있고, 만성 간염·간경변 환자에서 발생하고 있는 것이 알려져 있다. 간세포암의 발암 위험 인자에는 바이러스 이외에도 남성, 고령, 알코올 과음, 담배, 곰팡이독의 하나인 어플라톡신(afflatoxin) 등이 지적되고 있다(간암 진료 가이드라인, (재)국제의학정보센터).
1-4. 간세포암의 조기 진단
간세포암의 발견은 현재로서는 피험자로부터의 혈청 샘플 중의 AFP나 PIVKA-Ⅱ 등의 간장암 마커의 측정 및 초음파 검사(에코 검사)를 중심으로 한 화상 진단이 주로 이용되고 있다. 화상 진단으로는 최초의 검사로서 초음파 검사 또는 CT를 이용하고, 이들에서 어떠한 이상이 발견될 때에는 추가로 MRI나 혈관 조영을 하는 것이 통상이다.
1-5. 간세포암 예방의 관점으로부터 발암 고위험군의 특정
간세포암 환자의 약 9할이 B형 간염 바이러스 혹은 C형 간염 바이러스 감염에 의한 간염 환자로부터 발생하는 일본에 있어서는 바이러스 감염과 간기능 저하를 지표로 하여 정밀 검사의 대상이 되는 환자를 특정하는 것은 가능하다.
그렇지만, 연율 7% 정도의 확률로 간세포암이 출현하는 간경변(F4) 환자였다고 하더라도, 조기에 암을 발견하여 치료하기 위하여 3개월 간격으로 고액으로 침습성이 높은 정밀 검사를 반복하는 일은 경제적으로도 신체적으로도 환자의 부담은 크다고 하지 않을 수 없다. 연 3-4%의 발암률인 F3인 경우에는 더욱 더 그러하다. 나아가서는, 인터페론에 의한 C형 간염 바이러스 치료의 성공률이 5할 정도인 것을 고려하면, 상당한 인원수에 오르는 인터페론 치료가 성공하지 않았던 만성 간염 환자에게는 간경변 및 간세포 발암에 이르는 어느 위치에 있는지를 명확하게 하여 임상적 팔로우업(follow-up)을 하는 것이 필요하다. 즉 현재의 간염∼간세포암에 이르는 질병의 치료에 있어서는 혈액검사 등의 간편한 검사에 의해 간염∼간경변 환자에 대해 발암 위험의 중요도 부여를 수행하고, 그것에 알맞은 간세포암의 진단 치료를 실시하는 것이 필요한 상황에 있다.
임상 병리학적으로는 섬유화의 정도가 간경변 및 간세포 발암의 위험과 상관하는 것으로부터, 본 발명자들은 섬유화의 진전을 혈청학적으로 정량적으로 측정할 수 있는 검사 기술의 개발에 이 문제 해결의 가능성을 찾아내고 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 간장에 생긴 C형 간염 바이러스 감염은 장해된 간세포의 재생과 반흔 수복으로서의 섬유화를 야기한다. 간장의 섬유화가 진행됨에 따라 발암의 위험이 높아지는 것으로부터, 「섬유화의 정도」는 발암으로 향하는 지표가 된다. 암을 발생하는 배경 간조직에서는 구성 세포가 변화하는 것으로부터, 섬유화의 진전에 수반하여 당쇄 변화를 발생하는 일이 예측된다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 감염으로부터 경시적으로 발암에 이르지만, 이 때 간에는 정상 구조나 기능의 항상적 활동성의 상실이 관찰되고, 동시에 섬유화를 특징으로 하는 병적 구조의 출현을 본다. 간세포암은 조기 간세포암으로부터 고전적 간세포암으로 진전하여 세포의 성질이 변화하는 것이 알려져 있고, 2 ㎝를 넘으면 조기 간세포암 중에 고전적 간세포암이 출현한다. 도 6에 간 상태 변화와 진단 치료 스킴과의 관계를 나타낸다. 만성 간염에 대해서는 페그인터페론/리바비린 병용 요법(PEG-IFN+RBV 요법)이 행해지는데 대해, 조기 간세포암에 대해서는 라디오파 소작술(燒灼術)(RFA)이 행해진다. 간경변에 대해서는 진단적 검사법이나 유효한 치료법이 없다. 본 발명의 당쇄 마커 당단백질은 만성 간염, 간경변, 간세포암을 구별할 수 있으므로, 간경변에 대한 신규 치료 개발에서의 지표가 된다. 또, 파이브로스캔과 공용함으로써 섬유화의 정량적 평가가 가능해지는 것이 기대되므로, 당쇄 마커 당단백질에 의해 섬유화(F3∼F4) 증례의 특정도 가능해진다. 이것은, 섬유화의 정량적 진단에 더하여, 간섬유화 진전이나 발암 억제를 목표로 한 치료의 임상 도입에 즈음하여 치료 효과의 혈청 평가 마커로서 활용되는 사례가 기대된다.
2. 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질의 간질환 특이적 당쇄 변화
본 발명의 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질인 AGP 및 M2BP는 바이러스 감염에 의한 질환의 발증과 진전에 있어서 발생하는 만성 간염, 간경변, 간세포암을 특징짓는 당쇄 변화가 생기는 것이 발견되었다. 이와 같이, 바이러스성 간질환의 병태 진행에 수반하는 당쇄 변화를 지표로 하여 간질환 병태를 특정할 수 있는 마커 당단백질을 간질환 병태 지표 당쇄 마커라 부른다.
본 발명의 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커인 AGP 및 M2BP의 당쇄 변화 검출은 바이러스성 간질환의 각각의 병태, 즉 간세포암, 간경변, 간섬유화(F3 및 F4 마커), 혹은 만성 간염에 특징적이고 각 질환의 감별에 유효하다. 그렇지만, 이들 마커의 당쇄 변화는 질환의 종류나 진전 정도에 의해 종류나 비율을 달리한다. 따라서 마커를 활용해 각각의 대상에 특화한 검출 키트를 구축하기 위해서는 질환 특이적 당쇄 변화를 반영하는 렉틴 프로브의 통계학적인 선발이 필요하다.
3. 당쇄 마커 당단백질의 간질환 특이적 당쇄 변화의 검증
AGP 및 M2BP 상에 존재하는 당쇄의 질환 특이적인 변화는 후술하는 렉틴 어레이에 의해 검증한다. 보다 바람직하게는 항체 오버레이·렉틴 어레이법을 이용한다. 상기 마커 당단백질을 렉틴 어레이를 이용하여 측정한 결과를 기초로 1) 병의 진행 상태에 따라 어느 렉틴 신호에 어느 정도의 측정값 변화를 볼 수 있는지, 2) 측정값의 변화는 어느 병기(초기인지, 말기인지)에 가장 현저하게 되는지, 3) 측정값 변화의 정보는 질병의 조절에 이바지할지 여부를 검토하고, 유용성을 평가하여, 어느 간질환 병태에 적합한 마커인지를 검증한다.
당쇄 마커 당단백질을 간섬유화 진전 모니터링이나, 간경변 검출을 위해 이용하는데 적합한 렉틴 프로브를 선발하는 보다 구체적인 방법을 이하에 기재한다.
(바이러스성) 간염 환자, 간경변 환자 및 간세포암 환자의 혈청으로부터 포집한 당단백질(AGP 및 M2BP)에 대해 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이 등에 의한 비교 당쇄 프로파일링을 수행한다. 우선, (바이러스성) 간염 환자, 만성 간염, 간경변 환자 및 간세포암 환자로부터 혈액 시료를 채취한다. 채취된 각각의 혈액 시료로부터 AGP 및 M2BP에 대해 항체를 이용한 면역 침강에 의해 농축 정제 하고, 항체 오버레이·렉틴 어레이를 이용하여 간질환 병태의 당쇄 마커 당단백질로서 사용할 수 있는 것을 확인한다. 보다 구체적으로는, 도 7에 나타낸 바와 같이, 간염 바이러스 이환 환자 혈청을 대상으로 AGP 및 M2BP에 대해 비교 당쇄 해석을 수행한다. AGP 및 M2BP는 각각 항-AGP 항체 및 항-M2BP 항체를 이용한 면역 침강법에 의해 간편하게 인리치(enrich)된다. 렉틴 마이크로어레이는 고감도인 비교 당쇄 해석 장치이며, 100 나노그램 정도의 단백질 조제량으로 충분히 분석이 가능하기 때문에, 상술한 전처리는 미니 스케일로 수행하는 것이 가능하다. 인리치된 AGP 및 M2BP는 신속하게 렉틴 마이크로어레이에 첨가되고, 일정시간 반응 후, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이법에 의해 AGP 및 M2BP의 당쇄 프로파일을 취득한다. 이 때, 렉틴 어레이에 첨가하는 단백질량은 단백질에 따라 다르지만, 대개 나노그램으로부터 수십 나노그램 정도이다. 통계 해석에 견딜 수 있을 만큼의 검체수에 대해 어레이 해석을 수행한 후, 그 데이터 세트를 이용해 Student-T test등의 2군 비교 해석을 실시한다. 그것에 의해, 객관적으로 병태 변화에 의해 신호에 유의차가 생기는 렉틴을 선발하는 것이 가능하게 된다. 렉틴 마이크로어레이로는, 예를 들어, 다음에 나타내는 표 2에 기재된 렉틴의 일부 또는 전부를 포함하는 복수의 렉틴을 고상화한 렉틴 마이크로어레이를 이용할 수 있고, 보다 구체적으로는 Kuno A., et al. Nat. Methods 2, 851-856 (2005)에 기재된 렉틴 마이크로어레이 또는 GP 바이오사이언스사 제의 LecChip을 이용할 수 있다. 또 항체로는 표 1에 기재된 항체를 이용할 수 있다.
당단백질명 항체(벤더, 카탈로그 번호)
alpha-1-acid glycoprotein
(AGP）		 mouse mononclonal, clone AGP-47(Sigma, A5566)
rabbit polyclonal(Rockland, 200-406-046)
Galectin 3 binding protein
(Mac-2-binding protein, Mac2BP)		 goat polyclonal(R&D Systems, AF2226)
3-1. 렉틴 마이크로어레이(단순히 '렉틴 어레이'라고도 부름)
렉틴 어레이는 복수 종의 특이성이 상이한 판별자(프로브) 렉틴을 1개의 기판상에 병렬로 고정(어레이화)한 것으로, 분석 대상이 되는 복합 당질에 어느 렉틴이 얼마나 상호작용했는지를 일제히 해석할 수 있는 것이다. 렉틴 어레이를 이용함으로써, 당쇄 구조 추정에 필요한 정보를 한 번의 분석으로 취득할 수 있고, 또한 샘플 조제로부터 스캔까지의 조작 공정은 신속하고 간편하게 할 수 있다. 질량 분석 등의 당쇄 프로파일링 시스템에서는 당단백질을 그대로 분석할 수는 없고, 미리 당펩티드나 유리 당쇄 상태로까지 처리를 해야 한다. 한편, 렉틴 마이크로어레이에서는, 예를 들면, 코어 단백질 부분에 직접 형광체를 도입하는 것만으로 그대로 분석할 수 있다고 하는 이점이 있다. 렉틴 마이크로어레이 기술은 본 발명자들이 개발한 것으로, 그 원리·기초는, 예를 들면, Kuno A., et al. Nat. Methods 2, 851-856 (2005)에 기재되어 있다.
렉틴 어레이에 이용하는 렉틴으로는 다음의 표 2에 기재된 것을 들 수 있다.
렉틴 기원 결합 특이성(당결합 특이성)
1 LTL Lotus tetragonolobus Fucα1-3GlcNAc, Sia-Lex and Lex
2 PSA Pisum sativum Fucα1-6GlcNAc and α-Man
3 LCA Lens culinaris Fucα1-6GlcNAc and α-Man, α-Glc
4 UEA-I Ulex europaeus Fucα1-2LacNAc
5 AOL Aspergillus oryzae Terminal αFuc and ±Sia-Lex
6 AAL Aleuria aurantia Terminal αFuc and ±Sia-Lex
7 MAL Maackia amurensis Siaα 2-3Gal
8 SNA Sambucus nigra Siaα 2-6Gal/GalNAc
9 SSA Sambucus sieboldiana Siaα 2-6Gal/GalNAc
10 TJA-I Trichosanthes japonica Siaα 2-6Galβ1-4GlcNAcβ-R
11 PHA(L) Phaseolus vulgaris Tri- and tetra-antennary complex oligosaccharides
12 ECA Erythrina cristagalli Lac/LacNAc
13 RCA120 Ricinus communis Lac/LacNAc
14 PHA(E) Phaseolus vulgaris NA2 and bisecting GlcNAc
15 DSA Datura stramonium (GlcNAc)n, polyLacNAc and LacNAc (NA3, NA4)
16 GSL-Ⅱ Griffonia simplicifolia Agalactosylated N-glycan
17 NPA Narcissus pseudonarcissus non-substituted α1-6Man
18 ConA Canavalia ensiformis α-Man (inhibited by presence of bisecting GlcNAc)
19 GNA Galanthus nivalis non-substituted α1-6Man
20 HHL Hippeastrum hybrid non-substituted α1-6Man
21 BPL Bauhinia purpurea alba Galβ1-3GalNAc and NA3, NA4
22 TJA-Ⅱ Trichosanthes japonica Fucα1-2Gal, β-GalNAc > NA3, NA4
23 EEL Euonymus europaeus Galα1-3[Fucα1-2Gal] > Galα1-3Gal
24 ABA Agaricus bisporus Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) and sialyl-T
25 LEL Lycopersicon esculentum (GlcNAc)n and polyLacNAc
26 STL Solanum tuberosum (GlcNAc)n and polyLacNAc
27 UDA Urtica dioica (GlcNAc)n and polyLacNAc
28 PWM Phytolacca americana (GlcNAc)n and polyLacNAc
29 Jacalin Artocarpus integrifolia Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) and GalNAcα-Thr/Ser (Tn)
30 PNA Arachis hypogaea Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T)
31 WFA Wisteria floribunda Terminal GalNAc (e.g., GalNAcβ1-4GlcNAc)
32 ACA Amaranthus caudatus Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T)
33 MPA Maclura pomifera Galβ1-3GalNAcα-Thr/Ser (T) and GalNAcα-Thr/Ser (Tn)
34 HPA Helix pomatia Terminal GalNAc
35 VVA Vicia villosa α-, β-linked terminal GalNAc and GalNAcα-Thr/Ser (Tn)
36 DBA Dolichos biflorus GalNAcα-Thr/Ser (Tn) and GalNAcα1-3GalNAc
37 SBA Glycine max Terminal GalNAc (especially GalNAcα1-3Gal)
38 GSL-I
mixture		 Griffonia simplicifolia α-GalNAc, GalNAcα-Thr/Ser (Tn), α-Gal
39 PTL-I Psophocarpus tetragonolobus α-GalNAc and Gal
40 MAH Maackia amurensis Siaα 2-3Galβ1-3[Siaα2-6GalNAc] α-R
41 WGA Triticum unlgaris (GlcNAc)n and multivalent Sia
42 GSL-IA4 Griffonia simplicifolia α-GalNAc, GalNAcα-Thr/Ser (Tn)
43 GSL-IB4 Griffonia simplicifolia α-Gal
예를 들면, 45 종류의 렉틴을 기반으로 고정화한 렉틴 어레이(GP 바이오사이언스사 제의 LecChip)가 이미 상용상 입수 가능하다.
