CH660375A5 - Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica. - Google Patents

Description

La presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione di una proteina correlata alla tossina difterica mediante coltura in un mezzo nutritivo liquido con concentrazioni di ioni ferro da 0,05 ng/ml a 0,5 ng/ml, ad una temperatura da 30° C a 40° C, in un ambiente di coltura neutro ed in condizioni aerobiche, un microorganismo appartenente al genere Corynebacterium diphteriae con due fagi mutati condificanti per la proteina correlata alla tossina difterica integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma.

La tossina difterica è una proteina estremamente tossica nei confronti delle cellule eucariotiche.

Detta tossina è costituita da due subunità: il frammento B, capace di legarsi ai recettori presenti sulla membrana delle cellule eucariotiche ed il frammento A, tossico, che dopo penetrazione nelle cellule ne blocca la sintesi proteica.

La tossina difterica è codificata da un gene, la cui struttura primaria è stata recentemente determinata (C. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Reserch. 11, 6589—6595, 1983), presente nel DNA di alcuni batteriofagi correlati (ß, y, co) capaci di infettare il Corynebacterium diphteriae (J. J. Costa et al. J. Bacteriol, 148,124—130 (1981); V. Freeman, J. Bacteriol. 61,675-688 (1951)).

I suddetti fagi, dopo aver infettato il batterio possono li-sarlo e quindi ucciderlo, oppure possono integrarsi nel cro-mosomo batterico, rimanere quiescenti e replicarsi tutte le volte che il batterio si replica.

II DNA del fago integrato verrà trasmesso insieme al cromosoma batterico alle cellule figlie che conterranno così il gene condificante per la proteina.

Attualmente, la tossina difterica è prodotta coltivando il ceppo PWg e viene impiegata, dopo detossificazione con formolo, per la preparazione del vaccino antidifterico. Di recente, mutanti del fago ß sono stati ottenuti, mediante trattamento con nitrosoguanidina, da Uchida et al. (Nature New Biol. 233, 8 — 11 (1973)).

Detti fagi mutanti integrati nel cromosoma batterico del microorganismo Corynebacterium diphteriae, codificavano s la sintesi di proteine correlate alla tossina difterica, dalla quale differivano in struttura e/o funzione per la presenza di una o più mutazioni inserite nel gene strutturale della tossina.

Dette proteine vennero chiamate Cross Reacting Materi-io als (CRM), in quanto davano una cross reazione immunolo-gica con la tossina difterica.

Fra i vari fagi mutanti isolati, furono studiati in particolare quelli che codificavano per le proteine CRM 176, CRM 197, CRM 228 e CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem., 218, 15 3838-3844(1973)).

In particolare, il CRM 45 è una proteina costituita da un frammento A, simile in struttura e funzione a quello della tossina difterica e da un frammento B privo di un segmento capace di legare la proteina ai recettori presenti sulla superfi-20 eie delle cellule eucariotiche.

Ne consegue che, il CRM 45 pur avendo un frammento A completamente attivo in vitro, non ha alcuna attività in vivo, in quanto non può penetrare nelle cellule.

Il frammento B invece possiede intatta la struttura idro-25 fobica necessaria per. traslocare il frammento A all'interno della cellula. Date queste caratteristiche: presenza del frammento A attivo, presenza nel frammento B della struttura necessaria per la traslocazione del frammento A all'interno della cellula e assenza della regione capace di riconoscere i 30 recettori sulle membrane cellulari, si pensò d'impiegare il CRM 45 per la costruzione di tossine ibride. Infatti, sostituendo il segmento mancante con una sostanza quale: anticorpo, anticorpo monoclonale, ormone o altre sostanze di interesse biologico, capace di riconoscere delle molecole spe-35 cifiche sulla superficie di alcune cellule, tipo le cellule target, si otteneva una tossina ibrida in grado di uccidere in modo selettivo solo alcuni tipi di cellule. Queste tossine ibride possono trovare una loro applicazione in campo farmacologico e, soprattutto, nella cura di alcuni tipi di tumore (P. Bacha et 40 al. J. Biol. Chem. 258, 1565-1570 (1983)).

