JP5112854B2 - Ｒｎａ干渉においてオフターゲット効果を減じるための修飾されたポリヌクレオチド類 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、修飾されたポリヌクレオチドに関する。

背景
ＲＮＡにより誘導された遺伝子サイレンシングの遺伝子ノックダウンは、現在、３つの異なるレベルの調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）：（ｉ）転写不活性化（ｓｉＲＮＡによりガイドされたＤＮＡ及びヒストンメチル化）；（ｉｉ）小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘導性ｍＲＮＡ分解；及び（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡ誘導性転写終結の最低限を意味すると信じられる。ｓｉＲＮＡにより生じるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、長く継続し、そして複数の細胞分裂にわたり有効であり得る。よって、ＲＮＡｉは、遺伝子機能分析、ドラッグ標的確認、経路分析、及び疾患治療において有用であり得る有力で貴重なツールを代表する。

ＲＮＡｉ媒介性転写分解経路の機構に関する最近の研究は、この経路におけるキーコンポーネントを多数明らかにした。ダイサーと呼ばれるタイプＩＩＩのＲＮａｓｅは、長いｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡにプロセシングし（ＲＩＳＣ）、続いてＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のパートナーとすることにより、配列特異的様式において標的転写物の分解に介在する。この現象は多様な群の生物において観察されてきた。不幸なことに、哺乳類細胞においてＲＮＡｉを誘導するために長いｄｓＲＮＡを用いた最初の試みは、インターフェロン応答の誘導のために限られた成功しかもたらさず、目的とは異なり、一般的な蛋白質合成阻害をもたらした。

より最近、短い合成ｓｉＲＮＡを培養にて哺乳類細胞に導入したとき、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が達成できたが、インターフェロン応答は誘導しなかった。これらの短い二重鎖は、細胞中の標的ｍＲＮＡを９５％より多く分解するために少し足りないモル濃度において触媒的に作用し得る。ｓｉＲＮＡの活性並びにその応用のいくつかに関する機構の説明が、Ｐｒｏｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｃｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．，２００２ Ｎｏｖ．，１，２１（２１）：５８６４−５８７４；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＤＥ−４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＤＥ−１，ＤＣＲ−１ ａｎｄ ａ ＤｅｘＨ−ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｊｕｎｅ ２８，１０９（７）：８６１−７１；Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｉｍｉｎｇ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１，１５）２０）：２６５４−９；及びＭａｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ Ｇｕｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｓｅｐｔ．６，１１０（５）：５６３に提供される。

ＲＮＡｉの裏付けにも拘わらず、ｓｉＲＮＡを用いて作業するときは、機能性、特異性、デリバリー法、及び安定性を含む４つの主要な問題に注意を向けなければならない。特異性は、他の遺伝子の発現を変更することなしに所望の標的を沈黙させる特定のｓｉＲＮＡの能力を意味し、そして最近の研究は、「オフターゲット」（即ち、意図された標的以外の標的のノックダウン）が最初に予測されたよりもＲＮＡｉにおいては遥かに広範囲であることを示した（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：６３５−７を参照）。

オフターゲット効果は不所望の表現型を誘導し得るので、オフターゲットを最小にするか、変更するか、又は排除するための新規な方法が、有効な研究及び治療のツールにｓｉＲＮＡがなるために不可欠であると考える。本発明は、ｓｉＲＮＡ特異性を増加させるか又は変更し得るｓｉＲＮＡへ修飾を提供することにより特異性の問題に取り組む。

発明の概要
本発明は、ＲＮＡ干渉を実行するための組成物及び方法に向けられる。一般に、本明細書において記載されるｓｉＲＮＡ化学修飾は、分子特異性の決定的な特性に影響する。特異性に影響する修飾は、特異性が決定的な研究及び治療の応用において特に有利である。ＲＮＡｉの応用を実質改善する修飾の別々の組み合わせ（及びその修飾パターンの派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ））が開示されて、サイレンシング試薬のデザインにおいて応用できる。

第１の態様によれば、本発明は、二重鎖リボヌクレオチドに向けられ、
ａ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖は：
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖は、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは糖部分の５’炭素がリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチド（５’ ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

第２の態様によれば、本発明は、ヘアピンｓｉＲＮＡを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡに向けられ、当該単分子ｓｉＲＮＡは：
ａ．センス領域を含むセンス鎖であって、但し、当該センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；
ｂ．アンチセンス領域を含むアンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは５’炭素がリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖；及び
ｃ．ループ領域であって、但し、ループ領域はセンス領域とアンチセンス領域の間に位置するループ領域
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドが二重鎖領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドが二重鎖領域のアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

第３の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にするための方法に向けられ、当該方法は、標的核酸分子を発現しているか又は発現することができる標的核酸又は細胞に、ｓｉＲＮＡを曝露することを含み、当該ｓｉＲＮＡは、
ａ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖が：
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖；
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

第４の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にするための方法に向けられ、当該方法は、標的核酸分子を発現しているか又は発現することができる標的核酸又は細胞に、単分子ｓｉＲＮＡ（ヘアピンを形成することができる）を曝露することを含み、当該単分子ｓｉＲＮＡは、
ａ．センス領域を含むセンス鎖であって、但し、当該センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス領域を含むアンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖；及び
ｃ．ループ領域であって、但し、ループ領域はセンス領域とアンチセンス領域の間に位置するループ領域
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドが二重鎖領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドが二重鎖領域のアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

第５の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にするための方法に向けられ、当該方法は、標的核酸分子を発現しているか又は発現することができる標的核酸又は細胞に、２つ又はそれより多いｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡのプール）を曝露することを含み、当該ｓｉＲＮＡｓはアンチセンス鎖とセンス鎖を含み、但し：
ａ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

第６の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にするための方法に向けられ、当該方法は、標的核酸分子を発現しているか又は発現することができる標的核酸又は細胞に、２つ又はそれより多いｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡのプール）を曝露することを含み、当該ｓｉＲＮＡｓはアンチセンス領域とセンス領域を含み、但し：
ａ．センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス領域；及び
ｂ．アンチセンス領域であって、但し、アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス領域
ｃ．ループ領域であって、但し、ループ領域はセンス領域とアンチセンス領域の間に位置するループ領域
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

本発明と他の並びにさらなる利点及び態様を合わせた良好な理解のためには、実施例と共に以下の記載が参照されるが、その範囲は特許請求の範囲に記載される。

詳細な説明
本発明は、好ましい態様との関連において今記載される。これらの態様は、本発明の理解の助けのために提示されて、如何なる意味においても発明を限定するために意図されたものではないし、解釈されるべきでもない。全ての代替物、修飾及び均等物はこの開示を読んだ当業者には明らかになり、本発明の精神と範囲の中に含まれる。

この開示はＲＮＡ干渉を実施するために組成物及び方法の入門書（ｐｒｉｍｅｒ）ではない。当業者に知られている基礎的な概念は、詳細には示されなかった。

本発明は、ｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングを含むＲＮＡ干渉を実施するための組成物と方法に向けられる。本発明、修飾されたポリヌクレオチド及びそれらの誘導体の使用を通して、ＲＮＡ干渉の応用の効率を改善するかもしれない。

他に特別に明確にしない限り、又は内容から暗に含まれるとおり（ｏｒ ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｅｎｔ）、以下の用語及び句は以下に提供される意味を含む：
アルキル
用語「アルキル」は、飽和か又は未飽和であり得るヒドロカルビル部分を意味する。それは、直鎖状、枝分かれ及び／又は環状の部分を含んでよい。

例示のアルキル部分は、限定ではないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及び多数の炭素のアルキル基、並びに、２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル等を含む。用語アルキルは、アルケニル基、例えば、ビニル、アリル、アラルキル及びアルキニル基も包含する。他に特定しない限り、アルキル基は置換されていない。

２’修飾のための好ましいアルキル基は、リボシル部分の２’炭素へのＯ−結合を含むメチル基であり、即ち、２’−Ｏ−メチル基を含む２’−Ｏ−アルキルである。好ましい２’−Ｏ−メチル基は置換されていない−Ｏ−ＣＨ_３である。

２’−Ｏ−アルキル修飾されたヌクレオチド
句「２’−Ｏ−アルキル修飾されたヌクレオチド」は、糖部分、例えば、酸素原子が糖の２’位に位置する炭素原子とアルキル基の両方に結合するように２’位で修飾されたデオキシリボシル部分を有するヌクレオチドユニットを意味する。様々な態様において、上記アルキル部分は、アルキル部分がメチル部分であるものである。

アンチセンス鎖
句「アンチセンス鎖」は、目的のポリヌクレオチド領域に対して実質上相補性（即ち、８０％又はそれより高い）であるか又は１００％相補性のポリヌクレオチドを意味する。アンチセンス鎖は、ＲＮＡ，ＤＮＡ又はキメラＲＮＡ／ＤＮＡであるポリヌクレオチド領域から構成されてよい。例えば、アンチセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡ，ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例えば、ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）又はコーディング又は非コーディングのＤＮＡの配列の分子に全体又は一部で相補性であってよい。句「アンチセンス鎖」は、２つの別々の鎖から形成されるポリヌクレオチドのアンチセンス領域並びにヘアピン構造を形成することができる単分子ｓｉＲＮＡｓのアンチセンス領域を含む。句「アンチセンス鎖」及び「アンチセンス領域」は、均等であることが意図され、交換可能に使用される。アンチセンス鎖は、小分子及び／又はコンジュゲートの別種の（ｄｉｖｅｒｓｅ）グループ内で修飾することができる。

２’炭素修飾
句「２’炭素修飾」は、糖部分、例えば、糖サブユニットの２’位において修飾される部分を有するヌクレオチドユニットを意味する。「２’−Ｏ−アルキル修飾されたヌクレオチド」は、酸素原子が糖の２’位に位置する炭素原子とアルキル基の両方に結合されるようにこの位置で修飾されており、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）、及び２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）である。「２’炭素センス修飾」は、ポリヌクレオチドのセンス鎖上又はセンス領域内のヌクレオチドの２’炭素位置上における修飾を意味する。「２’炭素アンチセンス修飾」は、ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖上又はアンチセンス領域内のヌクレオチドの２’炭素位置上における修飾を意味する。

相補性
用語「相補性」は、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を意味する。塩基対は、一般に、逆平行ポリヌクレオチド鎖又は領域内のヌクレオチドユニット間の水素結合により形成される。相補性ポチヌクレオチド鎖又は領域は、ワトソン−クリック様式（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）によるか、又は安定な二重鎖の形成を許容するあらゆる他の様式にて塩基対合できる。相補性は、一般に、二重鎖領域に関して測定され、即ち、例えば突出は除外する。二重鎖領域は、２つの鎖の間、又は単一の鎖、例えば単分子ｓｉＲＮＡの２つの領域の間の相補性の領域を含む。一般には、相補性の領域はワトソン−クリック塩基対合からもたらされる。

完全な相補性又は１００％の相補性は、一つのポリヌクレオチド鎖又は領域の各ヌクレオチドユニット第２のポリヌクレオチド鎖又は領域の各ヌクレオチドユニットと水素結合できるような状況を意味する。完全相補性は、決して、２つの鎖又は２つの領域の幾つかであるが全てではないヌクレオチドユニットが互いに水素結合できることではない。例えば、２０マーに関しては、各鎖上のたった２つの塩基対しか互いに水素結合できなくても、ポリヌクレオチド鎖又は領域は１０％相補性を呈する。同じ例として、各鎖又は各領域の１８マー塩基対が互いに水素結合できるのなら、実質上の相補性は、８０％又はそれより高い相補性を呈するポリヌクレオチド鎖又は領域を意味する。

デオキシヌクレオチド
用語「デオキシヌクレオチド」は、糖部分の２’又は３’位においてか、及び／又は２’，３’末端ジデオキシにおいてＯＨ基を欠くが、代わりに２’及び／又は３’に水素を有するヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。

デオキシリボヌクレオチド
用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボシル部分の２’位にＨを有する少なくとも一つのリボシル部分を含むヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。

下流
第１の領域のもっとも５’の位置が第２の領域（又はヌクレオチド）の３’エンドに対してその領域のもっとも近い部分であれば、ヌクレオチドの鎖の第１の領域又はヌクレオチドが第２の下流にあると考えられる。

第１の５’末端アンチセンスヌクレオチド
句「第１の５’末端アンチセンスヌクレオチド」は、第２の鎖又は領域上に対応する相補塩基を有するアンチセンス鎖又は領域の塩基に関してその鎖のもっとも５’の部分に位置するアンチセンス鎖又は領域のヌクレオチドを意味する。即ち、２つの異なる鎖から作られたｓｉＲＮＡ（即ち、単分子又はヘアピンｓｉＲＮＡではない）において、それはアンチセンス鎖上のあらゆる５’突出の一部である塩基以外のもっとも５’の塩基を意味し、存在してもしなくてもよい。第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドがヘアピン分子の一部なら、用語「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」は、アンチセンス領域内のもっとも５’の相対的な位置を意味し、即ち、アンチセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドである。

第１の５’末端センスヌクレオチド
句「第１の５’末端センスヌクレオチド」は、アンチセンスヌクレオチドに関して定義される。２つの異なる鎖から構成された分子（即ち、単分子又はヘアピンｓｉＲＮＡではない）において、それはアンチセンス鎖上に対応する相補塩基を有するセンス鎖の塩基に関してその鎖のもっとも５’位に位置するセンス鎖を意味する。即ち、２つの異なる鎖から作られたｓｉＲＮＡ（即ち、単分子又はヘアピンｓｉＲＮＡではない）において、それはセンス鎖上のあらゆる５’突出の一部である塩基以外のもっとも５’の塩基を意味し、存在してもしなくてもよい。第１の５’末端センスヌクレオチドがヘアピン分子を形成することができる単分子ｓｉＲＮＡの一部なら、用語「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）」は、センス鎖又は領域内の相対的な位置を意味し、第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドに相補な塩基からの距離により測定される。

機能性
ｓｉＲＮＡは、五つ（５）の群（非機能性、半機能性、機能性、高機能性、及び超機能性）に、培養された細胞系においてそれらが誘導するサイレンシングのレベル又は程度に基づいて分類してよい。本明細書にて使用されるこの定義は、ｓｉＲＮＡが１００ｎＭの濃度において上記細胞系にトランスフェクトされて、サイレンシングのレベルがトランスフェクションの大まかに２４時間後であってトランスフェクションから７２時間を超えない時間に試験される場合の条件設定に基づく。このコンテクストにおいて、「非機能性ｓｉＲＮＡ」は、５０％未満（＜５０％）の標的サイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡとして定義される。「半機能性ｓｉＲＮＡ」は、５０−７９％標的サイレンシングを誘導する。「機能性ｓｉＲＮＡ」は、８０−９５％遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「高機能性ｓｉＲＮＡ」は、９５％より高い遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。「超機能性ｓｉＲＮＡ」は、特殊なクラスの分子である。このドキュメントのため、超機能性ｓｉＲＮＡは、（１）それらがサブナノモラー濃度（即ち、１ナノモラーより低い）にてトランスフェクトされた場合に特定の標的の９５％を超えるサイレンシングを誘導し；及び／又は（２）９６時間より長くサイレンシングの機能性（又は良好な）レベルを誘導する分子として定義される。これらの相対的な機能性（絶対的であることを意図しない）は、機能性ゲノミクス、標的道程及び治療のような応用のために特定の標的に対してｓｉＲＮＡｓを比較するため使用してよい。

機能性用量
「機能性用量」は、投与の２４、４８、７２、及び９６時間後に１００ｎＭのレベルにおいてｍＲＮＡ中の９５％より大きいか又は等しい低下を誘導するのに有効なｓｉＲＮＡの用量を意味するが、「僅かに機能的な用量の」ｓｉＲＮＡは投与の２４時間後に１００ｎＭにおいてｍＲＮＡの５０％より多くか又は等しい低下を誘導するのに有効であり、そして「非機能用量」のＲＮＡは投与の２４時間後に１００ｎＭにおいてｍＲＮＡの５０％より多くか又は等しい低下を誘導するのに有効である。

ミスマッチ
用語「ミスマッチ」は、センス鎖のヌクレオチドとアンチセンス鎖のヌクレオチドの間にワトソンクリック塩基対合が起こらない状況を含み、但し、上記ヌクレオチドはミスマッチ位置の直後（５’方向）で始まるミスマッチの５’位置において及びミスマッチ位置の直後で（３’方向）始まるミスマッチの３’方向において塩基対を含む二重鎖を周囲に有する。ミスマッチの例は、Ｇの向かいにＡ、Ａの向かいにＣ、Ｃの向かいにＡ、Ａの向かいにＡ、Ｇの向かいにＧ、Ｃの向かいにＣ等々である。ミスマッチは、ヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドの向かいの脱塩基残基、ヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドの向かいの非環状残基、ギャップ、又は不対ループを含むことも意味する。そのもっとも広い意味において、本明細書にて使用されるミスマッチは、変化が現れる位置においてか又は位置の近辺にて熱力学特性を低下させる所定の位置において、特定の位置の二重鎖の熱力学安定性がその位置のワトソンクリック塩基対の熱力学安定性よりも低いようなあらゆる変化を含む。好ましいミスマッチは、Ａの向かいのＧ、及びＣの向かいのＡを含む。特に好ましいミスマッチは、Ａの向かいのＡ、Ｇの向かいのＧ、Ｃの向かいのＣ、及びＵの向かいのＵを含む。

ヌクレオチド
用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はそれらの修飾形態、並びにそれらの類似体を意味する。ヌクレオチドは、プリン、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及びそれらの誘導体及び類似体、並びにピリミジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びそれらの誘導体及び類似体を含む種を含む。好ましくは、「ヌクレオチド」は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、又はグアニン部分を含む。好ましいヌクレオチドは、他に特定しない限り（例えば、２’修飾、５’修飾、３’修飾、核塩基修飾、まあは修飾されたヌクレオチド間結合を特定する場合）、未修飾のシトシン、ウラシル、チミン、アデニン、及びグアミンを含む。

ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を有するヌクレオチド、例えば、限定ではないが、５−位のピリミジンの修飾、８−位のプリンの修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、及び５位ブロモ−ウラシルの置換；２’−位の糖修飾、例えば、限定ではないが、２’−ＯＨがＨ，ＯＲ，Ｒ，ハロ、ＳＨ，ＳＲ，ＮＨ_２，ＮＨＲ，ＮＲ_２又はＣＮ（式中、Ｒは前で定義されたアルキル部分である）により置換された糖修飾されたリボヌクレオチドを含むものを含む。ヌクレオチド類似体は、イノシン、キュェオシン、キサンチンのような塩基、２’−メチルリボースのような糖、メチルホスフォネート、ホスフォロチオエート及びペプチドのような非天然リン酸結合を含むヌクレオチドを含むことも意味する。

修飾された塩基は、例えば、一つ又はそれより多い原子又は基の置換又は付加により修飾された、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル、キサンチン、イノシン、及びキュェオシンのような塩基を意味する。塩基部分に関して修飾されたヌクレオチドを含み得る修飾の種類の例は、限定ではないが、アルキル化された、ハロゲン化された、チオール化された、アミン化された、アミド化された、又はアセチル化された塩基を様々な組み合わせにて含む。より特定の修飾された塩基は、例えば、５−プロポニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン及び５位において修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２−チオウリジン及び４−チオウリジン及び２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キュェオシン、アーケオシン、ナフチル及び置換されたナフチル基、あらゆるＯ−及びＮ−アルキル化されたプリン及びピリミジン、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−ベンゼン、Ｇ−クランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８−置換されたアデニン及びグアニン、５−置換されたウラシル及びチミン、アザピリジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化されたヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドは、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、並びに、リボシルではない糖又はその類似物を有するヌクレオチドも含む。例えば、糖部分は、例えば、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、及び他の糖、複素環、又は炭素環であるか、又は、に基づいてよい。用語ヌクレオチドは、当業界においてユニバーサル塩基として知られるものを含むことも意味する。例示として、ユニバーサル塩基は、限定ではないが、３−ニトロピロール、５−ニトロピロール、又はネブラリンを含む。

さらに、用語ヌクレオチドは、検出可能な標識、例えば放射性部分又は蛍光部分を有する種、又はヌクレオチドへのマス標識連結をも含む。

ヌクレオチドユニット
句「ヌクレオチドユニット」は、単一ヌクレオチド残基を意味し、そして修飾されたか又は未修飾の窒素含有塩基、修飾されたか又は未修飾の糖、及び２つのヌクレオチドを一緒に結合することを許容する修飾されたか又は未修飾の部分、又はさらなる結合を排除するコンジュゲートから構成される。

オフターゲット
用語「オフターゲット」及び句「オフターゲット効果」は、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列又は細胞蛋白質又は他の部分に対して直接又は間接の何れかで相互作用することにより、所定の標的に対して向けられたｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが意図されない効果を誘導するあらゆる例を意味する。例えば、「オフターゲット効果」は、他の転写物とｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖との間の部分的相同性又は相補性のために、他の転写物の同時分解が存在する場合に起こるかもしれない。

突出
用語「突出」は、第１の鎖又は領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて伸びる一つの鎖又は領域によりもたらされる、末端の非塩基対合のヌクレオチド（単一又は複数）を意味する。塩基対の水素結合を通して二重鎖を形成することができる２つのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域の一方又は両方が、２つのポリヌクレオチド及び／又は両方により共有される相補な３’エンド及び／又は５’エンドを超えて伸びる５’及び／又は３’エンドを有してよい。二重鎖の３’及び／又は５’エンドを超えて伸びる単鎖領域を突出と呼ぶ。

薬学上受容可能な担体
句「受容可能な担体」は、限定ではないが、ｄｓＲＮＡ，ｄｓＤＮＡ，又はｄｓＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの細胞への導入を促進させる組成物を含み、そして限定ではないが、溶剤又は分散剤、コーティング、抗感染剤、アイソトニック剤、及び発明のポリヌクレオチド及びｓｉＲＮＡｓの吸収時間又は放出に介在する剤を含む。

ポリヌクレオチド
用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを意味し、そして限定ではないが、規則正しく又は不規則に交代するデオキシリボシル部分及びリボシル部分（即ち、交代するヌクレオチドユニットが糖部分の２’において−ＯＨを有する場合、次に−Ｈ，次に−ＯＨ，次に−Ｈ，等々）、及びあらゆる位置においてヌクレオチドユニットへの様々な全体又は部分の連結が含まれるこれらの種類のポリヌクレオチドの修飾を含む、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。他に特定しない限り、又はコンテクストから明らかでない場合、用語「ポリヌクレオチド」は単分子ｓｉＲＮＡｓ及び２つの別々の鎖から構成されるｓｉＲＮｓの両方を含む。

ポリリボヌクレオチド
用語「ポリリボヌクレオチド」は、２つ又はそれより多い修飾されたか又は未修飾のリボヌクレオチド及び／又はそれらの類似体を含むポリリボヌクレオチドを意味する。

プーリング（ＰＯＯＬＩＮＧ）
用語「プーリング」は、単一の遺伝子を標的とする２つ又はそれより多いｓｉＲＮＡ（好ましくは合理的に設計されたｓｉＲＮＡ）が組み合わされて細胞に導入されることにより遺伝子ノックダウンを導入するプロセスを意味する。