3-2. 렉틴 어레이에 의한 당쇄 프로파일의 통계 해석
렉틴 어레이는 현재로서는 정제표품뿐만 아니라 혈청이나 세포 용해물 등의 혼합 시료의 정량 비교 당쇄 프로파일링을 할 수 있는 실용화 기술에까지 발전해 오고 있다. 특히 세포 표층 당쇄의 비교 당쇄 프로파일링은 그 발전이 눈부시다(Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327 (2006), Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 11534-11539 (2007), Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146 (2007)).
또, 당쇄 프로파일의 통계 해석에 의한 데이터 마이닝(data mining)에 대해서는, 예를 들면, 「Kuno A, et al. J Proteomics Bioinform. 1, 68-72 (2008)」, 혹은 「일본 당질학회 2008/8/18 렉틴 마이크로어레이 응용 기술개발∼생체 시료의 비교 당쇄 프로파일링과 통계 해석∼쿠노 아츠시, 마츠다 코오시, 이타쿠라 요코, 마츠자키 히데키, 나리마츠 히사시, 히라바야시 준」 및 「Matsuda A, et al. Biochem Biophys Res Commun. 370, 259-263 (2008)」에 나타내는 방법으로 수행할 수 있다.
3-3. 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이법
렉틴 마이크로어레이의 플랫폼은 기본적으로 상기와 같이 하고, 검출에 즈음해서는 상기 피검체를 직접 형광 등으로 표지하는 것이 아니라 항체를 통해 간접적으로 형광기 등을 피검체에 도입함으로써, 일제히 다검체에 대한 분석을 간편, 고속화할 수 있는 응용법이다(「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009)」, 「히라바야시 준, 쿠노 아츠시, 우치야마 노보루, 「렉틴 마이크로어레이를 이용한 당쇄 프로파일링 응용 기술의 개발」, 실험의학증간 「분자 레벨로부터 다가가는 암진단 연구∼임상 응용으로의 도전∼」, 요토샤, Vol 25(17), 164-171 (2007)」, 쿠노 아츠시, 히라바야시 준, 「렉틴 마이크로어레이에 의한 당쇄 프로파일링 시스템의 당쇄 바이오마커 탐색으로의 활용」, 유전자의학 MOOK11호, 「임상 당쇄 바이오마커의 개발과 당쇄 기능의 해명」, pp.34-39, 메디카르두 (2008) 참조).
당단백질(AGP 및 M2BP)이 피검체이면 당쇄 부분은 렉틴 마이크로어레이 상의 렉틴에 의해 인식되기 때문에, 코어 단백질 부분에 대한 항체(항-AGP 항체 및 항-M2BP 항체)를 그 위에서 씌우는(오버레이) 것에 의해 피검 당단백질을 표지하거나 혹은 고도로 정제하거나 하는 일 없이 특정적으로 감도 높게 검출할 수 있다.
3-4. 렉틴 오버레이·항체 마이크로어레이법
렉틴 마이크로어레이 대신에 코어 단백질에 대한 항체를 유리 기판 등의 기판 위에 병렬로 고정(어레이화)한 항체 마이크로어레이를 이용하는 방법이다. 조사하는 마커에 대할 만큼의 수의 항체가 필요하다. 당쇄 변화를 검출하는 렉틴을 미리 확정하는 것이 필요하다.
4. 간질환 병태 지표 당쇄 마커의 질환 특이적 당쇄 변화를 이용하는 간질환의 검출 방법
AGP 및 M2BP는 섬유화의 진전 등의 간질환의 병태 변화에 수반하여 당쇄 구조가 변화하는 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커이다. 이 때문에 AGP 및 M2BP 당쇄 구조의 변화에 대응하여 반응성이 변화하는 렉틴(이하, 렉틴 "A"라 약칭함)과 피험자로부터 채취한 시료에 포함되는 마커를 반응시켜 렉틴에 반응한 마커를 측정함으로써 간질환의 병태를 판별하거나 간의 섬유화의 정도를 판정할 수 있다.
예를 들면, 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커의 검출은,
(1) (a) 상기 렉틴 "A" 및 (b) 상기 마커의 당쇄 이외의 부분(코어 단백질)을 검출하는 항체를 이용하여 실시할 수 있다. 또 (2) 간질환 병태 지표 당쇄 마커에 대한 특이적인 항체로서 당쇄 결합 부분을 포함하는 개소를 에피토프(epitope)로 하는 항체를 이용하여 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 검출할 수 있다.
예를 들면, 마커의 코어 단백질에 대한 항체 및 렉틴 "A"를 이용하여마커를 검출함으로써 간질환 환자를 정상인과 구별하여 검출할 수 있고, 바람직하게는 렉틴 어레이를 이용하는 항체 오버레이법(Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009))을 이용할 수 있다. 3의 질환 특이적 당쇄 변화의 검증 시험에서 1개 내지 2개 이상의 최적인 렉틴 "A"가 선발되어 있는 경우, 후술하는 제1 또는 제2 신속 측정 방법을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
예를 들어, 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 이용하는 구체적인 간질환의 검출 방법으로는
1) 피험자로부터 채취된 시료 중의 렉틴 "A"와 특이적으로 반응하는 당쇄를 갖는 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 측정하는 공정,
2) 정상인으로부터 채취된 시료 중의 렉틴 "A"와 특이적으로 반응하는 당쇄를 갖는 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 측정하는 공정,
3) 간질환 환자로부터 채취된 시료 중의 렉틴 "A"와 특이적으로 반응하는 당쇄를 갖는 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 측정하는 공정, 및
4) 피험자로부터 얻어진 간질환 병태 지표 당쇄 마커의 측정 결과와 정상인 또는 간질환 환자로부터 얻어진 간질환 병태 지표 당쇄 마커의 측정 결과를 비교하고, 피험자의 측정 결과가 보다 간질환 환자의 측정값에 가까운 경우에 간질환이라고 판별하는 공정을 포함하는 간질환의 검출 방법을 들 수 있다.
또, 다수의 간질환 환자 및 정상인의 측정 결과에 근거하여 미리 간질환을 판별하기 위한 역치를 설정해 두고 피험자의 측정값을 역치와 비교하여 피험자가 간질환인지 여부를 판정하도록 해도 된다.
4-1. 섬유화의 진전 측정 방법
간염 바이러스 감염에 의한 간염의 진전에 있어서, 섬유화의 정도는 간기능 저하 및 간세포 발암의 위험과 상관하는 것이 알려져 있다. 따라서 섬유화의 측정은 간기능 저하 및 발암 위험을 평가하는 것을 의미한다. 또 간염 환자 전체의 4할 정도는 인터페론 치료에 반응하지 않고 바이러스 감염이 지속한다. 이러한 병태가 활동성으로 진행하는지 여부는 섬유화의 진전으로 판단되어야 한다고 생각되고 있다. 이러한 관점으로부터, 섬유화의 진전을 측정하는 것은 간염의 진단 치료에 있어서 중요한 의미를 갖는다.
현재 수행되고 있는 섬유화의 평가는 생검 표본에 대한 병리 진단에 의한다. 근래, 파이브로스캔이 도입됨으로써 당해 방법이 보급되는 것이 기대된다. 또 섬유화를 혈청학적으로 평가하는 방법으로서 Fibro Test, Forn's index, Hepatoscore 등이 임상적으로 사용되고 있지만, 생검 진단에 비해 감도와 특이도 모두 떨어진다.
AGP 및 M2BP에 대하여, 섬유화의 진전 정도가 상이한 환자 혈청군을 이용하여, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이에 의해 섬유화의 진전 정도에 상관 하여 신호 강도가 증가 혹은 감소하는 렉틴을 선택한다. 이 정보를 기초로 마커 후보 분자에 대한 항체 및 섬유화의 진전에서 신호 변동하는 렉틴 "A"를 이용한 샌드위치 검출 방법, 예를 들어 렉틴-항체 샌드위치 ELISA나 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이법을 확립할 수 있다. 병리 진단에 의해 섬유화의 스테이징(staging)이 되어 있는 환자 혈청을 100 정도 수집하고, 그것들에 대해 분석을 수행하여 각 병기(stage)에서의 컷오프(cut-off)값를 설정함으로써 피환자 혈청을 이용하여 간섬유화의 진전을 모니터링할 수 있다.
또, 렉틴 "A"로서, AGP에 대해서는 AOL 및 MAL로부터 선택되는 제1 렉틴을 들 수 있고, M2BP에 대해서는 WFA, BPL, AAL, RCA120 및 TJAII로부터 선택되는 제2 렉틴을 들 수 있다. 이하, AOL 및 MAL로부터 선택되는 렉틴을 제1 렉틴이라 부르는 경우가 있고, WFA, BPL, AAL, RCA120 및 TJAII로부터 선택되는 렉틴을 제2 렉틴이라 부르는 경우가 있다.
예를 들면, 적어도 제1 렉틴이 고정된 제1 렉틴 어레이와 항-AGP 항체를 이용하여 제1 렉틴에 결합하는 AGP를 측정할 수 있고, 적어도 제2 렉틴이 고정된 제2 렉틴 어레이와 항-M2BP 항체를 이용하여 제2 렉틴에 결합하는 M2BP를 측정할 수 있다.
4-2. 간경변의 검출
간경변은 간소엽 구조가 소실된 재생 결절과 이것을 에워싸는 치밀한 섬유성 결합 조직이 간 전체에 미만성으로 출현하는 병태라고 정의된다. 이것은 간세포 장해와 섬유화가 지속하는 진행성 만성 간질환의 종말 상태이기도 하다. 간경변에서의 간생검은 성인(成因) 진단을 찾기 위하여 수행되는 것으로, 조기의 간경변이나 대결절형의 간경변에서는 진단 곤란한 증례가 많다(외과병리학 제4판, 문광당으로부터). 따라서, 간경변을 정성적, 정량적으로 진단할 수 있는 검사 기술이 필요하게 되고 있다. 이 목적에 대해, 「1)의 섬유화의 진전 측정 방법」의 항에서 발견된 섬유화의 진전을 모니터링할 수 있는 후보 분자 항체 및 렉틴 세트 중, 섬유화 병기 F3과 F4를 분별할 수 있는 경우 간경변 검출에 사용할 수 있다.
4-3. 시료 중의 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커상의 질환 특이적 당쇄 변화의 검출
시료로는 생검 시료, 체액 시료, 바람직하게는 혈액(혈청, 혈장 등)을 들 수 있다.
측정이란 정성적 측정 및 정량적 측정의 양자를 포함한다.
간질환 병태 지표 당쇄 마커의 측정은, 예를 들면, (1) 렉틴 "A"를 고정한 칼럼이나 어레이 및 (2) AGP 또는 M2BP에 대한 항체를 이용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 항체 오버레이·렉틴 어레이법, 보다 바람직하게는 신속 제1 또는 제2 신속 측정 방법을 이용할 수 있다.
또, AGP 또는 M2BP의 농도를 계측할 수도 있고, 이것에는 렉틴 어레이를 이용한 항체 오버레이·렉틴 어레이법, 면역학적 측정법, 효소 활성 측정법, 캐필러리 전기영동법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 항체 오버레이·렉틴 어레이에 의해 통계학적으로 선발된 질환 특이적 당쇄 변화를 가장 반영하는 렉틴 "A"와 AGP 또는 M2BP에 특이적인 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 이용한 효소 면역측정법, 2 항체 샌드위치 ELISA법, 금 콜로이드법, 방사면역측정법, 효소화학발광 면역측정법, 전기화학발광 면역측정법, 라텍스 응집 면역측정법, 형광 면역측정법, 웨스턴블롯팅법, 면역 조직화학법, 표면 플라즈몬 공명법(이하, 'SPR법'이라고 기재함) 등에 의한 정성적 또는 정량적 수법을 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 준정량을 렉틴 "A" 및 항-신규 질환 병태 지표 당쇄 마커 항체를 이용하는 웨스턴블롯팅법에 의해 수행할 수도 있다. 정성적 측정에 있어서, 상기 「피험자의 측정 결과가 보다 높은 경우」란 정상인보다 피험자의 시료 중에 신규 질환 병태 지표 당쇄 마커가 보다 많이 존재하는 것이 정성적으로 나타난 경우를 의미한다. 또한, 항체를 통하지 않는 당쇄의 직접 측정법으로서의 렉틴법도 포함된다.
