JP5173920B2 - 多価肺炎球菌多糖類−タンパク質コンジュゲート組成物 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、医療分野、具体的には微生物学、免疫学、ワクチン、および病原菌による感染の免疫化による予防に関する。

ストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中の乳児および子どもの髄膜炎、肺炎、および重度侵襲性疾患の主な原因である。多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、長年来認証されており、高齢者および高リスク患者の肺炎球菌による疾患の予防に有益であることが立証されている。しかし、殆どの肺炎球菌多糖類に対する乳児および子どもの応答は低い。７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（７ｖＰｎＣ、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標））は、その種の中でも、乳児および子どもの侵襲性疾患および中耳炎に対して高い免疫原性および効果を有することが示された最初のワクチンであった。今やこのワクチンは、世界中の多くの国で認証されている。Ｐｒｅｖｎａｒは、ＣＲＭ_１９７と呼ばれるキャリアタンパク質とそれぞれコンジュゲートした、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆからの莢膜多糖類を含有する。Ｐｒｅｖｎａｒは、米国、欧州、および世界の他の地域における肺炎球菌による侵襲性疾患（ＩＰＤ）の、それぞれ約８０〜９０％、６０〜８０％、および４０〜８０％をカバーしている［１，２］。Ｐｒｅｖｎａｒ導入後、数年の間に収集された調査データは、予想通り、米国乳児の肺炎球菌による侵襲性疾患の減少を明示している（図１）［３，４］。

Ｐｒｅｖｎａｒ導入前の米国乳児で実施されたＩＰＤの調査は、血清群６および１９による疾患の大部分が、血清型６Ａ（約３分の１）および血清型１９Ａ（約４分の１）に起因することを示した［５，６］。Ｐｒｅｖｎａｒの認証後に米国で実施された肺炎球菌による侵襲性疾患の調査は、負荷の大きい疾患が、依然として血清型６Ａおよび１９Ａに起因することを示唆している（図１）［３］。さらにこれら２種類の血清型は、血清型１、３、５、および７Ｆの組合せよりも多くの侵襲性疾患の症例を占めている（８．２対３．３症例／２歳以下の子ども１００，０００人）。さらに、血清型６Ａおよび１９Ａは、高い割合の抗生物質耐性を伴っている（図２）［７，８，９］。より多くの子どもが免疫を与えられると、血清群交差防御（cross-protection）によって血清型６Ａおよび１９Ａの疾患の減少をもたらすことが可能であるが、その減少には限界があり、これらの血清型に起因する過重の疾患が残されることを示唆する証拠がある（以下参照）。

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血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａに起因する肺炎球菌による侵襲性疾患の相対的負荷の大きさおよび重要性を鑑みると、これらの血清型をＰｒｅｖｎａｒ処方に加えることによって、米国および欧州では９０％超、ならびにアジアおよびラテンアメリカでは７０％〜８０％にまで、侵襲性疾患への適用範囲が高まるはずである。このワクチンは、Ｐｒｅｖｎａｒ以上に適用範囲を著しく拡大し、血清群交差防御の制限に依存しない６Ａおよび１９Ａへの適用範囲を提供するはずである。

したがって、本発明は、一般に、１３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物を提供し、そのコンジュゲートのそれぞれは、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含有する。所望により、処方には、アルミニウムをベースとするアジュバントなどのアジュバントが含まれる。より具体的には、本発明は、７ｖＰｎＣワクチン（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）の７種類の血清型に加えて、６種類のさらなる血清型（１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａ）を含む１３価の肺炎球菌コンジュゲート（１３ｖＰｎＣ）組成物を提供する。

本発明はまた、莢膜多糖類がストレプトコッカスニューモニエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのものであり、キャリアタンパク質がＣＲＭ_１９７である多価免疫原性組成物を提供する。

本発明はさらに、莢膜多糖類がストレプトコッカスニューモニエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのものであり、キャリアタンパク質がＣＲＭ_１９７であり、アジュバントがリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどのアルミニウムをベースとするアジュバントである多価免疫原性組成物を提供する。本発明の特定の一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。

本発明はまた、多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物を提供し、そのコンジュゲートのそれぞれは、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含み、その莢膜多糖類は、血清型３および少なくとも１種類のさらなる血清型から調製される。

この多価免疫原性組成物の一実施形態では、さらなる血清型は、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される。別の実施形態では、キャリアタンパク質はＣＲＭ_１９７である。さらに別の実施形態では、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムをベースとするアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。

本発明はまた、多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物を提供し、そのコンジュゲートのそれぞれは、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含み、その莢膜多糖類は、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、および少なくとも１種類のさらなる血清型から調製される。

この多価免疫原性組成物の一実施形態では、さらなる血清型は、血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａからなる群から選択される。別の実施形態では、キャリアタンパク質はＣＲＭ_１９７である。さらに別の実施形態では、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムをベースとするアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の一実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。

本発明はまた、免疫学的有効量の先に記載した免疫原性組成物のいずれかをヒトに投与することを含む、ストレプトコッカスニューモニエ莢膜多糖類コンジュゲートへの免疫応答を誘発する方法を提供する。

さらに本発明は、投与される免疫原性組成物のいずれかが、４μｇの６Ｂを除き、各糖類２μｇ、ＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質約２９μｇ、元素アルミニウムアジュバント０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように処方された単回用量０．５ｍＬになるようにする。

ベースライン（１９９８／１９９９）から２００１までの米国の２歳未満の子どもにおける、血清型によるＩＰＤ割合の変化を示すグラフである。 ５歳未満の子どもにおけるペニシリン（ＰＣＮ）に耐性を有する肺炎球菌分離株の分布を示すグラフである（１９９８）。 Ｄ１１８−Ｐ１６Ｐｒｅｖｎａｒ試験からのＯＰＡ３用量後の結果の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示すグラフである。

Ｐｒｅｖｎａｒ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆの含有
１９９５〜１９９８の間のＩＰＤ調査からのデータによって、Ｐｒｅｖｎａｒの７種類の血清型が、２歳未満の子どものＩＰＤの約８２％の原因になっていると推測された［５］。効果的な試験地である北カリフォルニアでは、Ｐｒｅｖｎａｒ血清型は、乳児および子どものＩＰＤ全ての症例の９０％を占めていた［１０］。２０００年にＰｒｅｖｎａｒワクチンを導入して以来、ワクチン血清型に起因する疾患の減少により、全体的なＩＰＤ率の著しい減少があった［３，４］。したがって、今回、Ｐｒｅｖｎａｒ血清型のいずれかを肺炎球菌コンジュゲートワクチンの次の代から除去するよりも、むしろより広い適用範囲を得るために、血清型を追加する正当な事由がある。

血清型１、３、５、および７Ｆの含有
米国では、血清型１によって生ずる５歳未満の子どものＩＰＤ率は２％未満であり、タイプ３および７Ｆそれぞれとおよそ同じである［１，６］。血清型１および５は、肺炎球菌による侵襲性疾患に対して高い危険にさらされた米国人口において、より高いＩＰＤ率を占めている。特に血清型１は、アラスカ先住民の２歳未満の子どもではＩＰＤを３．５％、２〜４歳の子どもでは１８％生ずる［１１］。血清型１および血清型５の両方は、世界の他の地域および先進国の土着人口において、著しく疾患を生じるものである［１２，１３，１４］。

血清型１はまた、他の肺炎球菌血清型と比較して、より重度の疾患に関連し得る［１５］。この観察結果は、米国と欧州との間の症例同定率の差異、ならびに医療実施に関連する差異がベースとなっている。概して、ＩＰＤの発生率は米国よりも欧州の方が低い。しかし欧州では、血清型１によって生ずるＩＰＤのパーセンテージが、米国と比較して不釣り合いに高い（それぞれ６〜７％対１〜２％）。欧州では、主に入院した子どもから血液培養物を得ている。米国では、３９℃以上の発熱を示し白血球数が上昇した子どもに定めた、外来患者における日常の医療実施から血液培養物を得ている。医療実施の差異を鑑みると、米国では、血清型１によって生じる疾患のパーセンテージが低いほど、より軽度の疾患を生じる他の高い血清型率によって弱められていることがあるが、欧州では、パーセンテージが高いほど、より重篤な疾患であることを反映していると仮定される。さらに、併発性肺炎を有する子どもに関する血清疫学的研究によって、血清型１は不釣り合いに多いことが示されている［１６，１７，１８］。このことは、血清型１を含有することによって、肺炎球菌による重度の疾患の量を低減すると同時に、肺炎球菌による侵襲性疾患の全体的な低減に寄与できることを示唆している。

血清型３および７Ｆの追加によって、ＩＰＤに対する適用範囲が、世界の殆どの地域で約３％〜７％、アジアでは約９％増大することになる。したがって、１１価のワクチンは、アジアではＩＰＤを５０％、全ての他の地域で約８０％カバーするはずである［１，２］。これらの血清型は、中耳炎の適用範囲に対しても重要である［１９］。中耳炎を生じる肺炎球菌血清型の多国間の研究において、Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ等は、血清型３が全体で８番目に最も一般的な中耳液分離株であることを見い出した［２０］。血清型３は、中耳炎に関連する肺炎球菌血清型の最大８．７％を占めていた。したがって、中耳炎ならびにＩＰＤにおけるタイプ３および７Ｆの重要性からすると、肺炎球菌コンジュゲートワクチンへのそれらの含有は当然のことである。

しかし、血清型３の多糖類に対して著しい免疫原性を示す多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成する試みは成功していない。例えば、１１価の肺炎球菌タンパク質Ｄコンジュゲートワクチン（１１−Ｐｎ−ＰＤ）の免疫原性および安全性の研究において、そのワクチンを３用量投与した後、追加用量の同じワクチンまたは肺炎球菌多糖類ワクチンを投与した乳児では、血清型３に対するプライミング効果は観測されなかった（Ｎｕｒｋｋａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．Ｊ．，２３：１００８−１０１４）。別の研究では、数用量の１１−Ｐｎ−ＰＤを投与した乳児からのオプソニン食細胞の（opsonophagocytic）アッセイ（ＯＰＡ）の結果は、血清型３について、試験した他の血清型に匹敵するレベルの抗体応答を示さなかった（Ｇａｔｃｈａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒ．Ｓｏｃ．Ｐａｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（ＥＳＰＩＤ），Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ．４，ＰＩＡ Ｐｏｓｔｅｒ Ｓｅｓｓｉｏｎ １，Ｉｓｔａｎｂｕｌ Ｔｕｒｋｅｙ，Ｍａｒ．２７，２００１）。急性中耳炎の予防における１１−Ｐｎ−ＰＤの効果を評価したさらに別の研究では、そのワクチンは、血清型３によって生じるエピソードを予防しなかった（Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．ｗｗｗ．ｔｈｅｌａｎｃｅｔ．ｃｏｍ，Ｖｏｌ．３６７：７４０−７４８（Ｍａｒｃｈ ４，２００６））。したがって、血清型３からの莢膜多糖類を含み、血清型３の多糖類に対する免疫原性応答を現すことができる肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、現況技術に勝る著しい改善をもたらす。