リボヌクレオチド及びリボ核酸
用語「リボヌクレオチド」及び句「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、少なくとも一つのリボヌクレオチドユニットを含む修飾されたか又は未修飾のヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドユニットは、リボシル部分の１位においてＮ−グリコシド結合に連結された（ａｔｔａｃｈｅｄ）窒素含有塩基を有するリボシル部分の２’位置に連結された酸素、及び別のヌクレオチドへの結合に関して許容するか又は結合を排除する部分を含む

ＲＮＡ干渉とＲＮＡｉ
句「ＲＮＡ干渉」及び用語「ＲＮＡｉ」は、同義であり、そして少なくとも一つのリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はｓｉＲＮＡが生物学的プロセスに影響を及ぼすプロセスを意味する。当該プロセスは、限定ではないが、ｍＲＮＡを分解し、翻訳を終結させ、ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｃＤＮＡ及びゲノミックＤＮＡとの相互作用、並びにＤＮＡの補助蛋白質によるメチル化による遺伝子サイレンシングを含む。

第２のヌクレオチド
用語「第２のヌクレオチド」又は「ヌクレオチド番号２」は、それぞれ各鎖の５’エンドから数えてセンス鎖又はアンチセンス鎖上の二重鎖内の第２番目のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは対合しているか、又は、例えばミスマッチの場合には対合していなくてよい。

第２の５’末端アンチセンスヌクレオチド
句「第２の５’末端アンチセンスヌクレオチド」は、第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドにすぐ隣接し且つ第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドの３’位に連結したヌクレオチドを意味する。即ち、それは、相補なセンス鎖が存在する場合のヌクレオチドのセット内のアンチセンス鎖又は領域のもっとも５’のヌクレオチドである。

第２の５’末端センスヌクレオチド
句「第２の５’末端センスヌクレオチド」は、第１の５’末端センスヌクレオチドにすぐ隣接し且つ第１の５’末端センスヌクレオチドの３’位に連結したヌクレオチドを意味する。即ち、それは、相補なセンス鎖が存在する場合のヌクレオチドのセット内のセンス鎖又は領域のもっとも５’のヌクレオチドである。

センス鎖
句「センス鎖」は、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列のような標的核酸と全部又は一部同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又は領域を意味する。句「センス鎖」は、２つの異なる鎖から形成されるポリヌクレオチド、並びにヘアピン構造を形成することができる単分子ｓｉＲＮＡｓ両方のセンス領域を含む。配列が用意された場合、慣用により、他に指示しない場合、それはセンス鎖（又は領域）であり、相補なアンチセンス鎖（又は領域）の存在は暗黙である。句「センス鎖」及び「センス領域」は均等であり交換可能に使用されることを意図する。

ｓｉＲＮＡ又は単鎖干渉ＲＮＡ
用語「ｓｉＲＮＡ」及び「単鎖干渉ＲＮＡ」は、単分子核酸を意味し、そしてＲＮＡｉを実施することができる２つの異なる鎖を含み且つ１８から３０の間の塩基の長さの二重鎖領域を有する核酸を意味する。代わりに、用語ｓｉＲＮＡ及び句「短鎖干渉ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド部分よりも短い部分も含む核酸を含み、限定ではないが、修飾されたヌクレオチド、修飾ヌクレオチド間結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド及び上記ヌクレオチドの類似体を含む。

ｓｉＲＮＡｓは二重鎖であって単分子ポリヌクレオチドをも含み得る。そのような単分子の分子は、自己相補性（ステム）の領域を含むことにより、ポリヌクレオチドの一つの領域からのヌクレオチドがポリヌクレオチドの別の領域と対合し（即ち、二重鎖を形成する）、そしてループにより分離される。そのような単分子の分子はサイズ及び設計を変更することができ、そして限定ではないがヘアピン、単鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短い一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を含む様々な名称により呼ばれる。これらの分子中のステム領域の長さは１８から４５ヌクレオチドの長さの間で変更し得る。同様に、ループのサイズは４から２３ヌクレオチドの長さの間で変更でき、そしてヌクレオチド、非ヌクレオチド、及びヌクレオチド−非ヌクレオチドの組成を含むことができる。

ｓｉＲＮＡがヘアピンの場合、センス鎖とアンチセンス鎖は一つの長い分子の一部である。

実質相補性
実質相補性は、８０％又はそれより高い相補性を呈するポリヌクレオチド鎖を意味する。

好ましい態様
本発明は、今、好ましい態様と関連して記載される。これらの態様は、本発明の理解の助けとなるために提示されたのであり、如何なる意味においても発明を限定することを意図してはおらず、そう解釈されるべきではない。全ての変更物、修飾及び均等物はこの開示を読んだ当業者には明らかになり、本発明の精神と範囲内に含まれる。

第１の態様によれば、本発明は、二重鎖リボヌクレオチドに向けられ、
ａ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖は：
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖は、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは糖部分の５’炭素がリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチド（５’ ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

一つの態様において、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは、その２’位に−ＯＨを含む。この態様において、第１の２’−Ｏ−アルキル修飾は、好ましくは２’−Ｏ−メチルであり、第２の２’−Ｏ−アルキル修飾は、好ましくは２’−Ｏ−メチルであり、そして第３の２’−Ｏ−アルキル修飾は、好ましくは２’−Ｏ−メチルである。好ましい態様において、この態様の二重鎖リボヌクレオチドは、第１の５’センスヌクレオチド、第２の５’センスヌクレオチド、及び第２の５’アンチセンスヌクレオチド以外の全てのヌクレオチド上に２’−ＯＨを含む。

別の態様において、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは、第４の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む。この態様において、第１の２’−Ｏ−アルキル修飾は２’−Ｏ−メチルを含み、第２の２’−Ｏ−アルキル修飾は２’−Ｏ−メチルを含み、第３の２’−Ｏ−アルキル修飾は２’−Ｏ−メチルを含み、そして第４の２’−Ｏ−アルキル修飾は２’−Ｏ−メチルを含む。好ましい態様において、この態様は、さらに、第１の５’センスヌクレオチド、第２の５’センスヌクレオチド、第１のアンチセンスヌクレオチド、上記第２の５’アンチセンスヌクレオチド以外の全てのヌクレオチド上に２’−ＯＨを含む。

著者は、１８−２４ｂｐの間の長さのｓｉＲＮＡｓのアンチセンス（及びセンス）鎖の第２の位置が（ｓｉＲＮＡ中のあらゆる「他の塩基又は塩基対と違い」、意図された標的（即ち、オフターゲット）以外の標的のサイレンシングに介在するキーポジションであること、及びこの位置の修飾及び／又は変更することにより、あらゆるｓｉＲＮＡにより生じたオフターゲットを排除することができることを認識する。この書類の実施例８に示されるとおり、２位の化学修飾は、マイクロアレイ分析により測定されたところによれば、その標準により生じたオフターゲット効果を有効に排除する。同様に、実施例９は、２位（及び他の位置）の塩基対ミスマッチの付加が如何にしてオフターゲット効果のパターンを劇的に変化させることができるのかを証明する。オフターゲット効果をシフトするか又は変化させる能力は、一つ又はそれより多いオフターゲット遺伝子のダウン制御が不所望の表現型を誘導する例において、特に価値がある。そのようなオフターゲット誘導性の表現型が存在して、ＡＳ鎖の２位における変化により排除され得る証拠を実施例１０に提供する。

２位の重要性に関する知見（センス及び／又はアンチセンス鎖の何れかの）は、様々な戦略によるオフターゲットの有効な排除を可能にさせる。例えば、この位置における例えばアンチセンス鎖上の２’修飾（例えば２’−Ｏ−アルキル修飾）の添加は、この鎖に帰するオフターゲット効果を有効に排除することができる。同様に、意図された標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の間にミスマッチが今存在するように、例えば、アンチセンス鎖の２位における塩基を置換することができる。この位置における単一の塩基対のミスマッチ（又は修飾）は、意図された標的を沈黙させるこのｓｉＲＮＡの能力を劇的に変更はしないが、それは、オフターゲットを沈黙化させｓｉＲＮＡの能力を変更する。例えば、アンチセンス鎖の２位以外の位置（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖の３、４、５、６、７、又は８位において、但し、ナンバリングはアンチセンス鎖の５末端に関しての位置を表示し、２位はアンチセンス鎖上のもっとも５’のヌクレオチドに隣接したヌクレオチドである）における塩基対ミスマッチが特定のオフターゲット効果を低下させるか、排除するか、又は変更することもできることに注目すべきである。適切なミスマッチは、限定ではないが、Ａ−Ｇ対合、Ａ−Ａ対合、Ｇ−Ｇ対合、Ｃ−Ｃ対合、及びＵ−Ｕ対合を含む。さらに、ミスマッチの位置は、好ましくは、アンチセンス鎖又はセンス鎖の３、４、５、６、７、又は８位にある。もっとも好ましくは、ミスマッチの位置はアンチセンス鎖又はセンス鎖の２位にある。このような塩基対置換の使用はオフターゲットのオリジナルセットを排除できるが、新規のオフターゲット（新規なセットの遺伝子の相補性からもたらされる）が結果として生じ得ることに注目すべきである。このため、この発明において記載された化学修飾が全てのオフターゲット効果を排除するか又は最小にするｓｉＲＮＡに添加されることは、より好ましい。即ち、限定ではないが：１）センス及び／又はアンチセンス鎖のヌクレオチド番号２の塩基、糖又はヌクレオチド内部の結合の化学修飾；（２）有力なオフターゲットｍＲＮＡとｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖の何れかとの間にミスマッチが生じるような塩基又は塩基対の置換を含む、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖の２、３、４、５、６、７、又は８位におけるヌクレオチド又はヌクレオチド対の変更；（３）それがｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖にアニールするときオフターゲット転写物中にバルジが生じるような２、３、４、５、６、７、又は８位におけるヌクレオチド又はヌクレオチド対の欠失；（４）それがオフターゲットｍＲＮＡメッセージにアニールするときｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖の中にバルジが生じるような２位におけるヌクレオチド又はヌクレオチド対の挿入を含む、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖の２、３、４、５、６、７、又は８位におけるヌクレオチド又はヌクレオチド対の変更；（５）糖の環のＣ３位に修飾を有する非塩基ヌクレオチド又はヌクレオチド対の存在を含む、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖の２、３、４、５、６、７、又は８位におけるヌクレオチド又はヌクレオチド対の変更、を含む修飾を用いて、危険な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）例においてオフターゲット効果を排除するか、最小にするか、又は変更することができる。上記のミスマッチは、オフターゲット効果を減じるために上記の態様の何れかと共に使用することができる。

即ち、好ましくは、第１の態様のｓｉＲＮＡは、突出を除いて１８−２４塩基対である。これらの分子は、タイプＩＩＩのＲＮａｓｅによりプロセシングを受け（あるいは不十分にプロセシングされ）、そしてこのために修飾のパターンは細胞内で保存される。好ましくは、センス鎖とアンチセンス鎖が塩基対の範囲全域で少なくとも実質相補であり、より好ましくは、この範囲全域で１００％相補である。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。

第１の態様のｓｉＲＮＡは、センス及び／又はアンチセンス鎖の何れかの５’又は３’エンドの何れかに１−６ヌクレオチドの突出を含んでもよい。しかしながら、好ましくは、何らかの突出が存在するなら、それらはセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’エンド上にある。さらに、好ましくは、何れの突出も６又はそれ未満の塩基長であり、より好ましくは２又はそれ未満の塩基長である。もっとも好ましくは、突出がないか、又は３’エンドにおいてセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は両方の２塩基の突出が存在する。突出するヌクレオチドは一つ又はそれより多い細胞内酵素処理又は事象によりしばしば除去されるため、即ち、未リン酸化５’−ヌクレオチドを残すため、アンチセンス鎖の５’エンド上には突出を有さないほうが好ましい。さらに、突出は一つ又はそれより多い安定化修飾、例えば、２’位のハロゲン修飾、ヌクレオチド間の修飾、例えば、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエート、又はメチルホスフォネート修飾を含み得る。

第１の態様をさらに参照すると、第１の５’末端アンチセンスヌクレオチドのリン酸化は、ヌクレオチドの糖部分の５’炭素に連結された一つ又はそれより多いリン酸基の存在を意味する。

本発明によれば、第１及び第２の５’センスヌクレオチド及び第２の５’アンチセンス鎖の修飾は、２’−Ｏ−アルキル基である。好ましくは、修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）、及び２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）からなる群から選択される。さらに好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチル部分である。さらに、修飾が、第１の５’センスヌクレオチド、第２の５’センスヌクレオチド、又は第２のアンチセンスヌクレオチドの各々で同じ必要はない。しかしながら、本発明の分子を合成することに関しての実施の問題として、同じ修飾を終始使うことが望まれる。

あるいは、上記分子は、センス鎖であって、但し、当該センス鎖は、第１の５’センスヌクレオチドを含み、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、そしてセンス鎖は第２の５’センスヌクレオチドを含み、但し、第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；そして全てのＣｓとＵｓ（上記の位置の何れか以外）が２’−Ｏ−アルキル修飾されている、センス鎖；及びアンチセンス鎖であって、但し、当該アンチセンス鎖は、第１の５’アンチセンスヌクレオチドを含むが、当該第１の５’センスヌクレオチドはリン酸化されており、そしてアンチセンス鎖は第２の５’アンチセンスヌクレオチドを含み、当該第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、そして全てのＣｓとＵｓ（もし存在するなら第２の５’アンチセンスヌクレオチドにおける以外）が２’Ｆにより修飾されているアンチセンス鎖を有することができる。さらに、これらの分子は鎖の何れか又は両方の３’エンドに２ヌクレオチド突出をさらに含むことができ、そして、（１）突出の２ヌクレオチドの間；及び（２）突出の終わりから２番目のヌクレオチドに二重鎖領域の最後のヌクレオチドの間の安定化されたヌクレオチド間結合をさらに含むことができ、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエート、又はメチルホスフォネート結合を含む。

あるいは、上記分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を含むことができ、センス鎖は第１の５’センスヌクレオチドを含み、但し、第１の５’センスヌクレオチドは５’デオキシヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は第１の５’アンチセンスヌクレオチドを含み、但し、当該第１の５’アンチセンスヌクレオチドは５’炭素においてリン酸化されており、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドを含み、但し、当該第２の５’アンチセンスヌクレオチドは２’−Ｏ−アルキル修飾を含む。ＲＮＡｉ経路により遺伝子サイレンシングに参加するための鎖に関して、その鎖の５’エンドは５’炭素位置においてリン酸化されていなければならない。５’エンドにおける５’デオキシヌクレオチドの存在は、その鎖から機能性官能基（−ＯＨ）を除去し、即ち、この位置においてリン酸を付加する内在キナーゼの能力を排除する。５’末端におけるリン酸基なしでこの鎖がＲＩＳＣ介在性オンターゲット及びオフターゲットサイレンシングに関与する能力を減じる。

発明は上記引用位置において２’−Ｏ−アルキル基を同定したが、発明者らは、類似又は同一の位置における他の化学修飾基を用いることによりオフターゲット効果を最小にすることも可能なことを認識する。例えば、そのような修飾がオフターゲット効果を最小にする条件下にて含まれるなら、２’修飾されたヌクレオチドは、２’ハロゲン修飾ヌクレオチド、２’アミン修飾ヌクレオチド、及び２’アルキル修飾ヌクレオチドであることができる。修飾がハロゲンの場合、ハロゲンは好ましくはフッ素である。２’修飾ヌクレオチドが２’アミン修飾ヌクレオチドの場合、アミンは好ましくは−ＮＨ_２である。２’修飾ヌクレオチドが２’アルキル修飾の場合、好ましくは、修飾は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、又はイソブチル部分からなる群から選択される。もっとも好ましくは、メチル部分の炭素が直接糖部分の２’炭素に連結された２’メチル修飾を用いる。

上記のとおり、第１の態様に記載された修飾パターンは、ダイサーによりプロセシングされない分子に適用可能である。また、いくつかの例においては、長い二重鎖（例えば、２５−３０塩基対）が好ましい。これらの分子は、ダイサーのための有力な基質であり、そしてそのために修飾のパターンがシフトし、そして突出の長さと位置の違うパターンが二重鎖設計に取り入れられることにより、第１の態様において記載された修飾の完全な相補体が最終二重鎖、ポストダイサープロセシング中に存在する。一つの非限定実施例において、二重鎖の末端の構造を操作することにより、最終産物が適切な位置において必要な修飾を有することを保証する。さらに、ダイサー分割の位置は、３’突出の長さを変更することにより操作することができる。即ち、例えば、２６塩基対又はそれより長い分子のための一つの好ましい設計は、（１）センス鎖上の１、２又は３ヌクレオチドの突出、及び二重鎖の反対のエンド上の突出なし；（２）第２の（鎖の５’エンドから数えて）アンチセンスヌクレオチド上の２’−Ｏ−アルキル修飾；（３）第１のアンチセンスヌクレオチドの５’炭素のリン酸化；及び（４）第２の（センス鎖の３’エンドから数えて、突出を含む）センス鎖のヌクレオチドの対の２’−Ｏ−アルキル修飾、を含む。ダイサーが二重鎖に入る（即ち、ダイサーが分子の平滑エンドよりむしろ突出を含む分子のサイドに入るのが好ましい）場合のサイドに、３’センス鎖の突出の付加がバイアスをかける。これは、両方のアンチセンス修飾（即ち、第２のアンチセンスヌクレオチド上の２’−Ｏ−アルキル修飾、及び第１のアンチセンスヌクレオチド上の５’リン酸基）の最終のダイサープロセシング後のｓｉＲＮＡにおける保持／維持を保証する。さらに、センス鎖修飾の位置が、以後のダイサープロセシング、これらの修飾が最終のプロセシングされたｓｉＲＮＡの末端センスヌクレオチド（センスヌクレオチド１及び２）上に存在することになるのを保証する（図１を参照）。

第２の態様によれば、本発明は、ヘアピンｓｉＲＮＡを形成することができる単分子のｓｉＲＮＡに向けられ、当該単分子ｓｉＲＮＡは：
ａ．センス領域を含むセンス鎖であって、但し、当該センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；
ｂ．アンチセンス領域を含むアンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは５’炭素がリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖；及び
ループ領域であって、但し、ループ領域はセンス領域とアンチセンス領域の間に位置するループ領域
を含み、但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドが二重鎖領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドが二重鎖領域のアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

この態様によれば、修飾の範囲は第１の態様と同じである。しかしながら、ポリヌクレオチドが単分子であり、且つ、ヘアピンを形成でき、そして２つの別々の鎖ではないから、センス領域とアンチセンス領域の両方を含む一つの連続した分子である。好ましくは、センス領域とアンチセンス領域が少なくとも実質上は相補であり、より好ましくは１００％相補である。好ましくは、センス領域とアンチセンス領域が１９−３５塩基対、より好ましくは２４−３５塩基対、そしてもっとも好ましくは２６−３１塩基対を含む。好ましくは、単分子ｓｉＲＮＡの全長は１００塩基未満、より好ましくは８５塩基である。ｓｉＲＮＡは１００塩基未満を含み、より好ましくは８５塩基未満である。好ましくは、ヌクレオチドがＲＮＡである。

ヘアピンは、ステム（アンチセンス鎖とセンス鎖を組み合わせた二重鎖領域である）とループの２つの主要な成分を含む。任意に、突出配列を分子の５’、３’又は両方に加えることができる。好ましくは、突出が存在する場合、それは分子の３’エンドに結合される。単分子ｓｉＲＮＡを設計する場合、ヘアピンは左利きのヘアピン（例えば、５’−ＡＳ−ループ−Ｓ）又は右利きのヘアピン（例えば、５’−Ｓ−ループ−ＡＳ）として設計できる。好ましくは、ヘアピンは左利きのヘアピンである。この構成は、末端アンチセンスヌクレオチドをリン酸化するのが容易であるため、望まれる。二重鎖ｓｉＲＮＡを用いる場合のように、分子のステムの長さは、ダイサーによりプロセシングされるか否かを決定する。長いステム構造を含むヘアピンはダイサーの基質であるように、最終のダイサープロセシング後のｓｉＲＮＡが所望の位置において修飾を含むことを保証するために、化学修飾の位置が適合されなければならない。好ましくは、ダイサープロセシング後の分子は、第１の態様において記載された修飾の全てを含む。一つの非限定例において、２４塩基より長いステムを有する単分子の分子に関する好ましいヘアピン設計は、以下の特性を含む：（１）左利きヘアピンデザイン、（２）１，３ヌクレオチド３’突出、（３）もっとも５’のヌクレオチドの５’炭素上のリン酸基、（４）第２のアンチセンスヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル（好ましくはＯ−メチル）修飾、（５）センス鎖ヌクレオチド２１と２２、２２と２３、又は２３と２４（センス鎖の３’エンドから数えて、突出が含まれる）の対の２’−Ｏ−アルキル修飾。３’センス鎖突出の追加は、ダイサーが分子の５’ＡＳエンド上のヘアピンに入る能力を増強する。さらに、センス鎖の修飾の位置は、以後のダイサープロセシング、これらの修飾が最終のプロセシングされたｓｉＲＮＡの末端センスヌクレオチド（アンチセンス鎖上に相補塩基を有するセンスヌクレオチド１及び２）上に存在することになるのを保証する（図２を参照）。

ヘアピンはループ構造を含んでよく、好ましくは、４から１０塩基を含む。ループの塩基は修飾され得る。あるいは、ループは非ヌクレオチド成分、例えば、２００４年３月２５日にＵＳ２００４／００５８８８６ Ａ１として公表された米国特許出願番号１０／６３５１０８に記載されたような成分を含むことができる。ループ構造の好ましい配列は、例えば、５’−ＵＵＣＧ−３’（配列番号１８），５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（配列番号１９），５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号２０），５’−ＡＵＡＵＧＵＧ−３’（配列番号２１），又は先（ｐｒｉｏｒ）又は前（ｐｒｅ−）ｍＲＮＡ中に同定された他のあらゆるループを含む。

上で記載されたとおり、本発明の単分子ｓｉＲＮＡは最終的には、それらが２つの別々の分子に変換され得るように、細胞の機構によりプロセシングされてよい。さらに、これらの単分子ｓｉＲＮＡは、決して全ての修飾を伴って細胞に導入されなくてよく、そして導入された天然プロセス又はプロセシング分子の使用により細胞自身の中で修飾されてよい（例えば、細胞内リン酸化）。しかしながら、好ましくは、ｓｉＲＮＡは既に存在する全ての修飾を導入される。（同様に、第１の態様の鎖は全ての修飾により細胞に導入されることが好ましいが、アンチセンス鎖は、例えば導入後に修飾され得る。）ヘアピンがダイサーによりプロセシングされるなら、結果のヘアピンは本明細書に記載された様々な態様の修飾を保持すべきである。

