KR102240833B1 - let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 이용한 골분화 억제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는 골분화 억제 방법에 관한 것으로, 상기 방법에 의할 경우 골모세포의 분화능이 현저히 떨어지는 것을 확인하였는바, 골분화 조절이 되지 않아 발병되는 뼈 또는 혈관의 석회화, 골육종암 등의 질병의 치료기술로써 본 발명을 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는, 골분화 억제 방법에 관한 것이다.
세포밖 소포(Extracellular vesicles, EVs)는 체내를 순환하는 나노크기(40-150nm)의 세포막 소체로 진핵세포의 엑소좀을 포함하는 개념이며, 세포간 신호전달 분자를 전달하는 기능이 있다. 상기 "엑소좀(exosomes)"이라는 용어는 다중 소관체 (multivesicular bodies, MVBs)의 엑소사이드 소포를 나타내는데 널리 사용되며 다른 소포는 막입자(membrane particle), 엑토좀(ectosomes), 엑소베시클(exovesicles), 나노파티클(nanoparticle) 및 마이크로소포(microvesicle) 등의 다양한 이름으로 알려져 있다.
일단 엑소좀이 체액으로 분비되면 표적세포막과의 융합 또는 엔도사이토 시스(endocytosis)를 통해 표적 세포에서 순환 및 내부화 되어 그 내용물을 전달하고 전달받은 세포를 조절할 수 있다. 이러한 기능은 엑소좀을 자연적인 전신 전달 도구로 만들고, 세포질 단백질과 RNA는 MVB에서 생성된 엑소좀과 융합되어 엑소좀 내에서 분비될 수 있다. 엑소좀은 단백질, 지질, 전령 RNA, 마이크로 RNA (miRNAs)를 포함한 다양한 분자를 함유하고 있기 때문에, 치료에 있어서 생체 적합 물질로 가장 잘 알려져 있다.
상기 miRNA의 조절 기능은 세포에서의 많은 역할 때문에 생물학의 모든 분야에서 집중적으로 연구되고 있으며, 이러한 종류의 작고 비 암호화된 RNA는 발달, 분화, 종양 형성 및 많은 유전병을 포함한 거의 모든 생물학적 사건에 관여한다. 따라서, 엑소멀(exosomal) miRNA는 암뿐만 아니라 다양한 신경계 및 감염성 질환에 대한 바이오마커 및 진단 도구로 사용되며 또한, 엑소멀 miRNA의 세포간 신호 전달 분자로서의 기능이 제안되어왔다.
한편, 수천 개의 miRNA 유전자 중에서 let-7은 첫번째로 발견된 유전자 중 하나이며, let-7 패밀리는 다양한 종에 걸쳐서 시퀀스 및 기능이 높게 보존되어 있다. 동물에서 let-7은 정상적인 발달 및 암 발달의 핵심 조절자 역할을 하며, 쥐(murine)의 let-7 패밀리는 8개의 유전자 좌위(genomic loci)로부터 발현된 12개의 성숙한 서브타입(동일한 seed 시퀀스를 공유함)으로 구성된다.
엑소좀과 let-7 miRNA는 PI3K/Akt 신호 전달 캐스케이드(cascade)를 활성화시킴으로써, 마우스의 골재생에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며 중간엽줄기세포 유래 엑소좀은 골다공증성 래트(rat)에서 골형성을 향상시킨다. 골세포의 분화과정은 골모세포 특이적인 유전자의 발현을 엄격히 조절하는 복잡한 신호 경로를 따른다. 다만, 골모세포 분화에 대한 엑소좀 miRNA의 효과 및 이를 이용한 천연의 생체 물질 엑소좀을 유전적으로 조작함으로써 골형성을 조절하는 기술에 대한 연구는 부족한 실정이다.
본 발명자들은 활발히 증식하는 골모세포의 엑소좀에서 let-7 패밀리에 속하는 miRNA들이 많이 포함되고 있음을 확인하였고, 골모세포에서 엑소좀 분비를 억제하였을 경우 현격하게 골모세포의 분화가 억제 되는 것을 밝혔다. 이에 더하여, 상기 분화 억제는 골모세포에서 분비되는 엑소좀 내의 miRNA 중 let-7 에 기인한 것으로 확인되었고, 엑소좀 내의 let-7을 억제하는 물질을 엑소좀에 주입하여 이를 골모세포에 처리한 후 분화를 유도한 결과, 그 분화능이 현저히 떨어지는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은, (a) 골모세포(osteoblast)로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 분리한 엑소좀에 let-7 억제제를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는, 골분화 억제 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 골모세포(osteoblast)로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 분리한 엑소좀에 let-7 억제제를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는, 골분화 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 let-7은 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 let-7은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 억제제는 상기 let-7에 특이적으로 결합하는 핵산분자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산분자는 RNA(Ribonucleic acid), DNA(deoxyribonucleic acid), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), 안타고미르(antagomir), siRNA(small interfering RNA), miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 억제제는 골형성 인자의 발현을 억제 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 골형성 인자는 오스테오칼신(osteocalcin), 콜라겐 타입1 알파(Col1a), 렁스2(RunX2) 및 오스테릭스(OSX)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다.
let-7 억제제를 엑소좀에 도입한 다음, 상기 엑소좀을 골모세포에 처리하여 분화를 유도한 결과 골모세포의 분화능이 현저히 떨어지는 것을 확인하였는바, 본 발명은 골분화 조절이 되지 않아 발병되는 뼈 또는 혈관의 석회화 혹은 무기질화, 골육종암 등의 질병의 치료방법으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 엑소좀 방출 억제제(SPI)의 효과 확인을 위해 수행한 유세포 분석기를 이용한 엑소좀 정량 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 엑소좀 방출 억제제(SPI) 처리 후 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 측정한 결과이다.
