Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum
Trennen und Messen von zwei oder mehreren Formen von
Glykoproteinen, die in der Zuckerkettenstruktur verschieden sind.
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Nicht nur beim Menschen, sondern auch bei den meisten
Tieren sind viele der in den Körperflüssigkeiten enthaltenen
Proteine Glykoproteine mit einer oder mehreren Zuckerketten.
Aufgrund der Vielfalt seiner Struktur u. dgl. ist der
Zuckerkettenteil neuerdings besonders bekannt als eine Substanz,
die bestimmte Informationen in bezug auf das Innere eines
lebenden Körpers trägt und wurde an vielen Universitäten und
Forschungsinstituten innerhalb und außerhalb Japans
untersucht.
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Im Verlaufe der Untersuchung wurde oftmals eine
Änderung in der Zuckerkettenstruktur eines bestimmten
Glykoproteins beobachtet, die durch eine bestimmte Erkrankung
hervorgerufen wurde. Beispielsweise wurde festgestellt, daß beim
Human-alpha-Fetoprotein (AFP) die Addition eines alpha-L-
Fucose-Rests oder eines N-Acetylglucosamin-Rests
(N-Acetylglucosamin halbierend) an eine AFP-Zuckerkette häufig mit
der Entwicklung eines Leberzellkarzinoms zu beobachten ist.
Darüber hinaus ist der Grad einer derartigen Veränderung der
Zuckerkettenstruktur unabhängig von der AFP-Konzentration im
Serum, und es wird die Änderung sogar im frühen
Leberzellkarzinom festgestellt. Daher wird angenommen, daß die
Ermittlung des Grades der Veränderung eine Krebsdiagonose
ermöglicht. Auf diese Weise ist die Änderung der
Zuckerkettenstruktur bekannt geworden.
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Der Grad der Änderung der Zuckerkettenstruktur eines
Glykoproteins wird hauptsächlich mit einer Analysenmethode
unter Verwendung eines Lektins gemessen, wie beispielsweise
als Lektin-Säulenmethode oder Lektin-Elektrophoresemethode.
Der Grund dafür, weshalb der Grad der Veränderung der
Zuckerkettenstruktur hauptsächlich unter Verwendung eines
Lektins gemessen wird, ist beispielsweise folgender. Lektine
sind nicht teuer. Darüber hinaus kann, da die Immunogenität
des Zuckerkettenteils eines Glykoproteins geringer ist als
die des Proteinteils des Glykoproteins, kein wirksamer
Antizuckerketten-Antikörper mit der Ausnahme von dem eines Teils
der nichtreduzierenden, terminalen Struktur erhalten werden,
d. h. die Herstellung eines Antikörpers zur Zuckerkette des
Glykoproteins ist schwierig.
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Obgleich Lektine jedoch über eine hohe
Erkennungsspezifität der Zuckerkettenstruktur verfügen, ist ihre Bindung
stärker (kupplungskonstant) an der Zuckerkette um
Tausendstel bis Zehntausendstel so hoch wie die des Antikörpers.
Daher ist es schwierig, einen Komplex eines Lektins und der
Zuckerkette zu erzeugen, der so stabil ist wie ein durch
Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugter Komplex. Wenn
dementsprechend ein Lektin anstelle eines Antikörpers in einer
Analysemethode verwendet wird, die eine Waschprozedur nach
der Erzeugung eines Komplexes auf einer festen Phase
erfordert, wie beispielsweise ein Enzymimmonoassay (ELISA) unter
Verwendung eines verfestigten Antikörpers, dissoziiert ein
Komplex des Lektins und eines Glykoproteins, das gemessen
werden soll, während des Waschens, was dazu führt, daß
Probleme entstehen, wie beispielsweise eine merkliche
Verringerung der Meßempfindlichkeit. Daher kann man nicht
sagen, daß eine solche Methode für eine klinische Diagnose
praktisch ist. Aufgrund der vorgenannten Eigenschaften des
Lektins hat es darüber hinaus die folgenden Einschränkungen
gegeben: Für das Messen eines Glykoproteins unter Nutzung
der Reaktion eines Lektins mit dem Glykoprotein sollte die
Messung daher in Gegenwart eines großen Überschusses des
Lektins gegenüber dem zu messenden Glykoprotein unter
Anwendung einer mit dem Lektin gekuppelten Säule, eines Agarose-
Gels, welches das Lektins enthält o. dgl. ausgeführt werden.
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In der EP-A-0 399 464 wird ein Assay für ein
Glykoprotein mit einer speziellen Zuckerkette zur Erzeugung eines
Komplexes zwischen einem Antikörper, einem Glykoprotein und
einem Lektin und das Separieren offenbart, wobei jedoch für
die Trennung und das Messen von zwei oder mehreren Formen
eines Glykoproteins, das über unterschiedliche Zuckerketten
verfügt, keine Methode angegeben wird.
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Daher wird die Entwicklung eines Verfahrens zur
schnellen und leichten Abtrennung und Messung von
Glykoprotein-Zuckerketten angestrebt, das sowohl über die Zucker-
Erkennungsspezifität von Lektinen als auch über die hohe
Empfindlichkeit eines Enzymimmunoassays verfügt.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung wurde angesichts dieser
Situation ausgeführt und soll ein Verfahren für die schnelle
und leichte Trennung und Messung mit hoher Empfindlichkeit
von zwei oder mehreren Formen von Glykoproteinen unter
Nutzung eines Lektins und eines Antikörpers gewähren.
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Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum
Trennen und Messen, bei welchem die zu messenden Analyten
zwei oder mehrere Formen von Glykoproteinen sind, die
hinsichtlich der Zuckerkettenstruktur verschieden sind,
jedoch weitgehend die gleiche Proteinstruktur haben, welches
Verfahren umfaßt: Umsetzen einer Probe, die zwei oder
mehrere Formen von Glykoproteinen enthält, mit einem Lektin,
das in der Lage ist, die spezielle Zuckerkettenstruktur von
mindestens einem dieser zu messenden Glykoproteine zu
erkennen, sowie mit einem ersten Antikörper, der die
Eigenschaft hat, sich an allen Analyten zu binden, jedoch vom
Binden an Glykoprotein(en) abgehalten wird, das/die das
daran befindliche Lektin aufweisen (dieser Antikörper wird
nachfolgend abgekürzt als "erster Antikörper"; sowie Trennen
und Messen von Glykoprotein(en), die den daran befindlichen
ersten Antikörper aufweisen, von Glykoprotein(en), die keine
daran befindlichen ersten Antikörper aufweisen, indem die
Unterschiede der Eigenschaft zwischen dem/den ersteren
Glykoprotein(en) und dem/den letzteren Glykoprotein(en)
genutzt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Es zeigen:
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Fig. 1 ein Trennungsprofil, das mit Hilfe der
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) in Beispiel 1
erhalten wurde;
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Fig. 2 eine graphische Darstellung, erhalten in
Beispiel 1 durch Auftragen jedes der Flächenwerte der zwei
Peaks in Fig. 1, die von der jeweiligen Probelösung erhalten
wurden, und die Summe der zwei Peakflächen, die dem
Mischverhältnis einer alpha-Fetoprotein (AFP)-Lösung vom
Leberzellkarzinom-Typ und einer AFP-Lösung vom Normal-Typ in
jeder Probenlösung entspricht;
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Fig. 3 eine schematische Darstellung der Skizze
einer HPLC-Apparatur, die in Beispiel 1 verwendet wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Im Verlaufe einer eingehenden Untersuchung zur
Entwicklung eines Verfahrens für schnelle und leichte Trennung
und Messung von zwei oder mehreren Formen von
Glykoproteinen, die sowohl über die Zucker-Erkennungsspezifität
von Lektinen als auch über die hohe Empfindlichkeit eines
Enzyimmunoassays verfügen, haben die Erfinder der
vorliegenden Erfindung festgestellt, daß Antikörper, die von der
Antigen-Antikörper-Reaktion in Gegenwart eines Lektins
(erster Antikörper) abgehalten werden, unter den Antikörpern
an Glykoproteinen existieren. Als Ergebnis einer weiteren
Untersuchung für die Entwicklung eines Trennungs- und
Meßverfahrens von zwei oder mehreren Formen von
Glykoproteinen unter Einsatz eines solchen Antikörpers haben die
Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß der
Grad der Änderung in der Zuckerkettenstruktur eines
Glykoproteins mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann,
indem eine Kombination eines Lektins, das in der Lage ist,
eine Strukturänderung der Zuckerkette eines Glykoproteins zu
erkennen, die durch eine Erkrankung hervorgerufen wurde, und
eines Antikörpers, der über die vorgenannte Eigenschaft
verfügt (ein erster Antikörper). Auf diese Weise wurde die
vorliegende Erfindung ausgeführt.
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Die vorliegende Erfindung wird z. B. folgendermaßen
ausgeführt.
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Ersten, wird eine von einem lebenden Körper genommene
Probe, die zwei oder mehrere Formen von zu messenden
Glykoproteinen enthält, umgesetzt mit einem Lektin, das zur
Erkennung der Zuckerkettenstruktur von mindestens einem
dieser zu messenden Glykoprotein-Analyten in der Lage ist,
sowie einem ersten Antikörper. Sodann wird ein Komplex aus
Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten Antikörper von
dem/den Gykoprotein-Analyt(en) abgetrennt, der/die über
keinen daran befindlichen ersten Antikörper verfügen, und
zwar unter Einsatz der Unterschiede in den Eigenschaften
zwischen dem erstem und dem letzten, wie beispielsweise dem
Unterschied in der relativen Molekülmasse, dem Unterschied
im isoelektrischen Punkt, der unterschiedlichen elektrischen
Ladung, dem Unterschied der Hydrophobie o. dgl. Danach wird
jeweils der erstere und der letztere mit Hilfe einer Methode
gemessen, die für deren Eigenschaften geeignet ist.
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Obgleich das Lektin und der erste Antikörper mit dem zu
messenden Glykoprotein-Analyten gleichzeitig zur Reaktion
gebracht werden können, wird das Lektin vorzugsweise zuerst
und danach der erste Antikörper umgesetzt, weil dadurch die
Reaktion des Lektins mit Glykopropetin-Analyt(en) mit
Gewißheit ausgelöst wird, so daß die Genauigkeit der Messung
verbessert ist.