여기서, 간섬유화 진전에 수반하는 AGP의 당쇄 구조의 변화에 대응하여 반응성이 변화하는 렉틴 "A"로는 항체 오버레이·렉틴 어레이 후의 통계 해석에 의해 엄선된 AOL, MAL, 또는 AOL 및 MAL의 병용을 들 수 있다. AOL은 간섬유화 진전에 수반하여 AGP의 당쇄에 대한 반응성이 높아지는 렉틴군 중에서 가장 유의차를 나타내는 렉틴이며, MAL은 간섬유화 진전에 수반하여 AGP의 당쇄에 대한 반응성이 낮아지는 렉틴군 중에서 가장 유의차를 나타내는 렉틴이다. 이 때문에 AOL에 결합한 AGP의 측정값과 MAL에 결합한 AGP의 측정값 모두를 이용하면 보다 정확하게 피험자의 간질환의 병태를 판별할 수 있다. AOL에 결합한 AGP의 측정값(AOL 측정값)과 MAL에 결합한 AGP의 측정값(MAL 측정값)의 양자를 이용하는 방법으로는 주지의 통계학적 수법을 채용할 수 있지만, 간편하게는 AOL 측정값과 MAL 측정값의 차나 비를 이용할 수 있다. 또한, AOL 측정값과 MAL 측정값의 차나 비를 이용하는 경우에는 양 측정값의 스케일을 갖추는 것이 바람직하고, 간편하게는 양 측정값의 컷오프 라인 값의 차를 구해 스케일을 보정할 수 있다. 예를 들면, MAL 컷오프 라인 값과 AOL 컷오프 라인 값의 비를 이용하여, AOL 측정값 및 MAL 측정값의 어느 한쪽을 보정하면 된다. AOL 및/또는 MAL을 이용하여 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 AGP를 측정함으로써, AGP를 간의 섬유화 판별 마커, 간경변 검출 마커 또는 간세포암 검출 마커로 사용할 수 있다. 또, 이들 렉틴 "A"를 이용하여 인터페론 등의 치료를 수행하고 있는 환자로부터 채취된 시료 중의 AGP를 측정함으로써 치료 효과의 모니터를 수행하는 것이 가능하다.
또한, AOL이나 MAL에 결합한 AGP의 측정값은 AGP의 당쇄 구조의 변화에 관계없이 반응성이 실질적으로 변화하지 않는 렉틴에 결합한 AGP의 측정값을 이용하여 규격화하는 것이 바람직하다. 이와 같은 렉틴으로는 DSA가 바람직하다. 또, 피험자로부터 채취한 시료에 포함되는 AGP의 코어 단백의 측정값을 이용하여 AOL이나 MAL에 결합한 AGP의 측정값의 규격화를 수행해도 된다. 또, AOL 측정값 및 MAL 측정값의 양자를 이용하는 방법에 있어서도 규격화된 AOL 측정값 및 규격화된 MAL 측정값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 제1 렉틴 어레이 및 제2 렉틴 어레이로서, 각각에 추가로 DSA가 고정되어 있는 것을 이용하여 DSA에 결합하는 AGP를 측정하고, 제1 렉틴에 결합한 AGP의 측정값을 DSA에 결합한 AGP의 측정값으로 규격화하여 DSA에 결합하는 M2BP를 측정하고, 제2 렉틴에 결합한 M2BP의 측정값을 DSA에 결합한 M2BP의 측정값으로 규격화하여 AGP 및/또는 M2BP의 측정을 수행할 수 있다. 간의 병태 변화에 수반하는 M2BP의 당쇄 구조의 변화에 대응하여 반응성이 변화하는 렉틴 "A"로는 항체 오버레이 렉틴 어레이 후의 통계 해석에 의해 엄선된 WFA, BPL, AAL, RCA120 및/또는 TJAII를 들 수 있다. WFA, BPL, AAL, RCA120 및 TJAII는 모두 간질환의 병태가 진행함에 따라 M2BP의 당쇄에 대한 반응성이 높아지는 렉틴이다. WFA, BPL 및 TJAII는 간세포암 환자, 특히 수술 후 암재발 증례의 M2BP와의 반응성이 강하고, WFA, BPL 및/또는 TJAII를 이용하여 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 M2BP를 측정함으로써 M2BP를 간세포암 고위험군 환자 특정 마커로서 사용할 수 있다. 또, AAL 및/또는 RCA120을 이용하여 피험자로부터 채취된 시료에 포함되는 M2BP를 측정함으로써 M2BP를 간의 섬유화 판별 마커, 간경변 검출 마커 또는 간세포암 검출 마커로 사용할 수 있다. 또, 간세포암을 적출한 후의 환자에 대하여, 정기적으로 WFA를 이용하여 환자로부터 채취된 시료 중의 M2BP를 측정함으로써 재발 위험의 예측을 수행하는 것이 가능하다. 또한, 혈청 중에 포함되는 당단백질에서 WFA에 결합할 수 있는 분자가 매우 적기 때문에, 측정 시료로서 혈청을 직접 사용하는 것이 가능해지기 때문에, WFA는 측정계를 구축할 때의 자유도가 커서 바람직하다.
또한, WFA, BPL, AAL, RCA120 또는 TAJII에 결합한 M2BP의 측정값은 M2BP의 당쇄 구조의 변화에 관계없이 반응성이 실질적으로 변화하지 않는 렉틴에 결합한 M2BP의 측정값을 이용하여 규격화하는 것이 바람직하다. 이와 같은 렉틴으로는 DSA가 바람직하다. 또, 피험자로부터 채취한 시료에 포함되는 M2BP의 코어 단백의 측정값을 이용하여 WFA, BPL, AAL, RCA120 또는 TAJII에 결합한 M2BP의 측정값의 규격화를 수행해도 된다.
AOL, MAL, 또는 DSA에 결합한 AGP의 측정 및 WFA, BPL, AAL, RCA120, 또는 TAJII에 결합한 M2BP의 측정은 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이법에 의해 수행하는 것이 바람직하다. 특히, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이법은 복수 종의 렉틴에 결합한 AGP 또는 M2BP를 동시에 측정할 수 있다. 또, 렉틴 "A"를 이용하여 AGP나 M2BP 등의 마커를 신속하게 측정하는 경우에는 하기의 제1 또는 제2 신속 측정 방법으로 측정하는 것이 바람직하다.
제1 신속 측정 방법으로는 렉틴 "A"에 비오틴(biotin)을 결합한 비오틴화 렉틴 "A"와 시료를 혼합하고, 그것에 스트렙트아비딘(streptavidin)이 고정된 자성 입자를 첨가하여 자성 입자-렉틴 "A"-AGP의 복합체를 형성하고, 그 복합체에 표지 항-AGP 항체를 반응시켜 자성 입자-렉틴 "A"-AGP-표지 항-AGP 항체의 제2 복합체를 형성하여 제2 복합체의 표지량을 측정함으로써, 상기 렉틴 "A"에 반응하는 AGP를 정량하는 방법을 들 수 있다. 또한, M2BP를 측정하는 경우에는 표지 항-M2BP 항체를 이용하는 것 이외에는 상기 AGP의 측정 방법과 동일하게 실시할 수 있다. 제1 신속 측정 방법에서는 시료 중의 AGP나 M2BP의 정량을 60분 정도로 수행하는 것이 가능하다. 비오틴화 렉틴 "A"와 스트렙트아비딘 고정화 자성 입자를 사용하면, 시료 중의 AGP나 M2BP에 대한 렉틴 "A"의 반응성이 향상하여 AGP나 M2BP와 렉틴 "A"의 반응 시간을 약 30분 정도로 단축할 수 있다.
또한, 제2 신속 측정 방법으로는 렉틴 "A"를 고정화한 자성 입자와 시료를 혼합하여 시료 중의 AGP의 당쇄를 렉틴 "A"로 포착하고, 자성 입자에 포착된 AGP에 표지 항-AGP 항체를 반응시켜서, 자성 입자-렉틴 "A"-AGP-표지 항-AGP 항체의 복합체를 형성하여 복합체의 표지량을 측정함으로써, 상기 렉틴 "A"에 반응하는 AGP를 정량하는 방법을 들 수 있다. 제2 신속 측정 방법에 있어서도, M2BP를 측정하는 경우에는 표지 항-M2BP 항체를 이용하는 것 이외에는 상기 AGP의 측정 방법과 동일하게 실시할 수 있다. 제2 신속 측정 방법에서는 시료 중의 AGP나 M2BP의 정량을 20분 정도로 수행하는 것이 가능하다. 이것은 렉틴 "A" 고정화 자성 입자를 사용하면 시료 중의 AGP나 M2BP에 대한 렉틴 "A"의 반응성이 현저하게 향상되어, AGP나 M2BP와 렉틴 "A"의 반응 시간을 약 5분 정도까지 단축할 수 있다.
제1 및 제2 신속 측정 방법은 자동화에 적합하며, 특히 제2 신속 측정 방법은 전자동 측정 장치에서 바람직하게 실시 가능하다. 제2 신속 측정 방법을 자동화함으로써 다검체의 연속 측정을 용이하게 수행할 수 있다. 또, 자동화에 의해 하나의 검체에 대한 다항목 측정(상이한 렉틴을 이용한 측정)을 단시간에 실행할 수 있다.
표지 항-AGP 항체나 표지 항-M2BP 항체의 표지로는 형광 물질이나 효소가 사용 가능하다. 형광 물질로는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 그린 형광 단백질(GFP), 루시페린 등을 들 수 있다. 효소로는, 예를 들면, 알칼린 포스파타아제(ALP), 퍼옥시다아제, 글루코오스옥시다아제, 티로시나아제, 산성 포스파타아제 등을 들 수 있다. 효소로서 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우, 공지의 발광 기질, 발색 기질 등을 이용할 수 있고, 예를 들면 CDP-star(등록상표)(4-클로로-3-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸}-4-일)페닐인산 2나트륨), CSPD(등록상표)(3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸}-4-일)페닐인산 2나트륨) 등의 화학 발광 기질, p-니트로페닐 포스페이트, 5-브로모-4-클로로-3-인드릴 인산(BCIP), 4-니트로블루-테트라졸륨 클로라이드(NBT), 요오드니트로테트라졸륨(INT) 등의 발색 기질을 들 수 있다. 또, 항체를 비오틴 표지하고, 스트렙트아비딘이 결합된 상기 형광 물질이나 상기 효소를 비오틴-아비딘 결합을 통해 항체에 결합시켜도 된다.
혈액 시료 중에 포함되는 간장의 섬유화에 의해 당쇄 구조가 변화한 AGP나 M2BP의 양은 미량이기 때문에, 고감도와 표지 검출의 신속화의 관점으로부터 표지로서 효소를 사용하고, 발광 기질을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, ALP 등의 효소는 당쇄를 갖고 있다. 그 당쇄와 렉틴의 비특이 반응을 방지하기 위하여 탈글리코실화 처리된 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 처리를 실시한 효소로는, 예를 들면, Recombinant AP, EIA Drade, CR 03535452(Roche Diagnostics사 제)와 같이 탈글리코실화 처리된 ALP를 사용할 수 있다.
또, 항-AGP 항체나 항-M2BP 항체에 대해서도 당쇄를 갖고 있다. 그 당쇄와 렉틴의 비특이 반응을 방지하기 위하여 탈글리코실화된 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 펩신 소화 및 환원을 수행함으로써 Fab'로 전환된 항-AGP 항체나 항-M2BP 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
표지 항체 시약의 제작은 공지의 방법에 따라 항-AGP 항체 또는 항-M2BP 항체와 EMCS[N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido](동인화학)와 같은 가교제를 이용하여 말레이미드화한 표지를 혼합하고, 반응시킴으로써 표지 항체를 조제할 수 있다. 예를 들면, 탈글리코실화 처리된 ALP를 가교제를 이용하여 말레이미드화하고, Fab'로 전환된 항-AGP 항체 또는 항-M2BP 항체와 반응시켜 조제한 것을 이용하는 것이 비특이 반응 방지의 관점에서 바람직하다.
5. 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 이용한 신규의 특이적 폴리클로날 항체 및/또는 모노클로날 항체
신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커를 이용하는 간세포암의 검출 방법에 있어서, 간질환 병태 지표 당쇄 마커 특이적 폴리클로날 항체 및/또는 모노클로날 항체를 용이하게 입수할 수 있는 경우에는 그것들을 이용할 수 있지만, 용이하게 입수할 수 없는 경우에는, 예를 들면, 이하와 같이 조제할 수 있다.
5-1. 항체의 조제
본 발명의 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커는 간질환 검출용 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 조제에 이용할 수 있다.
예를 들면, 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커에 대한 항체는 주지의 방법으로 조제할 수 있다. 프로인트(Freund)의 완전 어주번트(adjuvant)를 동시 투여하여 항체의 생성을 부스트(boost)할 수도 있다. 또, X의 당쇄가 결합하고 있는 결합 위치를 포함하는 펩티드를 합성하고, 이 펩티드를 시판 키홀·림펫·헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)에 공유결합시켜 동물에 투여한다. 또한, 이 때 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)를 동시에 투여하여 항체 생산을 부스트할 수도 있다.
