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KR101916652B1 - 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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KR101916652B1
KR101916652B1 KR1020170081063A KR20170081063A KR101916652B1 KR 101916652 B1 KR101916652 B1 KR 101916652B1 KR 1020170081063 A KR1020170081063 A KR 1020170081063A KR 20170081063 A KR20170081063 A KR 20170081063A KR 101916652 B1 KR101916652 B1 KR 101916652B1
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rna
rna interference
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gene
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이동기
손다슬
김양희
Original Assignee
올릭스 주식회사
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Abstract

본 발명은 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)의 RNA 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 RNA 간섭효과 증진용 조성물, 및 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 함께 처리하는 siRNA의 유전자 발현 저해 효과를 증진시키므로 RNA 간섭 효과를 극대화 시킬 수 있는 장점이 있으며, 번거로움 없이 간단한 과정을 통해 이용할 수 있다. 또한, 상기 화합물은 국가지정 화합물 관리 유통 전담기관인 한국 화합물 은행에서 일차적으로 독성 검증을 끝낸 라이브러리로부터 선별된 것이므로 세포독성을 나타내지 않아 인체에 무해하고 안정한 장점이 있으며, 적은 양으로도 효과적인 RNA 간섭 효과를 나타내어 비용을 절감할 수 있다. 따라서 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 RNA 간섭에 기반을 둔 신약 개발의 상용화를 위해 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

작은 간섭 RNA의 RNA 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도{Compounds improving RNA interference of small interfering RNA and use thereof}
본 발명은 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)의 RNA 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 RNA 간섭효과 증진용 조성물, 및 증진 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 1998년 Andrew Fire와 Craig Mello에 의해 처음 발견되었으며, 2006년 노벨 생리의학상을 받은 현상이다. 이후 RNA 간섭에 기반을 둔 연구는 꾸준히 이루어지고 있어 생명 혹은 생물화학 분야의 큰 축으로 성장하고 있다.
RNA 간섭은 유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 현상으로, 이는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥 및 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 표적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 표적유전자의 발현을 억제한다. 또한, 생존을 위하여 필수적인 유전자부터 암 세포와 같은 특정세포의 성장에 관여하는 유전자에 이르기까지 표적유전자도 다양하여 여러 질환의 치료제로써도 활발히 연구 및 개발되고 있다.
이러한 RNA 간섭을 유도하는 siRNA(small interfering RNA; siRNA)는 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중나선 가닥을 말하는데, 이러한 siRNA를 이용한 효과적인 치료제 개발을 위해서는 여러 가지 해결해야할 문제점들이 남아 있다.
우선, siRNA는 혈청에 대한 안정성이 낮아 RNA 분해 효소에 의해 분해될 수 있다는 구조적인 불안정성의 문제를 지니고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 여러 화학적 변형을 가하는 연구들이 진행되어 왔으며, 예컨대 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond)을 도입하여 생체 내 분해속도를 조절하는 연구가 대표적이다(한국 등록특허, KR10-1390966). 그러나 이 또한 화학적 변형이 없는 siRNA에 비해 RNA 간섭 효능이 떨어지거나 표적 유전자와 특이적으로 결합하지 못하는 오류를 만들 수 있는 한계점을 지니고 있다. 또한, siRNA는 높은 음전하를 지니고 있어 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 그 자체만으로는 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 핵산분자의 음전하와 결합되는 다중양이온성 고분자가 이용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 세포 내 전달 효율은 증가되는 반면 높은 세포 독성과 추가적인 전달 과정이 필요하기 때문에 상용화 관점에서는 여전히 제한 요인이 되고 있다. 상기와 같은 이유로 다른 전달체의 도움 없이 siRNA의 화학 구조적 변이를 유도하여 핵산 물질 자체의 전달 효율을 높이기 위한 많은 연구가 수행되고 있다. 예컨대, RNA 합성 시 콜레스테롤을 접합시키거나 단백질과 결합체를 만들어 세포 내 도입을 높이고자 하는 시도를 하고 있지만 이 역시 화학 구조의 변화에 있어 제약을 갖는다.