도 1c는 엑소좀 방출 억제제(SPI)만 처리한 경우 및 엑소좀 방출 억제제(SPI)와 성장 배지에서 얻어진 엑소좀을 함께 처리한 경우를 비교한 결과이다.
도 1d는 다른 종류의 엑조좀 방출 억제제(GW4869)를 처리한 경우 ALP 활성을 측정한 결과이다.
도 1e는 qRT-PCR(quantitative Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)을 통해 엑소좀 방출 억제제(SPI)만 처리한 경우 및 엑소좀 방출 억제제(SPI)와 성장 배지에서 얻어진 엑소좀을 함께 처리한 경우 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN)의 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 2a 및 2b는 MC3T3-E1 세포에서 추출한 엑소좀 miRNA의 RNA-Seq을 수행한 결과를 그래픽으로 나타낸 것이다.
도 2c는 GM(growth medium) 및 OM(osteogenic medium)의 엑소좀에서 let-7 패밀리의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 2d는 GM(growth medium) 및 OM(osteogenic medium)에서 MC3T3-E1 세포로부터 얻어진 let-7 패밀리의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 3a는 MC3T3-E1 세포에서 let-7 패밀리 발현의 세포 수준을 조건을 달리하여 측정한 결과이다.
도 3b는 let-7 유사체(mimic)을 처리한 경우 골형성 인자들의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 3c는 let-7 안타고미르(antagomir)를 처리한 경우 골형성 인자들의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4a는 let-7 억제제가 형질감염된 엑소좀(at-exo)의 제조방법을 간략히 나타낸 것이다.
도 4b는 엑소좀의 전기천공(electroporation) 전, 후 전자 현미경을 통해 엑소좀의 물리적 변화 여부를 관찰한 결과이다.
도 4c는 본 발명의 엑소좀의 주요 크기 분획을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4d는 스피로에폭사이드와 함께 at-exo로 처리한 MC3T3-E1 세포에서는 ALP 측정 결과 분화 회복능력이 손상되었음을 확인한 사진이다.
도 4e는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 골형성 유전자 (OCN, Col1a, RunX2 및 OSX)의 발현을 비교한 것이다(GC-exo : 성장조건배지에서의 엑소좀).
도 4f는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 면역형광염색 및 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 사진이다.
도 5a는 let-7 유사체 또는 let-7 안타고미르를 처리한 경우 Lin28의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 5b는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 Lin28의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명인 let-7 억제제가 형질감염된 엑소좀을 이용한 골분화 억제방법의 내용을 간략히 요약한 것이다.
도 1b는 엑소좀 방출 억제제(SPI) 처리 후 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 측정한 결과이다.
도 1c는 엑소좀 방출 억제제(SPI)만 처리한 경우 및 엑소좀 방출 억제제(SPI)와 성장 배지에서 얻어진 엑소좀을 함께 처리한 경우를 비교한 결과이다.
도 1d는 다른 종류의 엑조좀 방출 억제제(GW4869)를 처리한 경우 ALP 활성을 측정한 결과이다.
도 1e는 qRT-PCR(quantitative Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)을 통해 엑소좀 방출 억제제(SPI)만 처리한 경우 및 엑소좀 방출 억제제(SPI)와 성장 배지에서 얻어진 엑소좀을 함께 처리한 경우 오스테오칼신(Osteocalcin, OCN)의 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 2a 및 2b는 MC3T3-E1 세포에서 추출한 엑소좀 miRNA의 RNA-Seq을 수행한 결과를 그래픽으로 나타낸 것이다.
도 2c는 GM(growth medium) 및 OM(osteogenic medium)의 엑소좀에서 let-7 패밀리의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 2d는 GM(growth medium) 및 OM(osteogenic medium)에서 MC3T3-E1 세포로부터 얻어진 let-7 패밀리의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 3a는 MC3T3-E1 세포에서 let-7 패밀리 발현의 세포 수준을 조건을 달리하여 측정한 결과이다.
도 3b는 let-7 유사체(mimic)을 처리한 경우 골형성 인자들의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 3c는 let-7 안타고미르(antagomir)를 처리한 경우 골형성 인자들의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 4a는 let-7 억제제가 형질감염된 엑소좀(at-exo)의 제조방법을 간략히 나타낸 것이다.
도 4b는 엑소좀의 전기천공(electroporation) 전, 후 전자 현미경을 통해 엑소좀의 물리적 변화 여부를 관찰한 결과이다.
