KR900007643B1

KR900007643B1 - 신규 미생물 스트렙토마이세스 sp.Y-125 및 이로부터 제조되는 아밀레이스 저해제

Info

Publication number: KR900007643B1
Application number: KR1019880010151A
Authority: KR
Inventors: 이주경; 박주웅; 최신원
Original assignee: 영진약품공업 주식회사; 김생기
Priority date: 1988-08-09
Filing date: 1988-08-09
Publication date: 1990-10-17
Also published as: JPH0517831B2; KR900003360A; JPH02131571A

Abstract

내용 없음.

Description

신규 미생물 스트렙토마이세스 sp.Y-125 및 이로부터 제조되는 아밀레이스 저해제

제1도는 본 발명에 따라 정제된 아밀레이스 저해제의 안정성을 나타낸 그래프.

제2도는 상기 아밀레이스 저해제의 열안정성을 나타낸 그래프.

제3도는 상기 아밀레이스 저해제의 적외선 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

본 발명은 신규 미생물인 스트렙토마이세스 sp.Y-125 및 이로부터 제조되는 아밀레이스 저해제에 관한 것이다.

일반적으로, 인체에 필요한 3대 영양소의 하나인 탄수화물은 그 대부분이 이당류나 다당류의 형태로 섭취된 다음, 체내에 흡수되기 직전에 아밀레이스나 말테이스 또는 사카레이스등의 당분해효소(glycoside Hydrolase Enzyme)의 작용으로 분해되어 섭취되는바, 이때 체내에서 과량의 당이 생성되게 되면 당뇨병이나, 비만증, 과지방증, 위염, 위궤양, 십이지장궤양등이 원인이 된다.

따라서, 이들 질병을 예방, 치료하기 위해서는 당분해효소의 저해제를 사용하여 체내에 있는 각종 당분해효소의 작용을 억제하므로서 과량의 당이 생성되는 것을 방지하는 방법이 알려져 있으며(USP 제4,307,194호, 제4,451,455호), 이러한 당분해효소 저해제는 방선균, 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에서 많이 생산되는 것으로 알려져 있다.

종래의 당분해 효소는 대체로 그 분자량에 따라 고분자량인 것은 아밀레이스에 대한 저해효과가 우수하고, 반면에 저분자량인 것은 말테이스나 사카레이스에 대한 저해효과가 우수한 것으로 보고되어 있으나, 본 발명은 비교적 저분자량이면서도 아밀레이스에 대하여 특이적인 저해효과를 나타내는 아밀레이스 저해제에 관한 것이다.

종래에 알려져 있는 아밀레이스 저해제의 제조방법으로 생물학적인 방법이외에도 화학적인 방법, 즉 살리실릭산(Salicylic Acid)이나 아비스신(Abiscisn)과 같은 저분자물질과, 물리적 흡착에 의해 비특이적으로 효소를 저해하거나 효소를 변성, 침전시키는 고분자물질을 이용하여 제조하기도 하였다.

그러나, 이러한 종래의 아밀레이스 저해제들은 타액 아밀레이스에 대해서만 영향을 줄뿐, 췌장 아밀레이스에 대해서는 거의 영향을 주지 못했으며(E.KNEEN, R.M.ST-ANDSTEDT, ARCH., BIOC. BIOPHY, 9, P 235 1946). 다른 아밀레이스에 대해서도 비특이적이나 거의 저해를 주지 못하는 단점이 있을 뿐만아니라, 열에 불안정하고 트립신(Trypsin)에 의해서 불활성으로 되기때문에 활성도가 비교적 낮은것으로 보고되어 있다(USP 4,282,318).

이에 본 발명자들은 아밀레이스 저해제를 생산하는데 높은 활성을 갖는 신규 미생물을 발견하고, 그 분리 및 이용에 대하여 광범위한 연구를 계속한 결과, 상기 신규 미생물이 생산하는 아밀레이스 저해제는 종래의 아밀레이스 저해제에 비하여 그 활성 및 안정성이 훨씬 우수한 것이라는데 근거하여 본 발명을 하게된 것이다.