La proteina CRM 197 ha lo stesso peso molecolare della tossina difterica ed è costituita da un frammento B identico in funzione e struttura a quello della tossina e da un frammento A, non tossico, diverso da quello originale per un am-45 minoacido.

Il CRM 197, atossico, è immunologicamente indistinguibile dalla tossina difterica e può quindi rappresentare una alternativa al tossoide difterico attualmente impiegato per la produzione del vaccino.

so Infatti è sufficiente un blando trattamento con formolo del CRM 197 per ottenere buoni livelli protettivi di anticorpi difterici nella cavia (M. Porro et al. J. Infect. Dis. 142, 5 (1980)).

Tuttavia, sino ad ora lo sviluppo di prodotti derivati dal-55 le proteine correlate alla tossina difterica, ottenute secondo il procedimento descritto da Uchida, è stato ostacolato dalle basse rese con cui venivano sintetizzate in coltura dette proteine.

Costituisce pertanto lo scopo della presente invenzione 6o un procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica che comprende il coltivare in un mezzo nutritivo liquido c.on concentrazioni di ioni ferro da 0,05 ng/ml a 0,5 ng/ml, ad una temperatura da 30° C a 40° C, in un ambiente di coltura neutro ed in condizioni aerobiche, un mic-65 roorganismo appartenente al genere Corynebacterium diphteriae con due fagi mutanti codificanti per la proteina correlata alla tossina difterica integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma.

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In particolare costituisce Io scopo della presente invenzione un procedimento per produrre CRM 45 in rese da 50 Lf/ml a 200 Lf/ml e CRM 197 in rese da 30 Lf/ml a 60 Lf/ mi mediante coltivazione del ceppo C7(ß45)M8 con due fagi mutanti ß45 integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma e del ceppo C7(ßl97)Mj con due fagi ßl97 integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma. La presente invenzione si basa essenzialmente sulla constatazione alquanto sorprendente che il ceppo Corynebacterium diphteriae C7 (ATCC 27010) possiede nel proprio cromosoma due siti di attaccamento attB dove il DNA fagico può integrarsi. Il processo di lisogenizzazione di un fago secondo il modello di Campbell (Episomes Adv. Genetics 11, 101 —145 (1982)) riportato in figura 1A, prevede l'apertura del DNA circolare fagico in un punto specifico attP e l'integrazione in un punto altrettanto specifico del cromosoma batterico attB, detto sito di attaccamento. Sino ad ora, in tutti i sistemi conosciuti, sono stati identificati un solo sito attP ed un solo sito attB.

E' stato ora trovato che il ceppo Corynebacterium diphteriae C7 (ATCC 27010) possiede nel proprio cromosoma due siti di attaccamento, attBi e attB2, dove il DNA fagico può integrarsi. Con l'impiego del terreno TYE da noi modificato, sono stati isolati nel processo di lisogenizzazione di detto batterio, i seguenti ceppi lisogeni: monolisogeni, quando il fago è presente una sola volta in attB i o attB2, doppi lisogeni tandem, quando due fagi sono presenti contemporaneamente in un solo sito attB e doppi lisogeni non tandem, quando due fagi sono presenti contemporaneamente uno in attBi e l'altro in attB2 (figura 1B).

In accordo con la presente invenzione il ceppo Corynebacterium diphteriae C7 (ATCC 27010) è stato infettato con un fago mutante codificante per la proteina correlata alla tossina difterica mediante piastramento su un terreno di coltura CY.

Dopo 48 ore di crescita ad una temperatura di 35° C, si sono osservate delle placche di lisi del fago contenenti all'interno una zona opaca dovuta alla crescita di quei batteri nei quali il fago si era integrato nel cromosoma batterico.