도 4c는 본 발명의 엑소좀의 주요 크기 분획을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4d는 스피로에폭사이드와 함께 at-exo로 처리한 MC3T3-E1 세포에서는 ALP 측정 결과 분화 회복능력이 손상되었음을 확인한 사진이다.
도 4e는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 골형성 유전자 (OCN, Col1a, RunX2 및 OSX)의 발현을 비교한 것이다(GC-exo : 성장조건배지에서의 엑소좀).
도 4f는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 면역형광염색 및 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸 사진이다.
도 5a는 let-7 유사체 또는 let-7 안타고미르를 처리한 경우 Lin28의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 5b는 GC-exo 또는 at-exo를 처리한 경우 Lin28의 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명인 let-7 억제제가 형질감염된 엑소좀을 이용한 골분화 억제방법의 내용을 간략히 요약한 것이다.
본 발명자들은 활발히 증식하는 골모세포의 엑소좀에서 let-7 패밀리에 속하는 miRNA들이 많이 포함되고 있음을 확인하였고, 골모세포에서 엑소좀 분비를 억제하였을 경우 현격하게 골모세포의 분화가 억제 되는 것을 밝혀냈으며 이는 골모세포에서 분비되는 엑소좀 내의 miRNA 중 let-7 때문인 것을 확인하였는바 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 골모세포에서 유래한 엑소좀이 MC3T3-E1 세포에서 조기 골형성에 영향을 미친다는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, OM으로부터 수득한 엑소좀의 경우 GM에서의 엑소좀에 비해 let-7 패밀리의 발현 수준이 감소함을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, let-7 발현은 OSX와 같은 골형성 유전자의 발현을 증가시켰고, let-7 억제제(antagomir)는 골형성 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 miRNA 억제제가 엑소좀에 성공적으로 적재될 뿐만 아니라 이를 골모세포에 처리하는 경우 let-7 패밀리의 기능을 불활성화 시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, at-exo가 let-7을 억제한 결과 Lin28의 상대적 발현 양이 증가됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 골모세포(osteoblast)로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 분리한 엑소좀에 let-7 억제제를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는, 골분화 억제 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “엑소좀(exosomes)”은 진핵생물에 존재하는 세포 유래 베시클(vesicle)이며 다중 소관체(multivesicular bodies, MVBs)가 원형질막과 융합되거나 원형질막에서 직접 방출될 때 세포로부터 방출된다.
본 발명에서 사용하는 용어 “let-7”은 miRNA의 한 종류로 22뉴클레오타이드 이내의 아주 짧은 가닥의 RNA로 이루어져 있다. let-7은 핵 내에서 RNA 합성효소(polymerase Ⅱ)에 의해서 프라이머리(primary) let-7(pri-let-7)이 만들어지고, Drosha/DGCR8이 전구체(precursor) let-7 (pre-let-7)로 만든다.
본 발명에서 사용하는 용어 “골모세포(osteoblast)”는 조골세포라고도 하며 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 칼슘 및 마그네슘 이온 등의 무기염을 침착 시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖는 세포를 지칭하는 것으로, 골화 등에 의해 뼈의 신생이 이루어지는 부위에서 볼 수 있는 것이 특징이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “분화(differentiation)”는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 지칭한다. 아울러, “골분화”는 동물의 발달과정에서 나타나는 전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화되어 골을 형성하는 일련의 생리적인 반응인 골형성 과정 중에서도 골기질을 형성하는 과정, 또는 자연적 혹은 인위적으로 동물의 줄기세포의 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “GC-exo(growth condition exosome)”란 성장조건배지의 MC3T3-E1 세포에서 배출된 엑소좀을 의미하고, “at-exo(antagomir-transfected exosomes)”이란 let-7 안타고미르가 형질감염된 엑소좀을 의미한다.
본 발명에서 상기 let-7은 let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g 및 let-7i를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 let-7은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 억제제는 상기 let-7에 특이적으로 결합하는 핵산 분자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 “핵산”이란 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체, 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있다.
본 발명에서 상기 핵산 분자는 RNA(Ribonucleic acid), DNA(deoxyribonucleic acid), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), 안타고미르(antagomir), siRNA(small interfering RNA), miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 안타고미르 일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “안타고미르(antagomir)”는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 miRNA의 차단(silence)에 사용되며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본 발명에서 안타고미르는 miRNA에 효과적으로 결합하여 저해할 수 있도록 let-7의 상보적 RNA 염기서열을 hydroxyprolinol- linked cholesterol solid support and 2' -OMe phosphoramidites 로 변형(Kru tzfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R., Rajeev, K.G., Tuschl, T., Manoharan, M., and Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with “antagomirs.” Nature 438, 685-689 참조)하여 이용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "상보적"이란 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 let-7 표적에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가진다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과 즉, let-7의 발현을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본 발명에서 상기 억제제는 골형성 인자의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 골형성 인자는 오스테오칼신(osteocalcin), 콜라겐 타입1 알파(Col1a), 렁스2(RunX2) 및 오스테릭스(OSX)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비
실시예 1-1. 세포배양 및 엑소좀 정제
MC3T3-E1 마우스의 골모아세포(pre-osteoblast)는 10% exosome-depleted FBS(Exo-FBS, SBI, Mountain View, CA, USA)가 함유된 GM(growth medium)인 DMEM(Dulbecco 's modified Eagle 's Medium)에서 유지하였다.