血清型６Ａおよび１９Ａの含有
ａ．血清型６Ａおよび１９Ａの疫学
文献の調査データは、血清型６Ａおよび１９Ａが、血清型１、３、５、および７Ｆのを合わせたものと比べて、米国の２歳未満の子どもにおける肺炎球菌による侵襲性疾患の多くを占めることを示唆している（図１）［１，５］。さらに、これらの血清型には、一般に、抗生物質に対する抵抗性が伴い（図２）、中耳炎において重要な役割を担う［６，１９，２０］。６Ａおよび９Ａに起因する疾患を予防するための現在のＰｒｅｖｎａｒワクチンの能力は、明らかでない。１３ｖＰｎＣワクチンにおける６Ａおよび１９Ａ成分の含有についての論理的根拠を以下に論ずる。

ｂ．６Ｂおよび１９Ｆ多糖類によって誘発される６Ａおよび１９Ａへの応答
認可済みのコンジュゲートしていない肺炎球菌多糖類ワクチン（２歳以上のヒトへの使用）は、６Ａまたは６Ｂ莢膜多糖類のいずれかを含有していた［２１］。２３価の肺炎球菌多糖類ワクチンの処方時に得られた免疫原性データは、６Ｂの一価のワクチンが、６Ａおよび６Ｂ莢膜両方に対する抗体を誘発したことを示した。ＩｇＧを評価するいくつかの試験、ならびに遊離多糖類および肺炎球菌コンジュゲートワクチンでの様々な集団におけるオプソニン食細胞のアッセイ（ＯＰＡ）応答からのデータは、６Ｂ抗原によって６Ａに対するＩｇＧ応答が誘発されるが、その応答性は一般に低く、６Ａ有機体でのＯＰＡ活性は、６Ｂ有機体での活性とは異なっていることを示唆した［２２，２３，２４，２５］。さらに、高力価の６Ｂ抗体に応答する被検者は、６Ａに対する活性を殆どまたは全く有することができない。

高度な類似性が存在する６Ａおよび６Ｂ莢膜多糖類の化学組成物とは対照的に、１９Ａおよび１９Ｆ莢膜は、１９Ａ多糖類に２つのさらなる側鎖が存在することによって全く異なっている。当然のことながら、１９Ｆ多糖類ワクチンで免疫を与えられたヒトボランティアで測定された免疫応答は、被検者の８０％で１９Ｆに対する応答が誘発されたが、１９Ａに対して応答したのは被検者のわずか２０％であったことを示した［２６］。コンジュゲートワクチンでの試験では、１９Ｆ多糖類での免疫後の、血清型１９Ａに対する低レベルの交差反応性ＩｇＧおよびＯＰＡ応答も同様に証明されている［２４，２６］。

６Ａおよび１９Ａに対する交差反応性ＯＰＡ応答に関する内部データは、米国の乳児で実施された７ｖＰｎＣブリッジ試験（Ｄ１１８−Ｐ１６）から得られた（図３）。これらの研究は他の研究者の発見と一致し、６Ｂ多糖類での免疫後、低レベルではあるが６Ａ多糖類への交差反応性機能的抗体の誘発を示しており、１９Ｆでの免疫後の１９Ａへの機能的抗体の誘発は殆ど示していない。

動物モデルにおける６Ａおよび１９Ａへの６Ｂおよび１９Ｆ免疫のインパクト
多糖類免疫化の交差防御に対する潜在性を評価するために、動物モデルを使用した。Ｇｉｅｂｉｎｋ等によって開発された中耳炎モデルの中、チンチラを、４価の多糖類外膜タンパク質（ＯＭＰ）コンジュゲートワクチン（６Ｂ、１４、１９Ｆ、２３Ｆ糖類を含有）またはプラシーボで免疫した［２７］。この試験では、６Ａについていくつかの交差防御が見られたが、統計的有意性に達するものではなく、中耳炎からの防御レベルは６Ｂの防御レベルよりも低かった。これと同じモデルにおいて、１９Ｆ中耳炎からの防御は１００％であったが、１９Ａ中耳炎からの防御はわずか１７％であった。

Ｓａｅｌａｎｄ等は、８価の肺炎球菌破傷風コンジュゲートワクチン（６Ｂおよび１９Ｆを含有する）で免疫した乳児からの血清を使用して、６Ａ有機体での鼻腔内チャレンジの前に、肺感染モデルとしてのマウスを受動免疫した［２８］。５９の血清サンプルのうち、５３％が６Ｂでの菌血症からマウスを防御し、３７％が６Ａから防御した。１１価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（破傷風トキソイドにコンジュゲートした１９Ｆを含有する）４用量で免疫した乳児からの血清で受動免疫したマウスに、同じモデルにおける１９Ａ有機体での鼻腔内チャレンジを与えた［２９］。受動免疫し、チャレンジを与えたマウス１００匹のうち、６０匹のマウスには、肺組織で検出された１９Ａ有機体がなかったが、生理食塩水プラシーボを与えられた全てのマウスには有機体が同定された。しかし受動免疫は、このモデルにおける１９Ｆ有機体でのチャレンジに対して防御しなかった。したがって、血清群１９についてモデルの関連性は疑わしい。一般にこれらのモデルは、６Ａ有機体への６Ｂ免疫の多少の生物学的インパクトの証拠を提供するが、異種血清型への効果は、同種血清型で観測されたものほど大きくなかった。１９Ａ有機体への１９Ｆ免疫のインパクトは、これらのモデルからは十分に理解されていない。

有効性／効果試験における６Ａおよび１９Ａ疾患への６Ｂおよび１９Ｆ多糖類コンジュゲート免疫のインパクト
７ｖＰｎＣおよび９ｖＰｎＣ（７ｖＰｎＣに血清型１および５を加える）有効性試験における６Ｂ、６Ａ、１９Ｆ、および１９Ａ血清型に起因する症例の疾患数を、表１に示す［３０，１０，３１］。侵襲性疾患の症例の数は非常に少なく、血清型６Ａおよび１９Ａについての結果を得ることができない。しかしフィンランドの中耳炎試験によって、多数の肺炎球菌分離株が生成された［３２］。パープロトコル解析では、７ｖＰｎＣは、血清型６Ｂに起因する中耳炎に対して８４％（９５％ ＣＩ ６２％、９３％）の効果があり、血清型６Ａに起因する中耳炎に対して５７％（９５％ ＣＩ ２４％、７６％）の効果があった（表１）。それとは対照的に、７ｖＰｎＣでの血清型に特異的な有効性は、１９Ｆまたは１９Ａいずれかに起因する中耳炎に対して示されなかった。

市販後のＩＰＤ調査データは、Ｐｒｅｖｎａｒの効果を評価するために疾病管理センターによって実施された症例対照試験からも利用可能である［３３］。生後３〜２３ヵ月の子どもに生じた肺炎球菌による侵襲性疾患の症例が、調査研究室で同定され、年齢およびジップコードによる３つの対照の症例と一致した。保護者と症例および対照の医療提供者とから承諾を得た後、病歴および免疫歴（被検者が少なくとも１用量のＰｒｅｖｎａｒを投与された場合、免疫したとみなした）を得た。２００３年のＩＣＡＡＣミーティングで、中間結果を提示した。６Ｂ、１９Ｆ、１９Ａ、および６Ａ疾患についての発見の概要を表２に提示する。これらのデータによって、Ｐｒｅｖｎａｒが、血清型６Ｂ疾患よりもいくらか低いレベルであるものの、６Ａに起因する疾患を予防できることが示されている。これらのデータはまた、１９Ａに起因する侵襲性疾患に対する交差防御が制限されていることを示す。

また、Ｐｒｅｖｎａｒの使用による公表済み解析［３］は、２歳未満の子どもにおいて、血清型６Ｂおよび１９Ｆが、血清型６Ａおよび１９Ａによって生じるＩＰＤに中程度の減少をもたらしたことを示した（表１［３］）。非免疫成人では、血清型６Ａ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２３Ａ、および２３Ｂによって生じる疾患率（「全てのワクチン関連血清型」）がいくらか低減した（表２［３］）。これらのデータによって、２歳未満の子どもにおけるＰｒｅｖｎａｒの使用による集団免疫は、血清型６Ａおよび１９Ａについては軽度であったことが確立され、本発明の１３ｖＰｎＣワクチンへの血清型６Ａおよび１９Ａの含有の根拠が与えられる。

６Ａおよび１９Ａの追加による結論
７ｖＰｎＣワクチンに関する図１および表２に示されている市販後のＩＰＤ調査データおよび症例対照研究の結果は、上記の動物モデルにおける免疫応答および免疫性能の他の情報と一致し、６Ａ疾患に対していくらかの交差防御があり得るが、６Ｂ疾患に対してはより低度であることを示唆している。さらに、１９Ａからの防御には制限があると思われる。したがって、血清型６Ａおよび１９Ａを含有する１３ｖＰｎＣワクチンは、血清型６Ｂおよび１９Ｆによる血清群交差防御の制限に依存しない適用範囲を提供する。

したがって本発明は、１３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物を提供し、そのコンジュゲートのそれぞれは、キャリアタンパク質にコンジュゲートした異なる莢膜多糖類を含有し、その莢膜多糖類は、ストレプトコッカスニューモニエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから調製される。そのようなキャリアタンパク質の１つが、ＣＲＭ_１９７と呼ばれるジフテリアトキソイドである。さらに免疫原性組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどのアルミニウムをベースとするアジュバントといったアジュバントを含むことができる。

莢膜多糖類は、当業者に周知の標準の技術によって調製される。本発明では、莢膜多糖類は、ストレプトコッカスニューモニエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから調製される。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、個別のプロセスによって調製され、単回用量処方に処方される。例えば一実施形態では、大豆ベースの培地で各肺炎球菌多糖類血清型を増殖させる。次いで個々の多糖類を、遠心分離、沈殿、限外ろ過、およびカラムクロマトグラフィーによって精製する。精製した多糖類を化学的に活性化させて、キャリアタンパク質と反応することができる糖類を生成する。

活性化すると、各莢膜多糖類は別々にキャリアタンパク質とコンジュゲートして、複合糖質を形成する。一実施形態では、各莢膜多糖類は、同じキャリアタンパク質にコンジュゲートする。この実施形態では、還元的アミノ化によってコンジュゲーションを実施する。

多糖類の化学的活性化およびその後のキャリアタンパク質とのコンジュゲーションは、従来の手段によって実現される。例えば、米国特許第４，６７３，５７４および第４，９０２，５０６を参照されたい［３４，３５］。

キャリアタンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原性（nonreactogenic）であり、十分な量および純度で得られるタンパク質である。キャリアタンパク質は、通常のコンジュゲーション手順に順応するはずである。本発明の特定の一実施形態では、キャリアタンパク質としてＣＲＭ_１９７を使用する。

ＣＲＭ_１９７（Ｗｙｅｔｈ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地で増殖したコリネバクテリウムジフテリア株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離した、ジフテリア毒素の非毒性変異（すなわちトキソイド）である。ＣＲＭ_１９７は、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。あるいは、ＣＲＭ_１９７は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１４，３８２に従って、組換え技術によって調製される。他のジフテリアトキソイドも、キャリアタンパク質としての使用に適している。