한편, 이러한 제약을 극복하고자 스크리닝 방법을 이용하여 접근하는 시도가 이루어지고 있다. 스크리닝은 특정한 화학물질이나 생체 분자 등을 다수 중에서 선별하는 조작으로 실제로 다양한 종류의 스크리닝은 신약 개발에 쓰이고 있다. 이는 신약 개발 과정 초기 단계에서 다수의 후보물질을 확인하고 최적화시켜 연구 범위를 좁혀감으로 실패 가능성을 줄이고 신약 개발 후기 단계로 넘어갈 수 있도록 한다. 따라서 신약 선도 물질 발굴을 위한 분석 방법으로 효율적이라는 평가를 받고 있다. 실제로 다양한 리포터 유전자와 발현시스템을 이용하여 RNA 간섭에 영향을 미치는 화합물 라이브러리 스크리닝을 통해 최적화된 물질을 선별해내는 연구가 이루어지고 있고, 이는 기존 siRNA가 가진 문제점을 보완하기 위한 시도이지만 재현성과 효율성의 문제로 여전히 최적화된 물질을 찾는데 한계를 지니고 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 전달체 사용 없이 단독으로 세포 내 전달이 가능한 siRNA를 제작하였고, 상기 siRNA를 이용한 화합물 라이브러리 스크리닝을 통해 siRNA의 RNA 간섭효과 즉, 유전자 발현 억제능을 증진시킬 수 있는 화합물을 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 작은 간섭 RNA의 RNA 간섭효과 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 인체를 제외한 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 RNA 간섭효과 증진 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 RNA 간섭효과 증진용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017061487110-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 H 또는
Figure 112017061487110-pat00002
이고;
R2는 C1~C5 알킬,
Figure 112017061487110-pat00003
또는
Figure 112017061487110-pat00004
이고;
R3는 할로젠 또는
Figure 112017061487110-pat00005
이고;
R4는 C1~C5 알킬 또는
Figure 112017061487110-pat00006
일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 실니디핀(Cilnidipine), 니카디핀(Nicardipine), 니페디핀(Nifedipine), 및 암로디핀(Amlodipine)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 작은 간섭 RNA는 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 작은 간섭 RNA는 2' O-메틸(Methyl) 변형, 콜레스테롤(cholesterol) 접합, 및 포스포로티오에이트 결합(Phosphorothioate bond)으로 구성된 군데서 선택되는 하나 이상으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 작은 간섭 RNA는 세포전달체 없이 세포 내로 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 인체를 제외한 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 RNA 간섭효과 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의, RNA 간섭효과 증진 용도를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물을 siRNA와 함께 세포에 처리할 경우 적은 양의 siRNA로 더 높은 농도의 siRNA가 나타내는 유전자 침묵 효과를 나타냄을 관찰함으로써 상기 화합물이 표적 유전자의 발현을 효율적으로 억제시킬 수 있음을 확인하였는바, 본 발명에 따른 화합물은 함께 처리하는 siRNA의 유전자 발현 저해 효과를 증진시키므로 RNA 간섭 효과를 극대화 시킬 수 있는 장점이 있으며, 번거로움 없이 간단한 과정을 통해 이용할 수 있다. 또한, 상기 화합물은 국가지정 화합물 관리 유통 전담기관인 한국 화합물 은행에서 일차적으로 독성 검증을 끝낸 라이브러리로부터 선별된 것이므로 세포독성을 나타내지 않아 인체에 무해하고 안정한 장점이 있으며, 적은 양으로도 효과적인 RNA 간섭 효과를 나타내어 비용을 절감할 수 있다. 따라서 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 RNA 간섭에 기반을 둔 신약 개발의 상용화를 위해 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은, 본 발명에 따른 화학적으로 변형시킨 cp-asiRNA의 구조를 그림으로 도시한 것이다.
도 2는, 스크리닝을 통해 선별된 GFP 표적 cp-asiRNA인 cp-asiGFP13을 세포전달체 이용 없이 세포에 처리하고 배양했을 때의 GFP 유전자 침묵 효과를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은, GFP 표적 cp-asiRNA인 cp-asiGFP13을 세포전달체 이용 없이 세포에 처리하고 배양했을 때의 GFP 유전자 침묵 효과를 Image cytometry 및 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는, 유전자 침묵 효과를 증진시키는 화합물의 스크리닝 과정을 그림으로 도시한 것이다.
도 5는, 유전자 침묵 효과를 증진시키는 화합물의 1차 및 2차 스크리닝 결과와 이로부터 선별된 10개 화합물의 구조를 도시한 것이다.
도 6은, 도 5의 화합물 스크리닝 결과 공통된 구조를 갖는 3종류의 화합물 즉, Cilnidipine(실니디핀), Nicardipine(니카디핀), 및 Nifedipine(니페디핀)의 화학구조를 도시한 것이다.