또, 예를 들면, 항 신규 간질환 병태 지표 당쇄 마커 모노클로날 항체는 켈러와 미르슈타인의 방법으로 조제할 수 있다(Nature Vol.256, pp495-497 (1975)). 예를 들면, 항원으로 면역한 동물로부터 얻어지는 항체 생산 세포와 마이엘로마(myeloma) 세포의 세포융합에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 조제하고, 얻어지는 하이브리도마로부터 항-X 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 조제할 수 있다.
구체적으로는, 얻어진 항원용의 간질환 병태 지표 당쇄 마커에 어주번트를 첨가한다. 어주번트로는 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트 등을 들 수 있고, 이들 중 어느 것을 혼합해도 된다.
상기와 같이 하여 얻어진 항원을 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트, 말, 원숭이, 토끼, 염소, 양 등의 포유동물에 투여한다. 면역은 기존의 방법이면 어느 방법도 이용할 수 있지만, 주로 정맥내 주사, 피하 주사, 복강내 주사 등에 의해 수행한다. 또, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않고, 수일부터 수주간 간격으로, 바람직하게는 4∼21일 간격으로 면역한다.
최종 면역일로부터 2∼3일 후에 항체 생산 세포를 채집한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포를 들 수 있다.
항체 생산 세포와 융합시키는 마이엘로마(골수종) 세포로서, 마우스, 래트, 인간 등 여러 가지 동물에 유래하고, 당업자가 일반적으로 입수 가능한 주화(株化) 세포를 사용한다. 사용하는 세포주로는 약제 저항성을 갖고, 미융합 상태에서는 선택 배지(예를 들면 HAT 배지)에서 생존하지 못하며, 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 이용된다. 일반적으로 8-아자구아닌 내성주가 이용되고, 이 세포주는 히폭산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라아제를 결손하여 히폭산틴·아미노프테린·티미딘(HAT) 배지에 생육할 수 없는 것이다.
마이엘로마 세포는 이미 공지된 여러 가지 세포주, 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979)), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7 (1978)), NS-1(Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)), MPC-11(Margulies, D.H. et al., Cell 8, 405-415 (1976)), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature 276, 269-270 (1978)), FO(de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods 35, 1-21 (1980)), S194(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. 148, 313-323 (1978)), R210(Galfre, G. et al., Nature 277, 131-133 (1979)) 등이 바람직하게 사용된다.
다음에, 상기 마이엘로마 세포와 항체 생산 세포를 세포융합시킨다. 세포융합은 MEM, DMEM, RPME-1640 배지 등의 동물세포 배양용 배지 중에서 마이엘로마 세포와 항체 생산 세포를 혼합비 1:1∼1:10으로 융합 촉진제의 존재 하, 30∼37℃에서 1∼15분간 접촉시킴으로써 수행된다. 세포융합을 촉진시키기 위해서는 평균 분자량 1,000∼6,000의 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐 알코올 또는 센다이 바이러스 등의 융합 촉진제나 융합 바이러스를 사용할 수 있다. 또, 전기 자극(예를 들면 일렉트로포레이션)을 이용한 시판되는 세포융합 장치를 이용하여 항체 생산 세포와 마이엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.
세포융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서 선택 배지에서의 세포의 선택적 증식을 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 즉, 세포 현탁액을 적합한 배지에서 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 위에 분주하고, 각 웰에 선택 배지(HAT 배지 등)를 첨가하고, 이후 적절히 선택 배지를 교환하여 배양을 수행한다. 그 결과, 생육해 오는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.
하이브리도마의 스크리닝은 한계 희석법, 형광 여기 셀 소터(cell sorter)법 등에 의해 수행하고, 최종적으로 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 취득한다. 취득한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로는 통상의 세포 배양법이나 복수 형성법 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에서 말하는 항체에는 모노클로날 항체라도, 폴리클로날 항체라도 되고, 1 본쇄 Fvs(scFv), 1 본쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드 연결 Fvs(sdFv) 등도 포함된다. 또한, 제1 또는 제2 신속 측정법에 한정하지 않으며, 본 발명에서 이용하는 항체로는 당쇄와 렉틴의 비특이 반응을 방지하기 위하여 탈글리코실화한 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 펩신 소화 및 환원을 수행함으로써 Fab'로 전환한 항-AGP 항체나 항-M2BP 항체를 사용할 수 있다.
[실시예 1] 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질의 간질환 검출에 대한 이용
간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질인 AGP 및 Mac2BP(M2BP)에 대하여, 항체 오버레이·렉틴 어레이를 활용하여 간질환의 검출을 실시한 예를 이하에 나타낸다. 또한, 본 수법에 의한 (바이러스성) 간염 환자(CH), 간경변 환자(LC), 간세포암 환자(HCC) 및 정상인(HV) 혈청에 유래하는 상기 마커 당단백질 상 당쇄의 비교 해석의 순서를 도 7에 나타낸다.
1. 마커 단백질의 혈청으로부터의 인리치
(바이러스성) 간염 환자(CH), 간경변 환자(LC), 간세포암 환자(HCC) 및 정상인(HV) 혈청에 유래하는 상기 마커 당단백질의 인리치는 「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009)」에 따라 수행되었다. 또한, 얻어지는 결과가 병태에 의존하고 있다는 것을 밝히기 위하여, 각 병태에 대해 5례씩을 분석에 이용하기로 하였다. 각 환자 혈청을 0.2% SDS 함유 PBS 완충액으로 10배 희석하고, 10분간 95℃에서 가열 처리한 것을 AGP에 있어서는 5 ㎕, Mac2BP에 있어서는 20 ㎕ 반응 튜브에 분주하고, 그것에 500 ng의 각 항원에 대한 항체(비오틴화물)를 첨가하였다. 각 반응 용액은 반응 버퍼(1% Triton X-100이 들어 있는 Tris-buffered saline(TBSTx))에 의해 45 ㎕로 조정된 후, 4℃에서 2시간 진탕 반응되었다. 항원 항체 반응 후, 신속하게 스트렙트아비딘 고정화 자기 비즈 용액(Dynabeads MyOne Streptavidin T1, DYNAL Biotech ASA 제)을 미리 반응 버퍼로 3회 세정하고, 또한 2배 농축 상태로 조정한 것 5 ㎕(원래의 비즈 용액 10 ㎕ 분에 상당)를 상기 반응 용액에 첨가하여 1시간 추가로 반응하였다. 이 반응에 의해 비오틴화 항체를 통하여 상기 당단백질은 자기 비즈와 복합체를 형성한다. 이 복합체를 자기 비즈 회수용 마그넷에 흡착시킨 후에 용액을 폐기하였다. 회수된 복합체는 500 ㎕의 반응 버퍼에 의해 3회 세정된 후에, 10 ㎕의 용출 버퍼(0.2% SDS 함유 TBS)에 현탁되었다. 이 현탁 용액을 95℃에서 5분간 열처리함으로써 상기 당단백질을 자기 비즈로부터 해리 용출하고, 얻어진 용액을 용출액으로 하였다. 그 때, 열변성된 비오틴 항체도 혼입하기 때문에, 용출액에 상술한 수법으로 2배 농축 상태로 조정된 자기 비즈 용액을 10 ㎕(원래의 비즈 용액 20 ㎕ 분에 상당) 첨가하여 1시간 반응함으로써 비오틴화 항체를 흡착 제거하였다. 이것에 의해 얻어진 용액을 혈청 유래 상기 당단백질 용액으로 하고, 이후의 실험에 이용하였다.
2. 항체 오버레이·렉틴 어레이
상술에 의해 얻어진 상기 당단백질 용액을 적당량 취하고, 렉틴 어레이 반응 버퍼인 1% Triton X-100 함유 Phosphate-buffered saline(PBSTx)에 의해 60 ㎕로 조정하였다. 이 용액을 렉틴 마이크로어레이의 각 반응조(유리 1매 당 8개의 반응조가 형성되어 있음)에 첨가하고, 20℃에서 10시간 이상 반응하였다. 이 8개의 반응조로 이루어지는 렉틴 마이크로어레이 기반의 제작은 우치야마 등(Proteomics 8, 3042-3050 (2008))의 수법에 따랐다. 이것에 의해 상기 당단백질 상의 당쇄와 어레이 기판 상에 고정되어 있는 43종의 렉틴의 결합 반응이 평형 상태에 도달한다. 그 후, 미반응의 기판 상 렉틴에 검출용 항체 상의 당쇄가 결합하여 노이즈로서 생겨 버리는 것을 피하기 위하여, 인간 혈청 유래 IgG 용액(시그마사 제)을 2 ㎕ 첨가하고 30분 반응시켰다. 60 ㎕의 PBSTx로 각 반응조를 3회 세정한 후, 재차 인간 혈청 유래 IgG 용액을 2 ㎕ 첨가하여 약간 교반한 후에, 검출용의 상기 당단백질에 대한 항체(비오틴화물)를 100 ng 상당 첨가하고 20℃에서 1시간 반응시켰다. 항원 항체 반응 후, 60 ㎕의 PBSTx로 각 반응조를 3회 세정하고, 이어서 Cy3 표지 스트렙트아비딘 200 ng 상당이 함유되어 있는 PBSTx 용액을 첨가하고, 다시 30분, 20℃에서 반응하였다. 반응 후, 60 ㎕의 PBSTx로 각 반응조를 3회 세정한 후, 모리테크스사 제 어레이 스캐너 GlycoStation에 의해 어레이 스캔을 수행하였다.
얻어진 결과 중, 각 병태의 전형예를 AGP는 도 8에, Mac2BP는 도 9에 각각 나타낸다. 도 8은 간질환 병태 지표 마커 당단백질의 하나인 α1 산성 당단백질(AGP)에 대하여, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이에 의해 비교 당쇄 해석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 렉틴 마이크로어레이 상의 렉틴 배치를 상단 좌도에 나타낸다. 본 실험에 의해 유의한 신호가 얻어진 렉틴을 굵은 글씨로 나타낸다. 15종의 렉틴에 있어서 신호를 얻을 수 있었다. 간세포암, 간경변, 및 만성 간염 환자 혈청 및 정상인 혈청 유래 AGP의 전형적인 스캔 이미지를 상단우도에 나타낸다. 스캔 데이터로부터 어레이 해석 소프트를 이용하여 각 신호를 수치화하고, 15종의 렉틴에 대해 그래프로 나타낸 것을 하단에 나타낸다. 분명하게 간세포암, 간경변군과 간염, 정상인군 사이에 신호 패턴에 차이가 생기고 있는 것을 알 수 있다. 도 9는 간질환 병태 지표 마커 당단백질의 하나인 90K/Mac-2 Binding Protein(M2BP)에 대하여, 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이에 의해 비교 당쇄 해석을 수행한 결과이다. 렉틴 마이크로어레이 상의 렉틴 배치를 상단 좌도에 나타낸다. 본 실험에 의해 유의한 신호가 얻어진 렉틴을 굵은 글씨로 나타낸다. 17종의 렉틴에 있어서 신호를 얻을 수 있었다. 간세포암, 간경변 및 만성 간염 환자 혈청 및 정상인 혈청 유래 M2BP의 전형적인 스캔 이미지를 상단우도에 나타낸다. 스캔 데이터로부터 어레이 해석 소프트를 이용하여 각 신호를 수치화하고, 17종의 렉틴에 대해 그래프로 나타낸 것을 하단에 나타낸다. 병태의 중증도에 따라 신호 강도에 변화(증가 혹은 감소)가 생기고 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 2] 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질 AGP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의한 간섬유화 진전의 판별
실시예 1과 같이 당단백질의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의해 얻어진 렉틴 신호 정보로부터 통계 해석에 의해 취사선택하여 최적인 것을 이용함으로써 각 간질환 병태를 검출할 수 있는 가능성을 발견하였다.
이에 AGP를 표적 분자로 하여 이하의 순서로 실험을 실시하였다.
1. 간경변과 간염을 구별하는 렉틴의 압축
섬유화 진전에 수반하여 신호 변동을 나타내는 렉틴군을 압축하기 위하여, 우선 임상 진단이 끝난 환자 HCC, LC, CH 각 10 증례의 혈청을 이용하여 AGP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석을 실시하였다. 보다 객관적인 압축을 수행하기 위하여, HCC-LC 및 LC-CH 간에 Student T 검정을 수행하고, 위험도가 0.1% 이하의 값을 나타내는 렉틴을 유용 렉틴으로 하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 앞의 실험 결과(도 8)로부터 알 수 있는 바와 같이, AGP의 어레이 해석에 의해 15종의 렉틴에 있어서 신호를 얻고 있지만, 그 중 Student T 검정에 의해 위험도가 0.1% 이하의 유의차를 나타내는 렉틴은 LEL, AOL, AAL, MAL, STL 및 PHAE의 6종이었다. 또, 본 실험에 의해 가장 신호 변동하지 않고 재현성 높은 결과를 취득할 수 있었던 렉틴 DSA에 대해서는 취득된 데이터의 규격화에 유효성을 발견하고, 이후 스캔 후 수치화된 데이터는 모두 DSA 신호에 의해 규격화하는 것으로 하였다.