본 발명의 목적은 아밀레이스 저해제를 생산하는 신규 균주 및 이를 이용하여 고수율의 아밀레이스 저해제를 효과적으로 제조하는 방법. 그리고 그로부터 제조된 아밀레이스 저해제를 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 미생물 균주인 스트렙토마이세스 sp.Y-125(Streptomyces sp.Y-125)는 대한민국 강원도 춘천과 경기도 오산에서 채취한 토양샘플로부터 분리배양해낸 신균주로서 1988년 7윌 5일자로 한국과학기술원에 수탁번호 KCTC 8387 P로 기탁되고, 또한 1989년 3월 31일자로 미국종균협회에 수탁번호 ATCC 53890으로 기탁되었다.

다음은 신균주 스트렙토마이세스 sp.Y-125의 계통학적 특성을 단계적으로 기술한 것으로서, 특성화 방법은 인터내셔날 스트렙토마이세스 프로젝트(INTERNATIONAL STREPTOMYCES PROJECT(ISP))에서 권장하는 방법과 버어지스 매뉴얼(BERGEY'S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY, Vo1.2, 1986)을 참고로 하여 실시한 것이다.

1) 배양학적 특성

본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 sp.Y-125는 포자의 색이 회색(GY) 계열에 속하는 풍부한 연속균사체를 생성하는데 이러한 배양상의 특성은 다음 표 1에서 보는 바와 같이 오우트밀 한천(ISP No.3), 무기염류전분한천(ISP No.4), 티로신한천(ISP No.7)상에서 나타나며, 특히 오우트밀 한천(ISP No.3)에서 증식상태 및 색상이 명확히 관찰된다. 뒷면의 색상은 황-갈색이며, 이 색상은 pH에 영향을 받지 않는다. 티로신 한천배지에서는 황색색소가, 탈지유배지에서는 연황색의 색소가 생성되며, 그 이외의 배지상에서는 가용성색소가 생성되지 않았다.

[표 1]

1/ISP=인터내셔널 스트렙토마이세스 프로젝트 배지

(International Streptomyces Project Media)

2/SM=탈지유 한천배지(Skim Milk Agar Media)

3/NT=영양 한천배지(Nutrient Agar Media)

4/GA=포도당-아스파라긴 한천배지

(Glucose-Asparagine Agar Media)

2) 형태학적 특성

오우트밀 한천상에서 증식시킨 스트렙토마이세스 sp.Y-125의 형태학적 특성을 살펴보면, 분열되지 않는 분지된 균사체를 생성하며 포자낭은 형성하지 않는다.

또한, 기균사 끝에 포자체를 형성하며 기균사는 파상형이고, 포자는 구형 또는 막대형이다. 포자의 표면은 부드럽고 0.7-1.2×1.2-l.8μm의 크기를 갖는다.

이때, 형태학적 특징은 광학현미경으로 조사하였으며, 포자의 표면 및 크기는 스캐닝 전자 현미경으로 관찰하였다.

3) 생리학적 특성

다음 표 2는 스트렙토마이세스 sp.Y-125의 탄소이용 형태를 나타낸 것으로서, 멸균 탄소원을 가해 최종농도를 1.0%로한 ISP 배지를 사용하여 탄소이용도를 측정한 것이다.

이때, 배양온도는 30℃이며, 14일 후에 결과를 측정하였다.

[표 2]

- : 이용하지 못함 + : 이용함

한편, 스트렙토마이세스 sp.Y-125는 전분을 가수분해시키는 반면, 탈지유와 젤라틴은 가수분해시키지 않았으며 나이트레이트를 나이트라이트로 환원시키지도 않았고, 섬유질 역시 가수분해시키지 않았다.

