CN103777026B - 一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，包含Fuc-PON1半定量检测ELISA板，所述的Fuc-PON1半定量检测ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板组成。本发明的试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，糖生物学。
背景技术
HCC是一种多基因、多因素、病理机制复杂的常见恶性肿瘤。在我国，乙肝病毒携带者占人口的7.18％，是全世界乙肝携带者的2／3。与此相关的HCC患者数量庞大，占全世界的一半左右。绝大多数患者发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机，因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。理想的肝癌标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等疾病区分开来；同时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期即提示诊断，同时应具有易检测、可重复、可经非侵入性操作测定等特点。
糖蛋白聚糖存在着宏观和微观的不均一性，其结构功能变化和与疾病发生发展有着密切的联系。聚糖在很多关键的生物学过程中起到重要作用，比如细胞黏附、分子运输和清除、受体激活、信号转导以及内吞作用等。在生物体发育过程中，聚糖结构也在变化，在不同的分化阶段，聚糖有不同的表达。在癌症的发生过程中，糖基化的改变是普遍存在的，如能关注糖基化的变化，可以提升诊断的特异性和敏感性。因此，利用检测糖蛋白聚糖结构的异常来诊断恶性肿瘤已引起相当重视，如AFP-L3的变化已成为检测肝癌的重要聚糖标志等。目前检测糖蛋白聚糖结构变化的技术方法有生物质谱、液相色谱和植物凝集素亲和印迹等，其中植物凝集素是一类存在于多数植物中的糖蛋白，其最大特点是能够识别糖蛋白和糖脂中的聚糖，特别是细胞膜中复杂结构的聚糖即细胞膜表面决定簇，它们与聚糖的结合是非共价且可逆的。AAL是一种亲和α连接岩藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素，岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。在癌症中发现sialylLewisx和sialylLewisa含量增多，许多肿瘤中A和B型血型抗原丢失伴随着H血型抗原和Lewisy表达升高。
PON1是由肝脏合成的一种糖蛋白，与高密度脂蛋白(HDL)结合，存在于血液和肝脏中，当慢性肝病有活动性病变时，肝细胞持续坏死，合成减少，相应地进人循环的PON1减少，导致血清PON1活性降低。肝炎后肝硬化既有肝细胞的持续坏死，又有肝纤维化，其病理过程非常复杂，血清PON1活性显著降低。血清PON1活性可作为判断植入肝脏存活的生化指标之一，协同其他生化指标用来监测肝移植患者的肝脏功能。据报道，HCV引起的炎症继而纤维化，PON1水平会持续下降，作为联合许多氧化和抗氧化的分子一起作为临床有用的监测指标。最新发现HDL微粒和一些脂质的蛋白含量异常，包括PON1的糖基化都会导致肝病患者血清中PON1的表达水平减少。在前期工作中，发现肝癌患者血清单位PON1亲和AAL能力显著增强，说明肝癌患者的单位PON1岩藻糖基化聚糖含量增多。本发明应用AAL对岩藻糖化聚糖的高亲和性，通过AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成PON1抗体-抗原-生物素标AAL复合物和PON1抗体-抗原-生物素标抗体复合物，获得PON1结合AAL的吸光度与PON1蛋白的吸光度比值Fuc-PON1，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得ROC曲线和Cutoff值，同时比较AFP-L3和Fuc-PON1对肝癌诊断的准确率差异。本发明适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高准确率的用于诊断肝细胞性肝癌(HCC)的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，包含Fuc-PON1半定量检测ELISA板，所述的Fuc-PON1半定量检测ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板组成。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含HCC预测模型：
P=exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)／[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)]
所述的Fuc-PON1值的计算方法为：每个血清样品中PON1结合AAL的实际OD值与相同血清样品中PON1蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中PON1结合AAL的实际OD值通过AAL-ELISA板检测得到，血清样品中PON1蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.2727。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含PON1捕获抗体，其浓度为1μg／mL。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含第一封闭剂和第二封闭剂，第一封闭剂为3％BSA溶液，用于封闭AAL-ELISA板，第二封闭剂为含有1％BSA和0.05％NaN3的溶液，用于封闭Protein-ELISA板。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液，用于AAL-ELISA板的氧化。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含生物素标记的AAL和生物素标记的抗体。
优选地，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
本发明中提及的PON1蛋白由前期蛋白质组学工作确定单位PON1亲和AAL能力显著增强，说明肝癌患者的单位PON1岩藻糖基化聚糖含量增多。