上記の修飾は、記載されたヌクレオチドに加えて他の何れの部分も修飾されないこと、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果を最小にするか又は他の特性（例えば、改善された安定性又は機能性）を増強するのに寄与もすることを示唆すると解釈すべきではない。他の種類の修飾は、それらが容認不可能なほどにオフターゲット効果を増加させない限りにおいて、許容される。特定の態様において、そのような追加の修飾は、センス鎖の一つ、二つ、三つ、又はそれより多くの連続するヌクレオチド又は他の全てのヌクレオチドに加えることができる。あるいは、ＲＩＳＣによりセンス鎖の侵入及び／又は使用に対して鍵であるとして同定された特定の位置に、追加の修飾を制限することができる。前に記載されたとおり、さらに、追加の修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル基（又は他の２’修飾）を、センス鎖の一つ又はそれより多くの、好ましくは全てのピリミジン（例えば、Ｃ及び／又はＵ）に加えることができ、そして／又は、２’Ｆ修飾（又は他のハロゲン修飾）を、上で特定されたように別に修飾されたヌクレオチド以外の、アンチセンス鎖の一つ又はそれより多くの、好ましくは全てのピリミジン（例えば、Ｃ及び／又はＵ）に加えることができる。アンチセンス及び／又はセンス鎖のＣｓ及びＵｓ（それぞれ）及び上で特定されたヌクレオチドのその他のいくつか又は全ての修飾、例えば、２’Ｆ又は２’−Ｏ−アルキルは、標的特異的サイレンシングをかなり変更することなしに、態様１及び２に記載された修飾を有するｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子の安定性を多大に増強することができる。

さらに、標識を発明と共に使用するなら、これらの試薬は、トラッキング剤として有用であり得て、トランスフェクションの検出、並びに分子が細胞の何処に存在するのかの検出において補助する。共通に使用される標識の例は、限定ではないが、蛍光標識、放射性標識、又はマスラベルを含む。

リン酸バックボーンに接近する追加の安定性修飾を、本発明のいくつかの応用のためにｓｉＲＮＡ中に含めてもよい。例えば、少なくとも一つのホスフォロチオエート及び／又はメチルホスフォネートで、オリゴヌクレオチドバックボーンのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の中、並びに存在するかもしれないあらゆる突出、ループ構造又はステム構造の中の、何れかの又は全てのピリミジンのいくつか又は全ての３’位置のリン酸基を置換してよい。ホスフォロチオエート（及びメチルホスフォネート）類似体は、オリゴヌクレオチドバックボーン中のリン酸基から生じる。ホスフォロチオエートにおいては、リン酸Ｏ⁻が硫黄原子により置き換わる。メチルホスフォネートにおいては、酸素がメチル基により置き換わる。さらに、ホスフォロチオエート３’修飾を２’フルオロ修飾に代えるか又は独立に使用することにより、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を増加させてよい。これらの修飾は、本明細書において開示された他の修飾と組み合わせてか、又はｓｉＲＮＡの応用においてそれらの修飾とは独立して、使用してよい。

他の態様において、追加の修飾、例えば、以下に記載されたようなもの：（１）第２のアンチセンスヌクレオチド上の２’修飾（好ましくは２’−Ｏ−アルキル修飾）を含むアンチセンス鎖、プラス第１のアンチセンスヌクレオチドの５’炭素上のリン酸基；プラス（２）その鎖の５’エンドから数えてセンス鎖（又はｓｈＲＮＡのセンス領域）の１、２、及び３位が２’修飾基（好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾）により修飾されているか、又は（３）その鎖の５’エンドから数えて第１のセンスヌクレオチドが５’デオキシヌクレオチドであるかの何れかがさらに存在し得る。修飾の何れかの組み合わせもセンス鎖及びアンチセンス鎖により誘導されたオフターゲット効果の両方を実質上減じるのに有益かもしれない。

別の態様において、上記分子は、以下の修飾を含む：（１）第２の末端アンチセンスヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル修飾を含む；及び（２）第１の末端アンチセンスヌクレオチドが５’炭素上にリン酸基を含む；及び（３）センス鎖の第１の末端ヌクレオチドの５’炭素が、ヒドロキシル基をリン酸基に変換されることを受容するか又は変換されることをブロックするのに適した当業界公知のあらゆる基を含む。好ましくは、５’末端ヌクレオチドブロッキング基は、５’−Ｏ−アルキル、５’アミン妨害基、又は５’アジドブロッキング基を含む。

他の態様において、本発明の組成物の何れかが、さらに、３’キャップを含み得る。３’キャップは、例えば、転化された（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）デオキシチミジンであり得る。

本発明の他の態様において、組成物の何れかがコンジュゲートを含み得る。コンジュゲートは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、糖、糖質、脂質、ポリマー、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。コンジュゲートは、例えば、コレステロール又はＰＥＧであり得る。コンジュゲートは、さらに、標識、例えば、蛍光標識を含み得る。蛍光標識は、ＴＡＭＲＡ，ＢＯＤＩＰＹ，Ｃｙ３，Ｃｙ５，フロオレセイン、及びダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）からなる群から選択され得る。あるいは、蛍光標識は、当業界公知の如何なる蛍光標識でもあり得る。

他の態様において、本発明の組成物は、少なくとも一つの２’−オルソエステル修飾を含むことができ、２’−オルソエステル修飾は、好ましくは、２’−ビス（ヒドロキシエチル）オルソエステル修飾である。

二重鎖又は二重鎖領域は、一つ又はそれより多いミスマッチを含み得る。例えば、二重鎖領域は、例えばアンチセンス鎖の２から８位の何れか一つか又は組み合わせにて、一つ又はそれより多いミスマッチを含み得る。にも拘らず、二重鎖領域は、この場合に、少なくとも８０％相補性の１８−２４ヌクレオチドの塩基対の間で一つ又はそれより多いミスマッチが計算できる一つ又はそれより多いミスマッチを含むと考えられる。二重鎖領域が少なくとも一つのミスマッチを含み得るということは、本明細書において記載されたあらゆる態様に含まれ得る。

本発明の上記の修飾は、無作為に又は合理的デザイン選択手法、例えば、２００３年１１月１４日に出願された、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ」と題する米国特許出願連続番号１０／７１４，３３３；２００４年６月３日にＷＯ２００４／０４５４３ Ａ２として公表された「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ」と題する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３６７８７；及び２００４年９月１４日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ」と題する米国特許出願連続番号１０／９４０８９２に記載された合理的デザイン計算法に従い選択された配列を含むｓｉＲＮＡと組み合わせてよい。さらに、内部熱安定性に全部か又は一部基づいて配列を選択することが望まれるかもしれない。

本発明の第１及び第２の態様の修飾は、用いられるｓｉＲＮＡの機能性に依存して異なる効果を有してよいことに注目すべきである。即ち、高度に機能性のｓｉＲＮＡにおいては、本発明の修飾は特定の量の機能性を分子に損失させるかもしれないが、にも拘らず、オフターゲット効果が望まれるため、望まれる。中度又は低度の機能性ｓｉＲＮＡを用いる場合には対照的に、極めて僅かな機能性しか低下せず、幾例かにおいては、機能性が増加し得る。

様々なアプローチを用いることにより、センス及び／又はアンチセンス鎖のオフターゲット効果を排除することが必要な分子の種類及びキーポジションの両方を同定することができる。非限定例においては、修飾機能のウオークが実施される。この手法においては、単一の種類の修飾を、センス及び／又はアンチセンス鎖の全域で（ａｃｒｏｓｓ）一つ又はそれより多いヌクレオチドに加えられる。次に、修飾された分子及び未修飾の分子を（１）機能性；及び（２）オフターゲット効果に関していくつかの方法の一つにより試験する。即ち、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ基を、センス及び／又はアンチセンス鎖の何れかの、１及び２位、３及び４位、５及び６位、７及び８位、９及び１０位、１１及び１２位、１３及び１４位、１５及び１６位、１７及び１８位、又は１８及び１９位に添加し、そして機能性（例えば、これらの分子が特定の標的を沈黙化する能力を測定することによる）及びオフターゲット効果に関して試験する。オフターゲットのいくつか又は全てを排除するが二重鎖機能性の損失をもたらすキーの位置が同定されたなら、次に、第２ラウンドの修飾が歩きだし、それにより、二重鎖の機能性を増加させる疑いのある追加の化学基（例えば、アンチセンス鎖の５’エンドの上の５’リン酸）、ミスマッチ、又はバルジを、オフターゲットを排除する修飾を既に含む分子に追加することができる。

どの修飾が許容されるかを決定するために、いくつかの非限定アッセイを実施することにより、オフターゲット効果を制限する修飾を同定することが可能である。一つの非限定例においては、センス又はアンチセンス鎖（試験される修飾を含む）を多数の標識されたヌクレオチドの一つにより標識することができる。次に、結合アッセイを実施し、例えば修飾されたセンス鎖に関してＲＩＳＣの親和性を未修飾の形態のそれと比較することができる。あるいは、様々な修飾を含むｓｉＲＮＡを様々な方法論により細胞内へトランスフェクトすることができ、そして培養物を後でマイクロアエイ分析することにより評価して、上記修飾がオフターゲット遺伝子の数とパターンを変更させたか否かを決定することができる。

この態様によると、本発明は、オフターゲット効果を最小にする方法に向けられ、当該方法は、態様１に記載された修飾を含む修飾ｓｉＲＮＡを、標的核酸、又は標的核酸を発現するか又は標的核酸を発現できる細胞又は生物に曝露することを含む。

別の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にする方法に向けられ、当該方法は、第２の態様に記載された修飾を含む単分子ｓｉＲＮＡを、標的核酸、又は標的核酸を発現するか又は標的核酸を発現できる細胞又は生物に曝露することを含む。

様々な態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の１から６塩基の３’突出が存在し得る。当該突出は、他に特定しない限りあるいはコンテクストから明らかでない場合、本明細書に記載された態様の何れかの中に（ｗｉｔｈ）存在し得る。

第５の態様によれば、本発明は、オフターゲット効果を最小にするための方法に向けられ、当該方法は、標的核酸分子を発現しているか又は発現することができる標的核酸又は細胞に、２つ又はそれより多いｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉＲＮＡのプール）を曝露することを含み、当該ｓｉＲＮＡｓはアンチセンス鎖とセンス鎖を含み、但し：
ａ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｂ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス領域
ｃ．ループ領域であって、但し、ループ領域はセンス領域とアンチセンス領域の間に位置するループ領域
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

他の態様において、発明はキットを含み、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含むが、当該少なくとも２つのｓｉＲＮＡは第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡを含み、そして第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は：
ｉ．センス鎖であって、但し、当該センス鎖は：
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス鎖；及び
ｉｉ．アンチセンス鎖であって、但し、アンチセンス鎖は、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドは糖部分の５’炭素がリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス鎖
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖は二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており；第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

いくつかの態様において、当該キットはｓｉＲＮＡｓを含み、第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は、標的ｍＲＮＡ内の領域に対して少なくとも実質上相補な配列を含む。いくつかの態様において、当該キットは、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップするｓｉＲＮＡｓを含む。いくつかの態様において、当該キットは、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップしないようなｓｉＲＮＡｓを含む。

別の態様において、発明はキットを含み、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを含むが、当該少なくとも２つのｓｉＲＮＡは第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡを含み、そして第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は：
ａ．センス領域であって、センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
センス領域；及び
ｂ．アンチセンス領域であって、但し、アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む
アンチセンス領域
を含み、
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており；第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

当該キットはｓｉＲＮＡｓを含み、第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は、標的ｍＲＮＡ内の領域に対して少なくとも実質上相補な配列を含む。いくつかの態様において、当該キットは、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップするようなｓｉＲＮＡｓを含む。いくつかの態様において、当該キットは、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップしないようなｓｉＲＮＡｓを含む。

別の態様において、発明は、ＲＮＡｉのオフターゲット効果を最小にする方法を含み、当該方法は、標的核酸又は細胞に、少なくとも２つの単分子ｓｉＲＮＡを曝露することを含み、第１の単分子ｓｉＲＮＡと第２の単分子ｓｉＲＮＡの各々はアンチセンス領域とセンス領域を含み、但し：
ａ．センス領域が、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；そして
ｂ．アンチセンス領域が、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており、及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

いくつかの態様において、上記方法は、ｓｉＲＮＡｓを用いることを含み、第１の単分子ｓｉＲＮＡと第２の単分子ｓｉＲＮＡの各々は、標的ｍＲＮＡ中の領域に少なくとも実質上相補な配列を含む。いくつかの態様において、上記方法は、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップするようなｓｉＲＮＡｓを用いることを含む。いくつかの態様において、上記方法は、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップしないようなｓｉＲＮＡｓを用いることを含む。

別の態様において、発明はＲＮＡｉのオフターゲット効果を最小にする方法を含み、当該方法は、標的核酸又は細胞に、少なくとも２つのｓｉＲＮＡを曝露することを含み、当該少なくとも２つのｓｉＲＮＡは第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡを含み、但し、第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は：
ａ．センス鎖であって、当該センス鎖は、
ｉ．第１の５’センスヌクレオチドであって、但し、第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；及び
ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチドであって、第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；そして
ｂ．アンチセンス鎖であって、当該アンチセンス鎖は、
ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されており；及び
ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチドであって、但し、第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含み；
但し、センス鎖とアンチセンス鎖は、１８−２４の塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、二重鎖の範囲全域で少なくとも８０％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス領域のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接している。

いくつかの態様において、上記方法は、ｓｉＲＮＡｓを用いることを含み、第１のｓｉＲＮＡと第２のｓｉＲＮＡの各々は、標的ｍＲＮＡ中の領域に少なくとも実質上相補な配列を含むようなｓｉＲＮＡｓである。いくつかの態様において、上記方法は、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップするようなｓｉＲＮＡｓを用いることを含む。いくつかの態様において、上記方法は、第１のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域が、第２のｓｉＲＮＡの配列が少なくとも実質上相補な標的ｍＲＮＡの領域とオーバーラップしないようなｓｉＲＮＡｓを用いることを含む。

本発明のｄｓＲＮＡが機能性を保持して且つ改善された特異性を呈する能力は、塩基の配列、細胞の種類、又は導入される種に依存しないため、本発明は、限定ではないが、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス及び真菌を含む広い範囲の生物を通して適用可能である。本発明は、哺乳類、例えば、畜牛、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、齧歯類、例えばハムスター、マウス、及びラット、及び霊長類、例えば、ゴリラ、チンパンジー、及びヒトにおける使用のために特に有利である。

本発明は、多様な細胞種と共に特に有利に使用され、限定ではないが、初期細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）、生殖細胞系及び体細胞を含む。上記細胞は、例えば、幹細胞又は分化した細胞であってよい。例えば、細胞の種類は、胚細胞、卵母細胞、精子、含脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、膠、血液細胞、巨核細胞、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞であってよい。

本発明は、広い範囲の遺伝子に対して向けられたＲＮＡ干渉を用いる（及び／又は対照として使用する）ための用途に適用可能であって、限定ではないが、４５，０００のヒト遺伝子、例えば、糖尿病、アルツハイマー及び癌のような疾患に関係するもの、並びにヒト、マウス、ハムスター、チンパンジー、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ブタ、イヌ、ネコ、線虫（例えば、シノラブディスエレガンス）、ハエ（例えば、ドロソフィラメラノガスター）、及び他の脊椎動物及び無脊椎動物を含む。

本発明のｓｉＲＮＡｓは、今公知のあらゆる方法又は公知になったあらゆる方法及びこの開示からの方法により細胞に投与してよく、当業者は、本発明を用いて有用であると結論するはずである。例えば、ｓｉＲＮＡｓは受動的に細胞にデリバリーされてよい。修飾されたｓｉＲＮＡｓの受動的な取り込みは、例えば、センス鎖の５’末端のポリエチレングリコール部分又はコレステロール部分のようなコンジュゲート及び適切な状況下では薬学上受容可能な担体の存在下で変調され得る。

デリバリーのための他の方法は、限定ではないが、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、カチオン脂質／リポソーム、マイクロ注入、エレクトロポレーション、イムノポレーション、及びｓｉＲＮＡｓの特定のコンジュゲート又はリガンド、例えば、抗体、ペプチド、抗原、又は受容体へのカップリングを用いるトランスフェクション技術を含む。

好ましくは、ｓｉＲＮＡｓが投与されるときは二重鎖を含む。
さらに、遺伝子サイレンシングのレベルを評価する方法は限定されない。即ち、あらゆる所定のｓｉＲＮＡのサイレンシング能力は、幾多の数の当業界で試験された手法の一つにより研究することができ、限定ではないが、ノーザン分析、ウエスタン分析、ＲＴ ＰＣＲ，発現プロファイリング、及びその他を含む。

本発明のポリヌクレオチドは、今公知のあらゆる方法又は公知になったあらゆる方法及びこの開示からの方法により合成してよく、当業者は、本発明の分子を合成するために有用であると結論するはずである。特定された修飾を含むｓｉＲＮＡ二重鎖は、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．（２０００）“Ａｄｖａｎｃｅｄ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７，３−１８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．（２００１）“ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，２０６−２１７；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９９９）米国特許番号５，８８９，１３６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．（１９９９）米国特許番号６，００８，４００；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．（２０００）米国特許番号６，１１１，０８６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．（２００３）米国特許番号６，５９０，０９３に記載された事項及び方法の合成物を用いて化学合成してよい。上記合成方法は、ヌクレオシドエンキを保護された５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−オルソエステル−３’−Ｏ−ホスフォロアミダイトを利用することにより、所望の未修飾ｓｉＲＮＡ配列を固相支持体上で３’から５’方向に集合させる。簡単に言えば、必要なホスフォロアミダイトの合成が標準の塩基保護されたリボヌクレオシド（ウリジン、Ｎ^４−アセチルシチジン、Ｎ^２−イソブチリルグアノシン及びＮ^６−イソブチリルアデノシン）上で始まる。５’−Ｏ−シリル及び２’−Ｏ−オルソエステル保護基、並びに反応性３’−Ｏ−ホスフォロアミダイト部分の導入が、次に、５つの工程において達成され、
１．マルキエビッチ試薬（１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン［ＴＩＰＳ−Ｃｌ_２］）のピリミジン溶液｛Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｗ．Ｔ．（１９７９）”Ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｄｉｓｏｌｏｘａｎｅ−１，３−ｄｉｙｌ，ａ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ３’−ａｎｄ ５’−Ｈｙｄｒｏｘｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ），２４−２５｝によるヌクレオシドの糖の５’及び３’ヒドロキシル基の一過性の同時ブロッキング、続くクロマトグラフィー精製；
２．ＴＩＰＳ−ヌクレオシドの２’−ヒドロキシルのビス（アセトキシエチル）オルソエステル［ＡＣＥ誘導体］への、ジクロロメタン中のトリス（アセトキシエチル）−オルソフォルメート並びに触媒としてｐ−トルエンスルフォン酸を伴うレギオ特異的（ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）変換、続く、クロマトグラフィー精製；
３．アセトニトリル中のフッ化水素及びＮ，Ｎ，Ｎ”Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを用いたヌクレオシド糖の３’−ヒドロキシル基のＴＩＰＳ−保護基の特異的除去による遊離、続くクロマトグラフィー精製；
４．ジクロロメタン中のベンズヒドロキシビス（トリメチルシリルオキシ）シリルクロリド［ＢｚＨ−Ｃｌ］を用いた５’−Ｏ−シリルエーテルとしての５’−ヒドロキシルの保護；続くクロマトグラフィー精製；及び
５．ジクロロメタン／アセトニトリル中のビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン及び５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールを用いた３’−Ｏ−ホスフォロアミダイト誘導体の変換、続くクロマトグラフィー精製
を含む。

ホスフォロアミダイト誘導体は典型的には、厚く、無色からパールイエローのシロップである。自動化されたＲＮＡ合成装置との適合性に関しては、生成物各々を予め決定された容量の無水アセトニトリルに溶解し、そしてこの溶液を適当な数の血清バイアルに分配して、１．０−ｍモルの量のホスフォロアミダイトを各バイアル中にもたらす。バイアルを次に適当な真空デシケーターに入れ、そして溶剤を高真空下で一晩除去する。雰囲気を次に乾燥アルゴンに置換し、バイアルにゴム隔壁をかぶせ、そしてパッケージされたホスフォロアミダイトを−２０℃において必要なときまで保存する。各ホスフォロアミダイトは、合成装置への設置の前に所望の濃度を提供するように十分な無水アセトニトリルの中に溶解する。

所望のオリゴヌクレオチドの合成は、自動化された合成装置を用いて実施される。それは、分割可能な結合を通して固相ビーズ化されたポリスチレン支持体に対してその３’−ヒドロキシルにより共有結合された３’−末端ヌクレオシドから始まる。所望の合成スケールのための支持体の適切な量は、反応カートリッジ内で測定されて、次に合成装置に固定される。結合したヌクレオシドは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル部分により保護されており、無水酸（ジクロロメタン中の３％［ｖ／ｖ］ジクロロ酢酸）を用いて除去されることにより、鎖集合のための５’−ヒドロキシルを遊離させる。

集合されるべき配列中の次のヌクレオシドが、４段階のサイクルを用いて固相支持体上で成長する鎖に付加され、以下の一般的反応からなる：
１．カップリング：適当なホスフォロアミダイトを５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾルにより活性化し、そして支持体に結合したヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの遊離５’−ヒドロキシルへの反応を許容させる。これらの２つの試薬の濃度及びモル過剰、並びに反応時間の最適化は、一般にサイクルあたり９８％の過剰のカップリング収量をもたらす。
２．酸化：カップリング工程において形成されるヌクレオチド間結合がそのＰ（ＩＩＩ）［リン酸］酸化状態にリン原紙を残す。リンは、よって、トルエン中のｔｅｒｔ−ブチルヒドロパーオキシドの溶液を用いて、Ｐ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）に酸化される。
３．キャッピング：少量の残渣未反応５’−ヒドロキシル基が次のカップリングサイクルにおいて沈殿物からブロックされることにより欠失含有配列の形成を阻止しなければならない。これはアセトニトリル中の過剰の無水酢酸及び１−メチルイミダゾールにより支持体を処理することにより達成され、有効に残渣５’−ヒドロキシル基を酢酸エステルとしてブロックする。
４．脱シリル化：シリル保護された５’−ヒドロキシルは次のカップリング工程の前に脱保護されなければならない。これは、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中のトリエチルアミントリヒドロジェンフルオリドにより処理により達成され、他の保護基（２’−Ｏ−ＡＣＥ，Ｎ−アシルベース保護基、又はリン酸メチル）の付随する除去なしに５’−ヒドロキシルを迅速且つ特異的に遊離させる。

上記の４つの反応工程の間にアセトニトリルにより数回の洗浄が存在することに注意すべきであり、次の反応工程の前に過剰な試薬及び溶剤を除去するために採用される。上記のサイクルは、オリゴヌクレオチドの未修飾部分が集合するまで必要な回数繰り返される。上記の合成方法は、ほんの例示であって、分子が作成されるかもしれない手段を限定するように解釈されるべきではない。ｓｉＲＮＡを合成することに関して今知られているか又は知られるようになる如何なる方法も、そしてこの開示を読むことによる如何なる方法も、当業者は本発明と共に有用になると結論するはずである。