또한, 이들 균주는 20-80℃에서 증식하는데, 특히 25-30℃에서 증식이 왕성하였고 호기성이며 티로신한천(ISP No.7)에서 멜라닌색소를 생성하였다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 sp.Y-125는 형태학적, 배양 및 생리학적 특징을 유사종의 공지기술내용과 비교해볼때 공지된 종과 여러가지 차이가 있으므로 이를 신규 균주로 분리하였다(참고 : BERGEY'S MANUAL OF DETERMlNATIVE BACTERIOLOGY, Vo1.2, p1383-1418, 1986).

한편, 본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 sp.Y-l25가 생산해내는 아밀레이스 저해제는 다당류와 아미노산으로 구성되어 있는 것으로서, 그 활성도가 12,000 AIU/mg으로 매우 높으며, 120분 동안 보일링하여도 저해특성에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

이때, 아밀레이스 저해제 1단위(1 ATU)는 아밀레이스의 단위가 50% 저해했을때의 저해제의 양으로 정의하며, 아밀레이스단위는 1분 동안 전분에서 1μm의 포도당이 생성될때의 호소량으로 정의하고, 생성된 포도당은 3,5-디니트로살리실릭산에 의해 환원당을 측정하였으며 맥아당으로 표준곡선을 선정하였다.

한편, 본 발명에서는 다음과 같은 방법으로 아밀레이스 저해제 활성도를 측정하였는바, 즉 5mM의 염화칼슘이 포함된 100mM 트리스-염산 완충용액(pH 7.0)에 2×10^-3%의 아밀레이스용액(10-20 AIU/ml) 0.5ml를 녹이고, 여기에다 0.5ml의 저해제용액(0.300 Ug)이나 배양액을 가하여 혼합시킨다음, 이를 37℃에서 10분간 반응시킨후, 100mM 트리스-염산 완충용액에 녹인 1.5%의 가용성 전분용액 2ml를 첨가하여 10분간 반응시켰다.

이어서 2ml의 3,5-디니트로살리실릭산을 가하고 5분간 가열후 충분히 냉각시켜 증류수로 10배 희석시킨 다음, 546nm에서 흡광도를 측정하였다.

한편, 대조시험은 저해제용액 대신 증류수 0.5ml를 넣는것 이외에는 상기와 동일한 방법으로 실시하였으며, 공시험은 아밀레이스용액 대신 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0) 0.5ml를 넣고, 저해제용액 대신 증류수 0.5ml를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 실시하였다.

T.C 및 B는 저해제시험, 대조시험 및 공시험 각각의 흡광도이다.

한편, 본 발명에 따른 아밀레이스 저해제는 pH에 대한 안정성도 매우 높아서 pH 2.0 내지 12.0에서는 안정하였으며, 따라서 분해경로시에 그 활성도가 줄어들지는 않을것으로 기대된다.

그리고, 세파덱스(Sephadex) G-25로 측정한 분자량은 700 내지 1500으로서 분자량이 비교적 작음에도 불구하고 아밀레이스, 말테이스, 사카레이스에 대하여 충분한 저해효과를 나타내며, 특히 타액 아밀레이스보다는 췌장 아밀레이스에 대한 저해효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 신균주인 스트렙토마이세스 sp.Y-125를 배양하는 방법 및 그 배양물로부터 아밀레이스 저해제를 분리해내는 방법을 보다 구체적으로 기술하면 다음과 같다.

(I ) 균주배양

효모추출물, 탈지대두, 펩톤과 같은 질소원, 가용성 전분, 포도당과 같은 탄소원, 염화나트륨과 같은 무기염을 함유하는 배양매질에 묽은 염산 수용액을 가하여 그 pH를 6.0 내지 7.0으로 조절하여, 121℃에서 15분간 살균한 후, 균을 접종하여 호기성 조건하의 25-30℃에서 2-4일 배양시켰다.

다음 표 3은 다양한 탄소원(농도 1%)에 대한 저해제의 활성도를 나타낸 것이고, 표 4는 질소원에 대한 저해제의 활성도를 나타낸 것인바, 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이 탄소원은 가용성 전분, 질소원은 효모추출물과 폴리펩톤의 혼합물에서 가장 활성도가 높았다.