Questi ceppi sono stati prelevati sterilmente e piastrati su un terreno CY in modo da isolare le singole colonie, successivamente analizzate per verificare la presenza di fagi lisogeni mediante il «phage release assays» (Miller et al. Virology 29,410-425 (1966)).

Uno screening per i doppi lisogeni è stato effettuato in base alla considerazione del fatto che i lisogeni contenenti due copie del fago integrato possiedono due geni codificanti per la proteina correlata alla tossina difterica e quindi possono sintetizzare una quantità doppia di detta proteina.

Sono state preparate delle piastre di terreno di coltura TYE contenenti ciascuna 3,4, 6, 8,12 U/ml di siero antitossina difterica ed ogni lisogeno è stato successivamente saggiato per ogni singola concentrazione di siero mediante trasferimento su piastra.

La proteina prodotta dai vari lisogeni diffondendo nell'a-gar, veniva precipitata dall'anticorpo presente nel terreno, formando un alone le cui dimensioni erano direttamente proporzionali alla quantità di CRM prodotto dalle singole colonie.

Nelle piastre contenenti una concentrazione di anticorpo di 3 U/ml, tutti i lisogeni formavano un identico alone, in quelle a concentrazione intermedia, 4—6 U/ml di anticorpo, si osservavano aloni di dimensioni diverse: molto piccoli per i monolisogeni, più grandi per i doppi lisogeni.

Nelle piastre contenenti una concentrazione di anticorpo da 8 a 12 U/ml, solo i doppi lisogeni presentavano un alone di precipitazione.

In Figura 2, è riportata la foto di una piastra di TYE contenente 6 U/ml di anticorpo, nella quale si possono distinguere 3 aloni di dimensioni diverse corrispondenti a differenti lisogeni: monolisogeni (alone piccolo), doppi lisogeni tandem (alone A) e doppi lisogeni non tandem (alone B).

La dimostrazione che i lisogeni con alone più grande contengono due fagi integrati nel proprio cromosoma, è stata effettuata evidenziando l'organizzazione molecolare dei fagi, mediante purificazione del DNA cromosomiale secondo tecniche note.

Dalla figura 1B si osserva che tagliando il DNA fagico nei punti A e B con un'enzima di restrizione, si ottiene un frammento AB, mentre se si usa lo stesso enzima per il monolisogene si dovrebbero ottenere due frammenti A e B. contenenti entrambi una parte del cromosoma batterico, quattro frammenti per il doppio lisogene non tandem e tre per il doppio lisogene tandem.

Infatti, le analisis eseguite con la tecnica del Southern blot (J. Mol. Biol. 98, 503 — 517 (1975)), usando come sonda il frammento ß Barn 4 contenente il sito attP marcato con 32P e riportate in figura 3, corrispondono per numero e posizione delle bande a quanto da noi previsto in base all'analisi della figura 1B.

In Figura 3, il DNA del fago dà una sola banda (A), quello del monolisogene due bande (B), quello del doppio lisogene non tandem quattro bande (C) mentre il doppio lisogene tandem tre bande, una delle quali comigra con quella del fago (D).

La stabilità dei doppi lisogeni è stata verificata prelevando da colture vecchie di cinque giorni singole colonie, pia-strandole su terreno CY ed analizzando con il metodo dell'alone la presenza di uno o due fagi. L'analisi ha dato i seguenti risultati: doppi lisogeni tandem risultavano poco stabili per la tendenza a perdere un fago e trasformarsi in monolisogeni, su 250 colonie esaminate circa 180 erano diventati monolisogeni, mentre i doppi lisogeni non tandem risultavano estremamente stabili, infatti su 450 colonie esaminate non veniva trovato nessun monolisogene.

In accordo con la presente invenzione abbiamo infettato il ceppo C7 con il fago mutante ß45 codificante per la proteina CRM 45 e il fago ßl97 codificante per il CRM 197 ed abbiamo isolato i seguenti ceppi lisogeni: C7(ß45)M3 e C7(ßl97)M5 (monolisogeni), C7(ß45)M„ e C7(ßl97)M8 (doppi lisogeni tandem) e C7(ß45)M8 e C7(ßl97)M! (doppi lisogeni non tandem).