特定の態様のｓｉＲＮＡ二重鎖は各鎖の５’エンドにおいて２つの修飾されたヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチル誘導体）を含む。これらの修飾されたヌクレオシドの導入に必要な５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスフォロアミダイト誘導体は、以前に記載されたのと類似の手法を用いて（上記工程４及び５）、塩基保護された２’−Ｏ−メチルヌクレオシド（２’−Ｏ−メチル−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ^４−アセチルシチジン、２’−Ｏ−メチル−Ｎ^２−イソブチリルグアノシン及び２’−Ｏ−イソブチリルアデノシン）から開始して製造される。これらの修飾されたヌクレオシド内の２’−ヒドロキシルの不在は、これらの化合物のＡＣＥ保護の必要性を排除する。そうして、５’−Ｏ−シリル及び反応性３’−Ｏ−ホスフォロアミダイト部分の導入は２つの工程において達成され、
１．Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中のベンズヒドロキシビス（トリエチルシリルオキシ）シリルクロリド（ＢｚＨ−Ｃｌ）を用いた５’−ヒドロキシルの５’−Ｏ−シリルとしての保護、次のクロマトグラフによる精製；そして
２．ジクロロメタン／アセトニトリル中のビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン及び５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾルを用いた３’−Ｏ−ホスフォロアミダイトへの変換、次のクロマトグラフ精製
を含む。

ホスフォロアミダイトの精製後パッケージングを標準ヌクレオシドホスフォロアミダイトに関して以前に記載された手法を用いて実施する。同様に、それらのホスフォロアミダイト誘導体による２つの５’−Ｏ−シリル−２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの取り込みは、標準ヌクレオシドホスフォロアミダイトに関して以前に記載されたのと同じ４工程サイクルを２回適用することにより達成する。

この発明の特定の態様のｓｉＲＮＡ二重鎖は、アンチセンス鎖の５’エンドにおいてリン酸部分を含む。このリン酸はアンチセンス配列への最終的なカップリングとして化学的に導入される。必要とされるホスフォロアミダイト誘導体（ビス（シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフォロアミダイト）は、簡単に言えば以下のとおりに合成される：三塩化リンを無水テトラヒドロフラン中の当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンで、過剰のトリエチルアミン存在下で処理する。次に、２当量の３−ヒドロキシプロピオニトリルを加えて、完全に反応させるよう許容する。最後に、生成物をクロマトグラフィーにより精製する。ホスフォロアミダイトの精製後パッケージングは、標準ヌクレオシドホスフォロアミダイトに関して以前に記載された手法を用いて実施される。同様に、アンチセンス鎖の５’エンドにおけるホスフォロアミダイトの取り込みは、標準ヌクレオシドホスフォロアミダイトに関して以前に記載されたのと同じ４工程サイクルを２回適用することにより達成する。

修飾されて保護されたオリゴリボヌクレオチドは鎖集合の最後においても固相支持体に連結したままである。２工程の迅速な分割／脱保護手法を用いることにより、リン酸メチル保護基を除去し、固相支持体からオリゴリボヌクレオチドをブナ得し、そしてＮ−アシルベースの保護基を除去する。この手法はアンチセンス鎖上の５’リン酸からシアノエチル基も除去することに注目すべきである。さらに、当該手法は、ＡＣＥオルソエステルからアセチル官能基を除去し、２’−Ｏ−ＡＣＥ保護基をビス（２−ヒドロキシエチル）オルソエステルに変換する。この新たなオルソエステルはマイルドな酸に対して顕著に一層不安定であり、並びに、親のＡＣＥ基よりも親水性である。２工程の手法を以下に簡単に述べる：
１．支持体結合したオリゴリボヌクレオチドをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中のジソディウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートトリヒドレートの溶液で処理する。この試薬は、迅速且つ有効にメチル保護基をヌクレオチド間リン酸結合から、固相支持体からのオリゴリボヌクレオチドの分割なしに除去する。当該支持体を次に水で洗浄することにより、過剰のジチオレートを除去する。
２．オリゴリボヌクレオチドを固相支持体から４０％（ｗ／ｖ）水性メチルアミンを用いて室温において分割する。粗オリゴリボヌクレオチドを含むメチルアミン溶液を次に５５℃に加熱することにより、保護基をヌクレオシド塩基から除去する。粗オルソエステル保護されたオリゴリボヌクレオチドを以下の溶剤除去を真空にて得る（ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｉｎ ｖａｃｕｏ）。

２’−オルソエステルの除去は、合成プロセスの最終工程である。これは、粗オリゴリボヌクレオチドを、酢酸とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンの水溶液により、ｐＨ３．８にて５５℃において３５分間処理することにより、達成される。完全に脱保護されたオリゴリボヌクレオチドを、次に、エタノール沈殿により脱塩して、遠心分離により単離する。

加えて、蛍光標識のポリヌクレオチドの５’末端における取り込みは共通であり、そして当業者にはよく理解されている操作である。一般には、この取り込みを達成するために用いられる２つの方法があり、そして必要な材料はいくつかの市販源から利用可能である（例えば、グレンリサート社、スターリング、バージニア、ＵＳＡ；ンリキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン、ＵＳＡ；トリリンクバイオテクノロジーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ；及びその他）。第１の方法は、以前に記載されたヌクレオシドのホスフォロアミダイト誘導体に類似したホスフォロアミダイト部分により誘導された蛍光分子を利用する。そのような場合に、蛍光染料を鎖集合の最終サイクルにおいて支持体結合したポリヌクレオチドに付加する。フルオロフォア修飾されたポリヌクレオチドを、次に、固相支持体から分割し、そして上で記載された標準手法を用いて脱保護される。この方法は、「直接標識」と呼ばれる。別法として、第２の方法は、保護された反応性官能基（例えば、アミノ、スルフィドリル、カルボニル、カルボキシル、及びその他）を含むホスフォロアミダイト部分により誘導されたリンカー分子を利用する。このリンカー分子を鎖集合の最終サイクルにおいて支持体結合されたポリヌクレオチドに付加する。リンカー修飾されたポリヌクレオチドを、次に、固相支持体から分割し、そして上で記載された標準手法を用いて脱保護される。リンカー上の官能基を、標準脱保護手法の間においてか、又は続く官能基特異的処理により、脱保護する。粗リンカー修飾されたポリヌクレオチドを次に適当なフルオロフォア誘導体と反応させ、フルオロフォア上の部位とリンカーの官能基の間の共有結合の形成をもたらす。この方法は、「間接標識」と呼ばれる。

合成されたら、本発明のポリヌクレオチドはさらなる使用のために直後に使用するか又は保存してよい。好ましくは、発明のポリヌクレオチドを適当なバッファー中で二重鎖として保存する。多くのバッファーが公知であって、ｓｉＲＮＡｓを保存するために適している。例えば、バッファーは、１００ｍＭ ＫＣｌ，３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５，及び１ｍＭ ＭｇＣｌ_２からなってよい。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡｓは、４℃において１年間そのような場合に中で保存された場合にそれらの生物活性の３０％から１００％を保持する。より好ましくは、それらは、４℃において１年間そのような場合に中で保存された場合にそれらの生物活性の８０％から１００％を保持する。あるいは、上記組成物は、少なくとも１年又はそれより長く、そのようなバッファー中で−２０℃において保存することができる。好ましくは、−２０℃における１年間又はそれより長い保存は、生物活性の５０％よりも少ない低下をもたらす。より好ましくは、−２０℃における１年間又はそれより長い保存は、生物活性の２０％よりも少ない低下をもたらす。もっとも好ましくは、−２０℃における１年間又はそれより長い保存は、生物活性の１０％よりも少ない低下をもたらす。

使用の前にｓｉＲＮＡプールの安定性を保証するために、それらを使用準備まで−２０℃にドライダウン形態で保持してよい。使用の前に、それらを再懸濁すべきである；しかしながら、例えば上記のバッファー中に懸濁したら、それらは使用まで−２０℃に保存されるべきである。使用の前に、上記のバッファーを約４℃又は室温に保存してよい。トランスフェクションを実施するために有効な温度は当業者に知られており、例えば室温を含む。

成分相補鎖（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄｓ）から二重鎖ｓｉＲＮＡを形成するためには、センス鎖とアンチセンス鎖を等量混合する。オリゴヌクレオチドはこの点において２’−オルソエステルを保持するのであるから、それらは、５５℃においてマイルドな酸により処理されて、当該処理がこれらの保護基を除去する。脱保護溶液をゆっくりと室温に冷却させることにより、脱保護された鎖をアニールさせて二重鎖を形成させる。最後に、それをエタノール沈殿させることにより、二重鎖を脱塩し、そして精製された二重鎖をＲＮＡｓｅフリーの水に溶解し、そして紫外線分光により定量する。二重鎖化のプロセスの質は天然ゲル電気泳動により評価する。

この新たで（ｎｅｗ）新規な（ｎｏｖｅｌ）技術のための応用は広い。例えば、個人（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）が、例えば治療上重要な標的に対して向けられた一つ又はそれより多いｓｉＲＮＡを同定するかもしれないということは有り得る。上記の分子は目的の標的の優秀なサイレンシングを提供するかもしれないが、同時に、当該ｓｉＲＮＡのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖と部分的に相補性を有する追加の遺伝子（オフターゲット）を沈黙化するかもしれない。これらの二次遺伝子（オフターゲット）のサイレンシングは不所望の効果（例えば、細胞死、細胞増殖、分化）を誘導し得るため、目的のｓｉＲＮＡと関連したオフターゲット効果を排除するのに有利である。

さらに、本発明のｓｉＲＮＡは多様なセットの応用において使用してよく、限定ではないが、基礎研究、薬剤の発見及び開発、診断、及び治療を含む。研究における設定においては、上記応用は、リバーストランスフェクション又はフォワードトランスフェクションプロトコルの何れかを用いた、修飾された分子の細胞への導入を含み得る。例えば、本発明は、遺伝子産物が薬剤の発見又は開発のための標的であるか否かを確認するために使用してよい。この応用においては、目的の標的核酸配列に相当するｍＲＮＡを標的化された分解に関して同定する。特定の遺伝子を標的とするのに特異的な発明のｓｉＲＮＡｓを細胞又は生物に導入するが、好ましくは二重鎖の形態である。細胞又は生物は、標的化されたｍＲＮＡの分解を許容する条件下で維持されて、遺伝子の活性又は発現の低下をもたらす。当該遺伝子のあらゆる低下した発現又は活性の程度を次にそのような低下した発現又は活性の効果と共に測定して、そして発現又は活性が低下したら目的の核酸が薬剤発見又は開発のための作用因子（ａｇｅｎｔ）であると決定を下す。この様式においては、表現型上望まれる効果が目的の特定の標的核酸のＲＮＡ干渉に関連し得るし、適切なケースにおいては、毒性及び薬力学の研究に取り掛かり、そして治療用の製造物が開発され得る。

発明は、修飾された分子のトランスフェクションに関連した広い範囲の応用に関して実行され得る。一つの非限定例においては、発明の修飾を用いることにより、リバーストランスフェクションフォーマットにおけるｓｉＲＮＡのトランスフェクションによりもたらされるオフターゲット効果を排除する。例えば、修飾されたｓｉＲＮＡを固相表面（例えば、９６、３８４、又は１５３６ウエルプレートのウエルの底）の上で乾燥し、担体（例えば、脂質トランスフェクション試薬）の追加により可溶化し、次に、トランスフェクションのための特別の細胞種を添加する。

発明の別の応用においては、発明の修飾により修飾されたｓｉＲＮＡ又は未修飾のｓｉＲＮＡを別々に細胞にトランスフェクトし、そして平行してランすることにより、標的特異性サイレンシング及びオフターゲットサイレンシングにより生じた遺伝子ノックダウン誘導性表現型の結果の間を確認するか又は識別する。

発明の修飾されたｓｉＲＮＡを用いる別の応用においては、細胞に修飾されたｓｉＲＮＡのプール又はプールを構成する修飾された個々のｓｉＲＮＡをトランスフェクトする。この様式においては、使用者が、個々の標的に対してもっとも機能するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの組み合わせを同定することができる。

また別の態様においては、発明の修飾を有するｓｉＲＮＡを、特定のファミリーの遺伝子（例えば、キナーゼ）、特定の経路に関連する遺伝子（例えば、細胞周期制御）、又は全ゲノム（例えば、ヒト、ラット、マウス、シノラブディスエレガンス、ドロソフィラのゲノム）に向ける。発明の修飾を有するｓｉＲＮＡによるコレクションの各遺伝子のノックダウンは、研究者が、遺伝子のファミリーの各メンバー、又は経路の各メンバー、又はゲノム中の各遺伝子の特定の生物学的機能又は事象に対する寄与を、表現型がオフターゲット効果の結果であるような危険を伴わずに、素早く評価することを可能にさせるはずである。この種の応用の一つの例としては、例えばＨＩＶウイルスがヒト細胞に感染する能力に寄与する一つ又はそれより多い宿主（ヒト）の遺伝子を同定することに興味のある人々が全ヒトゲノムに対するｓｉＲＮＡをＲＴＦフォーマットにおいてプレートすることができる。リポプレックス形成の後に、ＨＩＶ感染を受けた疑いのある細胞（例えば、ＪＣ５３細胞）をトランスフェクションのために各ウエルに加える。細胞を２４−４８時間培養の後に、各ウエル中の細胞を致死量のタイターのＨＩＶウイルスに供することができた。感染に必要な適切なインキュベーション期間の後に、どのウエルが生きた細胞を含むかについてプレートを試験することができた。生きた細胞（実質上は対照よりも多い数の生きた細胞）を含むウエルが、ウイルス感染、複製、及び／又は放出に必要な宿主遺伝子を同定する。この様式において、観察された表現型がオフターゲット効果の結果であるような危険のある病原体感染において役割を担う宿主遺伝子を同定することが可能である。

また別の応用においては、発明の修飾を有するｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞を用いて、細胞からの薬剤の排除への特定の遺伝子の（標的の）寄与を評価する。一つの非限定例においては、ヒトゲノムの全ての公知のメンバーに対して向けられたｓｉＲＮＡ（ｓ）、特定のファミリーの遺伝子（例えば、キナーゼ）に対して向けられたｓｉＲＮＡ、特定の経路に遺伝子に対して向けられたｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＤＭＥ−ｔｏｘ経路）を含むＲＴＦプレート上にて細胞をリバーストランスフェクトする。次に、細胞を特定の化合物（例えば、有力な治療用化合物）で処理し、そして細胞が、例えばその化合物を保持するか、排泄するか、代謝するか、又は吸収する能力を測定し、そして、未処理の細胞と比較することができる。この様式においては、研究者が、化合物の薬力学において役割を担う一つ又はそれより多い宿主遺伝子を、観察された表現型がオフターゲット遺伝子のダウン制御の結果であるような限られた危険しか伴わずに同定することができる。

また別の応用においては、発明の修飾を有するｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞を用いて、生物学上関連のある一つ又はそれより多くの作用因子（例えば、薬剤）の標的を確認する。例えば、特定の薬剤が特定の蛋白質を標的とし且つ特定の表現型を誘導すると信じられるなら、その標的蛋白質を発明の修飾を含む遺伝子特異的ｓｉＲＮＡにより標的化することにより、当該薬剤の作用を確認することができる。当該ｓｉＲＮＡが薬剤と同じ表現型を誘導するなら、標的が確認される。修飾されたｓｉＲＮＡが同じ表現型を誘導しないなら、これらの実験は提案された蛋白質の薬剤標的としての有効性について異議を唱える。

また別の応用においては、発明の修飾を含み２つ又はそれより多い標的を標的とする２つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡｓを用いて、合成致死性ペアを同定して研究することができる。

また別の応用においては、発明の修飾を含むｓｉＲＮＡを用いて、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰｓ）を有する転写物を標的とすることにより、特定のＳＮＰの表現型、生物学的機能、疾患状態、又は事象に対する寄与を促進して（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ）評価することができる。

また別の応用においては、発明の修飾を含むｓｉＲＮＡを用いて、そのノックダウンが特定の疾患状態を誘導することが知られている遺伝子を標的とすることができる。この様式においては、その特定の疾患の研究を、追加の遺伝子の発現をノックダウンする危険なしに促進することができる。

上で記載された応用の全てにおいて、単一のウエルにおいて一つ又は複数の遺伝子をノックダウンするためのそのような様式にて上記応用を用いることができる。
本発明は、生物において疾患又は障害の一過性又は永久性の状態を誘導するＲＮＡ干渉の応用において、例えば、目的の疾患又は障害の原因又は因子であると信じられる目的の標的核酸の活性を停止させることにより、用いてもよい。場合によっては、目的の標的核酸の活性の増加は、疾患又は障害を悪化させるか、又は目的の疾患又は障害を改善するか又は治癒させる傾向があるかもしれない。目的の標的核酸は、ゲノム又は染色体の核酸又は染色体外の核酸、例えばウイルス核酸を含み得る。

さらにまた、本発明は、ＲＮＡ干渉の応用、例えば、診断、予防及び治療において使用してよく、動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトにおいて疾患の治療、又は標的の発現の終わりまでか又は発現下での医薬の製造における組成物の使用を含む。好ましくは、上記の疾患又は障害は、一つ又はそれより多い蛋白質の機能不全により起こるものであり、その疾患又は障害が一つ又はそれより多い蛋白質の遺伝子産物の発現に関連する。例えば、ヒトの胸部の特定の癌は「ｂｃｌ−２」遺伝子として一般に知られる遺伝子から発現される蛋白質の機能不全に関連することが広く認識されている。ｂｃｌ−２遺伝子に対して向けられた一つ又はそれより多いｓｉＲＮＡｓを用い、そして任意に薬学上受容可能な担体、希釈剤及び／又はアジュバントと組み合わせて、本発明の組成物と教示に従い医薬を製造することができ、当該医薬は胸部の癌の治療のために使用することができる。出願人は、細胞モデルにおいて上記方法及び組成物の利用性を確立した。ヒトを含む動物内で細胞へｓｉＲＮＡｓのようなポリヌクレオチドをデリバリーする方法は、当業界でよく知られている。今知られているあらゆるデリバリー媒体、又は知られることになり、そしてポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡｓをヒトを含む動物に導入する有用性を有するデリバリー媒体が、本発明により作成された組成物内に存在するかもしれないあらゆる修飾と不適合でない限り、当該デリバリー媒体を本発明による医薬の製造において有用であると予測される。本発明により作成された組成物内に存在するかもしれないあらゆる修飾と適合しないデリバリー媒体は、細胞培養における有効性に対して測定されたところにより９５％を超えて上記組成物の有効性を低下させるものである。

多数の障害に関して動物モデルが存在し、例えば、癌、血管系の疾患、先天性のエラー又は代謝等を含む。核酸を動物に対して用量養生法にて投与することにより、動物、例えば哺乳類、例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類における特定の疾患又は障害のための最適な用量養生法に到達することは、当業者の範囲内である。当業者により日常の実験により哺乳類において有効性が確証されたなら、ヒト臨床の開始のための用量養生法をそのような研究において到達したデータに基づいて到達し得る。

本発明により製造された医薬の用量は、被験者のキログラムあたりマイクログラムからキログラムあたり数百ミリグラムまで変更してよい。当業界において知られるとおり、用量は投薬を受ける哺乳類の体重、投薬を受ける哺乳類の体力（ｎａｔｕｒｅ）、疾患又は障害の重度、及び被験者の血清中の上記医薬の安定性に依存して、当業者によく知られた他の因子の間で変化させることになる。

これらの応用のためには、目的の特定の標的核酸の操作による変調に影響を受けやすい疾患又は障害を有する疑いのある生物にｓｉＲＮＡを投与することにより処置する。ｓｉＲＮＡ処置の結果は、特定の疾患又は障害の改善、軽減、予防及び／又は診断であってよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡを薬学上受容可能な様式にて薬学上受容可能な担体又は希釈剤と共に投与する。

本発明の治療上の応用は、様々な治療用組成物と投与方法により実施できる。薬学上受容可能な担体及び希釈剤は、当業者に知られている。細胞及び生物への投与の方法も、当業者に知られている。用量養生法は、例えば、処置される疾患又は障害の感受性の重度及び程度に依存することが知られており、数日から数カ月の間の処置期間にわたるか、又は障害又は疾患の状態に対して所望の効果が達成されるまでである。いくつかの疾患又は障害に関して所望の効果を持続するためには、ｓｉＲＮＡの長期にわたる投与が必要かもしれない。適切な用量養生法は、例えば、薬学上受容可能な経路により薬学上受容可能な担体又は希釈剤中で量を変化させて一つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡｓを投与することにより決定することができ、そしてレシピエント生物の体内に蓄積する薬剤の量は、投与後の様々な時間において決定することができる。同様に、所望の効果（例えば、遺伝子産物又は遺伝子活性の発現の抑圧の程度）をｓｉＲＮＡの投与後の様々な時間において決定することができ、そしてこのデータは他の薬力学データ、例えば、体内又は器官の蓄積に相関し得る。当業者は、最適な用量、用量養生法等を決定することができる。当業者は、ヒトの研究のガイドとしてインビボ及びインビトロ動物モデルからのＥＣ_５０データを用いてよい。

またさらに、本発明は、ＲＮＡ干渉の応用、例えば、診断、予防、及び治療において使用してよい。これらの応用のためには、目的の特定の標的核酸の操作による変調に影響を受けやすい疾患又は障害を有する疑いのある生物にｓｉＲＮＡを投与することにより処置する。ｓｉＲＮＡ処置の結果は、特定の疾患又は障害の改善、軽減、予防及び診断であってよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡを薬学上受容可能な様式にて薬学上受容可能な担体又は希釈剤と共に投与する。

さらに、ｓｉＲＮＡｓを、局所的にクリーム又は軟膏中にて、経口調製物、例えばカプセル又はタブレット又はサスペンジョン又は溶液等にて投与することができる。投与の経路は、有利な位置、例えば目的の標的核酸を有する器官又は組織又は細胞種の近く（ｎｅａｒ）においてｓｉＲＮＡを放出する装置の、静脈内、筋肉内、皮膚内、皮膚下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、皮膚内（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下、鼻内、経口、直腸内、目薬によるか、組織移植によってよい。

ある程度の特殊性を伴って発明を記載してきたが、実施例を今提供する。これらの実施例は、如何なる様式においても請求の範囲を限定することを意図しないし解釈されるべきでない。発明は以下の実施例を参照することによりより容易に理解されるかもしれないが、それらは例示の目的で提供され、特記しない限りは本発明を限定することを意図しない。

