JP5202327B2 - プロリルヒドロキシラーゼ阻害活性を示すキノロンベースの化合物、およびこの組成物、およびこの使用 - Google Patents

Description

細胞転写因子ＨＩＦ（低酸素誘導性因子）は、広範な生物の酸素恒常性において中心的な位置を占め、および低酸素に対する応答の鍵となる調節因子である。ＨＩＦ転写活性によって調節される遺伝子は、血管形成、赤血球生成、ヘモグロビンＦ産生、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能、アポトーシス、および細胞増殖において決定的な役割を果たし得る。ＨＩＦはまた、これが一般的には上方制御される癌において、ならびに虚血および低酸素に対する病態生理学的応答において、役割を果たし得る。

ＨＩＦ転写複合体はαβヘテロダイマーを含む：ＨＩＦ−βは、酸素調節されるＨＩＦ−αサブユニットとともに二量体化する構成的核タンパク質である。酸素調節は、ＨＩＦ−αサブユニットの水酸化を通して起こり、次いでこれは、プロテアソームによって急速に破壊される。酸素化細胞においては、フォン・ヒッペル−リンダウ腫瘍抑制タンパク質（ｐＶＨＬ）が水酸化ＨＩＦ−αサブユニットに結合し、これによって、これらのユビキチン依存性タンパク質分解を促進する。このプロセスは低酸素条件下で抑制され、ＨＩＦ−αを安定化し、およびＨＩＦαβ複合体による転写活性化を促進する。例えば、米国特許第６，７８７，３２６号を参照されたい。

ＨＩＦ−αサブユニットの水酸化はプロリン残基およびアスパラギン残基上で起こり得、ならびにこれは２−オキソグルタル酸依存性酵素のファミリーによって媒介され得る。このファミリーには、ヒトＨＩＦ１αのＰｒｏ４０２およびＰｒｏ５６４を水酸化するＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼアイソザイム（ＰＨＤ）、ならびにヒトＨＩＦ１αのＡｓｎ８０３を水酸化する、ＨＩＦを阻害する因子（ＦＩＨ）が含まれる。ＦＩＨまたはＰＨＤの阻害は、ＨＩＦ安定化および転写活性化に導く。例えば、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ ５，３４３−３５４ページ（２００４）を参照されたい。

式Ｉ：

の化合物から選択される少なくとも１種の化合物、この医薬的に許容される塩、この溶媒和物、このキレート、この非共有結合複合体、このプロドラッグ、および前述の任意の混合物が本発明で提供され、式中、
ｎは１から６であり；
Ｒ_１はＨ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_２はＨ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、Ｈ、低級アルキル、置換低級アルキル、低級ハロアルキル、置換低級ハロアルキルから選択され、または、Ｒ_３およびＲ_４は、一緒に結合して、３から６員環もしくは置換された３から６員環を形成可能であり；
Ｒ_５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルコキシ、置換低級アルコキシ、およびスルファニルから選択され；
Ｒ_６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＨＳＯ_２Ｒ_１、およびスルホニルから選択され；
Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ＮＲ_３Ｒ_４、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＯＲ_１３、ＳＲ_１３、ＳＯ_２Ｒ_１３、ＣＮ、ＮＯ_２、ハロ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキルシリル、置換アルキルシリル、アルキニルシリル、置換アルキニルシリル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、および−Ｘ−Ｒ_１２から独立して選択され、ここで：
Ｒ_３およびＲ_４は上記に定義した通りであり；
Ｘは−Ｎ（Ｒ_１１）−Ｙ−および−Ｙ−Ｎ（Ｒ_１１）−から選択され；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）、ＳＯ_２、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、および置換アルキニレンから選択され；
Ｒ_１１は、Ｈ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_１２は、Ｈ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから選択され；ならびに
Ｒ_１３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、およびＮＲ_３Ｒ_４から選択され；
ここで、少なくとも１つの隣接する対のＲ_６およびＲ_７、Ｒ_７およびＲ_８、Ｒ_８およびＲ_９、Ｒ_９およびＲ_１０、ならびにＲ_１０およびＲ_１は、一緒に結合して、４から７員環もしくは置換された４から７員環を形成可能である。

少なくとも１種の医薬的に許容される担体、および本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量を含む薬学的組成物もまた、本発明で提供される。

赤血球形成刺激剤または化学療法剤などの少なくとも１種のさらなる化合物と組み合わせた、少なくとも１種の医薬的に許容される担体、および本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量を含む薬学的組成物がさらに提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することによって、被験者におけるＨＩＦのレベルまたは活性を増加させる方法が、加えて本発明で提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、ＨＩＦの活性を調節することが所望される状態を治療する方法がさらに提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、被験者における低酸素または虚血関連障害を治療する方法もまた提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、被験者における貧血を治療する方法もまた提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物と細胞を接触させる工程を含む、細胞中のＨＩＦの量を調節する方法がさらに提供される。

加えて、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、被験者におけるヘモグロビンＦの量を増加させる方法が提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、被験者における血管形成を調節する方法もまた提供される。

加えて、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、このような治療の必要がある患者における少なくとも１つの疾患を治療する方法が提供される。

本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、被験者におけるＨＩＦ水酸化を阻害する方法もまた提供される。

希土類元素で標識されたＶＣＢ複合体と蛍光色素標識ＨＩＦ１αポリペプチドまたはこのフラグメントを温置する工程、および均質時間分解ＦＲＥＴによりＨＩＦ１αへのＶＣＢ複合体の結合を検出する工程を含む、ＨＩＦ１αヒドロキシプロリン残基の検出のためのアッセイがさらに提供される。

ルテニウムで標識されたＶＣＢ複合体とＨＩＦαポリペプチドまたはこのフラグメントを温置する工程、および電気化学発光によってＨＩＦ１αへのＶＣＢ複合体の結合を検出する工程を含む、ＨＩＦ１αヒドロキシプロリン残基の検出のためのアッセイもまた提供される。

本発明のさらなる実施形態は以下に続く説明に示され、または本発明の実施によって習され得る。

他に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、反応条件などを表現するすべての数は、すべての例において「約」という用語によって修飾されると理解される。従って、反対に示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値のパラメーターは、これらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差に依存して変動し得る概算値である。

本明細書で使用される場合、任意の変数が化学式の中で１回より多く存在するならば、各存在についてのこの定義は、すべての他の存在におけるこの定義とは独立している。化学構造および化学名が矛盾する場合には、化学構造がこの化合物の同一性を決定する。本開示の化合物は、１個以上のキラル中心および／または二重結合を含むことができ、それゆえに、二重結合異性体（即ち、幾何異性体）、エナンチオマー、またはジアステレオマーなどの立体異性体として存在し得る。従って、相対的な配置を用いて全体的にまたは部分的に示される、本明細書の範囲内の任意の化学構造は、立体異性体的に純粋な型（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマー混合物および立体異性体混合物を含む、図示した化合物のすべての可能なエナンチオマーおよび立体異性体を包含する。エナンチオマー混合物および立体異性体混合物は、当業者に周知である分離方法またはキラル合成方法を使用して、成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分割することができる。

化学式Ｉの化合物には、化学式Ｉの化合物の光学異性体、このラセミ化合物、およびその他の混合物が含まれるがこれらに限定されない。これらの状況において、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマー、即ち、光学活性型は、不斉合成によってまたはラセミ化合物の分割によって得ることができる。ラセミ化合物の分割は、例えば、分割剤の存在下で結晶化などの従来の方法によって、またはクロマトグラフィー、例えば、キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムを使用して達成することができる。加えて、化学式Ｉの化合物には、二重結合を有する化合物のＺ型およびＥ型（またはシス型およびトランス型）が含まれる。化学式Ｉの化合物が種々の互変異性型で存在する場合、本発明の化学的実体には、この化合物のすべての互変異性型が含まれる。

本発明の化合物には、化学式Ｉの化合物およびこのすべての医薬的に許容される型が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に引用される化合物の医薬的に許容される型には、医薬的に許容される塩、溶媒和物、結晶型（多形体および包接化合物を含む）、キレート、非共有結合複合体、プロドラッグ、およびこれらの混合物が含まれる。特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物は、医薬的に許容される塩の型である。以下で使用されるように、「化合物」という用語には、この化合物自体のみならず、この医薬的に許容される塩、この溶媒和物、このキレート、この非共有結合複合体、このプロドラッグ、および前述の任意の混合物もまた包含される。

上記に述べたように、プロドラッグ、例えば、化学式Ｉの化合物のエステルまたはアミド誘導体もまた、化学的実体の範囲内に含まれる。「プロドラッグ」という用語には、患者に投与されるとき、例えば、プロドラッグの代謝的処理の際に、化学式Ｉの化合物になる任意の化合物が含まれる。プロドラッグの例には、化学式Ｉの化合物の中にある官能基（アルコール基またはアミン基など）の、酢酸塩、ギ酸塩、および安息香酸塩などの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。

「溶媒和物」という用語は、溶媒および化合物の相互作用によって形成される化合物をいう。適切な溶媒和物は、一水和物および半水化物を含む水和物などの医薬的に許容される溶媒和物である。

「アルケニル」とは、親のアルケンの単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって誘導される少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する不飽和の分枝鎖、直鎖、または環状のアルキル基をいう。この基は、二重結合に関して、Ｚ型およびＥ型（またはシス型またはトランス型の立体配座）のいずれかであり得る。代表的なアルケニル基には以下が含まれるがこれらに限定されない。エテニル；プロペニル、例えば、プロプ−１−エン−１−イル、プロプ−１−エン−２−イル、プロプ−２−エン−１−イル（アリル）、プロプ−２−エン−２−イル、シクロプロプ−１−エン−１−イル；シクロプロプ−２−エン−１−イル；ブテニル、例えば、ブト−１−エン−１−イル、ブト−１−エン−２−イル、２−メチル−プロプ−１−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−１−イル、ブト−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブト−１−エン−１−イル、シクロブト−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イルなど。特定の実施形態において、アルケニル基は２から２０個の炭素原子を有し、他の実施形態において、２から６個の炭素原子、即ち、「低級アルケニル」を有する。

「アルキニル」とは、親のアルキンの単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって誘導される少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する不飽和の分枝鎖または直鎖をいう。代表的なアルキニル基には以下が含まれるがこれらに限定されない。エチニル；プロピニル；ブテニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニルなど。特定の実施形態において、アルキニル基は２から２０個の炭素原子を有し、他の実施形態において、２から６個の炭素原子、即ち、「低級アルキニル」を有する。