CV(평균) 총 강도
(0.53)		 DSA 표준화 후
(0.49)
T-test(P) T-test(P)
렉틴 HCC-CH LC-CH HCC-CH LC-CH
LEL 2.60E-10 7.30E-06 3.20E-16 1.70E-08
AOL 4.70E-08 7.40E-09 1.50E-07 1.10E-07
AAL 6.50E-08 1.20E-07 1.00E-07 1.20E-07
MAL 1.10E-07 1.60E-04 1.30E-07 1.70E-04
STL 4.30E-07 2.00E-04 5.30E-11 3.10E-07
PHAE 1.20E-04 8.80E-05 2.90E-05 2.40E-05
ABA 5.60E-01 2.00E-02 5.60E-01 2.40E-03
PHAL 1.90E-03 4.40E-02 1.40E-03 2.30E-02
SSA 2.80E-02 2.00E-02 3.50E-04 1.50E-06
RCA120 1.70E-01 3.20E-02 7.60E-02 3.70E-04
WGA 5.20E-02 2.50E-01 5.20E-03 3.50E-02
SNA 1.60E-01 1.30E-01 4.60E-02 3.30E-03
UDA 4.40E-01 8.70E-01 5.00E-01 6.80E-01
DSA 9.70E-01 7.10E-01 - -
TJAI 9.10E-01 8.50E-01 9.30E-01 6.70E-01
2. 섬유화 진전을 판별하는 렉틴의 압축
다음에, 간염 바이러스에 이환하여, 간생검에 의해 병리 진단되어 섬유화의 스테이징이 되어 있는 환자군 125 증례를 대상으로 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이를 실시예 1의 순서에 따라 수행하였다. 또한, 125 증례의 간장 섬유화 병기의 내역은 F0 및 F1이 33 증례, F2가 32 증례, F3이 31 증례, F4가 29 증례이다. 상술한 순서에 따라 통계학적으로 판별에 유용한 렉틴의 압축을 수행하였다. 그 결과, 상위 6종 렉틴의 결과를 표 4에 나타낸다. 먼저 얻어진 6개의 렉틴이 상위를 차지하고, 그 중에서도 LEL, AOL, MAL이 가장 판별에 유효한 것으로 선발되었기 때문에, 이 3종에 대해 보다 상세한 데이터 해석을 수행하였다.
N=125 T-test(P)
렉틴 F0-3 vs F4 F3 vs F4
LEL 1.74E-16 2.53E-08
AOL 8.37E-16 5.30E-05
AAL 1.98E-13 3.46E-04
MAL 2.83E-14 8.05E-06
STL 1.41E-06 5.79E-04
PHAE 1.18E-12 2.36E-04
도 10은 간장의 섬유화 진전과 AGP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의해 얻어진 렉틴 신호 강도의 변화와의 상관을 나타내는 도면이다. 각 신호는 DSA 렉틴의 신호에 의해 규격화되어 있고, 수치는 DSA 신호를 100%로 했을 때의 상대 신호 강도로서 나타나 있다. 도 10의 상단의 A에 있어서는 간생검 후의 병리 해석에 의해 섬유화의 스테이징(F)이 되어 있는 125 증례에 대해 렉틴 어레이 해석을 수행하고, 각 병기의 렉틴 신호의 분포를 상자 수염도에 의해 나타내고 있다. 상자의 상단 및 하단은 각각 75% 점, 25% 점을 나타내고, 수염의 상단 및 하단은 각각 95% 점, 5% 점을 나타낸다. 상자 중의 가로선은 중앙값을 나타내고, ×는 평균값을 나타낸다. 간경변(F4)과 만성 간염의 각 병기군(F0, 1, 2 및 3)의 유의차를 검정하기 위하여 Student-T 검정을 수행하고, 그 위험도가 P<0.0001인 것에 *를 부기하였다. 또 대조로서 일반적 생화학 검사에서 간장의 섬유화의 지표로서 이용되고 있는 혈소판 수치의 분포도 이와 같이 기재한다. 그 결과 AOL의 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도를 증가하며, 강도차로 만성 간염(F0-3)과 간경변(F4)을 충분히 분별할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 그것에 대해, MAL 및 LEL 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도가 감소하고 있다는 것을 알 수 있었다.
AOL, MAL 및 LEL의 신호 변동을 동일 환자에서 경시적으로 측정한 결과를 도 10의 하단 B에 나타낸다. 도 10의 하단 B에 있어서는 간경변 환자 및 간세포암 환자 각각 1 증례의 시리즈 검체(채취 시기가 다른 혈청) 중의 AGP에 대해서 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이 해석을 수행하고, DSA 신호에 의한 규격화 후의 AOL, MAL, LEL의 상대 신호값을 플로팅하고 있다. 시간축은 간경변 및 간세포암으로 확정 진단된 날을 0으로 하고 있다. AOL 신호는 경시적으로 증가하고, MAL의 신호는 감소하고 있으며, 이것이 간섬유화 진전을 반영시키고 있다. 그에 대해, LEL 신호나 간이 섬유화 마커로서 이용되고 있는 혈소판 수는 어느 특정 시기에 급격한 변동을 나타내고 있어 섬유화의 진전을 명확하게 표현하는 것은 아니었다.
이상의 결과로부터, AOL 및 MAL의 신호 변동을 단독 혹은 조합함으로써 간장의 섬유화의 진전 판별이 가능해진다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 3] 간질환 병태 지표 당쇄 마커 당단백질 AGP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의한 간경변의 검출
실시예 2의 결과로부터, 간섬유화의 진전을 기준으로 하여 각 렉틴 신호 단독 혹은 조합의 컷오프 값을 설정함으로써 간경변의 검출이 가능해진다고 생각하여 이하의 순서로 실험을 실시하였다.
1. 간경변을 검출하기 위한 렉틴 신호·컷오프 값의 설정
우선, 간염 바이러스 이환자 중에서 간경변 발증 환자를 검출하기 위하여, 각 렉틴의 컷오프 값을 설정하기로 하였다. 이 때문에 병리 진단이 끝난 환자 80 증례분(F1, F2, F3, F4 각 20 증례)을 대상으로 실시예 2에서 압축된 2종 렉틴의 신호를 DSA 렉틴 신호로 규격화한 데이터를 이용하여, 다른 (F1-F3)로부터 F4(간경변)를 구별하는 Receiver operating characteristic curve(ROC 곡선)를 작성하였다. 그 결과를 도 11의 왼쪽에 나타낸다. 도 11에는 AOL, MAL 신호를 단독으로 이용한 경우의 곡선 외에, 2개의 신호를 이용한 수식 (AOL의 상대 신호 강도)×1.5-(MAL의 상대 신호 강도)로부터 얻어지는 수치에 의한 곡선도 나타낸다. 곡선의 하부 영역의 면적을 나타내는 AUC(area under curve) 값을 구하여 각 수법의 진단력을 사정한다. 또 감도 100%, 특이도 100% 점으로부터 가장 가까운 거리에 있는 곡선상의 점, 바꾸어 말하면 Y=X의 직선에 평행한 선과 ROC 곡선의 접점을 「최적인 특이도 및 감도」로 하고, 그 주변에 컷오프 값을 설정하였다. 그러한 수치를 도 11의 오른쪽 표에 기재한다. 얻어진 컷오프 값을 이용하여 병리학적 진단 또는 화상·임상 진단에 의해 간염 및 간경변이라고 확정된 환자 45 증례 및 43 증례를 대상으로 블라인드 테스트를 실시하였다. 그 결과를 도 11의 오른쪽 표의 Validation set의 항에 기재한다. 간경변을 양성, 간염을 음성으로 하고, 각각의 검출수를 열거하였다. ROC 곡선에 의해 최적의 감도(Sensitivity) 및 특이도(Specificity)를 나타내는 점에서의 컷오프 값을 결정하였는데, AOL은 8%, MAL은 11.8%였다. 또, 콤비네이션의 계가 가장 위음성, 위양성 환자수가 적고, 정진율(正診率)(%)((총환자수-위양성, 위음성 환자수)/(총환자수)×100)이 높아졌다.
2. 간경변의 검출
임상 진단이 끝난 만성 간염 환자 45 증례 및 간경변 환자 43 증례에 대하여 실시예 2의 순서에 따라 AGP를 표적 분자로 한 항체 오버레이·렉틴 어레이를 실시하였다. 신호는 모두 DSA 렉틴의 신호를 100%로 하여 규격화하였다. 그 수치를 상술한 컷오프 값을 이용하여 양성, 음성의 판별을 함으로써 간경변 검출 검정을 시도하였다. 그 결과, AOL 신호를 이용한 경우, 검출력으로서 감도 86.1%, 특이도 91.1%, 정진율 88.6%가 되고, MAL 신호를 이용한 경우, 검출력으로서 감도 90.7%, 특이도 88.9%, 정진율 89.8%가 되었다. 모두 상당히 고도의 검출이 가능하고, 정진율이 85%를 넘고 있었다. 또한, 2개의 신호를 콤비네이션 한 식 ((AOL의 상대 신호 강도)×1.5-(MAL의 상대 신호 강도))를 이용하여 검출력을 조사해 보았는데, 감도 95.4%, 특이도 91.1%, 정진율은 93.2%라는 가장 확실도가 높은 간경변 검출 결과를 얻을 수 있었다. 특필해야 할 것은, 지금까지 공지가 되어 있는 AAL 렉틴이나 RCA 렉틴을 이용한 AGP의 질환 특이적 당쇄 변화를 검출하는 수법과 비교해 압도적으로 검출력이 높은 점이다. 이와 같은 결과는 이번 항체 오버레이·렉틴 어레이에 의한 압축 공정에서 AAL이나 RCA120이 AOL, MAL에 비해 떨어져 있었던 것과 일치한다(표 3 및 표 4를 참조).
[실시예 4] 간장의 섬유화 진전을 모니터링할 수 있는 마커를 이용한 인터페론의 치료 효과 판정
실시예 2의 결과에 의해 AOL 및 MAL의 신호 변동의 관찰에 의해 섬유화의 진전을 모니터링할 수 있음을 알 수 있었다. 그래서, AOL/DSA나 MAL/DSA를 섬유화 진전 파라미터로 이용하여 항바이러스제인 인터페론의 치료 효과를 판정할 수 있는지 여부를 시도하였다. C형 간염 환자에서 인터페론의 치료 효과가 인정된 지속성 바이러스 음성화(SVR)예 군과 치료 효과가 인정되지 않았던 바이러스학적 불응(NVR)예 군에 대해 이하의 실험을 수행하였다. 인터페론 치료 후, 경시적으로 혈액 채취된 환자의 혈청을 대상으로 실시예 1과 동일한 수법으로 혈청 중 AGP의 인리치 및 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이 해석을 수행하고, DSA 신호에 의한 규격화 후의 AOL, MAL의 상대 신호값을 산출하였다. 그 전형예 각각 2 증례 분의 각 신호의 경시적 변화를 도 12에 나타낸다. 시간축은 치료 직후의 채혈일을 0으로 하고, 상대 결합 신호는 치료 직후의 상대값을 0으로 하고 있다. SVR 증례에서는 MAL 신호는 경시적으로 증가하였지만, AOL의 신호는 감소 혹은 신호 검출할 수 없었다. 즉, 이들 증례는 섬유화가 완화되고 있는 경향이었다. 그에 대해 NVR 증례에서는 AOL 신호는 경시적으로 증가하고, MAL의 신호는 거의 변화가 없었다. 즉 이들 증례의 섬유화는 완화되지 않고 오히려 악화되고 있는(섬유화가 진전하고 있는) 경향이 관찰되었다. 이상에 의해, 인터페론 치료 후의 효과 판정을 혈액검사로 수행하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5] 1. 제1 신속 측정 방법(매뉴얼법)
1-1. 시약의 조제
R1 시약의 조제: 완충액 A(PBS-1% Triton X, pH 7.4) 중에 5 ㎍/㎖의 비오틴화 DSA(J-오일밀스사 제)를 첨가하여 R1 시약 1을 조제하였다. 완충액 A 중에 5 ㎍/㎖의 비오틴화 MAL(Vector사 제)를 첨가하여 R1 시약 2를 조제하였다. 완충액 A 중에 2.5 ㎍/㎖의 비오틴화 AOL을 첨가하여 R1 시약 3을 조제하였다. 또한, 비오틴화 AOL는 비오틴 표지 키트(DOJIDO사 제)를 이용하여 AOL(도쿄화성사 제)을 비오틴화한 것을 사용하였다.
R2 시약의 조제: 완충액 A 중에 스트렙트아비딘이 고정된 자성 입자(개수 평균 입경 2 ㎛)를 0.5 w/v%가 되도록 첨가하여 R2 시약을 조제하였다.
R3 시약의 조제: 0.025 U/㎖의 ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체, 0.1 M의 MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.5), 0.15 M의 염화나트륨, 1 mM의 염화마그네슘, 0.1 mM의 염화아연, 0.1 w/v%의 NaN3 및 0.5 w/v%의 카제인나트륨을 포함하는 용액을 조제하여 R3 시약 1로 하였다. 0.025 U/㎖의 ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체 대신에 0.5 U/㎖의 ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체를 이용하는 것 이외에는 R3 시약 1과 동일하게 하여 R3 시약 2를 조제하였다.
R4 시약의 조제: 0.1 M의 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP, pH 9.6), 1 mM의 염화마그네슘 및 0.1 w/v%의 NaN3을 포함하는 용액을 조제하여 R4 시약으로 하였다.
R5 시약의 조제: CDP-Star with Sapphirine-Ⅱ(ALP의 발광 기질, 어플라이드 바이오시스템즈사 제)를 R5 시약으로 하였다.
세정 시약의 조제: 20 mM의 트리스(pH 7.4), 0.1 w/v%의 Tween 20, 0.1 w/v%의 NaN3 및 0.8 w/v%의 염화나트륨을 포함하는 용액을 조제하여 세정 시약으로 하였다.