実施例
実施例１
ｓｉＲＮＡｓを合成
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを２’−ＡＣＥ化学を用いて合成した（図３を参照）。当該合成は、好ましくは、適当な機械上で自動化されたプロセスとして実施される。いくつかのそのような合成機械は当業者に知られている。各ヌクレオチドを連続して（３’−から５’−の方向へ）固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドに対して加える。ポリエステル支持体が好ましいが、あらゆる適当な支持体を使用することができる。鎖の３’エンドの第１のヌクレオシドは、固相支持体に共有結合している。ヌクレオチド前駆体、活性化されたリボヌクレオチド、例えばＳ−エチル−テトラゾール（あらゆる他の適当な活性化因子を加えることができるが）を加え（図３の工程ｉ）、第２塩基を第１のヌクレオシドの５’エンドにカップリングさせる。支持体を洗浄し、そしてあらゆる未反応の５’−ヒドロキシル基にアセチル化試薬、例えば限定ではないが無水酢酸又はフェノキシ無水酢酸でキャップすることにより、未反応５’−アセチル部分を生じさせる（工程ｉｉ）。適当な酸化剤、例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド又はヨージド及び水を用いて、Ｐ（ＩＩＩ）結合を次に酸化することにより、より安定にして、最終的には所望のＰ（Ｖ）結合にする（工程ｉｉｉ）。ヌクレオチドの添加最黒の最後において、５’−シリル基をフッ素イオンにより（工程ｉｖ）、例えば、トリエチルアンモニウムフルオライド又はｔ−ブチルアンモニウムフルオライドを用いて分割する。上記サイクルは各々の次のヌクレオチドに関して繰り返される。図３はエチル保護基を有するホスフォロアミダイトを例示するが、あらゆる他の適切な基を用いることによりホスフォロアミダイト部分の酸素を保護するか又は置換してよいことは、強調されるべきである。例えば、アルキル基、シアノエチル基、又はチオ誘導体をこの位置において使用することができる。さらに、工程（ｉ）において入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）活性化ヌクレオシドは、異なる種類の活性化されたヌクレオシド、例えば、Ｈ−ホスフォネート、メチルホスフォロアミダイト又はチオホスフォロアミダイトであり得る。支持体に結合した最初の、又は３’の、ヌクレオシドは、シリル基よりも、異なる５’保護基、例えば、ジメトキシトリチル基を有することができる。ジメトキシトリチル基の分割は、標準ＤＮＡ合成化学において採用されるような酸加水分解を必要とする。即ち、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）のような酸を、この工程のみのために用いる。ＤＣＡ分割工程とは別に、所望のポリヌクレオチドを合成するために必要な回数ほど、上記サイクルを繰り返す。

合成の後、図３においてメチル基として描写されたがメチル基には限定されない、リン酸上の保護基を３０分以内でＤＭＦ（ジメチルフォルムアミド）中の１Ｍジソディウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物（ジチオレート）を利用して分割する。脱保護溶液を水を用いて固相支持体結合オリゴヌクレオチドから洗浄した。支持体を次に４０％メチルアミンで２０分間５５℃において処理する。これは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを溶液中に放出し、環外アミンを脱保護し、そして２’−ＡＣＥ基の上のアセチル保護を除去する。上記オリゴヌクレオチドはこの段階においてアニオン交換ＨＰＬＣにより分析することができる。

２’−オルソエステル基は、除去が望まれるなら、除去されるべき最後の保護基である。２’−脱保護の直前の２’−ＡＣＥ保護されたＲＮＡの構造は、図４に示されたとおりである。

自動化手法のために、最初のヌクレオシドを有する固相支持体を合成装置に設置する。当該装置は、合成に必要な全ての補助的な試薬及びモノマーを含むことになる。試薬はアルゴン下で保存されるが、なぜなら不活性ガス下で保存されないと加水分解し得るからである。当該装置は、試薬により全てのラインを満たすように満たされる（ｐｒｉｍｅｄ）。合成サイクルに従った正確な順序で試薬のデリバリーを規定する合成サイクルが設計され、特定された順序にて試薬をデリバリーする。サイクルが規定され、添加される各試薬の量を規定し、工程の間の時間を規定し、そして洗浄工程を規定したら、最初のヌクレオシドを有する固相支持体を加えるやいなや、合成が進行する準備ができる。

本明細書に記載されたＲＮＡ類似体に関して、修飾は３つの異なる一般的方法により達成される。糖質及び塩基の修飾のため並びに特定のリンカー及びコンジュゲートの導入のために実行される第１が、修飾が予め存在する修飾されたホスフォロアミダイトを採用する。そのような修飾の例は、糖質２’−修飾された種（２’−Ｆ，２’−ＮＨ_２，２’−Ｏ−アルキル等）であり、但し、２’オルソエステルが所望の修飾により置き換わっており、３’又は５’末端修飾、例えばフルオレセイン誘導体、ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、コレステロール、シアニン誘導体又はポリプロピレングリコールを導入することもできる。特定のヌクレオチド間結合の修飾も、入ってくる反応性ヌクレオシド中間体により導入される。結果のヌクレオチド間結合修飾の例は、限定ではないが、メチルホスフォネート、ホスフォロアミダイト、ホスフォロチオエート又はホスフォロジチオエートを含む。

多くの修飾剤を同じサイクル又は類似のサイクルにて用いることができる。このクラスにおける例は、例えば、２−アミノプリン、５−メチルシチジン、５−アミノアリルウリジン、ジアミノプリン、２−Ｏ−アルキル、複数原子スペーサー、単一モノマースペーサー、２’−アミノヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、５−ヨードウリジン、４−チオウリジン、アクリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、５−ヨードシチジン、５−ビオチン−チミジン、５−フルオレセイン−チミジン、イノシン、シュードウリジン、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）モノマー、ネブラレン、デアザヌクレオシド、ピレンヌクレオシド、アザヌクレオシド等を含む。合成における残りの工程は、標準の脱保護条件には不安定な置換基を導入する修飾の例外はあるが、しばしば同じままである。ここでは、置換基に影響しない、修飾された条件を用いる。第２に、特定のヌクレオチド間結合修飾は、それらの導入のために許容されるように酸化工程の変更を必要とする。このクラスの例は、ホスフォロチオエート及びホスフォロジチオエートを含むが、不可欠な要素である（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ）硫黄又は別の適切な硫黄輸送因子による酸化が必要である。第３に、「合成後の」プロセスにより特定のコンジュゲート及び修飾を導入するが、固相合成が完了した後に所望の分子をバイオポリマーに添加する。これの例は、炭化水素に結合した第１級アミンを含む予め合成されたオリゴヌクレオチドへのポリエチレングリコールの添加であろう。この場合の結合は、溶液相反応においてポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステルを用いて達成することができる。

これは合成ＲＮＡとその類似体の合成のためのもっとも好ましい態様を概説したが、これらの分子を集合させることができる如何なる核酸合成方法もそれらの集合において用いることができる。別の方法の例は、５’−ＤＭＴ−２’−ＴＢＤＭＳ及び５’−ＤＭＴ−２’−ＴＯＭ合成アプローチを含む。いくつかの２’−Ｏ−メチル、２’−Ｆ及びバックボーン修飾を、転写反応において、修飾されたもの及び野生型のＴ７及びＳＰ６のポリメラーゼを例えば用いて導入できる。

合成修飾ＲＮＡ
以下のガイドラインは、修飾されたＲＮＡｓの合成のために提供され、そして当業界公知の自動化合成器の何れかにおける使用に適合させることができる。

３’末端修飾
３’修飾を取り込むためのいくつかの方法がある。３’修飾は当業界公知の方法を用いて特別の（ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ）固相上で固定化（ａｎｃｈｏｒｅｄ）されるか又は「負荷され（ｌｏａｄｅｄ）」得る。別法として、３’修飾はホスフォロアミダイトとして利用可能であるかもしれない。ホスフォロアミダイトをユニバーサル支持体へ標準合成方法を用いてカップリングさせるが、ユニバーサル支持体は所望の末端修飾の活性化されたホスフォロアミダイトの導入により３’末端修飾が創製されるヒドロキシルを提供する。別の方法によれば、３’修飾は、ポリヌクレオチドが固相支持体から除去された後に合成後に導入できる。遊離のポリヌクレオチドは、最初は、特別の修飾の適切な活性化形態と反応する３’末端ヒドロキシル、アミノ、チオール、又はハロゲンを有する。例は、限定ではないが、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル、チオエステル、ジスルフィド、マレイミド、又はハロアルキル反応を含む。この修飾が、今、ポリヌクレオチドの３’末端になる。合成後にコンジュゲート形成できる修飾の例は、限定ではないが、フルオレセイン、アクリジン、ＴＡＭＲＡ，ダブシル、コレステロール、ポリエチレングリコール、複数原子スペーサー、シアニン、脂質、糖質、脂肪酸、ステロイド、ペプチド、又はポリペプチドであり得る。

５’末端修飾
５’修飾をポリヌクレオチドに導入するための多数の手段がある。例えば、５’手段を有するヌクレオシドを購入して、次にホスフォロアミダイトに活性化することができ、又は５’修飾を有するホスフォロアミダイトを購入して利用してよい。次に、５’修飾を有する活性化ヌクレオシドを、他の如何なる活性化ヌクレオシドを用いてよいように、サイクルにて使用される。しかしながら、全ての５’修飾がホスフォロアミダイトとして利用可能ではない。そのような事象においては、５’修飾を上で３’修飾に関して記載されたものと類似の様式にて導入することができる。

チオエート
一つ又はそれより多いチオエート部分、例えばホスフォロチオエート結合を有するポリヌクレオチドを、上で記載されて図３に例示された合成サイクルに従い作成した。しかしながら、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド酸化工程に代えて、不可欠な要素である硫黄又は他の硫黄化剤を用いた。

５’−チオ修飾
５’チオールを有するモノマーを商業的供給者、例えば、グレンリサーチからホスフォロアミダイトとして購入することができる。これらの５’チオール修飾されたモノマーは、一般に、トリチル保護基を有する。合成後に、トリチル基を当業界公知のあらゆる方法により除去することができる。

他の修飾
特定の修飾のために、合成サイクルの工程がいくらか変更される。例えば、３’エンドが倒置ｄＴ（第１塩基が５’−ヒドロキシルを通して固相支持体に結合して、第１のカップリングが３’−３’結合である場合）脱トリチルを有して、カップリングがもっとゆっくりと起こる場合、そのような脱トリチル化剤、例えばジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用するべきであり、そしてカップリング時間は３００秒に増加させるべきである。いくつかの５’修飾は長期の（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）カップリング時間を必要とするかもしれない。例は、コレステロール、フルオロフォア、例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５ビオチン、ダブシル、アミノリンカー、チオリンカー、スペーサー、ポリエチレングリコール、リン酸化試薬、ＢＯＤＩＰＹ，又は光分割可能なリンカーを含む。

ポリヌクレオチドが単一の修飾を有するなら、その修飾はその上に部分的に構築されたポリヌクレオチドを有する支持体を取り出し、当該修飾を有するモノマーをカップリングし、そして自動化合成器内で支持体を置き換えて自動化合成を再開することにより、もっとも有効にマニュアルで実施することができることに注目するべきである。

実施例２
合成されたオリゴの支持体からの脱保護と分離
分割はマニュアルによるか又は機械において自動化されたプロセスにて実施することができる。保護部分のヌクレオチド間結合、例えばメチル基からの分割は、当業界公知のあらゆる適切な分割剤、例えば、ジチオレート又はチオフェノールを用いることにより達成され得る。ＤＭＦ中の１モラーのジチオレートを固相支持体へ室温において１０から２０分間添加する。支持体を、次に、徹底的に、例えば、ＤＭＦ、次に水、次にアセトニトリルで洗浄する。あるいは、水の洗浄に続き入念なアセトニトリル洗浄は残りのあらゆるジチオレートを除去するのに十分である。

ポリヌクレオチドの支持体からの分割及び環外塩基保護の除去は、４０％水性Ｎ−メチルアミン（ＮＭＡ）を用いて、次に、２０分間５５℃に加熱することにより実施できる。ポリヌクレオチドが溶液中にあるなら、ＮＭＡを注意深く固相支持体から除去する。ポリヌクレオチドを含む溶液を次に真空下でＮＭＡを除去するためにドライダウンする。さらなる加工は、二重鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、脱塩、ゲル精製、質のコントロール等を含み、当業界公知のあらゆる方法により実施することができる。

いくつかの修飾に関しては、ＮＭＡ工程を変更してよい。例えば、３’アミノ修飾に関しては、ＮＭＡによる処理を４０分間５５℃にするべきである。プロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、５’末端アミノリンカー処理、及び２’アミノヌクレオシド修飾を、４０％ＮＭＡの添加後１時間加熱する。Ｃｙ５により修飾されたオリゴヌクレオチドを水酸化アンモニウムで２４時間光から防御しながら処理する。

分割試薬の調製
ＨＰＬＣグレードの水と合成グレードのアセトニトリルを用いる。ジチオレートを結晶として予め調製する。４．５グラムのジチオレート結晶を９０ｍＬのＤＭＦに加える。使用準備された４０パーセントのＮＭＡを、供給者、例えばシグマアルドリッチコーポレーションから購入することができる。

一本鎖ポリヌクレオチドをアニールする
一本鎖ポリヌクレオチドを当業界公知の方法により何か適当なバッファーを用いてアニールする。例えば、等量の各鎖を適切なバッファー、例えば５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウムの中で混合することができる。当該混合物を１分間９０℃において加熱し、そして室温まで冷却させる。別の例においては、各々が５０マイクロモラー濃度になるように、各ポリヌクレオチドを別々に調製する。３０マイクロリットルの各ポリヌクレオチド溶液を次に、１５マイクロリットルの５Ｘアニーリングバッファーを含むチューブに加えるが、アニーリングバッファーの最終濃度は、１００ｍＭ塩化カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４及び２ｍＭ塩化マグネシウムである。最終容量は７５マイクロリットルである。当該溶液を次に１分間９０℃において加熱し、遠心分離にて１５秒間回し、そして３７℃において１時間インキュベートさせ、次に室温までにする。この溶液を次にマイナス２０℃に凍らせて保存し、そして凍結解凍を５回行うことができる。二重鎖の最終濃度は２０マイクロモラーである。ポリヌクレオチドの保存に適したバッファーの例は、２０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，０．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２である。使用される全てのバッファーはＲＮａｓｅフリーであるべきである。

オルソエステル部分の除去
所望なら、オルソエステル部分を当業界公知のあらゆる適当な方法によりポリヌクレオチドから除去してよい。一つのそのような方法は、揮発性の酢酸−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）ｐＨ３．８バッファー系を用い、オルソエステル部分の続く凍結乾燥除去により除去することができる。３．０より高いｐＨにおける脱保護はホスフォジエステル結合の酸触媒分割の可能性を最小にさせる。例えば、オルソエステル保護されたポリヌクレオチドを懸濁してそれを３０分間６０℃においてインキュベートすることにより、ｐＨ３．８に調節された１００ｍＭ酢酸をＴＥＭＥＤと友に用いて脱保護が達成できる。当該溶液を次に凍結乾燥するか又はＳｐｅｅｄＶａｃに供することにより使用前に乾燥する。必要なら、当業界公知のあらゆる方法、例えば、エタノール沈殿又は逆相カートリッジ上での脱塩により、脱保護の後の脱塩を実施することができる。

実施例３
ＲＮＡ干渉における使用のために合成されたｓｉＲＮＡｓ
オリゴｄｉ−ｄＴを有する１９マーのｓｉＲＮＡｓをダーマコン社の所有のＡＣＥ化学を用いて合成し、そして本明細書に記載された発明に従いデザインして使用した。「ＳＥＡＰ」はヒトの分泌されたアルカリホスファターゼを意味し；「ヒトシクロ」はヒトのシクロフィリンＢを意味し；ヌクレオチド間の星印はホスフォロチオエート結合である修飾されたヌクレオチド間結合を意味し；構造２’−Ｆ−Ｃ又は２’−Ｆ−Ｕはリボシル部分の２’炭素に結合したフッ素原子を有するヌクレオチドユニットを意味し；構造２’−Ｎ−Ｃ又は２’−Ｎ−Ｕはリボシル部分の２’炭素に結合したＮＨ_２基を有するヌクレオチドユニットを意味し；構造２’−ＯＭＥ−Ｃ又は２’−ＯＭＥ−ＵはそれぞれＣｓ又はＵｓの何れかのリボシル部分の２’炭素に結合した２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドユニットを意味し；ｄＧ，ｄＵ，ｄＡ，ｄＣ，及びｄＴは２’位に関してデオキシであるヌクレオチドユニットを意味し、そして代わりにリボシル部分の２’炭素に結合した水素を有する。他に示さなければ、以下に掲載した全てのヌクレオチドユニットは、２’炭素に−ＯＨを有するリボシルである。

一般式ＩのｓｉＲＮＡ二重鎖の合成
一般式Ｉ：

式中、Ｘ_ｑ及びＹ_ｑはｒＡ，ｒＣ，ｒＧ，又はｒＵを含むリボヌクレオシドであり；
ｍＸ_ｑは２’−Ｏ−メチル−ｒＡ，２’−Ｏ−メチル−ｒＣ，２’−Ｏ−メチル−ｒＧ，及び２’−Ｏ−メチル−ｒＵを含む２’−Ｏ−メチルヌクレオシドであり；
ＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖であり；
そしてＡＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖である。

米国特許６，００８，４００；米国特許６，１１１，０８６；米国特許６，５９０，０９３；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３１７：３−１８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（３）：２０６−２１７に記載された手法を用いて、二重鎖の各鎖（Ｓ及びＡＳ）を別々に化学的に合成する。

簡単に言えば、上記手法は、もっとも３’のヌクレオシド（Ｘ_２１又はＹ_２１）が共有結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）固相ポリスチレン支持体を利用する。ヌクレオシドを次に連続して配列特異的様式にて（３’から５’）、支持体結合種へ繰り返しサイクルを用いて添加する。即ち、第１サイクルは、Ｘ_２０をＸ_２１に加えるか又はＹ_２０をＹ_２１に加え；第２サイクルはＸ_１９をＸ_２０Ｘ_２１に加えるか又はＹ_１９をＹ_２０Ｙ_２１に加え；などなどである。各サイクルは４つの工程からなる：支持体結合種の５’ヒドロキシル基の脱保護；入ってくるヌクレオシドの反応誘導体の支持体結合種の５’−ヒドロキシル基へのカップリング；未反応の５’−ヒドロキシル基のキャッピング；及びヌクレオチド間結合の酸化。Ｘ_ｑ（ｑ＝３から２０）Ｙ_ｑ（ｑ＝１から２０）＝リボヌクレオシドに関しては、反応誘導体が５’シリル−２’−オルソエステル−３’−ホスフォロアミダイト、特に、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチル）オルソフォルミル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイトである（図１５）。

一般式Ｉの二重鎖はセンス鎖の１及び２位（ｍＸ_ｑ，ｑ＝１及び２）に２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有する。これらの修飾されたヌクレオシドは、配列に適切な５’−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−ホスフォロアミダイト、特に５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイト（図１６）を用いてＳに取り込まれ、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

一般式Ｉの二重鎖はアンチセンス鎖の５’末端上にリン酸部分を有する。このリン酸基化学的にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ビス（２−シアノエチル）ホスフォロアミダイト（図１７）を用いてＳに導入され、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

鎖の集合に続き、完全に保護されたオリゴヌクレオチドをジソディウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物で処理することにより、ヌクレオチド間リン酸結合からメチル基を除去する。オリゴヌクレオチドを次に支持体から分割して、５’−リン酸上の塩基保護基及び２−シアノエチル基を水性Ｎ−メチルアミンにより最初は室温において次に５５℃において処理し、次に真空下で乾燥することにより除去する。この点において、粗オリゴヌクレオチドがイオン交換ＨＰＬＣ及び／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定法により質的に分析され、そして必要ならばゲル精製する。オリゴヌクレオチドを次にＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器を用いて定量する。

成分相補鎖から二重鎖ｓｉＲＮＡを形成させるために、等量のセンス鎖とアンチセンス鎖を混合する。オリゴヌクレオチドはこの点において２’−オルソエステル保護を保持するから、それらを温和な酸により５５℃において処理するが、当該処理はこれらの保護基を除去する。脱保護溶液をゆっくりと室温に冷却させることにより、脱保護された鎖をアニールすることにより二重鎖を形成させる。最後に、二重鎖をエタノールで沈殿させることにより脱塩し、そして精製された二重鎖をＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器により定量する。二重鎖化プロセスの質は天然ゲル電気泳動により評価する。

一般式ＩＩのｓｉＲＮＡ二重鎖の合成
一般式ＩＩ：

式中、Ｘ_ｑ及びＹ_ｑはｒＡ，ｒＣ，ｒＧ，又はｒＵを含むリボヌクレオシドであり；
ｍＸ_ｑ及びｍＹ_ｑは２’−Ｏ−メチル−ｒＡ，２’−Ｏ−メチル−ｒＣ，２’−Ｏ−メチル−ｒＧ，及び２’−Ｏ−メチル−ｒＵを含む２’−Ｏ−メチルヌクレオシドであり；
ＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖であり；
そしてＡＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖である。

米国特許６，００８，４００；米国特許６，１１１，０８６；米国特許６，５９０，０９３；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３１７：３−１８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（３）：２０６−２１７に記載された手法を用いて、二重鎖の各鎖（Ｓ及びＡＳ）を別々に化学的に合成する。

簡単に言えば、上記手法は、もっとも３’のヌクレオシド（Ｘ_２１又はＹ_２１）が共有結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）固相ポリスチレン支持体を利用する。ヌクレオシドを次に連続して配列特異的様式にて（３’から５’）、支持体結合種へ繰り返しサイクルを用いて添加する。即ち、第１サイクルは、Ｘ_２０をＸ_２１に加えるか又はＹ_２０をＹ_２１に加え；第２サイクルはＸ_１９をＸ_２０Ｘ_２１に加えるか又はＹ_１９をＹ_２０Ｙ_２１に加え；などなどである。各サイクルは４つの工程からなる：支持体結合種の５’ヒドロキシル基の脱保護；入ってくるヌクレオシドの反応誘導体の支持体結合種の５’−ヒドロキシル基へのカップリング；未反応の５’−ヒドロキシル基のキャッピング；及びヌクレオチド間結合の酸化。Ｘ_ｑ（ｑ＝３から２０）Ｙ_ｑ（ｑ＝３から２０）＝リボヌクレオシドに関しては、反応誘導体が５’シリル−２’−オルソエステル−３’−ホスフォロアミダイト、特に、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチル）オルソフォルミル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイトである（図１５）。

一般式ＩＩの二重鎖は、センス鎖の１及び２位（ｍＸ_ｑ，ｑ＝１及び２）において及びアンチセンス鎖の１及び２位（ｍＹ_ｑ，ｑ＝１及び２）において２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有する。これらの修飾されたヌクレオシドは、配列に適切な５’−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−ホスフォロアミダイト、特に５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイト（図１６）を用いてＳ及びＡＳに取り込まれ、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

一般式ＩＩの二重鎖はアンチセンス鎖の５’末端上にリン酸部分を有する。このリン酸基化学的にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ビス（２−シアノエチル）ホスフォロアミダイト（図１７）を用いてＳに導入され、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

鎖の集合に続き、完全に保護されたオリゴヌクレオチドをジソディウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物で処理することにより、ヌクレオチド間リン酸結合からメチル基を除去する。オリゴヌクレオチドを次に支持体から分割して、５’−リン酸上の塩基保護基及び２−シアノエチル基を水性Ｎ−メチルアミンにより最初は室温において次に５５℃において処理し、次に真空下で乾燥することにより除去する。この点において、粗オリゴヌクレオチドがイオン交換ＨＰＬＣ及び／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定法により質的に分析され、そして必要ならばゲル精製する。オリゴヌクレオチドを次にＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器を用いて定量する。

成分相補鎖から二重鎖ｓｉＲＮＡを形成させるために、等量のセンス鎖とアンチセンス鎖を混合する。オリゴヌクレオチドはこの点において２’−オルソエステル保護を保持するから、それらを温和な酸により５５℃において処理するが、当該処理はこれらの保護基を除去する。脱保護溶液をゆっくりと室温に冷却させることにより、脱保護された鎖をアニールすることにより二重鎖を形成させる。最後に、二重鎖をエタノールで沈殿させることにより脱塩し、そして精製された二重鎖をＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器により定量する。二重鎖化プロセスの質は天然ゲル電気泳動により評価する。