「アルコキシ」とは、−ＯＲ基（Ｒが、本明細書に定義されるようなアルキル基、置換アルキル基、置換シクロアルキル基、置換ヘテロシクロアルキル基、置換アリール基、または置換ヘテロアリール基を表す。）をいう。代表的な例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロヘキシルオキシなどが含まれるがこれらに限定されない。

「アルコキシカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ基（Ｒが本明細書に定義される通りである。）をいう。

「アルキル」とは、親のアルカンの単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって誘導される飽和分枝鎖または直鎖の一価の炭化水素基をいう。代表的なアルキル基には以下が含まれるがこれらに限定されない。メチル、エチル、プロピル、例えば、プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、およびシクロプロパン−１−イル、ブチル、例えば、ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチル−プロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ｔｅｒｔ−ブチルなど。特定の実施形態において、アルキル基は１から２０個の炭素原子を含む。本明細書で使用される場合、「低級アルキル」という用語は、１から６個の炭素原子を含むアルキル基をいう。

「アリール」とは、親の芳香族環系の単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって誘導される一価の芳香族炭化水素基をいう。アリールには、５員および６員の炭素環芳香環、例えば、ベンゼン；少なくとも１個の環が炭素環および芳香族、例えば、ナフタレン、インダン、およびテトラリンである二環式環系；ならびに少なくとも１個の環が炭素環および芳香族、例えば、フルオレンである三環式環系が包含される。例えば、アリールには、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個以上のヘテロ原子を含む５から７員環ヘテロシクロアルキル環に縮合した５および６員環炭素環芳香環が含まれる。特定の実施形態において、アリール基は、６から１０個の炭素原子を含むことができる。しかし、アリールは、多少なりとも、以下に別々に定義されるヘテロアリールを包含せず、またはこれと重複しない。従って、１個以上の炭素環芳香族環がヘテロシクロアルキル芳香族環と縮合する場合、生じる環系はヘテロアリールであり、本明細書に定義されるようなアリールではない。

「アリールアルキル」または「アラルキル」とは、炭素原子に結合した１個の水素原子、典型的には、末端またはｓｐ_３炭素原子が、アリール基で置き換えられている非環式アルキル基をいう。代表的なアリールアルキル基には、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが含まれるがこれらに限定されない。特定のアルキル部分が意図される場合、命名法アリールアルキル、アリールアルケニル、および／またはアリールアルキニルが使用される。特定の実施形態において、アリールアルキル基は（Ｃ_６−３０）アリールアルキルであり得、例えば、アリールアルキル基のアルキル基は（Ｃ_１−１０）であり得、アリール部分は（Ｃ_５−２０）であり得る。

「カルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）基をいう。

「カルボキシ」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基をいう。

「シアノ」とは、−ＣＮ基をいう。

「シクロアルキル」とは、飽和または不飽和の環状アルキル基をいう。特定のレベルの飽和が意図される場合、命名法「シクロアルカニル」または「シクロアルケニル」が使用される。代表的なシクロアルキル基には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどから誘導された基が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、シクロアルキル基は、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、例えば、Ｃ_３−６シクロアルキル基などであり得る。

「ヘテロシクロアルキル」とは、１個以上の炭素原子（および任意の付随する水素原子）が、適切な場合、同じまたは異なるヘテロ原子およびこの付随する水素原子で独立して置き換えられている、飽和または不飽和の、しかし芳香族ではない、環状アルキル基をいう。炭素原子を置き換えるための代表的なヘテロ原子には、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、およびＳｉが含まれるがこれらに限定されない。特定のレベルの飽和が意図される場合、命名法「ヘテロシクロアルカニル」または「ヘテロシクロアルケニル」が使用される。代表的なヘテロシクロアルキル基には、エポキシド、イミダゾリジン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、キヌクリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピランなどから誘導される基が含まれるがこれらに限定されない。置換ヘテロシクロアルキルには、１個以上のオキソ（＝Ｏ）またはオキシド（−Ｏ⁻）置換基、例えば、ピペリジニルＮ−オキシド、モルホリニル−Ｎ−オキシド、１−オキソ−１−チオモルホリニル、および１，１−ジオキソ−１−チオモルホリニルで置換された環系もまた含まれる。

「疾患」とは、任意の疾患、障害、状態、徴候、または指標をいう。

「ハロ」とは、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、またはヨード基をいう。

「ヘテロアリール」とは、親のヘテロ芳香族環系の単一の原子からの１個の水素原子の除去によって誘導される一価ヘテロ芳香族基をいう。ヘテロアリールは以下を包含する。

Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個以上の、例えば、１から４個の、または特定の実施形態においては、１から３個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である、５から７員芳香族の単環；ならびに
Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個以上の、例えば、１から４個の、または特定の実施形態においては、１から３個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素であり、少なくとも１個のヘテロ原子が芳香環中に存在する、多環式ヘテロシクロアルキル環。

例えば、ヘテロアリールには、５から７員環シクロアルキル環に縮合した５から７員環ヘテロ芳香族環、および５から７員環ヘテロシクロアルキル環に縮合した５から７員環ヘテロ芳香族環が含まれる。１個のみの環が１個以上のヘテロ原子を含む、このような縮合二環式ヘテロアリール環系については、結合点はヘテロ芳香族環またはシクロアルキル環であり得る。ヘテロアリール基の中のＳ原子およびＯ原子の総数が１を超える場合、これらのヘテロ原子は互いに隣接しない。特定の実施形態において、ヘテロアリール基の中のＳ原子およびＯ原子の総数は２を超えない。特定の実施形態において、芳香族複素環の中のＳ原子およびＯ原子の総数は１を超えない。ヘテロアリールは、上記に定義したようなアリールを包含しないか、またはこれと重複しない。代表的なヘテロアリール基には以下から誘導される基が含まれるがこれらに限定されない。アクリジン、アルシンドール、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなど。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、５から２０員の間のヘテロアリール、例えば、５から１０員の間のヘテロアリールなどであり得る。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、キノリン、イミダゾール、オキサゾール、およびピラジンから誘導されるものであり得る。

「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロアラルキル」とは、炭素原子に結合された水素原子の１つ、典型的には、末端またはｓｐ^３炭素原子が、ヘテロアリール基で置き換えられている非環式アルキル基をいう。特定のアルキル部分が意図される場合、命名法ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニル、および／またはヘテロアリールアルキニルが使用される。特定の実施形態において、ヘテロアリールアルキル基は、６から３０員ヘテロアリールアルキルであり得、例えば、ヘテロアリールアルキルのアルカニル部分、アルケニル部分、またはアルキニル部分は１から１０員であり得、ヘテロアリール部分は５から２０員ヘテロアリールであり得る。

「スルホニル」とは、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ基（Ｒが、本明細書で定義されるようなアルキル基、置換アルキル基、置換シクロアルキル基、置換ヘテロシクロアルキル基、置換アリール基、または置換ヘテロアリール基である。）をいう。代表的な例には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、ブチルスルホニルなどが含まれるがこれらに限定されない。

「スルファニル」とは、−ＳＲ基（Ｒが、本明細書に定義されるように場合により置換されてもよい、本明細書に定義されるような、アルキル基、置換アルキル基、置換シクロアルキル基、置換ヘテロシクロアルキル基、置換アリール基、または置換ヘテロアリール基である。）をいう。代表的な例には、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオなどが含まれるがこれらに限定されない。

「医薬的に許容される」とは、動物における、およびより特定的にはヒトにおける使用のために一般的に認められることをいう。

「医薬的に許容される塩」とは、医薬的に許容され、および親の化合物の所望の薬理学的活性を有する化合物の塩をいう。このような塩には以下が含まれる。（１）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など；もしくは有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸などとともに形成された酸付加塩；または（２）親の化合物の中に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオンによって置き換えられているか；もしくはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ジシクロヘキシルアミンなどのような有機塩基と配位するかのいずれかのときに形成される塩。

「医薬的に許容される賦形剤」、「医薬的に許容される担体」、または「医薬的に許容されるアジュバント」とは、それぞれ、本開示の少なくとも１種の化合物がこれとともに投与されている賦形剤、担体、またはアジュバントをいう。「医薬的に許容される媒体」とは、本開示の少なくとも１種の化合物がこれとともに投与されている任意の希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体をいう。

「立体異性体」とは、空間における構成原子の配置が異なる異性体をいう。互いの鏡像であり、および光学的に活性である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれ、ならびに互いの鏡像ではなく、光学的に活性である立体異性体を「ジアステレオ異性体」と呼ぶ。

「被験者」には哺乳動物およびヒトが含まれる。「ヒト」および「被験者」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。

「置換」は、１個以上の水素原子が、同じまたは異なる置換基で各々独立して置き換えられている基をいう。代表的な置換基には以下が含まれるがこれらに限定されない。−Ｘ、−Ｒ_３３、−ＯＨ、＝Ｏ、−ＯＲ_３３、−ＳＲ_３３、−ＳＨ、＝Ｓ、−ＮＲ_３３Ｒ_３４、＝ＮＲ_３３、−ＣＸ_３、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_３３、−ＯＳ（Ｏ_２）ＯＨ、−ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ_３３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ_３３）（ＯＲ_３４）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_３３、−Ｃ（Ｓ）Ｒ_３３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_３３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_３３Ｒ_３４、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ_３３、−ＮＲ_３５Ｃ（Ｏ）ＮＲ_３３Ｒ_３４、−ＮＲ_３５Ｃ（Ｓ）ＮＲ_３３Ｒ_３４、−ＮＲ_３５Ｃ（ＮＲ_３３）ＮＲ_３３Ｒ_３４、−Ｃ（ＮＲ_３３）ＮＲ_３３Ｒ_３４、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ_３３Ｒ_３４、−ＮＲ_３５Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_３３、−ＮＲ_３５Ｃ（Ｏ）Ｒ_３３、および−Ｓ（Ｏ）Ｒ_３３、ここで、各Ｘは独立してハロであり；各Ｒ_３３およびＲ_３４は、独立して、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、−ＮＲ_３５Ｒ_３６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_３５、もしくは−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_３５であり、または場合により、Ｒ_３３およびＲ_３４は、Ｒ_３５およびＲ_３４が結合する原子と一緒になって、１個以上のヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール環を形成し；ならびにＲ_３５およびＲ_３６は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、または置換ヘテロアリールアルキルであり、または場合により、Ｒ_３５およびＲ_３６は、Ｒ_３５およびＲ_３６が結合する窒素原子と一緒になって、１個以上のヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、もしくは置換ヘテロアリール環を形成する。特定の実施形態において、三級アミンまたは芳香族窒素は、１個以上の酸素原子で置換され、対応する窒素酸化物を形成してもよい。