골형성을 유도하기 위해, OM(osteogenic medium)은 상기 GM에 L-아스코르브 산(L-ascorbic acid) 및 b-글리세로포스 포릭산(b-glycerophosphoric acid) 칵테일을 첨가하여 MC3T3-E1의 분화를 위해 제조하였으며, 중성 스핑고미렐리나제(nSMase)를 표적으로하는 특정 억제제인, 스피로에폭 사이드(spiroepoxide) 억제제(Sc-202721, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 엑소좀 분비를 억제 하였다.
실시예 1-2. 엑소좀의 정제 및 분석
혼합된 소포에서 엑소좀을 구별하는 특정 기술이 부족함에도 불구하고 스피로에폭사이드 억제제가 다소포체(multivesicular body)에서 엑소좀을 차단하기 때문에 본 발명에서는 엑소좀 이라는 용어를 사용하였다.
우선, 세포 배양 배지(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)의 총 엑소좀 분리 시약(Total Exosome Isolation Reagent)을 사용하여 엑소좀을 분리 하였다. 10ml의 상기 배지를 5ml의 상기 시약과 완전히 섞은 다음 4℃에서 밤새 배양하고 10,000 x g 로 4 ℃에서 1시간 동안 원심 분리한 다음 펠릿을 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 재현탁 시켰다.
그 다음, FACS 분석을 위해 제조자의 프로토콜에 따라 Ex-Flow 키트 (SBI)를 사용하였다. 구체적으로, GM과 OM에서 얻은 엑소좀은 9.1μm 직경에 흡수되었으며 CD63-접합 Exo-Flow 비드를 처리하고, Exo-FITC 2차 항체로 배양한 후, BD Accurri C6 유동 세포 계측기(Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)로 세척 및 분석 하였다.
또한, 엑소좀의 양 측정(quantification)은 제조자의 프로토콜에 따라 ExoELISA 키트 (SBI)를 사용하였다. 구체적으로, 정제된 엑소좀은 농도가 알려진 표준 엑소좀과 함께 제공된 ExoELISA 플레이트에서 3시간 배양되었으며 플레이트를 제공된 엑소좀 특이적 항-CD63 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 제공된 HRP-접합된 2차 항체와 함께 1시간 동안 항온 배양하고, 광학 밀도(optical density)는 플레이트 판독기로 450 nm에서 측정하였으며, 엑소좀은 또한 제조사의 프로토콜에 따라 NanoSight 시스템 (NS300, Malvern Panalytical, Malvern, UK)을 사용하여 BCA 분석 (Thermo Scientific)으로 단백질 농도를 측정하고 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 수행함으로써 수량화하였다.
또한, 엑소좀의 전자 현미경 검사를 위해 Exosome-TEM-easy 키트 (101Bio, Mountain View, CA, USA)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. 구체적으로, 정제된 엑소좀은 인산완충생리식염수로 희석 (1 : 100)하고 Formvar-carbon grids (400-grid, coated side down)에 적용하였다. 그 다음, 그리드를 제공된 세척 완충액으로 3회 세척 한 다음 제공된 EM 용액으로 세척 하고 그리드를 밤새 공기 건조시켜 100 kV에서 HT7700 투과 전자 현미경 (TEM, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 1-3. let-7 억제제가 도입된 엑소좀의 제조 및 let-7 유사체(mimic) 사용
성장 조건 배지에서 MC3T3-E1 세포로부터 얻은 약 7 × 1010 개의 엑소좀(GC-exo) 입자를 Gene Pulser 전기 천공 큐벳에서 1 : 1의 비율로 완충액으로 희석시킨 후(Bio-Rad Laboratories, NY, USA). 150 pmol의 최종 부피에서 let-7 패밀리 안타고미르(antagomir)(Exiqon, Vedbaek, Denmark)를 1 μg / μl의 엑소좀 샘플에 첨가했다. 동일한 양의 unrelated scrambled miRNA를 음성대조군으로 사용하였다(Ctrl-exo).
그 다음, 혼합물을 냉각된 0.2cm 전기 천공 큐벳으로 옮기고 Gene Pulser Ⅱ 시스템 (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 150V에서 100μF로 전기천공(electroporation) 한 후, 전기천공된 엑소좀을 RNase A로 처리하고 ExoQuick-TC 키트 (SBI)를 사용하여 다시 정제 하였으며, 합성 let-7 패밀리 유사체(각각 l50 nM : let-7b, let-7c, 및 let-7-d; Bioneer, Daejeon, Korea)를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 MC3T3-E1 세포의 형질감염에 사용 하였다. 동일한 양의 unrelated scrambled miRNA 를 음성대조군으로 사용하였다.