도 7은, Cilnidipine(실니디핀), Nicardipine(니카디핀), 및 Nifedipine(니페디핀)의 세포독성을 검증하기 위해 MTT assay를 실시한 결과이다.
도 8은, Cilnidipine(실니디핀), Nicardipine(니카디핀), 및 Nifedipine(니페디핀)의 유전자 침묵 증진효과를 검증하기 위해, 상기 각각의 화합물을 cp-asiGFP와 함께 세포에 처리한 후 세포 내 GFP mRNA 발현수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도 9는, 화합물 스크리닝에 이용된 GFP가 아닌 다른 유전자에 대한 상기 화합물들의 유전자 침묵 증진효과를 검증하기 위해, Cilnidipine(실니디핀), Nicardipine(니카디핀), 및 Nifedipine(니페디핀) 각각을 cp-asisurvivin과 함께 세포에 처리한 후 세포 내 survivin mRNA 발현수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도10a 및 도 10b는, 유전자 침묵 증진효과가 가장 좋은 Cilnidipine(실니디핀) 화합물에 대해 cp-asiRNA의 농도를 바꿔가며 상대적인 mRNA 발현수준을 측정한 것으로, 각각 cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin을 처리하여 GFP(도 10a) 및 survivin(도 10b)의 발현수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도 11은, 유전자 침묵 효과를 향상시키는 화합물의 스크리닝 결과, Cilnidipine(실니디핀), Nicardipine(니카디핀), 및 Nifedipine(니페디핀)과 공통적인 구조를 갖는 추가적으로 선별된 Amlodipine(암로디핀)의 화학구조를 도시한 것이다.
도12a 및 도 12b는, Amlodipine(암로디핀) 화합물에 대해 cp-asiRNA의 농도를 바꿔가며 상대적인 mRNA 발현수준을 측정한 것으로, 각각 cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin를 처리하여 GFP(도 12a) 및 survivin(도 12b)의 발현수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
도 13은, 본 발명에 따른 화학적으로 변형시킨 cp-lasiRNA의 구조를 그림으로 도시한 것이다.
도 14a 및 도 14b는, Amlodipine(암로디핀)과 Cilnidipine(실니디핀) 화합물에 대해 cp-lasiCTGF의 농도를 달리하여 상대적인 mRNA 발현수준을 측정한 것으로, 상기 cp-lasiCTGF와 함께 각각 Amlodipine(도 14a)및 Cilnidipine(도 14b)을 농도별로 처리한 후 CTGF mRNA의 발현수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 siRNA와 함께 세포에 처리하였을 때 siRNA에 의한 유전자 발현 억제 효과가 증진됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 RNA 간섭효과 증진용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017061487110-pat00007
상기 화학식 1에서,
R1은 H 또는
Figure 112017061487110-pat00008
이고;
R2는 C1~C5 알킬,
Figure 112017061487110-pat00009
또는
Figure 112017061487110-pat00010
이고;
R3는 할로젠 또는
Figure 112017061487110-pat00011
이고;
R4는 C1~C5 알킬 또는
Figure 112017061487110-pat00012
일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 화합물은 실니디핀(Cilnidipine), 니카디핀(Nicardipine), 니페디핀(Nifedipine), 및 암로디핀(Amlodipine)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 실니디핀(Cilnidipine; 3-(E)-3-Phenyl-2-propenyl 5-2-methoxyethyl 2,6-dimethyl-4-(m-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate)은 칼슘 채널 차단제로써 소동맥 및 세맥을 확장시키는 작용을 하여 고혈압 개선 및 치료용 약물로 이용되고 있다. 실니디핀의 화학구조는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112017061487110-pat00013
상기 니카디핀(Nicardipine; 2-[benzyl(methyl)amino]ethylmethyl-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate)은 실니디핀과 마찬가지로 칼슘 채널 차단제로써 고혈압 및 협심증 치료 약물로 이용되고 있으며, 화학구조는 하기와 같다.