他の適切なキャリアタンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載［３８］）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＬＴ、大腸菌ＳＴ、およびシュードモナスエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が含まれる。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）などの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡまたはグループＢストレプトコッカスからのＣ５ａペプチダーゼ、あるいはヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、キャリアタンパク質として使用できる。

莢膜多糖類をキャリアタンパク質にコンジュゲートした後、多糖類−タンパク質コンジュゲートを様々な技術によって精製する（多糖類−タンパク質コンジュゲートの量に対して強化する）。これらの技術には、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過が含まれる。以下の実施例を参照のこと。

個々の複合糖質を精製した後、それらを化合して、ワクチンとして使用できる本発明の免疫原性組成物を処方する。本発明の免疫原性組成物の処方は、当分野で認められている方法を使用して実現することができる。例えば、１３種類の個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理学的許容できるビヒクルと共に処方して、組成物を調製することができる。このようなビヒクルの具体例には、それらに限定されるものではないが、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびデキストロース溶液が含まれる。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含む。本明細書に定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を強化する働きをする物質である。したがってアジュバントは、しばしば免疫応答を高めるために与えられ、当業者には周知のものである。組成物の効果を高める適切なアジュバントには、それらに限定されるものではないが、以下が含まれる。
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、
（２）水中油エマルジョン処方（ムラミルペプチド（以下に定義）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤を含むまたは含まない）、例えば、
（ａ）スクアレンを５％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．５％、およびＳｐａｎ８５を０．５％（所望により、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する（不要であっても、以下を参照のこと））を含有し、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロン粒子に処方したＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）スクアレンを１０％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．４％、ｐｌｕｒｏｎｉｃブロックトポリマーＬ１２１を５％、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下参照）を含有し、サブミクロンエマルジョンにマイクロ流体化され、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたＳＡＦ、ならびに、
（ｃ）スクアレンを２％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．２％、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種または複数の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、
（３）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）などのサポニンアジュバント（米国特許第５，０５７，５４０号）を使用することができ、またはＩＳＣＯＭｓ（免疫賦活複合体）など、それらから生成される粒子、
（４）米国特許第６，１１３，９１８号に記載の、細菌リポ多糖類、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、あるいはそれらの誘導体または類似体などの合成脂質Ａ類似体；このようなＡＧＰの１つが、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として周知）、水性形態または安定なエマルジョンとして処方される；ＣｐＧモチーフ（複数）を含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、
（５）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８等）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、副刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２等、
（６）細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化変異体、例えば、野生型または変異形態のコレラ毒素（ＣＴ）（例えば、アミノ酸位置が２９のグルタミン酸は、公開済み国際特許出願ＷＯ００／１８４３４（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照のこと）に従って、別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換される）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）、ならびに
（７）組成物の効果を高めるために免疫賦活剤として作用する他の物質。

ムラミルペプチドには、それらに限定されるものではないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等が含まれる。

本発明のワクチン処方は、全身または粘膜経路を介してそのワクチンを投与することによって、肺炎球菌感染を受けやすいヒトを予防または治療するために使用できる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下経路を介する、あるいは口腔／消化管、呼吸器、または泌尿生殖器への粘膜投与を介する注射が含まれ得る。一実施形態では、肺炎または中耳炎の治療に、鼻腔内投与が使用される（より効果的に肺炎球菌の鼻咽頭保菌を予防することができ、したがってその最初の段階で感染を弱毒化することができるため）。

各ワクチン用量におけるコンジュゲートの量は、著しい副作用なしに免疫防御応答を誘発する量として選択される。このような量は、肺炎球菌の血清型に依存して変わり得る。一般に、各用量は、多糖類０．１〜１００μｇ、具体的には０．１〜１０μｇ、より具体的には１〜５μｇからなるはずである。

ある特定のワクチンに対する成分の最適な量は、被験者の適切な免疫応答を観測する標準の研究によって確定することができる。最初のワクチン投与後、被験者は、適切な間隔で１回または数回の追加免疫を受けることができる。

本発明の特定の一実施形態では、１３ｖＰｎＣワクチンは、個々にＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖類の滅菌液体処方である。各用量０．５ｍＬは、４μｇの６Ｂを除き、各糖類２μｇ、ＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質約２９μｇ、元素アルミニウム０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように処方される。その液体は、単回用量のシリンジに保存剤なしで充填される。振とう後、ワクチンは、筋肉内投与に使用できる均質な白色懸濁液になる。

１３ｖＰｎＣワクチンの用量レベルの選択は、市販の７ｖＰｎＣワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ）と同じである。１用量につき４μｇの６Ｂを除き、全ての血清型について糖類２μｇの用量レベルが選択された。７ｖＰｎＣワクチンは、血清型４、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆについては糖類２μｇの用量レベルで、６Ｂについては４μｇの用量で、ＩＰＤに対する望ましい安全性、免疫原性、および有効性を示した。

７ｖＰｎＣワクチンに合わせて設計された免疫スケジュールに従ってもよい。例えば、１３ｖＰｎＣワクチンに含まれる血清型に起因するＳ．ニューモニエによって生じる侵襲性疾患に対する乳児および幼児の通常のスケジュールは、生後２、４、６、および１２〜１５カ月である。本発明の組成物は、より年長の子ども、青少年、および成人への使用にも適している。

さらに本発明の組成物は、他の細菌での感染によって生じる中耳炎に対して使用するために、１種または複数のさらなる抗原を含むことができる。このような細菌には、型別不能のヘモフィルスインフルエンザ、モラクセラカタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（以前はブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）として周知）、およびアロイオコッカスオティティディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ ｏｔｉｔｉｄｉｓ）が含まれる。

含有に適した型別不能のヘモフィルスインフルエンザ抗原の例には、タンパク質「ｅ」としても知られるＰ４タンパク質（米国特許第５，６０１，８３１号；国際特許出願ＷＯ０３／０７８４５３）、ＰＡＬとしても知られるＰ６タンパク質またはＰＢＯＭＰ−１タンパク質（米国特許第５，１１０，９０８号；国際特許出願ＷＯ０１００７９０）、Ｐ５タンパク質（米国再発行特許第３７，７４１号）、ヘモフィルス接着性および浸透タンパク質（米国特許第６，２４５，３３７号および同第６，６７６，９４８号）、ＬＫＰ先端付着因子タンパク質（米国特許第５，６４３，７２５号）、およびＮｕｃＡタンパク質（米国特許第６，２２１，３６５号）が含まれる。

含有に適したモラクセラカタラーリス抗原の例には、ＵｓｐＡ２タンパク質（米国特許第５，５５２，１４６号、同第６，３１０，１９０号）、ＣＤタンパク質（米国特許第５，７２５，８６２号）、Ｅタンパク質（米国特許第５，９４８，４１２号）、および７４キロダルトン外膜タンパク質（米国特許第６，８９９，８８５号）が含まれる。

含有に適したアロイオコッカスオティティディス抗原の例には、国際特許出願ＷＯ０３／０４８３０４で同定されているものが含まれる。

本発明の組成物は、ストレプトコッカスニューモニエからの１種または複数のタンパク質を含むこともできる。含有に適したストレプトコッカスニューモニエタンパク質の例には、国際特許出願ＷＯ０２／０８３８５５で同定されているもの、ならびに国際特許出願ＷＯ０２／０５３７６１に記載されているものが含まれる。

本発明の組成物はさらに、ネイセリアメニンジタイディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タイプＢからの１種または複数のタンパク質を含むこともできる。含有に適したネイセリアメニンジタイディスタイプＢのタンパク質の例には、国際特許出願ＷＯ０３／０６３７６６、ＷＯ２００４／０９４５９６、ＷＯ０１／８５７７２、ＷＯ０２／１６６１２、およびＷＯ０１／８７９３９で同定されているものが含まれる。

概して、本発明は先の開示によって説明される。以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができよう。これらの実施例は例示目的のみに記載され、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖類血清型1の調製
マスターおよび使用セルバンクの調製
Ｓ．ニューモニエ血清型１を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ、株６３０１から入手した。その株を拡大し、動物由来成分を除去するために、数世代の原種を創生した（Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３代）。原種の２つの追加世代を生成した。Ｆ３バイアルから第１の追加世代を生成し、第１の追加世代のバイアルから次の世代を生成した。冷凍保存剤として合成グリセロールを用いて、種バイアルを冷凍保存した（−７０℃未満）。Ｆ４代については、冷凍バイアルに加えて凍結乾燥バイアルを調製した。セルバンクの調製では、全ての培養物を大豆ベースの培地で増殖させた。冷凍前に、細胞を遠心分離によって濃縮し、使用済み培地を除去し、合成グリセロールなどの冷凍保存剤を含有する新しい培地に細胞ペレットを再懸濁した。

発酵および集菌
使用セルバンクからの培養物を使用して、大豆ベースの培地を入れた種ボトルを接種した。そのボトルを、増殖要件が満たされるまで、３６℃±２℃で撹拌なしにインキュベートした。種ボトルを使用して、大豆ベースの培地を入れた種発酵槽を接種した。滅菌炭酸ナトリウム溶液でｐＨを約７．０に維持した。標的の光学的密度に達した後、その種発酵槽を使用して、大豆ベースの培地を入れた生成発酵槽を接種した。滅菌炭酸ナトリウム溶液でｐＨを維持した。増殖の停止後または発酵槽の使用容量に達したとき、発酵を終了した。適切な量の滅菌した１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加して、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖類を放出した。溶解後、発酵槽の内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのｐＨを、酢酸でｐＨ約６．６に調整した。その溶解物を、連続的フロー遠心分離に次いで、深層ろ過および０．４５μｍの精密ろ過によって清浄化した。

代替プロセスでは、発酵ｐＨを３ＮのＮａＯＨで約７．０に維持した。標的の光学的密度に達した後、種発酵槽を使用して、大豆ベースの培地を入れた生成発酵槽を接種した。３ＮのＮａＯＨでｐＨを維持した。増殖の停止後または発酵槽の使用容量に達したとき、発酵を終了した。適切な量の滅菌した１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加して、ブロス中の濃度が０．１２％になるようにし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖類を放出した。溶解後、発酵槽の内容物を、８〜２４時間間隔にて７℃〜１３℃の温度で撹拌しながら保持して、完全な細胞溶解および多糖類の放出が確実に生ずるようにした。この保持時間中の撹拌によって、発酵槽壁およびｐＨプローブ上への溶解沈殿物の固着が防止され、したがってｐＨプローブの完全性を維持することができた。次に、溶解した培養ブロスのｐＨを、５０％酢酸でｐＨ約５．０に調整した。１２〜２４時間間隔にて１５℃〜２５℃の温度で撹拌なしに保持した後、多糖類が殆ど損失しないまたは分解しない固体沈殿物として、既に溶解していたタンパク質の実質的な部分が溶液から離脱し（dropped out）、溶液に残存した。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続的フロー遠心分離に次いで、深層ろ過および０．４５μｍの精密ろ過によって清浄化した。