「治療有効量」とは、疾患、または疾患もしくは障害の臨床的徴候の少なくとも１つを治療するために被験者に投与されるときに、化合物の量が、疾患、障害、または徴候のためのこのような治療をもたらすために十分であることをいう。「治療有効量」は、化合物；疾患、障害、および／または疾患もしくは障害の症候；疾患、障害、および／または疾患もしくは障害の重篤度；治療される被験者の年齢；ならびに／または治療される被験者の体重に依存して変化し得る。任意の所定の例における適切な量は、当業者には容易に明らかであり得、または日常的な実験によって決定可能である。

任意の疾患または障害を「治療すること」またはこの「治療」とは、疾患、障害、または疾患もしくは状態の少なくとも１つの臨床的徴候を停止または改善すること；疾患、障害、または疾患もしくは状態の少なくとも１つの臨床的徴候をもたらすリスクを減少すること；疾患、障害、または疾患もしくは障害の少なくとも１つの臨床的徴候の発生を減少すること；または疾患、障害、または疾患もしくは障害の少なくとも１つの臨床的徴候の発生のリスクを減少することをいう。「治療すること」または「治療」はまた、身体的に（例えば、識別可能な徴候の安定化）、生理学的に（例えば、身体的なパラメーターの安定化）、もしくは両方のいずれかで、疾患もしくは障害を阻害すること、または被験者に識別できない可能性がある少なくとも１つの身体的パラメーターを阻害することもいう。さらに、「治療すること」または「治療」とは、被験者が、疾患または障害の徴候をまだ経験していないか、またはこれをまだ示していないにも関わらず、疾患または障害に曝露された可能性があるか、またはこの素因があるこの被験者における疾患または障害または少なくともこの徴候の発症を遅延させることをいう。

ここで、本開示の実施形態に対して、詳細に言及がなされる。本開示の特定の実施形態が記載されるが、本開示の実施形態を、記載された実施形態に限定することを意図しないことが理解される。反対に、本開示の実施形態に対する言及は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本開示の実施形態の精神および範囲内に含まれ得るので、代替物、修飾、および等価物を網羅することが意図される。

本発明の実施形態は、式Ｉ：

の少なくとも１つの化合物、この医薬的に許容される塩、この溶媒和物、このキレート、この非共有結合複合体、このプロドラッグ、および前述の任意の混合物に関し、
式中、
ｎは１から６であり；
Ｒ_１は、Ｈ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_２は、Ｈ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈ、低級アルキル、置換低級アルキル、低級ハロアルキル、置換低級ハロアルキルから独立して選択され、または、Ｒ_３およびＲ_４は、一緒に結合して、３から６員環もしくは置換された３から６員環を形成可能であり；
Ｒ_５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルコキシ、置換低級アルコキシ、およびスルファニルから選択され；
Ｒ_６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、ＮＨＳＯ_２Ｒ_１、およびスルホニルから選択され；
Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ＮＲ_３Ｒ_４、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＯＲ_１３、ＳＲ_１３、ＳＯ_２Ｒ_１３、ＣＮ、ＮＯ_２、ハロ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキルシリル、置換アルキルシリル、アルキニルシリル、置換アルキニルシリル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、および−Ｘ−Ｒ_１２から独立して選択され、ここで：
Ｒ_３およびＲ_４は上記に定義した通りであり；
Ｘは−Ｎ（Ｒ_１１）−Ｙ−および−Ｙ−Ｎ（Ｒ_１１）−から選択され；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）、ＳＯ_２、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、および置換アルキニレンから選択され；
Ｒ_１１は、Ｈ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
Ｒ_１２は、Ｈ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから選択され；ならびに
Ｒ_１３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、およびＮＲ_３Ｒ_４から選択され；
ここで、少なくとも１つの隣接する対のＲ_６およびＲ_７、Ｒ_７およびＲ_８、Ｒ_８およびＲ_９、Ｒ_９およびＲ_１０、ならびにＲ_１０およびＲ_１１は、一緒に結合して、４から７員環もしくは置換された４から７員環を形成可能である。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_１は、低級アルキル、例えば、メチルまたはエチルから選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_２は、Ｈから選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈ、低級アルキル、例えば、メチルまたはエチル、置換低級アルキル、および置換ヒドロキシアルキル、例えば、ヒドロキシメチルから独立して選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_５は、ＯＨ、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシ、置換低級アルコキシ、ならびに一級アミドから選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_６は、Ｈ、ＯＨ、およびアルコキシから選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_３およびＲ_４は、一緒に結合して、３から６員環または置換された３から６員環を形成する。３から６員環は、少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、少なくとも２個のヘテロ原子を含み得る。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_６およびＲ_７は、一緒に結合して、４から７員環または置換された４から７員環を形成する。４から７員環は、少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、少なくとも２個のヘテロ原子、および少なくとも３個のヘテロ原子を含み得る。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも１つは、ハロおよび少なくとも１個のハロで置換された部分、例えば、トリフルオロメチルから独立して選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも１つは、アルコキシまたは置換アルコキシから独立して選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも１つは、アルキルシリル、置換アルキルシリル、アルキニルシリル、および置換アルキニルシリルから独立して選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも１つは、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、および置換ヘテロシクロアルキル、例えば、置換ピリジン、置換ピリミジン、置換ピラジン、置換ピリダジン、置換テトラヒドロフラン、および置換ピペリジンから独立して選択される。

化学式Ｉの化合物の特定の実施形態において、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも１つは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、および置換アルキニル、例えば、イソプロピル、シクロヘキサン、シクロペンタン、シクロヘキセン、およびシクロペンテンから独立して選択される。

本開示の個々の代表的な化合物、ならびに本開示の組成物中に含まれ、および本開示の方法において使用される化合物の例は、表１に列挙される。表１に列挙される各化合物、即ち、化合物１から１７５は、この構造、名称、分子量、水素ＮＭＲデータ、および少なくとも１つの合成方法に関する情報を含む。

特定の実施形態において、本開示の化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼなどのプロリルヒドロキシラーゼを阻害する。本開示のアッセイは、化合物のプロリルヒドロキシラーゼ阻害活性を決定するために使用することができる。

特定の実施形態において、本開示の化合物は、例えば、ＨＩＦを安定化することによって、ＨＩＦのレベルまたは活性を調節する。

さらに、本開示の化合物は、１つ以上のキラル中心を含み得る。このような化合物は、純粋な立体異性体として、即ち、個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして、または立体異性体が富化された混合物として、調製または単離され得る。すべてのこのような立体異性体、およびこの富化された混合物が、本開示の範囲内に含まれる。純粋な立体異性体、およびこの富化された混合物は、例えば、当分野において周知である光学活性出発物質または立体選択的試薬を使用して調製することができる。または、このような化合物のラセミ混合物が、例えば、キラルカラムクロマトグラフィー、キラル分解剤などを使用して分離できる。

本開示の特定の実施形態は、少なくとも１種の医薬的に許容される賦形剤、および本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量を含む薬学的組成物に向けられる。少なくとも１種の化合物は、虚血、貧血、創傷治癒、自己移植、同種移植、異種移植、全身高血圧、地中海貧血症、糖尿病、癌、および炎症性障害から選択される少なくとも１つの疾患の治療のための有効量で存在することができる。

本開示の他の実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物を被験者に投与することを含む、ＨＩＦ活性を調節することが所望される状態を治療する方法に向けられる。この状態は、虚血、貧血、創傷治癒、自己移植、同種移植、異種移植、全身高血圧、地中海貧血症、糖尿病、癌、および炎症性障害から選択することができる。

さらなる実施形態は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、このような治療の必要がある患者における少なくとも１つの疾患を治療する方法に向けられる。この少なくとも１種の疾患は、虚血、貧血、創傷治癒、自己移植、同種移植、異種移植、全身高血圧、地中海貧血症、糖尿病、癌、および炎症性障害から選択することができる。

本開示の他の実施形態は、希土類元素で標識されたＶＣＢ複合体と蛍光色素標識ＨＩＦ１−αポリペプチドまたはこのフラグメントを温置する工程；および均質時間分解ＦＲＥＴによりＨＩＦ１−αへのＶＣＢ複合体の結合を検出する工程を含む、ヒドロキシプロリルＨＩＦ１−αタンパク質またはこのフラグメントの検出のためのアッセイに向けられる。特定の実施形態において、蛍光色素はアロフィコシアニンであり得る。他の実施形態において、希土類元素はユーロピウムであり得る。

さらなる実施形態は、ルテニウムで標識されたＶＣＢ複合体とＨＩＦ１−αポリペプチドまたはこのフラグメントを温置する工程；および電気化学発光によってＨＩＦ１−αへのＶＣＢ複合体の結合を検出する工程を含む、ヒドロキシプロリルＨＩＦ１−αタンパク質またはこのフラグメントの検出のためのアッセイに向けられる。特定の実施形態において、ＨＩＦ１−αポリペプチドまたはこのフラグメントは固体支持体に結合される。

本開示のアッセイは、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼによるＨＩＦ１−αタンパク質またはこのフラグメントの水酸化を検出するためにもまた使用されてもよい。

本開示のさらなる実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼの阻害剤についてのアッセイに向けられる。

本発明の化合物は、以下の一般的反応スキームの１つ以上によって製造することができる。

以下は、中間体から本発明の化合物までを製造するために使用できる方法の例である。

方法１：５−ヨード−２−（メチルアミノ）安息香酸
１Ｌ 三つ口フラスコに、２−（メチルアミノ）安息香酸（４０ｇ、２６５ｍｍｏｌ）、水（３００ｍＬ）、および塩酸（２６．７ｍＬ、８７１ｍｍｏｌ）を加えた。塩酸（４５ｍＬ、１４６９ｍｍｏｌ）および水（１６７ｍＬ、９２７２ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に一塩化ヨウ素（４３ｇ、２６５ｍｍｏｌ）を加えることにより、一塩化ヨウ素溶液を調製した。この一塩化ヨウ素溶液を、２−（メチルアミノ）安息香酸の攪拌溶液に急速に加えた。この混合物を２時間攪拌し、培地フリット漏斗（ｍｅｄｉｕｍ ｆｒｉｔ ｆｕｎｎｅｌ）で濾過し、および固形物を水で洗浄し、および真空下で乾燥させて、明緑色粉末として定量的な収率の生成物を得た。参考文献、ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，ＪＡＣＳ，１９９４，１１６，５０７７−５０８３。