1-2. DSA의 희석 직선성의 확인
콘셀라(정상 인간 혈청, 닛스이 제약사 제) 중의 AGP를 실시예 1의 인리치와 동일하게 하고, 항-AGP 항체를 이용하여 완충액 B(TBS-0.5% Triton X-0.1% SDS)에 회수하여 시료로 하였다. 회수한 시료를 완충액 B로 1배, 1/2배, 1/4배, 1/8배, 1/16배로 각각 희석한 희석 시료를 조제하였다.
각 희석 시료 30 ㎕에 대하여, 110 ㎕의 R1 시약 1을 첨가하여 실온에서 2분간 반응 후, 30 ㎕의 R2 시약을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. DSA와 AGP의 복합체를 담지한 자성 입자를 집자(集磁)하여 B/F 분리를 수행한 후, 세정 시약으로 분리된 자성 입자를 세정하여 용액을 폐기하는 처리를 4회 수행하였다. 세정된 자성 입자에 100 ㎕의 R3 시약 1을 첨가하여 실온에서 20분간 반응을 수행하여 자성 입자에 담지된 복합체 중의 AGP와 ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체를 반응시켰다. ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체와 AGP와 DSA의 복합체를 담지한 자성 입자를 집자한 상태로 액체 성분을 제거(B/F 분리)한 후, 세정 시약으로 분리된 자성 입자를 세정하여 용액을 폐기하는 처리를 4회 수행하였다. 복합체 담지 자성 입자를 50 ㎕의 R4 시약에 분산시켜 100 ㎕의 R5 시약을 첨가하고, 발광 측정 장치를 이용하여 ALP에 의한 화학 발광 강도를 photo count 값으로서 측정하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이 DSA 측정계에 대해서는 R2=0.99로 양호한 직선성을 나타내었다.
1-3. MAL의 희석 직선성의 확인
「DSA의 희석 직선성의 확인」에 있어서, R1 시약 1에 대신에 R1 시약 2를 사용하고, R3 시약 1에 대신에 R3 시약 2를 사용하는 것 이외에는 동일하게 하여 MAL 측정계에서의 희석 직선성의 확인 실험을 수행하고, 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타낸 바와 같이 MAL 측정계에 대해서는 R2=0.99로 양호한 직선성을 나타내었다.
1-4. AOL의 희석 직선성의 확인
「DSA의 희석 직선성의 확인」에 있어서, 콘셀라 대신에 HCV 양성 혈장 2(Millenium Biotech사 제)를 사용하고, R1 시약 1에 대신에 R1 시약 3을 사용하는 것 이외에는 동일하게 하여 AOL 측정계에서의 희석 직선성의 확인 실험을 수행하고, 결과를 도 3에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이 AOL 측정계에 대해서는 R2=0.98로 양호한 직선성을 나타내었다.
1-5. 각종 시판 검체에 대한 DSA, MAL 및 AOL 측정
콘셀라(정상 인간 혈청, 닛스이제약사 제), 정상 인간 혈청(TRINA사 제), HCV 양성 혈장 1 및 2(Millenium Biotech사 제)의 각각에 대해 실시예 1의 인리치와 동일하게 하여 항-AGP 항체를 이용하여 AGP를 분리하고, 완충액(TBS-0.5% Triton X-0.1% SDS)에 회수하여 측정 시료로 하였다. 또, 완충액만을 블랭크 측정 시료(NC)로 하였다.
각 측정 시료 30 ㎕에 대하여, 110 ㎕의 R1 시약 1을 첨가하여 실온에서 2분간 반응 후, 30 ㎕의 R2 시약을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. DSA와 AGP의 복합체를 담지한 자성 입자를 집자하여 B/F 분리를 수행한 후, 세정 시약으로 분리된 자성 입자를 세정하여 용액을 폐기하는 처리를 4회 수행하였다. 세정된 자성 입자에 100 ㎕의 R3 시약 1을 첨가하여 실온에서 20분간 반응을 수행하고, 자성 입자에 담지된 복합체 중의 AGP와 ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체를 반응시켰다. ALP 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체와 AGP와 DSA의 복합체를 담지한 자성 입자를 집자하여 B/F 분리를 수행한 후, 세정 시약으로 분리된 자성 입자를 세정하여 용액을 폐기하는 처리를 4회 수행하였다. 복합체 담지 자성 입자를 50 ㎕의 R4 시약에 분산시켜 100 ㎕의 R5 시약을 첨가하고, 발광 측정 장치를 이용하여 DSA 측정계에서의 화학 발광 강도를 photo count 값으로서 측정하였다. 측정에 필요로 한 시간은 65분이었다. 측정 결과를 표 5에 나타낸다.
또, DSA 측정계에 있어서, R1 시약 1에 대신에 R1 시약 2를 사용하고, R3 시약 1에 대신에 R3 시약 3을 사용하는 것 이외에는 동일하게 하여 MAL 측정계에서의 화학 발광을 측정하고, 결과를 표 5에 나타내었다. 또, DSA 측정계에 있어서, R1 시약 1을 R1 시약 3에 대신하는 것 이외에는 동일하게 하여 AOL 측정계에서의 화학 발광을 측정하고, 결과를 표 5에 나타내었다. 또, MAL 및 AOL에 의한 측정 결과를 DSA에 의한 측정 결과로 규격화한 값을 표 5에 나타냄과 동시에 도 16 및 도 17에 나타내었다.
DSA MAL AOL MAL/DSA AOL/DSA
NC 134464 4591 39520
콘셀라 947041 2566153 122283 315.24 10.19
정상 인간 혈청 920232 2057193 145020 261.22 13.43
HCV-1 1154871 3063570 181898 299.78 13.95
HCV-2 848290 1093355 404969 152.53 51.20
1-6. 각종 시판 검체에 대한 렉틴 어레이법에 의한 측정
상기 1-5의 각 측정 시료에 대하여, 실시예 1에서 이용한 렉틴 어레이를 이용하여 항체 오버레이법에 의한 측정을 수행하였다. 렉틴 어레이법에 의한 측정 시간은 약 18시간이었다. 결과를 표 6에 나타냄과 동시에 도 18 및 도 19에 나타내었다.
렉틴 어레이의 측정 결과
MAL/DSA AOL/DSA
콘셀라 15.4 2.8
정상 인간 혈청 11 4.7
HCV-1 15.2 4
HCV-2 5.4 15.4
DSA로 규격화한 MAL의 측정 결과에 대하여, 도 16에 나타낸 본 실시형태의 제1 측정법에 의한 측정 결과가 도 18에 나타낸 렉틴 어레이법에 의한 측정 결과와 양호한 상관을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 또, DSA로 규격화한 AOL의 측정 결과에 대하여, 도 17에 나타낸 제1 신속 측정법에 의한 측정 결과가 도 19에 나타낸 렉틴 어레이법에 의한 측정 결과와 동일한 패턴을 나타내고, 양호한 상관을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
2. 제2 신속 측정 방법(자동 측정법)
2-1. 시약의 조제
R1 시약의 조제: 완충액 A(PBS-1% Triton X, pH 7.4)를 R1 시약으로 하였다.
R2 시약의 조제: 완충액 A 중에 스트렙트아비딘이 고정된 자성 입자(개수 평균 입경 2 ㎛)를 0.5 w/v%가 되도록 첨가하고, 다시 2.5 ㎍/㎖의 비오틴화 DSA(J-오일 밀스사 제)를 첨가하여 실온에서 30분 교반하였다. 교반 후 집자하여 자성 입자를 침강시켜 용액 성분을 폐기하였다. 여기에 완충액 A를 첨가하여 교반 후, 집자하여 자성 입자를 침강시켜 용액 성분을 폐기하는 조작을 3회 반복 수행하였다. 이것에 자성 입자 농도가 0.5 w/v%가 되도록 완충액 A를 첨가하여 DSA를 담지한 자성 입자를 포함하는 R2 시약 1로 하였다. 2.5 ㎍/㎖의 비오틴화 DSA(J-오일 밀스사 제) 대신에 25 ㎍/㎖의 비오틴화 MAL(Vector사 제)를 이용하는 것 이외에는 R2 시약 1과 동일하게 하여 MAL을 담지한 자성 입자를 포함하는 R2 시약 2를 조제하였다. 2.5 ㎍/㎖의 비오틴화 DSA(J-오일 밀스사 제) 대신에 25 ㎍/㎖의 비오틴화 AOL을 이용하는 것 이외에는 R2 시약 1과 동일하게 하여 AOL을 담지한 자성 입자를 포함하는 R2 시약 3을 조제하였다. 또한, 비오틴화 AOL은 비오틴 표지 키트(DOJIDO사 제)를 이용하여 AOL(도쿄 화성사 제)을 비오틴화한 것을 사용하였다.
R3 시약의 조제: 0.1 U/㎖의 ALP(Recombinant AP, EIA Drade, CR 03535452) 표지 마우스 항-AGP 모노클로날 항체-Fab', 0.1 M의 MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.5), 0.15 M의 염화나트륨, 1 mM의 염화마그네슘, 0.1 mM의 염화아연, 0.1 w/v%의 NaN3 및 0.25 w/v%의 카제인산나트륨을 포함하는 용액을 조제하여 R3 시약 1로 하였다. 0.25 w/v%의 카제인산나트륨 대신에 0.1 w/v%의 BSA를 이용하는 것 이외에는 R3 시약 1과 동일하게 하여 R3 시약 2를 조제하였다.
또한, 상기의 제1 신속 측정 방법(매뉴얼법)에 있어서는 탈글리코실화되어 있지 않은 ALP를 이용하였지만, 제2 신속 측정 방법에서는 탈글리코실화된 ALP를 사용하였다.
R4 시약의 조제: 0.1 M의 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP, pH 9.6), 1 mM의 염화마그네슘 및 0.1 w/v%의 NaN3을 포함하는 용액을 조제하여 R4 시약으로 하였다.
R5 시약의 조제: CDP-Star with Sapphirine-Ⅱ(ALP의 발광 기질, 어플라이드 바이오시스템즈사 제)를 R5 시약으로 하였다.
세정 시약의 조제: 20 mM의 트리스(pH 7.4), 0.1 w/v%의 Tween 20, 0.1 w/v%의 NaN3 및 0.8 w/v%의 염화나트륨을 포함하는 용액을 조제하여 세정 시약으로 하였다.
2-2. DSA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인
콘셀라(정상 인간 혈청, 닛스이 제약사 제) 중의 AGP를 실시예 1의 인리치와 동일하게 하고, 항-AGP 항체를 이용하여 완충액 B(TBS-0.5% Triton X-0.1% SDS)에 회수하여 시료로 하였다. 회수한 시료를 완충액 B로 1배, 1/2배, 1/4배, 1/8배, 1/16배로 각각 희석한 희석 시료를 조제하였다.
전자동 면역 측정 장치 HISCL2000i(시스멕스사 제)의 동작 설정을 하기의 조건으로 변경하고, 각 희석 시료에 대해 화학 발광(photo count 값)을 측정하였다.
각 희석 시료 30 ㎕를 용기에 분주하여 42℃에서 2.25분간 인큐베이트한 후, 30 ㎕의 R2 시약 1을 분주하여 42℃에서 2.5분간 반응시켰다. 또한, 100 ㎕의 R3 시약 1을 분주하여 42℃에서 2.75분간 반응시켰다. 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하였다. 세정 시약을 분주하여 세정 시약에 자성 입자를 분산 세정하고, 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하는 처리를 3회 반복 실행하였다. 50 ㎕의 R4 시약을 분주하고, 이어서 100 ㎕의 R5 시약을 분주하여 화학 발광을 측정하였다. 상기의 측정을 3회 수행하고, 그 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20에 나타낸 바와 같이 DSA 측정계에 대해서는 R2=0.98로 양호한 직선성을 나타내었다.
2-3. MAL을 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인
「DSA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」에 있어서, R2 시약 1에 대신에 R2 시약 2를 사용하고, R3 시약 1에 대신에 R3 시약 2를 사용하는 것 이외에는 동일하게 하여 MAL 측정계에서의 희석 직선성의 확인 실험을 수행하고, 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에 나타낸 바와 같이, MAL 측정계에 대해서는 R2=0.99로 양호한 직선성을 나타내었다.
2-4. AOL을 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인
「DSA의 희석 직선성의 확인」에 있어서, 콘셀라 대신에 HCV 양성 혈장 2(Millenium Biotech사 제)를 사용하고, R2 시약 1 대신에 R2 시약 3을 사용하는 것 이외에는 동일하게 하여 AOL 측정계에서의 희석 직선성의 확인 실험을 수행하고, 결과를 도 22에 나타내었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, AOL 측정계에 대해서는 R2=0.99로 양호한 직선성을 나타내었다.
2-5. 각종 시판 검체에 대한 DSA, MAL 및 AOL을 이용하는 측정
콘셀라(정상 인간 혈청, 닛스이 제약사 제), 정상 인간 혈청(TRINA사 제), HCV 양성 혈장 1 및 2(Millenium Biotech사 제)의 각각에 대하여, 항-AGP 항체를 이용한 면역 침강법에 의해 AGP를 분리하고, 완충액 B(TBS-0.5% Triton X-0.1% SDS)에 회수하여 측정 시료로 하였다. 또, 완충액 B만을 블랭크 측정 시료로 하였다.
「DSA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」, 「MAL을 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」 및 「AOL을 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」과 동일한 조건에서 전자동 면역 측정 장치 HISCL2000i를 이용하여 각 측정 시료의 측정을 수행하였다. 각 측정에 필요로 한 시간은 17분이었다. 결과를 표 7, 도 23 및 도 24에 나타낸다.
