CN101424690A - 快速检测肝癌的试剂板、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肝癌的试剂板、其制备方法及应用。本发明试剂板由硬质板和贴附于硬质板上的试剂条组成，所述的试剂条按照自上而下的次序，依次由吸水滤纸、硝酸纤维素膜，吸附有金标记的鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸样玻璃纤维膜紧密拼接在一起而组成；其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一端有一条由凝集素包被而成的检测线，在靠近吸水滤纸的另一端有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；所述的吸样玻璃纤维膜的下端有一排加样孔。本发明检测肝癌试剂板具有以下的优点：1.不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适用于现场检测；2.没有放射性同位素、TMB等有害物质或化学物质的参与，更加安全；3.实验结果可以长期保存；4.简单快速，可单人份操作。

Description

快速检测肝癌的试剂板、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种检测疾病的试剂板，尤其涉及一种能够快速、准确的检测肝癌的试剂板、其制备方法及应用，属于生物医学领域。

背景技术

由于甲胎蛋白(AFP)对肝细胞癌具有相对特异的诊断价值，因此在临床广泛应用于肝细胞癌的早期检测。但是长期临床研究表明，AFP在早期肝癌的诊断中存在一定的局限性，具体如下：一诊断特异性差：除肝癌之外，其他一些疾病也可以引起血清中AFP的升高，特别是约20％—40％慢性肝炎患者和20％—50％肝硬化患者血清中也有AFP升高现象，而这些患者并没有发生肝癌，慢性肝炎或肝硬化在急性恶化后血清中AFP浓度也可达到一个极高的水平，甚至超过1000ng/ml。二是漏检率高：为了提高诊断特异性，鉴别良恶性肝病，现有检测标准规定：规定AFP≥400ng/ml为肝癌特异性指标，但是由于早期肝癌中只有25.7％的患者AFP≥400ng/ml，因此仅检测AFP造成大量早期肝癌患者的漏检。

不同病变组织产生的甲胎蛋白含有的糖基不同，含有不同糖基的甲胎蛋白成为AFP异质体。AFP不同的糖基与植物源性凝集素的亲和性不同，借此可将AFP分为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP-L1主要存在于良性肝病中，AFP-L2来自孕妇，AFP-L3为凝集素结合型，为原发性肝癌HCC细胞所特有。临床研究发现，AFP-L3是原发性肝癌HCC的高度特异性指标，是公认的新一代肝癌诊断标志物。研究表明，肝癌AFP-L3阳性率为61％—86％，非肝癌患者阳性率为1.6％—5％，采用AFP-L3作为肝癌的检测指标可显著提高单纯检测总AFP对肝癌诊断的准确率，并在评估肿瘤的恶性程度、提示肿瘤的复发及治疗等方面具有应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够快速、准确的检测肝癌的试剂板，具有灵敏度高、特异性强、安全无污染、快速、操作简便、成本低等优点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种检测肝癌的试剂板，由硬质板和贴附于硬质板上的试剂条组成；所述的试剂条按照自上而下的次序，依次由吸水滤纸、硝酸纤维素膜，吸附有金标记的鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸样玻璃纤维膜紧密拼接在一起而组成；其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一端有一条由凝集素包被而成的检测线，在靠近吸水滤纸的另一端有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；所述的吸样玻璃纤维膜的下端(即在远离固定有金标记羊抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜的一端)有一排加样孔。

所述的吸附有冻干金标记鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜制备方法如下：将鼠抗AFP单克隆抗体用胶体金溶液标记后均匀加到玻璃纤维膜上，采用冷冻干燥的方式干燥12小时以上，即得。

所述的硬质板可以是硬质塑料板，也可以硬质木板或纸板等，只要能将试剂条固定并具有一定的硬度和强度的材质，均可作为本发明的硬质板，优选为硬质塑料板。

所述的硝酸纤维素膜也可由尼龙膜等类似性质的膜来代替。

其中，组成试剂条的吸水滤纸、硝酸纤维素膜，吸附有金标记鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸样玻璃纤维膜的各自面积或大小都没有特别的要求，只要在满足上述拼接次序的前提下，本领域技术人员可根据需要或实际情况将各种膜的面积进行调整，都可实现本发明，其技术效果也没有任何实质性的差别，不过，为了更有利于方便制备和实际应用，同时也为了降低生产成本，所述的试剂条的规格最好为60(长)×4(宽)mm²，所述的硝酸纤维素膜的规格最好为20(长)×4(宽)mm²，所述的冻干金标记鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸样玻璃纤维膜的各自规格最好为7(长)×4(宽)mm²，至于吸水滤纸的规格，其弹性程度更大，可视其它三种膜的规格或面积进行调整。