이때, 소포제를 사용할 수도 있는데, 소포제는 일반적으로 과도한 포말을 방지하는데 유용하며 실리콘 소포제 같이 통상적으로 사용되는 소포제를 사용하였다.

[표 3]

이때, 기본배지 조성은 0.5% 육즙, 0.5% 폴리펩톤, 0.3% 염화나트륨이고, 배지의 pH는 7.0으로 한다.

[표 4]

이때, 기본배지조성은 1% 가용성전분, 0.3% 염화나트륨, 0.05% 황화마그네슘, 0.1% 인산화칼슘, 0.001% 황산화구리이고, 배지의 pH는 7.0으로 한다.

(II) 아밀레이스 저해제의 분리

균주 배양물로부터 배양액과 균체를 분리하는 공정은 원심분리나 셀라이트(Celite)와 같은 여과 보조제를 사용하는 여과법등과 같은 통상적인 방법으로 수행할 수 있고, 이와같이 하여 분리된 배양액에서 아밀레이스 저해제를 분리하기 위해서는 일반적인 방법, 즉 배양액의 동결건조, 염석, 또는 유기용매 침전, 흡착등과 같은 방법이나 이온교한수지, 겔여과 같은 방법으로 분리할 수 있는바, 이를 보다 구제적으로 기술하면 다음과 같다.

가) 균주배양물을 원심분리(30,000-40,000rpm)하여 균체와 배양액을 분리한 후, 배양액을 50-70℃ 감압(10-50mHg)하에서 1/5-1/10로 농축시킨다.

이어서 침전물은 여과, 제거하고 필요시 농축액은 동결건조시킨다.

나) 원심분리한 배양액이나 농축액에 유기용매, 메탄올, 에탄올, 아세톤과 같은 친수성 용매를 처리하여 저해제를 침전시킨다.

불순물은 저농도에서 침전이 생기므로 60-70% 정도일때 불순물 제거가 용이하다.

다) 황산암모늄이나 염화나트륨과 같은 염류를 사용하여 침전물을 침전분리한다.

침전물은 원심분리 또는 유기용매로 직접 세척하여 투석, 건조시킨다.

라) 이온교환수지에 의한 흡착

이 과정은 아밀레이스 저해제가 극성을 갖고 있을 경우에 이를 분리하는데 가장 적당한 방법으로서, 이온강도의 변화나 pH의 변화에 의해 용출시키고 분자량의 크기를 이용한 겔여과를 통하여 저해제를 분리한다.

이상과 같은 분리방법 이외에 열변성에 의한 불순물의 침전, 분자량에 의한 분자막의 투과, 한외여과등을 이용할 수도 있다.

이하, 본 발명에 대한 실시예를 들어보면 다음과 같다.

실시예 1

2

진탕 플라스크에다, 0.1% 가용성 전분, 1% 포도당 ,0.5% 육즙, 0.5% 펩톤, 0.3% 염화나트륨으로 이루어진 pH 7.0의 배지 400ml를 넣고, 121℃에서 15분간 살균후, 미리 배양한 스트렙토 마이세스 sp.Y-125 균현탁액 20ml를 접종하여 4일간 배양하였다.

배양후 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하고 15AIU/ml인 배양액 270ml를 40-60℃, 감압하(10-50mHg)에서 농축하여 30ml의 농축액을 얻었다.

이 농축액에 에탄올 90%를 가하고, 이렇게 하여 생성된 침전물을 원심분리 하여 분리해낸 후, 이를 증류수에 용해시켜 36시간 동결건조시켜서 2×10⁴AIU/g인 0.07g의 아밀레이스 저해제를 얻었다.

실시예 2

2ℓ 진탕 플라스크 5개에다, 1% 가용성전분, 0.5% 펩톤, 0.5% 육즙, 0.3% 염화나트륨으로 이루어진 pH7.0의 배지를 각각 400ml씩 넣고 121℃, 15분간 살균한 후 미리 배양해둔 균액 스트렙토 마이세스 sp.Y-125를 20ml씩 접종하여 28℃에서 4일간 배양하였다.