한편, let-7 패밀리의 염기서열은 하기 표 1에서 정리하였다.
| let-7a | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU | 서열번호 1 |
| let-7b | UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU | 서열번호 2 |
| let-7c | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU | 서열번호 3 |
| let-7d | AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU | 서열번호 4 |
| let-7e | UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU | 서열번호 5 |
| let-7f | UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU | 서열번호 6 |
| let-7g | UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU | 서열번호 7 |
| let-7i | UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU | 서열번호 8 |
실시예 1-4. ALP 염색 및 활동 분석
골모세포의 활성을 조사하기 위해 1 × 105 개의 세포를 12-웰 플레이트에 넣고 약 7 × 1010 개의 엑소좀 입자를 단일 웰(well)에 사용하였으며 세포를 수확하여 0.2 % Triton X-100가 포함된 증류수 0.5ml에 넣고 실온에서 20분 동안 진탕하여 용해시켰다. 그 다음, 세포 용해물을 0.05 mM MgCl2 (pH 10.5)가 함유된 0.05M 글리신(glycine) 완충액에서 37℃에서 30분 동안 p-니트로페닐인산염(p-nitrophenyl phosphate)기질 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 배양하였다.
ALP 활성은 마이크로 플레이트 판독기 (Infinite M200, Tecan Inc., 
, Switzerland)로 405 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 데이터는 세포용해물의 전체 단백질 함량에 의해 표준화 되었다. ALP 염색은 알카라인 포스파타제 검출 키트(Alkaline Phosphatase Detection Kit)(Sigma-Aldrich)로 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 요약하자면, 세포를 3개의 12-웰 플레이트에서 1 × 105 세포/웰로 접종하고 OM과 함께 5일 동안 배양한 다음, 각 웰의 세포를 인산완충생리식염수로 세척하고 45초 동안 고정시켰다. 세포와 ALP기질 (ALP-양성 세포가 적색으로 염색됨)이 반응한 후, 용액을 제거하고 세포를 인산완충생리식염수로 3회 세척하였다.
실시예 1-5. 면역형광염색 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 관찰
MC3T3-E1 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 실온에서 10분간 고정시키고 인산완충생리식염수로 세척한 후, 고정된 세포를 25℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 용액 (3% 소 혈청 알부민 및 0.1 % 트리톤(Triton)-X가 포함된 인산완충생리식염수)으로 처리하였다. 그 후 세포를 4℃의 블로킹 용액에서 항-오스테오칼신(anti-osteocalcin) 항체 (1 : 100, Enzo, New York, NY, USA)와 함께 밤새 배양하고 인산완충생리식염수로 세척하였다. 그 다음, 세포는 블로킹 용액에서 2차 항체 (염소 항-토끼, 1 : 150, Life Technologies, Alexa Fluor 568) 및 phalloidin (1 : 100, Life Technologies, Alexa Fluor 488)과 함께 25℃에서 1시간 동안 배양되었으며, 세포를 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM Zeiss 700, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)으로 시각화 하였다.
실시예 1-6. 엑소좀 miRNA의 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq) 및 데이터 증착
엑소좀 miRNA 샘플에 대해 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS)을 수행하였다.
구체적으로, 10 ml의 세포 배양 배지를 1500 × g에서 5분 동안 원심 분리하여 잔류 세포 및 잔해물을 제거한 다음, 엑소좀 분리를 위해 상등액을 새로운 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겼다. NGS 라이브러리는 제조사의 프로토콜 (SeqMatic LLC, Fremont, CA)에 따라 TailorMix Micro RNA 샘플 준비 키트 버전 2로 생성되었으며, 하기 단계를 수행하였다. 3'-어댑터를 RNA 샘플에 연결하고 여분의 3'-어댑터를 제거하였으며 이어서, 5'-어댑터를 3'-어댑터-라이게이션 된 샘플에 연결하고, 제 1가닥 cDNA 합성을 실시 하였다. cDNA 라이브러리는 농축 PCR 분석을 통해 증폭되고 바코드 처리되었다
마지막으로, RNA 라이브러리는 8% TBE 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔에서 크기 선택(size-selected)되었으며, 시퀀싱은 Illumina NextSeq 500 플랫폼에서 제조업체의 지침에 따라 수행되었고, 로(raw) 딥-시퀀싱 데이터는 수락 번호 SRP136299로 입수할 수 있다.
실시예 1-7. RNA 분리
RNA-Seq를 위해 SeraMir 엑소좀 RNA 증폭 키트(Exosome RNA Amplification Kit, SBI)를 사용하였다.
구체적으로, qRT-PCR을 수행하기 위해 TRIzol Reagent (Invitrogen) 및 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출 및 정제된 엑소좀에서 총 RNA를 추출하였으며, 그 다음 NanoDrop (Thermo Scientific)을 사용하여 전체 RNA의 양과 품질을 확인하였다.
실시예 1-8. qRT-PCR 및 스파이크-인(spike-in) 컨트롤
qRT-PCR을 수행하여 MC3T3-E1 세포에서 엑소좀 내 let-7 패밀리 및 골형성 마커의 존재를 확인하였다.