本发明中所用到的试剂，例如鼠抗AFP单克隆抗体、羊抗鼠IgG、胶体金原料、凝集素等均可从商业途径购买得到。

本发明所要解决的另一个提供一种制备上述检测肝癌试剂板的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备检测肝癌的试剂板的方法，包括：

(1)制备吸附有冻干金标记鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜(金标玻璃纤维膜)：将鼠抗AFP单克隆抗体用胶体金溶液标记后均匀喷洒到玻璃纤维膜上，冷冻干燥，即得；

(2)制备含有检测线和对照线的硝酸纤维素膜：将羊抗鼠IgG抗体、凝集素稀释后，分别点到硝酸纤维素膜预先画好的2条相平行的直线上，干燥，即得(点到硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体形成检测线，点到硝酸纤维素膜上的凝集素形成对照线)；

(3)将吸水滤纸与靠近检测线一端的硝酸纤维素膜相叠接，硝酸纤维素膜的另一端与金标玻璃纤维膜相叠接，再将金标玻璃纤维膜的另一端与吸样玻璃纤维膜相叠接，得到试剂条；将试剂条固定或黏附于硬质板上；在按照所需要的规格进行裁剪或切条，即得。

优选的，步骤(1)中，所述的冷冻干燥的时间优选为(12小时以上)；

步骤(2)中，将羊抗鼠IgG抗体、凝集素分别按照0.75μl/cm²的量点到硝酸纤维素膜预先画好的2条相平行的直线上；所述的干燥优选为干燥12小时以上；

步骤(3)中，首先将金标玻璃纤维膜裁剪成宽度为7.0mm，吸水滤纸裁剪成24.0mm，吸样玻璃纤维膜裁剪成15.0mm；将吸水滤纸与靠近检测线一端的硝酸纤维素膜相叠接，其中，吸水滤纸边缘压硝酸纤维素膜1.0mm；硝酸纤维素膜的另一端与金标玻璃纤维膜相叠接，其中金标玻璃纤维膜的边缘压住硝酸纤维素膜1.0mm；吸样玻璃纤维膜粘贴于金标玻璃纤维膜下端，压住金标玻璃纤维膜2.0mm。

本发明检测肝癌的试剂板根据胶体金免疫层析检测的原理进行临床检测，在测试时将待测样本(全血或血清)滴加入吸样玻璃纤维膜的下端的加样孔中，液体样本由于层析原理开始向试纸条上部移动，当被测标本遇到干燥在玻璃纤维上的金标AFP抗体时将其溶解，如果样品中有AFP-L3存在，样本中的AFP-L3首先与金标AFP抗体结合，形成免疫复合物向上移动，并继续往上移动至硝酸纤维膜的检测线，由于AFP-L3可以与凝集素发生特异结合，也就是说被包被在检测线上的凝集素捕获，形成“金标记AFP抗体—样品中AFP-L3—凝集素”的“三明治”夹心复合物，在检测线上形成一条深色或者浅色的红色或紫红色的沉淀线。如果样本中没有AFP-L3，不会与包被在检测线上的凝集素形成复合物，检测线上就没有红色或紫红色线出现。样本和金标AFP抗体混合物继续往上移动至对照线，包被在对照线上的羊抗鼠IgG将会同金标AFP抗体结合，在对照线上形成一条红色或紫红色线，表明该试纸条有效，如果对照线无红色或紫红色线出现则表明反应无效，此时应更换新的试纸条重新检测。

本发明检测肝癌试剂板的检测标准如下：

阳性：检测线出现深色或者浅色的红色或紫红色线，对照线出现红色或紫红色线。

阴性：检测线没有出现线，对照线出现红色或紫红色线。

无效试验：对照线没有出现红色或紫红色线，此时无论检测线是否出现均为无效试验，此时应更换新的试纸条重新检测。引起无效实验的主要原因有试纸条过期失效、试纸条的保存条件不合格(如受潮、高温等)、实验操作失误等。

本发明检测肝癌试剂板具有以下的优点：1.不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适用于现场检测；2.没有放射性同位素、TMB等有害物质的参与，更加安全；3.实验结果和金标探针可以长期保存；4.简单快速，可单人份操作。总之，本发明具有敏感、特异、操作简便、快速、不需仪器设备和其它试剂等优点。

附图说明

图1本发明检测肝癌试剂板示意图；

A：本发明检测肝癌试剂板的正视图；

B：本发明检测肝癌试剂板的纵切图。

附图标号说明：1：吸水滤纸；2：固定有凝集素和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜(NC)；3：固定有金标记羊抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维；4：吸样玻璃纤维；5：包被有羊抗鼠IgG的对照线；6：包被有凝集素的检测线；7：硬质塑料底板。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 本发明检测肝癌试剂板的制备