이어서, 균체와 배양액을 원심분리하여 85AIU/ml인 배양액 1500ml를 얻고 이 배양액을 50-60℃ 감압하에서 150ml까지 농축 여과하여 침전불순물을 제거한 후 에탄올 60%를 처리하여 침전물을 제거하고 여액을 농축하였다.

농축물을 24시간 동결건조시켜 3×10⁵AIU/g인 6.4g의 아밀레이스 제해제를 얻었다.

실시예 3

2

진탕 플라스크 10개의 실시예 2와 같이 배양하여 배양액 3000ml를 얻고, 이 배양액을 60-70℃감압하에서 1/10로 농축한 후, 에탄올 90%로 처리하여 그 침전물을 게거하고, 여액을 다시 농축하여 얻어진 농축물을 증류수에 용해한 다음, 24시간 동결 건조시켜 4.7×10⁵AIU/g인 10.2g의 아밀레이스 저해제를 얻었다.

실시예 4

2

진탕 플라스크 5개에다, 2% 가용성전분, 0.5% 폴리펩톤, 0.5% 육즙, 0.3%염화나트륨으로 이루어진 pH 7.0의 배지를 각각 400ml씩 넣고, 이를 121℃, 15분간 살균한 후, 균액 스트렙토 마이세스 sp.Y-125를 20ml씩 접종하여 28℃에서 3일간 배양한 다음, 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다.

이렇게 하여 얻어진 218AIU/ml의 배양액 1550ml를 60-70℃ 감압하에서 1/10까지 농축하여 여과한다음 침전 불순물을 제거하고 메탄올 90%로 처리하여 침전물을 다시 제거시킨 후 농축하여 농축물을 얻었다.

이를 증류수에 녹여 36시간 동결 건조시킨 결과 5.5×10⁵AIU/g인 8.2g의 아밀레이스 저해제를 얻었다.

실시예 5

2

진탕 플라스크 5개에 1% 옥수수전분, 0.5% 펩톤, 0.5% 육즙, 0.3% 염화나트륨, pH 7.0인 배지를 각각 400ml씩 넣고 121℃, 15분간 살균한 후, 여기에다 미리 배양한 균액 스트렙토 마이세스 sp.Y-125 20ml를 각각 접종하여 28℃에서 4일간 배양하였다.

이어서 균체와 배양액을 원심분리하여 186AIU/ml인 배양액 1600ml를 얻고, 이 배양액을 1/10까지 농축하여 침전물을 여과한 후, 농축액에 에탄올 90%를 처리하여 침전물은 제거한다음, 여액을 농축시켜 농축물을 얻었다. 이 농축물을 증류수로 녹여 42시간 동결건조시킨 결과 5×10⁵AIU/g인 9.8g의 아밀레이스 저해제를 얻었다.

실시예 6

실시예 5에서 1% 옥수수 전분 대신 2% 옥수수전분을 포함하는 배지를 사용하여 동일한 조건으로 배양한 결과, 배양액은 220AlU/ml이었으며, 아밀레이스 저해제는12.0g(5.8×10⁵AIU/g)을 얻었다.

실시예 7

2

진탕 플라스크 5개에 2.5% 가용성전분, 0.5% 폴리펩토, 0.5% 효모엑기스, 0.3% 염화나트륨, pH 6.0으로 조절한 배지를 각각 400ml씩 넣고, 이를 121℃에서 15분간 살균한 후, 미리 배양한 균액 스트렙토마이세스 sp.Y-125 20ml를 접종한 다음, 28℃에서 3일간 배양하였다.

이어서 이 배양물을 원심분리하여 균체와 배양액을 분리한 결과, 2750AIU/ml인 배양액 1550ml를 얻었다.