方法２：６−ヨード−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン
０℃に冷却した、５−ヨード−２−（メチルアミノ）安息香酸（１０ｇ、３６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（４ｇ、３６ｍｍｏｌ）、および水（１３０ｍＬ、７２１８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、添加漏斗を介してトルエン中の２Ｍ ホスゲン（１８ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）溶液をゆっくりと加えた。２時間後、沈殿生成物を濾過により単離した。固形物を、水１００ｍＬ、エタノールおよびエーテルの１：１混合液１５０ｍＬ、エーテル １００ｍＬで洗浄し、真空下で乾燥して所望の生成物を得た。収量＝７．１５ｇ。

方法３：５−クロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン
２５０ｍＬ丸底フラスコ中、Ｎ_２下で、１，４−ジオキサン１００ｍＬに２−アミノ−６−クロロ安息香酸（１１．６９ｇ、６８ｍｍｏｌ）を溶解した。この溶液を０℃に冷却し、この溶液にホスゲン（３６ｍＬ、６８ｍｍｏｌ）を漏斗から滴下して加えた。この反応混合液を、２３℃（室温）に温めながら２４時間攪拌した。得られる白色固体を濾過し、１，４−ジオキサンおよびＥｔ_２Ｏで洗浄した。収量＝１２．５ｇ、９３％。

方法４：６−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン
５−ブロモイサト酸無水物（３ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ５０ｍＬ中０℃にて攪拌し、室温で１時間攪拌しながら、水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液）（０．４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。ヨードメタン（０．８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合液を４時間攪拌させた。水（５０ｍＬ）をゆっくりと加え、ジクロロメタン（ＤＣＭ）５０ｍＬもまた加えた。白色固形物が沈殿し、これを濾別した。液層は分離層であった。水層をＤＣＭ（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（４×２５ｍＬ）で抽出し、およびブライン（２５ｍＬ）で１回抽出した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（０から３％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物１．５７ｇを得た。収率４９％。

方法５：７−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン
水素化ナトリウム（０．４７ｇ、１２ｍｍｏｌ）を三つ口２５０ｍＬ ＲＢＦに窒素下で加え、次いで、ヘキサンで洗浄した。一旦ヘキサンを静かに注ぐと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０．０ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を加えた。得られる混合液を、氷冷バスを使用して０℃に冷却し、次いで、７−ブロモ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン（２．７ｇ、１１ｍｍｏｌ）を１つのバッチに加えた。室温で１時間の攪拌後、ヨードメタン（０．７０ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を黄色溶液に滴下して加え、反応混合液を１６時間攪拌した。水（５０ｍＬ）を加え、生じる形成した沈殿物を濾過を介して収集した。固形物を、さらなる水（１００ｍＬ）、続いてエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。真空オーブン中での５０℃での一晩の乾燥は、白っぽい色の（ｏｆｆ−ｗｈｉｔｅ）固形物としての所望の生成物を与えた（２．１ｇ、７４％収率）。

方法６：メチル１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボキシレート
水素化ナトリウム（０．５１ｇ、２１ｍｍｏｌ）を、冷却した（０℃）ＤＭＦ（４０ｍＬ）に加えた。２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（２．０ｇ、９．７ｍｍｏｌ）をこの混合液に加え、水素ガスの（激しい）発生が停止するまで、０℃で攪拌した。黄色の懸濁物が生じた。次いで、この混合液にヨードメタン（１．２ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を加え、この混合液を室温まで温め、続いて、３０分間、５０℃に加熱した。この混合液を０℃に冷却し、水をゆっくりと加え、続いてジクロロメタンを加えた。層が分離し、水層をジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）、Ｈ２Ｏで２回、および飽和ＮａＣｌ（１５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、および濃縮して、ＤＭＦ中の黄色溶液を得、これを精製なしで使用した。

方法７：メチル４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート
６０％水素化ナトリウム（１．２ｍＬ、２８ｍｍｏｌ）を、室温で攪拌しながら、マロン酸ジエチルエステル（１７ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）の混合液に少しずつ加えた。６−ヨード−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン（７．１２ｇ、２３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）の混合液をこの溶液に加え、続いて、１２０℃で２．５時間攪拌を行った。形成した沈殿物を濾過により収集し、水に溶解し、３０％ ＨＣｌをこの混合液に加えた。沈殿した結晶を濾過により収集し、乾燥して所望の生成物を得た。収量＝３．５ｇ。

方法８：ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート
１，４−ジオキサン（７０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルマロナート（５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、６０％ 水素化ナトリウム（０．８ｇ、３５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。この混合液を室温で４５分間攪拌し、次いで、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）中の６−ヨード−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン（６．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合液を６０℃の油浴中に配置し、２０分間の時間にわたって１２０℃まで浴温度を上げ、その後、攪拌を９０分間継続した。溶媒を、回転式蒸発器で除去し、冷水（３００ｍＬ）を残留物に加えた。この混合液をＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、水層を２Ｎ ＨＣｌで酸性化した。有機層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）に抽出し、ＭｇＳＯ_４での乾燥後、溶媒を回転蒸発器で除去した。収量＝４．１ｇ。

方法９：メチル７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート
５０ｍＬ ＲＢＦに、窒素下で、水素化ナトリウム（０．１５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を、アイスバスで１０分間冷却し、次いで、ジメチルマロナート（６．４ｍＬ、５６ｍｍｏｌ）を３分間にわたって加えた。ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中の７−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４−ジオン（０．８０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の混合液を加え、次いで、反応物を、油浴中に、１２０℃で３時間配置した。反応物を室温まで冷却し、水（２５ｍＬ）を混合液に加えた。白色固形物を濾過によって収集し、水（１００ｍＬ）、続いてエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。この白色固形物を真空オーブン中にて、５０℃で６時間配置し、所望の生成物を白色固形物として得た（０．６５ｇ、６７％）。

方法１０：３−ベンジル７−メチル４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３，７−ジカルボキシレート
ＤＭＦ（４１ｍＬ）中のジベンジルマロナート（２．９９ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウムを少しずつ加えた。この曇った灰色の混合液を室温で２０分間攪拌し、この時間後、透明な溶液が生じた。この溶液を、１２０℃で２０分間さらに攪拌し、その後、ＤＭＦ（４１ｍＬ）中のメチル１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボキシレート（２．８２ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた黄色溶液を１２０℃で３時間攪拌した。この反応混合液を室温まで冷却し、２Ｎ ＨＣｌおよびＥｔＯＡｃを加え、層を分離させる。水層をＥｔＯＡｃで３回抽出し、合わせた有機層を、Ｈ_２Ｏで（１回）、続いて飽和ＮａＣｌで（２回）洗浄した。次いで、有機層を、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、および濃縮して、黄色固形物を得た。精製は、ＩＳＣＯにより、１０％から５０％までのＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ勾配、４０ｇカラムを使用して実施し、３００ｍｇの黄色固形物を得た。

方法１１：４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸
アイスバス中で冷却した、ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（４．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（２０ｍＬ）の溶液に、７０％過塩素酸（０．２ｍＬ）を加え、この混合液を３０秒間攪拌した。黄色固形物を濾過した。収量＝０．５ｇ。

方法１２：４−ヒドロキシ−７−（メトキシカルボニル）−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸
活性炭上のパラジウム１０ｗｔ．％（５．１ｍｇ、４８μｍｏｌ）を、酢酸エチル（１９ｍＬ）中の３−ベンジル７−メチル４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３，７−ジカルボキシレート（８８ｍｇ、２４０μｍｏｌ）の溶液に加え、激しく攪拌しながら、Ｈ_２雰囲気下に配置した。反応の完了後、この混合液はセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）パッドを通して濾過し、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭを用いてすすぎ、白っぽい色の粉末（５９ｍｇ、８９％）を得、これをさらなる精製なしで使用した。

方法１３：メチル３−（（２−（ベンジルオキシ）−２−オキソエチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボキシレート
４−ヒドロキシ−７−（メトキシカルボニル）−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１０７ｍｇ、３８６μｍｏｌ）、グリシンベンジルエステルハイドロクロライド（１１７ｍｇ、５７９μｍｏｌ）、ｐｙｂｏｐ（６０３ｍｇ、１１５８μｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（４０３μｌ、２３１６μｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、室温で２４時間攪拌した。反応混合液をＨ_２ＯおよびＤＣＭで希釈し、層を分離し、水層をＤＣＭで抽出し（３回）、有機層をＨ_２Ｏで洗浄し（２回）およびＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、ならびに濃縮して、黄色固体を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ ２：１を使用して実施し、所望の生成物４５ｍｇを得た。

方法１４：エチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（グリシンメチルエステルまたはグリシンｔ−ブチルエステルもまた使用可能である。）
短路蒸留ヘッドを装着した１００ｍＬ 丸底フラスコ中のエチル４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（０．５ｇ、１ｍｍｏｌ）、グリシンエチルエステルハイドロクロライド（０．２ｇ、１ｍｍｏｌ）、および１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）の溶液を１２０℃に加熱した。７時間後、反応を完了した。溶媒を完全に蒸留して除いた。黄褐色の固形物残留物をＥｔＯＡｃで洗浄し、回転蒸発器で、次いで、高真空で、１５時間濃縮した。黄褐色の固形物をＤＣＭで洗浄し、白色固形物を濾別した。濾液を回転蒸発器で濃縮し、明黄褐色固形物を得た。収量＝０．４ｇ。

方法１５：メチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（グリシンメチルエステルまたはグリシンｔ−ブチルエステルもまた使用可能である。）
１００ｍＬ 丸底フラスコに、４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（０．５ｇ、１ｍｍｏｌ）、グリシンメチルエステルハイドロクロライド（０．３ｇ、２ｍｍｏｌ）、Ｐｙｂｏｐ（１ｇ、２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、およびトリエチルアミン（０．６ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を加え、この混合液を室温で攪拌した。４時間後、さらなるグリシンメチルエステルハイドロクロライド（０．３ｇ、２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍＬ、４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、さらにＰｙｂｏｐ（１ｇ、２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を３日間攪拌し、次いで、白色固形物を濾過した。収量＝０．２８ｇ。