Figure 112017061487110-pat00014
상기 니페디핀(Nifedipine; 3,5-dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate)은 협심증, 고혈압, 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 조기분만 등의 개선 및 치료용 약물로 이용되고 있으며, 니페디핀의 화학구조는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112017061487110-pat00015
상기 암로디핀(Amlodipine; (RS)-3-ethyl 5-methyl 2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-chlorophenyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate)은 지속성 작용성의 칼슘 채널 차단제로써 고혈압과 협심증 치료에 이용되는 약물이다. 암로디핀은 다른 칼슘 통로 차단제들과 마찬가지로 동맥벽의 평활근을 이완시키며, 총말초저항을 줄여 혈압을 낮추고, 협심증에서는 심근으로 흐르는 혈류를 증가시키는 작용을 한다. 암로디핀의 화학구조는 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure 112017061487110-pat00016
본 발명에서 사용되는 용어, “RNA 간섭(RNA interference; RNAi)”이란 이중가닥의 RNA가 그 염기서열에 특이적으로 mRNA를 분해하여 결과적으로 해당 유전자의 발현을 억제하는 현상 즉, 해당 유전자를 침묵(silencing) 시키는 것을 의미한다. RNA 간섭은 유전자 발현을 강하게 억제할 수 있어 간편하고 효과적인 유전자 발현 억제기법의 하나로 많이 이용되고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥 및 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료법(gene therapy)으로 제공된다.
본 발명에 있어서, 작은 간섭 RNA는 화학적으로 변형된 것으로 양이온성 폴리머, 지질, 세포투과성 펩타이드, 및 세포 표적 리간드와 같은 세포 전달체의 사용 없이 세포 내로 도입이 가능하다. 상기 siRNA의 화학적 변형은 바람직하게는 2' O-메틸(Methyl) 변형, 콜레스테롤(cholesterol) 접합, 또는 포스포로티오에이트 결합(Phosphorothioate bond) 등의 화학적 변형이 가해진 것으로 도 1 또는 도 13으로 도시된 변형된 구조의 siRNA를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기와 같은 화학적 변형이 가하여 세포 전달체의 도움 없이 세포 내로의 도입이 가능한 siRNA를 제작하였고, 이를 이용해 siRNA의 유전자 발현 억제효과를 증진시킬 수 있는 화합물을 스크리닝하여 최종적으로 4종의 공통된 구조를 갖는 화합물을 선별하였다.
본 발명의 일실시예에서는, GFP 또는 survivin 유전자를 표적으로 하는 화학적 변형을 가한 cp-asiRNA 즉, cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin을 제작하였고(실시예 1 참조), cp-asiGFP를 이용해 상기 siRNA가 별도의 트랜스펙션 시약과 같은 전달체 없이 세포에 처리하여 배양함으로써 세포 내로 도입되어 GFP 유전자의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 한국 화합물 은행에서 제공받은 다양한 화합물 라이브러리의 화합물과 cp-asiGFP를 세포에 함께 처리하고 GFP mRNA의 발현량을 측정하는 방법으로 1차 및 2차 스크리닝을 실시하여 최종적으로 공통된 구조를 가지는 4종류의 화합물 즉, Cilnidipine, Nicardipine, Nifedipine, 및 Amlodipine을 선별하였다(실시예 3 및 5 참조). 또한, 상기 화합물에 대하여 cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin을 농도를 다르게 처리하여 각 화합물에 의한 유전자 발현 억제 증진효과를 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 cp-asiRNA의 유전자 발현 저해능을 더욱 향상시키고자 추가적으로 cp-lasiRNA을 디자인하였으며 CTGF 유전자를 특이적으로 타겟하는 cp-lasiCTGF를 합성하여 상기 Amlodipine 또는 Cilnidipine과 함께 세포에 처리하였을 때 유전자 발현 저해능이 증진되는지 검증하였다. 그 결과, 상기 화합물들의 처리농도에 비례하여 CTGF mRNA의 발현량이 현저히 감소하였으며 이러한 효과는 cp-lasiCTGF의 처리농도에 비례하여 나타나는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 4종의 화합물은 다양한 종류의 유전자에 대하여 siRNA의 RNA 간섭효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. siRNA 디자인
본 발명에 따른 혈청에 대한 안전성을 높이고 siRNA 전달체의 도움 없이 세포 내 도입이 가능하도록 화학적 변형을 가한 cp-asiRNA를 제작하기 위해, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 각각 GFP 또는 survivin을 특이적으로 타겟하는 siRNA를 합성하였으며, 표 1의 화학적 변형 기호에 대한 설명을 표 2에 나타내었고, 도 1에 상기 변형된 cp-asiRNA의 구조를 나타내었다. 도 1에서 각각 Modification 1은 O-메틸(Methyl) RNA를, modification 2는 콜레스테롤(cholesterol)을, modification 3은 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond) RNA를 의미한다.