이 배양액을 60-70℃, 감압하에서 농축하여 농축액 200ml를 얻고, 이를 여과하여 불순 침전물을 제거한후, 에탄올 90%를 처리하여 침전물을 제거하고, 그 여액을 농축하여 24시간 동결 건조시킨 결과, 7.0×10⁵AIU/g인 저해제를 얻었다. 이 저해제를 다시 증류수에 용해후 세파덱스 G-10컬럼(1.8×30cm)을 이용하여 겔여과 시켰다.

이때 용출은 증류수를 사용하였으며 활성도가 있는 부분만 모아 동결건조시킨 결과, 2.1×10₃AIU/mg인 아밀레이스 저해제 0.8g을 얻었다.

실시예 8

실시예 7과 동일한 조건의 배지를 2

진탕 플라스크 10개의 넣고, 살균후 배양하여 3000AIU/ml인 3000ml의 배양액을 얻었다.

이어서, 얻어진 배양액을 300ml까지 농축한 후 에탄올 90%로 처리하여 침전물을 제거한다음, 여액을 농축하여 농축물을 얻었다.

이 농축물을 다시 증류수에 용해시킨 후 동결건조하여 7.1×10⁵AIU/g인 저해제 15.5g을 얻고, 이를 다시 증류수에 용해시켜서 세파덱스 G-10 컬럼(2.1×30cm)을 통해 겔여과 시킨 후, 활성도가 있는 부분만 동결건조시킨결과, 2700AIU/mg인 아밀레이스 저해제 1.02g을 얻었다.

실시예 9

실시예 8과 동일한 배지 조건하에서 0.1%의 소포제(실리콘 A, 시그마사제품명)를 첨가하여 배양시킨 결과, 7.3×10⁵AIU/g인 저해제 16.4g을 얻었으며, 세파덱스 G-10컬럼(2.1×30cm)을 이용하여 3100AIU/mg인 저해제 1.2g을 얻었다.

실시예 10

2

진탕 플라스크 10개에다, 2.5% 가용성 전분, 0.5% 폴리펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.3% 염화나트륨, 0.05%소포제, pH 6.0으로 조절한 배지를 400ml씩 넣고, 이를 살균하여 미리 배양한 균액 20ml를 접종한 후, 28℃에서 3일간 배양하여 얻어진 배양물을 원심 분리하여 5250AIU/ml의 배양액 3000ml를 얻었다.

이 배양액을 60-70℃, 감압(10-50mHg)하에서 1/10까지 농축한 후, 여과하여 불순물을 제거하고, 이를 에탄올 90%로 처리하여 침전물을 제거한 다음, 에탄올이 완전 제거될때까지 농축하였다.

이어서 농축액을 동결건조하여 7.5×10⁵AIU/g인 아밀레이스 저해제를 얻고, 이를 세파덱스 G-10컬럼(1.8×40cm)으로 겔여과시킨 결과, 3300AIU/mg인 아밀레이스 저해제 1.70g을 얻었다.

혈당량 변화특성

실시예 10에서 얻은 아밀레이스 저해제를 사용하여 동물실험을 실시하였다. 사용한 동물은 마우스이며, 5마리를 1군으로 하여 과혈당증을 유발시키고, 이들 마우스에 대하여 5,15,30분 간격으로 혈당량의 변화를 관찰하였다.

과혈당증을 유발하기 위해 2.5g의 전분 또는 맥아당/kg 마우스로 구강투여 했으며, 설탕의 경우는 5.0g의 설탕을 역시 구강투여하여 측정하였다.

혈당량의 측정은 글루코스-옥시데이스법(Glucose-oxidase)으로 측정하였다.

가) 전분분해 효소에 대한 효과

나) 맥아당 분해효소에 대한 효과

다) 설탕 분해효소에 대한 효과

독성실험

실시예 10에서 얻은 아밀레이스 저해제를 사용하여 독성시험을 하였다. 사용한 동물은 17-20g의 마우스를 사용하였고 아밀레이스저해제는 3,000-3,000,000AIU/kg마우스의 농도를 사용하여 관찰한 결과 죽은 마우스는 없었으며 특별한 증상은 발견되지 않았다.