구체적으로, exosomal let-7의 경우 RNA 추출 중에 합성 Cel-miR-39-5p (330 fmol / μl 원액) 3 μl를 첨가하고 총 RNA (25 ng)를 TaqMan miRNA 리버스 트렌스크립션 키트(MiRNA Reverse Transcription Kit)를 사용하여 역전사 시켰다(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 그리고 15μl의 반응 혼합물 중, 1.33μl는 TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems) 및 TaqMan 프로브 (Applied Biosystems)를 사용하여 수행된 qRT-PCR에 사용하였으며 Cel-miR-39-5p는 외부 스파이크 인 조절 및 정규화에 사용되었다. 각각의 RNA 샘플은 20 μl의 반응 부피(reaction volume)로 준비되었으며, 제조사의 프로토콜에 따라 let-7 패밀리를 분석하기 위해 HB miR Multi Assay Kit System I (HeimBiotek, Seoul, Korea)을 사용하였다. 증폭 프로토콜은 하기와 같이 수행 하였다.
95℃에서 15분간의 초기 변성;
95℃에서 10초, 60℃에서 40초 동안 45회 열(thermal) 사이클;
램프의 표준 용융 조건은 55℃에서 99℃ 범위이며 각 단계에서 1℃ 상승함.
오스테오제닉(osteogenic) 마커 및 Lin28는 총 RNA (1 ㎍) OmniScript (QIAGEN)를 사용하여 역전사 되었으며 희석된 cDNA는 골형성 마커 유전자 및 Lin28 프라이머 세트 (하기 표 2 참조)와 함께 qRT-PCR에 사용되었다. PCR은 7500 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 96-웰 플레이트에서 수행 하였으며 miRNA의 발현 정도는 각 RNA 샘플에서 3번 반복하여 결정되었다.
| Gene | Primers |
| Hprt OCN Col1a RunX2 OSX Lin28 |
Forward: CCT AAG ATG ATC GCA AGT TG(서열번호 9) Reverse: CCA CAG GGA CTA GAA CAC CTG CTA A(서열번호 10) Forward: CCG GGA GCA GTG TGA GCT TA(서열번호 11) Reverse: TAG ATG CGT TTG TAG GCG GTC(서열번호 12) Forward: CA CCC CAG CCG CAA AGA GT(서열번호 13) Reverse: CG GGC AGA AAG CAC AGC ACT(서열번호 14) Forward: CT CAG TGA TTT AGG GCG CAT T(서열번호 15) Reverse: AG GGG TAA GAC TGG TCA TAG G(서열번호 16) Forward: GG AGG TTT CAC TCC ATT CCA(서열번호 17) Reverse: TA GAA GGA GCA AGG GGA CAG A(서열번호 18) Forward: AGT CTG CCA AGG GTC TGG AA(서열번호 19) Reverse: C GCT CAC TCC CAA TAC AGA ACA(서열번호 20) |
실시예 1-9. 통계 분석
모든 데이터는 결과의 평균 편차 (SD)로 표시되었으며 parametric two-tailed non-paired t-test를 계산하기 위해 유의한 변이 분석이 사용되었다. 모든 분석은 Origin 8.0 (Origin Lab, MA, USA)을 사용하여 수행되었으며, p 값은 0.05 이하가 통계적으로 유의 하다고 간주되었다.
실시예 2. MC3T3-E1 세포의 골형성 과정에서 엑소좀의 효과
증식중인 MC3T3-E1 세포로부터 유래한 엑소좀의 기능을 탐색하기 위해, 성장조건배지로부터 얻은 엑소좀(GC-exo)을 분화된 MC3T3-E1 세포에 대한 엑소좀 분비 억제제와 함께 처리하였다.
구체적으로, 미분화 세포 배양액에 GC-exo(약 7 x 1010 입자) 및 엑소좀 방출을 차단하는 것으로 알려진 중성 스핑고미에리나제(sphingomyelinase) 억제제인, N-SMase 억제제 스피로에폭사이드(spiroepoxide, SPI)를 사용하고 실시예 1-2에 기재된 유세포 분석(FACS)을 수행 하였다. 그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이 10 μM의 스피로에폭사이드로 처리 한 후, MC3T3-E1 세포는 엑소좀 분비가 현저하게 감소한 것을 확인하였다.
또한, ALP는 MC3T3-E1 세포의 골원성(osteogenic) 분화의 초기 지표이기 때문에, 스피로에폭사이드의 효과 확인을 위해 ALP의 활성을 골원성 유도 5일 후 실시예 1-4에 기재된 방법을 통해 관찰하였다. 그 결과, 도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이 ALP 활성은 스피로에폭사이드에 의해 현저하게 감소되었지만, 성장 배지에서 얻어진 엑소좀(GC-exo)을 첨가함으로써 회복되었으며 또한, 도 1d에 나타난 바와 같이 다른(구조적으로 관련성이 없는) 엑소좀 방출 억제제인 GW4869 (20 μM)로 실험하여도 동일한 결과를 얻었다. 나아가, 실시예 1-8에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행한 결과, 도 1e에 나타난 바와 같이 OCN과 같은 골형성 인자의 전사 수준은 스피로에폭시드와 엑소좀의 첨가에 따른 ALP 활성과 관련이 있다는 점을 확인하였다.