本发明主要是建立并优化AAL-ELISA和Protein-ELISA方法，确定最优的捕获抗体浓度、血清样品的上样量、凝集素浓度和检测抗体浓度；并选择合适的AAL-ELISA封闭剂和氧化剂。排除PON1抗体与其它抗原的交叉反应，确立AAL-ELISA和Protein-ELISA对PON1的检测范围和重复性，构建可用于临床血清样品筛查的Fuc-PON1半定量检测系统。
如图1所示，本发明通过AAL-ELISA和Protein-ELISA的制备，联合并行分析血清中对氧磷脂酶(PON)1的岩藻糖(Fuc)和蛋白的表达水平，用于肝癌和肝硬化病人血清中单位PON1蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-PON1)的定量检测。并根据Fuc-PON1的检测数据和临床资料的回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数可用于原发性肝细胞肝癌的早期诊断。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过AAL(杨树茹凝集素)-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成抗体-抗原-生物素标AAL复合物和抗体-抗原-生物素标抗体复合物，以PON1结合AAL的吸光度(OD值)与PON1蛋白的吸光度比值作为衡量单位PON1蛋白中结合岩藻糖的含量(Fuc-PON1)，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线(ROC)以及判别(Cutoff)值，该函数对于HCC的诊断灵敏度和特异度分别为60.3％和71.4％，AUC为0.736，优于甲胎蛋白N-聚糖核心岩藻糖(AFP-L3)。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
附图说明
图1为高通量Fuc-PON1检测系统原理示意图；
图2a为AAL-ELISA线性检测范围图
图2b为Protein-ELISA线性检测范围图。
图3为Fuc-PON1和AFP-L3检测系统分别构建ROC曲线图；
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例：
一、一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，包含如下组分：
1、Fuc-PON1半定量检测ELISA板，所述的Fuc-PON1半定量检测ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板组成。
2、HCC预测模型：
P=exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)／[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)]
所述的Fuc-PON1值的计算方法为：每个血清样品中PON1结合AAL的实际OD值与相同血清样品中PON1蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中PON1结合AAL的实际OD值通过AAL-ELISA板检测得到，血清样品中PON1蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.2727。
3、PON1捕获抗体，其浓度为1μg／mL。(R&DSystems，Catalog#DYC5816，Part#843480)
4、第一封闭剂(3％BSAinPBS，pH7.2-7.4)。
5、第二封闭剂(1％BSA，0.05％NaN3inPBS，pH7.2-7.4)。
6、第一氧化剂(100mMNaIO4，50mMCitricacid，pH4.0)。
7、生物素标记的AAL。
8、生物素标记的抗体(1％BSAinPBS，pH7.2-7.4稀释)。
9、HRP-streptavidin。(ThermoScientific，Product#N100)。
10、采集血样装置及操作说明书。
二、检测方法：
(一)AAL-ELISA板和Protein-ELISA板的预处理方法：
1、取两块ELISA板，分别用作AAL-ELISA板和Protein-ELISA板；
2、捕获抗体：在AAL-ELISA板和Protein-ELISA板中加入PON1捕获抗体，AAL-ELISA中PON1捕获抗体浓度为1μg／mL，100μL／well；Protein-ELISA中PON1捕获抗体浓度为1μg／mL，100μL／well。室温孵育过夜。
3、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4、封闭：AAL-ELISA板采用第一封闭剂(3％BSAinPBS，pH7.2-7.4)；Protein-ELISA采用第二封闭剂(1％BSA，0.05％NaN3inPBS，pH7.2-7.4)室温封闭1h，200μL／well。
5、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
6、氧化：AAL-ELISA板采用第一氧化剂(100mMNaIO4，50mMCitricacid，pH4.0)；Protein-ELISA采用第二封闭剂(1％BSA，0.05％NaN3inPBS，pH7.2-7.4)进行氧化，4℃避光反应1h，200μL／well。
7、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，分别得到处理后的AAL-ELISA板和Protein-ELISA板，用于下述步骤。
(二)Fuc-PON1半定量检测ELISA检测方法：
1、加样：AAL-ELISA板加入稀释后血清样品50μL／well(采用PBS1：30稀释)；Protein-ELISA板加入稀释后血清样品100μL／well(0.5μL血清采用1mMEDTA，0.5％TritonX-100inPBS，pH7.2-7.4稀释至100μL)，室温2h。
2、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
3、检测试剂：AAL-ELISA板中加入1μg／mL生物素标记的AAL(PBST稀释)；Protein-ELISA板中加入600ng／mL生物素标记的抗体(1％BSAinPBS，pH7.2-7.4稀释)，100μL／well，室温2h。
4、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
5、酶结合物工作液：AAL-ELISA板中加入HRP-sztreptavidin(采用封闭剂1，1：12500稀释)；Protein-ELISA板中加入HRP-sztreptavidin(采用1％BSAinPBS，1：12500稀释)，100μL／well，室温30min。