方法１６：（Ｓ）−メチル２−（４−ヒドロキシ−８−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）プロパノアート
３５ｍＬ密封バイアル中に、Ｎ_２下で、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中のメチル４−ヒドロキシ−８−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を懸濁した。この溶液に、Ｌ−アラニンメチルエステルハイドロクロライド（０．２９ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を、１２０℃で一晩（１８時間）攪拌した。この溶液を熱源から取り出し、細密なフリット漏斗で濾過し、いかなる不溶性の出発物質も取り除いた。濾液を真空中で濃縮し、残りの沈殿物をＥｔ_２Ｏに懸濁し、濾過し、Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、および乾燥して、明黄色固形物を得た。収率＝０．４０ｇ、６３％。

方法１７：メチル２−（１−エチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
マイクロ波バイアル中のトルエン４ｍＬ中で、エチル１−エチル−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（０．３８０ｇ、１ｍｍｏｌ）、グリシンメチルエステルハイドロクロライド（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）を、１８０℃で３分間、マイクロ波処理し、次いで、シリカフラッシュクロマトグラフィーによって、１から５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配を用いて精製し、０．０５０ｇを得た。収率：１１％。

方法１８：エチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
エチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（５ｇ、１２ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（３ｇ、１３ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウムジクロライド（０．３ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、酢酸、カリウム塩（１ｍＬ、２３ｍｍｏｌ）、および１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）の混合液を、窒素雰囲気下で、８５から９５℃に加熱した。４４時間後、反応混合液を冷却し、紫色がかったベージュ色の固形物を濾別した。濾液を回転蒸発器で濃縮し、ＥｔＯＨで処理した。基褐色固形物を濾別し、エーテルで洗浄した。第２の収集物は濾液混合液から得た。収量＝２．５ｇ。

方法１９：エチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
エチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（２００ｍｇ、４６５μｍｏｌ）、フェニルボロン酸（８５ｍｇ、６９７μｍｏｌ）、２Ｍ 炭酸ナトリウム（０．７ｍＬ、１３９５μｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５ｍｇ、５μｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）の溶液を１００℃で攪拌した。８時間後、フェニルボロン酸のさらなる等価物を加え、この混合液を１５時間攪拌した。この反応混合液を回転蒸発器で濃縮し、ＥｔＯＡｃで抽出した。次いで、この生成物を水およびブラインで洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮し、赤オレンジ色オイルとして粗生成物を得た。この粗生成物を、シリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（１０から７５％ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ段階勾配）、白色固形物として所望の生成物を得た。収量＝１２０ｍｇ。ある場合において、エステルの加水分解が観察され、カルボン酸が単離された。

方法２０：エチル２−（６−（６−クロロピリミジン−４−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
１０ｍＬ反応バイアルに、１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のエチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ）−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（２００ｍｇ、４６５μｍｏｌ）、４，６−ジクロロピリミジン（６９ｍｇ、４６５μｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｏ）（２７ｍｇ、２３μｍｏｌ）、および炭酸ナトリウム（０．７ｍＬ、１３９５μｍｏｌ）を仕込み、この反応バイアルを７０℃に加熱した。反応の完了後、反応混合液を回転蒸発器で濃縮し、ＥｔＯＡｃで抽出し、水およびブラインで洗浄し（各３回）、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、および回転蒸発器で濃縮した。黄色固形物をＥｔＯＨで洗浄し、濾過し、この固形物をエーテルで洗浄した。収量＝５５ｍｇ。

方法２１：メチル２−（７−（３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
１，２−ジメトキシエタン（またはＤＭＦ）８ｍＬ中のメチル２−（７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（４００ｍｇ、１０８４μｍｏｌ）、３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−イルボロン酸（３０５ｍｇ、２１６７μｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（１２５ｍｇ、１０８μｍｏｌ）ならびに２Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液１．６ｍＬの混合液を７５℃に加熱し、１２時間攪拌した。この混合液を２４℃まで冷却し、１Ｍ ＨＣｌ水溶液およびＣＨＣｌ_３で処理し、その後、固形物が沈殿した。有機層を分離し、固形物を濾過によって収集し、およびＭｅＯＨで洗浄した。

方法２２：２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−（ピペリジン−ｌ−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のエチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド）アセテート（２５０ ｍｇ、５８１μｍｏｌ）、Ｐｄ_２ｄｂａ_３．ＣＨＣｌ_３（６０ｍｇ、５８μｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（５５ｍｇ、１１６μｍｏｌ）、およびｔ−ブトキシドナトリウム（２７９ ｍｇ、２９０６μｍｏｌ）の溶液を、ピペリジン（２８７μｌ、２９０６μｍｏｌ）で処理した。反応物を、密封したチューブ中で８０℃で攪拌した。２２時間後、溶液を２３℃まで冷却し、セライトを通して濾過し（ＭｅＯＨで洗浄する。）、濃縮し、メタノール／ＤＭＳＯで希釈し、およびＲＰ ＨＰＬＣ（０から１００％ ＭｅＣＮ／水＋１％ ＴＦＡ、１０分間）で精製し、白っぽい固形物として、２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−（ピペリジン−ｌ−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸１７ｍｇ（８％）を得た。

方法２３：２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノ−２−オキソ）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
１，４−ジオキサン（３ｍＬ）中のエチル２−（６−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（２０２ｍｇ、５２７μｍｏｌ）、Ｐｄ_２ｄｂａ_３．ＣＨＣｌ_３（５５ｍｇ、５３μｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（５０ｍｇ、１０５μｍｏｌ）、およびモルホリン（１１５μｌ、１３１８μｍｏｌ）の溶液を、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウム（２０３ｍｇ、２１０９μｍｏｌ）で処理した。反応物を、密封したチューブ中で８０℃で攪拌した。２１時間後、溶液をシリカゲルに吸着させ、真空中で濃縮し、およびシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：４％エタノール／ジクロロメタン、次に／ジクロロメタン＋１％ ＡｃＯＨ）、続いて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（０から１００％ ＭｅＣＮ／水＋１％ ＴＦＡ、１０分）、２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−６−モルホリノ−２−オキソ）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸２１ｍｇ（１１％）を黄色固形物として得た。

方法２４：２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−７−モルホリノ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
１，４−ジオキサン（３ｍＬ）中のメチル２−（７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（１００ｍｇ、２７１μｍｏｌ）、Ｐｄ_２ｄｂａ_３．ＣＨＣｌ_３（２８ｍｇ、２７μｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（２６ｍｇ、５４μｍｏｌ）、およびモルホリン（７１μｌ、８１３μｍｏｌ）の溶液を、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウム（１０４ｍｇ、１０８４μｍｏｌ）で処理した。反応物を、密封したチューブ中で８０℃で攪拌した。２１時間後、懸濁物を２３℃まで冷却し、セライトを通して濾過し（メタノールで広範に洗浄する。）、濾液を真空中で濃縮し、およびシリカへの吸着後にシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：１０％メタノール／ジクロロメタン＋１％ ＡｃＯＨ）、２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−７−モルホリノ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸１８ｍｇ（１８％）を緑色がかった白色固形物として得た。

方法２５：２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキサ−７−（ピペリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（２０５ｍｇ、４９８μｍｏｌ）、Ｐｄ_２ｄｂａ_３．ＣＨＣｌ３（５２ｍｇ、５０μｍｏｌ）、Ｘ−Ｐｈｏｓ（４８ｍｇ、１００μｍｏｌ）、およびピペリジン（１２３μｌ、１２４６μｍｏｌ）の溶液を、ｔｅｒｔ−ブトキシドナトリウム（１９２ｍｇ、１９９４μｍｏｌ）で処理した。反応物を、密封したチューブ中で８０℃で攪拌した。１５時間後、溶液を２３℃まで冷却し、溶液をシリカゲルに吸着させ、真空中で濃縮し、およびシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：５％メタノール／ジクロロメタン、次に５％メタノール／ジクロロメタン＋１％ ＡｃＯＨ）によって精製し、８３％純粋である黄色固形物を得た。純粋でない固形物をＲＰ ＨＰＬＣ（０から１００％ ＭｅＣＮ／水＋１％ ＴＦＡ、１０分間）により精製し、黄色固形物として生成物８３ｍｇ（４６％）を得た。

方法２６：メチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−７−（２−（トリメチルシリル）エチニル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
密封したチューブの中で、メチル２−（７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．７５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（０．１４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０７７ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、エチニルトリメチルシラン（１．４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、およびＮ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（２．８ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（２０．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）中に合わせた。このチューブにＡｒをフラッシュし、密封し、および１００℃の油浴中に５時間配置した。暗い混合液を室温まで冷却し、濾過し、および酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で洗浄した。この粗混合液を濃縮し、シリカに吸着させ、およびフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（１５％から４０％までのＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ勾配）、固形物として生成物を得た（０．５９ｇ、７５％収率）。

方法２７：２−（７−シアノ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
密封したフラスコ中で、メチル２−（７−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（２．０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（０．４８ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、シアン化銅（１．９ｇ、２２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．２０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、および１，４−ジオキサン（５０．０ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を合わせた。このフラスコにアルゴンをフラッシュし、次いで、シアン化テトラエチルアンモニウム（０．８５ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を加えた。チューブを密封し、７５℃で４時間加熱した後、反応物を室温まで冷却し、次いで、シリカに吸着させた。粗反応混合液を、フラッシュクロマトグラフィー（１５から７０％ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ勾配）を使用して精製し、エステル中間体を得た。ＴＨＦ（４ｍＬ）中で、固形物を５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）と４時間混合することによって、メチルエステルを加水分解した。この混合液は、５Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ １まで酸性化し、固形物を濾過によって収集し、水で洗浄し（５×１５ｍＬ）、次いでエーテルで洗浄した（２×５ｍＬ）。固形物は真空オーブン中で５０℃で一晩乾燥させ、所望の物質（０．９２ｇ、５６％収率）を得た。