상기 결과는 엑소좀이 MC3T3-E1 세포에서 조기 골형성에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
실시예 3. GM(growth media) 및 OM(osteogenic media)에서 MC3T3-E1 세포 exosomal miRNAs의 차별적인 발현 비교
엑소좀의 miRNA가 MC3T3-E1 세포의 분화에 관여하는지 여부를 확인하기 위해 유도 단계(유도 후 5일 후)의 MC3T3-E1 세포에서 추출한 엑소좀 miRNA의 RNA-Seq을 수행하였다. 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 GM(growth medium) 및 OM(osteogenic medium)에서 엑소멀(exosomal) miRNAs의 데이터를 얻은 다음 두 세트의 GM 및 OM 엑소멀 miRNA가 미분 발현 프로파일링을 위해 비교되었으며 RNA-seq 데이터의 리드 얼라이먼트(Reads alignment)는 하기 표 3에 요약하였다.
| 1st set | 2nd set | |||
| GM exosomal miRNAs 1 | OM exosomal miRNAs 1 | GM exosomal miRNAs 2 | OM exosomal miRNAs 2 | |
| Number of reads | 13808067 | 208512782 | 14623492 | 13455855 |
| Number of alignments | 130547112 | 113875006 | 116271213 | 128606785 |
| Number of aligned reads | 11593864 | 11623710 | 11899857 | 10353479 |
상기 실험 결과, 도 2b 및 2c에 나타난 바와 같이 GM과 OM의 엑소좀에서 발견된 miRNA 중에서 let-7 패밀리가 GM 엑소좀에서 가장 두드러지게 발현되었으며, OM 엑소좀에서 발현이 현저하게 감소되었다. 따라서, RNA-seq 프로파일링 데이터를 바탕으로 엑소좀의 let-7 패밀리에 연구의 중점을 두었으며 RNA-Seq 데이터로부터 let-7 패밀리의 발현 수준을 검증하기 위해 상기 실시예 1-8에 기재된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이 외인성 Cel-miR-39를 이용하여 엑소좀을 정규화(normalization) 한 후, let-7a, let7c 및 let-7e의 발현 수준은 OM으로부터 수득한 엑소좀의 경우 GM에서의 엑소좀에 비해 유의하게 감소하여 상기 miRNA 발현 데이터와 일치함을 확인하였다.
실시예 4. MC3T3-E1 세포의 골형성 과정에서 let-7 패밀리의 발현
상기 실시예 3의 실험을 통해 MC3T3-E1 세포에서 let-7 패밀리 구성원의 발현 수준이 초기 골형성 단계에서 성장 단계보다 약간 낮았다는 것을 발견했으며 세포에서 let-7의 차별적인 발현은 엑소좀에서 보다 덜 현저하였다.
이에, MC3T3-E1 세포에 각기 다른 조건(GM, OM, SPI 또는 GC-exo)을 처리하였을 때 let-7 패밀리 발현 수준이 어떠한지 TaqMan qRT-PCR을 사용하여 비교 하였으며 U6은 내부 정규화 컨트롤로 사용하였다. 그 결과, 엑소좀에서 let-7 패밀리의 발현 수준은 세포질(cytosol)보다 상대적으로 높았고, 스피로에폭사이드 억제제로 처리하면 세포질에 let-7이 축적되었으며, 이러한 축적은 높은 수준의 let-7을 함유한 외인성 엑소좀(GC-exo)이 성장 단계에서 첨가되었을때 빠르게 가속화되었다(도 3a 참조).
또한, let-7 유사체 또는 안타고미르를 처리한 후 골형성 인자의 발현 정도를 측정한 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 let-7 발현은 OSX와 같은 골형성 유전자의 발현을 증가시켰고, 도 3c에 나타난 바와 같이 let-7 안타고미르는 골형성 유전자의 발현을 하향 조절 하는 것을 확인하였다.
실시예 5. MC3T3-E1 세포의 골형성에 대한 let-7 억제제가 처리된 외인성 엑소좀(at-exo)의 효과
상기 실시예 1-3 및 도 4a에 기재된 방법에 따라 MC3T3-E1 세포의 성장 조건 배지에서 엑소좀(GC-exo)을 let-7 억제제로 형질감염 시킨 다음, 엑소좀을 RNase A로 처리하여 로딩되지 않은 안타고미르를 제거하고 엑소좀 아이솔레이션 키트로 다시 정제했다. 엑소좀 입자는 전기천공(electroporation)처리 및 본 실험에 최적화 되었으며, 전자 현미경을 통해 관찰한 결과 엑소좀이 전기천공에 의해 물리적인 영향을 받지 않았음을 확인하였으며 (도 4b 참조), 엑소좀 분석 결과 엑소좀의 주요 크기가 안타고미르 로딩 전후로 큰 차이가 없음을 확인하였다(도 4c 참조).