精製
肺炎球菌多糖類の精製は、いくつかの濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過工程からなっていた。別段の指定がない限り、全ての手順を室温で実施した。

Ｓ．ニューモニエ血清型１の発酵槽培養物からの清浄化ブロスを、１００ｋＤａのＭＷＣＯ（キロダルトン分画分子量）フィルターを使用して濃縮し、ダイアフィルトレーションした。リン酸ナトリウム緩衝液を使用して、中性ｐＨでダイアフィルトレーションを実現した。ダイアフィルトレーションによって、核酸、タンパク質、および多糖類などの高分子量のバイオポリマーから、低分子量の培地成分を除去した。

原液からのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＢ）を添加することによって、濃縮しダイアフィルトレーションした溶液から多糖類が沈殿して、ＨＢの最終濃度１％（ｗ／ｖ）を得た。多糖類／ＨＢ沈殿物をデプスフィルターで捕捉し、ろ液を廃棄した。沈殿物を含有するデプスフィルターを介して塩化ナトリウム溶液を再循環させることによって、多糖類沈殿物を再び可溶化し、溶出させた。次いで、フィルターをさらなる塩化ナトリウム溶液ですすいだ。

Ｎａｌ原液からのヨウ化ナトリウム（Ｎａｌ）を多糖類溶液に添加して、最終濃度０．５％を実現して、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を、深層ろ過によって除去した。ろ液は、標的多糖類を含有している。沈殿槽およびフィルターをＮａＣｌ／Ｎａｌ溶液ですすぎ、そのすすぎ液を一部分精製した多糖類溶液と混合した。フィルターを廃棄した。次いで、多糖類を０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、塩化ナトリウム溶液でダイアフィルトレーションした。

活性炭を含浸させたデプスフィルターを介してろ過することによって、一部分精製した多糖類溶液をさらに精製した。ろ過後、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖類溶液と混合し、次いでそれを０．２μｍのフィルターでろ過する。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で調整して、最終濃度０．０２５Ｍのリン酸ナトリウムを実現した。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。

セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して、適切な伝導率を得た（１５μＳ未満）。次いで、多糖類溶液をカラムに搭載した。これらの条件下、樹脂および多糖類に結合した不純物を、カラムからの貫流によって回収した。多糖類溶液を、カラムの前後に位置した０．２μｍの直列フィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯのフィルターを使用して、多糖類溶液を濃縮した。次いで、濃縮物を注射用水（ＷＦＩ）でダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖類溶液を、０．２μｍの膜フィルターでろ過して、ポリプロピレンボトルに入れた。遊離試験のためにサンプルを除去し、精製した多糖類を−２５℃±５℃で冷凍保存した。

特性決定
１Ｈ−ＮＭＲデータは、多糖類分子のプロトンに割り当てられたシグナル配置による化学構造と一致した。多糖類のＯ−アセチル官能基を定量化する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、十分に分解された一連のシグナル（メチル基からのプロトン）を示した。

特定の抗血清を使用する向流免疫電気泳動によって、一価の多糖類の同定を確認した。

サンプル濃縮物に関連して、屈折率検出器および多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器につないだ高速ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、分子量を計算した。

サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用して、多糖類の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。

実施例２
血清型１肺炎球菌多糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製した多糖類の容器を解凍し、反応槽中で混合した。その槽に、ｐＨ９．０の０．２Ｍ炭酸ナトリウムを添加して、５０℃で３時間、部分的に脱アセチル化（加水分解）した。反応物を２０℃に冷却し、０．２Ｍの酢酸で中和した。過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２〜８℃でインキュベートすることによって酸化を行い、混合物を１５〜２１時間撹拌した。

３０ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物を０．９％のＮａＣｌで１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのろ過にかけた。活性化した糖類を、１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し、−７５℃でシェル凍結させ、凍結乾燥させた。

「シェル凍結」は、凍結乾燥（フリーズドライ）のためにサンプルを調製する方法である。アルコールまたは他の任意の適切な流体を入れた冷蔵槽中、フラスコを電動駆動ローラーで自動的に回転させる。生成物の薄いコーティングを、フラスコの「シェル」内部周りに均質に凍結させ、各フリーズドライ運転中、より多量の材料を安全に加工できるようにする。これらの自動冷凍ユニットは、一度に多くのフラスコを予め冷凍する、簡単で効率的な手段を提供し、内部に所望のコーティングを実現し、効率的なフリーズドライのために十分な表面領域を提供する。

凍結乾燥させた材料のボトルを室温に戻し、糖類／タンパク質が２：１の比で、ＣＲＭ_１９７溶液に再懸濁した。糖類／タンパク質混合物に、１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を添加して、０．２Ｍの最終イオン強度およびｐＨ７．５にし、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を２３℃で１８時間インキュベートし、その後３７℃で７２時間、２回目のインキュベーションを実施した。シアノ水素化ホウ素のインキュベーション後、冷却生理食塩水で反応混合物を希釈し、その後１Ｍの炭酸ナトリウムを添加して、反応混合物をｐＨ９．０に調整した。水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で３〜６時間インキュベートすることによって、未反応アルデヒドをクエンチした。

反応混合物を生理食塩水で２倍希釈し、０．４５〜５μｍのプレフィルターを通過させて保持液槽に入れた。反応混合物を、ｐＨ６の０．１５Ｍリン酸緩衝液で３０倍に、生理食塩水で２０倍にダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を希釈して、０．９％の生理食塩水中、標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードの最終バルク濃縮物（ＦＢＣ）容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

特性決定
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。

特定の抗血清型を使用するスロットブロットアッセイによって、コンジュゲートの同定を確認した。

ウロン酸およびローリーアッセイによって、糖類およびタンパク質の濃度をそれぞれ決定した。共有結合したコンジュゲート複合体の糖質とタンパク質との比率を、次の計算式によって得た。

Ｏ−アセチル含量を、Ｈｅｓｔｒｉｎ法によって測定した（Ｈｅｓｔｒｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４９，１８０、ｐ．２４９）。Ｏ−アセチル濃度と総糖類濃度との比率によって、糖類１ｍｇにつき数μモルのＯ−アセチルを得た。

実施例３
Ｓ．ニューモニエ筴膜多糖類血清型３の調製
マスターおよび使用セルバンクの調製
Ｓ．ニューモニエ血清型３を、ペンシルバニア州フィラデルフィア、ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｓｔｒｉａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照のこと。

発酵および集菌
使用セルバンクからの培養物を使用して、大豆ベースの培地を入れた種ボトルを接種した。そのボトルを、増殖要件が満たされるまで、３６℃±２℃で撹拌なしにインキュベートした。種ボトルを使用して、大豆ベースの培地を入れた種発酵槽を接種した。滅菌炭酸ナトリウム溶液で、ｐＨを約７．０に維持した。標的の光学的密度に達した後、その種発酵槽を使用して、中間種発酵槽を接種した。標的の光学的密度に達した後、その中間発酵槽を使用して、生成発酵槽を接種した。滅菌炭酸ナトリウム溶液でｐＨを維持した。発酵槽の使用容量に達した後、発酵を終了した。適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加して、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖類を放出した。溶解後、発酵槽の内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのｐＨを、酢酸でｐＨ約６．６に調整した。その溶解物を、連続的フロー遠心分離に次いで、深層ろ過および０．４５μｍの精密ろ過によって清浄化した。

精製
肺炎球菌多糖類の精製は、いくつかの濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過工程からなっていた。別段の指定がない限り、全ての手順を室温で実施した。

Ｓ．ニューモニエ血清型３の発酵槽培養物からの清浄化ブロスを、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、ダイアフィルトレーションした。リン酸ナトリウム緩衝液を使用して、中性ｐＨでダイアフィルトレーションを実現した。ダイアフィルトレーションによって、核酸、タンパク質、および多糖類などの高分子量のバイオポリマーから、低分子量の培地成分を除去した。

ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＢ）の添加の前に、計算された容量のＮａＣｌ原液を、濃縮しダイアフィルトレーションした多糖類溶液に添加して、最終濃度０．２５ＭのＮａＣｌを得た。次いで、原液からのＨＢを添加することによって多糖類が沈殿して、最終濃度１％（ｗ／ｖ）のＨＢを得た。多糖類／ＨＢ沈殿物をデプスフィルターで捕捉し、ろ液を廃棄した。沈殿物を含有するデプスフィルターを介して塩化ナトリウム溶液を再循環させることによって、多糖類沈殿物を再び可溶化し、溶出させた。次いで、フィルターをさらなる塩化ナトリウム溶液ですすいだ。

Ｎａｌ原液からのヨウ化ナトリウム（Ｎａｌ）を多糖類溶液に添加し、最終濃度０．５％を実現して、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を、深層ろ過によって除去した。ろ液は、標的多糖類を含有していた。沈殿槽およびフィルターをＮａＣｌ／Ｎａｌ溶液ですすぎ、そのすすぎ液を、一部分精製した多糖類溶液と混合した。フィルターを廃棄した。次いで、多糖類を０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、塩化ナトリウム溶液でダイアフィルトレーションした。

活性炭を含浸させたデプスフィルターを介してろ過することによって、一部分精製した多糖類溶液をさらに精製した。ろ過後、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。そのすすぎ液を多糖類溶液と混合し、次いでそれを０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で調整して、最終濃度０．０２５Ｍのリン酸ナトリウムを実現した。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。

セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して、適切な伝導率を得た（１５μＳ）。次いで、多糖類溶液をカラムに搭載した。これらの条件下、樹脂および多糖類に結合した不純物を、カラムからの貫流によって回収した。多糖類を、緩衝液でカラムフラッシュし、０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して、多糖類溶液を濃縮した。次いで、濃縮物をＷＦＩでダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖類溶液を、０．２μｍ膜フィルターでろ過して、ステンレス鋼容器に入れた。遊離試験のためにサンプルを除去し、精製した多糖類を−２５℃±５℃で冷凍保存した。

特性決定
１Ｈ−ＮＭＲデータは、多糖類分子のプロトンに割り当てられたシグナル配置による化学構造と一致した。

特定の抗血清を使用する向流免疫電気泳動によって、一価の多糖類の同定を確認した。

サンプル濃縮物に関連して、屈折率検出器および多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器につないだ高速ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、分子量を計算した。

サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用して、多糖類の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。

実施例４
血清型３肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製した血清型３糖類の容器を解凍し、反応槽中で混合した。その槽に、ＷＦＩおよび２Ｍの酢酸を添加して、糖類の最終濃度を０．２Ｍとし、２ｍｇ／ｍＬにした。溶液の温度を１時間で８５℃に上げて、多糖類を加水分解した。反応物を２５℃以下に冷却し、１Ｍの塩化マグネシウムを添加して、最終濃度を０．１Ｍにした。過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２３℃で１６〜２４時間インキュベートすることによって酸化を行った。

１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物をＷＦＩで１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