Il ceppo C7(ß45)M8 è stato deposito il 7 novembre 1983 e il ceppo C7(ßl97)Mi è stato deposito il 9 dicembre 1982 presso il centro di raccolta American Type Culture Collection Assession, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA e contrassegnati con le sigle ATCC-39526 e ATCC-39255.1 vari ceppi lisogeni sono stati esaminati per la produzione di CRM 45 e CRM 197 mediante crescita in condizioni aerobiche e in un mezzo nutritivo con concentrazioni di ioni ferro da 0,05 ng/ml a 0,5 pg/ml, preferibilmente 0,1 ng/ml, ad una temperatura da 30r C a 40e C, preferibilmente da 35° C a 37° C ad un pH neutro per un periodo di tempo necessario ad accumulare una quantità notevole di proteina nell'ambiente di coltura.

La proteina è stata successivamente recuperata e purificata secondo una delle tecniche note ad un esperto dell'arte.

Terreni usati nel procedimento:

Terreno TYE per la produzione dell'alone di precipitazione

Il seguente terreno è stato modificato rispetto alla formula originale di Pappenheimer (Inf. Imm. 18, 203—209

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(1977)) ed ha la seguente composizione: Tryptose 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 5 g, KH2P04 5 g, acqua 11. Il pH viene corretto ad un valore di 7,4 e 2 mi di CaCl2 (50%) vengono addizionati al terreno prima di autoclavarlo.

Si lascia sedimentare il precipitato quindi si aggiungono 2 ml/1 di soluzione II, 1 ml/1 di soluzione III e 12 ml/1 di agar noble.

Infine viene addizionato del siero di cavallo antidifterico in concentrazioni di 4,6, 8 o 12 U/ml a seconda dell'alone desiderato.

Terreno CY per la produzione di proteine CRM

Yeast extract 20 g, casamino acids 10 g, 5 mi triptofano all'I %, KH2P04 5 g, acqua 11. Portare a pH 7,4, bollire e filtrare su filtri Wathman ancora bollente. Aggiungere 2 mi di soluzione II, 1 mi di soluzione III, autoclavare.

Prima dell'uso aggiungere 3 mi di soluzione maltosio-CaCl2 per 100 mi di terreno.

Soluzione II

MgS04-7H20 22,5 g, alanina 115 mg, acido nicotonico 115 mg. Aggiungere 1 mi di H20 e Hcl concentrato per disciogliere i componenti, quindi aggiungere acido pimelico 7,5 mg, 5 mi di CuS04-5H20 all'I%, 4 mi di ZnS04-5H20 all'I %, 1,5 mi di MnCl2-4H20 all'I%, 3 mi di HCl concentrato ed acqua fino a 100 mi.

Soluzione III

L-cistina 20 g, Hcl concentrato 20 mi, acqua fino a 100 mi.

Soluzione maltosio CaCl2

Maltosio 50 g, 2 mi CaCl2 al 50%, KH2P041 g, portare a 100 mi con acqua. Correggere il pH ad un valore di 7,4. Filtrare su carta Whatman 40 ed infine autoclavare.

Descrizione figure

Figura 1 A: Processo di lisogenizzazione secondo il modello di Campbell. Il DNA fagico si apre in un punto specifico attP e si integra in un punto altrettanto specifico del cromosoma batterico attB.

Figura 1B: Processo di lisogenizzazione in Corynebacterium diphteriae C7 (ATCC 27010).

Il DNA fagico si apre nel sito attP e può integrarsi nei due siti di attaccamento attB! e attB2 presenti nel cromosoma batterico e dare: monolisogeni, doppi lisogeni tandem e doppi lisogeni non tandem.

Figura 2: Piastra con terreno TYE contenente 6 U/ml di siero antidifterico. Si distinguono 3 aloni di precipitazione: alone molto piccolo (monolisogeni), alone intermedio A (doppi lisogeni tandem), alone grande B (doppi lisogeni non tandem).