MC3T3-E1 세포는 엑소좀 방출 억제제인 스피로에폭사이드 및 at-exo를 처리하고 분화를 유도 하였으며 at-exo의 효과는 골모세포 특이적 마커인 ALP 활성 측정을 통해 평가 하였다. 그 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이 스피로에폭사이드와 함께 at-exo를 처리한 MC3T3-E1 세포에서는 분화능력이 회복 되지 않음을 확인하였다.
또한, 세포에서 at-exo의 기능을 더 확인하기 위해, qRT-PCR를 통해 다른 골형성 인자 유전자의 발현을 조사했다. 그 결과, 도 4e에 나타난 바와 같이 골형성 유전자 (OCN, Col1a, RunX2 및 OSX)의 발현은 GC-exo와 비교하여 at-exo에 의해 유의하게 억제되어 세포의 let-7 직접 억제(도 3c 참조) 및 let-7의 엑소좀 매개 억제 모두 골형성 분화에 유사한 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 1-5의 방법에 따른 면역형광염색 및 공초점 현미경 관찰 결과 도 4f에 나타난 바와 같이 SPI + GC-exo에서 MC3TC-E1 세포의 OCN 형광 강도가 회복된 것과 대조적으로 SPI + at-exo에서는 OCN의 형광 강도가 회복되지 않았다. 상기 결과는 let-7 억제제가 엑소좀에 성공적으로 적재될 뿐만 아니라 let-7 패밀리 기능이 불활성화 된다는 것을 의미한다.
실시예 6. Lin28을 사용한 MC3T3-E1 세포에서 let-7 유사체, let-7 안타고미르 및 at-exo의 효과 확인
let-7 유사체, 안타고미르 및 at-exo의 효과 확인을 위해 let-7의 직접 표적 유전자인 Lin28을 선정하였다. 상기 Lin28은 let-7의 음성 피드백 조절 인자이며 let-7의 과발현에 의해 전사 수준이 하향 조절된다.
Lin28 발현 측정을 위해 상기 실시예 1-8에 기재된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행한 결과 도 5a에 나타난 바와 같이 Lin28 발현은 let-7 유사체에 의해 유의하게 감소되었지만, let-7 안타고미르를 도입시킨 경우 컨트롤에 비해 상향 조절되었다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이 Lin28 발현의 유의한 증가는 at-exo를 처리 한 후에도 관찰되었는데 이는, at-exo가 let-7을 억제한 결과 Lin28의 상대적 발현양이 증가하였음을 의미한다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Methods for inhibiting bone marrow differentiation using exosomes
transfected let-7 inhibitors
<130> MP18-317
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7a
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7b
<400> 2
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7c
<400> 3
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7d
<400> 4
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7e
<400> 5
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7f
<400> 6
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7g
<400> 7
ugagguagua guuuguacag uu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7i
<400> 8
ugagguagua guuugugcug uu 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hprt Forward Primer
<400> 9
cctaagatga tcgcaagttg 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hprt Reverse Primer
<400> 10
ccacagggac tagaacacct gctaa 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN Forward Primer
<400> 11
ccgggagcag tgtgagctta 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OCN Reverse Primer
<400> 12
tagatgcgtt tgtaggcggt c 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col1a Forward Primer
<400> 13
caccccagcc gcaaagagt 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col1a Reverse Primer
<400> 14
cgggcagaaa gcacagcact 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RunX2 Forward Primer
<400> 15
ctcagtgatt tagggcgcat t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RunX2 Reverse Primer
<400> 16
aggggtaaga ctggtcatag g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OSX Forward Primer
<400> 17
ggaggtttca ctccattcca 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OSX Reverse Primer
<400> 18
tagaaggagc aaggggacag a 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lin28 Forward Primer
<400> 19
agtctgccaa gggtctggaa 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lin28 Reverse Primer
<400> 20
cgctcactcc caatacagaa ca 22
Claims (6)
- (a) 골모세포(osteoblast)로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 분리한 엑소좀에 let-7 억제제를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 골모세포에 처리하는 단계를 포함하는, 골분화 억제 방법으로서,
상기 let-7은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 표시되고, 상기 let-7 억제제는 골형성 인자의 발현을 억제하며,
상기 방법은 시험관 내(In vitro)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 골분화 억제 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 억제제는 상기 let-7에 특이적으로 결합하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는, 골분화 억제 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 핵산 분자는 RNA(Ribonucleic acid), DNA(deoxyribonucleic acid), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), 안타고미르(antagomir), siRNA(small interfering RNA), miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골분화 억제 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 골형성 인자는 오스테오칼신(osteocalcin), 콜라겐 타입1 알파(Col1a), 렁스2(RunX2) 및 오스테릭스(OSX)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 골분화 억제 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190016898A KR102240833B1 (ko) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 이용한 골분화 억제방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190016898A KR102240833B1 (ko) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | let-7 억제제가 도입된 엑소좀을 이용한 골분화 억제방법 |
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-
2019
- 2019-02-13 KR KR1020190016898A patent/KR102240833B1/ko active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CRISTINA BELTRAMI ET AL, MOL THER. 2017; 25(3): 679_693* |
| Yong Xie et al, J Cell Mol Med. 2017; 21(5): 1033_1041* |
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