siRNA 방향 서열 서열
번호
cp-asiGFP sense 5’-mAUmGGmCAmUCmAAmGGmUG*mA*A* chol-3’ 1
antisense 5’-UUCACCUUGAUGCCmAmUmU*mC*mU*mU*mG -3’ 2
cp-asisurvivin sense 5’-mCAmUGmACmUUmGUmGUmGU*mG*A* chol-3’ 3
antisense 5’-UCACACACAAGUCAmUmGmC*mA*mU*mC*mU-3’ 4
표기법 도입된 화학적 변형
* 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond)
m 2'-O-메틸(Metyl)
chol 콜레스테롤
실시예 2. siRNA 기능 검증
2-1. qRT-PCR
상기 실시예 1에서 제작한 cp-asiRNA가 전달체의 도움 없이 정상적으로 세포 내에서 타겟 유전자의 발현을 저해하는지 검증하고자 하였다. 이를 위해, 스크리닝을 통해 선별된 GFP를 표적으로 하는 cp-asiRNA인 cp-asiGFP13을 GFP를 발현하는 HeLa-GFP 세포에 전달체 없이 처리하고 배양하거나 트랜스펙션 시약(transfection reagent)을 이용해 트랜스펙션 시킨 뒤 real time PCR을 실시하여 표적유전자인 GFP의 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
보다 구체적으로, HeLa-GFP 세포주를 100 mm 페트리디쉬에 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하여 증식시킨 후세포를 12웰 플레이트에 웰 당 6×104 개씩 분주하였다. 한편, 상기 cp-asiGFP13의 경우 95℃에서 5분, 37℃에서 20분 동안 배양하여 어닐링(annealing)하였고, 대조군으로 사용된 트랜스팩션(TF) 조건에서는 추가적으로 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(Invitrogen)을 첨가하여 진행하였다. 준비된 RNA를 Opti-MEM reduced serum media(Gibco)와 함께 상기 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하고, DMEM(10% FBS) 배양배지로 바꿔주어 다시 24시간 동안 배양한 후 Isol-RNA Lysis Reagent kit(5 Prime)를 이용하여 상기 세포로부터 total RNA를 추출하였다. 다음으로, 상기 추출된 RNA를 주형으로 하여 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용해 cDNA를 합성하였다. 이후 상기 cDNA에 대하여 Step One real-time PCR system(Applied Biosystems)으로 qRT-PCR(quantitative reverse transcription real time polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 유전자인 GFP의 발현 수준을 분석하였다. 이 때 GFP 유전자의 mRNA 정도는 항존 유전자(housekeeping gene)인 Tubulin 유전자의 mRNA 발현정도로 나누어 상대적인 값을 표기했고, 실험에 사용된 primer의 염기서열은 하기 표 3에 나타내었다.
유전자 방향 서열 서열번호
GFP Forward 5’-GGTCACGAAGCCGAAGTAGA-3’ 5
Reverse 5’-ACCAGCAGAATACCCCCATC-3’ 6
Tubulin Forward 5’-GACCAAGCGTACCATCCAGT-3’ 7
Reverse 5’-CACGTTTGGCATACATCAGG-3’ 8
실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, cp-asiGFP13을 전달체 도움 없이 세포에 트랜스펙션 시킨 경우(IB), siRNA 처리 농도에 비례하게 GFP 유전자의 mRNA 발현을 저해함으로써 유전자 침묵 효과를 나타냄을 확인하였다.
2-2. Image cytometry 및 형광현미경 관찰
상기 실시예 2-1의 결과에 더하여, Image cytometry를 통해 cp-asiGFP13이 전달체의 도움 없이 세포 내로 전달되어 작용함을 다시 한 번 검증하였다. 이를 위해, HeLa-GFP 세포를 DMEM(10% FBS) culture medium를 이용하여 6웰 플레이트에 웰 당 1×105 개씩 분주하였다. 한편, 녹색 형광을 나타내는 GFP 유전자를 표적으로 하는 cp-asiGFP13은 95℃에서 5분, 37℃에서 20분 동안 배양하여 어닐링한 후 Opti-MEM reduced serum media(Gibco)와 함께 상기 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하고, DMEM(10% FBS) 배양배지로 바꿔주어 다시 48시간 동안 배양하였다. 이후 10 ㎍/㎖ 농도의 Hoechst 33342 염색시약을 세포에 처리하고 15-20분 동안 배양하고, Trypsin-EDTA를 이용해 세포를 플레이트로부터 떼어낸 후 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지를 이용해 재현탁시킨 후 Nucleocounter NC-3000(Chemometec)을 이용하여 분석하였다.