一般式ＩＩＩのｓｉＲＮＡ二重鎖の合成
一般式ＩＩＩ：

式中、Ｘ_ｑ及びＹ_ｑはｒＡ，ｒＣ，ｒＧ，又はｒＵを含むリボヌクレオシドであり；
ｍＸ_ｑ及びｍＹ_ｑは２’−Ｏ−メチル−ｒＡ，２’−Ｏ−メチル−ｒＣ，２’−Ｏ−メチル−ｒＧ，及び２’−Ｏ−メチル−ｒＵを含む２’−Ｏ−メチルヌクレオシドであり；
ＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖であり；
そしてＡＳはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖である。

米国特許６，００８，４００；米国特許６，１１１，０８６；米国特許６，５９０，０９３；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３１７：３−１８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（３）：２０６−２１７に記載された手法を用いて、二重鎖の各鎖（Ｓ及びＡＳ）を別々に化学的に合成する。

簡単に言えば、上記手法は、もっとも３’のヌクレオシド（Ｘ_２１又はＹ_２１）が共有結合された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）固相ポリスチレン支持体を利用する。ヌクレオシドを次に連続して配列特異的様式にて（３’から５’）、支持体結合種へ繰り返しサイクルを用いて添加する。即ち、第１サイクルは、Ｘ_２０をＸ_２１に加えるか又はＹ_２０をＹ_２１に加え；第２サイクルはＸ_１９をＸ_２０Ｘ_２１に加えるか又はＹ_１９をＹ_２０Ｙ_２１に加え；などなどである。各サイクルは４つの工程からなる：支持体結合種の５’ヒドロキシル基の脱保護；入ってくるヌクレオシドの反応誘導体の支持体結合種の５’−ヒドロキシル基へのカップリング；未反応の５’−ヒドロキシル基のキャッピング；及びヌクレオチド間結合の酸化。Ｘ_ｑ（ｑ＝３から２０）Ｙ_ｑ（ｑ＝１又は３から２０）＝リボヌクレオシドに関しては、反応誘導体が５’シリル−２’−オルソエステル−３’−ホスフォロアミダイト、特に、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチル）オルソフォルミル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイトである（図１５）。

一般式ＩＩＩの二重鎖は、センス鎖の１及び２位（ｍＸ_ｑ，ｑ＝１及び２）において及びアンチセンス鎖の１及び２位（ｍＹ_ｑ，ｑ＝２）において２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有する。これらの修飾されたヌクレオシドは、配列に適切な５’−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−ホスフォロアミダイト、特に５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォロアミダイト（図１６）を用いてＳ及びＡＳに取り込まれ、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

一般式ＩＩＩの二重鎖はアンチセンス鎖の５’末端上にリン酸部分を有する。このリン酸基化学的にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ビス（２−シアノエチル）ホスフォロアミダイト（図１７）を用いてＳに導入され、同じ反応サイクルが上で記載されたリボヌクレオシドの取り込みに利用される。

鎖の集合に続き、完全に保護されたオリゴヌクレオチドをジソディウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物で処理することにより、ヌクレオチド間リン酸結合からメチル基を除去する。オリゴヌクレオチドを次に支持体から分割して、５’−リン酸上の塩基保護基及び２−シアノエチル基を水性Ｎ−メチルアミンにより最初は室温において次に５５℃において処理し、次に真空下で乾燥することにより除去する。この点において、粗オリゴヌクレオチドがイオン交換ＨＰＬＣ及び／又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定法により質的に分析され、そして必要ならばゲル精製する。オリゴヌクレオチドを次にＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器を用いて定量する。

成分相補鎖から二重鎖ｓｉＲＮＡを形成させるために、等量のセンス鎖とアンチセンス鎖を混合する。オリゴヌクレオチドはこの点において２’−オルソエステル保護を保持するから、それらを温和な酸により５５℃において処理するが、当該処理はこれらの保護基を除去する。脱保護溶液をゆっくりと室温に冷却させることにより、脱保護された鎖をアニールすることにより二重鎖を形成させる。最後に、二重鎖をエタノールで沈殿させることにより脱塩し、そして精製された二重鎖をＲＮＡｓｅフリーの水又はバッファーに溶解して、紫外線分光器により定量する。二重鎖化プロセスの質は天然ゲル電気泳動により評価する。

トランスフェクション
ｓｉＲＮＡ二重鎖を標準バッファー（５０ミリモラーＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１００ミリモラーＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を用いてアニールさせた。トランスフェクションを以下に記載されるとおりに標準プロトコルに従い行った。

９６ウエル及び６ウエルのプレートに関しての標準トランスフェクションプロトコル：ｓｉＲＮＡ
１．２９３及びＣａｌｕ６，ＨｅＬａ，ＭＤＡ７５のプロトコルは同一である。
２．トランスフェクションの日に９５％コンフルエントになるように細胞をプレートする。
３．ＲＮＡｓｅに対する防御のために、ＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（アンビオン）をトランスフェクション混合物に加える。
４．全ての溶液及び取り扱いはＲＮＡｓｅフリーな条件下で行われなければならない。
プレート１ 小フラスコ中２５ｍｌの培地の中で０．５−１ｍｌ又は大フラスコ中５０ｍｌ中１ｍｌ。

９６ウエルプレート
１．ミディアムフラスコ（大フラスコ中６）中に０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを３ｍｌ加え、５分間３７℃においてインキュベートする。
２．レギュラー培地７ｍｌ（１４ｍｌ大）を加え、そして前後に１０回ピペッティングして細胞を懸濁させる。
３．工程２から細胞懸濁液を２５マイクロリットル及び７５マイクロリットルのトリパンブルー染料（１：４）を取り出して、細胞カウンター内に１０マイクロリットル入れる。
４．標準血球計数系の中で細胞の数を数える。
５．細胞の平均数ｘ４ｘ１００００がｍｌあたりの細胞の数である。
６．レギュラー培地により希釈して３５０ ０００／ｍｌにする。
７．１００マイクロリットル（ＨＥＫ２９３に関して３５，０００細胞）を９６ウエルプレートにプレートする。

２ｘ９６ウエルプレートのためのトランスフェクション（６０ウエルフォーマット）
１．ＯＰＴＩ−ＭＥＭ ２ｍｌ＋８０マイクロリットルのリポフェクタミン２０００（１：２５）＋１５マイクロリットルのＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（アンビオン）。
２．ｓｉＲＮＡアリコート（１００マイクロモラーの０．８マイクロリットルはスクリーニングするため（全希釈係数は１：７５０、１００マイクロモラーの０．８マイクロリットルが１００ナノモラー最終を生じる）を所望の順の深い皿（通常は６０ウエルフォーマットについて３カラムｘ６又は９６ウエルに関して４カラムかける（ｂｙ）８）に移す。
３．１００マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭを移す。
４．リポフェクタミン２０００とＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎを含む１００マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭを各ウエルに移す。
５．室温において２０−３０分間放置する。
６．レギュラー培地０．５５ｍｌを各ウエルに加える。プレートにフィルムをかぶせて混合する。
７．１００ｘ３ｘ２を直接細胞にアレイアウトする（２つのプレートに対して十分）。
２ｘ６ウエルプレートのためのトランスフェクション
８．８ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ＋１６０マイクロリットルのリポフェクタミン２０００（１：２５）。３０マイクロリットルのＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（アンビオン）。
９．ｓｉＲＮＡアリコート（全希釈係数は１：７５０、１００マイクロモラー溶液の５マイクロリットルが１００ナノモラー最終を生じる）をポリスチレンチューブに移す。
１０．リポフェクタミン２０００とＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（アンビオン）を含む１，３００マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭを移す。
１１．室温において２０−３０分間放置する。
１２．レギュラー培地０．５５ｍｌを各ウエルに加える。プレートにフィルムをかぶせて混合する。
１３．２ｍｌを各ウエルに移す（２つのプレートに対して十分）。
ｍＲＮＡ又は蛋白質のレベルをトランスフェクションの２４、４８、７２又は９６時間後に標準キット又はＣｕｓｔｏｍ Ｂ−ＤＮＡセット及びＱｕａｎｔｉｇｅｎｅキット（バイエル）を用いて測定する。

実施例５
活性の測定／検出
標的ｍＲＮＡのレベルの低下又は相当する蛋白質のレベルの低下をアッセイすることにより、ｓｉＲＮＡ誘導性ＲＮＡ干渉、又は遺伝子サイレンシングのレベルを評価した。ｍＲＮＡレベルのアッセイは、ＤＮＡ^ＴＭ技術（Ｑｕａｎｔａｇｅｎｅ社）を用いて実施した。ｆＬＵＣ及びｒＬＵＣの蛋白質のレベルをＳＴＥＡＤＹ ＧＬＯ^ＴＭ（プロメガ社）によりアッセイした。ヒトアルカリホスファターゼレベルをＧｒｅａｔ ＥｓｃＡｐｅ ＳＥＡＰ蛍光検出キット（＃Ｋ２０４３−１）、ＢＤバイオサイエンス、クロンテックにより評価した。

マイクロアレイ分析のために、ＨｅＬａ細胞に６−ウエルのプレート内でオリゴフェクタミン（インビトロジェン）及び示された用量のｓｉＲＮＡ二重鎖を用いてトランスフェクトした。特定しなければ、ｓｉＲＮＡの濃度は１００ｎＭであった。ＲＮＡをトランスフェクションの２４時間後に単離した。ｓｉＲＮＡトランスフェクトされた細胞からのＲＮＡを、偽トランスフェクトされた細胞（ＲＮＡ二重鎖の不在下でトランスフェクション試薬により処理された）からのＲＮＡに対してハイブリダイズさせた。全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットにより精製し、そして約２１，０００ヒト遺伝子に相当するオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションのために加工した。比率（ｒａｔｉｏ）ハイブリダイゼーションを蛍光標識リバーサルにより実施することにより染料のバイアスを排除した。マイクロアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入するか又はＨｕｇｅｓ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｋ−ｊｅｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３４２−３４７に記載されるとおりに合成した。各列は個々のｓｉＲＮＡのトランスフェクションによりもたらされた発現パターンを表す。示されたデータは、偽トランスフェクトされた細胞に対する発現レベル（ｐ値＜０．０１及びｌｏｇ_１０強度＞−１．５）の違いを表すサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）遺伝子である。発現において倍の変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）にカットを定めなかった（ｎｏ ｃｕｔｓ ｗｅｒｅ ｐｌａｃｅｄ）。緑は低下した発現を示す；赤は増加した発現を示す。Ｒｏｓｅｔｔａ Ｒｅｓｏｌｖｅｒ^ＴＭソフトウエアを用いてデータを分析した。クラスターダイアグラムの上部のヒストグラムは、実験において分析された異なる遺伝子間の遺伝子発現変化の類似性を反映する。

実施例６
サイレンシング活性を変調する化学修飾の同定
ＲＮＡ合成のためのプラットフォームとして２’−Ｏ−ＡＣＥ化学を用いて、センス（Ｓ）及びアンチセンス（ＡＳ）鎖における一つ、二つ、又は三つの連続した修飾ヌクレオチドからなる修飾ウオーキングを、ＳＥＡＰ−２２１７、ヒト分泌アルカリホスファターゼに対するｓｉＲＮＡ（ＳＥＡＰ，ＳＥＡＰ−２２１７−センス鎖５’−ＧＵＧＡＵＧＵＡＵＧＵＣＡＧＡＧＡＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号２２））に実施した。次に、各二重鎖をＳＥＡＰ発現ベクター（クロンテック）によりＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし（１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ，５０ｎｇ／ウエルのＳＥＡＰ発現ベクター、リポフェクタミン２０００）、そしてトランスフェクションの２４時間後の標的蛋白質の活性の低下をアッセイすることにより、これらの修飾されたｓｉＲＮＡｓのサイレンシング効率を評価した。図５は、２’−Ｏ−メチル化されたＳＥＡＰ−２２１７ ｓｉＲＮＡの修飾と機能の間の関係を示す。ＳＥＡＰを標的とする未修飾の二重鎖はＳＥＡＰ遺伝子の＞９０％のサイレンシングを誘導する。ＳとＡＳ鎖の両方の単一の塩基の修飾はｓｉＲＮＡ活性にほとんど又は全く効果がないことから、何れかの鎖の単一の２’−ヒドロキシル基は標的特異的ＲＮＡｉにおいて不可欠な役割を担わないことが示唆される。対照的に、２つの並んだ修飾のウオークはいくつかのキーポジションを同定し、修飾された塩基の導入がサイレンシング活性を顕著に干渉した。機能に関するもっとも深い（ｐｒｏｆｏｕｎｄ）干渉は、ＡＳ鎖の５’エンドの２つの連続する塩基（１及び２位）又は３つの連続する塩基（１、２及び３位）が修飾された時に観察され、即ち、隣接する修飾基の間の協同的効果の暗示である。Ｓ鎖の類似の修飾は二重鎖の機能性を変化させなかったため、対の２’−Ｏ−メチル修飾された塩基は、ＳとＡＳ鎖の識別を可能にさせ、そして標的ノックダウンのためのキーとなる位置の同定を可能にさせる。さらに、これらの実験は、評定（及び可能なのはオフターゲット）サイレンシングにおいてキーとなる役割を担う二重鎖の中に位置を同定する。

実施例７
化学修飾の様々な組み合わせのｓｉＲＮＡ誘導された
遺伝子サイレンシングに対する効果のさらなる分析
２’−Ｏ−メチル修飾の様々な組み合わせの二重鎖機能性に対する効果を試験するため、ルシフェラーゼ遺伝子に対して向けられたｓｉＲＮＡのシリーズ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）を、２’−Ｏ−ＡＣＥ化学を用いて合成し、そしてリボース環の２’位においてＯ−メチル基を含むように修飾した。

（上に掲載された配列はセンス鎖である。）
特定すれば、（１）センス鎖、（２）アンチセンス鎖、又は（３）両鎖の、２つのもっとも５’のヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡを、Ｌｕｃ−発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｕｃ，５０ｎｇ／ウエル）と共にＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。次に、各二重鎖のサイレンシング能力の並びの比較を実施することにより、標的転写物の分解に対するこの修飾の効果を決定した。

これらの研究の結果は、ＡＳ鎖のみへの２’−Ｏ−メチル基の追加が標的ｍＲＮＡを沈黙化させる二重鎖の能力を劇的に増加させることを示した（図６参照）。対照的に、センス鎖上にこの修飾を有する二重鎖は、均等物の未修飾ｓｉＲＮＡよりも悪くはない（ｌｕｃ ５８，６３，８１）か又は良好（ｌｕｃ ５６，８，１８）に機能したことから、センス鎖の修飾はＲＩＳＣにより鎖の選択に偏向を生じ（いくつかの場合に）、そして有効なアンチセンス鎖の濃度を増加させた。増強されたサイレンシングは、分子の５’センスエンドへのＲＩＳＣの結合親和性の低下の結果（よって反対の鎖への対合に関しての遊離ＲＩＳＣの利用可能性の増加）、センス鎖への天然キナーゼの能力の低下の結果（即ち、ＲＩＳＣへの接近に関してのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の競合を低下させる）、又は５’−センスエンドから二重鎖をほぐすＲＩＳＣの能力の低下の結果であり得た。両鎖に２’−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡは、何れか一方の鎖に修飾を含んだ分子に関して観察された値の間にある低下したサイレンシング能力を呈した。これらの結果の一つの解釈は、修飾された鎖に関してＲＩＳＣが有する結合親和性を２’−Ｏ−メチル修飾が低下させることである。両方の鎖が修飾されている場合、どちらの鎖もその相補体を超える利点を享受することはなく、そして両方の修飾された分子の機能性の平均を表す新たな平衡が確立される。

２’−Ｏ−メチル化されたＳ／ＡＳ ｓｉＲＮＡを含む細胞内で観察されたサイレンシングのレベルの低下は、二重鎖をリン酸化する細胞キナーゼの能力の弱化の結果であったか否かを試験するために、ＡＳ鎖の５’エンドへのリン酸基を有するように、２’−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡｓを修飾した。特定すれば、２’−Ｏ−メチル基を（１）アンチセンス鎖の５’エンドの１及び２位上；又は（２）アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の５’エンドの１及び２位上の何れかに有するＬｕｃ ｓｉＲＮＡｓを合成の間にＡＳ鎖を５’リン酸化した。これらの二重鎖を次に以前に記載された手法を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入し、そして所望の標的を沈黙化する能力に関して試験した。結果は、試験されたうちの８３％において（１０／１２）、アンチセンス鎖の５’リン酸化が均等な未リン酸化の分子を超えて二重鎖のサイレンシング効率を改善したことを示した（図６）。残りの２つのケースにおいては、サイレンシングが変化しないままであるか又はほんのわずかしか改善しなかった。これらの結果は、アンチセンス鎖の５’リン酸化及びセンス鎖とアンチセンス鎖の１及び２位の２’Ｏ−メチル化の組み合わせが、二重鎖の機能性を維持することと両立することを証明する。さらに、鎖の１及び２位の２通りの２’−Ｏ−メチル修飾（末端位の５’リン酸の不在下）が厳密に未リン酸化鎖のサイレンシング能力を傷つけるように、この修飾パターン（センス鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾、プラス、アンチセンス鎖の５’リン酸化）は、オンターゲットノックダウンを傷つけることなくセンス鎖のオフターゲット効果を排除する戦略を明らかにする。さらに、２’−Ｏ−メチル化の他の工程に対する有力な効果は、アンチセンス鎖と１００％相同性を有する意図された標的と、低い量の相同性しか有さないオフターゲットの間を識別するＲＩＳＣの能力をも上記の修飾が変化させるかもしれないことを著者に考えさせる。

実施例８
ｓｉＲＮＡにより生じたオフターゲット効果を排除するか
最小にするか又は変化させる化学修飾パートナーの同定
（センス鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾、プラス、アンチセンス鎖の５’リン酸化）修飾を含むｓｉＲＮＡが同じオフターゲット効果を有するか又はオフターゲット効果を変化させるかを決定するために、ＩＧＦＲ１（ＩＧＦＲ１−７３）を標的とするｓｉＲＮＡを未修飾及び修飾状態にて細胞にトランスフェクトした。図７に示されるとおり、ｓｉＲＮＡの未修飾バージョンは顕著なオフターゲット遺伝子変調を誘導したが、修飾形態は遥かにずっと限定された（ｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｌｉｍｉｔｅｄ）サブセットしかダウン制御しなかった。これらの発見は、広い範囲の試験されたｓｉＲＮＡ全域で矛盾なく観察された（ＭＡＰＫ１４−１５３ヒートマップに関しては図８を、そして４つの遺伝子を標的とする８つの異なるｓｉＲＮＡに関する結果の要約に関しては図９を参照）。これらケースの全てにおいて、完全に修飾された分子のサイレンシングは未修飾の分子とおおよそ均等であった。

観察された増加した特異性に２’−Ｏ−メチル修飾の数及び位置が重要であるか否かを決定するために、発明者らは、ＭＡＲＫ１４−１５３の全域で化学修飾のウオークを実施した。二重鎖Ｄ（未修飾二重鎖）及び二重鎖Ｆ（センス鎖の１及び２位において修飾された２’−Ｏ−メチル、アンチセンス鎖上は未修飾）を除いてこれらの研究において全ての二重鎖がセンス鎖の１及び２位に対の２’−Ｏ−メチル修飾を含む。さらに、この研究においては全ての二重鎖（Ｄ→Ｒ）がＡＳ鎖の５’エンドにリン酸基を含む。さらに、残りの配置の相補鎖（Ｅ，Ｇ→Ｑ）は以下の修飾を含む：
Ｅ：ＡＳ鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｆ：ＡＳ鎖の２及び３位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｇ：ＡＳ鎖の３及び４位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｈ：ＡＳ鎖の４及び５位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｉ：ＡＳ鎖の５及び６位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｋ：ＡＳ鎖の６及び７位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｌ：ＡＳ鎖の７及び８位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｍ：ＡＳ鎖の８及び９位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｎ：ＡＳ鎖の９及び１０位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｏ：ＡＳ鎖の１０及び１１位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｐ：ＡＳ鎖の１位の２’−Ｏ−メチル修飾
Ｑ：ＡＳ鎖の２位の２’−Ｏ−メチル修飾。

図１０ａに示されるとおり、３つの修飾パターンＥ，Ｇ及びＱのみがオフターゲット効果の顕著な低下を呈する。これらの分子の３つ全ての間の共通の要素がアンチセンス鎖の２位の修飾であることから、この位置がオフターゲットを排除するためのキー要素であることがわかった。

この発見を確認するため、ＭＡＰＫ１４，ＫＮＴＣ２，及びＳＴＫ６を標的とする３つの追加のｓｉＲＮＡｓをデザインして（１）センス鎖の１及び２位の修飾；（２）センス鎖の１及び２位の修飾、プラスアンチセンス鎖の１位の修飾；（３）センス鎖の１及び２位の修飾、プラスアンチセンス鎖の２位の修飾；（４）センス鎖の１及び２位の修飾、プラスアンチセンス鎖の１及び２位の修飾を含むようにした。これらの分子により生じたオフターゲット効果を、未修飾のｓｉＲＮＡと比較した。研究した全てのケースにおいて、アンチセンス鎖は５’−末端ヌクレオチドの５’炭素上にリン酸基も含む。ＭＡＰＫ１４，ＫＮＴＣ２，及びＳＴＫ６を標的とするｓｉＲＮＡ（ＭＡＰＫ１４，５’１９３ ＣＣＵＡＣＡＧＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＵＵ−３’（配列番号２９），センス配列；ＫＮＴＣ２，５’ＧＧＣＵＵＣＣＵＵＡＣＡＡＧＧＡＧＡＵ−３’（配列番号３０），センス配列；及びＳＴＫ６，５’ＣＧＧＧＵＣＵＵＧＵＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号３１），センス配列）全てが、それらが未修飾の場合にオフターゲット効果の顕著なレベルを示す（図１０ｂ）。対照的に、以下の修飾パターン：センスヌクレオチド１及び２の２’−Ｏ−メチル修飾、プラスアンチセンスヌクレオチド１及び２（又は２のみ）の２’−Ｏ−メチル修飾、プラス第１アンチセンスヌクレオチドの５’炭素のリン酸化の追加がオフターゲット効果の大部分の排除に十分であった。これらの研究は、オフターゲット効果を制限することにおける２位の必須の重要性及び態様１に記載された化学修飾パターンのこれらの効果を低下させるか及び／又は排除する能力を証明する。