DSA MAL AOL MAL/DSA AOL/DSA
콘셀라 13757054 1377260 132648 10.0 1.0
정상 인간 혈청 17770250 1549266 417612.7 8.7 2.4
HCV-1 19885106 1877027 185538 9.4 0.9
HCV-2 15225585 825426.3 1776264 5.4 11.7
DSA를 이용한 측정 결과로 규격화한 MAL을 이용한 측정 결과에 대하여, 도 23에 나타낸 제2 신속 측정법에 의한 측정 결과가 도 18에 나타낸 렉틴 어레이법에 의한 측정 결과와 양호한 상관을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또, DSA를 이용한 측정 결과로 규격화한 AOL을 이용한 측정 결과에 대하여, 도 24에 나타낸 제2 신속 측정법에 의한 측정 결과가 도 19에 나타낸 렉틴 어레이법에 의한 측정 결과와 동일한 패턴을 나타내고, 양호한 상관을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
2-6. 임상 검체에 대한 DSA, MAL 및 AOL을 이용하는 측정
섬유화 병기 F1의 환자 혈청 1 및 2, 섬유화 병기 F2의 환자 혈청 3 및 4, 섬유화 병기 F3의 환자 혈청 5 및 6, 섬유화 병기 F4의 환자 혈청 7 및 8의 각각에 대하여, 실시예 1의 인리치와 동일하게 하여 항-AGP 항체를 이용하여 AGP를 분리하고, 완충액 B(TBS-0.5% Triton X-0.1% SDS)에 회수하여 측정 시료로 하였다. 또, 완충액 B만을 블랭크 측정 시료로 하였다.
「DSA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」, 「MAL을 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」 및 「AOL의 희석 직선성의 확인」과 동일한 조건으로 전자동 면역 측정 장치 HISCL2000i를 이용하여 각 측정 시료의 측정을 수행하였다. 각 측정에 필요로 한 시간은 17분이었다. 결과를 표 8, 도 25 및 도 26에 나타낸다.
검체 1 2 3 4 5 6 7 8
MAL/DSA 12.8 11.5 11.5 10.7 9.4 8.7 5.5 1.1
AOL/DSA 0.3 0.7 0.7 1.2 3.2 3.9 20.2 117.0
2-7. 임상 검체에 대한 렉틴 어레이법에 의한 측정
상기 2-6의 각 측정 시료에 대하여, 실시예 1에서 이용한 렉틴 어레이를 이용하여 항체 오버레이법에 의한 측정을 수행하였다. 렉틴 어레이법에 의한 측정 시간은 약 18시간이었다. 결과를 표 9, 도 27 및 도 28에 나타내었다.
검체 1 2 3 4 5 6 7 8
MAL/DSA 27.3 24.3 25.6 24.0 18.1 18.9 8.5 1.3
AOL/DSA 0.5 3.0 4.0 5.0 11.8 13.1 37.1 73.6
도 25∼도 28에 나타난 결과로부터 제2 신속 측정법이 임상 검체에 대해서도 렉틴 어레이법과 동일한 패턴을 나타내고, 양호한 상관을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 6] 제2 신속 측정법의 확인(validation)
1. HCV 감염 환자 125 증례를 이용한 해석
실시예 5에 의해 제2 신속 측정법은 렉틴 어레이와 동일한 패턴을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 보다 많은 증례로 실증하기 위하여, 실시예 2에서 사용한 간염 바이러스에 이환하고, 간생검에 의해 병리 진단되어 섬유화의 스테이징이 되어 있는 환자군 125 증례를 대상으로 제2 신속 측정법을 실시예 5의 2-6의 순서에 따라 수행하였다. 또한, 125 증례의 간장 섬유화 병기의 내역은 F0 및 F1이 33 증례, F2가 32 증례, F3이 31 증례, F4가 29 증례이다.
도 29는 간장의 섬유화 진전과 AGP의 제2 신속 측정법에 의해 얻어진 렉틴 신호 강도의 변화의 상관을 나타내는 도면이다. 각 신호는 DSA 렉틴의 신호에 의해 규격화되어 있고, 수치는 DSA 신호를 100%로 했을 때의 상대 신호 강도로서 나타나 있다. 도 29의 왼쪽에 있어서는, 간생검 후의 병리 해석에 의해 섬유화의 스테이징(F)이 되어 있는 125 증례에 대해 제2 신속 측정법을 수행하고, 각 병기의 렉틴 신호의 분포를 상자 수염도에 의해 나타내고 있다. 제2 신속 측정법에 의해 얻어진 3종 렉틴 값으로부터 MAL/DSA 값을 구하여 상자 수염도로 한 것이 좌상단이며, AOL/DSA 값을 구하여 상자 수염도로 한 것이 좌하단이다. 상자의 상단 및 하단은 각각 75% 점, 25% 점을 나타내고, 수염의 상단 및 하단은 각각 95% 점, 5% 점을 나타낸다. 상자 중의 가로선은 중앙값을 나타내고, ×는 평균값을 나타낸다. 그 결과는 모두 렉틴 어레이의 결과와 매우 닮아 있고, AOL의 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도를 증가하여, 강도차로 만성 간염(F0-3)과 간경변(F4)을 충분히 분별할 수 있음을 알 수 있었다. 그에 대해, MAL 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도가 감소하고 있음을 알 수 있었다. 렉틴 어레이의 결과와 제2 신속 측정법의 결과 사이에 상관성이 있음을 지지하기 위하여, 양자로부터 얻어진 수치를 2차원 플롯하였다. 그 그래프를 도 29의 오른쪽에 나타낸다. 이 그래프에 의해 렉틴 어레이의 결과와 제2 신속 측정법의 결과 사이에 강한 상관이 있는 것이 판명되었다.
2. 간경변의 검출
실시예 3에 나타낸 렉틴 어레이에 의한 간경변의 검출과 동일한 순서로 제2 신속 측정법에 의해 간경변의 검출을 시도하였다. 상술한 병리 진단이 끝난 환자 125 증례분을 대상으로 2종 렉틴의 신호를 DSA 렉틴 신호로 규격화한 데이터를 이용하여 다른 (F1-F3)로부터 F4(간경변)를 구별하는 ROC 곡선을 작성하고, 감도 100%, 특이도 100% 점으로부터 가장 가까운 거리에 있는 곡선상의 점, 바꾸어 말하면 Y=X의 직선에 평행한 선과 ROC 곡선의 접점을 「최적의 특이도 및 감도」로 하고, 그 주변에 컷오프 값을 설정하였다. 얻어진 개개의 렉틴에 대한 컷오프 값으로부터 간경변 검출에 최적인 콤비네이션식 (AOL/DSA×1.8-MAL/DSA)을 구하고, 그것에 의해 병리학적 진단 또는 화상·임상 진단에 의해 간염 및 간경변으로 확정된 환자 45 증례 및 43 증례를 대상으로 블라인드 테스트를 실시하였다.
그 결과, 콤비네이션식(AOL/DSA×1.8-MAL/DSA)을 이용하여 검출력을 조사해 보았는데, 감도 88.3%, 특이도 91.1%, 정진율은 89.8% 결과를 얻을 수 있었다.
이어서, 본 수식에 의한 위양성의 출현 빈도를 검토하기 위하여, 정상인 100인분의 혈청에 대해서도 제2 신속 측정법에 의한 해석을 수행하였다. 수식을 이용하여 간경변 판정을 하였는데, 도 30에 나타내는 바와 같이 위양성률은 5%이고, 렉틴 어레이의 결과와 위양성 검체가 일치하였다.
[실시예 7] 간질환 병태 지표 당쇄 마커 후보 당단백질 M2BP의 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의한 간섬유화 진전의 판별
실시예 2와 같이, M2BP에 있어서도 항체 오버레이·렉틴 어레이 해석에 의해 얻어진 렉틴 신호 정보로부터 각 간질환 병태를 검출할 수 있을 가능성이 발견되었다. 이에 간섬유화와의 상관을 검토하기 위한 실험을 실시하였다. AGP의 실험에서 이용한 간염 바이러스에 이환하고, 간생검에 의해 병리 진단되어 섬유화의 스테이징이 되어 있는 환자군 125 증례를 대상으로 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이를 실시예 2의 순서에 따라 수행하였다. 결합 신호가 생긴 17종의 렉틴 중, 유의차 검정에 의해 섬유화의 진전에 수반하는 신호 변화가 확인된 6개의 렉틴에 대하여 섬유화 진전과의 상관을 나타내는 그래프를 작성하였다. 그것을 도 31에 나타낸다. 각 병기의 렉틴 신호의 분포를 상자 수염도에 의해 나타내었다. 상자의 상단 및 하단은 각각 75% 점, 25% 점을 나타내고, 수염의 상단 및 하단은 각각 95% 점, 5% 점을 나타낸다. 상자 중의 가로선은 중앙값을 나타내고, ×는 평균값을 나타낸다. 또한, 각 그래프의 세로축은 DSA의 신호를 100%로 했을 때의 상대값으로 되어 있다. RCA120, AAL, TJAII, WFA, BPL의 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도를 증가하는 한편, LEL 신호는 섬유화의 진전에 수반하여 강도가 감소하고 있다는 것을 알 수 있었다. 이 중, 섬유화의 진전을 모니터링하는 관점에 있어서는 RCA120나 AAL가 적합하다고 생각된다. 또, TJAII, WFA, BPL에 관해서는 간경변(F4)이 되어 처음으로 신호가 생기고 있는 타입이다. 한편, F4에서의 신호가 편차가 크기 때문에, 이것은 발암 고위험군을 특정하는데 유효한 마커로 될 가능성이 시사되었다.
[실시예 8] M2BP의 당쇄 변화 검출에 의한 간암 발암 고위험군 특정
1. 간암 발암 고위험군 특정에 적합한 렉틴의 선발
실시예 7에 있어서, 간섬유화에 수반하여 신호 강도가 증가하는 렉틴군이 발견되었다. 그들 렉틴군 중 발암 고위험군을 특정할 수 있는 것을 선발하기 위하여, 간세포암 환자 수술 전 수술 후 혈청 7 증례를 대상으로 한, M2BP의 항체 오버레이·렉틴 마이크로어레이 해석을 수행하였다. 그 실험 순서는 실시예 1을 따랐다. 또, 전자동 형광 면역 측정 장치(μTAS Wako i30; 와코 순약공업주식회사 제) 및 전용 시약에 의해 공지인 간세포암 마커 AFP 혈중량 및 양성 질환·간세포암 감별 마커 AFP-L3%의 측정도 수행하였다. 그 결과의 일부의 렉틴 신호 패턴을 도 32에 나타낸다. AFP-L3%를 포함한 모든 파라미터가 7 증례 모두에서 반드시 수술 후의 신호 감소를 나타낸다는 것은 아니었다. 이것은 모두 암 검출 마커는 아닌 것을 의미하고 있다. 본 실험에서는 간세포암 발암의 고위험군 특정 마커 후보를 선발하는 것이 목적이다. 그 점에 있어서는 AFP-L3%에 패턴이 유사한 것이 바람직하다. 실시예 7에서 예상한 바와 같이 WFA, BPL 렉틴이 AFP-L3%의 패턴에 유사하였다. 한편, BPL에 비해 WFA는 신호 강도가 보다 강하고 안정적이었기 때문에, WFA를 유력 렉틴으로서 선발하였다.
2. 렉틴-항체 샌드위치 ELISA법에 의한 WFA 결합성 M2BP의 검출
WFA 결합성 M2BP를 간암 발암 고위험군 특정 마커로 하고, 상기 바이오 마커를 검출하는 바람직한 형태로서는 혈청에 포함되는 바이오 마커를 임상에서 허용 되는 성능으로, 또한 임상에서 적용 가능한 간편한 수단에 의해 검출 및 판별하는 방법을 고려할 수 있다. 이하에는 그 예로서 항-M2BP 항체 오버레이-WFA 웰 플레이트(도 33을 참조)를 이용한 샌드위치 검출 분석의 결과를 나타낸다. 또한, 본 수법에 있어서 WFA 웰 플레이트에는 혈청을 직접 첨가하는 것이 가능하다. 그 근거로는 혈청 중에 포함되는 당단백질에서 WFA에 결합할 수 있는 분자는 매우 적고, 발암 고위험군 환자에 있어서는 M2BP가 가장 혈중 농도가 높은 분자의 하나이기 때문이다.
(실험 방법)
마이크로타이터 플레이트(그라이너사 제 96-웰 평저 스트렙트아비딘 코트 플레이트)에 PBS 완충액에 용해한 비오틴화 WFA(Vector사 제, 5 ㎍/㎖)를 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고 2시간 실온에서 보온하여 지지체에 WFA를 고상화하였다. 미결합 WFA를 세정액인 0.1% Tween 20 함유 PBS(300 ㎕)로 2회씩 세정하여 WFA 고상화 웰 플레이트를 완성시켰다.
각 샘플 1 ㎕를 상기 세정액 50 ㎕로 희석하고, 1에서 제작한 WFA 고상화 웰 플레이트에 첨가한 후, 2시간 실온에서 결합 반응하였다. 반응 후, 각 웰은 상기 세정액 300 ㎕로 5회 세정하여 미결합 단백질을 제거하였다. 여기에 미리 1.0 ㎍/㎖로 세정액으로 조정한 검출제(염소 항-M2BP 폴리클로날 항체 용액; R&D Systems사 제)를 1 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 실온에서 2시간 항원 항체 반응하였다.