또한, confocal imaging dishes(SPL)에 HeLa-GFP 세포를 5×104 개씩 분주한 후 cp-asiGFP13을 상기와 같은 방법으로 세포에 처리하여 배양하였다. 다음으로 세포의 배지를 제거하고 세포바깥의 형광을 없애기 위해 trypan(0.02%)이 포함된 PBS 용액을 이용해 세포를 씻어준 후 세포 내 GFP 세기를 Fluorescence microscope (Olympus IX-81)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, cp-asiGFP13을 전달체의 도움 없이 세포에 처리하여 배양(IB)하였을 때, siRNA를 처리하지 않은 경우에 비하여 GFP 형광 단백질이 감소하는 것을 Image cytometry 및 형광현미경 관찰을 통해 확인하였다. 상기 결과는 화학적으로 변형시킨 cp-asiGFP13이 전달체의 도움 없이 세포 내로 도입되어 유전자 침묵 효과를 나타냄을 의미한다.
실시예 3. 화합물 라이브러리 스크리닝을 통한 유전자 침묵 효과를 향상시키는 화합물의 선별
3-1. 화합물 라이브러리 스크리닝 방법
96 웰 플레이트에 HeLa-GFP 세포를 웰 당 4000개씩 분주하고, GFP 유전자를 표적으로 하는 cp-asiGFP13을 Opti-MEM reduced serum media(Gibco)과 함께 상기 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하고, DMEM(10% FBS) 배양배지로 바꿔주어 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세포를 씻어준 후 lysis buffer(25 mM Tris-phosphate(pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N´,N´-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton￠c X-100)를 처리하여 세포를 떼어내어 96웰 플레이트(OptiPlate-96 Black, Black Opaque 96-well Microplate)로 옮겨 Victor X2(PerkinElmer)로 세포 내 상대적인 GFP 형광 세기를 측정하였다. 이 때 Lmap filter는 F485-slotA5, emission filter는 F535-slot A5를 사용하였다. 상기 스크리닝 과정은 도 4에 그림으로 도시하였다.
3-2. 유전자 침묵 효과를 향상시키는 화합물 선별
상기 실시예 3-1의 방법에 따라 세포 내 GFP 유전자의 발현을 저해하는 cp-asiGFP13의 유전자 침묵 효과를 향상시키는 화합물을 선별하기 위해, 1차 및 2차 스크리닝을 통해 도 5에 나타낸 바와 같이 10개의 화합물을 선별하였다. 나아가 상기 10개의 화합물 중 공통된 구조를 지닌 3개의 화합물(Cilnidipine, Nicardipine, Nifedipine)을 선별하였고, 상기 3종류 화합물의 구조를 도 6에 나타내었다.
3-3. 선별된 화합물의 세포독성 검증
상기 실시예 3-1 및 3-2의 과정을 통해 선별된 3종류의 화합물(Cilnidipine, Nicardipine, Nifedipine)이 세포독성을 유발하는지 검증하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 이를 위해, 96 웰 플레이트에 HeLa 세포주를 웰 당 4000개씩 분주하고 DMEM(10% FBS) 배양배지를 이용해 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 상기 각각의 화합물을 Opti-MEM reduced serum media(Gibco)와 함께 상기 세포에 농도별(0.1, 1, 10, 100 μM)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후 DMEM(10% FBS) 배양배지로 갈아주고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT assay를 실시하기 위해 MTT 시약(50 ㎍)을 세포에 처리하고 생성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystals)을 녹인 후 microplate reader를 이용해 각 샘플의 흡광도를 570 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 Cilnidipine, Nicardipine, 및 Nifedipine 화합물을 세포에 처리하였을 때 LD50은 각각 7.40, 16.05, 및 28.76 μM로 나타났다. 상기 결과를 통해 세포에 독성을 거의 유발하지 않는 상기 화합물들의 적정 농도를 선택하고 선택된 농도 범위 안에서 상기 화합물들의 유전자 침묵 증진효과를 검증하였다.