化合のために、ｐＨ７．０の０．２Ｍリン酸ナトリウムを活性化糖類に添加して、最終濃度１０ｍＭおよびｐＨ６．０〜６．５にした。ＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質を糖類溶液と混合して、ＣＲＭ_１９７１ｇにつき糖類２ｇの比率とした。混合した糖類／タンパク質溶液を、標的充填物５０ｍＬと共に１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し、−７５℃でシェル凍結させ、凍結乾燥させた。

共に凍結乾燥させた糖類／タンパク質材料のボトルを室温に戻し、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁して、糖類の最終濃度を２０ｍｇ／ｍｌにした。ｐＨを６．５に調整し、次いで０．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を、３７℃で４８時間インキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーション後、反応混合物を、冷却した５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水緩衝液で希釈した。水酸化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で３〜６時間インキュベートすることによって、未反応アルデヒドをクエンチした。反応混合物を、０．４５〜５μｍのプレフィルターを介して保持液槽に移した。

反応混合物を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ９）で３０倍に、０．１５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６）で２０倍に、５ｍＭのコハク酸塩／０．９％の生理食塩水で２０倍にダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を希釈して、糖類標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードのＦＢＣ容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

特性決定
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。

特定の抗血清を使用するスロットブロットアッセイによって、コンジュゲートの同定を確認した。

アントロンおよびローリーアッセイによって、糖類およびタンパク質の濃度をそれぞれ決定した。共有結合したコンジュゲート複合体の糖類とタンパク質との比率を、次の計算式によって得た。

実施例５
Ｓ．ニューモニエ筴膜多糖類血清型５の調製
Ｓ．ニューモニエ血清型５を、ニューヨーク州ブルックリン、ニューヨーク州立大学のＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照のこと。多糖類の発酵、集菌、精製、および特性決定については、実施例１を参照のこと。

代替発酵プロセス
使用セルバンクからの培養物を使用して、大豆ベースの培地および１０ｍＭの滅菌ＮａＨＣＯ_３溶液を入れた種ボトルを接種した。そのボトルを、増殖要件が満たされるまで、３６℃±２℃で撹拌なしにインキュベートした。種ボトルを使用して、大豆ベースの培地および１０ｍＭの滅菌ＮａＨＣＯ_３溶液を入れた種発酵槽を接種した。３ＮのＮａＯＨでｐＨを約７．０に維持した。標的の光学的密度に達した後、その種発酵槽を使用して、大豆ベースの培地を入れた濃度１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３の生成発酵槽を接種した。３ＮのＮａＯＨでｐＨを維持した。増殖の停止後または発酵槽の使用容量に達したとき、発酵を終了した。適切な量の滅菌した１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加して、ブロス中の濃度が０．１２％になるようにし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖類を放出した。溶解後、発酵槽の内容物を、８〜２４時間間隔にて７℃〜１３℃の温度で撹拌しながら保持して、完全な細胞溶解および多糖類の放出が確実に生ずるようにした。この保持時間中の撹拌によって、発酵槽壁およびｐＨプローブ上への溶解沈殿物の固着が防止され、したがってｐＨプローブの完全性を維持することができた。次に、溶解した培養ブロスのｐＨを、５０％酢酸でｐＨ約４．５に調整した。１２〜２４時間間隔にて１５℃〜２５℃の温度で撹拌なしに保持した後、多糖類が殆ど損失しないまたは分解しない固体沈殿物として、既に溶解していたタンパク質の実質的な部分が溶液から離脱し、溶液に残存した。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続的フロー遠心分離に次いで、深層ろ過および０．４５μｍの精密ろ過によって清浄化した。

実施例６
血清型５肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型５糖類の容器を解凍し、反応槽中で混合した。その槽に、ｐＨ４．７の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、その後過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２３℃で１６〜２２時間インキュベートすることによって酸化を行った。

１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物をＷＦＩで１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

血清型５活性化糖類を、０．８：１の比でＣＲＭ_１９７と混合した。混合した糖類／タンパク質溶液を、１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し（標的充填物５０ｍＬ）、−７５℃でシェル凍結させ、共に凍結乾燥させた。

共に凍結乾燥させた材料のボトルを室温に戻し、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸ナトリウムに再懸濁し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を３０℃で７２時間インキュベートし、その後シアノ水素化ホウ素の２回目の添加を行い、３０℃で２０〜２８時間インキュベートした。

シアノ水素化ホウ素のインキュベーション後、反応混合物を生理食塩水で２倍希釈し、０．４５〜５μｍのプレフィルターを介して保持液槽に移した。反応混合物を、０．０１Ｍのリン酸緩衝液で３０倍に、ｐＨ８の０．１５Ｍリン酸緩衝液で２０倍に、ｐＨ６の生理食塩水で２０倍にダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を希釈して、糖類標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードのＦＢＣ容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

コンジュゲートの特性決定については、実施例２を参照のこと。

実施例７
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖類血清型６Ａの調製
Ｓ．ニューモニエ血清型６Ａを、ニューヨーク州ブルックリン、ニューヨーク州立大学のＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照のこと。多糖類の発酵、集菌、および精製については、精製中、クロマトグラフィー工程の前の３０ｋＤａのＭＷＣＯ濃縮工程を省略することを除き、実施例１を参照のこと。

実施例８
血清型６Ａ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型６Ａ多糖類は高分子量のポリマーであり、酸化の前にそのサイズを縮小しなければならなかった。血清型６Ａ糖類の容器を解凍し、反応槽中で混合した。その槽に、２Ｍの酢酸を添加して最終濃度を０．１Ｍにし、６０℃で１．５時間加水分解した。反応物を２３℃に冷却し、反応生成物を１ＭのＮａＯＨでｐＨ６に調整することによって中和した。過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２３℃で１４〜２２時間インキュベートすることによって酸化を行った。

１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物をＷＦＩで１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

血清型６Ａを、ショ糖と化合させ、１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し（標的充填物５０ｍＬ）、−７５℃でシェル凍結させ、凍結乾燥させた。

凍結乾燥させた材料のボトルを室温に戻し、１：１の糖類／タンパク質の比で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加後、反応混合物を２３℃で１８時間インキュベートした。シアノ水素化ホウ素のインキュベーション後、反応混合物を冷却生理食塩水で希釈した。水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で３〜２０時間インキュベートすることによって、未反応アルデヒドをクエンチした。

希釈した反応混合物を、５μｍプレフィルターを介して保持液槽に移した。反応混合物を、０．９％のＮａＣｌで１０倍に、コハク酸塩−緩衝ＮａＣｌで３０倍にダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を希釈して、糖類標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードのＦＢＣ容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

コンジュゲートの特性決定については、実施例２を参照のこと。

実施例９
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖類血清型７Ｆの調製
Ｓ．ニューモニエ血清型７Ｆを、ニューヨーク州ブルックリン、ニューヨーク州立大学のＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製、ならびに多糖類の発酵および集菌については、実施例３を参照のこと。発酵および集菌の代替プロセスは、実施例１に記載の代替プロセスを参照のこと。

精製
肺炎球菌多糖類の精製は、いくつかの濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過工程からなっていた。別段の指定がない限り、全ての手順を室温で実施した。

Ｓ．ニューモニエ血清型７Ｆの発酵槽培養物からの清浄化ブロスを、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮し、ダイアフィルトレーションした。リン酸ナトリウム緩衝液を使用して、中性ｐＨでダイアフィルトレーションを実現した。ダイアフィルトレーションによって、核酸、タンパク質、および多糖類などの高分子量のバイオポリマーから、低分子量の培地成分を除去した。

血清型７Ｆは、ＨＢを伴う沈殿物を形成しない。その代わり、原液からのＨＢを添加することによって、濃縮しダイアフィルトレーションした溶液から不純物が沈殿して、ＨＢの最終濃度が１％になった。沈殿物をデプスフィルターで捕捉し、フィルターを破棄した。ろ液には多糖類が含まれていた。

Ｎａｌ原液からのヨウ化ナトリウム（Ｎａｌ）を多糖類溶液に添加して、最終濃度０．５％を実現して、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を、深層ろ過によって除去した。ろ液は、標的多糖類を含有していた。沈殿槽およびフィルターをＮａＣｌ／Ｎａｌ溶液ですすぎ、そのすすぎ液を、一部分精製した多糖類溶液と混合した。フィルターを廃棄した。次いで、多糖類を０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、塩化ナトリウム溶液でダイアフィルトレーションした。

活性炭を含浸させたデプスフィルターを介してろ過することによって、一部分精製した多糖類溶液をさらに精製した。ろ過後、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。そのすすぎ液を多糖類溶液と混合し、次いでそれを０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で調整して、最終濃度０．０２５Ｍのリン酸ナトリウムを実現した。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。

セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して、適切な伝導率を得た（１５μＳ）。次いで、多糖類溶液をカラムに搭載した。これらの条件下、樹脂および多糖類に結合した不純物を、カラムからの貫流によって回収した。多糖類を緩衝液でカラムフラッシュし、０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して、多糖類溶液を濃縮した。次いで、濃縮物をＷＦＩでダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖類溶液を、０．２μｍ膜フィルターでろ過して、ステンレス鋼容器に入れた。遊離試験のためにサンプルを除去し、精製した多糖類を２℃〜８℃で保存した。

多糖類の特性決定については、実施例３を参照のこと。

実施例１０
血清型７Ｆ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２３℃で１６〜２４時間インキュベートすることによって、酸化を行った。

１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物をｐＨ４．５の１０ｍＭのＮａＯＡｃで１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

血清型７Ｆを、１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し（標的充填物５０ｍＬ）、−７５℃でシェル凍結させ、凍結乾燥させた。

凍結乾燥させた血清型７ＦおよびＣＲＭ_１９７のボトルを室温に戻し、１．５：１の糖類／タンパク質の比で、ＤＭＳＯに再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加後、反応物を２３℃で８〜１０時間インキュベートした。水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で１６時間インキュベートすることによって、未反応アルデヒドをクエンチした。

反応混合物を冷却生理食塩水で１０倍希釈し、５μｍのプレフィルターを介して保持液槽に移した。反応混合物を、０．９％の生理食塩水で１０倍に、コハク酸塩−緩衝生理食塩水で３０倍にダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を希釈して、０．９％の生理食塩水中、糖類標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードのＦＢＣ容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

コンジュゲートの特定化については、実施例４を参照のこと。

実施例１１
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖類血清型１９Ａの調製
Ｓ．ニューモニエ血清型１９Ａを、ニューヨーク州ブルックリン、ニューヨーク州立大学のＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照のこと。多糖類の発酵、集菌、および精製については、実施例７を参照のこと。特性決定については、実施例３を参照のこと。

実施例１２
血清型１９Ａ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型１９Ａ糖類の容器を解凍し、反応槽中で混合した。酢酸ナトリウムを添加して１０ｍＭ（ｐＨ５．０）にし、過ヨウ素酸ナトリウムの存在下、２３℃で１６〜２４時間インキュベートすることによって酸化を行った。

１００ＫのＭＷＣＯ膜を使用して、活性化反応混合物をｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸で１０倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