Figura 3: Analisis del DNA dei lisogeni con il metodo Southern blot. Il DNA è stato digerito con BamH i ed i frammenti separati su gel di agarosio (1,3%) e trasferiti su nitrocellulosa, sono stati ibridizzati con il frammento ß Barn 4 contenente il sito attP marcato con 32P. Il frammento ß Barn 4 corrisponde al frammento AB della figura 1B. Un unico frammento AB nel DNA fagico (A) due frammenti AB nel monolisogene (B), quattro frammenti nel doppio lisogene non tandem (C) 3 frammenti nel doppio lisogene tandem (D).

Figura 4: Produzione di CRM 197 con il ceppo monolisogene C7(ßl97)M5: O; il ceppo doppio lisogene tandem C7(ßl97)M8: V; il ceppo doppio lisogene non tandem C7(ßl97)M,: □.

Con i quadratini scuri è indicata la densità ottica delia coltura: ■.

Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione.

Esempio 1

s Si preparano delle beute a 125 mi contenenti ciascuna 10 mi di terreno CY e si sterilizzano a 120° C per 15 minuti. Le beute vengono inoculate con una quantità corrispondente ad un occhiello di platino dei seguenti ceppi lisogeni, C7(ßl97)M5, C7(ßl97)M8 e C7(ßl97)M! fatti crescere per 24 io ore a 35° C su piastre di CY.

Le beute così inoculate vengono coltivate per una notte ad una temperatura di 35° C.

0,1 mi di ogni singola coltura vengono inoculati in beute di Ermenmeyer da 125 mi contenenti ciascuna 10 mi di terre-i5 no CY deferrato e addizionato con 0,1 jxg/ml di Fe++ e poste ad incubare su un agitatore rotatori (240 giri/min.) per 45 ore ad una temperatura di 35° C.

Ad intervalli di circa 2 ore, si prelevano dei campioni sui quali viene determinata la densità ottica e il CRM 197 rilas-20 ciato nel supernatante. La densità ottica viene misurata a 590 nm con uno spettrofotometro Perkin Elmer Mod. 35 (percorso della luce 1 cm) e il CRM 197 viene determinato con il metodo rocket immunoelettroforesi (Murfy et al. J. Clin. Microbiol. 7,91 —96 (1978)) e/o flocculazione (G. Ra-25 mon, C.R. Soc. Biol. 86,661 —671 1922).

Per Lf/ml si intende l'unità di flocculazione così come riportato da C. Ramon in C. R. Soc. Biol. (Paris) 86,

661-771 (1922)).

I risultati ottenuti son rappresentati in figura 4. Come 30 possiamo osservare la produzione di CRM 197 non comincia prima che la densità ottica della coltura abbia raggiunto valori di 4,5—5 densità ottiche (D. O), corrispondenti alla fine della fase logaritmica.

Con l'inizio della parte terminale di questa fase comincia 35 la produzione massiccia di CRM 197 che continua fino all'inizio della fase stazionaria (circa 20 ore), quando si riscontra la massima densità ottica e la massima quantità di CRM 197.

Oltre le 24 ore di crescita si osserva una diminuzione del 40 CRM 197 del 25% alle 30 ore e del 75% alle 45 ore.

L'andamento della curva di produzione del CRM 197 è essenzialmente lo stesso per i diversi lisogeni mentre la produzione è di: 20 Lf/ml per i monolisogeni, 30 Lf/ml per i doppi lisogeni tandem e 60 Lf/ml per i doppi lisogeni non 45 tandem.

Esempio 2

Con le stesse modalità riportate nell'Esempio 1 vengono • preparati degli inoculi di C7(ß45)M3, C7(ß45)Mn e so C7(ß45)M8. 0,1 ml di ogni coltura viene inoculato in beute da 125 mi contenenti ciascuna 10 mi di terreno CY deferrato e addizionato con 0,1 jig/ml di Fe++.