方法２８：２−（７−エチル−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）およびメタノール（１．０ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）中のメチル２−（４−ヒドロキシ−ｌ−メチル−２−オキソ−７−（２−（トリメチルシリル）エチニル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．５９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、窒素下でフッ化セシウム（０．２３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間の攪拌後、この混合液を濃縮して溶媒を除去した。得られた固形物をシリカに吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（１５から８０％ ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ勾配）を使用して精製して、黄色固形物を得た。この固形物を、Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｏｌ％）とともにメタノール（１０ｍＬ）に懸濁し、バルーンからの水素に１６時間曝露した。粗反応混合液をセライトを通して濾過し、フィルターパッドを、アルゴン下でジクロロメタン（５×１０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮して白色固形物を得て、これをさらに、フラッシュクロマトグラフィー（１００％ クロロホルム）によってシリカ上で精製した。次いで、固形物を、ＴＨＦ（３ｍＬ）中の５Ｎ ＮａＯＨ水溶液（３ｍＬ）で５時間処理した。この混合液を、５Ｎ ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ １に酸性化し、得られる沈殿物を濾過によって収集した。水（５×１０ｍＬ）およびエーテル（２×１０ｍＬ）を用いての固形物の洗浄後、真空オーブン中での５０℃で一晩の乾燥後に所望の物質を得た（０．２１ｇ、３８％収率、３段階）。

方法２９：エチル２−（６−シアノ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中のエチル２−（４−ヒドロキシ−６−ヨード−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．２００ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（０．０４８ｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）、シアン化銅（０．１９４ｇ、２．２ｍｍｏｌ）、およびトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０．０２０ｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬチューブ中で合わせた。シアン化テトラエチルアンモニウム（０．０８５ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１ｍＬ）を加え、チューブを密封し、アルゴン下で、マイクロ波中で（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３００Ｗ）、１５分間、１４５℃まで加熱した。冷却後、混合液を濾過し、塩化メチレン（５０ｍＬ）で洗浄した。濾液を脱イオン水で洗浄し（３×５０ｍＬ）、次いで、ブラインで洗浄し（５０ｍＬ）、硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで、真空中で乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中０−１００％ 塩化メチレン）は固形物を与え、これをジエチルエーテルで洗浄し、濾過し、および真空中で乾燥させて、エチル２−（６−シアノ−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．１３５ｇ、９０％収率）を得た。

方法３０：エチル２−（６−（２，４−ジメチルチアゾール−５−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート
１，４−ジオキサン／ジメチルホルムアミド（４：１、５ｍＬ）中のエチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボラン−２−イル）−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．２００ｇ、０．４６５ｍｍｏｌ）の溶液に、５−ブロモ−２，４−ジメチル−１，３−チアゾール（０．１３４ｇ、０．６９７ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．０５３７ｇ、０．０４６５ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（０．３４９ｍＬ、０．６９７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を、密封したチューブの中で、アルゴン下で、マイクロ波中で（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３００Ｗ）、１５分間、１４５℃まで加熱した。ＬＣ／ＭＳにより、エチルエスエル：酸：出発物質の比率は、９：３：１であった。冷却後、この混合液を脱イオン水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２×２５ｍＬ）。有機層の溶液（ｃｏｌｕｔｉｏｎ）を脱イオン水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いでブラインで洗浄し（３０ｍＬ）、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、および真空中で乾燥させ、粗生成物２４１ｍｇを得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン中０から２５％ 酢酸エチル）は黄色固形物８６ｍｇを生じ、これをエーテルで洗浄し、濾過し、および真空中で乾燥させて、エチル２−（６−（２，４−ジメチルチアゾール−５−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．０３３０ｇ、１７．１％収率）を白色固形物として得た。

方法３１：２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸（メチルエステルのためにもまた使用可能である。）
エチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（１２０ｍｇ、３１５μｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）の溶液に、５Ｎ 水素化ナトリウム（１．３ｍＬ）を加え、この混合液を室温で攪拌した。２．５時間後、反応が完了した。この反応混合液を５Ｎ ＨＣＬ（２ｍＬ）で酸性化し、固形物が現れるまで、回転蒸発器で濃縮し、次いで、水を加え、および濾過して、所望の化合物を明桃色の固形物として得た。収量＝７７ｍｇ。

方法３２：２−（７−（３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
ＭｅＯＨ ３ｍＬ、ＴＨＦ １ｍＬ、および１Ｍ ＮａＯＨ水溶液２ｍＬ中に、メチル２−（７−（３，５−ジメチルイソオキサゾール−４−イル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテートを懸濁し、２４℃で４時間攪拌した。この混合液を、２Ｍ ＨＣｌ水溶液を使用してｐＨ＝１に酸性化し、固形物を濾過によって収集し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、および真空中で乾燥させた。５０ｍｇ白色固形物。

方法３３：２−（７−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
トリフルオロ酢酸（４．００ｍＬ、５４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２．００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（７−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．０５７ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。室温で１０分間の攪拌後、水を加え、溶液をＳＣＸ ＭＥＧＡ ＢＥカラムにロードした。このカラムにメタノールを広範に流し、続いて、メタノール中の２Ｍ アンモニアを流した。メタノール中のアンモニアから得られる画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。残留物を、ＴＨＦ（１ｍＬ）中の５Ｎ ＮａＯＨで処理し、室温で１時間攪拌した。この懸濁液を５Ｎ ＨＣｌで酸性化し、固形物を濾過によって収集した。この固形物を水、エーテルで洗浄し、真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、緑色固形物（１０ｍｇ）を得た。

方法３４：２−（７−（３−シアノフェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
トリフルオロ酢酸（４．００ｍＬ、５４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２．００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（７−（３−シアノフェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．１６２ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。室温にて１時間の攪拌後、水を加え、形成した固形物を濾過によって収集した。この固形物を水、エーテルで洗浄し、真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、白っぽい色の固形物を７４％収率で得た。

方法３５：３−（（カルボキシメチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボン酸
メチル３−（（２−（ベンジルオキシ）−２−オキソエチル）カルバモイル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボキシレート（２６ｍｇ、６１μｍｏｌ）（６５６８９−１７−３）を、ジオキサン／Ｈ_２Ｏ（５：１）１２ｍＬに溶解し、これに、水素化リチウム一水和物（６１３μｌ、６１３μｍｏｌ）を１Ｍ水溶液として加えた。得られる混合液を６０℃で４時間加熱した。溶媒を真空中で除去し、水層を２Ｎ ＨＣｌでｐＨ２まで酸性化した。ＥｔＯＡｃを用いる希釈後、層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。有機層をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄し、次いで、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を回転蒸発器で除去し、ベンゼンとともに共沸させ（３回）、明黄色固形物を得、これをＤＣＭで、続いてＭｅＯＨですすいだ。

方法３６：２−（１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（Ａｒｃｈｉｖ ｄｅｒ Ｐｈａｒｍａｚｉｅ（１９９０），３２３（２），６７−７２）および塩化オキサリルから調製した１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボニルクロライドを、ジクロロメタン（１．００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−アミノアセテートハイドロクロライド（０．０４１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０８６ｍＬ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加え、室温で１時間攪拌した。この反応混合液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、ｔｅｒｔ−ブチル２−（１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテートを２７％収率で得た。

トリフルオロ酢酸（１．００ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブチル２−（１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．０２１ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）に加え、室温で１５分間攪拌した。トルフルオロ酢酸を真空下で除去し、得られた固形物を水（３回）、エーテル（３回）で洗浄し、真空オーブン中で５０℃で乾燥させ、２−（１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸を２９％収率で得た。

方法３７：２−（４−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−１．２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）酢酸
メチル２−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（．３９４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、メタノール（０．３３ｍＬ、８．１ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（０．９４ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬ丸底フラスコの中に、ＴＨＦ ２５ｍＬとともに配置した。フラスコをアイスバスの中に配置した。ジエチルアゾジカルボキシレート（０．６４ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。白色固形物を濾過し、この固形物をシリカフラッシュクロマトグラフィー（０から３％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、所望の生成物を得た。

メチル２−（４−メトキシ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキシアミド）アセテート（０．１５０ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬ 丸底フラスコ中のＴＨＦに溶解した。ＮａＯＨを加え、この混合液を１．５時間攪拌した。ジクロロメタンおよび水を反応液に加え、層が分離した。水層をジクロロメタンで２回以上洗浄した。この水相に、ｐＨが約１になるまで１Ｎ ＨＣＬを加えた。次いで、水相を２５％ ＩＰＡ／ＣＨＣ１_３で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、および回転蒸発器で濃縮した。次いで、化合物をＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物を白色固形物として得た。

以下は、ＨＩＦ ＰＨＤ活性および本発明の化合物によるＨＩＦ ＰＨＤ活性の阻害を定量するために使用してもよい方法の例である。

ＶＣＢの発現、精製、およびユーロピウム標識、ならびにヒドロキシプロピルＨＩＦ １αペプチドの検出のためのＥｕ−ＶＣＢベースのＨＴＲＦアッセイの設計
ＶＣＢ複合体は、フォン・ヒッペル−リンダウタンパク質（ｐＶＨＬ）、エロンギンＢ、およびエロンギンＣのヘテロ三量体複合体として定義される。ＶＣＢは、ＨＩＦ１αのヒドロキシプロリン残基に特異的に結合し、ＨＩＦ１αのポリユビキチン化およびこの引き続くタンパク質分解を開始する。プロリルヒドロキシラーゼ活性の非存在下では、ＶＣＢは、非修飾ＨＩＦ１αには結合しない。ＶＣＢ複合体は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、可溶性画分から精製された。３つのタンパク質成分のアミノ酸配列は以下の通りである。

ＶＨＬのＮ末端は、精製目的のための６個のヒスチジン親和性タグを含む。

ＶＣＢベースのアッセイは、酵素生成物形成のための高感度および直接的な測定（水酸化プロリン残基を含むＨＩＦ１αタンパク質またはこのフラグメント）を可能にし、ならびに高処理スクリーニングのために適している。

大腸菌における発現のために、ＶＨＬ ５４−２１３を、ｐＡＭＧ２１（Ｐｌｕｘプロモーター）に、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位の間でクローニングした。これのすぐ下流には、ＸｈｏＩ部位からＳａｃＩＩ部位までにクローニングされたエロンギンＣ遺伝子がある。ＶＨＬの終止コドンとエロンギンＣの開始コドンの間には１３ｂｐのスペーサーがある。発現プラスミドｐＡＭＧ２１は、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）から誘導された６１１８塩基対プラスミドであり、これは、次には、米国特許第４，７１０，４７３号に記載されている発現ベクター系から誘導することができる。この設計は、合成バクテリオファージλｐｌを、ＬｕｘＲ遺伝子およびＬｕｘＰＲプロモーターを含むＤＮＡセグメントで置き換える、プロモーター領域の置換によって、熱的誘導ではなく化学的誘導のタンパク質発現を可能にし、プラスミドによってコードされるＬｕｘＲタンパク質による発現の調節を与え、これによって、任意の大腸菌株が宿主として働くことを可能にする。