活性化糖類をショ糖と化合し、その後ＣＲＭ_１９７を添加した。血清型１９Ａ活性化糖類およびＣＲＭ_１９７混合物（比０．８：１）を、１００ｍＬのガラス製の凍結乾燥用ボトルに充填し（標的充填物５０ｍＬ）、−７５℃でシェル凍結させて、凍結乾燥させた。

凍結乾燥させた材料のボトルを室温に戻し、ＤＭＳＯに再懸濁した。糖類／タンパク質混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応物を２３℃で１５時間インキュベートした。シアノ水素化ホウ素のインキュベーション後、水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で３〜２０時間インキュベートすることによって、未反応アルデヒドをクエンチした。

反応混合物を冷却生理食塩水で１０倍希釈し、５μｍプレフィルターを介して保持液槽に移した。反応混合物を、０．４５μｍのろ過にかけた０．９％のＮａＣｌで１０倍に、ｐＨ６の５ｍＭコハク酸／０．９％ＮａＣｌ緩衝液を使用したダイアフィルトレーションで３０倍に、ダイアフィルトレーションした。保持液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

コンジュゲート溶液を、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生地食塩水を使用して希釈して、標的を０．５ｍｇ／ｍＬにし、次いで滅菌ろ過して、クラス１００フードのＦＢＣ容器に入れた。コンジュゲートを２〜８℃で保存した。

コンジュゲートの特性決定については、実施例４を参照のこと。

実施例１３
Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖類血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆの調製
Ｓ．ニューモニエ種培養物の調製
Ｓ．ニューモニエ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを、ニューヨーク州ブルックリン、ニューヨーク州立大学のＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。Ｓ．ニューモニエ血清型１４を、ＡＴＣＣ、株６３１４から入手した。

ストレプトコッカスニューモニエの所望の血清型それぞれ１個のバイアルを別々に使用して、回分発酵を開始した。大豆ベースの培地およびフェノールレッドを入れた２つのボトルを、炭酸ナトリウムを使用してｐＨ７．４±０．２の範囲に調整し、次いで必要量の５０％デキストロース／１％硫酸マグネシウム溶液をそれらのボトルに添加した。２つのボトルに異なる量の種を接種した。培地が黄色に変わるまで、ボトルを３６℃±２℃でインキュベートした。インキュベーション後、各ボトルからサンプルを除去し、光学的密度（ＯＤ）（０．３〜０．９）およびｐＨ（４．６〜５．５）に関して試験した。２つのボトルのうち１つを、種発酵槽の接種用に選択した。

大豆ベースの培地を種発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％デキストロース／１％硫酸マグネシウム溶液を、その発酵槽に添加した。種発酵槽のｐＨおよび撹拌をモニターし、制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。種接種物（ボトル）を、種発酵槽に無菌連結し、接種物を移した。発酵槽をｐＨ制御下で維持し、サンプルを周期的に除去し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。６００ｎｍにて所望のＯＤである０．５に達したとき、中間発酵槽を種発酵槽からの発酵ブロスで接種した。

大豆ベースの培地を中間発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％デキストロース／１％硫酸マグネシウム溶液を、その発酵槽に添加した。中間発酵槽のｐＨおよび撹拌をモニターし、制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。種発酵槽の内容物を、中間発酵槽に移した。発酵槽をｐＨ制御下で維持し、サンプルを周期的に除去し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。６００ｎｍにて所望のＯＤである０．５に達したとき、生成発酵槽を中間発酵槽からの発酵ブロスで接種した。

大豆ベースの培地を生成発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％デキストロース／１％硫酸マグネシウム溶液を、その発酵槽に添加した。生成発酵槽のｐＨおよび撹拌をモニターし、制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。発酵が終了するまで、発酵槽をｐＨ制御下で維持し、サンプルを周期的に除去し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。

デオキシコール酸ナトリウムを発酵槽に添加して、最終濃度約０．１２％ｗ／ｖにした。培養物を最低３０分間混合し、温度設定点を１０℃に下げた。培養物を終夜インキュベートし、不活化を確認した後、必要に応じて培養物のｐＨを５０％酢酸で６．４〜６．８に調整した。発酵槽の温度を２０℃±５℃に上げ、内容物を浄化保持タンクに移した。

浄化保持タンクの内容物（細胞破片を含む）を、１時間につき２５〜６００リットルのフロー速度で、遠心処理にかけた（細胞破片を廃棄し、フロー速度を１時間につき２５〜２５０リットルに固定した血清型４を除く）。上清のサンプルを除去し、ＯＤについて試験した。遠心分離中の望ましいＯＤは、０．１５以下であった。

最初に、０．０５±０．０３のＯＤを実現するまで、デプスフィルターアセンブリを介して上清を再循環させた。次いで、デプスフィルターアセンブリおよび０．４５μｍ膜フィルターに上清を通過させて、ろ液保持タンクに入れた。

その後、加工のために、密閉パイプを介して生成物を精製領域に移した。

上記の操作全て（遠心分離、ろ過、および移動）を、１０℃〜３０℃で実施した。

血清型４および６Ｂについての発酵および集菌の代替プロセスは、実施例１に記載の代替プロセスを参照のこと。

精製
肺炎球菌多糖類の精製は、いくつかの濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層ろ過工程からなっていた。別段の指定がない限り、全ての手順を室温で実施した。

１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して、所望のＳ．ニューモニエ血清型の発酵槽培養物からの清浄化ブロスを濃縮し、ダイアフィルトレーションした。リン酸ナトリウム緩衝液を使用して、ｐＨ９．０未満でダイアフィルトレーションを実現した。ダイアフィルトレーションによって、核酸、タンパク質、および多糖類などの高分子量のバイオポリマーから、低分子量の培地成分を除去した。

原液からのＨＢを添加することによって、濃縮しダイアフィルトレーションした溶液から多糖類が沈殿して、ＨＢの最終濃度１％（ｗ／ｖ）を得た（最終濃度２．５％の血清型２３Ｆを除く）。多糖類／ＨＢ沈殿物をデプスフィルターで捕捉し、ろ液を廃棄した（注：血清型１４は沈殿せず、したがってろ液を保持する）。沈殿物を含有するデプスフィルターを介して塩化ナトリウム溶液を再循環させることによって、多糖類沈殿物を再び可溶化し、溶出させた。次いで、フィルターをさらなる塩化ナトリウム溶液ですすいだ。

Ｎａｌ原液からのヨウ化ナトリウム（Ｎａｌ）を多糖類溶液に添加し、最終濃度０．５％を実現してＨＢを沈殿させた（最終濃度０．２５％の血清型６Ｂを除く）。沈殿物を深層ろ過によって除去した。ろ液は、標的多糖類を含有していた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖類を０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、塩化ナトリウム溶液でダイアフィルトレーションした。

活性炭を含浸させたデプスフィルターを介してろ過することによって、一部分精製した多糖類溶液をさらに精製した。ろ過後、塩化ナトリウム溶液で炭素フィルターをすすいだ。すすぎ液を多糖類溶液と混合し、次いでそれを０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で多糖類溶液を濃縮し、塩化ナトリウム溶液でフィルターをすすいだ。ｐＨをチェックし、７．０±０．３に調整した。

ｐＨ７．０±０．３および伝導率２６±４μＳになるまで、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを平衡化した。次いで、多糖類溶液をカラムに搭載した。これらの条件下、樹脂および多糖類に結合した不純物を、カラムからの貫流によって回収した。多糖類溶液を、０．２μｍのフィルターでろ過した。

３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターを使用して、多糖類溶液を濃縮した。次いで、伝導率が１５μＳ未満になるまで、濃縮物をＷＦＩでダイアフィルトレーションした。

ダイアフィルトレーションした多糖類溶液を、０．２μｍ膜フィルターでろ過してバルク容器に入れ、２〜８℃で保存した。

実施例１４
血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆの肺炎球菌糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
活性化プロセス
この実施例に記載するように、異なる血清型糖類は、活性化（活性化の前に加水分解する、または加水分解しない）およびコンジュゲーション（水性またはＤＭＳＯ反応）のための異なる経路に従う。

多糖類を、バルク容器から反応槽に移した。次いで、多糖類をＷＦＩおよびリン酸ナトリウムで希釈して、最終濃度範囲１．６〜２．４ｍｇ／ｍＬにした。

工程１
血清型６Ｂ、９Ｖ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆについて、ｐＨをｐＨ６．０±０．３に調整した。

血清型４について、塩酸（最終的な酸濃度０．０１Ｍ）を添加し、溶液を４５℃±２℃で２５〜３５分間インキュベートした。２１〜２５℃に冷却し、１Ｍのリン酸ナトリウムを添加して、標的をｐＨ６．７±０．２にすることによって、加水分解を停止させた。工程中の試験を実施して、適切なレベルの脱ピルビル化（depyruvylation）を確認した。

血清型１８Ｃについて、氷酢酸（最終的な酸濃度０．２Ｍ）を添加し、溶液を９４℃±２℃で２０５〜２１５分間インキュベートした。次いで、温度を２１〜２５℃に下げ、１〜２Ｍのリン酸ナトリウムを添加して、標的をｐＨ６．８±０．２にした。

工程２：過ヨウ素反応
糖類含量（血清型４を除く）を使用して、肺炎球菌糖類活性化に必要とされる過ヨウ素酸ナトリウムのモル当量を決定した。血清型４については、糖類１モルにつき過ヨウ素酸ナトリウム０．８〜１．２モルの比率を使用した。十分に混合することによって、温度を１５℃以下にした１９Ｆを除く全ての血清型について、２１〜２５℃で１６〜２０時間、酸化反応を進行させた。

工程３：限外ろ過
１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過（１８Ｃについては５ｋＤａの限外ろ過）で、ＷＦＩ（血清型１９ＦについてはｐＨ６．０の０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液）を用いて、酸化した糖類を濃縮し、ダイアフィルトレーションした。透過物を廃棄し、保持液を、０．２２μｍのフィルターでろ過した。

工程４：凍結乾燥
血清型４、９Ｖ、および１４について、濃縮糖類をＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質と混合し、ガラス製ボトルに充填し、シェル凍結させ、−６５℃以下で保存した。凍結した濃縮糖類−ＣＲＭ_１９７を凍結乾燥させ、次いで−２５℃±５℃で保存した。

血清型６Ｂ、１９Ｆ、および２３Ｆについて、コンジュゲーション反応混合中、５％±３％のショ糖濃度を実現するように計算した特定量のショ糖を添加した。血清型１８Ｃは、ショ糖を添加する必要がなかった。次いで、濃縮糖類をガラス製ボトルに充填し、シェル凍結させ、−６５℃以下で保存した。凍結した濃縮糖類を凍結乾燥させ、次いで−２５℃±５℃で保存した。

コンジュゲーションプロセス
２種類のコンジュゲーションプロセス；血清型４、９Ｖ、１４、および１８Ｃについては水性コンジュゲーション、血清型６Ｂ、１９Ｆ、および２３ＦについてはＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した。