Le beute vengono poste ad incubare per 36 ore ad una temperatura di 35° C su un agitatore rotante (240 giri/min.). 55 I campioni prelevati dopo 20 ore e 30 ore dall'inizio della fermentazione, vengono analizzati con le stesse modalità riportate nell'Esempio 1, per la determinazione della densità ottica e produzione di CRM 45 rilasciato nel supernatante.

I risultati ottenuti sono rappresentati nella tabella se-60 guente:

Tab. 1

Ceppi lisogeni Densità ottica CRM 45 g/ml

20 h 30 h 20h 30h

65 C7(ß45)M3 4.5 9.7 16 31.5

C,(ß45)Mn 4.5 9.8 22 42

Cv(ß45)Ms 4.7 10 40 70

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I risultati di cui sopra mostrano che la massima produzione di CRM 45 si riscontra dopo 30 ore di coltivazione ed è essenzialmente la stessa per i monolisogeni e doppi lisogeni tandem e circa il doppio per i lisogeni non tandem.

Esempio 3

Una precoltura del lisogene C7(ß45)M8 venne preparata così come descritto nell'Esempio 1 e 2 mi di detta precoltura furono trasferiti in 2 beute di Erlenmayer da 2000 mi contenenti ciascuna 500 mi di terreno CY deferrato e addizionato con 0,1 |ig/ml di Fe++ e coltivate sotto agitazione (240 giri/ min.) ad una temperatura di 35° C per 24 ore.

1000 mi della coltura di lisogeni risultante vennero inoculati in 401 di un terreno di coltura CY con concentrazione di ioniFe++.

0,1 (xg/ml, contenuto in un fermentatore a vaso di 501 e coltivato ad una temperatura di 37° C aereando ad un regime di 15 1/min. dal basso verso l'alto, agitando a 600 giri per minuto e mantenendo il pH dell'ambiente di coltura da 6,5 a 7,5 con una soluzione di glucosio al 20% o NaOH 4N per un periodo di 40 ore.

5 La quantità di CRM 45 dopo 30 ore di fermentazione era di 200 Lf/ml.

La brodocoltura risultante venne centrifugata in una centrifuga a flusso continuo e la proteina venne recuperata dal supernatante precipitandola con ammonio solfato addi-io zionato sino ad una saturazione del 75%.

La sospensione così ottenuta venne centrifugata ed il sedimento, dopo lavaggio con tampone fosfato a pH 7,5, venne purificato attraverso una colonna caricata con una resina scambiatrice di ioni (Dimetilammonioetile cellulosa). i5 La proteina venne recuperata eluendo la colonna con un gradiente di cloruro di sodio con una resa dell'80%.

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35

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S

3 foglie disegni

Claims (7)

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1. Procedimento perla produzione di una proteina correlata alla tossina difterica che comprende il coltivare in un mezzo nutritivo liquido con concentrazioni di ioni ferro da 0,05 ng/ml a 0,5 ng/ml ad una temperatura da 30° C a 40° C ad un pH neutro ed in condizioni aerobiche, un microorganismo appartenente al genere Corynebacterium diphteriae con 2 fagi mutati codificanti per la proteina correlata alla tossina difterica integrati in modo non tandem nei due siti di attaccamento del cromosoma batterico.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui la proteina correlata alla tossina difterica è la proteina CRM 45.

2

RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 2 dove il microorganismo è il ceppo C7(ß45)M8 ATCC-39526 con 2 fagi mutati ß45 integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui la proteina correlata alla tossina difterica è la proteina CRM 197.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 dove il microorganismo è il ceppo C7(ßl97)Mi ATCC-39255 con due fagi mutati ßl97 integrati in modo non tandem nel proprio cromosoma.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che un terreno nutritivo solido con concentrazioni di siero antidifterico da 4 a 12 U/ml è impiegato per isolare il microorganismo.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la concentrazione di ioni ferro nel mezzo nutritivo liquido è di 0,1 [ig/ml.