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In der vorstehend ausgeführten Trennung und Messung
nach der vorliegenden Erfindung wird zur Erleichterung der
Detektion der zu messenden Glykoprotein-Analyten an den
ersten Antikörper vorzugsweise eine Substanz angebracht, die
zur Änderung der Eigenschaften des Komplexes von
Glykoprotein-Analyt(en) und dem Antikörper (diese Substanz wird
nachfolgend abgekürzt als "trennungverbessernde Substanz")
in der Lage ist, oder eine markierende Substanz.
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Darüber hinaus wird zur Erleichterung der Detektion der
zu messenden Glykoprotein-Analyten und auch der Messung der
Gesamtmenge der Glykoprotein-Analyten die Mitverwendung
eines Antikörpers bevorzugt, der sich an allen Glykoprotein-
Analyten binden kann, die ein daran befindliches Lektin
aufweisen, und der eine daran befindliche markierende
Substanz aufweist (dieser Antikörper wird nachfolgend
abgekürzt als "zweiter Antikörper").
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Wenn der zweite Antikörper verwendet wird, wird die
vorliegende Erfindung beispielsweise wie folgt ausgeführt.
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Erstens, wird eine von einem lebenden Körper genommene
Probe, die zwei oder mehrere Formen der zu messenden
Glykoproteine enthält, mit dem zweiten Antikörper, einem
Lektin, das zum Erkennen der Zuckerkettenstruktur von
mindestens einem dieser zu messenden Glykoprotein-Analyte in
der Lage ist, und einem ersten Antikörper zur Reaktion
gebracht. Danach wird ein Komplex von Glykoprotein-
Analyt(en) und dem ersten Antikörper von dem/den
Glykoprotein-Analyt(en) abgetrennt, der/die keinen daran
befindlichen ersten Antikörper aufweisen, indem die Unterschiede
in den Eigenschaften zwischen den ersteren und den letzten
genutzt werden, wie beispielsweise dem Unterschied der
relativen Molekülmasse, dem Unterschied in dem
isoelektrischen Punkt, der unterschiedlichen elektrischen Ladung, dem
Unterschied in der Hydrophobie o. dgl. Danach werden jeden
jeweils der erstere und der letzte unter Nutzung der
Eigenschaften der an dem zweiten Antikörper befindlichen
markierenden Substanz gemessen.
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Obgleich der Antikörper, das Lektin und der erste
Antikörper den zu messenden Glykoprotein-Analyten gleichzeitig
zur Reaktion gebracht werden können, wird das Lektin
vorzugsweise zuerst umgesetzt und danach der erste
Antikörper, weil dadurch die Reaktion des Lektins mit
Glykoprotein-Analyt(en) mit Gewißheit ausgelöst wird, so daß die
Genauigkeit der Messung verbessert ist.
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Die eigentliche Trennung und Messung können mit höherer
Genauigkeit in einigen Fällen dadurch ausgeführt werden, daß
die zu messenden Glykoprotein-Analyten mit Gylkosidase
gleichzeitig (oder vor) der Reaktion des Lektins und des
ersten Antikörpers oder des zweiten Antikörpers mit den
Glykoprotein-Analyten behandelt werden.
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Die Gründe dafür sind folgende. Die äußeren Ketten der
Zuckerketten der zu messenden Glykoprotein-Analyte
unterliegen verschiedenen strukturellen Veränderungen in
Abhängigkeit von der Art der Erkrankung. Selbst wenn die
Zuckerkette eine Struktur hat, die dem Lektin und dem ersten
Antikörper oder dem zweiten Antikörper es im wesentlichen
ermöglicht, sich an den Zuckerketten zu binden, wird das
Binden in einigen Fällen behindert oder unmöglich, was von
der Art eines mit dem nichtreduzierenden Ende der
Zuckerkette verknüpften Zuckerrest abhängt. In diesem Fall kann
die Genauigkeit der eigentlichen Trennung und Messung
dadurch verbessert werden, daß das Binden des Lektins und
des ersten Antikörpers oder des zweiten Antikörpers an
Glykoprotein-Analyt(en) mit einer objektiven Struktur
erleichtert wird, indem die zu messenden Glykoprotein-Analyte
mit einer geeigneten Glykosidase behandelt werden, um den
Zuckerrest an dem nichtreduzierenden Ende zum Zeitpunkt der
Reaktion (oder davor) des Lektins und des ersten Antikörpers
oder des zweiten Antikörpers mit den zu messenden
Glykoprotein-Analyten zu entfernen.
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Die für diese Aufgabe verwendete Glykosidase ist
solange nicht speziell beschränkt, wie sie als
Zucker-Hydrolase wirkt. Bevorzugte Beispiele für die Glykosidase sind:
Sialidase, beta-Galaktosidase, beta-N-Acetylglucosamidase,
alpha-Mannosidase, beta-Mannosidase, alpha-Fucosidase, usw.
Die jeweilige Herkunft dieser Glykosidasen sind nicht
speziell beschränkt.
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In dem vorstehend beschriebenen Fall können die
Bedingungen der Reaktion mit Glykosidase, wie beispielsweise
Temperatur und pH-Wert, in Abhängigkeit von der Art der
verwendeten Glykosidase in geeigneter Weise gewählt werden.
Die Reakionstemperatur beträgt gewöhnlich 0ºC ... 50ºC,
bevorzugt 1ºC ... 40ºC und mehr bevorzugt 25ºC ... 37ºC.
Der pH-Wert der Reaktion beträgt gewöhnlich 2 ... 10 und
bevorzugt 4 ... 9. Die Konzentration der verwendeten
Glykosidase variiert in Abhängigkeit von der Art der verwendeten
Glykosidase und ist solange nicht entscheidend, wie die
Konzentration größer als die Konzentration ist, bei der die
eigentliche Zucker-Hydrolysereaktion stattfindet. Die
Ausführung der Zucker-Hydrolysereaktion in einer Lösung mit
einer relativ hohen Glykosidase-Konzentration über eine
kurze Zeitdauer wird gegenüber einer Ausführung der Zucker-
Hydrolysereaktion in einer Lösung mit einer geringen
Glykosidase-Konzentration über eine lange Zeitdauer bevorzugt, da
eine unnötige Entfernung der Zuckerketten vermieden werden
kann. Die Konzentration wird so gewählt, daß die Gesamtmenge
der Glykosidase in der Reaktionslösung auf normalerweise 10
... 1.000 mU (Einheit) eingestellt wird und bevorzugt auf 50
... 5.000 mU. Die Reaktionsdauer beträgt in der Regel 1
Minute bis 24 Stunden und vorzugsweise 3 Minuten bis 1
Stunde. Wenn die Reaktion mit der Glykosidase und die
Reaktion mit dem Lektin und dem ersten Antikörper oder dem
zweiten Antikörper gleichzeitig ausgeführt werden, sind die
vorstehend angegebenen Reaktionsbedingungen durch die
Reaktionsbedingungen für das Reagieren des Lektins u. dgl.
selbstverständlich in einem gewissen Maße eingeschränkt.
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Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Lektin ist
nicht speziell beschränkt und es kann eines in geeigneter
Weise aus zahlreichen Lektinen ausgewählt werden, das über
eine Fähigkeit zum Erkennen einer objektiven
Zuckerkettenstruktur in der Lage ist, wie beispielsweise
Concanavalin A, Lens culinaris-Lektin, Phaseolus vulgaris-Lektin,
Datura stromonium-Agglutinin, Triticum vulgaris-Lektin, usw.
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Als der erste Antikörper (oder ein Antikörper, der zur
Herstellung des zweiten Antikörpers verwendet wird), der die
vorstehend beschriebenen Eigenschaften hat und der in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann einer der
folgenden polyklonalen Antikörper und monoklonalen
Antikörper solange verwendet werden, wie sie über die vorstehend
beschriebenen Eigenschaften verfügen: z. B. polyklonale
Antikörper, die hergestellt werden durch Immunisieren von
Tieren, wie beispielsweise Pferd, Rind, Schaft, Kaninchen,
Ziege, Ratte, Maus, usw. mit einem zu messenden Analyt(en),
und zwar nach einer konventionellen Methode, beispielsweise
der von Tadashi Matsuhashi et al. "Men-ekigaku Nyumon", 2.
Ausg., GAKKAT-SHUPPAN CENTER Ltd., (1981), usw.,
beschriebenen Methode; wie monoklonale Antikörper, die hergestellt
werden durch Hybridomas, die durch Verschmelzen von Zellen
aus einer Tumorreihe von Mäusen mit Mausrückenmarkszellen
erhalten wurden, die zuvor mit einem oder mehreren zu
messenden Analyten immunisiert wurden, und zwar nach der
konventionellen Methode, d. h. der Zellverschmelzungs-Methode
nach G. Kohler und C. Milstein (Nature, 256, 495, (1975)).
Diese polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper können
einzeln oder in geeigneter Kombination von zwei oder
mehreren davon verwendet werden.
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Als das Glykoprotein, das durch Anwendung der
vorliegenden Erfindung abgetrennt und gemessen werden kann, kann
jedes beliebige Glykoprotein ohne spezielle Einschränkung
solange exemplifiziert werden, wie es die folgenden
Bedingungen erfüllt. Es ist in einer von einem lebenden Körper
abgenommenen Probe enthalten, z. B. Körperflüssigkeiten, wie
beispielsweise Serum, Blut, Plasma oder Urin, Lymphozyten,
Hämozyten oder beliebige verschiedene Zellen; es kann Formen
aufweisen, die hinsichtlich der Zuckerkettenstruktur
verschieden sind, die aber weitgehend die gleiche Protein-
Struktur haben, wobei es ein Lektin gibt, das zum Erkennen
der spezifischen Zuckerkettenstruktur von mindestens einer
der Formen des zu messenden Glykoproteins und eines ersten
Antikörpers in der Lage ist. Bevorzugte spezielle Beispiele
für das Glykoprotein sind Enzyme, wie beispielsweise
Amylase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, gamma-
Glutamyltransferase (gamma-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK),
Lactatdehydrogenase (LDH), Glutaminsäure-oxalessigsäure-
Transaminase (GOT), Glutaminsäure-pyruvinsäure-Transaminase
(GPT), Renin, Proteinkinase, Tyrosinkinase, usw.;
physiologisch wirksame Substanzen, wie beispielsweise
Human-Choriongonadotropin (hCG), Thyreotropin (TSH), luteinisierendes
Hormon (LH), usw.; tumorspezifische Antigene, wie
beispielsweise Prostaglandin-spezifisches Antigen (PSA), alpha-
Makroglobulin, karzinoembryonales Antigen (CEA), alpha-
Fetoprotein, usw.; sowie Glykogenese fördernde Tumorantigen,
wie beispielsweise CA 19-9, CA 125, usw.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Trennen und
Messen wird die Konzentration des verwendeten Lektins in
Abhängigkeit von der Art des verwendeten Lektins, den
Eigenschaften der zu messenden Glykoprotein-Analyten usw.
variiert. Vorzugsweise liegt das Lektin gemeinsam mit den
Glykoprotein-Analyten in einer Konzentration von normalerweise
dem Zehnfachen oder mehr und vorzugsweise dem Hundertfachen
oder mehr und mehr bevorzugt dem Tausendfachen oder mehr
einer vorgegebenen Nachweisgrenzkonzentration der
Glykoprotein-Analyten vor.