미결합 항체를 제거하기 위하여 세정액 300 ㎕로 세정한 후, 세정액으로 10,000배 희석한 항 염소 IgG 항체-HRP 용액(Jackson immuno Research사 제)을 1 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 실온에서 1시간 보온하였다. 각 웰을 300 ㎕의 세정액으로 5회 세정한 후, 발색 시약인 ULTRA-TMB 용액(Thermo사 제)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 10분간 발색 반응하였다. 1 M의 H2SO4 용액을 1 웰 당 100 ㎕ 첨가하여 반응을 정지하고, 플레이트 리더에 의해 450 ㎚에서 흡광도 측정하였다. 얻어진 신호는 정상인 혈청을 음성대조군(N)로 하고, S/N 비로서 수치화하여, 이후의 해석에 이용하였다.
(결과)
우선, 상술한 간세포암 환자 수술 전 수술 후 혈청 7 증례를 대상으로 분석을 하였다. 그 결과, 도 32의 결과에 매우 닯은 신호 패턴을 얻을 수 있었다(도 34 상단). 이들 증례 중 수술 후에 계속적으로 채혈을 실시하고 있던 3 증례에 대하여 WFA 결합성 M2BP 양의 측정을 시도하였다. 또한, 환자 A 및 B는 수술 후 재발 증례이며, 환자 E는 재발 없음 증례이다. 재발한 포인트를 화살표로 나타낸다. 그 결과를 도 34 하단에 나타낸다. 가로축은 시술일을 0으로 하고, 경과 월수를 나타낸다. 또, 세로축은 정상인 혈청을 음성대조군(N)으로 하고, S/N 비로 나타낸다. 환자 A는 수술 후에도 측정값은 S/N=2.5 부근에서 추이하고, 재발 포인트 이후에 값이 상승하고 있다. 환자 B는 수술 전의 측정값이 매우 높고, 수술 후 그 값은 감소하지만 S/N=2.5 부근에서 정체하였다. 한편, 환자 E는 수술 전 수술 후에 S/N=2.0으로 가장 낮은 값을 나타내고, 또한 그 수치는 서서히 하강하여 갔다. 이상의 결과로부터, 수술 후 S/N>2.5에서 정체한 환자는 재발 위험이 높고, 또한 재발 후 값이 상승하는 한편으로, 수술 후 신속하게 감소하여 S/N=2.0을 크게 밑도는 환자는 재발하지 않을 가능성이 높다는 것이 발견되었다. 이상에 의해, WFA 결합성 M2BP는 간암 발암 고위험군 특정 마커로서 유용하고, 그것을 검출하는 간이 측정계로서 항-M2BP 항체 오버레이-WFA 웰 플레이트를 개발할 수 있었다.
[실시예 9] ELISA법에 의한 WFA 결합성 M2BP 검출에서의 검체 가열 처리의 영향의 검증
ELISA법에 의한 WFA 결합성 M2BP 검출에 있어서, 검체 가열 처리의 유무가 검출 감도에 미치는 영향을 확인하였다.
인간 간암 유래 세포주(HepG2 배양 상청)를 0.2% SDS 함유 PBS 완충액으로 10배 희석하고, 10분간 95℃에서 가열 처리하였다.
샘플로서 HepG2 배양 상청(미처리)과 HepG2 배양 상청(가열 처리)을 1 웰 당 단백량이 하기 표 10이 되도록 이용하는 것 이외에는 실시예 8의 2와 동일한 방법으로 WFA에 결합하는 M2BP의 측정을 수행하였다. 플레이트 리더에 의해 측정된 흡광도를 표 10 및 도 35에 나타낸다.
ng 총 단백질/웰 미처리 가열 처리
5,000 2.073 0.365
3,000 1.861 0.275
1,000 1.372 0.143
500 1.102 0.097
100 0.398 0.032
50 0.181 0.03
10 0.047 0.05
표 10 및 도 35의 결과로부터 ELISA법에 의한 WFA 결합성 M2BP의 측정에 있어서는 가열 처리가 수행되지 않은 혈청을 측정 샘플로서 이용함으로써 측정 감도가 향상되는 것이 판명되었다.
[실시예 10] 제2 신속 측정법에 의한 M2BP의 측정
1. 시약의 조제
R1 시약의 조제: 10 mM의 HEPES(pH 7.5), 150 mM의 NaCl, 0.01 mM의 MnCl2, 0.1 mM의 CaCl2, 0.08 w/v%의 NaN3을 포함하는 용액(완충액 C)을 조제하여 R1 시약으로 하였다.
R2 시약의 조제: 완충액 C에 시판되는 스트렙트아비딘이 고정된 자성 입자(개수 평균 입경 2 ㎛)(이하, '스트렙트아비딘 감작 자성 입자'라 함)를 0.5 w/v%의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 여기에 비오틴화한 렉틴 용액(WFA)을 첨가하였다. 이 혼합액을 실온에서 30분 교반하였다. 교반 후, 자석으로 집자하여 자성 입자를 침강시켜 용액 성분을 폐기하였다. 완충액 C로 3회 세정 후, 완충액 D(10 mM의 HEPES(pH 7.5), 150 mM의 NaCl, 0.01 mM의 MnCl2, 0.1 mM의 CaCl2, 0.1% W/V의 BSA, 0.08 w/v%의 NaN3을 포함하는 용액)를 자성 입자 농도가 0.5 w/v%가 되도록 첨가하였다.
R3 시약의 조제: 0.1 U/㎖의 Recombinant ALP 표지 마우스 항 M2BP 모노클로날 항체, 0.1 M의 MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.5), 0.15 M의 NaCl, 1 mM의 MgCl2 , 0.1 mM의 ZnCl2, 0.1 w/v%의 NaN3을 포함하는 용액을 조제해 R3 시약으로 하였다.
R4 시약, R5 시약 및 세정 시약에 대해서는 실시예 5의 제2 신속 측정법에서 이용한 R4 시약, R5 시약 및 세정 시약을 사용하였다.
2. WFA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인
인간 간암 유래 세포주 배양 상청(HepG2 배양 상청) 100 ㎍/㎖를 완충액(PBS)으로 10배, 100배, 1,000배 및 10,000배로 희석한 희석 시료를 조제하였다. 또, Recombinant Human Galectin-3BP/MAC-2 BP(R&D SYSTEMS제) 5 ㎍/㎖를 완충액(PBS)으로 2배, 4배, 8배, 16배, 32배 및 64배로 희석한 희석 시료를 조제하였다.
전자동 면역 측정 장치 HISCL2000i(시스멕스사 제)의 동작 설정을 하기의 조건으로 변경하고, 각 희석 시료에 대해 화학 발광 강도(photo count 값)를 측정하였다.
R1 시약 30 ㎕와 각 희석 시료 10 ㎕를 용기에 분주하고, 42℃에서 2.25분간 인큐베이트한 후, 30 ㎕의 R2 시약을 분주하고, 42℃에서 1.5분간 반응시켰다. 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하였다. 세정 시약을 분주하여 세정 시약에 자성 입자를 분산 세정하고, 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하는 처리를 3회 반복 실행하였다. 100 ㎕의 R3 시약을 분주하고, 42℃에서 2.75분간 반응시켰다. 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하였다. 세정 시약을 분주하여 세정 시약에 자성 입자를 분산 세정하고, 자기 분리에 의해 자성 입자를 집자하여 용액을 흡인 폐기하는 처리를 3회 반복 실행하였다. 50 ㎕의 R4 시약을 분주하고, 이어서 100 ㎕의 R5 시약을 분주하여 화학 발광 강도를 측정하였다. HepG2 배양 세포 상청의 측정 결과를 표 11 및 도 36에, Recombinant Human Galectin-3BP/MAC-2 BP의 측정 결과를 표 12 및 도 37에 나타낸다. 이들 측정 결과에 나타낸 바와 같이 WFA 측정계에 대해 양호한 희석 직선성을 나타내었다.
㎍/테스트(10 ㎕) 발광 강도(count) S/N(대 희석액)
희석액(PBS) 2,987 1.00
0.0001 3,043 1.02
0.001 4,850 1.62
0.01 31,671 10.60
0.1 332,706 111.38
㎍/테스트(10 ㎕) 발광 강도(count) S/N(대 희석액)
희석액(PBS) 2,987 1.00
0.3906 14,456 4.84
0.7813 26,640 8.92
1.5625 55,721 18.65
3.125 123,939 41.49
6.25 313,747 105.04
12.5 663,628 222.17
25 1,822,168 610.03
3. 임상 검체에 대한 측정
정상인 혈청, HBV 양성 간세포암 환자 혈청 및 HCV 양성 간세포암 환자 혈청을 「2. WFA를 이용하는 측정계의 희석 직선성의 확인」과 동일한 조건으로 전자동 면역 측정 장치 HISCL2000i에 의해 측정하였다. 각 검체의 측정에 필요로 한 시간은 17분이었다. 결과를 표 13에 나타낸다.
형광 강도(count) S/N(대 정상인 혈청)
정상인 혈청 654,663 1
HBV 양성 간암 환자 혈청 11,317,040 17.3
HCB 양성 간암 환자 혈청 17,124,911 26.2
표 13의 결과로부터, WFA에 결합하는 M2BP가 제2 신속 측정법에 의해 신속하고 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 간질환 또는 간질환 병태의 판정을 위한 장치, 기구 또는 키트 제조나, 간질환의 병태의 판별, 혹은 간경변의 검출 등에 이용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 간질환의 환자로부터 채취된 시료에 포함되는 당단백질로서 alpha-1-acid glycoprotein(AGP)을 측정하는 AGP의 측정 방법으로서,
    상기 환자로부터 채취된 시료에 포함되는 AOL(Aspergillus oryzae) 렉틴에 결합한 AGP의 양과, 상기 환자로부터 채취된 시료에 포함되는 MAL(Maackia amurensis) 렉틴에 결합한 AGP의 양을 측정하는 AGP의 측정 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    AGP의 당쇄 구조의 변화에 관계없이 반응성이 변화하지 않는 규격화용 렉틴에 결합한 AGP의 양을 측정하고, 상기 AOL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값 및 상기 MAL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값을 상기 규격화용 렉틴과 결합한 AGP의 측정값을 이용하여 규격화하는 AGP의 측정 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 규격화용 렉틴이 DSA(Datura stramonium)인 AGP의 측정 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 AOL 렉틴, 상기 AGP 및 표지 항-AGP 항체의 제1 복합체를 형성하고, 제1 복합체에서의 표지량을 측정함으로써 상기 AOL 렉틴에 결합한 상기 AGP를 정량하고, 상기 MAL 렉틴, 상기 AGP 및 표지 항-AGP 항체의 제2 복합체를 형성하고, 제2 복합체에서의 표지량을 측정함으로써 상기 MAL 렉틴에 결합한 상기 AGP를 정량하는 AGP의 측정 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1 복합체의 형성이 상기 AOL 렉틴이 고정된 자성 입자를 이용하여 실행되고, 상기 제2 복합체의 형성이 상기 MAL 렉틴이 고정된 자성 입자를 이용하여 실행되는 AGP의 측정 방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1 복합체의 형성이 비오틴화된 상기 AOL 렉틴과 스트렙트아비딘 또는 아비딘이 고정된 자성 입자를 이용하여 실행되고, 상기 제2 복합체의 형성이 비오틴화된 상기 MAL 렉틴과 스트렙트아비딘 또는 아비딘이 고정된 자성 입자를 이용하여 실행되는 AGP의 측정 방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 표지 항-AGP 항체의 표지가 탈글리코실화 처리된 알칼린 포스파타아제인 AGP의 측정 방법.
  8. 청구항 4에 있어서,
    상기 표지 항-AGP 항체의 항-AGP 항체가 탈글리코실화된 항-AGP 항체인 AGP의 측정 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    적어도 상기 AOL 렉틴 및 상기 MAL 렉틴이 고정된 렉틴 어레이와 항-AGP 항체를 이용하여 상기 AOL 렉틴 및 상기 MAL 렉틴에 결합한 AGP를 측정하는 AGP의 측정 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 렉틴 어레이에 추가로 DSA가 고정되고 있고, DSA에 결합한 AGP를 측정하여, 상기 AOL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값 및 상기 MAL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값을 DSA에 결합한 AGP의 측정값으로 규격화하는 AGP의 측정 방법.
  11. 간장의 섬유화 병기의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 간질환의 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, AOL 렉틴에 결합하는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP)의 양과, 상기 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, MAL 렉틴에 결합하는 AGP의 양을 측정하는 AGP의 측정 방법.
  12. 간경변의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 간질환의 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, AOL 렉틴에 결합하는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP)의 양과, 상기 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, MAL 렉틴에 결합하는 AGP의 양을 측정하는 AGP의 측정 방법.
  13. 간세포암 재발 위험의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 간세포암의 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, AOL 렉틴에 결합하는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP)의 양과, 상기 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, MAL 렉틴에 결합하는 AGP의 양을 측정하는 AGP의 측정 방법.
  14. 청구항 1에 기재된 AGP의 측정 방법에 의해 얻어진 상기 AOL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값 및 상기 MAL 렉틴에 결합한 AGP의 측정값에 근거하여 간질환의 치료에서의 항바이러스제의 치료 효과를 판정하는 방법.
  15. 청구항 1에 기재된 AGP의 측정 방법에 이용되는 AGP 정량용 시약으로서, AOL 렉틴이 고정된 자성 입자와, MAL 렉틴이 고정된 자성 입자와, 표지 항-AGP 항체를 구비한 것을 특징으로 하는 AGP 정량용 시약.
  16. 간질환의 환자로부터 채취된 시료에 포함되고, AOL 렉틴 및 MAL 렉틴에 결합하는 alpha-1-acid glycoprotein(AGP) 검출제제를 포함하는 간질환 병태 지표 당쇄 마커 조성물.
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