実施例９
オフターゲット効果を排除する塩基対ミスマッチの評価：
化学的に修飾されたｓｉＲＮＡとの比較
オフターゲット効果における２位の重要性をさらに探索するために、塩基対ミスマッチをＭＡＰＫ１４遺伝子標的ｓｉＲＮＡに取り込んだ。単一の塩基対ミスマッチ（標的のアンチセンス鎖と標的部位の間）を有する二重鎖を、次に、分子全域の位置で（即ち、アンチセンス鎖の、１及び２位、２及び３位、３及び４位、等）対の化学修飾（２’−Ｏ−メチル修飾）を有するｓｉＲＮＡと比較した。これらの実験の結果は図１１に提供されるが、いくつかの重要なポイントを証明する。第１に、以前に観察されたとおり、１及び２位の化学修飾はオフターゲットサインを排除するのにもっとも大きな効果を有するが、他の位置の対の２’−Ｏ−メチル修飾は、より劣る量のオフターゲットサイレンシングを提供した。驚くことに、二重鎖全域の様々な位置での塩基対ミスマッチの導入は、ミスマッチの位置に依存して様々な結果を提供した。１位のミスマッチは未修飾の分子のオフターゲットサインを排除できず、そして遺伝子のいくつかの付加的な／さらに増強されたダウン制御を導いた。２−７位の塩基対ミスマッチの導入は、未修飾二重鎖により生じたサインの実質的な部分を排除したが、たびたび他のオフターゲットにされた遺伝子の発現の偏向されたパターンを導いた。ＭＡＰＫ１４−１５３に関しては、ミスマッチがアンチセンス鎖の４位に導入されたときに、これが特に明確であった。一緒にすると、これらの研究は、塩基対ミスマッチと態様１の化学修飾パターンの両方がｓｉＲＮＡオフターゲット効果を変更できるが、未修飾分子において観察されたパターンを二次サインが置き換えないという事実により、化学修飾パターンは優れていることが証明される。

実施例１０
ｓｉＲＮＡオフターゲット効果は観察可能な
表現型を生じることの証明：傷害性ｓｉＲＮＡ
本発明の重要性は、標的ノックダウンに付随しなかった表現型をオフターゲット効果が誘導しうることが認識されたとき、明確となった。この現象は、ｓｉＲＮＡ誘導性のオフターゲット及び細胞傷害性の研究において明らかとなった。ＤＢＩを標的とする（ＮＭ＿０２０５４８，２０２−２９１位）ｓｉＲＮＡウオークに由来するランダムに選択されたｓｉＲＮＡの集団を、傷害性を誘導する能力に関して評価した。標的化ｓｉＲＮＡのコレクションは、９０の個々の（１９ｎｔ）二重鎖からなり、そして単一塩基ステップにおいて各領域をカバーした。二重鎖をリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いてＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし（ウエルあたり１０，０００細胞、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ）、傷害性を非傷害性配列から識別するための任意の閾値としてカットオフ７５％を用いた。処理後の細胞の生存性は、Ａｌｍａｒ Ｂｌｕｅ（バイオサイエンス社）細胞傷害性アッセイにより製造者の指示書に従い決定した。

これらの条件下でトランスフェクトされたｓｉＲＮＡは様々なレベルの細胞傷害性を誘導することが観察された。全体的に、９０のｓｉＲＮＡ二重鎖のうちの１４（１５．５％）が７５％未満に細胞生存性を低下させることがわかった（図１２ａ）。傷害性及び非傷害性ｓｉＲＮＡの実施例が強いＤＢＩサイレンシングを誘導することを見いだし得たので、各ｓｉＲＮＡの相対的細胞傷害性は標的特異的ノックダウンとは関連性がなかった。

ｓｉＲＮＡにより誘導された傷害性の独立した確認は、１２の異なる遺伝子（ＡＲＡＦ１，ＮＭ＿００１６５４，ＭＡＰ２Ｋ１，ＮＭ＿００２７５５，ＭＡＰ２Ｋ２，ＮＭ＿０３０６６２，ＰＩ３Ｋ−ＣＡ，ＮＭ＿００６２１８，Ｐｉ３Ｋ−ＣＢ，ＮＭ＿００６２１９ Ｂｃｌ２，ＮＭ＿０００６３３，Ｂｃｌ３，ＮＭ＿００５１７８，ＭＡＰＫ１，ＮＭ＿００２７４５，ＭＡＰＫ３，ＮＭ＿００２７４６，ＡＲ，ＮＭ＿００００４４，ＳＲＤ５ａ１，ＮＭ＿００１０４７，ＳＲＤ５ａ２，ＮＭ＿０００３４８，遺伝子あたり４つのｓｉＲＮＡｓ，図１２ｂ）を標的とする４８の機能性（＞７０％サイレンシング）ｓｉＲＮＡの別々のコレクションの分析から得た。ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ２を標的とする８つの二重鎖全てが８０％より高い遺伝子サイレンシングを示すが、各４とおりのうちたったひとつのｓｉＲＮＡは７５％未満に細胞生存性を低下させる（ＭＡＰＫ１−ｄ４及びＭＡＰＫ２−ｄ３）。即ち、各群の残りのｓｉＲＮＡｓは標的沈黙化させる能力に関して等しく機能したが、非傷害性であって、ＭＡＰ２Ｋ１−ｄ４とＭＡＰ２Ｋ２−ｄ３により誘導された傷害性は標的ノックダウンに関連性がない。さらに、傷害性の相対レベルがトランスフェクションの間のｓｉＲＮＡの濃度に依存することがわかった（図１２ｄ）。ｓｉＲＮＡ誘導性傷害性とオフターゲット効果の両方がｓｉＲＮＡ濃度への依存性を示すとおり、ｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性はオフターゲット効果であったと予測される。

傷害性のｓｉＲＮＡの分配の直線表示並びにＤＢＩウオークは、これらの配列の分散がしばしばランダムであったことを示し（即ち、クラスター化）、そして観察された傷害性に必須の一つ又はそれより多いモチーフの存在を示唆する（図１２ａ、箱のエリア）。ランダムな機能性ｓｉＲＮＡのセットからの傷害性配列の続く分析は、１２の配列全てがＡＡＡ／ＵＵＵ又はＧＣＣＡ／ＵＧＧＣモチーフの何れかを含んだことを明らかにした。これらのモチーフの存在と傷害性の間に相関が存在したか否かを試験するために、３つの追加のランダムに選択された、ＡＡＡ／ＵＵＵモチーフを含むか、ＧＣＣＡ／ＵＧＧＣモチーフを含むか、又は何れも含まないｓｉＲＮＡｓの群を選択して、細胞死を誘導する能力に関して試験した。図１３ａ及び１３ｂに示されるとおり、ＡＡＡ／ＵＵＵ及びＧＣＣＡ／ＵＧＧＣモチーフを含むｓｉＲＮＡｓは、モチーフを含まないｓｉＲＮＡ（図１３ｃ，１６％）よりも高い確率で傷害性を誘導を呈した（５６％及び５３％、それぞれ）。これらの２つのサンプルに関してのＴ−試験のｐ−値は１．３ｘ１０^−７であったため、ｓｉＲＮＡ誘導性細胞傷害性とＡＡＡ／ＵＵＵ又はＧＣＣＡ／ＵＧＧＣモチーフを含む二重鎖のデリバリーの間に強い相関が存在したことを、これらの発見は強く指示する。図１２と１３のデータを生じさせるために用いられたｓｉＲＮＡｓの標的配列を表Ｉに提供する。用いられたときの、対応するｓｉＲＮＡｓの修飾を実施例及び図の説明において示す。

注：１４Ｌに関する配列も修飾された形態で存在し、センス鎖及びアンチセンス鎖の１及び２位が２’−Ｏ−メチル基を含み、そしてアンチセンス鎖の１位は５’炭素のリン酸基も含む。

上のデータは、ｓｉＲＮＡが配列特異的な標的非依存性の機構にて傷害性を誘導し得るとの仮説を支持する。発明者らは、ＲＮＡｉ機構に対するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性の依存度を試験するために別の２つの実験を実施した。これらの実験の結果を以下に提示するが、傷害性はＲＮＡｉ経路により媒介されることを証明する。以前の実験が、傷害性は標的ノックダウンに関連しないことを証明したので、第３の実験を実施することにより、第１の態様において記載された化学修飾パターンが傷害性を排除し得るか否かを確定した。

第１の実験において、ｓｉＲＮＡを含む傷害性モチーフが細胞死を誘導する能力を、ＲＮＡｉ機構が完全に欠陥を生じた条件下で調査した。以前の研究が明らかにしたのは、ｅＬＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２がｍＲＮＡの分割に必須であること及びこの遺伝子産物のノックダウンが厳重にこの経路を不具合にさせることであった。発明者らは、この発見を確認し（図１４ａ−ｉ）、そして次に新たに発見されたｓｉＲＮＡ−誘導による傷害性におけるこの経路の重要性を評定した。これを試験するため、ｅＬＦ２Ｃ２／ｈＡｇｏ２ ｓｉＲＮＡプール（Ｔ１）によりトランスフェクトされた細胞に、次にＡＡＡ／ＵＵＵ又はＧＣＣＡ／ＵＧＧＣモチーフの何れかを含んだ傷害性ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした（図１４ａ，「実験」）。これらの実験の結果は、完全なｓｉＲＮＡ経路の不在下において、傷害性ｓｉＲＮＡが細胞死表現型を誘導できなかったことを証明した（図１４ｊ）。ＲＮＡｉ経路が放置された（ｌｅｆｔ）平行実験はこれらの配列の傷害特性を呈したことから、完全なＲＮＡｉ経路がｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性に必要であったと結論された。これらの実験は、傷害性ｓｉＲＮＡがそれらの表現型をＲＮＡｉ経路により誘導するという仮説を強く支持する。観察された傷害性は標的ノックダウンのレベル又は程度に関連しないため、オフターゲットは観察された傷害性表現型に必須であるらしい。

ｓｉＲＮＡ傷害性におけるＲＮＡｉ経路の関与に関するさらなるサポートは、二重鎖のサイズを１９ｂｐから１７ｂｐに減らした実験によった。以前の研究は、１９ｂｐより短い二重鎖はｍＲＮＡ配列を標的化する効率が悪かったことを示しており、たぶん、ダイサー及び／又はＲＩＳＣが、１９ｂｐ未満の長さに二重鎖配列が低下するＲＮＡｉを媒介することができないことによるらしい（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．”Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”Ｎａｔｕｒｅ ２００１ Ｍａｙ ２４；４１１（６８３６）：４９４−８）。公知の１９ｂｐの傷害性ｓｉＲＮＡの長さを２ｂｐ減じた場合（全部で１７ｂｐの長さ、モチーフの破壊はない）、傷害性のレベルが劇的に低下した（図１４ｋ）ことから、ＲＮＡｉにより侵入及び／又はプロセシングは傷害性の誘導に必要であることが示唆される。これらの結果は、この形態のｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡｉ経路が細胞傷害性を誘導したことを再び暗示する。観察された傷害性は標的ノックダウンのレベル又は程度に関連しないので、オフターゲットは観察された傷害性表現型に必須であるらしい。

上記のとおり、発明の第１の態様において記載された修飾はオフターゲット効果を排除することが示された。ｓｉＲＮＡ誘導性の細胞傷害性はＲＮＡｉに依存するが、標的ノックダウンには関連しないので、発明者らは、オフターゲットを排除する修飾がｓｉＲＮＡ誘導性細胞傷害性を完全に破壊するか否かを試験することを決定した。これを成し遂げるため、第１の態様に記載された様々な化学修飾パターンを、ＲＮＡｉ−依存性の機構において傷害性を誘導することが知られているｓｉＲＮＡに加えた。特に、以下の修飾：センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル基、プラス５’末端アンチセンスヌクレオチドの炭素５の５’リン酸基を有するようにｓｉＲＮＡを合成した。図１４−１に示されるとおり、８つの別々の未修飾の傷害性ｓｉＲＮＡ（ＭＡＰ２Ｋ２，ＳＲＤ５Ａ１ ｄ２，ＳＲＤ５Ａ１ ｄ４，ＳＲＤ５Ａ２ ｄ３，ＰＤＥ８Ａ，ＳＴＫ１１，及びＣＨＤ４）を細胞のトランスフェクトしたところ、各々が細胞生存性を７５％未満に低下させた。対照的に、８つ全ての二重鎖の化学修飾は、標的特異的ノックダウンを顕著に変化させることなく、ｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を低下させた。これらの発見は、ＡＡＡ／ＵＵＵ又はＧＣＣＡ／ＵＧＧＣを含むｓｉＲＮＡにより誘導されたｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性がオフターゲット効果の結果であることを強く支持する仮定（ｐｒｅｍｉｓｅ）である。もっとも重要なことに、本明細書に提示した発見は、オフターゲット誘導性の表現型が発明の修飾の追加により排除可能であることを示唆する。

これらの研究は、ルシフェラーゼを標的とした追加の３７のｓｉＲＮＡに対する発明の修飾パターンの効果を評価することにより継続された（受入番号Ｍ１５０７７）。特に、以下の表ＩＩに掲載された配列を、修飾された（センス鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル基、アンチセンス鎖の２位上の２’−Ｏ−メチル基、アンチセンス鎖上の５’末端ヌクレオチドの５’炭素上のリン酸基）状態及び未修飾の状態の両方にて合成し、そしてＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした（ウエルあたり５，０００細胞、１０ｕＭ ｓｉＲＮＡ，ウエルあたり０．１マイクロリットルのリポフェクタミン２０００）。次に、各培養における細胞死のレベルをＡｌｍａｒ Ｂｌｕｅを用いてトランスフェクションの２４時間後に測定した。

これらの研究の結果を図１４ｍに提示し、そして（１）傷害性のレベルが発明の化学修飾の添加と共に顕著に低下した、３７ケースのうちの２５、及び（２）傷害性のレベルが傷害性トランスフェクションと非傷害性トランスフェクションの間を識別する線として以前に引かれた２５％レベルを下回るまで低下する、２４ケースのうちの２２ケースを示す。修飾されたｌｕｃ配列と未修飾のｌｕｃ配列の機能性を比較するために計画されたさらなる研究は両セットの分子において匹敵する活性を示したが（図１４ｎ，ＨＥＫ２９３細胞、ウエルあたり２０，０００細胞、ウエルあたりリポフェクタミン２０００を０．３マイクロリットル、７２時間点、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ）、これらの発見は（１）ＡＡＡ／ＵＵＵ又はＧＣＣＡ／ＵＧＧＣを含むｓｉＲＮＡによりもたらされたｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性がオフターゲット効果の結果であるという仮定、及び（２）オフターゲット誘導性の表現型が発明の修飾の添加により多大に減じられるか又は排除できるという仮定を強く支持する。

実施例１１
発明の化学修飾の相乗効果と
オフターゲット効果を排除することに対するプーリング
発明の化学修飾を混合すること及びオフターゲットサイレンシングを排除するためのプーリングの値を評価するため、シクロフィリンＢ（ＰＰＩＢ）を標的とする、４つのｓｉＲＮＡ及び分子の各プールを、マイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイリングを用いることによりオフターゲット効果について試験した（修飾された形態と未修飾の形態の両方）。これを成し遂げるため、ＰＰＩＢを標的とする配列（下記）最初に未修飾形態と修飾された（センス鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル、アンチセンス鎖の２位上の２’−Ｏ−メチル、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’炭素上のリン酸）形態にて合成した。
配列：センス鎖

次に、二重鎖をヒトＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした（９６ウエルプレートのウエルあたり１０Ｋ細胞、ウエルあたり０．４ｕＬダーマフェクト １リピッド（ダーマコン社）、１００ｎＭ濃度。プールの場合には、各二重鎖の濃度が２５ｎＭであったが、即ち、全濃度が個々のｓｉＲＮＡに対して実施された研究の間は一定のままであったことに注目。）。マイクロアレイの分析のための細胞溶解物を次に回収し（トランスフェクションの２４時間後）、そして全ＲＮＡの精製をＱｉａｇｅｎ’ｓ ＲＮｅａｓｙカラムをカラムＤＮａｓｅ消化と共に用いて実施した。ＲＮＡの完全性は、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐにより、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにて実施した。遺伝子発現プロファイリングを実施するために、以下の手法を実施した：各サンプルに関して、６５０ｎｇの全ＲＮＡを増幅し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ’ｓ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＣｙ３−及びＣｙ５−標識した（パーキンエルマー）。ハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ Ｈｕｍａｎ １Ａ（Ｖ２）Ｏｌｉｇｏ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）を用いて実施した。ハイブリダイゼーションのレファレンスは、示されるとおり、偽トランスフェクトされた細胞又は未トランスフェクト細胞であった。スライドを洗浄し、６Ｘ及び０．０６ＸのＳＳＰＥを０．０２５％のＮ−ラウロイルザルコシン、純粋アセトニトリル、及びＡｇｕｌｅｎｔ’ｓ所有の非水性乾燥及び安定化溶液を用いて乾燥した。次に、それらは、Ａｇｉｌｅｎｔｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（モデルＧ２５０５Ｂ）上でスキャンし、そしてロウイメージをＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ｖ７．１．１．）を用いて加工した。さらなる分析／データ加工は、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ８．０及びＳｐｏｔｆｉｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｍｏｄｕｌｅを用いて実施された。低いシグナルの遺伝子は、各自己自己アレイ上のデータからＬｏｇ（ピクセル中の赤及び緑の追加シグナル）＞２．８のカットオフを適用することにより分析からはずした。

ｓｉＲＮＡを標的とするシクロフィリンＢの分析からのデータは、標的とされた遺伝子のノックダウンのレベルが修飾及び未修飾の二重鎖において一定のままであったが（データは示さず）、全てのケースにおいて、発明の化学修飾パターンの追加はオフターゲット化された遺伝子の数を５０％又はそれ以上減じさせた（２倍を超えてダウン制御された）ことを示した。二重鎖Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，及びＣ４に関しては、オフターゲットの数を５→２、５７→２３、１２→６、及び７２→２１にそれぞれ減らした（Ｃ２の場合には、２３のオフターゲットのうちの７つが実験上の人工物と信じられ、即ち、この場合の減少は５７→６ほどといってよい）。これらの結果は、オフターゲット効果を強く抑圧する発明の修飾の追加を示す以前の発見（図７−１１を参照）を支持する。図１５ｃは、未修飾のプールから生じたオフターゲットの数が４つの個々のｓｉＲＮＡから予測された数よりも少ないことを示す（即ち、各二重鎖により生じたオフターゲットの合計＝５＋５７＋１２＋７２＝１４６対４つ全部の二重鎖のプール＝６５）。即ち、この場合、それ自身によるプーリングがオフターゲットの数を約５５％減少させ得る。発明者らが驚いたのは、たった４つのオフターゲットしか、修飾プールを用いて同定されなかったことである。未修飾の個々のｓｉＲＮＡ（１４６）において観察されたオフターゲットの全数に比較して、これは、オフターゲットの全数の９７．２％の減少を表す。未修飾のプール（６５）において観察されたオフターゲットの数に比較して、この変化（６５→４）は９４％の正味の減少を表す。これらの予測されなかった著しい結果は、発明の修飾とプーリングの組み合わせが個々のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのプールを超えた著しく劇的な利点を提供することを証明する。

化学修飾とプーリングを組み合わされた場合の観察された利益がシクロフィリンＢを標的とする配列に限定されたのか否かを決定するために、第２の遺伝子（ヒトｍｅｋ１、ＭＡＰ２Ｋ１，受入番号ＮＭ＿００２７５５）を標的とするｓｉＲＮＡを同一のフォーマットにて試験した。この研究において用いられた配列を以下に示す：

シクロフィリンＢの場合のように、発明の化学修飾のＭＡＰ２Ｋ１標的ｓｉＲＮＡへの追加は標的遺伝子のノックダウンに著しい影響を及ぼさなかった。しかし、以前に観察されたとおり、発明の化学修飾の個々のＭＡＰ２Ｋ１標的化ｓｉＲＮＡへの追加は、２倍（又はそれより高い）又は５０％又はそれより大きく（８５→８、９→２、５８→３２、１５→４１（人工物）、図１５ｄ−ｆ参照）オフターゲット化された遺伝子の数を減少させた（人工物の疑いのある一つを除く全てのケース）。さらに、ＰＰＩＢを用いた以前の研究におけるように、個々の二重鎖のプーリングは個々のｓｉＲＮＡにより観察された合計の数よりも少ないオフターゲットしか生じなかった（プールオフターゲット＝２６対合計された個々のオフターゲット＝１６７）。これはオフターゲットの全数の８５％の減少を表すが、化学修飾とプーリングを組み合わせることで再びプールのみの特異性を増強した。修飾されたＭＡＰ２Ｋ１標的化ｓｉＲＮＡを含むプールを用いた場合には、たった２つの遺伝子しか２倍又はそれ以上にダウン制御されなかったことが観察された。個々の未修飾のｓｉＲＮＡを用いて生じた結果に比較すると（１６７）、これは、オフターゲット遺伝子の全数の９８．８％の減少を表す。未修飾のプールに比較すると（２６の全オフターゲット）、修飾されたプールにおいて観察されたオフターゲットの数（２）は、オフターゲット化された遺伝子の全数の９２．３％の減少を表す。一緒にすると、これらのデータは、発明の修飾とプーリングの組み合わせが以前には得られなかったレベルの遺伝子ノックダウン特異性を提供したことを証明する。この増強された特異性は、標的遺伝子に拘わらず観察され、そして、例えば、有力な薬剤標的を同定するために設計された高処理量のスクリーンにおいて偽陽性の数を多大に減らすはずである。