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Die Konzentration des verwendeten ersten Antikörpers
wird in Abhängigkeit von einem Wert variiert, bei dem die
Nachweisgrenze der zu messenden Glykoprotein-Analyten
vorgegeben ist. Die Konzentration wird vorzugsweise in bezug auf
den Unterschied der Kupplungskonstante zwischen dem Lektin
und dem ersten Antikörper für die Glykoprotein-Analyten
bestimmt. Obgleich die Konzentration abhängig beispielsweise
von den Arten und Eigenschaften der Glykoprotein-Analyten
und dem Lektin sowie den Eigenschaften des ersten
Antikörpers variiert wird, wird die Konzentration vorzugsweise
unter Anwendung der folgenden allgemeinen Formel bestimmt:
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Konzentration des ersten Antikörpers ≤
[(Kupplungskonstante des Lektins)/(Kupplungskonstante des ersten
Antikörpers)] · (Konzentration des Lektins)
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Die Kupplungskonstante in der vorstehenden allgemeinen
Formel bezieht sich auf eine Kupplungskonstante, die in dem
durch Formel (1) nachfolgend beschriebenen
Reaktionsgleichgewicht erhalten wird und mit Hilfe der nachstehend
beschriebenen Gleichung (2) berechnet wird:
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[A] + [B] [A · B] (1)
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Kupplungskonstante = [A · B] / ([A] · [B]) (2)
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worin sind:
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[A] Die Konzentration (M) des Lektins oder des ersten
Antikörpers in einem Gleichsgewichtszustand;
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[B] die Konzentration (M) von freiem/freien
Glykoprotein-Analyt(en), die in einem
Gleichgewichtszustand gemessen werden sollen;
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[A · B] die Konzentration (M) eines Komplexes aus dem
Lektin (oder des ersten Antikörpers) und
dem/den Glykoprotein-Analyt(en).
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Spezieller beträgt die Konzentration des ersten
Antikörpers, wenn beispielsweise die Kupplungskonstante des
Lektins für die Glykoprotein-Analyten 1 · 10&sup6; M&supmin;¹ und die
Kupplungskonstante des ersten Antikörpers für die
Glykoprotein-Analyten 1 · 10&sup8; M&supmin;¹ beträgt, ein Hundertstel oder
weniger und bevorzugt ein Tausendstel oder weniger von dem
der Lektin-Konzentration. Obgleich die Konzentration des
verwendeten ersten Antikörpers vorzugsweise nicht geringer
ist als eine Konzentration, bei der der erste Antikörper an
der Gesamtheit der zu messenden Glykoprotein-Analyten einer
Konzentration entsprechend einer vorgegebene Nachweisgrenze
binden kann, kann sie geringer sein als (beispielsweise etwa
ein Zehntel) die vorstehend angegebene Konzentration.
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Die Konzentration des verwendeten zweiten Antikörpers
variiert in Abhängigkeit von einer Konzentration, bei der
die Nachweisgrenze der Glykoprotein-Analyten festgelegt ist.
Vorzugsweise wird die Konzentration des zweiten Antikörpers
in der Reaktionslösung auf eine Konzentration eingestellt,
die nicht kleiner ist als (bevorzugt das Zweifache oder
darüber und mehr bevorzugt das Fünffache oder darüber) eine
Konzentration, bei der der zweite Antikörper an der
Gesamtheit der Glykoprotein-Analyten einer Konzentration
entsprechend der Nachweisgrenze binden kann.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Trennen und
Messen sind die Reaktionsbedingungen für das Reagieren des
Lektins, des ersten Antikörpers und wahlweise des zweiten
Antikörpers mit den zu messenden Glykoprotein-Analyten unter
Bildung eines Komplexes aus dem Lektin und dem/den
Glykoprotein-Analyt(en) und eines Komplexes des ersten
Anti
körpers und dem/den Glykoprotein-Analyt(en) (oder Komplexe
von jeweils den vorgenannten Komplexen und dem zweiten
Antikörper) solange nicht kritisch, solange sie die Bildung
dieser Komplexe nicht hemmen. Die Reaktion kann unter
Reaktionsbedingungen ausgeführt werden, die zur Erzeugung
eines Komplexes o. dgl. in einer konventionellen Methode
eingesetzt werden, wie beispielsweise einem Enzymimmunoassay
(EIA), Radioimmunoassay (RIA), Fluoroimmunoassay (FA) oder
Affinitätschromatographie. Wenn in der Reaktion
beispielsweise eine Pufferlösung verwendet wird, können als Puffer
und andere Reagenzien in geeigneter Weise solche gewählt
werden, wie sie in den vorgenannten konventionellen Methoden
verwendet werden. Obgleich der pH-Wert der Reaktion solange
nicht kritisch ist, wie er die Bildung der vorgenannten
Komplexe hemmt, beträgt er gewöhnlich 2 bis 10 und
vorzugsweise 5 bis 9. Obgleich die Temperatur der Reaktion
solange nicht kritisch ist, wie sie die Bildung der Komplexe
nicht hemmt, beträgt sie gewöhnlich 0ºC ... 50ºC, bevorzugt
0ºC ... 40ºC und mehr bevorzugt 0ºC ... 10ºC. Hinsichtlich
der Reaktionsdauer kann die Reaktion, da die für die Bildung
der Komplexe erforderliche Zeit in Abhängigkeit vom
Reaktionsvermögen der Glykoprotein-Analyten mit dem Lektin, dem
ersten Antikörper und dem zweiten Antikörper variiert, in
geeigneterweise über mehrere Sekunden bis zu mehreren
Stunden je nach den Eigenschaften dieser Komponenten
ausgeführt werden.
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Als die trennungverbessernde Substanz, die an den
ersten Antikörper angebracht werden soll, kann jede
beliebige Substanz ohne spezielle Beschränkung exemplifiziert
werden, solange sie die Eigenschaften (z. B. relative
Molekülmasse, Hydrophobie, isoelektrischer Punkt, usw.) des
Komplexes auf Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten
Antikörper ändern kann. Bevorzugte spezielle Beispiele für die
trennungverbessernde Substanz sind Proteine, wie
beispielsweise alpha-Chymotrypsinogen, beta-Galactosidase, Lysozym,
Cytochrom C, Trypsin-Inhibitor, usw.; Peptide, die
Aminosäuren enthalten, wie beispielsweise Phenylalanin, Prolin,
Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, usw.;
Halogenatome, wie beispielsweise Brom, Chlor, Iod, usw.;
synthetische Polymere, wie beispielsweise Poly(ethylenglykol(e)),
usw.; Poly(aminosäure(n)), wie beispielsweise
Poly(glutaminsäure(n)), Poly(asparaginsäure(n)), Poly(lysin(e)), Poly-
(arginin(e)), Poly(phenylalanin(e)), Poly(tyrosin(e)), usw.;
Alkylketten mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; Fettsäuren, wie
beispielsweise Palmitinsäure, Oleinsäure, Stearinsäure, usw.;
sowie chemische Substanzen, die über eine reaktionsfähige
Gruppe verfügen, die zum Binden an dem ersten Antikörper in
der Lage sind und über Hydrophobie oder Ionenstärke
verfügen, z. B. N-(ε-Maleinimidocaproyloxy)succinimid (EMCS), N-
Succinimidyl-6-maleinimidohexanoat, Bismaleinimidohexan (BMH),
Octylamin, usw. Es ist ausreichend, daß die
trennungverbessernde Substanz, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, in geeigneter Weise hinsichtlich der
Eigenschaften (z. B. pH-Stabilität, Hydrophobie, Löslichkeit in
einer wäßrigen Lösung, isoelektrischer Punkt, usw.) der zu
messenden Glykoprotein-Analyte und des ersten Antikörpers
gewählt wird.
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Als ein Verfahren zum Vereinigen des ersten Antikörpers
und der trennungverbessernden Substanz, die in der
vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann ein Verfahren zum
Verknüpfen der spezifischen reaktiven Gruppe des ersten
Antikörpers mit der spezifischen reaktiven Gruppe der
trennungverbessernden Substanz exemplifiziert werden; ein
Verfahren zum Austausch der spezifischen reaktiven Gruppe
des ersten Antikörpers gegen die trennungverbessernde
Substanz; und ein Verfahren zum Vereinigen des ersten
Antikörpers und der trennungverbessernden Substanz über eine
Substanz, die über eine Affinität zum ersten Antikörper
verfügt (z. B. Antikörper, Lektin, Antigen, Inhibitor, DNA,
usw.). Spezieller können exemplifiziert werden, sämtliche
(1) konventionelle Verfahren zum Anbringen einer
markierenden Substanz an einen Antikörper, die allgemein
eingesetzt wird, beispielsweise in der konventionellen EIA, RIA
und FIA (z. B. Yuichi Yamamura "Ikagaku Jikken Koza, Bd. 8",
1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN Ltd., (1971); Akira Kawano
"Zusetsu Keikokotai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., (1983); und
Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai and Kiyoshi Miyai "Koso
MenekiSokuteiho", 2. Ausg., IGAKU SHOIN Ltd., (1982)), sowie
(2) konventionelle Methoden zur Modifikation und zum
Anbringen von Substanzen (z. B. Ikuzo Uritani, Kensuke
Shimura, Michinori Nakamura and Masaru Funazu "Tanpakushitsu-no
Kagakushushoku < Jo> < Ge> ", 1. Ausg., GAKKAI-SHUPPAN CENTER
Ltd., (1981)); Yuji Inada et al., "Poly(ethylene glycol)
Syushoku Tanpakushitsu" Seikagaku, Bd. 62, Nr. 11, S. 1351 ... 1362,
Japanese Biochemical Association, (1990); und George H. K.
und Mark M. M. "DNA PROBES" STOCKTON PRESS, (1989)). Die
Vereinigung des ersten Antikörpers und der
trennungverbessernden Substanz kann nach diesen Verfahren ausgeführt
werden.