一、试验材料及来源

1 鼠抗AFP单克隆抗体

鼠抗AFP单克隆抗体购自厦门大学肿瘤细胞工程国家实验室。使用紫外分光光度计测定蛋白浓度不低于2.0mg/ml；用SDS-PAGE电泳检测纯度大于90％；用ELISA间接法测定抗体效价，稀释到1.0mg/ml时，其效价不低于1∶256。

2 羊抗鼠IgG

羊抗鼠IgG抗体购自厦门大学肿瘤细胞工程国家实验室。使用紫外分光光度计测定蛋白浓度不低于4.0mg/ml；用SDS-PAGE电泳检测纯度大于90％；用ELISA间接法测定抗体效价，稀释到1.0mg/ml时，其效价不低于1∶128。

3 凝集素

凝集素购自厦门大学肿瘤细胞工程国家实验室。使用紫外分光光度计测定蛋白浓度不低于4.0mg/ml；用SDS-PAGE电泳检测纯度大于90％；浓度为3.0mg/ml条件下，血凝滴度不低于1∶256。

4 硝酸纤维素膜

购买自Millipore公司，白色、均匀、平整、无瑕疵，宽度为20.0mm，包装完好。

5 玻璃纤维素膜

购自南京玻璃纤维设计院，白色、无瑕疵、纤维丝均匀细密。

6 吸水滤纸

质地均匀、外观平整、无瑕疵、白色。

7 硬质塑料板

平整干净、无扭曲变形，水胶层均匀无堆积。

二、制备方法

1、鼠抗AFP的标记

先制备胶体金溶液，取100ml纯化水置于一个干净的容器中，在磁力加热搅拌器上搅拌加热至沸腾，加入5.0ml1.0％的氯金酸，搅拌下加热至沸腾，再加入6.0ml2.0％的柠檬酸三钠，加热搅拌并沸腾10分钟后，冷却至室温避光保存待用。取上述制备好的胶体金溶液100ml，用碳酸钾调节pH值至8.0，缓慢滴加加2.0mg鼠抗AFP单克隆抗体，搅拌30分钟；加入20％的BSA2.0ml，搅拌30分钟；用高速冷冻离心机4℃，12000rpm离心30分钟，弃去上清液，用0.02M pH7.4 PBS溶液复溶沉淀至100ml。

2、金标玻璃纤维膜的制备

按照500ml/M²的比例将鼠抗AFP单克隆抗体金标记物的复合溶液，加到玻璃纤维膜上，并用真空冷冻干燥机干燥12小时以上，得到金标玻璃纤维膜。

3、羊抗鼠IgG抗体和凝集素的包被

用0.02M pH7.4PBS稀释羊抗鼠IgG抗体至1.5mg/ml，将凝集素用0.02M pH7.4PBS稀释至1.2mg/ml。调节点膜机(BIO DOT公司XYZ3000或XY3000型系列点膜机，具体厂家机型无严格要求，以能够在膜上喷出均匀的直线为标准)点膜位置分别为T线(T线为检测线)25.7mm(说明：该数据为喷线位置与塑料底板下缘的距离)、C线(C线为对照线)30.2mm(说明：该数据为喷线位置与塑料底板下缘的距离)，并将硝酸纤维素膜贴到硬质塑料板上，硝酸纤维素膜的粘贴位置的下缘与塑料底板的下缘的距离为17.0mm。分别将稀释好的羊抗鼠IgG抗体、凝集素注入到点膜机的C泵、T泵中，按照0.75μl/cm²的量喷到硝酸纤维素膜上。喷好的硝酸纤维素膜放置于湿度不高于30％，温度不高于25℃的干燥间内干燥12小时以上。

4、组装

将金标玻璃纤维膜裁剪成宽度为7.0mm，吸水滤纸裁剪成24.0mm，吸样玻璃纤维膜裁剪成15.0mm。将吸水滤纸粘贴于硝酸纤维素膜(硬质塑料板)的上端，边缘压硝酸纤维素膜1.0mm，金标玻璃纤维膜粘贴于硝酸纤维素膜(硬质塑料板)下端，边缘压住硝酸纤维素膜1.0mm，吸样玻璃纤维膜粘贴于金标玻璃纤维膜下端，压住金标玻璃纤维膜2.0mm。组装成后，并按所需宽度切条(比如4.0mm)，装入塑料卡中或组装成检测条，按规格分装。

试验例1 本发明试剂板检测肝癌的灵敏性、特异性试验

1、本发明试剂板(实施例1所制备)的灵敏度检测

收集北京佑安医院50份癌症病人血样，血样背景及检测结果见表1。

表1

在这50份样本中，共有10份原发性肝癌HCC样本，本发明试纸条的检测结果均为阳性，检出率为100.0％；40份其他肝癌样本，检出32份，即本发明试剂条的阳性检出率为32/40×100％＝80.0％。

2特异性检测

检测50份普通孕妇脐带血样本，检测结果见表2。

表2

 

样本编号	AFP含量	本发明试纸条检测结果
			1	850.00	-

 