水性コンジュゲーション
工程１：溶解
血清型４、９Ｖ、および１４について、凍結乾燥した活性化糖類−ＣＲＭ_１９７混合物を解凍し、室温で平衡化した。次いで、凍結乾燥した活性化糖類−ＣＲＭ_１９７を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液中、以下の一般的な比率で再構成した。
血清型４および９Ｖについては、糖類１６〜２４ｇにつき緩衝液１Ｌ
血清型１４については、糖類６〜１０ｇにつき緩衝液１Ｌ

完全に溶解するまで、血清型９Ｖについては３７℃±２℃、血清型４および１４については２３℃±２℃で、反応混合物をインキュベートした。

血清型１８Ｃについて、凍結乾燥した糖類を、ＣＲＭ_１９７溶液１Ｌにつきリン酸ナトリウム０．１１Ｌの一般的な比率の、ＣＲＭ_１９７の１Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム中溶液で再構成した。完全に溶解するまで、反応混合物（糖類濃度８〜１２ｇ／Ｌ）を、２３℃±２℃でインキュベートした。

この段階で、ｐＨを工程管理として試験した。

工程２：コンジュゲーション反応
血清型４および９Ｖについて、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して、糖類１モルにつきシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０〜１．４モルを実現することによって、コンジュゲーション反応を開始した。反応混合物を、３７℃±２℃で４４〜５２時間インキュベートした。次いで、温度を２３℃±２℃に下げ、塩化ナトリウム０．９％を反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して、糖類１モルにつき水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量を実現した。混合物を、２３℃±２℃で３〜６時間インキュベートした。混合物を０．９％の塩化ナトリウムで希釈し、反応器をすすいだ。希釈したコンジュゲーション混合物を、１．２μｍのプレフィルターを使用してろ過し、保持槽に入れた。

血清型１４および１８Ｃについて、シアノ水素化ホウ素溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して、糖類１モルにつきシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０〜１．４モルを実現することによって、コンジュゲーション反応を開始した。反応混合物を、２３℃±２℃で１２〜２４時間インキュベートした。温度を３７℃±２℃に上げ、反応物を７２〜９６時間インキュベートした。次いで、温度を２３℃±２℃に下げ、０．９％の塩化ナトリウムを反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して、糖類１モルにつき水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量を実現した。混合物を、２３℃±２℃で３〜６時間インキュベートした。混合物を０．９％の塩化ナトリウムで希釈し、反応器をすすいだ。次いで、希釈したコンジュゲーション混合物を、１．２μｍのプレフィルターを使用してろ過し、保持槽に入れた。

工程３：限外ろ過１００ｋＤａ
１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外ろ過で、最少１５容量（血清型４）または４０容量（血清型９Ｖ、１４、および１８Ｃ）の０．９％塩化ナトリウムを用いて、希釈したコンジュゲーション混合物を濃縮し、ダイアフィルトレーションした。

透過物を廃棄した。

血清型４について、保持液を、０．４５μｍのフィルターでろ過した。

この工程で、工程管理（糖類内容物）を実施した。

工程４：ＨＡカラム精製
この工程は、血清型４コンジュゲートについてのみ実施した。

まず、０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０±０．３）を使用してＨＡカラムを中和し、次いで０．９％の塩化ナトリウムで平衡化した。ろ過した保持液（血清型４）を、フロー速度１．０Ｌ／分でカラムに搭載した。０．９％の塩化ナトリウムを用いて、フロー速度２．０Ｌ／分以下でカラムを洗浄した。次いで、０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、フロー速度２．０Ｌ／分以下で生成物を溶出した。

次いで、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜で、最小２０容量の０．９％塩化ナトリウムを用いてＨＡ画分を濃縮し、ダイアフィルトレーションした。透過物を廃棄した。

工程５：滅菌ろ過
１００ｋＤａのＭＷＣＯダイアフィルトレーション後の保持液を、０．２２μｍのフィルターでろ過した。工程管理（糖類内容物、遊離タンパク質、遊離糖類、およびシアン化物）を、ろ過した生成物で実施した。ろ過した保持液で工程管理を実施して、ＦＢＣ標的を満たすためのさらなる濃縮、ダイアフィルトレーション、および／または希釈が必要かどうかを決定した。これらの試験および付加的試験を、ＦＢＣサンプルで反復した。

必要に応じて、ろ過したコンジュゲートを０．９％の塩化ナトリウムで希釈して、０．５５ｇ／Ｌ未満の最終濃度を実現した。この段階で、糖類含量、タンパク質含量、および糖類：タンパク質の比について遊離試験を実施した。

最後に、コンジュゲートをろ過し（０．２２μｍ）、２．６４ｇ／キャニスターの一般的な量で、１０Ｌのステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含量、タンパク質含量、ｐＨ、糖類：タンパク質の比、およびリシン含量を、工程管理として実施した。この段階で、遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、エンドトキシン、分子サイズの決定、残存シアン化物、糖類同定、ＣＲＭ_１９７同定）を実施した。

ＤＭＳＯコンジュゲーション
工程Ｉ：溶解
凍結乾燥した活性化糖類血清型６Ｂ、１９Ｆ、２３Ｆ、および凍結乾燥したＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質を、室温で平衡化し、ＤＭＳＯで再構成した。溶解濃度は、一般にＤＭＳＯ１リットルにつき糖類２〜３グラム（タンパク質２〜２．５ｇ）の範囲であった。

工程II：コンジュゲーション反応
活性化糖類およびＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質を、血清型６Ｂおよび１９ＦについてはＣＲＭ_１９７１ｇにつき糖類０．６〜１．０ｇの範囲の比率で、または血清型２３についてはＣＲＭ_１９７１ｇにつき糖類１．２〜１．８ｇの範囲の比率で、２３℃±２℃で６０〜７５分間混合した。

活性化糖類１モルに対してシアノ水素化ホウ素ナトリウム０．８〜１．２モル当量の比率で、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することによって、コンジュゲーション反応を開始した。ＷＦＩを反応混合物に添加して、標的１％（ｖ／ｖ）にし、その混合物を、４０時間を超えて２３℃±２℃でインキュベートした。

水素化ホウ素ナトリウム溶液１００ｍｇ／ｍＬ（一般的に、活性化糖類１モルにつき水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量）およびＷＦＩ（標的５％ｖ／ｖ）を、反応物に添加し、その混合物を２３℃±２℃で３〜６時間インキュベートした。この手順によって、糖類に存在する未反応アルデヒドが低減した。次いで、反応混合物を、０．９％の塩化ナトリウムを入れた１５℃未満の希釈タンクに移した。

工程III：１００ｋＤａ限外ろ過
希釈したコンジュゲート混合物を、１．２μｍのフィルターでろ過し、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜で、最小１５容量の０．９％塩化ナトリウム（血清型２３Ｆについては０．０１Ｍのリン酸ナトリウム／０．０５ＭのＮａＣｌ緩衝液を使用した）を用いて濃縮し、ダイアフィルトレーションした。透過物を廃棄した。保持液を、０．４５μｍのフィルターでろ過した。工程中の糖類内容物のサンプルを、この段階で採取した。

工程ＩＶ：ＤＥＡＥカラム精製
この工程は、血清型２３Ｆについてのみ実施した。

ＤＥＡＥカラムを、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で平衡化した。ろ過した保持液（血清型２３Ｆ）をカラムに搭載し、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。次いで、生成物を０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出した。

工程Ｖ：１００ｋＤａ限外ろ過
６Ｂおよび１９Ｆからの保持液を、少なくとも３０容量の０．９％塩化ナトリウムで濃縮し、ダイアフィルトレーションした。透過物を廃棄した。

血清型２３Ｆからの溶出液を、最小２０容量の０．９％塩化ナトリウムで濃縮し、ダイアフィルトレーションした。透過物を廃棄した。

工程ＶＩ：滅菌ろ過
１００ｋＤａのＭＷＣＯダイアフィルトレーション後の保持液を、０．２２μｍのフィルターでろ過した。工程管理（糖類含量、遊離タンパク質、遊離糖類、残存ＤＭＳＯ、および残存シアン化物）を、ろ過した生成物で実施した。ＦＢＣ標的を満たすためのさらなる濃縮、ダイアフィルトレーション、および／または希釈が必要かどうかを決定するために、ろ過した保持液で工程管理を実施した。これらの試験および付加的試験を、ＦＢＣサンプルで反復した。

必要に応じて、ろ過したコンジュゲートを０．９％塩化ナトリウムで希釈して、最終濃度０．５５ｇ／Ｌ未満を実現した。この段階で、糖類含量、タンパク質含量、および糖類：タンパク質の比について遊離試験を実施した。

最後に、コンジュゲートをろ過し（０．２２μｍ）、２．６４ｇ／キャニスターの量で、１０Ｌのステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含量、タンパク質含量、ｐＨ、糖類：タンパク質の比、およびリシン含量を、工程管理として実施した。この段階で、遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、エンドトキシン、分子サイズの決定、残存シアン化物、残存ＤＭＳＯ、糖類同定、およびＣＲＭ_１９７同定）を実施した。

実施例１５
多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの処方
１３種類のコンジュゲートの最終バルク濃縮物は、０．８５％の塩化ナトリウムを含有する。タイプ３、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａのバルク濃縮物は、ｐＨ５．８で、５ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液も含有する。バッチ容量およびバルク糖類濃度に基づいて、バルク濃縮物の必要量を計算した。０．８５％の塩化ナトリウム（生理食塩水）８０％および必要量のコハク酸塩緩衝液を、ラベル前の処方槽に添加した後、バルク濃縮物を添加した。次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜フィルターユニットを使用して、調製物を０．２２μｍの膜で滅菌ろ過して、第２の容器に入れた。第１の容器を、残りの０．８５％塩化ナトリウム２０％で洗浄し、その溶液を同じフィルターに通過させ、第２の容器に収集した。処方したバルクを、バルクのリン酸アルミニウムの添加中およびその後に、静かに混合した。必要に応じてｐＨをチェックし、調整した。処方したバルク生成物を、２〜８℃で保存した。

処方したバルク生成物を、ベクトンディッキンソンから入手した、タイプ１のホウケイ酸塩のガラス製シリンジに充填した。濁度について、ワクチンを一定間隔でモニターして、充填作業の均一性を確実にした。充填したワクチン（最終生成物）を、２〜８℃で保存した。

実施例１６
１３価コンジュゲートワクチンの免疫原生
今まで、１３ｖＰｎＣワクチンに対する前臨床研究をラビットで実施してきた。研究＃ＨＴ０１−００２１および＃ＨＴ０１−００３６は、Ｓ．ニューモニエからの莢膜多糖類（ＰＳｓ）の、ＣＲＭ_１９７に対する化学的コンジュゲーション効果と、リン酸アルミニウム（ＡＩＰＯ_４）アジュバントの、ラビットにおける１３ｖＰｎＣワクチンへの免疫応答に対する効果を独立に調べるために設計された。これらの効果は、血清ＩｇＧ濃度については抗原特異的なＥＬＩＳＡによって、抗体機能についてはオプソニン食細胞のアッセイ（ＯＰＡ）によって特徴付けられた。