エロンギンＢは、Ｌａｃプロモーターの制御下にあるｐＴＡ２（ｐＡＣＹＣ １８４．１ベースのベクター）にクローニングした。コンピテント大腸菌細胞は、ｐＡＭＧ２１−ＶＨＬ−エロンギンＣ構築物で形質転換した。これらの大腸菌細胞は、ｐＴＡ２−エロンギンＢ構築物を用いる形質転換の前に再度コンピテントにされ、両方のプラスミド構築物を含む最終大腸菌株を生じた。タンパク質発現の誘導は、３０℃でのＩＰＴＧおよびＮ−（３−オキソ−ヘキサノイル）−ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）の添加によって開始した。

細菌細胞は、ｐＨ ８．０の水性緩衝液中でマイクロフルイダイザーによって溶解し、可溶性画分を遠心分離によって分離した。可溶性大腸菌画分は、ニッケル−ＮＴＡキレートクロマトグラフィーに供し、ｐＶＨＬ構築物上に配置した６個のヒスチジン親和性タグを利用した。ニッケルカラムからプールした画分は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＢＣ）カラムに適用した。タンパク質はＳＥＣでは単量体として溶出し、このことは、３つのタンパク質成分が溶液中で複合体を形成することを示す。ＳＥＣカラムから画分をプールし、最終精製のためにＱセファロース陰イオン交換カラムに適用した。精製した複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化し、３つのタンパク質成分の同定は、Ｎ末端アミノ酸シークエンシングによって確認した。

精製ＶＣＢは、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ ９．２に交換し、ユーロピウムキレートで一晩標識した。ＬＡＮＣＥ（商標）ユーロピウムキレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ；Ｅｕ−Ｗ１０２４ ＩＴＣキレート；カタログ番号はＡＤ００１３である。）を使用して、ＶＣＢ複合体のリジン残基を標識した。キレートは、リジン残基上でタンパク質を特異的に標識するイソチオシアネート反応基を含む（ＶＣＢタンパク質複合体中には１５個のリジン残基が存在する。）。得られるユーロピウム化ＶＣＢは脱塩カラムによって精製し、標準的な手段によって定量した。標識収率は、１個のＶＣＢ複合体あたり６．６個のユーロピウム基と決定した。

２つのペプチドがＳｙｎＰｅｐ，Ｉｎｃによって製造された。ヒドロキシプロリン修飾ペプチドおよび非修飾対照ペプチドである。ＶＣＢは、ヒドロキシプロリン修飾ペプチド（プロリルヒドロキシラーゼによる酵素的水酸化の模倣物）に特異的に結合することが予測された。ＶＣＢは非修飾ペプチドに結合することが予測されなかった。両方のペプチドは、Ｎ末端のビオチン基を伴って製造され、ストレプトアビジン標識蛍光アクセプターであるアロフィコシアニンによる結合を可能にした（ストレプトアビジン ＡＰＣ；Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）。

カスタム合成したＨＩＦ１αペプチドの配列（アミノ酸５５６から５７５、酸化を妨害するためにメチオニン残基がアラニン残基で置き換えている。）は以下の通りである。
（非修飾）ビオチン−ＤＬＤＬＥＡＬＡＰＹＩＰＡＤＤＤＦＱＬＲ−ＣＯＮＨ_２
（修飾）ビオチン−ＤＬＤＬＥＡＬＡ［ｈｙＰ］ＹＩＰＡＤＤＤＦＱＬＲ−ＣＯＮＨ_２
ペプチドは、凍結乾燥固体としてＳｙｎＰｅｐから購入し、実験的使用のためにＤＭＳＯに懸濁した。ペプチドは、２８０ｎｍにおけるこれらの吸収に従って定量した。

実験は、９６ウェルＣｏｓｔａｒポリスチレンプレートで実施した。ビオチン化ペプチドおよびユーロピウム化ＶＣＢは以下の緩衝液：１００ｎＭ ＨＥＰＥＳ ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁した。試薬は、１時間振盪することによって平衡に到達させ、その後プレートをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）上で読み取った。データ出力は、３２０ｎｍ励起から生じた６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ発光シグナルの比率である。

図１に示されるように、ストレプトアビジンＡＰＣと結合したヒドロキシプロリン修飾ＨＩＦ１αペプチドとのユーロピウム修飾ＶＣＢの特異的相互作用は、バックグラウンドシグナルに対して検出可能である蛍光シグナルを生じた。これらの結果は、ｈｙｐ−ＨＩＦ１αペプチドとのＥｕ−ＶＣＢの特異的相互作用によって生成した蛍光シグナルを実証する。各バーは、９６ウェルアッセイプレートの単一のウェルからのデータを表す。シグナル対バックグラウンド比率は、対照プレート（非修飾ペプチド）からのデータから計算した。ＥＵ−ＶＣＢ濃度は、行を横切って滴定し（ｎＭ）、およびストレプトアビジンＡＰＣ濃度は列を下がって滴定した。ペプチド濃度は１００ｎＭに固定した。

ＨＩＦ ＰＨＤ２およびＨＩＦ ＰＨＤ２活性の阻害による酵素的に転換されたヒドロキシプロリルＨＩＦ−１αの検出
ＶＣＢへのＰ５６４−ＨＩＦ１αペプチドの結合は、均質時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）技術を利用して確証した。ＨＩＦ１αタンパク質のアミノ酸配列５５８から５７４に対応するＮ末端標識ビオチン分子を有する１７アミノ酸（１７ａａ）ペプチドは施設内で合成した（ＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ）。５６４位に水酸化プロリンを含む第２の１７ａａペプチドは、ＶＣＢによって認識されるタンパク質のＰＨＤ酵素転換生成物型を模倣するために化学的に生成した。アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 熱不活化ＦＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．５％ ＮａＮ_３を含む緩衝液中で１００μｌの最終容量で実施した。バックグラウンドを超えた最適シグナルおよび検出の直線範囲は、５０ｎＭのストレプトアビジンＡＰＣを用いて、０から５０ｎＭの間の種々の濃度であるＶＣＢ−Ｅｕの滴定とともに、０から１μＭの間の種々の濃度の水酸化ペプチドまたは非水酸化ペプチドを滴定することによって決定した。結合試薬は、１時間振盪することによって平衡に到達させ、その後これをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）上で読み取った。データ出力は、３２０ｎｍ励起から生じた６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ発光シグナルの比率である。

ＨＩＦ ＰＨＤ２活性は、ＨＴＲＦ形式でのＰ５６４−ＨＩＦ１αペプチドおよびＶＣＢの結合によって検出した。ＨＩＦ ＰＨＤ２は、最終容量 １００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、２ｍＭ アスコルビン酸、および１００μＭ ＦｅＣｌ_２を含む緩衝液中で、３μＭ ＨＩＦ１αペプチドを用いて、０から４００ｎＭの間の種々の濃度でアッセイした。時間経過は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、および０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０×ＨＴＲＦ緩衝液２５０μｌ中に、反応液２．５μＬを定期的に移して酵素反応を終了することによって決定した。終結させた反応からの１５ｎＭ ＨＩＦ−１αペプチドは、１０×ＨＴＲＦ緩衝液中、１００μｌの最終容量まで、３５ｎＭストレプトアビジン−ＡＰＣおよび１０ｎＭ ＶＣＢ−Ｅｕに加えた。ＨＴＲＦ試薬は、シェーカー上に１時間配置し、その後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームで検出を行った。

図２において実証されるように、ペプチドの非水酸化型と比較して、水酸化−Ｐ５６４−ＨＩＦ１αペプチドのＶＣＢ−Ｅｕへの結合から生じるＨＴＲＦシグナルの用量依存性の増加が存在し、１２５ｎＭ ＨＩＦ１αペプチドにおいて、ノイズ比率の１４倍のシグナルを生じた。

ＡＰＣ結合ペプチドへのＶＣＢの結合は、ＥｕとＡＰＣの間のＦＲＥＴ移動を許容する。シグナルは、３．１２５ｎＭ ＶＣＢを用いると２ｎＭ ペプチドまで直線であったが、５０ｎＭ ＶＣＢを用いると、６２．５ｎＭペプチドまで増加し、より広い直線範囲を生じた。

Ｅｕ標識ＶＣＢを利用するＨＴＲＦ検出は、ＨＩＦ ＰＨＤ２触媒活性を決定するための実用的な系である。ＨＩＦ１αペプチドのＨＩＦ ＰＨＤ２水酸化は、ペプチドに対するＶＣＢの親和性の増大を生じ、従って、ＦＲＥＴシグナルを増大した。図３に示されるように、活性は、かなり直線的であり、および時間に対する増加しているＨＴＲＦシグナルを用いて確証した。４００ｎＭまでのＨＩＦ ＰＨＤ２酵素濃度の増加に伴って、用量依存的な初速度の増加が存在した。初速度は１００ｎＭ酵素まで直線状であった。

ＨＩＦ ＰＨＤ２活性の阻害は、ＨＴＲＦ技術を利用して定量した。ＨＩＦ ＰＨＤ２は、Ｐ５６４−ＨＩＦ１αペプチド基質（ビオチン−ＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ）のプロリン残基上でのヒドロキシル修飾を触媒し、ユーロピウム修飾フォン・ヒッペル−リンダウタンパク質（ｐＶＨＬ）、エロンギンＢ、およびエロンギンＣヘテロ三量体（ＶＣＢ−Ｅｕ）複合体の認識および結合を生じる。

ＰＨＤ２阻害アッセイは、３０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ ６、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｂｒｉｊ−３５、０．０１％ ＢＳＡ、および１％ ＤＭＳＯを含むＰＨＤ２反応緩衝液中への、１７８．５７μＭ（１００μＭ 最終濃度）までの新鮮に溶解したＦｅＣｌ_２の添加によって実行した。１００％ ＤＭＳＯ（最終５％ ＤＭＳＯ）中で段階希釈した鉄溶液 ２８μＬおよび阻害剤化合物２μｌは、黒色ポリプロピレン９６ウェルマイクロタイタープレートに加えた。これに、カラム１２の８ウェル（ＬＯ対照）以外は、プレートのすべてのウェルに１０ｎＭ ＰＨＤ２（最終２ｎＭ）１０μＬを加え、シェーカー上で室温にて１時間、インキュベートさせた。カラム６は、ＰＨＤ２酵素および５％ ＤＭＳＯを媒体を含むが阻害剤化合物を含まないＨＩ対照であった。ＰＨＤ２酵素反応を開始するために、ＰＨＤ２反応緩衝液中５００ｎＭ Ｐ５６４−ＨＩＦ１αペプチド（最終１００ｎＭ）、１０ｍＭ アスコルビン酸（最終２ｍＭ）、および１．２５μＭ ２−オキソグルタラート（α−ケトグルタラート；最終０．２５μＭ）を含む溶液１０μＬを、プレートのすべてのウェルに加え、シェーカー上で室温にて１時間、インキュベートさせた。