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Die markierende Substanz, die an dem ersten Antikörper
nach der vorliegenden Erfindung angebracht ist (oder zur
Herstellung des zweiten Antikörpers verwendet wird) schließt
beispielsweise ein: Enzyme, wie beispielsweise alkalische
Phosphatasen, beta-Galactosidase, Peroxidase,
Mikroperoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase,
Acetylcholinesterase, Malatdehydrogenase, Luciferase, usw., die
beispielsweise in der EIA verwendet werden kann;
Radioisotope, wie beispielsweise 99mTc, ¹³¹I, ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C, ³H, usw.,
die beispielsweise in der RIA verwendet werden können;
Substanzen, die Fluoreszens emittieren, wie beispielsweise
Fluoreszens, Dansyl-Rest, Fluorescamin, Cumarin,
Naphthylamin, Derivate davon, usw., die beispielsweise in der FIA
verwendet werden können; Lumineszens-Substanzen, wie
beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol, Bis(2,4,6-
trifluorphenyl)oxalat, usw.; Substanzen, die ultraviolettes
Licht absorbieren können, wie beispielsweise Phenol,
Naphthol, Anthracen, Derivate davon, usw.; sowie Substanzen
mit Eigenschaften als Spinmarkierer, die repräsentiert
werden durch Verbindungen, die über eine Oxyl-Gruppe
verfügen, wie beispielsweise
4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-1-
oxyl, 2,6-Di-tert-butyl-alpha-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-
cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxy, usw. Es ist unnötig
darauf hinzuweisen, daß die markierende Substanz nicht auf
diese Substanzen beschränkt ist.
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Als ein Verfahren zum Markieren des ersten Antikörpers
mit der vorstehend exemplifizierten markierenden Substanz,
oder als ein Verfahren zum Markieren eines Antikörpers mit
der vorstehend exemplifizierten, markierten Substanz zur
Herstellung des zweiten Antikörpers können alle
konventionellen Verfahren zum Markieren exemplifiziert werden, die
im allgemeinen eingesetzt werden, beispielsweise in der
konventionellen EIA, RIA und FIA (z. B. Yuichi Yamamura
"Ikagaku Jikken Koza, Bd. 8", 1. Ausg., NAKAYAMA-SHOTEN
Ltd., (1971); Akira Kawano "Zusetsu Keikokotai", 1. Ausg.,
Soft Science, Inc., (1983); und Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai
und Kiyoshi Miyai "Koso Men-eki Sokuteiho", 2. Ausg., IGAKU
SHOIN Ltd., (1982)). Das Markieren kann nach diesen
Verfahren ausgeführt werden. Es ist unnötig, darauf
hinzuweisen, daß als ein Verfahren zum Markieren ein
konventionelles Verfahren unter Nutzung der Reaktion von
Avidin (Streptoavidin) mit Biotin angewendet werden kann.
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Wenn das in der vorliegenden Erfindung zu messende
Glykoprotein eine Substanz ist, die nach einem bestimmten
Verfahren selbst gemessen (detektiert) werden kann,
beispielsweise ein Enzym, so ist es selbstverständlich möglich,
einen Komplex von Glykoprotein-Analyt(e) und erstem
Antikörper (und/oder zweiten Antikörper) und Glykoprotein-
Analyt(e), der/die keinen daran befindlichen ersten
Antikörper aufweisen, durch Nutzung einer solchen Eigenschaft
des Glykoproteins selbst zu messen. Es ist unnötig, darauf
hinzuweisen, daß in diesem Fall die Messung nach einer
konventionellen Bestimmungsmethode für Enzym-Aktivität
ausgeführt werden kann.
-
Zum Trennen und Messen eines Komplexes von
Glykoprotein-Analyt(e) und erstem Antikörper (und/oder zweitem
Antikörper) und Glykoprotein-Analyt(e) mit keinem daran
befindlichen ersten Antikörper unter Nutzung der
Unter
schiede zwischen ihren Eigenschaften kann eine
konventionelle Methode der Säulenchromatographie oder eine
elektrophoretische Methode eingesetzt werden, obgleich
Hochleistungschromatographie (HPLC) oder Kapillarelektrophorese
bevorzugt eingesetzt werden, da sie schnellere und genauere
Trennungen und Messungen erlauben.
-
Wenn der Komplex mit Hilfe der HPLC getrennt und
gemessen wird, wird die Trennung mit Hilfe der HPLC unter
Verwendung einer Säule ausgeführt, die mit einer Füllung
gepackt ist, die in Abhängigkeit von dem Unterschied der
Eigenschaften zwischen dem Komplex von
Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten Antikörper (und/oder dem zweiten
Antikörper) und Gylkoprotein-Analyt(e) ohne daran
befindlichen ersten Antikörper oder in Abhängigkeit von
Eigenschaften der trennungverbessernden Substanz für den Fall
ausgewählt werden, wo diese Substanz an dem ersten
Antikörper angebracht ist. Sodann werden der abgetrennte Komplex
u. dgl. mit Hilfe einer Meßmethode gemessen, die für deren
Eigenschaft geeignet ist, oder mit einer Meßmethode, die für
die Eigenschaften der markierenden Substanz in dem zweiten
Antikörper im Fall der Verwendung eines zweiten Antikörpers
geeignet sind. Auf diese Weise wird die Menge des
beliebigen, in einer Probe zu messenden Glykoprotein-Analyten
bestimmt.
-
Hinsichtlich der in der HPLC zum Einsatz gelangenden
Packung ist es ausreichend, daß die Packung in Abhängigkeit
von dem Unterschied der Eigenschaften zwischen dem Komplex
von Glykoprotein-Analyt(e) und dem ersten Antikörper
(und/oder dem zweiten Antikörper) und Glykoprotein-
Analyt(e), die keinen daran befindlichen ersten Antikörper
haben in geeigneter Weise gewählt wird, oder in Abhängigkeit
von den Eigenschaften der trennungverbessernden Substanz.
-
Nachfolgend wird detaillierter ein Verfahren zur
Auswahl der Packung erläutert, und zwar in Abhängigkeit von
dem Unterschied der Eigenschaften zwischen dem Komplex von
Proetein-Analyt(e) und dem ersten Antikörper (und/oder dem
zweiten Antikörper) und Glykoprotein-Analyt(e) ohne einen
daran befindlichen ersten Antikörper; oder den Eigenschaften
der trennungverbessernden Substanz.
-
(1) Wenn eine Packung für die Gelfiltration verwendet wird:
-
Da die Packung zur Gelfiltration über eine Eigenschaft
zum Trennen einer Zielsubstanz von anderen Substanzen, die
gemeinsam mit ihr vorliegen, indem der Unterschied zwischen
ihnen hinsichtlich der relativen Molekülmasse genutzt wird,
kann sie über ein hohes Trennvermögen verfügen, wenn die
relative Molekülmasse des Komplexes von Glykoprotein-
Analat(e) und dem ersten Antikörper (und/oder dem zweiten
Antikörper) das 1,2-fache oder darüber und vorzugsweise das
1,5-fache oder darüber und bevorzugt das 2-fache oder
darüber der relativen Molekülmasse von Glykoprotein-
Analyt(en) beträgt, der/die keinen daran befindlichen ersten
Antikörper aufweist/aufweisen; oder wenn das Verhältnis der
relativen Molekülmasse zwischen dem ersteren und dem
letzteren auf den vorgenannten Wert eingestellt werden kann,
indem als eine trennungverbessernde Substanz eine Substanz
mit hoher relativer Molekülmasse verwendet wird, wie
beispielsweise ein Protein, synthetisches Polymer [z. B. Poly-
(ethylenglykol)] oder Poly(aminosäure). Daher wird in diesen
Fällen vorzugsweise die Packung für die Gelfiltration
verwendet.
-
Ein Verfahren zum Trennen nach dem vorstehend
ausgeführten Prinzip, bei dem eine trennungverbessernde Substanz
verwendet wird, ist besonders wirksam, wenn eine Probe, die
die zu messenden Analyten enthält, verschiedene Substanzen
enthält, die die Analyse beeinflussen können (z. B. Serum)
und die hinsichtlicher der relativen Molekülmasse sehr
unterschiedlich sind.
-
Im Detail ist es ausreichend, zur Vermeidung der
Einflüsse von Substanzen, die mit den Analyten in der Probe
gemeinsam vorliegen, ausreichen, daß die relative
Molekülmasse des Komplexes größer ist als die maximale Molekülmasse
der Substanzen, die die Analyse beeinflussen kann. Daher ist
es ausreichend, daß eine trennungverbessernde Substanz mit
einer relativen Molekülmasse gewählt wird, die diese
Bedingung erfüllt.
-
Wenn die Trennmethode unter Verwendung einer
trennungverbessernden Substanz eingesetzt wird, wird er
komplex, der den/die zu messenden Analyten enthält, in den
Hohlraumteil einer Säule eluiert, wenn es eine daran
angebrachte trennungverbessernde Substanz mit einer relativen
Molekülmasse gibt, die größer ist als die "cut-off"-Molmasse
einer Packung zur Gelfiltration ist. Die Analyse kann daher
in der kurzen Testdauer ausgeführt werden. Es ist nicht
erforderlich, in diesem Fall darauf hinzuweisen, daß die
trennungverbessernde Substanz nicht eine Substanz mit einer
einfachen relativen Molekülmasse sein muß, d. h. es ist
ausreichend, daß die trennungverbessernde Substanz eine
Substanz mit einer relativen Molekülmasse ist, die größer
ist als die "cut-off"-Molmasse einer Packung zur
Gelfiltration.
-
Die Packung für die Gelfiltration schließt
beispielsweise ein: Wakosil 5Diol-200 (eine Handelsbezeichnung, Wako
Pure Chemical Ind. Ltd.), Wakosil 5Fiol-300 (eine
Handelsbezeichnung, Wako Pure Chemical Ind., Ltd.) und TSK-Gel
(eine Handelsbezeichnung, Tosoh, Ltd.)