6、洗板：采用PBST(0.05％Tween20inPBS，pH7.2-7.4)洗板4次，每次浸泡2分钟，300μL／well，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
7、加底物溶液：将底物溶液按照TMB：H2O2=1：2混合，100μL／well，室温20min。
8、加终止液：100μLStopSolution／well，终止液的加入顺序与底物溶液的加入顺序相同。
9、检测：立即用NanoQuantinfiniteM200(TECAN)酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
(三)Fuc-PON1半定量检测ELISA分析方法：
1、数据：每个血清样品的OD值应减去空白孔的OD值为实际OD值。每个血清样品PON1结合AAL的实际OD值(AAL-ELISA)与此相同血清样品PON1蛋白的实际OD值(Protein-ELISA)比值即为Fuc-PON1值。
按照上述HCC预测模型计算P值，将P值与Cutoff值比较，＞2.2727为肝癌，＜2.2727为肝硬化。
采用实施例中的试剂盒和检测方法，联合并行分析86例肝病血清样品(肝硬化和肝癌患者各43例，均经临床确诊)中PON1的岩藻糖和蛋白的表达水平，计算得到Fuc-PON1含量。采用SPSS软件logistic回归分析建立的上述HCC预测模型进行检测区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.2727。(AFP-L3检测试剂盒购自Abnova公司(Catalog#KA1187)，按照试剂盒操作步骤检测上述86例肝病血清样品中AFP-L3含量，采用SPSS软件获得ROC曲线。)，比较本发明试剂盒和AFP-L3对肝癌诊断的准确性和特异性，结果如图3所示，本发明试剂盒的灵敏度为60.3％，特异度71.4％，准确性为64％，AUC为0.736，而AFP-L3对HCC的诊断灵敏度、特异度和准确性均为60.5％，AUC为0.612。如表1所示，肝硬化患者AFP-L3检测均值为0.8466，标准差为0.32；肝癌患者AFP-L3检测均值为0.9779，标准差为0.36；p值为0.0393。肝硬化患者Fuc-PON1检测均值为2.6315，标准差为2.18；肝癌患者Fuc-PON1检测均值为4.3609，标准差为3.08；p值为0.002。
表1：Fuc-PON1和AFP-L3检测结果相互比较
利用本发明试剂盒分析40例测试集血清(血清标本来自于广西医科大学附属第一医院肝外科及消化内科住院病人)中Fuc-PON1水平，参考Cutoff值，结果显示成功预测了27例患者，准确率为67.5％。因此，本发明具有较高特异度和准确性，对肝癌的预测具有重要临床价值。
取1例混合血清样品(10例混合，血清标本来自于广西医科大学附属第一医院肝外科及消化内科住院病人)检测本发明的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒中的AAL-ELISA与其它蛋白是否存在非特异性交叉反应，结果如表2所示，本发明试剂盒中AAL-ELISA检测其它蛋白的OD值与PBS缓冲液一致，血清PON1的OD值远大于其它蛋白。
表2：Fuc-PON1检测系统中AAL-ELISA未见交叉反应：
取3例混合血清样品(每1例由10例血清混合，血清标本来自于广西医科大学附属第一医院肝外科及消化内科住院病人)检测用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒的重复性每例血清检测3次，计算每例血清Fuc-PON1的平均值、标准差及CV值。结果如表3所示。
表3：Fuc-PON1检测系统三次重复检测结果
采用已知PON1蛋白浓度的血清进行倍比稀释，确定本发明试剂盒中AAL-ELISA线性检测范围，其中血清中PON1蛋白浓度确定采用ELISA定量检测试剂盒(R&DSystems，Catalog#DYC5816)，结果如图2a所示，采用recombinantPON1标准品(R&DSystems，Catalog#DYC5816，Part#843482)进行倍比稀释，确定Protein-ELISA线性检测范围。结果如图2b所示，Protein-ELISA线性检测范围大于AAL-ELISA线性检测范围，因此Fuc-PON1检测系统的检测范围即AAL-ELISA线性检测范围。本发明的试剂盒的定量线性检测范围为0.71～7.1ng/mL。
Claims (5)
1.一种用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，包含Fuc-PON1半定量检测ELISA板，所述的Fuc-PON1半定量检测ELISA板由AAL-ELISA板和Protein-ELISA板组成；其中，Fuc-PON1值的计算方法为：每个血清样品中PON1结合AAL的实际OD值与相同血清样品中PON1蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中PON1结合AAL的实际OD值通过AAL-ELISA板检测得到，血清样品中PON1蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到；还包含HCC预测模型：
P=exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)/[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-PON1)]
该模型区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.2727。
2.如权利要求1所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，还包含PON1捕获抗体，其浓度为1μg/mL。
3.如权利要求1所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含第一封闭剂和第二封闭剂，第一封闭剂为3%BSA溶液，用于封闭AAL-ELISA板，第二封闭剂为含有1%BSA和0.05%NaN3的溶液，用于封闭Protein-ELISA板。
4.如权利要求1所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液，用于AAL-ELISA板的氧化。
5.如权利要求1所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的用于诊断肝细胞性肝癌的试剂盒还包含生物素标记的AAL和生物素标记的抗体。
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