실시예 4. 선별 화합물의 유전자 침묵 증진효과 검증
4-1. Cilnidipine, Nicardipine, 및 Nifedipine의 유전자 침묵 증진효과 검증
상기 실시예 3에서 선별한 3종류의 화합물(Cilnidipine, Nicardipine, 및 Nifedipine)이 실제로 cp-asiRNA의 유전자 침묵 효과를 향상시킬 수 있는지 검증하고자 하였다. 이를 위해, HeLa-GFP 세포를 12 웰 플레이트에 웰 당 6×104 개씩 분주하고, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 cp-asiGFP를 세포에 처리하여 배양하였다. 단, siRNA를 어닐링한 후 상기 화합물 각각을 농도별(1, 3, 5 μM)로 함께 세포에 처리하였다. 이후 실시예 2-1과 동일한 방법으로 세포로부터 total RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이로부터 qRT-PCR을 수행하여 GFP의 mRNA 발현수준을 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, cp-asiGFP만을 처리한 경우에 비하여 상기 화합물과 함께 처리한 경우 GFP mRNA의 발현량이 감소하였으며, 특히 Cilnidipine을 처리한 경우 처리 농도에 비례하여 가장 좋은 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
나아가 상기 결과를 다시 한 번 검증하기 위해, GFP를 표적하는 cp-asiGFP가 아닌, 실시예 1에서 제작한 암세포 성장과 증식에 관여하는 survivin 유전자를 표적으로 하는 cp-asisurvivin을 이용해 동일한 실험을 수행하였다. 이 때 사용한 survivn에 대한 primer는 하기 표 4에 나타내었다.
유전자 방향 서열 서열번호
survivin Forward 5'-GCACCACTTCCAGGGTTTAT-3' 9
Reverse 5'-CTCTGGTGCCACTTTCAAGA-3' 10
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3의 스크리닝에서 사용된 GFP 유전자가 아닌 다른 유전자를 표적으로 하는 cp-asiRNA를 이용하는 경우에도 상기 각 화합물이 cp-asisurvivin만 단독으로 처리한 경우에 비하여 survivin mRNA의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 상기 결과와 마찬가지로 3종류의 화합물 중에서 Cilnidipine에서 가장 좋은 효과가 나타남을 관찰하였다.
종합적으로, 상기 결과들은 본 발명에 따른 Cilnidipine, Nicardipine, 및 Nifedipine 화합물, 특히 Cilnidipine이 cp-asiRNA에 의한 유전자 침묵 효과를 증진시킬 수 있음을 의미한다.
4-2. Cilnidipine 화합물의 유전자 침묵 증진효과 재검증
상기 실시예 4-1을 통해 유전자 침묵 증진효과가 가장 좋은 것으로 확인된 cilnidipine 화합물에 대하여 cp-asiRNA의 농도를 바꾸어가며 상대적인 mRNA 발현수준을 qRT-PCR로 확인하였다. 보다 구체적으로, cp-asiRNA는 cp-asiGFP(50, 250 nM) 및 cp-asisurvivin(0.5, 1 μM)을 모두 이용하였으며, 각각 GFP를 발현하는 HeLa-GFP 세포 및 일반 HeLa 세포에서 GFP 및 survivin mRNA의 발현수준을 측정하였다. 상기 화합물은 각 cp-asiRNA에 대하여 0, 1, 3, 5 μM 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin을 처리한 경우 모두 cilnidipine의 처리농도에 비례하게 GFP 및 survivin mRNA의 발현량이 감소하였으며, 또한 처리한 cp-asiRNA의 농도가 높을수록 각 mRNA의 발현량이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 추가 선별 화합물 및 이의 유전자 침묵 증진효과 검증
상기 실시예 3에서 최종 선별된 공통적인 구조를 갖는 3종류의 화합물인 Cilnidipine, Nicardipine, 및 Nifedipine 이외에, 이들 화합물과 공통적인 구조를 갖는 새로운 화합물인 Amlodipine를 추가적으로 선별하였으며, 상기 화합물의 구조는 도 11에 도시하였다.
이에 더하여, Amlodipine가 상기 화합물들과 공통적인 구조를 갖는 화합물인 만큼 유전자 침묵 증진효과를 나타내는지 검증하였다. 이를 위해, 상기 실시예 4-2의 실험방법과 유사하게 Amlodipine에 대해 cp-asiGFP(50, 100, 250 nM) 및 cp-asisurvivin(0.3, 0.5, 1 μM)의 농도에 따른 상대적인 GFP 및 survivin mRNA의 발현수준을 qRT-PCR로 측정하였다.