2	679.50	-
			3	647.90	-
4	458.10	-
			5	29342.00	-
6	94380.00	-
			7	18220.00	-
8	994.60	-
			9	362.00	-
10	846.30	-
			11	411.90	-
12	342.97	-
			13	1673.37	-
14	2539.63	-
			15	3380.15	-
16	439.83	-
			17	690.55	-
18	13545.59	-
			19	1948.91	-
20	41149.92	-
			21	553.94	-
22	495.28	-
			23	483.62	-
24	406.66	-
			25	3254.61	-
26	5837.05	-
			27	2564.65	-
28	599.21	-
			29	361.50	-
30	552.73	-

 

31	385.61	-
			32	338.29	-
33	637.70	-
			34	753.51	-
35	844.81	-
			36	373.68	-
37	447.57	-
			38	1471.98	-
39	677.80	-
			40	2295.78	-
41	1176.80	-
			42	889.54	-
43	838.13	-
			44	543.41	-
45	98466.84	-
			46	54276.69	-
47	1432.15	-
			48	404.87	-
49	1170.40	-
			50	475.79	-

对于非AFP-L3的样本，本发明试纸条的检出率为0，即特异性达到100.0％。

3 灵敏度检测

该检测样本是使用HCC血清样本按一定比例使用阴性血清稀释后使用ELISA定量试剂盒进行标定得到下列表3所示浓度的标准品。

表3

 

经标定并稀释的的HCC样本	本发明试纸条检测结果
		400ng/ml	+
200ng/ml	+
		100ng/ml	+

 

50ng/ml	+
		25ng/ml	+-
12.5ng/ml	-

该检测的检测下限大约为25ng/ml。

Claims (10)

1、一种检测肝癌的试剂板，其特征在于：由硬质板和贴附于硬质板上的试剂条组成；所述的试剂条按照自上而下的次序，依次由吸水滤纸、硝酸纤维素膜，吸附有金标记的鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜和吸样玻璃纤维膜紧密拼接在一起而组成；其中，所述硝酸纤维素膜在靠近玻璃纤维膜的一端有一条由凝集素包被而成的检测线，在靠近吸水滤纸的另一端有一条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；所述的吸样玻璃纤维膜的下端有一排加样孔。

2、按照权利要求1的试剂板，其特征在于，所述的吸附有金标记的鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜制备方法如下：将鼠抗AFP单克隆抗体用胶体金溶液标记后均匀加到玻璃纤维膜上，冷冻干燥，即得。

3、按照权利要求1的试剂板，其特征在于：所述的硬质板选自硬质塑料板，硬质木板或硬质纸板。

4、按照权利要求3的试剂板，其特征在于：所述的硬质板是硬质塑料板。

5、一种制备权利要求1-4所述的任一试剂板的方法，包括：

(1)制备吸附有冻干金标记的鼠抗AFP单克隆抗体的玻璃纤维膜：将鼠抗AFP单克隆抗体用胶体金溶液标记后均匀喷洒到玻璃纤维膜上，冷冻干燥，即得；

(2)制备含有检测线和对照线的硝酸纤维素膜：将羊抗鼠IgG抗体、凝集素稀释后，分别点到硝酸纤维素膜预先画好的2条相平行的直线上，干燥，即得；

(3)将吸水滤纸与靠近检测线一端的硝酸纤维素膜相叠接，硝酸纤维素膜的另一端与金标玻璃纤维膜相叠接，再将金标玻璃纤维膜的另一端与吸样玻璃纤维膜相叠接，得到试剂条；将试剂条固定或黏附于硬质板上；在按照所需要的规格进行裁剪或切条，即得。

6、按照权利要求5的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的冷冻干燥的时间为12小时以上。

7、按照权利要求5的方法，其特征在于：步骤(2)中将羊抗鼠IgG抗体、凝集素分别按照0.75μl/cm²的量点到硝酸纤维素膜预先画好的2条相平行的直线上。

8、按照权利要求5的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的干燥时间为12小时以上。

9、按照权利要求5的方法，其特征在于：步骤(3)中，首先将金标玻璃纤维膜裁剪成宽度为7.0mm，吸水滤纸裁剪成宽度为24.0mm，吸样玻璃纤维膜裁剪成宽度为15.0mm；将吸水滤纸与靠近检测线一端的硝酸纤维素膜相叠接，其中，吸水滤纸边缘压硝酸纤维素膜1.0mm；硝酸纤维素膜的另一端与金标玻璃纤维膜相叠接，其中金标玻璃纤维膜的边缘压住硝酸纤维素膜1.0mm；吸样玻璃纤维膜粘贴于金标玻璃纤维膜下端，压住金标玻璃纤维膜2.0mm。

10、权利要求1-4的任一试剂板在制备检测或诊断肝癌试剂中的用途。

Images