-
(2) Wenn eine Packung für die hydrophobe Chromatographie
verwendet wird:
-
Da eine Packung für die hydrophobe Chromatographie die
Eigenschaft hat, eine Zielsubstanz und andere zusammen mit
ihr vorhandene Substanzen unter Nutzung des Unterschieds
zwischen deren Hydrophobie zu trennen, kann sie verwendet
werden, wenn die Hydrophobie des Komplexes von Glykoprotein-
Analyt(en) und dem ersten Antikörper (und/oder dem zweiten
Antikörper) über der von Glykoprotein-Analyt(en) verschieden
ist, die keinen daran angebrachten ersten Antikörper
aufweisen, oder wenn als eine trennungverbessernde Substanz
eine Substanz verwendet wird, die eine geeignete Einstellung
der Hydrophobie des Komplexes erlaubt, beispielsweise ein
stark hydrophobes Protein (z. B. alpha-Chymotrypsinogen oder
beta-Galactosidase), ein Peptid, das eine stark hydrophobe
Aminosäure enthält, wie beispielsweise Phenylanalin oder
Prolin, ein Homopolymer einer hadrophoben Aminosäure [z. B.
Poly(phenylalanin) oder Poly(tyrosin)], eine Alkyl-Kette mit
3 bis 10 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom (z. B. Brom,
Chlor oder Iod), eine stark hydrophobe chemische Substanz
(z. B. Octylamin, EMCS oder BMH), ein Komplex einer
Fettsäure, wie beispielsweise Palmitinsäure, Oleinsäure oder
Stearinsäure.
-
Wenn als eine trennungverbessernde Substanz ein Peptid
verwendet wird, enthält das Peptid vorzugsweise eine stark
hydrophobe Aminosäure, wobei es ausreichend ist, daß die
Hydrophobie des Komplexes dadurch eingestellt wird, daß die
Kettenlänge des Peptids entsprechend gewählt wird. Wenn als
eine trennungverbessernde Substanz ein Peptid oder eine
Poly(aminosäure) verwendet werden, die aus einer hydrophoben
Aminosäure allein bestehen, beträgt die Zahl der Reste der
Aminosäure vorzugsweise 2 bis 15, da die Wasserlöslichkeit
des Peptids oder der Poly(aminosäure) gesenkt wird, wenn die
Zahl der Reste der Aminosäure größer ist als 15. Wenn als
eine trennungverbessernde Substanz ein Halogenatom verwendet
wird, kann der erste Antikörper leicht durch direkte
Halogenierung modifiziert werden, und es läßt sich die
Hydrophobie des Komplexes einstellen, indem die Menge des
eingeführten Halogens geändert wird. Zusätzlich zu den
vorstehend exemplifizierten Substanzen können als die stark
hydrophobe chemische Substanz Substanzen mit einer langen
Alkyl-Kette exemplifiziert werden. Wenn eine derartige
Substanz als eine trennungverbessernde Substanz verwendet
wird, kann die Hydrophobie des Komplexes eingestellt werden,
indem die Länge der Alkyl-Kette entsprechend gewählt wird.
-
Eine trennungverbessernde Substanz, die über eine zu
starke Hydrophobie verfügt, ist aus dem folgenden Grund
nicht wünschenswert. Da eine derartige Substanz eine geringe
Wasserlöslichkeit hat, müßte in der Reaktion des Bindens
zwischen dem ersten Antikörper und der trennungverbessernden
Substanz ein organisches Lösemittel verwendet werden, so daß
in einigen Fällen das folgende Problem hervorgerufen wird:
-
Der resultierende, modifizierte erste Antikörper wird
denaturiert oder in seiner Aktivität herabgesetzt, oder er
ist wasserunlöslich.
-
Die Packung für hydrophobe Chromatographie schließt
beispielsweise ein: Butyl-NPR (eine Handelsbezeichnung,
Tosoh, Ltd.), Butyl-MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung,
Mitsubishi Kasei Corp.) und Phenyl-MCI-Gel (eine
Handelsbezeichnung, Mitsubishi Kasei Corp.).
-
(3) Wenn eine Packung für die Ionenaustauschchromatographie
verwendet wird:
-
In diesem Fall wird eine Zielsubstanz von anderen
zusammen damit vorhandenen Substanzen abgetrennt, indem der
Unterschied zwischen ihrer Ionenstärke ausgenutzt wird.
Daher kann eine Packung für die
Ionenaustauschchromatographie dann verwendet werden, wenn die Ionenstärke des
Komplexes von Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten
Antikörper (und/oder den zweiten Antikörper) von dem/den
des/der Glykoprotein-Analyten verschieden ist, der/die
keinen daran befindlichen ersten Antikörper aufweisen, oder
wenn als eine trennungverbessernde Substanz ein basisches
Protein verwendet wird (z. B. Lysozym oder Cytochrom C), ein
saures Protein (z. B. Trypsin-Inhibitor), ein Peptid, das
einen Rest einer basischen Aminosäure enthält, wie
beispielsweise Arginin oder Lysin, oder ein Rest einer
sauren Aminosäure, wie beispielsweise Asparaginsäure oder
Glutaminsäure, eine Poly(aminosäure) mit 50 oder mehr der
vorstehend exemplifizierten Aminosäure-Reste, oder eine
Fettsäure (z. B. Palmitinsäure, Oleinsäure oder
Stearinsäure). Im allgemeinen lassen sich in der
Ionenaustauschchromatographie eine hohe Trennleistung und eine hohe
Spezifität erzielen, wenn zu messende Analyten einmal an
einer Säule adsorbiert sind und dann eluiert werden. Daher
wird vorzugsweise eine Packung für die
Kationenaustauschchromatographie oder eine Packung für die
Anionenaustauschchromatographie verwendet, wenn eine kationische
trennungverbessernde Substanz bzw. eine anionische
trennungverbessernde Substanz verwendet wird.
-
Wenn ein Peptid oder eine Poly(aminosäure), die sich
lediglich aus basischen Aminosäure-Resten zusammensetzt
(oder sauren Aminosäure-Resten), als eine
trennungverbessernde Substanz verwendet werden, kann die Elutionszeit
des Komplexes frei dadurch kontrolliert werden, daß die Zahl
der Aminosäure-Reste kontrolliert wird. Bei Verwendung eines
Peptids oder einer Poly(aminosäure), die sich normalerweise
aus 5 oder mehr, bevorzugt 50 oder mehr und mehr bevorzugt
100 oder mehr Aminosäure-Resten zusammensetzt, kann die
Elutionslage des Komplexes vollständig von derjenigen der
Lebendkörperkomponenten im Serum und Urin abgetrennt werden.
Daher wird der Einsatz eines Peptids oder Poly(aminosäure)
bevorzugt. Wenn das vorgenannte Peptid oder die vorgenannte
Poly(aminosäure) ein synthetisches Peptid oder eine
synthetische Poly(aminosäure) sind, sind die Länge und die
Ionenstärke des Peptids (oder der Poly(aminosäure))
zueinander proportional. Daher können die Elutionslagen des
Komplexes u. dgl. mühelos kontrolliert werden, indem als eine
trennungverbessernde Substanz ein Peptid (oder eine Poly-
(amiosäure)) verwendet werden, deren Länge bei ihrer
synthetischen Darstellung in geeigneter Weise kontrolliert wurden.
-
Selbst wenn eine Probe ein Vielzahl von
Serumkomponenten enthält, die die Analyse beeinträchtigen, ist es
wirksam, unter Verwendung einer trennungverbessernden
Substanz die Ionenstärke des Komplexes u. dgl. größer zu machen
als die der Serumkomponenten, um eine durch die
Serumkomponenten hervorgerufene Beeinträchtigung der Analyse zu
vermeiden. In diesem Fall kann die für die Analyse
erforderliche Zeit durch Nutzung eines Stufengradienten und
nicht eines linearen Gradienten reduziert werden.
-
Bei der Trennung des Komplexes von Glykoprotein-
Analyt(en) und erstem Antikörper (und/oder dem zweiten
Antikörper) von Glykoprotein-Analyt(en) mit keinem daran
befindlichen ersten Antikörper mit Hilfe der
Ionenaustauschchromatographie werden in einigen Fällen die zu messenden
Glykoprotein-Analyten vorzugsweise zuvor mit Sialidase
behandelt. Wenn im Detail die Zuckerkette des Glykoprotein-
Analyten einem an ihrem Ende angebrachten Sialsäure-Rest
aufweist, speziell wenn die Zuckerkette eine verzweigte
Kette mit 3 bis 4 Nebenketten und einen an ihrem Ende
angebrachten Sialsäure-Rest ist, wird in einigen Fällen die
Trennung des Komplexes von Glykoprotein-Analyt(en) und dem
ersten Antikörper (und/oder dem zweiten Antikörper) von
dem/den Glykoprotein-Analyt(en), der/die keinen ersten
Antikörper daran angebracht aufweist/aufweisen, unzureichend,
was auf den Einfluß der Carboxyl-Gruppe des Sialsäure-Restes
zurückzuführen ist. Um daher diese Schwierigkeit zu
vermeiden, wird die vorherige Behandlung mit Sialidase ausgeführt.
-
Da eine Packung für eine Ionenaustauschchromatographie
im allgemeinen über eine hohe Austauschkapazität (absolute
Beladefähigkeit für ionische Substanzen) verfügt, kann auf
der Packung die Gesamtheit des Komplexes, der eine daran
befindliche trennungverbessernde Substanz aufweist, usw.
selbst in der Analyse einer Probe adsorbiert werden, die
eine große absolute Menge ionischer Substanzen gemeinsam mit
den zu messenden Analyten enthält, wie beispielsweise eine
von einem Lebendkörper abgenommene Probe, z. B. Serum. Daher
kann dieser Komplex an einer Lage eluiert werden, bei der
der Einfluß der gemeinsam mit den Analyten vorhandenen
Substanzen weitgehend vermieden werden kann. Da die in dem
erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare trennungverbessernde
Substanz über eine hohe Wasserlöslichkeit verfügt, ist
darüber hinaus die Wasserlöslichkeit des Komplexes, der die
daran angebrachte trennungverbessernde Substanz aufweist,
größer als vor der Anbringung. In dem erfindungsgemäßen
Prozeß treten daher kaum eine Denaturierung und
Deaktivierung der zu messenden Analyten während der Bildung des
Komplexes mit der daran angebrachten trennungverbessernden
Substanz auf.