체중변화에 대한 시험

실시예 10에서 얻은 아밀레이스 저해제를 농도별로 마우스먹이에 혼합하여 투여후 마우스의 몸무게의 변화를 측정하였다.

사용한 마우스의 몸무게는 17-20g이며, 5마리를 1군으로 하여 약 60일간 몸무게의 변화를 관찰한 결과, 3,000AIU/g(사료)에서는 42일후 조금씩 체중의 감소가 관찰되었으며, 9,000AIU/g에서는 21일 이후 체중의 감소가 관찰되었다.

다음 표 5는 마우스의 체중변화를 나타낸 것이다.

[표 5]

한편, 실시예 10에서 얻은 아밀레이스 저해제는 다음과 같은 특성을 갖는다.

1) 분자량

아밀레이스 저해제의 분자량을 측정하기 위하여 아밀레이스 저해제를 세파덱스 G-25(Sephadex G-25)로 겔여과하고, 이를 박층 크로마토그래피로 전개시킨 결과, 분자량은 700-1500이였다.

(전개용매 : 에틸아세테이트 : 메탈올 : 물=27 : 15 : 23)

2) pH안정성

pH 2-12까지의 용액에 아밀레이스 저해제를 넣고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 인체의 타액 아밀레이스에 대한 활성도를 측정한 결과, 산성, 중성, 염기성에서 모두 안정하였다(제1도 참조).

3) 열안정성

pH 7.0인 중성용액에 1%의 아밀레이스 저해제를 첨가하고 100℃에서 30-120분까지 가열후 냉각하여 인체의 타액 아밀레이스에 대한 활성도를 측정한 결과, 30분에서는 절대 안정하였으며 120분 가열시에도 85%의 활성도를 나타냈다(제2도 참조).

4) 다른 아밀레이스에 대한 저해효과

인체의 타액 아밀레이스 뿐만 아니라 세균이나 곰팡이 등 미생물이 생산하는 아밀레이스에 대해서도 그 저해 특성을 조사한 결과, 다음 표 6에서 알수 있는 바와 같이 미생물 아밀레이스에 대해서도 50% 미만의 저해도를 나타내는 반면, 돼지췌장이나 인체 타액의 아밀레이드등, 동물아밀레이스에 대해서는 90%이상의 현저한 저해효과를 나타내었다.

[표 6]

±=0-50% 저해 +=90% 이상저해

5) 아밀레이스 저해제의 화학적 특성

저해제의 화학적 특성은 다음 표 7에서 보는 바와 같이 엘슨-모르간 반응에 대하여 양성이며, 적외선 흡수 스펙트럼이 다당류(Oligosaccharid)의 흡수 파장이 갖는 특성과 유사하고, 녹는점 역시 말토펜토즈와 유사하였다(제3도 참조)

또한 염산에 의한 가수분해후 환원당 측정치는 현저히 증가됨을 알 수 있다.

이런 결과로 아밀레이스 저해제는 3-6개의 당화합물로서 순수한 당이 아인 헤테르 당류임을 알 수 있으며 이는 당과 아미노산이 결합된 형태로 생각되어진다.

또한 물에만 용해되며 메탄올, 에탄올 등에는 불용성을 나타낸다.

[표 7]

Claims

아밀레이스 저해제를 생산해내는 것을 특징으로 하는 스트렙토 마이세스 sp.Y-125(KCTC 8387P).
스트렙토 마이세스 sp.Y-125(KCTC 8387P) 균주의 배양물로부터 분리해낸 아밀레이스 저해제.
스트렙토 마이세스 sp.Y-125(KCTC 8387P) 균주를 배양하고 그 배양물로부터 아밀레이스 저해제를 분리해내는 것을 특징으로 하는 아밀레이스 저해제의 제조방법.
제2항에 있어서, 아밀레이스 저해제는 그 분자량이 700 내지 1500이고, pH 2 내지 12에서 안정한 것을 특징으로 하는것.