本発明の好ましい態様は、例示及び説明の目的で選択されたのであり、如何なるようにも発明の範囲を限定するものではない。発明の特定の側面の好ましい態様の利益は付随の図面において説明される。
図１は、２５ｂｐよりも長い二重鎖内の発明の修飾の一つの態様の位置決めの間の関係を描写する。当該分子の最適なデザインは、以下のダイサー消化、最終的な機能性二重鎖が描写された発明の修飾パターンを含むことを保証する。最初のダイサー基質中では、センス及び／又はアンチセンス鎖が３’突出を有し得ることに注目されたい。あるいは、両末端が平滑末端であり得る。 図２は、ヘアピン無いの発明の修飾の一つの態様の位置決めの間の関係を描写する。当該分子の最適なデザインは、以下のダイサー消化、最終的な機能性二重鎖が描写された発明の修飾パターンを含むことを保証する。当該分子の遊離（開いた）末端は平滑末端であるか又は３’突出を含み得ることに注目されたい。さらに、当該単分子は、５’アンチセンス−ループ−センス又は５’センス−ループ−アンチセンスの配置の何れかで構成され得る。 図３は、２’−ＡＣＥ ＲＮＡ合成サイクルの概要を例示する。 図４は、２’−脱保護の直前の好ましい２’−ＡＣＥ保護されたＲＮＡを例示する。 図５Ａ及びＢは、２’−Ｏ−メチル化されたＳＥＡＰ−２２１７ ｓｉＲＮＡの修飾と機能の間の関係を描写する。図は、ＳＥＡＰ−２２１７のセンス鎖（図５Ａ）とアンチセンス鎖（図５Ｂ）の単一塩基（黒いバー）及び対になった（グレー）２’−Ｏ−メチル修飾の遺伝子サイレンシングに対する効果を例示する。Ｘ軸は、各ｓｉＲＮＡ鎖に沿った修飾の相対位置を表す（５’→３’）。Ｙ軸は、対照に対するパーセント発現を表す。 図５Ａ及びＢは、２’−Ｏ−メチル化されたＳＥＡＰ−２２１７ ｓｉＲＮＡの修飾と機能の間の関係を描写する。図は、ＳＥＡＰ−２２１７のセンス鎖（図５Ａ）とアンチセンス鎖（図５Ｂ）の単一塩基（黒いバー）及び対になった（グレー）２’−Ｏ−メチル修飾の遺伝子サイレンシングに対する効果を例示する。Ｘ軸は、各ｓｉＲＮＡ鎖に沿った修飾の相対位置を表す（５’→３’）。Ｙ軸は、対照に対するパーセント発現を表す。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図６Ａ−Ｆは、５’リン酸化を伴う場合と伴わない場合の２’−Ｏ−メチル化の、６つの異なるルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ｌｕｃ ８，１８，５６，５８，６３，及び８１）のアンチセンス鎖に対する効果を示す。「Ｓ」＝センス鎖。「ＡＳ」＝アンチセンス鎖。「＊」は示された鎖の１及び２位における２’−Ｏ−メチル化を示す。「ｐ」は示された鎖の５’リン酸化を示す。Ｙ軸は、対照（未トランスフェクト）細胞に比較しての％発現を表す。「対照」＝偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞。 図７は、未修飾（上部）及び修飾（底部）の形態におけるＩＧＦ１Ｒ−７３標的化ｓｉＲＮＡにより処理された細胞中において生成されたマイクロアレイプロフィール（ヒートマップ）を描写する。修飾パターンは、センス鎖及びアンチセンス鎖の両者における１及び２位の２’−Ｏ−メチル化、プラス５’末端アンチセンスヌクレオチドのリボース環の炭素５のリン酸化を含む。（ＩＧＦ１Ｒ−７３：５’−ＵＧＣＵＧＡＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣＣＵＣ−３’）（配列番号１） 図８Ａ及び８Ｂは、（Ａ）ＭＡＰＫ１４及び（Ｂ）ＭＰＨＯＳＰＨ１を標的とするｓｉＲＮＡにより処理された細胞のヒートマップを描写する。二重鎖ＭＡＰＫ１４−１９３とＭＰＨＯＳＨＩ−２０２は、何れかが未修飾か（上部）、１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾によりセンス鎖が修飾されているか（上から２つ目）、１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾によりアンチセンス鎖が修飾されているか（上から３つ目）、又は１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾により両方の鎖が修飾されている（各ヒートマップの底部）。試験された全ての二重鎖は、５’末端アンチセンスヌクレオチドのリボース環の炭素５にリン酸基を含む。矢印は標的のサイレンシングの位置と相対レベルを示す。（ＭＰＨＯＳ１−２０２：５’−ＧＡＣＡＵＧＣＧＡＡＵＧＡＣＡＣＵＡＧ−３’（配列番号２）；Ｍａｐｋ１４−１９３：５’−ＣＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＵＵ−３’（配列番号３）、センス鎖。 図８Ａ及び８Ｂは、（Ａ）ＭＡＰＫ１４及び（Ｂ）ＭＰＨＯＳＰＨ１を標的とするｓｉＲＮＡにより処理された細胞のヒートマップを描写する。二重鎖ＭＡＰＫ１４−１９３とＭＰＨＯＳＨＩ−２０２は、何れかが未修飾か（上部）、１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾によりセンス鎖が修飾されているか（上から２つ目）、１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾によりアンチセンス鎖が修飾されているか（上から３つ目）、又は１及び２位の２’−Ｏ−メチル化修飾により両方の鎖が修飾されている（各ヒートマップの底部）。試験された全ての二重鎖は、５’末端アンチセンスヌクレオチドのリボース環の炭素５にリン酸基を含む。矢印は標的のサイレンシングの位置と相対レベルを示す。（ＭＰＨＯＳ１−２０２：５’−ＧＡＣＡＵＧＣＧＡＡＵＧＡＣＡＣＵＡＧ−３’（配列番号２）；Ｍａｐｋ１４−１９３：５’−ＣＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＵＵ−３’（配列番号３）、センス鎖。 図９は、２つの別々の標的ＭＡＰＫ１４，ＭＰＨＯＳＰＨ１，ＰＴＥＮ，及びＩＧＦ１Ｒを標的とする８つの異なるｓｉＲＮＡに関してのオフターゲットの数の要約を描写する。各二重鎖に関連したｓｉＲＮＡの化学修飾のパターンを各列の上部に示す。（１）２’−Ｏ−メチル修飾なし、（２）アンチセンス鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、（３）センス鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、又は（４）両鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル修飾、に加えて、試験された全ての二重鎖は、５’末端アンチセンスヌクレオチドのリボース環の炭素５にリン酸基を含む。 この図の分子のセンス鎖配列は：ＩＧＦ１Ｒ：５’ＵＧＣＵＧＡＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣＣＵＣ−３’（配列番号４），Ｍａｐｋ１４−１９３：５’ＣＣＵＡＣＡＧＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＵＵ−３’（配列番号５），Ｍａｐｋ１４−１５３：５’ＧＵＣＡＵＣＡＧＣＵＵＵＧＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号６），ＭＰＨＯＳ１−２０２：５’ＧＡＣＡＵＧＣＧＡＡＵＧＡＣＡＣＵＡＧ−３’（配列番号７）．ＭＰＨＯＳ１−２０３：５’ＡＧＡＧＧＡＡＣＵＣＵＣＵＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号８），ＰＴＥＮ ２１３：５’ＵＧＧＡＧＧＧＧＡＡＵＧＣＵＣＡＧＡＡ−３’（配列番号９）及びＰＴＥＮ ２１４：５’ＵＡＡＡＧＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＣＣＧ−３’（配列番号１０），ＩＧＦ１Ｒ−７３：５’ＵＧＣＵＧＡＣＣＵＣＵＧＵＵＡＣＣＵＣ−３’（配列番号１１），ＩＧＦ１Ｒ−７１：５’ＧＣＵＣＡＣＧＧＵＣＡＵＵＡＣＣＧＡＧ−３’（配列番号１２）を含む。 図１０ａは、ＭＡＰＫ１４−１５３ ｓｉＲＮＡを横切って走る化学修飾の結果を示すヒートマップを描写する。二重鎖は、センス鎖の１及び２位上の２’−Ｏ−メチル修飾と第１のアンチセンス（末端）ヌクレオチドのリボース環上のリン酸基の組み合わせにおいて、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の様々な位置の単一修飾又は対の２’−Ｏ−メチル修飾を有する。Ｍａｐｋ１４−１５３：５’ＧＵＣＡＵＣＡＧＣＵＵＵＧＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１３）、センス鎖。文字Ｄ−Ｒは以下の分子を記載する：Ｄ：修飾されていないＥ：ＡＳ鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｆ：センス鎖の修飾のないＡＳ鎖の１及び２位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｇ：ＡＳ鎖の２及び３位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｈ：ＡＳ鎖の３及び４位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｉ：ＡＳ鎖の４及び５位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｊ：ＡＳ鎖の５及び６位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｋ：ＡＳ鎖の６及び７位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｌ：ＡＳ鎖の７及び８位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｍ：ＡＳ鎖の８及び９位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｎ：ＡＳ鎖の９及び１０位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｏ：ＡＳ鎖の１０及び１１位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｐ：ＡＳ鎖の１位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｑ：ＡＳ鎖の２位の２’−Ｏ−メチル修飾；Ｒ：ＡＳ鎖の１、２、１１、及び１２位の２’−Ｏ−メチル修飾。 図１０ｂは、オフターゲット標的遺伝子変調を決定することにおいて２位が如何に決定的なヌクレオチドであるかを証明するヒートマップを描写する。Ａ）３つ異なる遺伝子（ＭＡＰＫ１４，ＫＮＴＣ２，及びＳＴＫ６）を標的とするｓｉＲＮＡを、二重鎖が修飾されていないか（ヒートマップの各セットの上部）、センス鎖の１及び２位において２’−Ｏ−メチル基により修飾されているか（ヒートマップの各セットの上から２番目）、センス鎖の１及び２位において２’−Ｏ−メチル基により、プラス、アンチセンス鎖の１位において２’−Ｏ−メチル基により修飾されているか（ヒートマップの各セットの上から３番目）、センス鎖の１及び２位において２’−Ｏ−メチル基により、プラス、アンチセンス鎖の２位において２’−Ｏ−メチル基により修飾されているか（ヒートマップの各セットの上から４番目）、そしてセンス鎖の１及び２位において２’−Ｏ−メチル基により、プラス、アンチセンス鎖の１及び２位において２’−Ｏ−メチル基により修飾されている（ヒートマップの各セットの上から５番目）。この研究における全ての二重鎖は第１のアンチセンス（末端）ヌクレオチドのリボース環の５’炭素上にリン酸基を含んだ。この図において使用されたセンス鎖配列は、ＫＮＴＣ２：５’ＧＧＣＵＵＣＣＵＵＡＣＡＡＧＧＡＧＡＵ−３’（配列番号１４），Ｍａｐｋ１４−１９３：５’ＣＣＵＡＣＡＧＡＧＡＡＣＵＧＣＧＧＵＵ−３’（配列番号１５），ＳＴＫ６：ＣＧＧＧＵＣＵＵＧＵＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号１６）を含む。 図１１は、選択された塩基対ミスマッチによる、化学修飾のｓｉＲＮＡ（ＭＡＰＫ１４−１５３）誘導されたオフターゲット効果に対する効果を比較する（Ｍａｐｋ１４−１５３：５’ＧＵＣＡＵＣＡＧＣＵＵＵＧＵＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１７），センス）。上部の８つのヒートマップは、未修飾であるか（上部）、又はアンチセンス鎖の１及び２位、２及び３位、３及び４位、４及び５位、５及び６位、６及び７位、又は７及び８位に２’−Ｏ−メチル修飾を含む二重鎖を表す。全ての二重鎖は、第１アンチセンス（末端）ヌクレオチドのリボース環の５’炭素にリン酸基を含む。ヒートマップの下半分は、ｓｉＲＮＡ二重鎖に取り込まれた塩基対ミスマッチ（ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的分子の間）を有するｓｉＲＮＡを表す。全ての二重鎖は、第１アンチセンス（末端）ヌクレオチドのリボース環の５’炭素にリン酸基を含む。 図１２ａ−ｄは、標的非依存性の配列特異的ｓｉＲＮＡ傷害性を例示する。１２ａ：ヒーラ細胞に、９０の異なるｓｉＲＮＡ標的化ＤＢＩ（ＮＭ＿０２０５４８，２０２−２９１位）の一つをトランスフェクトした。データは、ウオークにおいてｓｉＲＮＡ位置に従い表示される。点線（水平）は、７５％生存性の閾値を表す。囲ったエリアは配列類似性を有する傷害性ｓｉＲＮＡを示す。傷害性のデータ（グレーのバー）が、同じｓｉＲＮＡセットに関してのＤＢＩ ｍＲＮＡ発現データ（黒のバー）上に重ねられる。傷害性に関しての値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは、平均からの標準偏差を叙述する。実験プロトコルに関して：トランスフェクションの７２時間後、２５マイクロリットルのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料を１００マイクロリットルの培地中に細胞を含むウエルへ加えた。次に、細胞を３７℃において加湿インキュベーター中で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした（０．５時間）。次に蛍光をパーキンネルマーＷａｌｌａｃＶｅｃｔｏｒ２ １４２０マルチラベルカウンターを用いて５４０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの放射にて測定した。図１２の結果は、異なる日に実施された３つの別個の実験からの９つのデータ点の平均であり（標準偏差を考慮に入れた）、細胞生存性が７５％を下回ることを示した。比較の遺伝子発現レベルに関して、ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，フェアモント、ＣＡ）を用いてブランチ型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に関して製造者の指示書に従って定量した。ＧＡＰＤＨ（ハウスキープ遺伝子）のｍＲＮＡのレベルをレファレンスとして使用した。 図１２ａ−ｄは、標的非依存性の配列特異的ｓｉＲＮＡ傷害性を例示する。１２ｂ：ヒーラ細胞に、１２の異なる遺伝子を標的とする４８の機能性（＞７０％サイレンシング）ｓｉＲＮＡの一つをトランスフェクトした。データはｓｉＲＮＡ誘導された傷害性のレベル８に基づいて分類される。非傷害性ｓｉＲＮＡ（グレーのバー）、傷害性ｓｉＲＮＡ（黒のバー）。傷害性に関しての値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは、平均からの標準偏差を叙述する。実験プロトコルに関して：トランスフェクションの７２時間後、２５マイクロリットルのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料を１００マイクロリットルの培地中に細胞を含むウエルへ加えた。次に、細胞を３７℃において加湿インキュベーター中で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした（０．５時間）。次に蛍光をパーキンネルマーＷａｌｌａｃＶｅｃｔｏｒ２ １４２０マルチラベルカウンターを用いて５４０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの放射にて測定した。図１２の結果は、異なる日に実施された３つの別個の実験からの９つのデータ点の平均であり（標準偏差を考慮に入れた）、細胞生存性が７５％を下回ることを示した。比較の遺伝子発現レベルに関して、ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，フェアモント、ＣＡ）を用いてブランチ型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に関して製造者の指示書に従って定量した。ＧＡＰＤＨ（ハウスキープ遺伝子）のｍＲＮＡのレベルをレファレンスとして使用した。 図１２ａ−ｄは、標的非依存性の配列特異的ｓｉＲＮＡ傷害性を例示する。１２ｃ：ＭＡＰＫ１（ＭＥＫ１）又はＭＡＰＫ２（ＭＥＫ２）の何れかを標的とする（ｂ）からの傷害性ｓｉＲＮＡと非傷害性ｓｉＲＮＡのサブセットによりトランスフェクトされたヒーラ細胞。傷害性データ（グレーのバー）は、ｍＲＮＡ発現データと並んで表される（黒のバー）。データは、サイレンシングと傷害性のレベルの間に相関が存在しないことを示す。傷害性に関しての値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは、平均からの標準偏差を叙述する。実験プロトコルに関して：トランスフェクションの７２時間後、２５マイクロリットルのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料を１００マイクロリットルの培地中に細胞を含むウエルへ加えた。次に、細胞を３７℃において加湿インキュベーター中で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした（０．５時間）。次に蛍光をパーキンネルマーＷａｌｌａｃＶｅｃｔｏｒ２ １４２０マルチラベルカウンターを用いて５４０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの放射にて測定した。図１２の結果は、異なる日に実施された３つの別個の実験からの９つのデータ点の平均であり（標準偏差を考慮に入れた）、細胞生存性が７５％を下回ることを示した。比較の遺伝子発現レベルに関して、ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，フェアモント、ＣＡ）を用いてブランチ型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に関して製造者の指示書に従って定量した。ＧＡＰＤＨ（ハウスキープ遺伝子）のｍＲＮＡのレベルをレファレンスとして使用した。 図１２ａ−ｄは、標的非依存性の配列特異的ｓｉＲＮＡ傷害性を例示する。１２ｄ：様々な濃度においてヒーラ細胞中での傷害性ｓｉＲＮＡ（ＭＡＰ２Ｋ２−３，ＳＲＤ５Ａ１−１，ＳＲＤ５Ａ１−３及びＳＲＤ５Ａ２−３）の効果を示す希釈の研究。傷害性に関しての値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは、平均からの標準偏差を叙述する。実験プロトコルに関して：トランスフェクションの７２時間後、２５マイクロリットルのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料を１００マイクロリットルの培地中に細胞を含むウエルへ加えた。次に、細胞を３７℃において加湿インキュベーター中で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした（０．５時間）。次に蛍光をパーキンネルマーＷａｌｌａｃＶｅｃｔｏｒ２ １４２０マルチラベルカウンターを用いて５４０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの放射にて測定した。図１２の結果は、異なる日に実施された３つの別個の実験からの９つのデータ点の平均であり（標準偏差を考慮に入れた）、細胞生存性が７５％を下回ることを示した。比較の遺伝子発現レベルに関して、ｍＲＮＡをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）キット（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ，フェアモント、ＣＡ）を用いてブランチ型ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に関して製造者の指示書に従って定量した。ＧＡＰＤＨ（ハウスキープ遺伝子）のｍＲＮＡのレベルをレファレンスとして使用した。 図１３ａ−ｃは、ｓｉＲＮＡの傷害性の配列依存性。ヒーラ細胞に、１３ａ：ＡＡＡ／ＵＵＵを含む機能性ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。モチーフを含むｓｉＲＮＡは、傷害性の顕著な影響を呈した。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施した）。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。 図１３ａ−ｃは、ｓｉＲＮＡの傷害性の配列依存性。ヒーラ細胞に、１３ｂ：ＧＣＣＡ／ＵＧＧＣを含む機能性ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。モチーフを含むｓｉＲＮＡは、傷害性の顕著な影響を呈した。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施した）。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。 図１３ａ−ｃは、ｓｉＲＮＡの傷害性の配列依存性。ヒーラ細胞に、１３ｃ：傷害性モチーフなしの機能性ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。モチーフを含むｓｉＲＮＡは、傷害性の顕著な影響を呈した。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施した）。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ａ：ｅＩＦ２Ｃ２／Ａｇｏ２ノックダウン実験において使用された実験手法のダイアグラム。「Ｔ１」及び「Ｔ２」はそれぞれ「トランスフェクション１」及び「トランスフェクション２」を表す。対照及び試験ｓｉＲＮＡを１０ｎＭにて各トランスフェクションにおいてトランスフェクトした。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。研究は、ＲＮＡｉ経路をｅＩＦ２Ｃ２ ｓｉＲＮＡにより無能化するなら、そのとき標的ｓｉＲＮＡの続く添加はそれらの標的を沈黙できないことを示す。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｂ−１４ｉ：ｅＩＦ２Ｃ２遺伝子産物がＲＮＡｉ経路を無能化することを示す対照実験（ｂ，ｄ，ｆ，及びｈ−ＥＧＦＰ発現レベルを描写する；ｃ，ｅ，ｇ，及びｉ−比較用ヘキスト３３３４２染色を示す）。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｊ：ｅＩＦ２Ｃ２ノックダウンのｓｉＲＮＡ傷害性に対する効果を示すグラフ。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｋ：傷害性ｓｉＲＮＡの２ヌクレオチド末端削除（１９マー→１７マー）のｓｉＲＮＡ傷害性に対する効果を示すグラフ。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 図１４ａ−ｌは、ＲＮＡｉ経路を通して介在するｓｉＲＮＡ誘導性の傷害性を例示する。１４ｌ：傷害性ｓｉＲＮＡの化学修飾がｓｉＲＮＡ傷害性に有する効果を示すグラフ。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 １４ｍ．修飾された形態及び未修飾の形態の３７のルシフェラーゼ標的配列の傷害性のレベルを示すグラフ。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 １４ｎ．修飾された形態及び未修飾の形態のルシフェラーゼ標的配列のサイレンシングのレベルを示すグラフ。傷害性の値は３つの別個の実験の平均を表す（各々３通り実施された）。エラーバーは平均からの標準偏差を描写する。レギュラーの顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて、細胞の形態と核の形態に対するデータを得た。生きている細胞は細胞透過性の核蛍光染料ヘキスト３３３４２（２マイクロｇ／ｍｌ，１５分間、３７℃において、モリキュラープローブ）により染色された。ライカＤＭＬ蛍光顕微鏡ＩｎｓｉｇｈｔＣＣＤカメラ及びＳＰＯＴ３．５ソフトウエアにより写真を撮った。 図１５は、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチル）オルソフォルミル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォルアミダイトを示す。Ｂは、ヌクレオシド塩基、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、又はウラシル；Ｚは、環外アミンのための保護基（Ａ及びＧに関してはイソブチリル及びＣに関してはアセチル）。 図１６は、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスフォルアミダイトを示す。Ｂは、ヌクレオシド塩基、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、又はウラシル；Ｚは、環外アミンのための保護基（Ａ及びＧに関してはイソブチリル及びＣに関してはアセチル）。 図１７は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ビス（２−シアノエチル）ホスフォルアミダイトを示す。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。結果は、発明の化学修飾の個々の二重鎖への添加が、一般に、オフターゲットの数を５０％又はそれ以上低下させることを示す（１８ａ，１８ｂ，１８ｄ，１８ｅを参照）。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。結果は、発明の化学修飾の個々の二重鎖への添加が、一般に、オフターゲットの数を５０％又はそれ以上低下させることを示す（１８ａ，１８ｂ，１８ｄ，１８ｅを参照）。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。発明のプーリングによる修飾の組み合わせが２倍より高く９０％にわたりダウン制御される遺伝子の数を低下させる（１８ｃ，１８ｆ）。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。結果は、発明の化学修飾の個々の二重鎖への添加が、一般に、オフターゲットの数を５０％又はそれ以上低下させることを示す（１８ａ，１８ｂ，１８ｄ，１８ｅを参照）。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。結果は、発明の化学修飾の個々の二重鎖への添加が、一般に、オフターゲットの数を５０％又はそれ以上低下させることを示す（１８ａ，１８ｂ，１８ｄ，１８ｅを参照）。 図１８は、シクロフィリンＢ（１８ａ−１８ｃ）又はＭＡＰ２Ｋ１（１８ｄ−１８ｆ）二重鎖及びプールにより処理されたヒーラ細胞から生じたヒートマップを未修飾形態及び修飾された形態において示す。「Ｎ」＝正常、未修飾。「ＯＴＰ」＝修飾。発明のプーリングによる修飾の組み合わせが２倍より高く９０％にわたりダウン制御される遺伝子の数を低下させる（１８ｃ，１８ｆ）。

Claims (5)

1. 二重鎖ｓｉＲＮＡであって、
   ａ．センス領域を含むセンス鎖であって、ここで当該センス領域は以下：
   ｉ．第１の５’センスヌクレオチド、ここで該第１の５’センスヌクレオチドは第１の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む；及び
   ｉｉ．第２の５’センスヌクレオチド、ここで該第２の５’センスヌクレオチドは第２の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む；
   を含む、前記センス鎖；ならびに
   ｂ．アンチセンス領域を含むアンチセンス鎖であって、ここで当該アンチセンス領域は、
   ｉ．第１の５’アンチセンスヌクレオチド、ここで該第１の５’アンチセンスヌクレオチドはリン酸化されている；及び
   ｉｉ．第２の５’アンチセンスヌクレオチド、ここで該第２の５’アンチセンスヌクレオチドは第３の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む；
   を含む、前記アンチセンス鎖；
   を含み、
   ここで、センス領域とアンチセンス領域は、１８−３０塩基対のヌクレオチドの二重鎖を形成することができ、該二重鎖の範囲全域で１００％の相補性を有し、そして、二重鎖内では、第１の５’センスヌクレオチドがセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチド（５’ ｍｏｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、第２の５’センスヌクレオチドが第１の５’センスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、第１の５’アンチセンスヌクレオチドがアンチセンス鎖のもっとも５’のヌクレオチドであり、そして第２の５’アンチセンスヌクレオチドが第１の５’アンチセンスヌクレオチドのすぐ下流に隣接しており、ここで第１の５’センスヌクレオチド、第２の５’センスヌクレオチド及び第２の５’アンチセンスヌクレオチド以外の二重鎖ｓｉＲＮＡの各鎖の各ヌクレオチドが２’−ＯＨを含む、前記二重鎖ｓｉＲＮＡ。
2. 第１の２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチルを含み、第２の２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチルを含み、そして第３の２’−Ｏ−アルキル修飾が２’−Ｏ−メチルを含む、請求項１記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
3. さらに、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に１から６塩基の３’突出を含む、請求項１記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
4. さらに、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に１から６塩基の３’突出を含む、請求項２記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
5. さらに、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に１から３塩基の３’突出を含む、請求項１記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。

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