-
Die Packung für Ionenaustauschchromatographie schließt
beispielsweise Packungen für Anionenaustauschchromatographie
ein, z. B. DEAE-MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung, Mitsubishi
Kasei Corp.), QAE-MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung,
Mitsubishi Kasei Corp.), Wako Beads DEAE-Gel (eine
Handels
bezeichnung, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), POROS Q
(hergestellt von der Perseptive Biosystems), POROS PI
(hergestellt von der Perseptive Biosystems), usw.; sowie
Packungen für Kationenaustauschchromatographie, z. B. SP MCI-
Gel (eine Handelsbezeichnung, Mitsubishi Kasei Corp.), CM
MCI-Gel (eine Handelsbezeichnung, Mitsubishi Kasei Corp.),
Wako Beads CM-Gel (eine Handelsbezeichnung, Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.), POROS S (hergestellt von der
Perseptive Biosystems), POROS CM (hergestellt von der
Perseptive Biosystems), usw.
-
Obgleich der Komplex von Glykoprotein-Analyt(en) und
dem ersten Antikörper (und/oder dem zweiten Antikörper) und
Glykoprotein-Analyt(en) ohne einen daran angebrachten
Antikörper voneinander getrennt werden können und mit Hilfe der
HPLC unter Anwendung einer der vorgenannten Chromatographien
gemessen werden können, wird der Einsatz der
Ionenaustauschchromatographie in der vorliegenden Erfindung am meisten
bevorzugt. Der Grund dafür ist beispielsweise der folgende.
-
Beispielsweise sollte bei der Ausführung der Trennung
und der Messung mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie
eine Säule mit geeigneter Länge verwendet werden. Daher ist
der Einsatz der Gelfiltrationschromatographie insofern von
Nachteil, daß er eine längere Trennungszeit erfordert als
der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie. Wenn daher
eine Verringerung der Trennungszeit erforderlich ist, wird
vorzugsweise die Ionenaustauschchromatographie eingesetzt.
Darüber hinaus ist die Gelfiltrationschromatographie
insofern von Nachteil, daß sie nicht zur Trennung von Substanzen
geeignet ist, die eine sehr hohe relative Molekülmasse haben
(Größe des Moleküls: etwa 1.000 Å ((1 Å = 10&supmin;¹&sup0; m)) oder
darüber).
-
Die hydrophobe Chromatographie führt in einigen Fällen
zu dem folgenden Problem: Die Aktivität des/der
Glykoprotein-Analyten in dem Komplex geht aufgrund der Zerstörung
der Struktur höherer Ordnung des/der Glykoprotein-Analyten
durch ein bei der Trennung verwendetes organisches
Lösemittel verloren. Aus diesem Grund ist es nicht
wünschens
wert, eine stark hydrophobe Substanz als eine
trennungverbessernde Substanz zu verwenden. Darüber hinaus gibt es
ein Problem insofern, daß ein zu messender Komplex von
Analyt(en) und ein erster Antikörper mit daran angebrachter
hydrophober Substanz als eine trennungverbessernde Substanz
eine verringerte Wasserlöslichkeit hat und damit leicht
ausgefällt wird, so daß die Trennung schwierig wird.
-
Andererseits erlaubt die Ionenaustauschchromatographie
eine wirksame Trennung und Messung auf der Grundlage der
empfindlichen Differenz der Ionenstärke. Darüber hinaus kann
bei Einsatz der Ionenaustauschchromatographie eine
trennungverbessernde Substanz aus Substanzen verschiedener
Ionenstärke ausgewählt werden, so daß die Trennung und Messung
der zu messenden Glykoprotein-Analyte bei einem optimalen
pH-Wert ausgeführt werden kann. Da darüber hinaus die in der
Ionenaustauschchromatographie verwendete trennungverbessernde
Substanz selbst über eine hohe Wasserlöslichkeit verfügt,
bestehen zumeist keine Befürchtungen, was die Anbringung der
trennungverbessernden Substanz an zu messenden Analyten die
Analyten ausfällen kann. Daher läßt sich die Trennung stabil
ausführen.
-
Bei Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum
Trennen und Messen unter Verwendung einer
trennungverbessernden Substanz kann sich das Ziel-Peak durch die zu
messenden Glykoprotein-Analyten zu einer Lage verschieben,
bei der kein Einfluß von Serumkomponenten,
Harnstoffkomponenten, usw. besteht. Darüber hinaus kann auch der folgende
Effekt erhalten werden: Da die Elutionslagen von Komplexen,
die aus verschiedenen zu messenden Analyten erzeugt werden,
in Abhängigkeit von den Analyten durch geeignete Wahl einer
trennungverbessernden Substanz gleich gemacht werden können,
können die verschiedenen Analyten gemessen werden, indem die
HPLC unter den gleichen Analysebedingungen angewendet wird.
-
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Trennen und
Messen unter Verwendung eines ersten Antikörpers (und/oder
eines zweiten Antikörpers), der daran angebracht eine
markierende Substanz aufweist, wird die Menge der
markierenden Substanz, die in jedem Komplex von
Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten Antikörper (und/oder dem
zweiten Antikörper) und dem Glykoprotein-Analyt(en) ohne
einen daran angebrachten ersten Antikörper (einschließlich
Glykoprotein-Analyte mit daran angebrachten zweiten
Antikörper) enthalten ist und die voneinander mit Hilfe der HPLC
getrennt worden sind, nach einer vorbestimmten Methode auf
der Grundlage der meßbaren (detektierbaren) Eigenschaft der
markierenden Substanz bestimmt werden. Wenn die zu messenden
Glykoprotein-Analyten selbst nach einer bestimmten Methode
gemessen werden können, so wird die Menge von selbst in dem
Komplex enthaltendem Glykoprotein-Analyt(en) und die Menge
von Glykoprotein-Analyt(en) ohne einen daran angebrachten
ersten Antikörper (einschließend Glykoprotein-Analyte mit
daran angebrachten zweiten Antikörper) mit Hilfe einer
vorbestimmten Methode auf der Grundlage der meßbaren
(detektierbaren) Eigenschaft der Glykoprotein-Analyte selbst
bestimmt. Wenn die Eigenschaft der markierenden Substanz
oder der Glykoprotein-Analyte beispielsweise die
Enzymaktivität ist, so wird die Bestimmung entsprechend einer
konventionellen EIA-Methode ausgeführt, beispielsweise der
Methode, die in Tsunehiro Kitagawa, ToshioNanbara, Akio
Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho", eine
Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Kose, S.
51 ... 63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10.
September 1987, usw., beschrieben werden. Wenn die
markierende Substanz ein Radioisotop ist, so wird die Bestimmung
nach einer konventionellen RIA-Methode ausgeführt, indem in
geeigneter Weise ein Meßgerät gewählt und verwendet wird,
wie beispielsweise ein GM-Zähler, ein
Flüssigszintillationszähler, Zähler mit Probenkanal, Zählet für HPLC u. dgl.,
was von der Art und der Intensität einer von dem Radioisotop
emittierten Strahlung abhängt (siehe beispielsweise Yuichi
Yamamura, "Ikagaku Jikken Koza, Bd. 8", 1. Ausg., NAKAYAMA-
SHOTEN Ltd., (1971). Wenn es sich bei der Eigenschaft um
Fluoreszensemission handelt, wird die Bestimmung nach einer
konventionellen FIA-Methode unter Anwendung eines
Meßinstrumentes ausgeführt, wie beispielsweise einem
Fluorometer nach der beispielsweise von Akira Kawano "Zusetsu
Keikokotai", 1. Ausg., Soft Science, Inc., (1983), usw.
beschriebenen Methode. Wenn es sich bei der Eigenschaft um
Lumineszensemission handelt, so wird die Bestimmung nach
einer konventionellen Methode unter Anwendung eines
Meßinstruments wie beispielsweise einem Lichtquantenzähler
ausgeführt, z. B. nach der von Tsunehiro Kitagawa, Toshio
Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki
Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu
Kakusan Koso, S. 252 ... 263, KYORITSU-SHUPPAN Ltd.,
veröffentlicht am 10. September 1987, usw., beschriebenen
Methode. Wenn es sich bei der Eigenschaft um Absorption von
ultraviolettem Licht handelt, so wird die Bestimmung nach
einer konventionellen Methode unter Anwendung eines
Meßinstruments wie beispielsweise einem Spektrophotometer
ausgeführt. Wenn es sich bei der markierenden Substanz um
eine Substanz als Spinmarker handelt, wird die Bestimmung
nach einer konventionellen Methode unter Anwendung einer
Apparatur für die Elektronenspinresonanz ausgeführt, z. B.
nach der Methode, die von Tsunehiro Kitagawa, Toshio
Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki
Sokuteiho", eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu
Kakusan Koso, S. 264 ... 271, KYORITSU-SHUPPAN Ltd.,
veröffentlicht am 10. September 1987, usw., beschrieben wurde.
-
In der HPLC, die zum Trennen und Messen des Komplexes
von Glykoprotein-Analyt(en) und erstem Antikörper (und/oder
zweitem Antikörper) und Glykoprotein-Analyt(en) ohne daran
angebrachtem ersten Antikörper in den erfindungsgemäßen
Verfahren zum Trennen und Messen angewendet wird, kann jede
beliebige Apparatur ohne irgendein spezielles Problem
solange verwendet werden, die üblicherweise auf dem Gebiet
der Analyse verwendet wird und über eine konstante Flußrate
verfügt.
-
Ein von der HPLC verwendetes Lösemittel (ein
Eluierungsmittel) zum Trennen und Messen des Komplexes von
Glykoprotein-Analyt(en) und erstem Antikörper (und/oder
zweitem Antikörper) und Glykoprotein-Analyt(en) ohne daran
angebrachten Antikörper ist solange nicht kritisch, wie es
weder den erzeugten Komplex u. dgl. zu Glykoprotein-
Analyt(en) und Lektin (oder den ersten Antikörper) zersetzt,
noch die von einer bestimmten Methode detektierbare
Eigenschaft von dem Glykoprotein selbst oder einer
markierenden Substanz, die an dem ersten Antikörper
(und/oder dem zweiten Antikörper) angebracht ist, wegnimmt.