反応は、１５０ｍＭ コハク酸（生成物阻害剤；最終５０ｍＭ）、７５ｎＭ ストレプトアビジン−ＡＰＣ（最終２５ｎＭ）、および７．５ｎＭ ＶＣＢ−Ｅｕ（最終２．５ ｎＭ）を含むＨＴＲＦ緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ ９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＢＳＡ、および０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）２５μＬの添加によって終結させた。ＨＴＲＦ検出試薬をシェーカー上に１時間配置して、結合平衡に到達させ、その後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上での読み取りを行った。ユーロピウムは３１５ｎｍで励起こさせ、ラージＳｔｏｋｅシフトを用いて、６１５ｎｍでリン光を発する。次に、ＡＰＣは、６１５ｎｍにおける励起の際に６５５ｎｍで発光する。ＨＴＲＦシグナルは、内部ユーロピウム参照６１５ｎｍ発光シグナルによって割った、ＡＰＣ ６５５ｎｍシグナルの比率として測定する。

ＰＯＣ（対照のパーセンテージ）は、阻害剤化合物を含む酵素反応における水酸化ペプチド基質からのシグナルを、ＤＭＳＯ媒体単独（ＨＩ対照）を伴うＰＨＤ２酵素からのシグナル、および酵素なしからのシグナル（ＬＯ対照）と比較することによって決定した。ＰＯＣは、次の式を使用して計算した。対照％（ＰＯＣ）＝（ｃｐｄ−平均ＬＯ）／（平均ＨＩ−平均ＬＯ）^＊１００。データ（ＰＯＣおよび阻害剤濃度、μＭからなる。）は、Ｌｅｖｅｎｂｕｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ非線形回帰アルゴリズムを使用して、４パラメーターの等式（ｙ＝Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（ｘ／Ｃ）^ΛＤ）））（ここで、Ａは最小ｙ（ＰＯＣ）値であり、Ｂは最大ｙ（ＰＯＣ）であり、Ｃは変曲点におけるｘ（ｃｐｄ濃度）であり、およびＤは傾き因子である。）にフィットさせた。

特定の実施形態において、本発明の化合物は、４０μＭ以下のＨＩＦ ＰＨＤ阻害活性ＩＣ_５０値を示す。さらなる実施形態において、本発明の化合物は、１０μＭ以下のＨＩＦ ＰＨＤ阻害活性ＩＣ_５０値を示す。

電気化学発光（ＥＣＬ）検出アッセイにおけるＨｉｓタグ化ＶＣＢのルテニウム化および適用
ＨＩＦ結合活性を保持しているルテニウム化ＶＣＢ（Ｒｕ−ＶＣＢ）を製造し、水酸化ＨＩＦペプチドの検出のためのビーズベースの電気化学発光アッセイを開発するために使用した。

以下のＨＩＦ１αペプチドを合成した（アミノ酸５５８から５７４）：
ビオチン−ＨＩＦ：ＤＬＥＭＬＡＰＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ
ビオチン−ＨＩＦ−ＯＨ：ＤＬＥＭＬＡ［ｈｙＰ］ＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬ
上記のように製造したＶＣＢは、１２：１ Ｒｕ：ＶＣＢモル濃度チャレンジ比率のために、ＶＣＢ ５００μＬ（５０ｍＭ 炭酸緩衝液、ｐＨ ９．０中１ｍｇ／ｍＬ）を、ＯＲＩ−ＴＡＧ（商標）−ＮＨＳエステル ５０μＬ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；１００％ ＤＭＳＯ中３ｍｇ／ｍＬ）と混合することによってルテニウム化した（リジン残基を通して共有結合的に）。サンプルをホイルで包んで光から保護し、化学的結合体化を、室温で１時間起こした。反応は、２Ｍグリシン ２０μＬを加えること、および１０分間温置することによって停止した。Ｒｕ−ＶＣＢは、保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）への透析によって、未結合体化Ｒｕ−タグから精製した。

ビオチン−ＨＩＦ−ＯＨのためのＥＣＬ検出試薬としてのＲｕ−ＶＣＢの使用を評価するために（ならびに、感度および直線範囲を探索するために）、ビオチン−ＨＩＦとビオチン−ＨＩＦ−ＯＨの両方を段階希釈し、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５％ ＮａＮ_３）中で、種々の濃度のＲｕ−ＶＣＢおよび０．３３μｇ／μＬ ストレプトアビジン Ｍ２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに混合した。振盪しながらの室温で２時間のインキュベーション後、反応を、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（商標）分析装置（ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で読み取った。トリプロピルアミン（ＴＰＡ、ＥＣＬ反応緩衝液中の活性成分、ＢＶ−ＧＬＯＷ（商標）、 ＢｉｏＶｅｒｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の存在下で、低電圧をＲｕ−ＶＣＢ／ビオチン−ＨＩＦ−ＯＨ結合複合体に適用し、６２０ｎｍの光を発生する酸化還元サイクル反応を生じた。このシグナルはＤｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム上で検出した。

図４は、Ｒｕ−ＶＣＢ／ビオチン−ＨＩＦ−ＯＨ結合曲線および直線範囲の決定を図示する。結果は、Ｒｕ−ＶＣＢプラスビオチン−ＨＩＦからのシグナルで割った、Ｒｕ−ＶＣＢプラスビオチン−ＨＩＦ−ＯＨの６２０ｎｍの発光として表現する。このアッセイは、０．０９７ｎＭまで少ない水酸化ビオチン−ＨＩＦペプチド標準を検出することができ（検出限界＝２×ｓ／ｂ）、１．５６ｎＭまで直線である。

本開示の他の実施形態は、本明細書に開示された説明の考慮、および本明細書に開示された本開示の実施から当業者に明らかになる。明細書および特許請求の範囲は例示のみと見なされ、本開示の真の範囲および精神は特許請求の範囲によって示されることが意図される。

ストレプトアビジン−ＡＰＣ−ヒドロキシプロピルＨＩＦ１αペプチドとのＥｕ−ＶＣＢの相互作用によって生成する蛍光シグナル対バックグラウンドの比率を図示する。 ストレプトアビジン−ＡＰＣ−ＨＩＦ１αペプチド（非水酸化）とのＥｕ−ＶＣＢの相互作用によって生成するバックグランドシグナルに対するストレプトアビジン−ＡＰＣ−ヒドロキシプロピルＨＩＦ１αペプチドとのＥｕ−ＶＣＢの相互作用によって生成するＨＴＲＦシグナルの比率を図示する。パネルＡは０−１２５ｎＭペプチド範囲を図示する。パネルＢは０から１０ｎＭペプチド範囲を図示する。 ＨＩＦ１αペプチドのＨＩＦ ＰＨＤ２水酸化を決定するためのＶＣＢ結合およびＨＴＲＦ検出を図示する。パネルＡは、ＨＩＦ ＰＨＤ２酵素量の増加に伴うＨＩＦ１αペプチドの水酸化の時間経過を図示する。パネルＢは、酵素濃度の増加に伴う初速度を図示する。 Ｒｕ−ＶＣＢ／ビオチン−ＨＩＦ−ＯＨ結合曲線、およびＥＣＬ検出による直線範囲の決定を図示する。

Claims (3)

1. 少なくとも１種の式Ｉ：
   

   

   （式中、
   ｎは１であり；
   Ｒ_１はメチルであり；
   Ｒ_２は、Ｈであり；
   Ｒ_３およびＲ_４は、Ｈ、低級アルキル、置換低級アルキル、低級ハロアルキル、または置換低級ハロアルキルから独立に選択され；または
   Ｒ_３およびＲ_４は、一緒になって３から６員環もしくは置換された３から６員環を形成可能であり；
   Ｒ_５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルコキシ、置換低級アルコキシ、およびスルファニルから選択され；
   Ｒ_６はＯＨであり；
   Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ＮＲ_３’Ｒ_４’、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＯＲ_１３、ＳＲ_１３、ＳＯ_２Ｒ_１３、ＣＮ、ＮＯ_２、ハロ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキルシリル、置換アルキルシリル、アルキニルシリル、置換アルキニルシリル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、および−Ｘ−Ｒ_１２から独立して選択され；ここで
   Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、およびＲ_１０の少なくとも一つは、アリール、置換アリール、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールから独立に選択され；
   Ｒ_３’およびＲ_４’は各々Ｈ，低級アルキル、置換低級アルキル、低級ハロアルキル、置換低級ハロアルキルから独立に選択され；または
   Ｒ_３’およびＲ_４’は一緒に結合して、３から６員環もしくは置換された３から６員環を形成可能であり；
   Ｘは−Ｎ（Ｒ_１１）−Ｙ−および−Ｙ−Ｎ（Ｒ_１１）−から選択され；
   Ｙは、Ｃ（Ｏ）、ＳＯ_２、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、および置換アルキニレンから選択され；
   Ｒ_１１は、Ｈ、低級アルキル、および置換低級アルキルから選択され；
   Ｒ_１２は、Ｈ、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから選択され；ならびに
   Ｒ_１３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、およびＮＲ_３Ｒ_４から選択される。）
   の化合物、または医薬的に許容されるその塩。
2. 下表１に示される化合物９，１０、１６〜２８、３１、３３〜３７、３９、４０、４７、５３、５７、５８、６２、８１、８２、８４、８６〜８８、９１、９３、９５〜９８、１００〜１０６、１０９、１１５〜１１９、１２３、１２５、１２７、１３０、１３１、１３４、１４１、１４３、１４４、１４５、１４９、１５１〜１５３、１５５〜１５７および１６７〜１７２のいずれか１つの構造を有する、請求項１に記載の少なくとも１種の化合物。
   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   
3. 下表２に示される化合物５６の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
   

   

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