그 결과, 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, cp-asiRNA와 함께 Amlodipine를 처리한 경우 상기 화합물의 처리농도에 비례하여 GFP 및 survivin mRNA의 발현량이 현저히 감소하였으며, 이러한 유전자 침묵 증진효과는 처리한 cp-asiGFP 및 cp-asisurvivin의 농도에 비례하여 나타나는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 추가 siRNA 디자인 및 이의 유전자 침묵 증진효과 검증
상기 실시예 1에서 디자인한 cp-asiRNA의 유전자 발현 저해능을 향상시키기 위해, 구조 변화와 추가적인 화학적 변형을 가한 cp-lasiRNA를 제작하였다. 보다 상세하게, CTGF를 특이적으로 타겟하도록 합성한 siRNA 서열을 하기 표 5에 나타내었고, 상기 표 5에서 화학적 변형 기호는 상기 표 2와 동일하며, 도 13a에 상기 변형된 cp-lasiRNA의 구조를 그림으로 나타내었다. 도 13에서 각각 Modification 1은 2’ O-Methyl RNA를, modification 2는 콜레스테롤(cholesterol)을, modification 3은 phosphorothioated RNA를 의미한다.
siRNA 방향 서열 서열
번호
cp-lasiCTGF sense 5-mCUmUAmCCmGAmCUmGGmAA*mG*A*chol-3 11
antisense 5-UCUUCCAGUCGGUAmAmGmCmCmGmCmGmAmGmGmGmCmAm*mG*mG*mC*mC-3 12
추가적으로 합성한 cp-lasiRNA에 대하여, 상기 실시예 4 및 5를 통해 유전자 침묵 증진효과가 좋은 것으로 확인된 Amlodipine과 Cilnidipine을 함께 처리하는 경우 cp-lasiRNA를 단독으로 처리하는 경우에 비하여 타겟인 CTGF mRNA의 발현 저해효과가 증진되는지 검증하고자 하였다. 이때, 사용한 CTGF에 대한 프라이머 서열은 하기 표 6에 나타내었다.
유전자 방향 서열 서열번호
CTGF Forward 5'-CAAGGGCCTCTTCTGTGACT-3' 13
Reverse 5'-CCGTCGGTACATACTCCACA-3' 14
이를 위해, 상기 실시예 4-1 및 4-2의 실험방법과 유사하게, 세포에 cp-lasiCTGF를 농도별(0.01, 0.03, 0.1 μM)로 처리하였고, 이때 상기 siRNA를 어닐링한 후 Amlodipine과 또는 Cilnidipine을 농도별(0, 1, 3, 10 uM)로 함께 처리하였다. 이후 실시예 2-1과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 실시하여 상기 siRNA 처리에 따른 상대적인 CTGF mRNA의 발현수준을 측정하였다.
그 결과, 도 14a 및 도 14b에 나타낸 바와 같이, cp-lasiCTGF와 함께 Amlodipine 또는 Cilnidipine을 처리한 경우 상기 화합물의 처리농도에 비례하여 CTGF mRNA의 발현량이 현저히 감소하였으며, 이러한 유전자 침묵 증진효과는 cp-lasiCTGF의 처리 농도에 비례하여 나타나는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 유전자 발현 억제 효과 증진용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112018054739618-pat00017

    상기 화학식 1에서,
    R1은 H 또는
    Figure 112018054739618-pat00018
    이고;
    R2는 C1~C5 알킬,
    Figure 112018054739618-pat00019
    또는
    Figure 112018054739618-pat00020
    이고;
    R3는 할로젠 또는
    Figure 112018054739618-pat00021
    이고;
    R4는 C1~C5 알킬 또는
    Figure 112018054739618-pat00022
    인 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 실니디핀(Cilnidipine), 니카디핀(Nicardipine), 니페디핀(Nifedipine), 및 암로디핀(Amlodipine)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 작은 간섭 RNA는 화학적으로 변형된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 작은 간섭 RNA는 2' O-메틸(Methyl) 변형, 콜레스테롤(cholesterol) 접합, 및 포스포로티오에이트 결합(Phosphorothioate bond)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 변형된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 작은 간섭 RNA는 세포전달체 없이 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항의 조성물을 인체를 제외한 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)의 유전자 발현 억제 효과 증진 방법.
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