Als das Lösemittel wird gewöhnlich bevorzugt eine beliebige
Puffer-Lösung verwendet, die bei konventionellen Methoden
eingesetzt wird, wie beispielsweise EIA, RIA, FIA,
Affinitätschromatographie, usw. Bevorzugte spezielle Beispiele für
das Lösemittel sind Puffer-Lösungen mit einem pH-Wert von 2
bis 10, die in Abhängigkeit von den Eigenschaften des
Komplexes u. dgl. durch geeignete Wahl der folgenden
Materialien zubereitet werden, wonach Zugabe und Mischen
folgen: z. B. Puffer, wie beispielsweise Phosphate, Acetate,
Citrate, Good-Puffer, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, usw.;
Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Ammoniumsulfat, usw.; polare organische Lösemittel, wie
beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril,
Tetrahydrofuran, usw.; sowie Tenside.
-
In den erfindungsgemäßen Verfahren zum Trennen und
Messen wird vorzugsweise zum Messen des Komplexes
Glykoprotein-Analyt(en) und dem ersten Antikörper (und/oder
dem zweiten Antikörper) und Glykoprotein-Analyt(en) ohne
einen daran befindlichen ersten Antikörper nach deren
Trennung durch HPLC vorzugsweise die Methode eingesetzt, die
das Einführen eines Abflusses aus einer HPLC-Säule in einen
Detektionssektion in der vorliegenden Form umfaßt, sowie
direktes Messen der Menge des Glykoproteins selbst oder
einer an dem ersten Antikörper (und/oder dem zweiten
Antikörper) befindlichen markierenden Substanz, die in dem
Komplex u. dgl. im Abfluß enthalten ist, wie beispielsweise
die von Shoji Hara und Akio Tsuji "Newest Liquid
Chromatography", 1. Ausg., S. 92 ... 104, NANZANDO Ltd.,
veröffentlicht am 1. Februar 1978, beschriebene Methode.
-
Wenn die mit Hilfe einer bestimmten Methode detektierbare
Eigenschaft des Glykoproteins selbst oder der markierenden
Substanz, die sich an dem ersten Antikörper befindet
(und/oder dem zweiten Antikörper), die in dem Komplex u. dgl.
enthalten ist, beispielsweise die Enzymaktivität ist, so
sollte in diesem Fall eine Reaktionssektion der sogenannten
säulennachgeschalteten Methode, in der ein Reagens zum
Messen der Enzymaktivität dem Abfluß zur Reaktion mit ihm
hinzugefügt wird, selbstverständlich zwischen der HPLC-Säule
und der Detektionssektion vorgesehen werden. Als die
Reaktion zum Messen der Enzymaktivität, die in der
Reaktionssektion verwendet wird, wenn es sich bei der
Eigenschaft um die Enzymaktivität handelt, kann ein Reagens
verwendet werden, das nach einer konventionellen Methode
hergestellt wird, beispielsweise einer Methode auf der
Grundlage des Inhalts von Tsunehiro Kitagawa, Toshio
Nanbara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa "Koso Men-eki Sokuteiho",
eine Extraausgabe Nr. 31 von Tanpakushitsu Kakusan Koso, S.
51 ... 63, KYORITSU-SHUPPAN Ltd., veröffentlicht am 10.
September 1987, usw.; oder es kann ein geeignet ausgewähltes
und verwendetes Reagens eines kommerziell verfügbaren
Meßsatzes für die klinische Untersuchung verwendet werden.
Zwischen der HPLC-Säule und der Detektionssektion kann auch
dann eine geeignete Reaktionssektion vorgesehen werden, wenn
die Eigenschaft eine andere als die Enzymaktivität ist, um
ein vorbestimmtes Reagens zum Zwecke der Erhöhung der
Detektionsempfindlichkeit zuzusetzen und reagieren zu
lassen.
-
Wenn im Fall der Anwendung der HPLC in dem
erfindungsgemäßen Verfahren zum Trennen und Messen eine Vielzahl
von Abflüssen verwendet wird, die hinsichtlich ihrer
Komponenten unterschiedlich sind, kann die Elution entweder
nach der Methode des Konzentrationsgradienten (eine lineare
Gradienten-Methode) ausgeführt werden oder nach einer
schrittweisen Methode. Allerdings ist die schrittweise
Methode beispielsweise insofern von Vorteil, daß sie mit
leichten Operationen ausgeführt werden kann, die
tatsächliche Analysenzeit verringern kann und einen scharfen
Ziel-Peak gibt.
-
Es ist unnötig, darauf hinzuweisen, daß das
erfindungsgemäße Verfahren zum Trennen und Messen auf Methoden des
Immunoassays zur Anwendung gelangen kann, wie beispielsweise
die konventionellen EIA, RIA, FIA, usw.
-
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend konkreter
unter Bezugnahme auf die "Beispiele" erläutert, die zur
Veranschaulichung dienen und in keiner Weise einschränkend
sind.
Beispiel 1
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Trennung und Messung auf der Grundlage der AFP-
Zuckerkette unter Verwendung von Lens culinaris-Lektin
(LCA)-A
-
[Lektin-Lösung]
-
Als eine Lektin-Lösung wurde eine Lösung verwendet, die
durch Auflösen von LCA-A (verfügbar bei Honen Corporation)
in 50 mMol 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-Puffer
(pH 7,5) zu einer Konzentration von 1 mg/ml zubereitet
wurde.
-
[erste Antikörper-Lösung]
-
Es wurde Anti-AFP monoklonaler Antikörper (verfügbar
bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), von dem nach
nachgewiesen wurde, daß er über eine Eigenschaft des Bindens an
allen AFP's verfügt, jedoch vom Binden an AFP's abgehalten
wird, die ein daran befindliches LCA-A haben, zu Fab' nach
einer konventionellen Methode verarbeitet. Es wurde eine
Poly(asparaginsäure) (mittlere relative Molekülmasse:
28.800; hergestellt von der Sigma Chemical Co.) an das Fab'
mit Hilfe einer konventionellen Methode unter Verwendung von
N-(8-Maleinimidocapryloxy)-sulfosuccinimid (hergestellt von
DOJINDO LABORATORIES) als ein zweiwertiges Vernetzungsmittel
angebracht, um ein Anti-AFP-Fab' mit daran befindlicher
Poly(asparaginsäure) (Fab'-pAsp) zu erhalten. Dieses Fab'-
pAsp wurde zu 50 mMol MOPS-Puffer (pH 7,5) zu einer
Konzentration von 13,5 Mikromol zugesetzt, wodurch einer
erste Antikörper-Lösung erhalten wurde.
-
[zweite Antikörper-Lösung]
-
Es wurde Anti-AFP monoklonaler Antikörper (verfügbar
bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), von dem
nachgewiesen wurde, daß er über eine Antigen-Erkennungsstelle
verfügt, die von der des zur Zubereitung der ersten
Antikörper-Lösung verwendeten Antikörpers verschieden ist,
sowie über eine Eigenschaft des Bindens an allen AFP's und
ebenfalls eine Fähigkeit zum Binden an AFP's mit daran
befindlicher LCA-A, zu Fab' nach einer konventionellen
Methode verarbeitet. Es wurde Meerrettich-Peroxidase (POD,
verfügbar bei der Toyobo Co., Ltd.) an das Fab' mit Hilfe
einer konventionellen Methode unter Verwendung von N-(8-
Maleinimidocapryloxy)sulfosuccinimid (hergestellt von der
DOJINDO LABORATORIES) als ein zweiwertiges Vernetzungsmittel
angebracht, um POD-markiertes Anti-AFP-Fab' zu erhalten. Das
POD-markierte Anti-AFP-Fab' wurde zu 50 mMol MOPS-Puffer (pH
7,5) zu einer Konzentration von 100 nMol zugesetzt, wodurch
eine zweite Antikörperlösung erhalten wurde.
-
[Probelösungen]
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Jede der AFP vom Typ mit angebrachter LCA-A (AFP vom
Leberzellkarzinom-Typ) und AFP vom Typ mit nichtangebrachter
LCA-A (AFP vom normalen Typ) wurde zu 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 0,2 Prozent (Gewicht/Volumen)
Rinderserumalbumin) zu einer Konzentration von 100 ng/ml
zugesetzt, wodurch eine AFP-Lösung vom Leberzellkarzinom- bzw.
eine AFP-Lösung vom normalen Typ hergestellt wurde. Die
Probenlösungen wurden durch Mischen der zwei AFP-Lösungen
jeweils den in Tabelle 1 beschriebenen Verhältnissen
angesetzt.
Tabelle 1
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* Die Werte in Tabelle 1 geben die prozentualen
Mischungsanteile (Prozent) der einzelnen Lösungen an.
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[HPLC-Bedingungen]
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Eine schematische Darstellung, die ein HPLC-System
zeigt, ist in Fig. 3 gegeben.
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- Säule: WAKOPAK MCI CQA-31S
(4,6 mm ID · 10 mm)
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- Eluierungsmittel A: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 50 mMol NaCl)
-
- Eluierungsmittel B: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 1 Mol NaCl)
-
- Substratlösung: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 100 mMol
3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure
und 20 mMol H&sub2;O&sub2;)
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- Gradient: 0-5 Minuten
Eluierungsmittel B 0 Prozent
5-8 Minuten
Eluierungsmittel A 20 Prozent
8-12 Minuten
Eluierungsmittel B 80 Prozent
-
- Flußrate: Eluierungsmittel A + B 1 ml/min.
Substratlösung 0,1 ml/min.
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- Heizspulentemperatur: 55ºC
-
- Fluoreszenz-Detektion: Anregungswellenlänge 320 nm
Emissionswellenlänge 404 nm
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[Meßprozedur]
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Zu einer gemischten Lösung von 200 Mikroliter der
Lektin-Lösung und 10 Mikroliter der zweiten Antikörper-
Lösung wurden 10 Mikroliter jeweils der vorbestimmten
Probenlösung zugesetzt und die Reaktion bei 10ºC für 15
Minuten ausgeführt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10
Mikroliter der ersten Antikörper-Lösung zugesetzt und die
Reaktion für weitere 2 Minuten fortgesetzt. Danach wurden
100 Mikroliter des so erhaltenen Reaktionsgemischs mit Hilfe
der HPLC analysiert.
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[Ergebnisse]
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Fig. 1 zeigt ein Trennungsprofil, das mit Hilfe der
HPLC erhalten wurde. In Fig. 1 ist das Peak von einem AFP,
das über keinen daran befindlichen ersten Antikörper
verfügt, und Peak 2 ist von einem AFP mit einem daran
befindlichen ersten Antikörper.