研究＃ＨＴ０１−００２１
研究＃ＨＴ０１−００２１によって、ＡＩＰＯ_４アジュバントと共に、ワクチン血清型特異的な免疫応答を現す１３ｖＰｎＣワクチンの能力を調査した。１３ｖＰｎＣワクチンで表される肺炎球菌血清型には、タイプ１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆが含まれる。第２の目的は、抗体応答の動態および持続時間の評価を含んでいた。ニュージーランドホワイトラビットを、０週目および２週目に、ＡＩＰＯ_４（１００μｇ／用量）と共に処方した、またはＡＩＰＯ_４なしで処方した各多糖類の計画的ヒト臨床用量（６Ｂの４μｇを除き、各ＰＳを２μｇ）で、筋肉内注射によって免疫した。様々な時点で、血清を収集した。血清型特異的なＩｇＧをＥＬＩＳＡによって測定し、機能的活性をＯＰＡによって評価した。

表３は、１３ｖＰｎＣワクチンの２用量後のプール血清サンプルにおいて実現した幾何平均価（ＧＭＴ）を示している。ＩｇＧ ＧＭＴの比を使用して、４週〜０週の応答を比較した。これらのデータは、１３ｖＰｎＣ処方がＡＩＰＯ_４を含むことによって、アジュバントを伴わない同じワクチンと比べ、より高いレベルのＩｇＧ抗体が現れたことを示している。抗体応答は、処方がＡＩＰＯ_４を含む場合よりも高いが、これらの増加は統計的に有意ではなかった。

また、２種類の１３ｖＰｎＣ処方での免疫後の機能的抗体応答を、ラビットで評価した（表４）。アジュバントを伴うワクチン処方または伴わないワクチン処方を比較すると、１３ｖＰｎＣ＋ＡＩＰＯ_４ワクチン処理グループで、より高いＯＰＡ ＧＭＴが観測された。両方のグループにおける全てのワクチン血清型に対して、４週目の血清プールでＯＰＡ価が検出された。４週目に測定されたＯＰＡ価は、血清型の殆どについて、０週目（ベースライン）のＯＰＡ価より少なくとも４倍高かった。

１３ｖＰｎＣワクチン血清型のそれぞれに対する動態応答は、両方の処理グループの血清プールから評価した。各血清型に対するＩｇＧ価を、０週目と、１、２、３、４、８、１２、２６、および３９週目とに採取した血液から測定し、その後比較した。血清型１を除いて、アジュバントを伴うワクチンを投与された動物の抗体応答は、アジュバントなしのワクチンを投与された動物の抗体応答よりも優れており、免疫スケジュールの２週目でピークに達した（データは示さず）。

概して、リン酸アルミニウムと共に処方した１３ｖＰｎＣワクチンは、ラビットにおいては免疫原性を示し、ワクチンに含まれる肺炎球菌莢膜多糖類に対する実質的な抗体応答を表していること、およびこれらの応答は機能的活性に関連していることがデータによって示されている。１３ｖＰｎＣ＋ＡＩＰＯ_４で免疫した後の、７種の主要な血清型に対する観測された応答は、７価の処方に対するラビットの時刻歴応答と一致する。

研究＃ＨＴ０１−００３６
研究＃ＨＴ０１−００３６によって、ＣＲＭ_１９７タンパク質とコンジュゲーションしたまたはコンジュゲーションしていない１３ｖＰｎＣワクチンで免疫した後の、ワクチンに含まれる多糖類（ＰＳｓ）に対するラビットの免疫応答を比較した。ニュージーランドホワイトラビットを、０週目および２週目に、各ＰＳ用量２．２μｇ（６Ｂ４．４μｇを除く）で筋肉内注射により免疫した。３種類のワクチン調製物、（ａ）１３ｖＰｎＣ（ＣＲＭ_１９７に直接コンジュゲートしたＰＳ）、（ｂ）１３ｖＰｎＰＳ（遊離ＰＳ）、または（ｃ）１３ｖＰｎＰＳ＋ＣＲＭ_１９７（ＣＲＭ_１９７と混合した遊離ＰＳ）の１つを、動物に投与した。全てのワクチン調製物は、アジュバントとしてのＡＩＰＯ_４を１２５μｇ／用量含有していた。

全てのワクチン調製物に対する血清型特異的な免疫応答を、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡと、機能的抗体を測定する補体媒介性ＯＰＡで評価した。免疫応答を、処理グループ間で比較した。

表５は、抗原特異的なＩｇＧ ＥＬＩＳＡで分析した、４週目の血液から得られたＧＭＴデータを示す。追加分析は、４週〜０週のＧＭＴ値の比を示す。データは、コンジュゲートワクチン調製物が、遊離ＰＳまたは遊離ＰＳ＋ＣＲＭ_１９７ワクチンよりも高い血清ＩｇＧ価を現したことを示している。Ｓ．ニューモニエタイプ１４を除き、１３ｖＰｎＣワクチンは、ＯＰＡにおいて、Ｓ．ニューモニエの代表的な株に対する機能的抗体を誘発することができた（表６）。１３ｖＰｎＰＳまたは１３ｖＰｎＰＳ＋ＣＲＭ_１９７ワクチンでの２種の免疫の後、測定した１３種類のうち１０種類の血清型について、どちらも４週目対０週目で８倍以上のＯＰＡ価を誘発することができなかった（表６）。

結論として、これらの結果は、１３価の肺炎球菌ワクチン多糖類のコンジュゲーションが、遊離多糖類単独または非コンジュゲートＣＲＭ_１９７と混合した遊離多糖類で見られるものよりも高い血清ＩｇＧ価および全体的に高い機能的抗体をもたらすことを示している。

先の議論および実施例は、単に特定の実施形態の詳細な説明を提示するものであることを理解されたい。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な改変形態および相当する形態を使用できることが当業者には明らかとなろう。

本特許出願に特定されている全ての学術論文、他の参考文献、特許、および特許出願は、参照によってその全体が組み込まれる。

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３４．U.S. Patent No. 4,673,574.
３５．U.S. Patent No. 4,902,506.

Claims (27)

1. 多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物であって、ここで前記多糖類−タンパク質コンジュゲートが１３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートからなり、そのコンジュゲートの各々がキャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含み、その莢膜多糖類が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、ここで前記キャリアタンパク質がＣＲＭ_１９７であり、ここでコンジュゲーションが還元的アミノ化により実施されている、多価免疫原性組成物。
2. さらにアジュバントを含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
3. アジュバントがリン酸アルミニウムであるところの、請求項２記載の免疫原性組成物。
4. ストレプトコッカスニューモニエ莢膜多糖類コンジュゲートに対する免疫応答を誘発するための、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
5. ワクチン投与に用いるための、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
6. 最初のワクチン投与後、投与対象が適切な間隔で１回または数回の追加免疫を受けるワクチン投与に用いるための、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
7. 免疫スケジュールが生後２、４、６、および１２〜１５カ月である、乳児および幼児のワクチン投与に用いるための、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
8. 青少年および成人のワクチン投与に用いるための、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
9. １３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物であって、そのコンジュゲートの各々がキャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含み、その莢膜多糖類が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、ここで前記キャリアタンパク質がＣＲＭ１９７であり、ここで各用量が４．４μｇの６Ｂを除き各多糖類２．２μｇを含む、多価免疫原性組成物。
10. ストレプトコッカスニューモニエ莢膜多糖類コンジュゲートに対する免疫応答を誘発するための、請求項９に記載の免疫原性組成物。
11. ワクチン投与に用いるための、請求項９に記載の免疫原性組成物。
12. 最初のワクチン投与後、投与対象が適切な間隔で１回または数回の追加免疫を受けるワクチン投与に用いるための、請求項９に記載の免疫原性組成物。
13. 免疫スケジュールが生後２、４、６、および１２〜１５カ月である、乳児および幼児のワクチン投与に用いるための、請求項９に記載の免疫原性組成物。
14. 青少年および成人のワクチン投与に用いるための、請求項９に記載の免疫原性組成物。
15. １３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に含む多価免疫原性組成物であって、そのコンジュゲートの各々がキャリアタンパク質にコンジュゲートしたストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの莢膜多糖類を含み、その莢膜多糖類が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、ここで前記キャリアタンパク質がＣＲＭ１９７であり、ここで各０．５ｍｌ用量が４．４μｇの６Ｂを除き各多糖類２．２μｇ、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質２９μｇ、元素アルミニウム０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含む、多価免疫原性組成物。
16. ストレプトコッカスニューモニエ莢膜多糖類コンジュゲートに対する免疫応答を誘発するための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
17. ワクチン投与に用いるための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
18. 最初のワクチン投与後、投与対象が適切な間隔で１回または数回の追加免疫を受けるワクチン投与に用いるための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
19. 免疫スケジュールが生後２、４、６、および１２〜１５カ月である、乳児および幼児のワクチン投与に用いるための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
20. 青少年および成人のワクチン投与に用いるための、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
21. 各々がＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖類の滅菌液体処方物を充填された単回用量シリンジであって、各０．５ｍＬ用量が、６Ｂを４．４μｇとすることを除き、各糖類を２．２μｇにて；ＣＲＭ_１９７キャリアタンパク質を２９μｇにて；アルミニウム元素を０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウムを０．５ｍｇ）のアジュバントにて；ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように処方されるところの、単回用量シリンジ。
22. 筋肉内投与するための、請求項２１に記載の単回用量シリンジ。
23. 各々がＣＲＭ _１９７ にコンジュゲートした血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖類の滅菌液体処方物を充填された単回用量シリンジであって、各０．５ｍＬ用量が、６Ｂを４μｇとすることを除き、各糖類を２μｇにて；ＣＲＭ _１９７ キャリアタンパク質を２９μｇにて；アルミニウム元素を０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウムを０．５ｍｇ）のアジュバントにて；ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように処方されるところの、単回用量シリンジ。
24. 筋肉内投与するための、請求項２３に記載の単回用量シリンジ。
25. １３種類の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを生理学的に許容できるビヒクルとともに含む多価免疫原性組成物の製法であって、各コンジュゲートは異なる莢膜多糖類ＣＲＭ_１９７タンパク質コンジュゲートを含有し、ここで
    莢膜多糖類はストレプトコッカスニューモニエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、
    各々の多糖類は遠心分離、沈殿、限外ろ過およびカラムクロマトグラフィーを通じて精製され、
    精製された多糖類はキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７と反応することができるように化学的に活性化され、
    いったん活性化されると、各莢膜多糖類は別々にキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７とコンジュゲートして複合糖質を形成し、
    各々の複合糖質は精製および化合され免疫原性組成物に調製される、
    製法。
26. コンジュゲーションが還元的アミノ化により実施される、請求項２５に記載の製法。
27. １３の異なる多糖類−タンパク質コンジュゲートを生理学的に許容できるビヒクルとともに含む多価免疫原性組成物の製法であって、そのコンジュゲートの各々はストレプトコッカスニューモニエの異なる血清型からの、キャリアタンパク質にコンジュゲートした莢膜多糖類を含み、
    莢膜多糖類は血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、
    ここで前記キャリアタンパク質はＣＲＭ_１９７であり、
    ここで各々の複合糖質が精製されたのち化合され免疫原性組成物に調製される、
    製法。

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