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Fig. 2 zeigt Peak-Flächenwerte von jedem der Peaks 1
und 2, die von jeder Probenlösung erhalten wurden, sowie die
Summe der zwei Peak-Flächenwerte, die dem Mischverhältnis
zwischen der AFP-Lösung vom Leberzellkarzinom-Typ und der
AFP-Lösung vom normalen Typ in jeder der Probenlösung
entspricht. In Fig. 2 zeigen die Vierecke den Flächenwert
von Fig. 1 + den Flächenwert von Peak 2 und die Rhomben
zeigen die Summe der Peakflächen von Peak 1 und Peak 2.
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Aus den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen ist das
folgende klar. Der Flächenwert von Peak 1 nimmt proportional
mit der Zunahme der Menge der AFP-Lösung vom
Leberzellkarzinom-Typ in den Probelösungen zu, und der Flächenwert
von Peak 2 nimmt proportional mit der Abnahme der Menge der
AFP-Lösung vom normalen Typ in den Probelösungen ab, wobei
die Summe der Flächenwerte von Peak 1 und 2 in den
verschiedenen Probelösungen weitgehend konstant ist. Mit
anderen Worten, können unter Nutzung dieser zwei
Peakflächenwerte die Mengen des in jeder Probelösung enthaltenen
AFP vom Leberzellkarzinom-Typ und die
AFP-Gesamtkonzentration in der Probenlösung gleichzeitig bestimmt werden.
Beispiel 2
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Änderung des Meßwertes der Fucose-Zusatzrate von AFP
durch Sialidase-Behandlung
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[Sialidase-Lösung]
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Als eine verwendete Sialidase-Lösung wurde eine Lösung
durch Auflösen von Sialidase (verfügbar bei Toyobo Co.,
Ltd.) in 50 mMol MOPS-Puffer (pH 7,5) zu einer Konzentration
von 200 U/ml zubereitet.
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[Lektin-Lösung]
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Als eine verwendete Lektin-Lösung wurde eine Lösung
durch Auflösen von Lenz culinaris-Lektin (LCA)-A (verfügbar
bei Honen Corporation) in 50 mMol MOPS-Puffer (pH 7,5) zu
einer Konzentration von 1 mg/ml zubereitet.
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[Antikörper-Lösung 1]
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Es wurde Anti-AFP monoklonaler Antikörper (verfügbar
bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) kompetitiv mit LCA-
A zu Fab' nach einer konventionellen Methode verarbeitet. Es
wurde eine Poly(asparaginsäure) (mittlere relative
Molekülmasse: 28.800, hergestellt von der Sigma Chemical Co.) an
das Fab' nach einer konventionellen Methode unter Verwendung
von N-(8-Maleinimidocapryloxy)-sulfosuccinimid (hergestellt
von DOJINDO LABORATORIES) als ein zweiwertiges
Vernetzungsmittel angebracht, um Anti-AFP-Fab' mit daran angebrachter
Poly(asparaginsäure) (Fab'-pAsp) zu erhalten. Dieses Fab'-
pAsp wurde zu 50 ml MOPS-Puffer (pH 7, 5) zu einer
Konzentration von 13,5 Mikromol zugesetzt, wodurch eine erste
Antikörper-Lösung erhalten wurde.
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[Antikörper-Lösung 2]
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Es wurde Anti-AFP monoklonaler Antikörper (verfügbar
bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) nonkompetitiv mit
dem zur Herstellung einer Antikörper-Lösung 1 verwendeten
Antikörper Fab' nach einer konventionellen Methode
verarbeitet. Dieses Fab' wurde mit Meerrettich-Peroxidase (POD,
verfügbar bei Sigma Chemical Co.) nach einer konventionellen
Methode unter Verwendung von N-(8-Maleinimidocapryloxy)-
sulfosuccinimid (hergestellt von DOJINDO LABORATORIES) als
ein zweiwertiges Vernetzungsmittel markiert, um
POD-markiertes Anti-AFP-Fab' zu erhalten. Das POD-markierte Anti-
AFP-Fab' wurde zu 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,5) zu einer
Konzentration von 100 nMol zugesetzt, wodurch Antikörper-
Lösung 2 erhalten wurde.
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[Probelösungen]
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Drei Serumproben von Patienten mit Leberzellkarzinom,
in denen die Frucose-Zusatzrate zuvor mit Hilfe einer
Lektin-Gelelektrophorese-Methode unter Verwendung eines AFP-
Lektin-Fraktionierungssatzes L (verfügbar bei Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.,)(die Operationen wurden nach der
in einem Handbuch beschriebenen Standardprozedur ausgeführt,
das dem Meßsatz beigefügt war) gemessen wurde, mit 50 mMol
MOPS-Puffer (pH 7,5, enthaltend 0,2 Prozent
Rinderserumalbumin) zur Einstellung der AFP-Konzentration auf 100 ng/ml
verdünnt. Die so erhaltenen Verdünnungen wurden als
Probelösungen 1, 2 und 3 verwendet.
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[HPLC-Bedingungen]
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Eine schematische Darstellung, die den Umriß eines
HPLC-System zeigt, ist in Fig. 3 gegeben.
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- Säule: WAKOPAK MCI CQA-31S
(4,6 mm ID · 10 mm, hergestellt von
der Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.)
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- Eluierungsmittel A: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 50 mMol NaCl)
-
- Eluierungsmittel B: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 1 Mol NaCl)
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- Substratlösung: 50 mMol MOPS-Puffer
(pH 7,5, enthaltend 100 mMol
3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure
und 20 mMol H&sub2;O&sub2;)
-
- Gradient: 0-5 Minuten
Eluierungsmittel B 0 Prozent
5-8 Minuten
Eluierungsmittel A 20 Prozent
8-12 Minuten
Eluierungsmittel B 80 Prozent
-
- Flußrate: Eluierungsmittel A + B 1 ml/min.
Substratlösung 0,1 ml/min.
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- Heizspulentemperatur: 55ºC
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- Fluoreszenz-Detektion:
Anregungswellenlänge 320 nm
Emissionswellenlänge 404 nm
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[Meßprozedur]
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Nachdem 10 Mikroliter der Sialidase-Lösung, 100
Mikroliter der Lektin-Lösung, 5 Mikroliter der Antikörper-Lösung
2 und 10 Mikroliter jeder der vorbestimmten Probelösungen
gemischt waren, wurde die Reaktion bei 10ºC für 3 Minuten
ausgeführt. Dem Reaktionsgemisch wurden 10 Mikroliter
Antikörper-Lösung 1 zugesetzt und die Reaktion für weitere 4
Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Nach Beendigung Reaktion
wurden 100 Mikroliter des Reaktionsgemisches mit Hilfe der
HPLC unter den vorgenannten Bedingungen analysiert.
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Das bedeutet, für jede Probelösung wurde die Fläche von
Peak 1 (der Peak von AP ohne einen daran befindlichen ersten
Antikörper) und die Fläche von Peak 2 (der Peak von AFP mit
daran befindlichem ersten Antikörper) erhalten, um das Peak
1-Verhältnis (Prozent) unter Verwendung der folgenden
Gleichung zu ergeben:
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Peak 1-Verh. (%) = (Peak 1-Fläche) / (Summe d. Peak 1-Fläche und 2-Fläche) · 100
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Ferner wurde die vorgenannte Reaktion ausgeführt unter
Verwendung der vorgenannten Lösungen mit der Ausnahme der
Verwendung von 50 mMol MOPS-Pufferlösung (pH 7,5, enthaltend
0,2 Prozent (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin), die 100
ng/ml AFP mit einer Fucose-Zusatzrate von 0 Prozent oder AFP
mit einer Fucose-Zusatzrate von 100 Prozent anstelle der
Probelösungen. Die Fucose-Zusatzrate wurde unter Verwendung
des AFP-Lektin-Fraktionierungssatzes-L erhalten (verfügbar
bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Die resultierenden
Reaktionslösungen wurden mit Hilfe der HPLC unter den
gleichen Prozeduren wie vorstehend ausgeführt analysiert.
Für die einzelnen Probelösungen wurden die Peak 1-Flächen
und Peak 2-Flächen erhalten, um die Peak 1-Verhältnisse
(Prozent) unter Verwendung der vorgenannten Formel zu
ergeben. Aus den erhaltenen Daten wurde eine Kalibrierungskurve
erhalten, die die Beziehung zwischen den Peak
1-Verhältnissen und den Fucose-Zusatzraten zeigt. Indem die für die
Probelösungen 1, 2 und 3 erhaltenen Peak 1-Verhältnisse auf
die Kalibrierungskurve angewandt wurden, wurden die Fucose-
Zusatzraten von AFP in den Probelösungen erhalten.
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Ebenfalls wurde ein Reaktionsgemisch, das durch
Ausführung der gleichen Reaktionen wie vorstehend unter
Verwen
dung der gleichen Lösung wie vorstehend mit der Ausnahme der
Verwendung von 10 Mikroliter 50 mMol MOPS-Puffer (pH 7,5)
anstelle von 10 Mikroliter der Sialidase-Lösung erhalten
wurde, mit Hilfe der HPLC unter den vorgenannten Bedingungen
analysiert. Die Fukose-Zusatzraten von AFP in den
Probelösungen wurden ebenfalls erhalten.
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[Ergebnisse]
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Als Werte für die Fucose-Zusatzrate in den
Probelösungen 1 bis 3 werden in Tabelle 2 zusammen diejenigen
gezeigt, die mit Hilfe der Lektin-Gelelektrophorese-Methode
erhalten wurden, und diejenigen, die mit Hilfe des
vorstehend ausgeführten, erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten
wurden.
Tabelle 2
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Aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen ist klar,
daß die Entfernung des Zuckerrests an dem nichtreduzierenden
Ende der AFP-Zuckerkette mit Hilfe der Sialidase-Behandlung
mit hoher Genauigkeit eine schnelle Bestimmung der AFP-Menge
erlaubt, der Fucose zugesetzt wurde.
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Wie aus der vorstehenden Ausführung klar hervorgeht,
gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren, mit dem es
möglich ist, den Grad einer Strukturänderung der Zuckerkette
von Glykoprotein mit hoher Genauigkeit schnell und leicht zu
messen, die von einer Erkrankung hervorgerufen wird. Die
Anwendung dieses Verfahrens ist insofern effektiv, daß dadurch
möglich wird, der Krebsdiagnose u. dgl. neue Informationen
bereitzustellen, bei der Grad der Strukturänderung der
Zuckerkette von Glykoprotein genutzt wird. Daher trägt die
vorliegende Erfindung wesentlich zum Stand der Technik bei.